JP2023537104A - シグレック６結合ポリペプチド - Google Patents
シグレック６結合ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023537104A JP2023537104A JP2023509569A JP2023509569A JP2023537104A JP 2023537104 A JP2023537104 A JP 2023537104A JP 2023509569 A JP2023509569 A JP 2023509569A JP 2023509569 A JP2023509569 A JP 2023509569A JP 2023537104 A JP2023537104 A JP 2023537104A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- siglec
- seq
- car
- binding polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000863880 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 6 Proteins 0.000 title claims abstract description 296
- 102100029947 Sialic acid-binding Ig-like lectin 6 Human genes 0.000 title claims abstract description 294
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 130
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 127
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 127
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 196
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 112
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 112
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 99
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 80
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 78
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 28
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 245
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 219
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 141
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 139
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 57
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 54
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 43
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 37
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 37
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 29
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 28
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 28
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 25
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 25
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 22
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 22
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 21
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 14
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 14
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 14
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 12
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 claims description 12
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 claims description 11
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 claims description 9
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 claims description 8
- 206010061850 Extranodal marginal zone B-cell lymphoma (MALT type) Diseases 0.000 claims description 8
- 201000003791 MALT lymphoma Diseases 0.000 claims description 8
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 208000035268 Mast Cell Activation disease Diseases 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 22
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 65
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 42
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 32
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 31
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 31
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 28
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 23
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 23
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 22
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 21
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 108010003374 fms-Like Tyrosine Kinase 3 Proteins 0.000 description 18
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 17
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 17
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 17
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 108010047827 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Proteins 0.000 description 13
- 102000007073 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Human genes 0.000 description 13
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 12
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 102100026094 C-type lectin domain family 12 member A Human genes 0.000 description 11
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 11
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 10
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 9
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 9
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 8
- 101710188619 C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 description 7
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 6
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 239000002177 L01XE27 - Ibrutinib Substances 0.000 description 5
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 5
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N ibrutinib Chemical compound C1=2C(N)=NC=NC=2N([C@H]2CN(CCC2)C(=O)C=C)N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N 0.000 description 5
- 229960001507 ibrutinib Drugs 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 4
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 4
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 4
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 4
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 4
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 description 3
- 101100508818 Mus musculus Inpp5k gene Proteins 0.000 description 3
- 101100366438 Rattus norvegicus Sphkap gene Proteins 0.000 description 3
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 3
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 208000036676 acute undifferentiated leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 3
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000009162 epigenetic therapy Methods 0.000 description 3
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 108010029445 Agammaglobulinaemia Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 2
- 101100279855 Arabidopsis thaliana EPFL5 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 229940125814 BTK kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- -1 CD33 Proteins 0.000 description 2
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101150031358 COLEC10 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100496086 Homo sapiens CLEC12A gene Proteins 0.000 description 2
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 2
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 2
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010029180 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100029823 Tyrosine-protein kinase BTK Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000002791 cfu-m Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003968 dna methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229940075628 hypomethylating agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- BMGQWWVMWDBQGC-IIFHNQTCSA-N midostaurin Chemical compound CN([C@H]1[C@H]([C@]2(C)O[C@@H](N3C4=CC=CC=C4C4=C5C(=O)NCC5=C5C6=CC=CC=C6N2C5=C43)C1)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 BMGQWWVMWDBQGC-IIFHNQTCSA-N 0.000 description 2
- 229950010895 midostaurin Drugs 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004457 myocytus nodalis Anatomy 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011523 CAR-T cell immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 description 1
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 229940126190 DNA methyltransferase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102000010449 Folate receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 108050001930 Folate receptor beta Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000596234 Homo sapiens T-cell surface protein tactile Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010062489 Leukaemia recurrent Diseases 0.000 description 1
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000610085 Mus musculus Probasin Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010029157 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 102100035268 T-cell surface protein tactile Human genes 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011360 adjunctive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]3O)O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 239000013584 assay control Substances 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000649 b-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 231100000226 haematotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000048968 human SIGLEC6 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016595 therapy related acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Abstract
本発明は、シグレック6に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はシグレック6結合キメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなる、シグレック6結合ポリペプチド、シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含む発現ベクター、このポリペプチド、ポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む免疫細胞、免疫細胞及び免疫細胞を含む医薬組成物を生成するための方法に関する。本発明の免疫細胞及び医薬組成物は、患者における疾患、例えばがんを処置するための方法において使用し得る。
Description
本発明は、シグレック6に結合する抗体若しくはその断片又はシグレック6結合キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなるシグレック6結合ポリペプチド、シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含む発現ベクター、このポリペプチド、ポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む免疫細胞、このような免疫細胞及びこのような免疫細胞を含む医薬組成物を生成するための方法に関する。本発明の免疫細胞及び医薬組成物は、患者における疾患を処置するための方法において使用し得る。
合成キメラ抗原受容体(CAR)を賦与したT細胞は、B細胞及び形質細胞悪性腫瘍における長期寛解を示しており[1～4]、CAR T細胞により他の血液及び固形がんを標的とすることが探求されている。急性骨髄球性白血病(AML)は、医学的必要性が満たされていない疾患であり、新規の治癒的療法を必要としている。いくつかの前臨床試験によってCAR-T細胞によるAML標的化の実現可能性が示されているが、許容される安全性プロファイルを有するCAR標的抗原の同定は困難なままとなっている[5]。これは主に、正常造血幹及び前駆細胞(HSC/P)上でのこれまでに同定されている候補CAR標的抗原のAMLにおける発現のためである[6、7]。従って、HSC/Pにより発現せず、他の健常細胞及び組織上で全く発現しないか又は最小限に発現する、新規のCAR標的が強く望まれている。
B細胞及び形質細胞悪性腫瘍を標的とするCAR-T細胞は、複数の一次処置及び進行型血液悪性腫瘍を有する患者において前例のない臨床応答を示しており[1～4]、AMLにおけるCAR T細胞療法の使用に対する関心が高まっている。CART-細胞が細胞表面分子を標的とするため、標的抗原が腫瘍細胞上で均一に発現し、健常細胞及び組織上で最小限に発現するか又は更には発現しないことが望ましい。この必要条件は、これまでに提唱されている候補抗原の殆どが健常HSC/P及び先天免疫細胞により発現するため[20]、AMLにおけるCAR-T療法に対して困難な問題となっている。従って、CAR T-細胞をこのような抗原に対して方向づけることにより、健常な造血の減少又は消失を含む望まない毒性を引き起こすことが予測されている。実際、骨髄球系抗原、例えばCD123、CD33に対するCAR T-細胞は、骨髄破壊的であり、正常な造血を再構成するために同種造血幹細胞移植(アロHSCT)を必要とすることが示されている[19、22]。注目すべきは、CD123特異的CAR T-細胞の臨床的使用により、同種CD123-CAR T細胞生成物を利用したヒト初回投与臨床試験において顕著かつ予想外の毒性及び致死的な重度の有害事象が生じており、結果として、この試験は保留となっている[21]。正常HSC/Pの除去を防ぐために、Kimらは、CRISPR/Cas9を使用してドナーHSC/P細胞においてCD33をノックダウンする遺伝子編集によって、CD33-CAR T細胞によるHSC/Pの除去を防ぎ得ることを示唆した[22]。しかし、遺伝子編集HSC(遺伝子修飾CD33-CAR T細胞に加えて)の投与を必然的に伴う、この戦略の臨床的実施は、非常に労力を要し、複雑かつ高価である。加えて、遺伝子編集HSCの使用は、悪性形質転換のリスクを含む、望まない遺伝子毒性の実質的に大きなリスクを必然的に伴う。
更に、AMLにおける目的の他の潜在的CAR標的は、FLT3、CLL-1、CD44v6、CD7、葉酸受容体β、Lewis-y抗原を含む。発明者らは、高リスクFLT3-ITD+AMLにおけるCAR T細胞によるFLT3の標的化によって、マウス異種移植における完全寛解を誘導することができ、FLT3 CAR-T細胞の抗白血病効力をFLT3阻害剤により増強することができることをこれまでに示している[23]。しかし、FLT3はHSC/P上でも発現し、FLT3-CAR T細胞処置により骨髄破壊が誘導されることが予測されている[23]。C型レクチン様分子1(CLL-1)は、AML芽球により発現し、肺及び胃腸の上皮細胞上にも存在する[24]。発明者らは、HSC/P上でCLL-1発現を観察し、これは、CLL-1特異的CAR T細胞により標的とする場合、重度の毒性をもたらす可能性を示唆した。CD44v6はHSC/P上には存在しないが、CD44v6-CAR T細胞により標的とする場合、重要な細胞及び組織、例えばケラチノサイト、口腔粘膜及び単球におけるこの発現により、致死的毒性が引き起こされ得る[25]。CD7は、わずかに約30%のAML患者により、T細胞上に高レベルで発現するため[26]、T細胞からCD7をノックアウトして抗CD7-CAT T細胞を作製することが必要とされ、これによって臨床適用が更に複雑となる。
シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン(シグレック)は、主に白血球により発現し、ヒト免疫細胞における阻害性シグナル伝達と関連する細胞表面受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーである[8]。注目すべきことには、シグレック2(CD22)及びシグレック3(CD33)は、シグレックスーパーファミリーのメンバーであり、血液悪性腫瘍、例えば、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)及びAMLにおけるCAR標的抗原として、それぞれ興味深い。励みとなることには、CD22標的化CAR T細胞により、再発/不応性(R/R)B-ALL患者における完全寛解が示されており[9]、好ましい発現プロファイルを有するシグレックの標的化により、白血病の寛解を誘導し、患者を潜在的に治癒させることができることを示している。
Baskarらは、同種造血幹細胞移植(アロHSCT)後のレパトワからモノクローナル抗体(mAb)を生成し、これは、慢性リンパ球性白血病(CLL)患者における移植片対白血病(GVL)応答に潜在的に寄与した[10]。標的を発見するための後続の解析により、ヒトシグレック6タンパク質に対して結合及び認識する候補としてmAb「JML-1」が明らかとなった[11]。シグレック6は、CD33関連シグレックサブファミリーに属し、この構造は、シグレック3(CD33)に密接に関連する。シグレック6は、3つの細胞外免疫グロブリン(Ig)ドメイン及び2つの細胞内免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ(ITIM)のモチーフからなる[12～14]。このようなITIMモチーフにより、シグレック6は、他のCD33関連シグレックのように経路を活性化する制御因子として作用すると考えられている[13]。シグレック6発現は、一次B細胞において[10、12]、異常発現がCLLにおいて[10、11]、及びMALTリンパ腫[15]において報告されている。また、シグレック6は、胎盤[12、16]及びヒトマスト細胞[17、18]上に発現することがわかっている。しかし、他のシグレックタンパク質とは異なり、NK細胞、T細胞、好中球、マクロファージ及び単球上には存在しない[13]。
上記を考慮すれば、白血病及びリンパ腫、特には、AML、CLL、MALTリンパ腫及びクローン性マスト細胞疾患のための安全かつ有効な処置をもたらす新規療法の重要な必要性が依然として残存している。
Kim MY, Yu K-R, Kenderian SS, et al. Genetic inactivation of CD33 in hematopoietic stem cells to enable CAR T cell immunotherapy for acute myeloid leukemia. Cell. 2018; 173(6): 1439-1453. e1419.
BaskarS, Suschak JM, Samija I, et al. A human monoclonal antibody drug and target discovery platform for B-cell chronic lymphocytic leukemia based on allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and phage display. Blood, The o＼Journal of the American Society of Hematology. 2009; 114(20): 4494-4502.
本発明は、患者を治療処置するための改良組成物を提供することにより、満たされていない臨床的必要性を克服することを目的とする。
発明者らは、新たに診断されたAML患者及び再発/不応性AML患者に由来する原発性AML芽球上でのシグレック6発現を実証する。興味深いことには、発明者らは、AML白血病幹細胞(LSC)上でのシグレック6発現をも実証する。ヒトCD4+及びCD8+T細胞は、完全ヒトJML-1 IgG1 mAbに由来する標的ドメインによりシグレック6特異的CAR(JML-1-CAR)を発現する能力を備えた。原発性「バルク」AML芽球、AML白血病幹細胞及びAML細胞株に対する、AML患者及びHD由来のJML-1-CAR T細胞の抗白血病反応性を、評価及び実証した。更に、発明者らは、正常造血幹/前駆細胞(HSC/P)及び成熟末梢血細胞上でのシグレック6の発現を評価して、JML-1-CAR T細胞により媒介されるオンターゲット・オフ腫瘍における潜在的血液毒性を評価した。発明者らは、シグレック6が正常HSC/P上では発現しないことを示し、正常HSC/PがJML-1-CAR T細胞により認識されないことを実証する。未処置CLL患者由来の悪性B-CLL細胞上及び健常B細胞における高レベルのシグレック6が確認され、CLLに対するJML-1 CAR-T細胞の抗白血病活性が実証された。
本出願では、シグレック6に結合する免疫細胞、例えば、シグレック6に結合するCARを含む免疫細胞を使用する治療が、有効であることを初めて妥当性をもって示す。このような治療は、シグレック6発現細胞の除去を含む。
その上、本出願では、シグレック6が非がん性造血幹/前駆細胞(HSC/P)上では発現しないことを確認し、これにより、免疫細胞、例えば、CAR-T細胞によるシグレック6の標的化が、がん、例えばAMLの処置における安全な手法である可能性を有し、後続のアロHSCTを必要としない可能性を有することを示唆する。従って、本出願では、シグレック6に結合する免疫細胞を使用する処置を初めて提示し、これは、非がん性HSC/Pの除去を含まず、結果的に、このような免疫療法後のアロHSCTの実施が不要となる。その上、シグレック6に結合する免疫細胞の使用により、前記免疫細胞の処置後の枯渇が不要となり得る。
従って、本発明では、次の好ましい実施形態を提供する。
[1]シグレック6に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなる、シグレック6結合ポリペプチド。
[2]シグレック6に結合する抗体又はその断片を含むか又はこれからなる、[1]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[3]少なくとも二重特異性である、[1]又は[2]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[4]シグレック6に結合する第1の抗体又はその断片、及びシグレック6以外の標的に結合する第2の抗体又はその断片を含むか又はこれからなり、任意選択で、リンカーを介して相互に結合する、[2]又は[3]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[5]シグレック6に結合する上記抗体又はその断片が、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[2]から[4]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[6]免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞に結合可能な、[4]又は[5]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[7]CD3、例えば、CD3ゼータ又はCD3イプシロン、好ましくはCD3ゼータに更に結合する、[4]から[6]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[8]免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞を、その表面上にシグレック6を発現する標的細胞に動員可能な、[4]から[7]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[9]薬物にコンジュゲートする、[2]から[5]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[10]上記薬物がトキシンである、[9]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[11]シグレック6結合CARを含むか又はこれからなる、[1]又は[3]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[12]上記CARが、少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、[11]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[13]上記細胞外リガンド結合ドメインが、シグレック6結合エレメントを含む、[12]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[14]上記シグレック6結合エレメントが、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[13]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[15]上記細胞外リガンド結合ドメインが、スペーサードメイン、例えばCD8α、IgG3又はIgG4由来のスペーサードメインを含む、[12]から[14]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[16]上記膜貫通ドメインが、好ましくは、配列番号13に示すアミノ酸配列、又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表されるCD28膜貫通ドメインを含む、[12]から[15]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[17]上記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン及びCD3ゼータドメインを含み、上記共刺激ドメインが、好ましくは、CD28細胞質ドメイン又は4-1BB共刺激ドメインである、[12]から[16]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[18]上記共刺激ドメインが、CD28細胞質ドメインである、[17]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[19]上記CD28細胞質ドメインが、配列番号15に示すアミノ酸配列、又は配列番号15に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[17]又は[18]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[20]上記4-1BB共刺激ドメインが、配列番号17に示すアミノ酸配列、又は配列番号17に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[17]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[21]上記CD3ゼータドメインが、配列番号19に示すアミノ酸配列、又は配列番号19に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[17]から[20]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[22]配列番号27、29、31若しくは33のいずれか1つに示すアミノ酸配列、又は配列番号27、29、31若しくは33のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、[12]から[19]及び[21]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[23][1]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
[24]配列番号26により表されるヌクレオチド配列、又は配列番号26に示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[23]に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
[25]配列番号28、30、32若しくは34のいずれか1つにより表されるヌクレオチド配列、又は配列番号28、30、32若しくは34のいずれか1つに示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[23]又は[24]に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
[26]上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'方向及び3'方向に隣接セグメントを更に含む、[23]から[25]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[27]5'方向の上記隣接セグメントが、左逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントであり、3'方向の隣接セグメントが、右逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントである、[26]に記載のポリヌクレオチド。
[28]上記左IR/DRセグメントが、配列番号43により表され、上記右IR/DRセグメントが、配列番号44により表される、[27]に記載のポリヌクレオチド。
[29]左IR/DRのヌクレオチド配列、シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び右IR/DRのヌクレオチド配列を含む、[23]から[28]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[30][23]から[29]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む、発現ベクター。
[31]非ウイルスベクター又はウイルスベクターである、[30]に記載の発現ベクター。
[32]非ウイルスベクターである、[31]に記載の発現ベクター。
[33]最小DNA発現カセットである、[32]に記載の発現ベクター。
[34]トランスポゾンドナーDNA分子である、[32]又は[33]に記載の発現ベクター。
[35]上記トランスポゾンドナーDNA分子が、Sleeping Beauty又はPiggyBacトランスポゾンドナーDNA分子である、[34]に記載の発現ベクター。
[36]ミニサークルDNAである、[32]から[35]のいずれか一項に記載の発現ベクター。
[37]ウイルスベクターである、[31]に記載の発現ベクター。
[38]レンチウイルス又はガンマ-レトロウイルスベクターである、[37]に記載の発現ベクター。
[39][11]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド、及び/又は[11]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は請求項[11]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞。
[40]ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット及び/又はベクターが発現する、[39]に記載の免疫細胞。
[41]リンパ球である、[39]から[40]のいずれか一項に記載の免疫細胞。
[42]上記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、[41]に記載の免疫細胞。
[43]上記T細胞が、CD4+細胞又はCD8+細胞である、[42]に記載の免疫細胞。
[44]検出可能なマーカーを更に発現する、[39]から[43]のいずれか一項に記載の免疫細胞。
[45]ヒト細胞である、[39]から[44]のいずれか一項に記載の免疫細胞。
[46](a)対象の血液試料から免疫細胞を単離する工程と、
(b)[23]から[29]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は[30]から[38]のいずれか一項に記載の発現ベクターで免疫細胞に形質転換又は形質導入する工程と、
(c)任意選択で、形質転換又は形質導入した上記免疫細胞を精製する工程と
を含む、(組換え)免疫細胞を生成するための方法。
[47]工程(b)において、1)[23]から[29]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む転位エレメント及び2)トランスポゼース(をコードするポリヌクレオチド)を使用して免疫細胞を形質転換する、[46]に記載の方法。
[48]上記トランスポゼースが、Sleeping Beautyトランスポゼース又はPiggyBacトランスポゼースである、[47]に記載の方法。
[49]上記Sleeping Beautyトランスポゼースが、配列番号45に示すアミノ酸配列により表される、[48]に記載の方法。
[50]上記転位エレメントを、上記トランスポゼースの作用により上記免疫細胞のゲノムに組み込む、[47]から[49]のいずれか一項に記載の方法。
[51]上記免疫細胞がリンパ球である、[46]から[50]のいずれか一項に記載の方法。
[52]上記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、[51]に記載の方法。
[53]上記T細胞が、CD4+細胞又はCD8+細胞である、[52]に記載の方法。
[54]上記対象がヒトである、[46]から[53]のいずれか一項に記載の方法。
[55][46]から[54]のいずれか一項に記載の方法により入手可能な、免疫細胞。
[56][39]から[45]又は[55]のいずれか一項に記載の複数の免疫細胞を含む、医薬組成物であって、複数の上記免疫細胞が、任意選択で、CD4+細胞及びCD8+細胞の混合物である、医薬組成物。
[57]医薬としての使用のための、[39]から[45]の若しくは[55]のいずれか一項に記載の免疫細胞又は[56]に記載の医薬組成物。
[58]対象に投与される、がんを処置する方法における使用のための、[39]から[45]の若しくは[55]のいずれか一項に記載の免疫細胞又は[56]に記載の医薬組成物。
[59]上記医薬組成物が静脈内に投与される、[57]又は[58]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[60]前記免疫細胞がリンパ球である、[57]から[59]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[61]前記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、[60]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[62]上記T細胞が、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞である、[61]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[63]前記対象がヒトである、[58]から[62]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[64]前記がんが、シグレック6を発現するがんである、[58]から[63]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[65]前記がんが白血病である、[58]から[64]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[66]前記がんが、原発性急性骨髄球性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、MALTリンパ腫、クローン性マスト細胞疾患又は胸腺腫である、[58]から[65]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[67]上記がんがAMLである、[58]から[66]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[68]がんを処置する上記方法が、前記免疫細胞による前記がんのがん幹細胞の除去を含む、[58]から[67]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[69]前記がん幹細胞が、CD45dim細胞、好ましくはCD45dimCD34+細胞、最も好ましくはCD45dimCD34+CD38-細胞である、[68]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[70]がんを処置する上記方法が、前記免疫細胞による非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を含まない、[58]から[69]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[71]前記がん幹細胞及び/又は前記非がん性造血幹若しくは前駆細胞の除去を監視する工程を更に含む、[68]から[70]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[72]がんを処置する上記方法が、後続の同種造血幹細胞移植を含まないか、又は上記対象が、同種造血幹細胞移植後に上記がんの再発を有する対象である、[58]から[71]のいずれか記載に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[73]上記方法が、上記免疫細胞若しくは上記医薬組成物の投与後及び/又は上記免疫細胞若しくは上記医薬組成物による治療の終了後の更なる化学療法を含まない、[58]から[72]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[74]がんを処置する上記方法が、処置後に前記免疫細胞の枯渇を含まない、[58]から[73]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[75]上記方法が、
1)上記対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、その後、
2)上記免疫細胞又は上記医薬組成物を上記対象に投与する工程と
を含む、[58]から[74]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[76]シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、工程2)において投与される、[75]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[77]上記方法が、
(i)CD70に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなるCD70結合ポリペプチド、或いは
(ii)(i)に記載のCD70結合ポリペプチド、及び/又は(i)に記載のCD70結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は(i)に記載のCD70結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む免疫細胞
による更なる治療を含み、
前記免疫細胞が、好ましくはT細胞、例えば、CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はNK細胞である、[58]から[76]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[78]上記CD70結合ポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなる、[77]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[79]上記方法が、
(i)TIM-3に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなるTIM-3結合ポリペプチド、或いは
(ii)(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチド、及び/又は(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞
による更なる治療を含み、
前記免疫細胞が、好ましくはT細胞、例えば、CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はNK細胞である、[58]から[78]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[80]上記TIM-3結合ポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなる、[79]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[1]シグレック6に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなる、シグレック6結合ポリペプチド。
[2]シグレック6に結合する抗体又はその断片を含むか又はこれからなる、[1]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[3]少なくとも二重特異性である、[1]又は[2]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[4]シグレック6に結合する第1の抗体又はその断片、及びシグレック6以外の標的に結合する第2の抗体又はその断片を含むか又はこれからなり、任意選択で、リンカーを介して相互に結合する、[2]又は[3]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[5]シグレック6に結合する上記抗体又はその断片が、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[2]から[4]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[6]免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞に結合可能な、[4]又は[5]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[7]CD3、例えば、CD3ゼータ又はCD3イプシロン、好ましくはCD3ゼータに更に結合する、[4]から[6]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[8]免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞を、その表面上にシグレック6を発現する標的細胞に動員可能な、[4]から[7]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[9]薬物にコンジュゲートする、[2]から[5]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[10]上記薬物がトキシンである、[9]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[11]シグレック6結合CARを含むか又はこれからなる、[1]又は[3]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[12]上記CARが、少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、[11]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[13]上記細胞外リガンド結合ドメインが、シグレック6結合エレメントを含む、[12]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[14]上記シグレック6結合エレメントが、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[13]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[15]上記細胞外リガンド結合ドメインが、スペーサードメイン、例えばCD8α、IgG3又はIgG4由来のスペーサードメインを含む、[12]から[14]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[16]上記膜貫通ドメインが、好ましくは、配列番号13に示すアミノ酸配列、又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表されるCD28膜貫通ドメインを含む、[12]から[15]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[17]上記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン及びCD3ゼータドメインを含み、上記共刺激ドメインが、好ましくは、CD28細胞質ドメイン又は4-1BB共刺激ドメインである、[12]から[16]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[18]上記共刺激ドメインが、CD28細胞質ドメインである、[17]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[19]上記CD28細胞質ドメインが、配列番号15に示すアミノ酸配列、又は配列番号15に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[17]又は[18]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[20]上記4-1BB共刺激ドメインが、配列番号17に示すアミノ酸配列、又は配列番号17に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[17]に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[21]上記CD3ゼータドメインが、配列番号19に示すアミノ酸配列、又は配列番号19に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、[17]から[20]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[22]配列番号27、29、31若しくは33のいずれか1つに示すアミノ酸配列、又は配列番号27、29、31若しくは33のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、[12]から[19]及び[21]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
[23][1]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
[24]配列番号26により表されるヌクレオチド配列、又は配列番号26に示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[23]に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
[25]配列番号28、30、32若しくは34のいずれか1つにより表されるヌクレオチド配列、又は配列番号28、30、32若しくは34のいずれか1つに示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[23]又は[24]に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
[26]上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'方向及び3'方向に隣接セグメントを更に含む、[23]から[25]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[27]5'方向の上記隣接セグメントが、左逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントであり、3'方向の隣接セグメントが、右逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントである、[26]に記載のポリヌクレオチド。
[28]上記左IR/DRセグメントが、配列番号43により表され、上記右IR/DRセグメントが、配列番号44により表される、[27]に記載のポリヌクレオチド。
[29]左IR/DRのヌクレオチド配列、シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び右IR/DRのヌクレオチド配列を含む、[23]から[28]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[30][23]から[29]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む、発現ベクター。
[31]非ウイルスベクター又はウイルスベクターである、[30]に記載の発現ベクター。
[32]非ウイルスベクターである、[31]に記載の発現ベクター。
[33]最小DNA発現カセットである、[32]に記載の発現ベクター。
[34]トランスポゾンドナーDNA分子である、[32]又は[33]に記載の発現ベクター。
[35]上記トランスポゾンドナーDNA分子が、Sleeping Beauty又はPiggyBacトランスポゾンドナーDNA分子である、[34]に記載の発現ベクター。
[36]ミニサークルDNAである、[32]から[35]のいずれか一項に記載の発現ベクター。
[37]ウイルスベクターである、[31]に記載の発現ベクター。
[38]レンチウイルス又はガンマ-レトロウイルスベクターである、[37]に記載の発現ベクター。
[39][11]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド、及び/又は[11]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は請求項[11]から[22]のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞。
[40]ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット及び/又はベクターが発現する、[39]に記載の免疫細胞。
[41]リンパ球である、[39]から[40]のいずれか一項に記載の免疫細胞。
[42]上記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、[41]に記載の免疫細胞。
[43]上記T細胞が、CD4+細胞又はCD8+細胞である、[42]に記載の免疫細胞。
[44]検出可能なマーカーを更に発現する、[39]から[43]のいずれか一項に記載の免疫細胞。
[45]ヒト細胞である、[39]から[44]のいずれか一項に記載の免疫細胞。
[46](a)対象の血液試料から免疫細胞を単離する工程と、
(b)[23]から[29]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は[30]から[38]のいずれか一項に記載の発現ベクターで免疫細胞に形質転換又は形質導入する工程と、
(c)任意選択で、形質転換又は形質導入した上記免疫細胞を精製する工程と
を含む、(組換え)免疫細胞を生成するための方法。
[47]工程(b)において、1)[23]から[29]のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む転位エレメント及び2)トランスポゼース(をコードするポリヌクレオチド)を使用して免疫細胞を形質転換する、[46]に記載の方法。
[48]上記トランスポゼースが、Sleeping Beautyトランスポゼース又はPiggyBacトランスポゼースである、[47]に記載の方法。
[49]上記Sleeping Beautyトランスポゼースが、配列番号45に示すアミノ酸配列により表される、[48]に記載の方法。
[50]上記転位エレメントを、上記トランスポゼースの作用により上記免疫細胞のゲノムに組み込む、[47]から[49]のいずれか一項に記載の方法。
[51]上記免疫細胞がリンパ球である、[46]から[50]のいずれか一項に記載の方法。
[52]上記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、[51]に記載の方法。
[53]上記T細胞が、CD4+細胞又はCD8+細胞である、[52]に記載の方法。
[54]上記対象がヒトである、[46]から[53]のいずれか一項に記載の方法。
[55][46]から[54]のいずれか一項に記載の方法により入手可能な、免疫細胞。
[56][39]から[45]又は[55]のいずれか一項に記載の複数の免疫細胞を含む、医薬組成物であって、複数の上記免疫細胞が、任意選択で、CD4+細胞及びCD8+細胞の混合物である、医薬組成物。
[57]医薬としての使用のための、[39]から[45]の若しくは[55]のいずれか一項に記載の免疫細胞又は[56]に記載の医薬組成物。
[58]対象に投与される、がんを処置する方法における使用のための、[39]から[45]の若しくは[55]のいずれか一項に記載の免疫細胞又は[56]に記載の医薬組成物。
[59]上記医薬組成物が静脈内に投与される、[57]又は[58]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[60]前記免疫細胞がリンパ球である、[57]から[59]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[61]前記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、[60]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[62]上記T細胞が、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞である、[61]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[63]前記対象がヒトである、[58]から[62]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[64]前記がんが、シグレック6を発現するがんである、[58]から[63]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[65]前記がんが白血病である、[58]から[64]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[66]前記がんが、原発性急性骨髄球性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、MALTリンパ腫、クローン性マスト細胞疾患又は胸腺腫である、[58]から[65]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[67]上記がんがAMLである、[58]から[66]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[68]がんを処置する上記方法が、前記免疫細胞による前記がんのがん幹細胞の除去を含む、[58]から[67]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[69]前記がん幹細胞が、CD45dim細胞、好ましくはCD45dimCD34+細胞、最も好ましくはCD45dimCD34+CD38-細胞である、[68]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[70]がんを処置する上記方法が、前記免疫細胞による非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を含まない、[58]から[69]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[71]前記がん幹細胞及び/又は前記非がん性造血幹若しくは前駆細胞の除去を監視する工程を更に含む、[68]から[70]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[72]がんを処置する上記方法が、後続の同種造血幹細胞移植を含まないか、又は上記対象が、同種造血幹細胞移植後に上記がんの再発を有する対象である、[58]から[71]のいずれか記載に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[73]上記方法が、上記免疫細胞若しくは上記医薬組成物の投与後及び/又は上記免疫細胞若しくは上記医薬組成物による治療の終了後の更なる化学療法を含まない、[58]から[72]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[74]がんを処置する上記方法が、処置後に前記免疫細胞の枯渇を含まない、[58]から[73]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[75]上記方法が、
1)上記対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、その後、
2)上記免疫細胞又は上記医薬組成物を上記対象に投与する工程と
を含む、[58]から[74]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[76]シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、工程2)において投与される、[75]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[77]上記方法が、
(i)CD70に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなるCD70結合ポリペプチド、或いは
(ii)(i)に記載のCD70結合ポリペプチド、及び/又は(i)に記載のCD70結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は(i)に記載のCD70結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む免疫細胞
による更なる治療を含み、
前記免疫細胞が、好ましくはT細胞、例えば、CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はNK細胞である、[58]から[76]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[78]上記CD70結合ポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなる、[77]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[79]上記方法が、
(i)TIM-3に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなるTIM-3結合ポリペプチド、或いは
(ii)(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチド、及び/又は(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞
による更なる治療を含み、
前記免疫細胞が、好ましくはT細胞、例えば、CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はNK細胞である、[58]から[78]のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
[80]上記TIM-3結合ポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなる、[79]に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
本明細書において詳細に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術的及び科学的用語は、がん免疫療法、遺伝子療法、免疫学、生物化学、遺伝学、及び分子生物学の分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
本明細書に記載のものと類似するか又は等価な全ての方法及び材料は、本明細書に記載の適する方法及び材料により、本発明の実践又は検査において使用することができる。
本発明の文脈において使用する「約」の用語は、「約」の用語に続く値が、+/-20%の範囲、好ましくは+/-15%の範囲、より好ましくは+/-10%の範囲内で変動し得ることを意味する。
本明細書において引用する全ての出版物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込む。本明細書において言及する参考文献は、角括弧の参照番号により(例えば、「[31]」又は「[31]を参照」のように)示し、これは、本明細書末の参考文献リストのそれぞれの参照を指す。矛盾する場合は、定義を含む本明細書を、引用した参考文献より優先する。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、他に特定しない限り、制限することは意図しない。
本明細書において使用する場合、「含む(comprising又はcomprises)」のような用語がそれぞれ出現した場合、任意選択で、「からなる(consisting of又はconsists of)」と置換し得る。
シグレック6結合ポリペプチド
本発明は、シグレック6に結合する抗体若しくはその断片又はキメラ抗原受容体(CAR)、好ましくは、CARを含むか又はこれからなる、シグレック6結合ポリペプチドに関する。
本発明は、シグレック6に結合する抗体若しくはその断片又はキメラ抗原受容体(CAR)、好ましくは、CARを含むか又はこれからなる、シグレック6結合ポリペプチドに関する。
詳細には、シグレック6に結合する抗体又はその断片を含むか又はそれからなる、シグレック6結合ポリペプチドを提供する。
「抗体又はその断片」の用語は、例えば、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ヒト化及びヒト抗体を含む。これは、例えば、Fab断片、F(ab')2、Fv、scFv断片、又は単一ドメイン抗体、例えば、VHH、VH若しくはVL等の唯一の可変ドメインを含むドメイン抗体若しくはナノボディ、単一可変ドメイン抗体若しくは免疫グロブリン単一可変ドメインも含み、それらは、他の可変領域又はドメインとは独立的に抗原又はエピトープに特異的に結合する。その用語は、ダイアボディ又は二重親和性再標的化(DART)抗体も含む。(二重特異性)一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ(Tandab)、二重特異性T細胞誘導(BiTE)抗体及び三重特異性T細胞誘導抗体、例えば、ヘミボディ(hemibody)を更に想定する。そのような任意の抗体及びその断片、並びにそれらの生成は、当技術分野において一般に公知である。
好ましくは、シグレック6に結合する抗体又はその断片を含むか又はこれからなるポリペプチドは、少なくとも二重特異性である。しかし、多特異性、例えば、三重特異性又は四重特異性でもあり得る。二重特異性、三重特異性等は、ポリペプチドが2つ、3つ等の異なる標的抗原に同時に又は逐次的に結合可能であることを意味する。
従って、シグレック6結合ポリペプチドは、シグレック6に結合する第1の抗体又はその断片及びシグレック6以外の標的に結合する第2の抗体又はその断片を含むか又はそれからなってもよく、それらは、任意選択で、リンカーを介して相互に結合し得る。
シグレック6に結合する抗体又はその断片は、例えば、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、若しくは最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表すことができ、シグレック6結合能を有する。好ましくは、シグレック6に結合する抗体又はその断片は、配列番号25に示すアミノ酸配列により表される。
少なくとも二重特異性のシグレック6結合ポリペプチドは、好ましくは免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞に結合可能である。しかし、他の免疫細胞、例えばマクロファージへの結合も包含する。
従って、少なくとも二重特異性のシグレック6結合ポリペプチドは、好ましくは(ヒト)CD3、例えば、CD3イプシロン又はCD3ゼータ、好ましくは、CD3ゼータに更に結合する。CD3は、T細胞上で発現し、T細胞受容体の部分を形成する。従って、二重特異性ポリペプチドは、シグレック6と例えば、CD3とに同時に結合させることにより、シグレック6を表面に発現する標的細胞に、エフェクター細胞、例えば、T細胞又はNK細胞を動員することができる。ヒトCD3に対する抗体は、当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込む国際公開第2008/119567号における、CD3イプシロンのN末端アミノ酸1～27に対する抗体を参照されたい。
従って、少なくとも二重特異性のシグレック6結合ポリペプチドにより、好ましくは免疫細胞、例えばT細胞、NK細胞、好ましくはT細胞を、シグレック6を表面上に発現する標的細胞に動員することが可能である。
別の実施形態では、シグレック6結合ポリペプチドは、別の化合物、例えば、検出可能なマーカー又は薬物にコンジュゲートする。この実施形態では、ポリペプチドは、薬物にコンジュゲートすることが好ましい。薬物は、例えばトキシンであり得る。トキシンは、好ましくはシグレック6を表面上に発現する標的細胞を殺傷することが可能である。そのようなトキシンの例としては、マイタンシン、アウリスタチン、タキソイド及びPNUアントラサイクリンが挙げられる。
好ましい実施形態では、シグレック6結合ポリペプチドは、キメラ抗原受容体(CAR)である。CARは、細胞の表面上に発現可能であり、例えば、別の細胞の表面上に発現する、リガンドに結合可能な受容体である。これにより受容体は、リガンドを表面上に発現する標的細胞への、受容体を発現する細胞の動員を引き起こし得る。その上、任意選択で、CARは、リガンドへの結合時に、発現する細胞において細胞内シグナルを伝達することができる。従って、例えば、CARはT細胞上で発現し、そのリガンドへの結合時には、T細胞を活性化し得る。
従って、より特定の実施形態では、CARは、少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、その細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、シグレック6結合エレメントを含む。細胞外ドメインは、スペーサードメイン、例えば、CD8α、IgG3又はIgG4由来のスペーサードメインを更に含み得る。膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインを含み得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン及びCD3ゼータ(CD3ζ)ドメインを含み得る。
本発明のある実施形態では、シグレック6結合エレメントは、配列番号25に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表され、シグレック6結合能を有する。好ましくは、シグレック6結合エレメントは、配列番号25に示すアミノ酸配列により表される。
本発明のある実施形態では、スペーサードメインは、配列番号9又は11に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表される。好ましくは、スペーサードメインは、配列番号9又は11に示すアミノ酸配列により表される。スペーサーは、細胞外標的及び膜貫通ドメインに結合する。これは、シグレック6結合エレメントの可動性に影響し、CARからリガンドへの空間的制約を低減し、従って、エピトープの結合に影響を及ぼす。膜遠位でのエピトープへの結合では、短いスペーサードメインを有するCARを必要とすることが多く、細胞表面に近位のエピトープへの結合では、長いスペーサーを有するCARを必要とすることが多い。
本発明のある実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号13に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表される。好ましくは、膜貫通ドメインは、配列番号13に示すアミノ酸配列により表される。CD28膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスからなり、細胞の膜を横切り、CARを細胞表面に固定する。これは、細胞表面上でのCARの発現に影響を及ぼす。
本発明のある実施形態では、シグレック6-CARポリペプチドの共刺激ドメインは、CD28細胞質ドメイン又は4-1BB共刺激ドメインである。
本発明のある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28細胞質ドメイン及びCD3ゼータドメインを含む。本発明の別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BB共刺激ドメイン及びCD3ゼータドメインを含む。
本発明のある実施形態では、CD28細胞質ドメインは、配列番号15に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表される。好ましくは、CD28細胞質ドメインは、配列番号15に示すアミノ酸配列により表される。CD28細胞質ドメインは、共刺激ドメインであり、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。
本発明のある実施形態では、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号17に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表される。好ましくは、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号17に示すアミノ酸配列により表される。
本発明のある実施形態では、CD3ゼータドメインは、配列番号19に示すアミノ酸配列との少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列により表される。好ましくは、CD3ゼータドメインは、配列番号19に示すアミノ酸配列により表される。CD3ゼータドメインは、T細胞活性化において下流のシグナル伝達を媒介する。これは、T細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに由来し、ITAM(免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ)を含む。
本発明のある実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号35又は37に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、細胞外ドメインは、配列番号35又は37に示すアミノ酸配列を含む。より好ましくは、細胞外ドメインは、配列番号35又は37に示すアミノ酸配列からなる。
本発明のある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号39又は41に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号39又は41に示すアミノ酸配列を含む。より好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号39又は41に示すアミノ酸配列からなる。
従って、前記細胞外ドメインは、配列番号35若しくは37に示すアミノ酸配列、又は配列番号35若しくは37に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、前記膜貫通ドメインは、配列番号13に示すアミノ酸配列、又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号39若しくは41に示すアミノ酸配列、又は配列番号39若しくは41に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本発明の好ましい一実施形態では、シグレック6-CARポリペプチドは、配列番号27、29、31又は33のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、シグレック6-CARポリペプチドは、配列番号27、29、31又は33のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む。より好ましくは、シグレック6-CARポリペプチドは、配列番号27、29、31又は33のいずれか1つに示すアミノ酸配列からなる。
特定の配列番号との%配列同一性により定義するバリアントエレメントを含むシグレック6結合CARに関する実施形態では、CARは、理想的には、シグレック6結合CARとして機能する能力(例えば、リガンド結合及び/又はリンパ球活性化を含む)を保持し、シグレック6結合CARとして機能する能力は、理想的には、同一配列のCARに関して少なくとも同一であるが、ここで当該のエレメントは、差異なく、配列番号により表される。例えば、CARが配列番号11との少なくとも90%の配列同一性を有するスペーサードメインを含む場合、CARは、理想的には、配列番号11により表されるスペーサー以外の同一配列のCARと同一の(即ち、差異なく)シグレック6結合CARとして機能する能力を有する。
また、CARポリペプチドは、2つ以上の標的に対して特異的であり得る。従って、本発明では、その少なくとも1つがシグレック6に結合する少なくとも2つの結合エレメントを含み、及び/又はシグレック6に結合するように切換/プログラムすることができる切換可能/プログラム可能結合ドメインである少なくとも1つの結合エレメントを含む、CARを含むか又はこれからなるシグレック6結合ポリペプチドも提供する。
シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、上に定義する本発明のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットに関する。
本発明は、上に定義する本発明のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットに関する。
本発明のある実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、左及び右逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントと更に隣接する。5'方向の隣接セグメントは、左逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントにより表され、3'方向の隣接セグメントは、右逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントにより表される。
左IR/DRセグメントのヌクレオチド配列及び右IR/DRセグメントのヌクレオチド配列は、トランスポゼースタンパク質により認識され得る。トランスポゼースは、特には制限されず、例えば、Sleeping Beautyトランスポゼース又はPiggyBacトランスポゼースであり得る。
好ましくは、左IR/DRセグメントは、配列番号43に示すヌクレオチド配列に対する少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%、又は更には100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。同様に、右IR/DRセグメントは、配列番号44に示すヌクレオチド配列に対する少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%、又は更には100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
「～と隣接する」の用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'領域及び3'領域に更なるヌクレオチドが存在し、これらが全て同一ポリヌクレオチド上に位置することを示す。従って、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、IR/DR配列、即ち、隣接セグメントと隣接し、このため、トランスポゼースの存在により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド並びに隣接セグメントに対応するヌクレオチド配列の、トランスフェクト細胞のゲノムへの組込みが可能となる。ある態様では、ゲノムに組み込むポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び任意選択の検出可能なマーカー遺伝子、例えばEGFRtマーカーを含み、隣接セグメントと隣接する。この態様では、ポリペプチドのコード領域に対応するヌクレオチド配列及びEGFRtマーカーの領域は、参照セグメントを表すと考える。
本発明において使用する場合、「と隣接する」の用語は、隣接セグメントと参照セグメントとの間の距離が、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400、300bp、200bp、100bp、50bp、20bp未満又は10bp未満であることも意味する。
この点に関しては、参照セグメントは、ゲノムに組み込むポリヌクレオチドのコード領域に対応する領域である。トランスフェクト細胞のゲノムに組み込むポリヌクレオチドの全体構造は、次の通りであり得る(5'から3'方向):[左IR/DR配列]-[参照セグメント]-[右IR/DR配列]。
隣接セグメントと参照セグメントとの間の距離は、左IR/DR配列の3'末端と参照セグメントの5'末端との間のヌクレオチドを計数することにより決定し得る。同様に、隣接セグメントと参照セグメントとの間の距離は、参照セグメントの3'末端と右IR/DR配列の5'末端との間の距離を計数することにより決定し得る。両方の距離は、参照セグメントを隣接セグメント間の中心に置くように同一であってもよく、又はこの距離は異なってもよい。
左IR/DR配列の3'末端と参照セグメントの5'末端との間の距離は、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp未満又は100bp未満であり得る。
参照セグメントの3'末端と右IR/DR配列の5'末端との間の距離は、200bp、100bp、50bp、20bp未満又は10bp未満であり得る。
本発明の例となる実施形態では、左IR/DR配列の3'末端と参照セグメントの5'末端との間の距離は、700bp未満であってもよく、参照セグメントの3'末端と右IR/DR配列の5'末端との間の距離は、10bp未満であり得る。
本発明の例となる実施形態では、左IR/DR配列の3'末端と参照セグメントの5'末端との間の距離は、600bp超及び700bp未満であってもよく、参照セグメントの3'末端と右IR/DR配列の5'末端との間の距離は、5bp超及び10bp未満であり得る。
ある態様では、ゲノムに組み込むポリヌクレオチドは、シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び検出可能なマーカー遺伝子、例えばEGFRtマーカーを含み、隣接セグメントと隣接する。この態様では、シグレック6結合ポリペプチドのコード領域に対応するヌクレオチド配列及びEGFRtマーカーの領域は、参照セグメントを表すと考える。
ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号26により表される配列、又は配列番号26に示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の配列同一性、例えば少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。本発明のポリヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号26により表されるヌクレオチド配列を含む。
従って、本発明の関連実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号28、30、32又は34のいずれか1つに示すヌクレオチド配列に対する少なくとも90%、好ましくは95%、より好ましくは97%、又は最も好ましくは99%、又は更には100%の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列に関する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号28、30、32又は34のいずれか1つに示すヌクレオチド配列を含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号28、30、32又は34のいずれか1つに示すヌクレオチド配列からなり得る。
発現ベクター
本発明は、本明細書に定義する本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターに関する。
本発明は、本明細書に定義する本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターに関する。
ポリペプチドの広範な発現ベクターが、当技術分野において公知であり、本明細書において更に詳述する。例えば、本発明の一部の実施形態では、発現ベクターは、非ウイルス又はウイルスベクターであり、医学的目的の文脈では、好ましくは非ウイルスベクターである。
発現ベクターは、最小DNA発現カセットであり得る。その上、発現ベクターは、DNA発現ベクター、例えば、プラスミド、直鎖状発現ベクター又はエピソームであり得る。特定の態様では、ベクターは、更なる配列、例えば、ポリペプチドの発現を容易とする配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリAシグナル及び/又は1つ若しくは複数のイントロンを含む。特定の態様では、発現ベクターはトランスポゾンドナーDNA分子、好ましくはミニサークルDNAであり得る。
また、本発明は、本明細書に定義する本発明のポリヌクレオチドを含むミニサークルDNAに関する。本明細書において使用する場合、「ミニサークルDNA」の用語は、細菌の複製起点及び抗生物質耐性遺伝子を欠くスーパーコイルDNA分子であるベクターを指す。従って、これらは主に、真核生物発現カセットからなる。
有用なある実施形態では、本発明のミニサークルDNAは、トランスポゼースタンパク質又はトランスポゼースタンパク質をコードする核酸(例えば、DNA又はmRNA)(例えば、Sleeping Beauty又はPiggyBac)と併用して、電気泳動転写、例えば、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション;リポフェクタミン、フュージーン(fugene)、リン酸カルシウムのような物質を用いた化学導入;ナノ粒子、又は細胞への物質の導入に適する他の任意の考え得る方法により細胞に導入する。
ウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであり得る。このようなベクター及びそれらの構築及び生成は、当技術分野において一般に公知である。
ポリヌクレオチド又は発現ベクターは、適する任意の手段、例えば、トランスフェクション又は形質導入により免疫細胞に導入することができる。トランスフェクションは、例えば電気泳動転写、例えば、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション;リポフェクタミン、フュージーン、リン酸カルシウム、PEIのような物質を用いた化学導入による、細胞への化学的又は物理的送達を指す。形質導入は、ウイルスベクター又はナノ粒子による送達を含む、細胞への(標的化)送達の他の手段を指す。しかし、本発明は、免疫細胞への遺伝子物質の特定の任意の送達方法に制限されず、このため、本発明の文脈では、細胞への遺伝子物質の導入に適する他の任意の考え得る方法も使用することができる。
免疫細胞
また、本発明は、本明細書に定義する本発明のポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット及び/又は発現ベクターを含む、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)に関する。
また、本発明は、本明細書に定義する本発明のポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット及び/又は発現ベクターを含む、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)に関する。
また、本発明は、本明細書に定義する本発明のポリペプチドを含む、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)に関する。
また、本発明は、本明細書に定義する本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)に関する。
また、本発明は、本明細書に定義する本発明の発現ベクターを含む、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)に関する。
免疫細胞は、組換え免疫細胞であり得る。「組換え免疫細胞」は、そのように修飾せずには同一細胞に含まれない分子、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド、特には、ポリヌクレオチドを含むように修飾した免疫細胞、例えば、(ヒト)対象から得られる天然免疫細胞を指す。
免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを発現することも可能である。これにより、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるシグレック6結合ポリペプチドが翻訳されて、免疫細胞の細胞膜に組み込まれる。
シグレック6結合ポリペプチドの発現により、本発明の免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)が、白血病細胞を含むシグレック6抗原を発現する標的細胞に対する特異的反応性を得ることが可能となる。そのような免疫細胞、例えば、シグレック6 CAR-T細胞は、白血病細胞、より詳細には、AML、CLL、MALTリンパ腫、クローン性マスト細胞疾患細胞又は胸腺腫を認識して(抗原特異的に)根絶することが可能である。そのような細胞は、増殖して、シグレック6抗原との遭遇後に免疫応答を誘導することが可能である。
一部の有用な適用では、免疫細胞は、シグレック6以外の少なくとも1つの更なる標的に結合するように修飾することもできる。従って、本発明では、それぞれが別個の標的抗原を標的とし、それら標的抗原の少なくとも1つがシグレック6である、1つ、2つ又はそれ以上のCAR構築物、及び/又はそのようなCARをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又はそのようなCARをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞をも提供する。
また、本発明は、それらの少なくとも1つがシグレック6に結合する1つ、2つ又はそれ以上の結合エレメントを含む単一のCAR構築物、及び/又はこのようなCARをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又はそのようなCARをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞を提供する。
また、本発明では、少なくとも1つの結合ドメインが、シグレック6に結合するように切換/プログラムすることができる切換可能/プログラム可能結合ドメインである、CAR、及び/又はそのようなCARをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又はそのようなCARをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞を提供する。
免疫細胞は、好ましくはリンパ球、例えばT細胞又はNK細胞である。しかし、他の免疫細胞、例えばマクロファージも包含する。T細胞は特に好ましい。
本発明のある実施形態では、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)は、CD4+T細胞又はCD8+T細胞である。
本発明のある実施形態では、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)は、CD4+T細胞である。
本発明の実施形態では、免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)は、CD8+T細胞である。
本発明のある実施形態では、本発明の免疫細胞は、マーカー遺伝子、例えば、EGFRtマーカーを細胞表面上に更に発現し得る。EGFRtマーカーを使用して、本発明の免疫細胞を検出、追跡、選択及び枯渇させることができる。従って、免疫細胞投与後の製剤持続性の解析が利用可能となる。その上、EGFRtマーカーによって、本発明の免疫細胞が、抗体セツキシマブによりADCC/CDCに対して感受性となり、このため、この抗体を安全スイッチとして使用することができる。
本発明に使用し得るEGFRtのアミノ酸配列は、配列番号23により表される。
本発明のある実施形態では、免疫細胞は、哺乳動物、好ましくはヒトに由来する免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)から得られる(又は得ている)。好ましくは、免疫細胞は、シグレック6結合ポリペプチドを含むように修飾した後に免疫細胞により処置する対象から、例えば、本明細書に記載の方法により得られる(又は得ている)。或いは、シグレック6結合ポリペプチドを含むように修飾した免疫細胞は、健常(同種)ドナー、(自己又は同種)臍帯血単位又は誘導多能性幹細胞から得られる(又は得ている)。
免疫細胞を生成するための方法
また、本発明は、本明細書に定義する本発明の免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)を生成するための方法に関する。
また、本発明は、本明細書に定義する本発明の免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)を生成するための方法に関する。
本発明のある実施形態では、免疫細胞を生成するための方法は、(a)対象の(末梢)血液試料から免疫細胞を単離する工程と、(b)免疫細胞に上記のポリヌクレオチド又は発現ベクターを形質転換又は形質導入する工程と、その後任意選択で、(c)トランスフェクト又は形質導入した免疫細胞を精製する工程とを含む。この方法は、免疫細胞をヒト対象への投与に適する製剤に製剤化する工程を更に含み得る。
好ましくは、工程(b)では、免疫細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット及びトランスポゼースを含む転位エレメントを使用して形質転換する。
トランスポゼースは、更には制限されず、例えば、Sleeping Beautyトランスポゼース又はPiggyBacトランスポゼースであり得る。Sleeping Beautyトランスポゼースは、例えば、配列番号45に示すアミノ酸配列により表され得る。
転位エレメントは、好ましくは、トランスポゼースの作用により免疫細胞のゲノムに組み込む。
ある実施形態では、免疫細胞はリンパ球、より好ましくはT細胞又はNK細胞である。しかし、他の免疫細胞、例えばマクロファージも包含する。最も好ましくは、免疫細胞はT細胞である。
更なる実施形態では、T細胞は、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞である。
本発明の更なる実施形態では、血液試料は、ヒト対象、好ましくはがんと診断された、好ましくは白血病、例えばAMLと診断されたヒト対象から得られる(又は得ている)。
別の実施形態では、本明細書に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードする発現ベクターを対象に投与する工程(in vivoでの導入)を含む、免疫細胞を生成するための方法を本発明において提供する。例えば、すべてを参照により組み込む参考文献[38]～[40]を参照されたい。好ましくは、in vivoでの遺伝子導入のための発現ベクターは、ヒト免疫細胞(好ましくはT細胞)に形質導入するように偽型化したレンチウイルスベクター、又はヒト免疫細胞(好ましくはT細胞)への非ウイルスベクターの送達に適する非ウイルスベクターを含むナノ粒子である。
また、本発明は、上記の方法により入手可能な免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)又は免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)の製剤化に関する。
医薬組成物
また、本発明は、本明細書に記載する複数の免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体を更に含み得る。医薬組成物は、任意選択で、種々の細胞の混合物、例えば、CD4+及びCD8+T細胞の混合物を含み得る。
また、本発明は、本明細書に記載する複数の免疫細胞(好ましくはリンパ球、より好ましくはT細胞)を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体を更に含み得る。医薬組成物は、任意選択で、種々の細胞の混合物、例えば、CD4+及びCD8+T細胞の混合物を含み得る。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は、NaCl、グルコース及びヒト血清アルブミンを0.45%、2.5%及び1%の量でそれぞれ含む輸液として製剤化し得る。
医学的使用
また、本発明は、医薬としての使用のための本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物に関する。
また、本発明は、医薬としての使用のための本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物に関する。
本発明のある実施形態では、免疫細胞又は医薬組成物は、がんを処置する方法における使用のためのものであり、前記方法では、本発明の免疫細胞又は医薬組成物は、(それを必要とする)対象、好ましくはヒト対象に投与される。
また、本発明は、本発明の免疫細胞又は医薬組成物を対象、好ましくはヒト対象に投与する工程を含む、がんを処置する方法に関する。
本発明のある実施形態では、免疫細胞又は医薬組成物は、静脈内に投与される。
本発明のある実施形態では、がんは、シグレック6を発現するがん、即ち、シグレック6タンパク質を細胞表面上に発現及び呈示する異常細胞に起因するがんである。好ましくは、がんは白血病、例えばAML若しくはCLL、MALTリンパ腫又はクローン性マスト細胞疾患及び固形腫瘍、例えば胸腺腫からなる群から選択される。好ましくは、がんは白血病、例えばAML又はCLL、最も好ましくはAMLである。
がんを処置する方法(における使用)は、好ましくは、前記免疫細胞による前記がんのがん幹細胞の除去を含む。そのようながん幹細胞は、好ましくは白血病幹細胞、例えばAML幹細胞である。がん幹細胞は、腫瘍形成能の増強、並びに/又は自己再生及び分化の能力、並びに/又はそれらを非がん幹細胞から識別するために決定可能な表現型、機能性及び/若しくは遺伝子的特徴を有するがん細胞のサブセットとして定義する。
また、がんを処置する方法(における使用)は、好ましくは、前記免疫細胞による非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を含まない。造血幹又は前駆細胞は、CD34+細胞として同定することができる。造血幹細胞は、典型的にはCD38-であり、造血前駆細胞は、典型的にはCD38+である。非がん性造血幹又は前駆細胞は、典型的にはCD45+である。
これを考慮すると、がんを処置する方法(における使用)は、前記がん幹細胞及び/又は前記非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を監視する工程を更に含み得る。
従って、がんを処置する方法(における使用)は、前記がん幹細胞の除去を監視する工程を含み得る。
がんを処置する方法(における使用)は、前記非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を監視する工程を含み得る。
がんを処置する方法(における使用)は、前記がん幹細胞及び前記非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を監視する工程を更に含み得る。
がん幹細胞及び/又は非がん性造血幹若しくは前駆細胞の除去は、例えば、微小残存病変(MRD)解析のための高分解能フローサイトメトリーを含む、フローサイトメトリー解析を含む骨髄解析及び他の表現型決定方法、並びに次世代シーケンシング及び他の遺伝子型決定方法により、監視することができる。また、がん幹細胞及び/又は非がん性造血幹若しくは前駆細胞の除去は、血球数及び血球百分率数を含む末梢血解析、並びに液体生検及び他の遺伝子型決定方法により監視することができる。
フローサイトメトリーによりAML LCSを同定するために典型的に使用される表現型マーカーは、CD45、CD34及びCD38(AML LSC表現型:CD45dimCD34+CD38-)を含む。AML LSCを同定及び/又は特性決定するために使用されている更なる任意選択のマーカー(及び対応する表現型)は、HLA-DR(+)、CD25(+)、CD26(+)、CD32(+)、CD33(+)、CD36(+)、CD44(+)、CD45RA(+)、CD47(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD96(+)、CD99(+)、CD117(+)、CD123(+)、CD133(+)、CD135(+)、IL-1RAP(+)、CD184(+)、CD305(+)、CD366(+)、CD371(+)を含む[35、36、37]。CD45dimとなる細胞は、CD45の検出可能な表面発現が、CD45+として分類される細胞の発現よりも低いことを意味する。例えば、(CD45dim)がん幹細胞は、健常(CD45+)造血幹又は前駆細胞よりも低い(平均)CD45表面発現を有し得る。
その上、非がん性造血幹又は前駆細胞を除去しないことにより、修飾免疫細胞を使用した治療後に骨髄移植を実施する必要性を回避することができる。従って、一実施形態では、がんを処置する方法(における使用)は、同種造血幹細胞移植を含まない。
また、シグレック6結合ポリペプチドを含む免疫細胞による処置は、処置後に前記免疫細胞の枯渇を必要としない。従って、本発明では、処置後の免疫細胞の枯渇を含まない、本明細書に記載のがんを処置する方法(における使用)も提供する。
その上、一実施形態では、がんを処置する方法(における使用)は、更なる従来の化学療法を含まない。好ましくは、がんを処置する方法(における使用)は、免疫細胞若しくは医薬組成物の投与後及び/又は免疫細胞若しくは医薬組成物による治療の終了後の更なる化学療法を含まない。
従来の化学療法は、本明細書において使用する場合、処置する所与の異常細胞(例えば、がん細胞)を特異的に標的としない化学療法剤の治療的使用を指す。そのような化学療法剤としては、例えば、シタラビン及びダウノルビシンが挙げられる。従来の化学療法は、本明細書において使用する場合、所与の異常細胞(例えば、がん細胞)を更に特異的に標的とするのに使用する標的療法は指さない。そのような標的療法としては、例えばブルトンチロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、例えばイブルチニブ、又はfms様チロシンキナーゼ3(FLT3)阻害剤、例えばミドスタウリン、又はエピジェネティック療法、例えば低メチル化剤(DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤)、例えば5-アザシチジン(Azacitidin)の投与が挙げられる。そのような標的及び/又はエピジェネティック療法は、シグレック6結合ポリペプチドを含む免疫細胞による併用又は維持療法としてのいずれかで使用することができる。
従って、がんを処置する方法(における使用)は、例えば、標的療法、例えばブルトンチロシンキナーゼ(BTK)阻害剤(例えばイブルチニブ)、又はfms様チロシンキナーゼ3(FLT3)阻害剤(例えばミドスタウリン)、又はエピジェネティック療法、例えば低メチル化剤(DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤)、例えば5-アザシチジンを、シグレック6結合ポリペプチドを含む免疫細胞による併用又は処置後の維持療法としてのいずれかで投与する工程を更に含む、併用療法であり得る。
シグレック6に結合する免疫細胞を使用する治療は、シグレック6を発現する標的細胞に対して最も有効である。従って、本発明では、(ヒト)対象由来のがん細胞の表面上でのシグレック6の発現レベルを決定する方法も提供する。この方法は、好ましくはin vitroでの方法である。これは、好ましくは、がんを有することが疑われるか又はがんを有すると診断された対象から得られた試料に対して実施する。例えば、試料は、処置するがんの(末梢)血液試料又は生検であり得る。
また、本発明では、(ヒト)対象由来のがん細胞の表面上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程を含む、がん、好ましくはAMLを診断する方法を提供する。方法は、好ましくはin vitroでの方法である。これは、好ましくは、がんを有すると疑われる対象から得られた試料に対して実施する。例えば、試料は処置するがんの(末梢)血液試料又は生検であり得る。
その上、一実施形態では、記載する処置の方法(における使用)は、処置前に、指定の標的細胞、例えば処置するがん、例えばAMLのがん細胞の表面上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程を更に含む。
シグレック6の発現レベルを決定する工程は、好ましくはin vitroで実施する。これは、好ましくは、処置する対象から得られた試料に対して実施する。例えば、試料は処置するがんの(末梢)血液試料又は生検であり得る。
がん(例えばAML)の生検は、例えば、骨髄生検又は(例えば細胞外AML発現の)組織生検であり得る。
その結果、ある実施形態では、記載する処置の方法(における使用)は、指定の標的細胞、例えば、がん(例えばAML)細胞がシグレック6を発現する場合にのみ、免疫細胞を投与する工程を更に含む。
従って、本発明では、
1)対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、
2)本発明の免疫細胞又は医薬組成物を前記対象に投与する工程と
を含む、がんを処置する方法であって、任意選択で、シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、免疫細胞又は医薬組成物を投与する、方法も提供する。
1)対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、
2)本発明の免疫細胞又は医薬組成物を前記対象に投与する工程と
を含む、がんを処置する方法であって、任意選択で、シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、免疫細胞又は医薬組成物を投与する、方法も提供する。
また、本発明では、
1)対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、
2)本発明の免疫細胞又は医薬組成物を前記対象に投与する工程と
を含む、対象におけるがんを処置する方法における使用のための免疫細胞又は医薬組成物であって、任意選択で、シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、免疫細胞又は医薬組成物を投与する、免疫細胞又は医薬組成物を提供する。
1)対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、
2)本発明の免疫細胞又は医薬組成物を前記対象に投与する工程と
を含む、対象におけるがんを処置する方法における使用のための免疫細胞又は医薬組成物であって、任意選択で、シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、免疫細胞又は医薬組成物を投与する、免疫細胞又は医薬組成物を提供する。
好ましくは、がんは白血病、例えばAML若しくはCLL、MALTリンパ腫又はクローン性マスト細胞疾患、好ましくはAML及びCLL、最も好ましくはAMLからなる群から選択される。
当業者は、シグレック6が所与の細胞上で発現するかどうかを判定するための適する基準を設定することができる。例えば、表面発現は、本明細書に記載のようにフローサイトメトリーにより決定することができる。簡潔には、細胞は、第1の試料において、シグレック6に対するモノクローナル抗体(mAb)を検出可能な(例えば蛍光)色素にコンジュゲートさせ、第2の試料において、アイソタイプ対照(即ち、使用するシグレック6 mAbと同一アイソタイプの、シグレック6を標的としない対照モノクローナル抗体)を同一の検出可能な色素にコンジュゲートさせることにより、2つの別々の試料において(表面)染色することができる。第1の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えば、平均蛍光強度、MFI)が、第2の試料の強度よりも高い場合、細胞は、シグレック6を発現するものとして分類することができる。第1の試料における検出可能な色素の検出可能な(例えば蛍光の)(平均)シグナルが、第2の試料のシグナルと同一であるか又はこれよりも低い場合、細胞は、シグレック6を発現しないものとして分類することができる。
例えば、第1の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えばMFI)割る、第2の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えばMFI)(例えば、抗シグレック6 mAbによる染色後に得られるMFIをアイソタイプ対照のMFIで割ることにより算出する正規化平均蛍光強度(NMFI))が1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5又は少なくとも2、好ましくは、少なくとも1.2よりも高い場合、細胞は、シグレック6を発現するものとして分類することができる。
また、第1の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えばMFI)を、第2の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えばMFI)で割ることにより得られる値(例えばNMFI)が、U937細胞を使用する(シグレック6 mAbで染色した)第1の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えばMFI)を、MOLM-13細胞を使用する(アイソタイプ対照で染色した)第2の試料における検出可能な色素の検出可能な(平均)強度(例えばMFI)で割ることにより得られる値(例えばNMFI)と少なくとも同一である場合、細胞は、シグレック6を発現するものとして分類することができる。
修飾T細胞を含む上記の医薬組成物は、2～8℃で保存する。医薬組成物は、製剤化後(少なくとも)48時間安定であり、この期間内に患者に投与するべきである。
本出願の実験の節において生成したシグレック6 CAR-T細胞は、本発明の非制限的な例示的実施形態に関連する。
材料及び方法
ヒト対象
ヒト末梢血(PB)T細胞は、健常ドナー(HD)及びAML患者の軟膜から得た。G-CSF動員PB CD34+細胞をHD PBから単離した。原発性AML骨髄(BM)及びPB、並びにCLL PB試料は、書面によるインフォームドコンセント後に得た。
ヒト対象
ヒト末梢血(PB)T細胞は、健常ドナー(HD)及びAML患者の軟膜から得た。G-CSF動員PB CD34+細胞をHD PBから単離した。原発性AML骨髄(BM)及びPB、並びにCLL PB試料は、書面によるインフォームドコンセント後に得た。
シグレック6結合CARポリペプチドの構造
シグレック6 CAR T細胞に含まれることが予想される遺伝子カセットの模式図を図6に示す。
シグレック6 CAR T細胞に含まれることが予想される遺伝子カセットの模式図を図6に示す。
また、シグレック6 CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む例となる遺伝子カセットは、CAR及びEGFRtの2つの別々のタンパク質への翻訳及び両タンパク質のT細胞表面上での化学量論的発現を確実とするようにT2AリボソームスキップエレメントによりCAR配列から分離した、任意選択の切断型上皮増殖因子受容体(EGFRt)配列を含む。
EGFRtタンパク質により、抗EGFRモノクローナル抗体セツキシマブ(商品名:アービタックス(登録商標))を使用するCAR陽性細胞の検出及び選択が可能となる。加えて、管理不能な毒性が生じる場合、EGFRtにより、セツキシマブによるEGFRtを発現する細胞の選択的枯渇の選択が可能となる。前臨床モデルでは、セツキシマブの投与により、EGFRtを発現するCAR-T細胞の枯渇がin vivoで数日以内に引き起こされることが実証された。
例となるCARの構造及びアミノ酸配列をTable A(表1)に示す。
CAR構築
JML-1mAbのVH及びVLセグメントを含むコドン最適化標的ドメイン(GeneArt ThermoFisher社、Regensburg、独国、配列番号25;コドン最適化DNA配列は配列番号26)を合成し、短鎖IgF4-Fcヒンジスペーサー、CD28膜貫通ドメイン、CD28又は4-1BB共刺激部分、及びCD3z(配列番号27又は29;配列番号28又は30のDNA配列)を含むCAR骨格に、T2Aエレメント及びEGFRt形質導入マーカーとともにインフレームで融合させた(図6A)[14～16]。導入遺伝子全体は、レンチウイルスベクターepHIV7内にコードされ、EF1/HTLVハイブリッドプロモーターの調節下で発現した[16]。CD28又は4-1BB共刺激部分を有するFLT3(クローン4G8)、CD19(クローンFMC63)及びCD123(クローン32716)タンパク質に特異的なCAR[14、15、17～19]をこの試験の対照に使用した。
JML-1mAbのVH及びVLセグメントを含むコドン最適化標的ドメイン(GeneArt ThermoFisher社、Regensburg、独国、配列番号25;コドン最適化DNA配列は配列番号26)を合成し、短鎖IgF4-Fcヒンジスペーサー、CD28膜貫通ドメイン、CD28又は4-1BB共刺激部分、及びCD3z(配列番号27又は29;配列番号28又は30のDNA配列)を含むCAR骨格に、T2Aエレメント及びEGFRt形質導入マーカーとともにインフレームで融合させた(図6A)[14～16]。導入遺伝子全体は、レンチウイルスベクターepHIV7内にコードされ、EF1/HTLVハイブリッドプロモーターの調節下で発現した[16]。CD28又は4-1BB共刺激部分を有するFLT3(クローン4G8)、CD19(クローンFMC63)及びCD123(クローン32716)タンパク質に特異的なCAR[14、15、17～19]をこの試験の対照に使用した。
原発性AML及びCLL細胞
AML患者のBM及びPBを処理して、密度勾配遠心分離(Biocoll(登録商標)、Merck Millipore社)を使用する単核細胞単離を行った。容量1mL未満の試料を直接処理して、赤血球溶解後のフローサイトメトリー解析を行った。可能な場合、この工程の直後に細胞毒性解析を実施するか、さもなければ細胞を凍結させて、実験を実施するまで-80℃に維持した。解凍した原発性AML細胞を、10%のヒト血清、2mMのグルタミン、100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、並びにIL-4(1000IU/mL)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)(10ng/mL)、幹細胞因子(5ng/mL)及び腫瘍壊死因子(TNF)-α(10ng/mL)を含むサイトカインカクテル(Miltenyi Biotec社、独国のサイトカイン)を追加したRPMI-1640中に維持した。新鮮な一次CLL試料をフローサイトメトリーにより解析し、その後、細胞を凍結させて細胞毒性アッセイを行った。
AML患者のBM及びPBを処理して、密度勾配遠心分離(Biocoll(登録商標)、Merck Millipore社)を使用する単核細胞単離を行った。容量1mL未満の試料を直接処理して、赤血球溶解後のフローサイトメトリー解析を行った。可能な場合、この工程の直後に細胞毒性解析を実施するか、さもなければ細胞を凍結させて、実験を実施するまで-80℃に維持した。解凍した原発性AML細胞を、10%のヒト血清、2mMのグルタミン、100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、並びにIL-4(1000IU/mL)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)(10ng/mL)、幹細胞因子(5ng/mL)及び腫瘍壊死因子(TNF)-α(10ng/mL)を含むサイトカインカクテル(Miltenyi Biotec社、独国のサイトカイン)を追加したRPMI-1640中に維持した。新鮮な一次CLL試料をフローサイトメトリーにより解析し、その後、細胞を凍結させて細胞毒性アッセイを行った。
腫瘍細胞株
ヒト腫瘍細胞株U937(ATCC CRL-1593.2)、MOLM13(ACC 554)、MV4;11(ACC 102)、K562(ACC 10)、TF-1(ACC 334)、Kasumi-1(ACC 220)を米国培養細胞系統保存機関(ATCC、米国)又はDSMZ(独国微生物及び細胞培養物保存機関、Braunschweig、独国)から購入した。細胞は、10%のウシ胎仔血清(FCS)、2mMのグルタミン及び100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを追加したRPMI-1640中で培養した。フローサイトメトリー及び生物発光イメージングによる細胞の検出を可能とするために、発明者らは、ホタルルシフェラーゼ(ffluc)_緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを全ての細胞株に形質導入し、FACS選別によりGFP+細胞を濃縮した後、in vitro又はin vivoでの試験に利用した。
ヒト腫瘍細胞株U937(ATCC CRL-1593.2)、MOLM13(ACC 554)、MV4;11(ACC 102)、K562(ACC 10)、TF-1(ACC 334)、Kasumi-1(ACC 220)を米国培養細胞系統保存機関(ATCC、米国)又はDSMZ(独国微生物及び細胞培養物保存機関、Braunschweig、独国)から購入した。細胞は、10%のウシ胎仔血清(FCS)、2mMのグルタミン及び100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを追加したRPMI-1640中で培養した。フローサイトメトリー及び生物発光イメージングによる細胞の検出を可能とするために、発明者らは、ホタルルシフェラーゼ(ffluc)_緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを全ての細胞株に形質導入し、FACS選別によりGFP+細胞を濃縮した後、in vitro又はin vivoでの試験に利用した。
K562/シグレック6を、K562細胞における完全長ヒトSIGLEC-6遺伝子のエレクトロポレーションにより生成した。このために、完全長シグレック6 DNA(配列番号46)をpT2HBベクター骨格にクローニングし、4Dヌクレオフェクター(Lonza社、スイス国)を使用してSB100×ミニサークルDNAベクターをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞は、APCコンジュゲート抗シグレック6 mAbで染色し、シグレック6陽性細胞をFACSに基づく細胞選別により濃縮した。
CAR修飾T細胞の生成及びin vitroでの解析
CAR修飾T細胞の調製、in vitroでのCAR-T機能の解析、及びコロニー形成アッセイをこれまでに記載のように実施した[14、15、17、19、20]。患者由来のCD4+及びCD8+T細胞を正の選択によりPBから単離してCARコードレンチウイルスを形質導入し、ビオチン化抗EGFR mAb(上記参照)及び抗ビオチンビーズ(Miltenyi社)を使用してCAR+T細胞を濃縮した後、急速増殖プロトコールを使用して増殖させた[15、20]。
CAR修飾T細胞の調製、in vitroでのCAR-T機能の解析、及びコロニー形成アッセイをこれまでに記載のように実施した[14、15、17、19、20]。患者由来のCD4+及びCD8+T細胞を正の選択によりPBから単離してCARコードレンチウイルスを形質導入し、ビオチン化抗EGFR mAb(上記参照)及び抗ビオチンビーズ(Miltenyi社)を使用してCAR+T細胞を濃縮した後、急速増殖プロトコールを使用して増殖させた[15、20]。
コロニー形成アッセイ
PB由来のG-CSF動員ヒトCD34+CD38-及びCD34+CD38+末梢血HSC/P細胞を5×103細胞/ウェルで二つ組のウェルに播種し、JML-1-CAR若しくはCD123-CAR T細胞又は非形質導入T細胞とともにE:T比=5:1でインキュベートした。24時間後、細胞懸濁液の5分の1を、6ウェルプレート(Smartdish(商標)プレート、StemCell Technologies社)内のメチルセルロースベースの培地(Methocult opti H4034、Stem Cell Technologies社、Cambridge、MA)上に播種した。製造者の指示に従って確立した基準を使用してコロニーを評価し、14日後に光学顕微鏡下で計数した。
PB由来のG-CSF動員ヒトCD34+CD38-及びCD34+CD38+末梢血HSC/P細胞を5×103細胞/ウェルで二つ組のウェルに播種し、JML-1-CAR若しくはCD123-CAR T細胞又は非形質導入T細胞とともにE:T比=5:1でインキュベートした。24時間後、細胞懸濁液の5分の1を、6ウェルプレート(Smartdish(商標)プレート、StemCell Technologies社)内のメチルセルロースベースの培地(Methocult opti H4034、Stem Cell Technologies社、Cambridge、MA)上に播種した。製造者の指示に従って確立した基準を使用してコロニーを評価し、14日後に光学顕微鏡下で計数した。
フローサイトメトリー解析
健常ドナー又はAML患者由来の単核細胞を次のコンジュゲートmAb:CD3、CD4、CD8、CD19、CD33、CD34、CD38、CD45、CD56、CD123、CD135(FLT3)、CD327(シグレック6)、CD371(CLL-1)の1つ又は複数とともに適合するアイソタイプ対照、及び生/死細胞識別のための7-AADで染色した(Miltenyi biotec社、Bergisch-Gladbach、独国; BD社、Heidelberg、独国;Biolegend社、London、英国)。CLL患者由来のPB単核細胞(PBMC)は、次のコンジュゲートmAb:CD5、CD10、CD19、CD20、CD27、CD38、CD327の1つ又は複数で染色した(Miltenyi biotec社、Bergisch-Gladbach、独国;BD社、Heidelberg、独国;Biolegend社、London、英国)。非形質導入又はCAR形質導入T細胞は、次のコンジュゲートmAb:CD3、CD4、CD8及び7-AADの1つ又は複数で染色した(Miltenyi biotec社/BD社/Biolegend社)。AF647にインハウスでコンジュゲートさせた(EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-SSBiotin、ThermoFisher Scientific社、IL;製造者の指示に従う)抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.社)を使用してCAR T細胞を検出した。細胞をFACSCanto(BD社)上で得てフローサイトメトリー解析を行い、データ解析は、FlowJoソフトウェアv9.0.2(Treestar社、Ashland、OR)を使用して実施した。原発性AML芽球は、CD45、CD34、CD38、CD123、CD33、FLT3、シグレック6、CLL-1及びCD117に対するmAbで染色した。LSCは、CD45dimCD34+CD38-細胞として同定した。正規化平均蛍光強度(NMFI)は、特定の(例えば抗シグレック6)mAbによる染色後にフローサイトメトリーにより得られたMFIを、アイソタイプ対照による染色後にフローサイトメトリーにより得られたMFIで割ることにより算出した。
健常ドナー又はAML患者由来の単核細胞を次のコンジュゲートmAb:CD3、CD4、CD8、CD19、CD33、CD34、CD38、CD45、CD56、CD123、CD135(FLT3)、CD327(シグレック6)、CD371(CLL-1)の1つ又は複数とともに適合するアイソタイプ対照、及び生/死細胞識別のための7-AADで染色した(Miltenyi biotec社、Bergisch-Gladbach、独国; BD社、Heidelberg、独国;Biolegend社、London、英国)。CLL患者由来のPB単核細胞(PBMC)は、次のコンジュゲートmAb:CD5、CD10、CD19、CD20、CD27、CD38、CD327の1つ又は複数で染色した(Miltenyi biotec社、Bergisch-Gladbach、独国;BD社、Heidelberg、独国;Biolegend社、London、英国)。非形質導入又はCAR形質導入T細胞は、次のコンジュゲートmAb:CD3、CD4、CD8及び7-AADの1つ又は複数で染色した(Miltenyi biotec社/BD社/Biolegend社)。AF647にインハウスでコンジュゲートさせた(EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-SSBiotin、ThermoFisher Scientific社、IL;製造者の指示に従う)抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.社)を使用してCAR T細胞を検出した。細胞をFACSCanto(BD社)上で得てフローサイトメトリー解析を行い、データ解析は、FlowJoソフトウェアv9.0.2(Treestar社、Ashland、OR)を使用して実施した。原発性AML芽球は、CD45、CD34、CD38、CD123、CD33、FLT3、シグレック6、CLL-1及びCD117に対するmAbで染色した。LSCは、CD45dimCD34+CD38-細胞として同定した。正規化平均蛍光強度(NMFI)は、特定の(例えば抗シグレック6)mAbによる染色後にフローサイトメトリーにより得られたMFIを、アイソタイプ対照による染色後にフローサイトメトリーにより得られたMFIで割ることにより算出した。
フローサイトメトリーによるシグレック6発現解析
シグレック6(CD327)の発現を、APCコンジュゲートマウス抗ヒトシグレック6 mAb(クローン767329、R&D Systems社、米国)又はREAfinity(商標)抗ヒトシグレック6(クローンREA852、Milteny biotec社、独国)及びマウスIgG1アイソタイプ対照(R&D Systems社、米国)又はREA Control Antibody (S), human IgG1(Milteny biotec社、独国)を使用して評価した。簡潔には、1×106細胞を洗浄し、PBS/0.5%ウシ胎仔血清100μLに再懸濁し、R&D systems社のmABを使用する場合、ヒトIgGにより4℃で20分間ブロッキングし(Jackson ImmunoResearch社、米国)、抗ヒトシグレック6 mAb又はアイソタイプにより4℃で30分間染色した。
シグレック6(CD327)の発現を、APCコンジュゲートマウス抗ヒトシグレック6 mAb(クローン767329、R&D Systems社、米国)又はREAfinity(商標)抗ヒトシグレック6(クローンREA852、Milteny biotec社、独国)及びマウスIgG1アイソタイプ対照(R&D Systems社、米国)又はREA Control Antibody (S), human IgG1(Milteny biotec社、独国)を使用して評価した。簡潔には、1×106細胞を洗浄し、PBS/0.5%ウシ胎仔血清100μLに再懸濁し、R&D systems社のmABを使用する場合、ヒトIgGにより4℃で20分間ブロッキングし(Jackson ImmunoResearch社、米国)、抗ヒトシグレック6 mAb又はアイソタイプにより4℃で30分間染色した。
U937異種移植モデルによるIn vivoでの実験
管轄する動物実験委員会により全てのin vivoでの実験は評価及び認可された。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj/SzJ(NSG)マウス(雌、6～8週齢)をCharles River社(Sulzfeld、独国)から購入した。マウスにffluc_GFP+ U937細胞2×106細胞を接種した。マウスは、種々の処置群にランダムに割り当て、CAR T細胞の分割投与戦略を使用して、6日目及び21日目に尾静脈を介する用量の投与により注射した。各用量は、T細胞5×106細胞(即ち、PBS/0.5%FCS 200μL中CD4+を2.5×106細胞及びCD8+を2.5×106細胞)を含んだ。PBを一定間隔で得て、腫瘍細胞及び導入T細胞の周波数を解析した。生物発光イメージング(BLI)は、Dルシフェリン基質(0.3mg/g体重)(Biosynth社、Staad、スイス国)の腹腔内投与後、IVIS Luminaイメージングシステム(PerkinElmer社、Waltham、Massachusetts)を使用して毎週実施した。生物発光画像は、Living Imageソフトウェア(PerkinElmer社)を使用して解析した。
管轄する動物実験委員会により全てのin vivoでの実験は評価及び認可された。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj/SzJ(NSG)マウス(雌、6～8週齢)をCharles River社(Sulzfeld、独国)から購入した。マウスにffluc_GFP+ U937細胞2×106細胞を接種した。マウスは、種々の処置群にランダムに割り当て、CAR T細胞の分割投与戦略を使用して、6日目及び21日目に尾静脈を介する用量の投与により注射した。各用量は、T細胞5×106細胞(即ち、PBS/0.5%FCS 200μL中CD4+を2.5×106細胞及びCD8+を2.5×106細胞)を含んだ。PBを一定間隔で得て、腫瘍細胞及び導入T細胞の周波数を解析した。生物発光イメージング(BLI)は、Dルシフェリン基質(0.3mg/g体重)(Biosynth社、Staad、スイス国)の腹腔内投与後、IVIS Luminaイメージングシステム(PerkinElmer社、Waltham、Massachusetts)を使用して毎週実施した。生物発光画像は、Living Imageソフトウェア(PerkinElmer社)を使用して解析した。
MOLM-13異種移植モデルによるin vivoでの実験
管轄する動物実験委員会により全てのin vivoでの実験は評価及び認可された。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj/SzJ(NSG)マウス(雌、6～8週齢)をCharles River社(Sulzfeld、独国)から購入した。マウスにffluc_GFP+ MOLM-13細胞1×106細胞を接種した。マウスは、種々の処置群にランダムに割り当て、CAR T細胞の分割投与戦略を使用して、4日目及び7日目に尾静脈を介する用量の投与により注射した。各用量は、T細胞5×106細胞(即ち、PBS/0.5%FCS 200μL中CD4+を2.5×106細胞及びCD8+を2.5×106細胞)を含んだ。PBを一定間隔で得て、腫瘍細胞及び導入T細胞の周波数を解析した。生物発光イメージング(BLI)は、Dルシフェリン基質(0.3mg/g体重)(Biosynth社、Staad、スイス国)の腹腔内投与後、IVIS Luminaイメージングシステム(PerkinElmer社、Waltham、Massachusetts)を使用して毎週実施した。生物発光画像は、Living Imageソフトウェア(PerkinElmer社)を使用して解析した。
管轄する動物実験委員会により全てのin vivoでの実験は評価及び認可された。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj/SzJ(NSG)マウス(雌、6～8週齢)をCharles River社(Sulzfeld、独国)から購入した。マウスにffluc_GFP+ MOLM-13細胞1×106細胞を接種した。マウスは、種々の処置群にランダムに割り当て、CAR T細胞の分割投与戦略を使用して、4日目及び7日目に尾静脈を介する用量の投与により注射した。各用量は、T細胞5×106細胞(即ち、PBS/0.5%FCS 200μL中CD4+を2.5×106細胞及びCD8+を2.5×106細胞)を含んだ。PBを一定間隔で得て、腫瘍細胞及び導入T細胞の周波数を解析した。生物発光イメージング(BLI)は、Dルシフェリン基質(0.3mg/g体重)(Biosynth社、Staad、スイス国)の腹腔内投与後、IVIS Luminaイメージングシステム(PerkinElmer社、Waltham、Massachusetts)を使用して毎週実施した。生物発光画像は、Living Imageソフトウェア(PerkinElmer社)を使用して解析した。
フローサイトメトリーに基づく細胞毒性アッセイ
原発性AML芽球及びCLL細胞に対するJML-1-CAR、FLT3-CAR、CD19-CAR又は非形質導入T細胞の細胞溶解活性をFACSに基づく細胞毒性アッセイにおいて解析した。T細胞及び一次細胞を、1ウェルあたり標的細胞104細胞を用いて10:1～2.5:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比で96ウェルプレートに播種した。共培養した細胞は、4又は24時間の共培養後に染色して、次のmAbによりフロー解析を行った。AML試料では、抗CD3/抗CD33/抗CD34/抗CD45/抗EGFRt mAb及びCLL試料では、抗CD3/抗CD5/抗CD20/抗CD19/抗CD45を使用してCAR T細胞及び標的細胞を区別した。7-AADを使用して生及び死細胞を識別した。残存生AML細胞の数を定量するために、123計数ビーズ(e-bioscience社、San Diego、CA)を製造者の指示に従って使用した。フロー解析は、FACS Canto II(BD社)上で行い、FlowJoソフトウェア(Treestar社)を使用してデータを解析した。
原発性AML芽球及びCLL細胞に対するJML-1-CAR、FLT3-CAR、CD19-CAR又は非形質導入T細胞の細胞溶解活性をFACSに基づく細胞毒性アッセイにおいて解析した。T細胞及び一次細胞を、1ウェルあたり標的細胞104細胞を用いて10:1～2.5:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比で96ウェルプレートに播種した。共培養した細胞は、4又は24時間の共培養後に染色して、次のmAbによりフロー解析を行った。AML試料では、抗CD3/抗CD33/抗CD34/抗CD45/抗EGFRt mAb及びCLL試料では、抗CD3/抗CD5/抗CD20/抗CD19/抗CD45を使用してCAR T細胞及び標的細胞を区別した。7-AADを使用して生及び死細胞を識別した。残存生AML細胞の数を定量するために、123計数ビーズ(e-bioscience社、San Diego、CA)を製造者の指示に従って使用した。フロー解析は、FACS Canto II(BD社)上で行い、FlowJoソフトウェア(Treestar社)を使用してデータを解析した。
統計学的解析
Prismソフトウェアv6.07(GraphPad社、San Diego、California)を使用して統計学的解析を実施した。Studentのt検定(独立)を使用してin vitro及びin vivoでの実験において得られたデータを解析した。In vivoでの実験において観察された生存率における差を、ログランク(Mantel-Cox)検定を使用して解析した。<0.05の差を有するP値を統計学的に有意であると考えた。
Prismソフトウェアv6.07(GraphPad社、San Diego、California)を使用して統計学的解析を実施した。Studentのt検定(独立)を使用してin vitro及びin vivoでの実験において得られたデータを解析した。In vivoでの実験において観察された生存率における差を、ログランク(Mantel-Cox)検定を使用して解析した。<0.05の差を有するP値を統計学的に有意であると考えた。
結果
JML-1-CAR T細胞によりシグレック6+AML細胞株が認識及び除去される
発明者らは、健常ドナー(HD)(n>5)からCD4+及びCD8+JML-1-CAR T細胞を生成した。この目的のために、発明者らは、完全ヒトJML-1-mAb10に由来し、それをCD3ζシグナル伝達ドメイン及びCD28又は4-1BB共刺激ドメインに連結する一本鎖可変断片(scFv)を使用した(図6A)。発明者らは、T細胞をレンチウイルスにより形質導入し(感染多重度=3)、CD4+JML-1-CAR T細胞では38.9～82.4%、CD8+JML-1-CAR T細胞では31.7～66.2%の形質導入効率を観察した(図6B～図6D)。JML-1-CAR T細胞の増殖及び機能性検査の前に、発明者らは、EGFRt選択マーカーを使用して濃縮工程を実施し、これにより収率>85%のCAR+T細胞が得られた(図6C～図6D)。CD4+及びCD8+JML-1-CAR T細胞は、ビーズ刺激及びレンチウイルス形質導入後にFLT3-CAR T細胞と同様に増殖した(図6E)。
JML-1-CAR T細胞によりシグレック6+AML細胞株が認識及び除去される
発明者らは、健常ドナー(HD)(n>5)からCD4+及びCD8+JML-1-CAR T細胞を生成した。この目的のために、発明者らは、完全ヒトJML-1-mAb10に由来し、それをCD3ζシグナル伝達ドメイン及びCD28又は4-1BB共刺激ドメインに連結する一本鎖可変断片(scFv)を使用した(図6A)。発明者らは、T細胞をレンチウイルスにより形質導入し(感染多重度=3)、CD4+JML-1-CAR T細胞では38.9～82.4%、CD8+JML-1-CAR T細胞では31.7～66.2%の形質導入効率を観察した(図6B～図6D)。JML-1-CAR T細胞の増殖及び機能性検査の前に、発明者らは、EGFRt選択マーカーを使用して濃縮工程を実施し、これにより収率>85%のCAR+T細胞が得られた(図6C～図6D)。CD4+及びCD8+JML-1-CAR T細胞は、ビーズ刺激及びレンチウイルス形質導入後にFLT3-CAR T細胞と同様に増殖した(図6E)。
次いで、発明者らは、シグレック6を安定に発現するようにK562細胞を改変し(K562/シグレック6、図7A)、天然K562(シグレック6陰性)及びK562/シグレック6細胞に対してJML-1-CAR T細胞による細胞表面シグレック6の特異的認識を確認した(図7B～図7E)。次いで、発明者らは、種々のAML細胞株上でのシグレック6発現を評価し、シグレック6発現レベルの可変性を観察した(非常に高～低、正規化MFI=8.22～1.12)(図1A、図8A)。次いで、発明者らは、AML細胞株U937及びTF-1(高発現)、MV4;11(中等度の発現)、MOLM-13(弱発現)並びにK562及びKasumi-1(無発現)を使用してCD8+JML-1-CAR T細胞によるシグレック6の認識を評価し、シグレック6陽性細胞株に対してJML-1_28z及びJML-1_BBzの両CAR T細胞による高レベルの特異的細胞溶解活性を確認した(図1B、図8B)。注目すべきことには、特異的溶解及び溶解動態は、標的細胞上の抗原密度と相関した(R2=0.57、p=0.01)(図1A～図1B、図2C、図8A～図8B)。注目すべきは、これまでの研究に基づいて、発明者らは、類似的に設計し機能的に最適なFLT3 CAR(CD28z)をアッセイの対照として選択した。CD4+及びCD8+の両JML-1-CAR T細胞は、シグレック6陽性AML細胞株との共培養後に、高レベルのエフェクターサイトカイン(即ち、IFN-γ及びIL-2)を産生し、生産的増殖を起こしたが、対照T細胞において並びに抗原陰性細胞株K562及びKasumi-1への曝露後には、発明者らは、バックグラウンドの反応性を観察したのみであった(図1C～図1D、図8C～図8D)。
まとめると、CD28又は4-1BB共刺激ドメインを有するJML-1-CARを発現するT細胞が、in vitroでAML細胞株に対する抗原特異的で強力な抗白血病反応性を示すことが、データにより示される。
シグレック6は、AML白血病幹細胞を含む原発性AML芽球上で高度かつ均一に発現する/JML-1-CAR T細胞により原発性AML細胞がin vitroで認識及び除去される
発明者らは、成人AML患者n=10由来の原発性AML芽球上でのシグレック6発現を評価した。この患者コホートは、AML、再発/不応性AML及び続発性AMLと新たに診断された患者を含んだ。更に、患者コホートは、患者及び種々の分子的かつ細胞遺伝学的異常を有するAMLを含んだ(Table-1(表2))。発明者らは、それぞれの患者において(10/10)、シグレック6がAML芽球上で均一に発現することを見出し、正規化MFIに基づく発現レベルに従って患者を順位付けした(図2A、Table-1(表2))。
発明者らは、成人AML患者n=10由来の原発性AML芽球上でのシグレック6発現を評価した。この患者コホートは、AML、再発/不応性AML及び続発性AMLと新たに診断された患者を含んだ。更に、患者コホートは、患者及び種々の分子的かつ細胞遺伝学的異常を有するAMLを含んだ(Table-1(表2))。発明者らは、それぞれの患者において(10/10)、シグレック6がAML芽球上で均一に発現することを見出し、正規化MFIに基づく発現レベルに従って患者を順位付けした(図2A、Table-1(表2))。
興味深いことには、発明者らは、それぞれの患者において、AML白血病幹細胞(LSC)の亜集団上での均一なシグレック6発現も見出した。更により興味深いことには、シグレック6の発現レベルは、AML芽球の「バルク」集団と比較して、AML LSCの亜集団において類似するか又は更に高かった(図2A、Table-1(表2)、図9A)。また、発明者らは、同一患者における多様なAML芽球集団にわたってシグレック6発現を検出した。これは、シグレック6の標的化により、AML芽球の完全かつ決定的除去が引き起こされることを示し、これにより、有効かつ更には潜在的に治癒的な処置がもたらされる(図9B)。
原発性「バルク」AML芽球及びAML白血病幹細胞の認識を評価するために、発明者らは、健常ドナーから得られたCD8+JML-1-CAR T細胞により細胞溶解実験を実施した。発明者らは、原発性「バルク」AML芽球及びAML白血病幹細胞に対するJML-1-CAR T細胞による高レベルの細胞溶解活性を観察した(図2A、図2B及びTable-1(表2))。重要なことには、白血病幹細胞が従来の抗AML処置に対するより強い内因的耐性を有することがわかっていても、発明者らは、JML-1-CAR T細胞による「バルク」AML芽球及びAML LSCの細胞溶解が類似し、AML白血病幹細胞が急速に除去されることを観察した。CD28対4-1BB共刺激ドメインを有するJML-1-CAR T細胞(JML-1_28z及びJML-1_BBz CAR-T細胞)の、AML LSCに対する細胞溶解活性は、同様に強力であった(図2A)。
まとめると、種々のAML疾患亜型を有する患者の原発性AML芽球において、シグレック6が高度かつ均一に発現することが、データにより示される。また、AML LSCにおいて、シグレック6が高度に発現し、この発現レベルは、「バルク」AML芽球集団と比較して類似するか又は更に高いことが、データにより示される。シグレック6の標的化により、特異的かつ強力な抗AML活性が付与され、JML-1-CAR T細胞の例では、バルクAML芽球及びAML白血病幹細胞の特異的かつ強力な除去が引き起こされることが、データにより更に示される。
患者由来JML-1 CAR-T細胞により自己AML芽球が強力に除去される
次いで、発明者らは、新たに診断されたAML(n=2)及びこれまでに処置したAML(MRD+、n=1)を有するAML患者からJML-1-CAR T細胞を生成し、自己AML芽球に対するそれらの抗白血病活性を評価した。発明者らは、CD4+T細胞では24.9～50.0%及びCD8+T細胞では20.4～43.0%の形質導入効率を観察し、濃縮細胞では、CAR+T細胞が>95%であった(図10A)。患者由来のCD4+及びCD8+JML-1-CAR T細胞は、培養から12日以内に40～60倍に増殖し(図10B)、in vitroでシグレック6陽性細胞株に対する強力な抗白血病反応性を示した(図10C～図10E)。自己白血病芽球と共培養した場合、JML-1-CAR T細胞は、24時間以内にAML芽球のほぼ完全な除去を示し(図11A)、有意なレベルのIFN-γをもたらして、大規模な増殖を示した(図11B～図11C)。やはり、JML-1-CAR T細胞は、「バルク」AML芽球及びAML白血病幹細胞に対する類似の強力な細胞溶解及び細胞毒性活性を付与した(図11A)。同一のそれぞれの患者由来の対照非CAR修飾T細胞は、このような機能性アッセイにおいて識別可能ないかなる反応性も示さなかった。結論として、患者由来JML-1-CAR T細胞は、シグレック6陽性自己AML芽球及びAML細胞株に対して高度に応答性である。
次いで、発明者らは、新たに診断されたAML(n=2)及びこれまでに処置したAML(MRD+、n=1)を有するAML患者からJML-1-CAR T細胞を生成し、自己AML芽球に対するそれらの抗白血病活性を評価した。発明者らは、CD4+T細胞では24.9～50.0%及びCD8+T細胞では20.4～43.0%の形質導入効率を観察し、濃縮細胞では、CAR+T細胞が>95%であった(図10A)。患者由来のCD4+及びCD8+JML-1-CAR T細胞は、培養から12日以内に40～60倍に増殖し(図10B)、in vitroでシグレック6陽性細胞株に対する強力な抗白血病反応性を示した(図10C～図10E)。自己白血病芽球と共培養した場合、JML-1-CAR T細胞は、24時間以内にAML芽球のほぼ完全な除去を示し(図11A)、有意なレベルのIFN-γをもたらして、大規模な増殖を示した(図11B～図11C)。やはり、JML-1-CAR T細胞は、「バルク」AML芽球及びAML白血病幹細胞に対する類似の強力な細胞溶解及び細胞毒性活性を付与した(図11A)。同一のそれぞれの患者由来の対照非CAR修飾T細胞は、このような機能性アッセイにおいて識別可能ないかなる反応性も示さなかった。結論として、患者由来JML-1-CAR T細胞は、シグレック6陽性自己AML芽球及びAML細胞株に対して高度に応答性である。
JML-1-CAR T細胞によりin vivoで侵襲性の全身型急性骨髄球性白血病が根絶する
発明者らは、免疫不全NSGマウスを使用してAML異種移植モデルにおけるJML-1-CAR T細胞の抗白血病効力を評価した。発明者らは、雌NSGマウスにffLuc+GFP+ U937白血病細胞を接種し、腫瘍接種から6日後にマウスのBM及び脾臓において腫瘍細胞の全身的生着をBLI解析により観察した(図3A)。次いで、発明者らは、JML-1_28z若しくはJML-1_BBz-CAR T細胞5×106細胞、又は非形質導入T細胞(CD4+:CD8+比=1:1)でマウスを処置した。発明者らは、JML-1-CAR T細胞の生着、安定な増殖及び持続性を観察した(図3B、左)。注目すべきことには、PBでは、JML-1_BBz CAR-T細胞は増殖してJML-1_28z CAR T細胞よりも有意に高く持続し(図3B、左)、発明者らは、JML-1-CAR T細胞処置後7日以内にPBからの白血病細胞の急速なクリアランスを観察した(図3B、右)。その上、JML-1-CAR T細胞で処置した全てのマウスは、白血病の急速な退縮を示し、一方、非形質導入T細胞で処置した全てのマウスは、白血病の負荷の上昇を示した(図3A、図3C)。
発明者らは、免疫不全NSGマウスを使用してAML異種移植モデルにおけるJML-1-CAR T細胞の抗白血病効力を評価した。発明者らは、雌NSGマウスにffLuc+GFP+ U937白血病細胞を接種し、腫瘍接種から6日後にマウスのBM及び脾臓において腫瘍細胞の全身的生着をBLI解析により観察した(図3A)。次いで、発明者らは、JML-1_28z若しくはJML-1_BBz-CAR T細胞5×106細胞、又は非形質導入T細胞(CD4+:CD8+比=1:1)でマウスを処置した。発明者らは、JML-1-CAR T細胞の生着、安定な増殖及び持続性を観察した(図3B、左)。注目すべきことには、PBでは、JML-1_BBz CAR-T細胞は増殖してJML-1_28z CAR T細胞よりも有意に高く持続し(図3B、左)、発明者らは、JML-1-CAR T細胞処置後7日以内にPBからの白血病細胞の急速なクリアランスを観察した(図3B、右)。その上、JML-1-CAR T細胞で処置した全てのマウスは、白血病の急速な退縮を示し、一方、非形質導入T細胞で処置した全てのマウスは、白血病の負荷の上昇を示した(図3A、図3C)。
観察期間の終了時に、発明者らは、フローサイトメトリーにより白血病を含まないBM、脾臓及びPBを観察し、JML-1-CAR T細胞で処置したマウスでは、AMLの完全寛解の持続を確認したが、対照T細胞で処置した全てのマウスでは、進行性の有害な白血病を観察した(図3D、図11)。
発明者らは、JML-1-CAR T細胞で処置したマウスの群において、対照T細胞と比較して有意に高い全生存(図3E)率、及びJML-1-CAR T細胞で処置したマウスにおいて、対照T細胞と比較して優れた無増悪生存率を観察した(図3F)。
また、発明者らは、MOLM-13細胞(低シグレック6発現)を接種した免疫不全NSGマウスにおいてJML-1-CAR T細胞の抗白血病効力を評価した。シグレック6-CAR T細胞による処置によって、有意な抗白血病効果が付与され(図3G)、有意な延命効果が引き起こされたが(図3H)、これは、NSG/U937モデル(高シグレック6発現)と比較して、それほど有効ではなかった。
結論として、このようなデータによって、AMLにおけるシグレック6の標的化により、in vivoで強力な抗白血病活性が付与されることが実証される。このデータによって、JML-1-CAR T細胞により、強力な抗白血病活性が付与され、in vivoにおいてAMLの長期完全寛解が誘導されることも示される。
ヒト造血幹及び前駆細胞はシグレック6を発現せず、in vitroでのJML-1-CAR T細胞への曝露後も保存される
発明者らは、正常造血幹及び前駆細胞(HSC/P)上でのJML-1-CAR T細胞のオンターゲット・オフ腫瘍作用を評価しようと努力した。はじめに、発明者らは、HD(n=5)由来のG-CSF動員PB由来CD34+CD38-HSC及びCD34+CD38+HSPC上でのシグレック6発現を評価した。発明者らは、フローサイトメトリーにより解析したn=5全てのHDにおいてHSC及びHSPC上でのシグレック6発現の欠如を観察した(NMFI<1.0、図4A)。次いで、発明者らは、CD8+JML-1-CAR T細胞をHSC/Pと共培養して、標的細胞のin vitroでの認識を評価した。発明者らは、その骨髄破壊作用が報告されているため[19]、アッセイの陽性対照としてCD123-CAR T細胞を使用した。発明者らは、JML-1-CAR T細胞によって正常HSC/Pは溶解しなかったが、24時間後にCD123-CAR T細胞によってHSC/Pの大多数が急速に除去されたことを観察した(図4B、左)。In vitroでの残存HSC/Pのコロニー形成能を評価するために、残存HSC/Pを使用して、JML-1-CAR又はCD123-CAR T細胞との24時間の共培養後にコロニー形成アッセイを実施した。JML-1-CAR T細胞で処理したHSC/Pは、非形質導入T細胞に曝露したHSC/Pと同等のコロニー形成を示す(図4B、右)。予想通り、発明者らは、CD123-CAR T細胞に曝露した場合、少数の赤血球コロニーを観察したが、骨髄球コロニーの形成は、完全に除去された(図4B、右)。次いで、発明者らは、HSC/P上でのシグレック6発現を、AMLの他の候補CAR標的抗原(FLT3、CLL1、CD33及びCD123)と比較した。発明者らは、5人全てのHDにおいて健常HSC/P上でのシグレック6発現の非存在を観察した。対照的に、5人全てのHDにおいて健常HSC/P上でのFLT3、CLL1、CD33及びCD123の強力な発現が存在した(図4C、図12A～図12B)。
発明者らは、正常造血幹及び前駆細胞(HSC/P)上でのJML-1-CAR T細胞のオンターゲット・オフ腫瘍作用を評価しようと努力した。はじめに、発明者らは、HD(n=5)由来のG-CSF動員PB由来CD34+CD38-HSC及びCD34+CD38+HSPC上でのシグレック6発現を評価した。発明者らは、フローサイトメトリーにより解析したn=5全てのHDにおいてHSC及びHSPC上でのシグレック6発現の欠如を観察した(NMFI<1.0、図4A)。次いで、発明者らは、CD8+JML-1-CAR T細胞をHSC/Pと共培養して、標的細胞のin vitroでの認識を評価した。発明者らは、その骨髄破壊作用が報告されているため[19]、アッセイの陽性対照としてCD123-CAR T細胞を使用した。発明者らは、JML-1-CAR T細胞によって正常HSC/Pは溶解しなかったが、24時間後にCD123-CAR T細胞によってHSC/Pの大多数が急速に除去されたことを観察した(図4B、左)。In vitroでの残存HSC/Pのコロニー形成能を評価するために、残存HSC/Pを使用して、JML-1-CAR又はCD123-CAR T細胞との24時間の共培養後にコロニー形成アッセイを実施した。JML-1-CAR T細胞で処理したHSC/Pは、非形質導入T細胞に曝露したHSC/Pと同等のコロニー形成を示す(図4B、右)。予想通り、発明者らは、CD123-CAR T細胞に曝露した場合、少数の赤血球コロニーを観察したが、骨髄球コロニーの形成は、完全に除去された(図4B、右)。次いで、発明者らは、HSC/P上でのシグレック6発現を、AMLの他の候補CAR標的抗原(FLT3、CLL1、CD33及びCD123)と比較した。発明者らは、5人全てのHDにおいて健常HSC/P上でのシグレック6発現の非存在を観察した。対照的に、5人全てのHDにおいて健常HSC/P上でのFLT3、CLL1、CD33及びCD123の強力な発現が存在した(図4C、図12A～図12B)。
まとめると、このようなデータにより、シグレック6が、正常HSC/P上で発現しないという点において、ユニークなAML標的抗原であることが示される。このデータにより、正常HSC/Pが、JML-1-CAR T細胞によって認識されないことも示される。このようなデータは、シグレック6の標的化により、ヒトにおいて骨髄破壊が誘導されないことを示唆する。
B-CLLの悪性B細胞はシグレック6を発現し、JML-1-CAR T細胞により除去される
発明者らは、未処置CLL患者のPB由来一次B-CLL細胞上でのシグレック6発現を評価した(n=10、Table-2(表3))。発明者らは、シグレック6が、このような患者10人のうち9人の一次B-CLL細胞上で均一かつ高レベルに発現することを示す(図5A、Table-2(表3)及び図14A)。一次B-CLL細胞の認識を評価するために、発明者らは、患者由来のPBMCをCD8+JML-1-CAR T細胞と共培養した。発明者らは、共培養から4時間以内に、JML-1_28z及びJML-1_BBz CAR T細胞による、シグレック6陽性B-CLL細胞に対する高レベルの細胞溶解活性を観察した(図5B及びTable-2(表3))。シグレック6発現が非常に高いCLL患者(患者#2、6及び8)は、B-CLL細胞のほぼ完全な除去を示し、これは、4時間のアッセイ期間内にCD19-CAR T細胞により観察された溶解と同等であった(図5B)。その上、JML-1_BBz-CAR T細胞の細胞溶解活性は、B-CLL細胞のシグレック6発現レベルに対して線形相関を示した(図5C)。発明者らは、非CLL B細胞、特には、メモリーB細胞上でのシグレック6発現も観察した(図5D、図14B)。B-CLL患者由来の健常B細胞(CD19+CD5-CD20high非B-CLL細胞)は、JML-1-CAR T細胞により、CD19-CAR T細胞と類似のレベルで認識された(図15)。
発明者らは、未処置CLL患者のPB由来一次B-CLL細胞上でのシグレック6発現を評価した(n=10、Table-2(表3))。発明者らは、シグレック6が、このような患者10人のうち9人の一次B-CLL細胞上で均一かつ高レベルに発現することを示す(図5A、Table-2(表3)及び図14A)。一次B-CLL細胞の認識を評価するために、発明者らは、患者由来のPBMCをCD8+JML-1-CAR T細胞と共培養した。発明者らは、共培養から4時間以内に、JML-1_28z及びJML-1_BBz CAR T細胞による、シグレック6陽性B-CLL細胞に対する高レベルの細胞溶解活性を観察した(図5B及びTable-2(表3))。シグレック6発現が非常に高いCLL患者(患者#2、6及び8)は、B-CLL細胞のほぼ完全な除去を示し、これは、4時間のアッセイ期間内にCD19-CAR T細胞により観察された溶解と同等であった(図5B)。その上、JML-1_BBz-CAR T細胞の細胞溶解活性は、B-CLL細胞のシグレック6発現レベルに対して線形相関を示した(図5C)。発明者らは、非CLL B細胞、特には、メモリーB細胞上でのシグレック6発現も観察した(図5D、図14B)。B-CLL患者由来の健常B細胞(CD19+CD5-CD20high非B-CLL細胞)は、JML-1-CAR T細胞により、CD19-CAR T細胞と類似のレベルで認識された(図15)。
まとめると、このようなデータによって、シグレック6がB-CLLの悪性B細胞上で発現することが示され、JML-1-CAR T細胞により、悪性B-CLL細胞が急速かつ強力に除去されることが実証される。
シグレック6は正常B細胞のサブセット上で発現し、JML-1-CAR T細胞による認識を付与する
次いで、発明者らは、HD由来PBMC(n=7)上でのシグレック6発現を解析しようと努力した。発明者らは、フロー解析においてB細胞の画分上で高レベルのシグレック6を検出したが、他の健常PB細胞、即ち、NK細胞、T細胞、NKT細胞は、シグレック6を発現しない(図5E)。発明者らは、低レベルのシグレック6を発現するCD33+骨髄球系細胞の小画分を検出した(図5E)。発明者らは、HDのナイーブ/未成熟B細胞と比較した場合、メモリーB細胞上での有意に高いシグレック6発現を観察した(図5E、図14C)。注目すべきことには、各HDは、シグレック6発現が低いものから非常に高いメモリーB細胞を有した(ヒストグラム、図5E)。発明者らが、CLL患者及びHDの正常B細胞上でのシグレック6発現レベルを比較した場合、発明者らは、健常ドナーにおいて、CLL患者と比較して有意に低いシグレック6レベルを観察した(図5F)。従って、発明者らは、B-CLLを有する患者をJML-1-CAR T細胞で処置した場合、シグレック6+メモリー及びナイーブB細胞が、CARにより媒介される認識及び除去に感受性となることを予測する。
次いで、発明者らは、HD由来PBMC(n=7)上でのシグレック6発現を解析しようと努力した。発明者らは、フロー解析においてB細胞の画分上で高レベルのシグレック6を検出したが、他の健常PB細胞、即ち、NK細胞、T細胞、NKT細胞は、シグレック6を発現しない(図5E)。発明者らは、低レベルのシグレック6を発現するCD33+骨髄球系細胞の小画分を検出した(図5E)。発明者らは、HDのナイーブ/未成熟B細胞と比較した場合、メモリーB細胞上での有意に高いシグレック6発現を観察した(図5E、図14C)。注目すべきことには、各HDは、シグレック6発現が低いものから非常に高いメモリーB細胞を有した(ヒストグラム、図5E)。発明者らが、CLL患者及びHDの正常B細胞上でのシグレック6発現レベルを比較した場合、発明者らは、健常ドナーにおいて、CLL患者と比較して有意に低いシグレック6レベルを観察した(図5F)。従って、発明者らは、B-CLLを有する患者をJML-1-CAR T細胞で処置した場合、シグレック6+メモリー及びナイーブB細胞が、CARにより媒介される認識及び除去に感受性となることを予測する。
まとめると、このようなデータにより、シグレック6が、健常ドナー及び患者の正常B細胞のサブセット上で発現することが示され、シグレック6の標的化による予測したオンターゲット・オフ腫瘍作用が、正常B細胞の選択的な部分的除去であることを示唆する。
考察
本発明者らは、シグレック6が、AMLにおける抗体に基づく細胞免疫療法の標的であることを実証する。特には、発明者らは、シグレック6が、AML白血病幹細胞を標的として破壊する、抗体に基づく細胞免疫療法の標的であることを実証する。発明者らは、JML-1-CAR T細胞により、in vitroでの原発性AML芽球に対する強力な抗白血病効力が付与され、AML細胞株を移植したマウスにおいて白血病の完全寛解が誘導されることを実証する。
本発明者らは、シグレック6が、AMLにおける抗体に基づく細胞免疫療法の標的であることを実証する。特には、発明者らは、シグレック6が、AML白血病幹細胞を標的として破壊する、抗体に基づく細胞免疫療法の標的であることを実証する。発明者らは、JML-1-CAR T細胞により、in vitroでの原発性AML芽球に対する強力な抗白血病効力が付与され、AML細胞株を移植したマウスにおいて白血病の完全寛解が誘導されることを実証する。
重要なことには、シグレック6は、正常HSC/P上には存在しないことが見出された。従って、JML-1-CAR T細胞は、正常HSC/Pを認識せず、コロニー形成実験において造血系発生の低下を引き起こさなかった。正常HSC/Pを温存しながらAML芽球及びAML白血病幹細胞を根絶する可能性により、AMLを効率的に処置しながらアロHSCTの必要性を排除する、骨髄非破壊的免疫療法が可能となる。
他の健常組織上でのシグレック6発現は、胎盤[16]、マスト細胞[17]及び正常B細胞のサブセット[10]に限定され、無視可能なオンターゲット・オフ腫瘍反応性を有する好ましい安全性プロファイルを示唆する。発明者らは、メモリーB細胞では大多数であるが、ナイーブ及び未成熟B細胞ではごく一部の細胞がシグレック6を発現し、このため、正常B細胞の選択的な部分的除去が、例えば、JML-1 CAR-T細胞療法のような抗シグレック6免疫療法後に生じることが予測されることを見出した。勇気づけられることには、必要に応じて、既にCD19-CAR T細胞療法後の一般的治療である静注免疫グロブリン(IVIG)補充療法により、潜在的低ガンマグロブリン血症を克服することができる[27]。シグレック6は、マスト細胞上に存在することが報告されており[18]、これにより、抗シグレック6免疫療法後にマスト細胞の減少又は枯渇が生じ得る。
その上、発明者らは、未処置CLL患者から得られた一次B-CLL細胞上でのシグレック6の高発現を見出した。これは、これまでの知見と一致する[11]。実際、発明者らは、in vitroで一次B-CLL細胞に対するJML-1_28z及びJML-1_BBzの両CAR T細胞の強力な抗CLL活性を観察した。CLL患者由来のT細胞は、T細胞枯渇及び増殖異常の特徴を示し、このため、患者由来のJML-1-CAR T細胞は、HD由来CAR T細胞のそれと同等には良好に機能しない可能性を有する[28、23、24]。勇気づけられることには、ブルトンチロシンキナーゼ(BTK)阻害剤イブルチニブにより、マウスモデル及びCLL患者においてCD19-CAR T細胞の抗白血病効力が向上することが示された[28、29]。従って、イブルチニブとの併用により、CLL患者におけるJML-1-CAR T細胞療法の有効性が向上し、JML-1-CAR T細胞のイブルチニブとの相乗効果の前臨床評価が保証され得る。
マウスscFvを含む導入遺伝子(例えばFMC63)に起因するCAR T細胞拒絶は、CAR T細胞療法に対する耐性に寄与する機構である[30]。JML-1-CARは、完全ヒトscFvに由来し、このため、これが免疫原性である可能性は低い。これにより、JML-1-CAR T細胞の複数回にわたる逐次的輸注を投与して、抗白血病応答を更に増大及び持続させ、必要であった場合、アロHSCTを回避することが可能である。
その上、標的抗原の消失又は下方制御に起因する白血病再発が、CD19-CAR又はCD22-CAR T細胞で処置したB-ALL患者における全ての再発の30～60%で観察されている[9、31、32]。AML芽球上では均一なシグレック6発現が存在するが、クローンの多様性のため、抗シグレック6免疫療法の治療的圧力下でシグレック6発現が変化し得るという潜在的リスクが存在する。しかし、免疫標的としてのシグレック6による臨床経験はこれまでに存在しない。
その上、膜貫通ドメインを有しないシグレック6タンパク質が生じ、このため細胞表面シグレック6の消失が生じるタンパク質切断の可能性は、B-ALL患者におけるCD19-CAR T細胞療法後のCD19タンパク質により報告されたように[33]、排除することができない。抗原消失回避を模倣する前臨床マウスモデルは、CAR T細胞処置後の抗原消失回避及びCAR-T細胞療法に対する耐性を防ぐ戦略の検討に役立ち得る。或いは、2つ以上の抗原を同時に又は逐次的に標的とするタンデム又は化合物CARの使用により、AMLにおける抗原消失回避を防ぎ得る。
JML-1-CAR T細胞によるシグレック6発現及び抗白血病活性に関する発明者らの発見は、シグレック6結合免疫細胞、例えば、JML-1-CAR T細胞を使用する治療が、AML及びCLL患者に適用可能であり、ヒトにおける臨床的検討を保証することを示唆する。その上、MALTリンパ腫[15]、クローン性マスト細胞疾患[34]及び胸腺腫上でのシグレック6発現も報告されており、これにより、シグレック6結合免疫細胞、例えば、JML-1-CAR T細胞を使用する治療の適用が、他の血液及び腫瘍学的症候並びに医薬による他の適用に拡大する。
本発明によるシグレック6結合ポリペプチド、シグレック6結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、シグレック6結合ポリペプチドを含む発現ベクター並びに免疫細胞は、医薬製品の製造のための公知の規格に従って、記載の方法及び(例えば、本明細書に定義する、がんを処置するための)使用のための生成物として産業的に製造及び販売することができる。従って、本発明は、産業的に適用可能である。
配列
配列番号1(GMCSFシグナルペプチド)
配列番号1(GMCSFシグナルペプチド)
配列番号2(配列番号1をコードするDNA配列)
配列番号3(JML-1重鎖可変ドメイン(VH))
配列番号4(配列番号3をコードするDNA配列)
配列番号5(4(GS)×3リンカー)
配列番号6(配列番号5をコードするDNA配列)
配列番号7(JML-1軽鎖可変ドメイン(VL))
配列番号8(配列番号7をコードするDNA配列)
配列番号9(IgG4ヒンジドメイン)
配列番号10(配列番号9をコードするDNA配列)
配列番号11(IgG3ヒンジ)
配列番号12(配列番号11をコードするDNA配列)
配列番号13(CD28膜貫通ドメイン)
配列番号14(配列番号13をコードするDNA配列)
配列番号15(CD28共刺激ドメイン)
配列番号16(配列番号15をコードするDNA配列)
配列番号17(4-1BB共刺激ドメイン)
配列番号18(配列番号17をコードするDNA配列)
配列番号19(CD3ゼータシグナル伝達ドメイン)
配列番号20(配列番号19をコードするDNA配列)
配列番号21(T2Aリボソームスキップ配列)
配列番号22(配列番号21をコードするDNA配列)
配列番号23(EGFRt)
配列番号24(配列番号23をコードするDNA配列)
配列番号25(JML-1scFv)
配列番号26(配列番号25をコードするDNA配列)
配列番号27(IgG4ヒンジ及びCD28共刺激ドメインを有する完全長CAR)
配列番号28(配列番号27をコードするDNA配列)
配列番号29(IgG4ヒンジ及び4-1BB共刺激ドメインを有する完全長CAR)
配列番号30(配列番号29をコードするDNA配列)
配列番号31(IgG3ヒンジ及びCD28共刺激ドメインを有する完全長CAR)
配列番号32(配列番号31をコードするDNA配列)
配列番号33(IgG3ヒンジ及び4-1BB共刺激ドメインを有する完全長CAR)
配列番号34(配列番号33をコードするDNA配列)
配列番号35(IgG4ヒンジを有する細胞外ドメイン)
配列番号36(配列番号35をコードするDNA配列)
配列番号37(IgG3ヒンジを有する細胞外ドメイン)
配列番号38(配列番号37をコードするDNA配列)
配列番号39(CD28共刺激ドメインを有する細胞内ドメイン)
配列番号40(配列番号39をコードするDNA配列)
配列番号41(4-1BB共刺激ドメインを有する細胞内ドメイン)
配列番号42(配列番号41をコードするDNA配列)
配列番号43(左IR/DRセグメント)
配列番号44(右IR/DRセグメント)
配列番号45(Sleeping Beautyアミノ酸配列)
配列番号46(完全長シグレック6をコードするDNA配列)
Claims (80)
- シグレック6に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなる、シグレック6結合ポリペプチド。
- シグレック6に結合する抗体又はその断片を含むか又はこれからなる、請求項1に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 少なくとも二重特異性である、請求項1又は2に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- シグレック6に結合する第1の抗体又はその断片、及びシグレック6以外の標的に結合する第2の抗体又はその断片を含むか又はこれからなり、任意選択で、リンカーを介して相互に結合する、請求項2又は3に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- シグレック6に結合する前記抗体又はその断片が、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、請求項2から4のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞に結合可能な、請求項4又は5に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- CD3、好ましくはCD3イプシロンに更に結合する、請求項4から6のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 免疫細胞、例えばT細胞又はNK細胞、好ましくはT細胞を、その表面上にシグレック6を発現する標的細胞に動員可能な、請求項4から7のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 薬物にコンジュゲートしている、請求項2から5のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記薬物がトキシンである、請求項9に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- シグレック6結合CARを含むか又はこれからなる、請求項1又は3に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記CARが、少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項11に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記細胞外リガンド結合ドメインが、シグレック6結合エレメントを含む、請求項12に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記シグレック6結合エレメントが、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は配列番号25に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、請求項13に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記細胞外リガンド結合ドメインが、スペーサードメイン、例えば、CD8α、IgG3又はIgG4由来のスペーサードメインを含む、請求項12から14のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記膜貫通ドメインが、好ましくは、配列番号13に示すアミノ酸配列、又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表されるCD28膜貫通ドメインを含む、請求項12から15のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン及びCD3ゼータドメインを含み、前記共刺激ドメインが、好ましくは、CD28細胞質ドメイン又は4-1BB共刺激ドメインである、請求項12から16のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記共刺激ドメインが、CD28細胞質ドメインである、請求項17に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記CD28細胞質ドメインが、配列番号15に示すアミノ酸配列、又は配列番号15に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、請求項17又は18に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記4-1BB共刺激ドメインが、配列番号17に示すアミノ酸配列、又は配列番号17に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、請求項17に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 前記CD3ゼータドメインが、配列番号19に示すアミノ酸配列、又は配列番号19に示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列により表される、請求項17から20のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 配列番号27、29、31若しくは33のいずれか1つに示すアミノ酸配列、又は配列番号27、29、31若しくは33のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項12から19及び21のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
- 配列番号26により表されるヌクレオチド配列、又は配列番号26に示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項23に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
- 配列番号28、30、32若しくは34のいずれか1つにより表されるヌクレオチド配列、又は配列番号28、30、32若しくは34のいずれか1つに示すヌクレオチド配列に対する少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項23又は24に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット。
- 前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'方向及び3'方向に隣接セグメントを更に含む、請求項23から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 5'方向の前記隣接セグメントが、左逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントであり、3'方向の隣接セグメントが、右逆方向反復/直列反復(IR/DR)セグメントである、請求項26に記載のポリヌクレオチド。
- 前記左IR/DRセグメントが、配列番号43により表され、前記右IR/DRセグメントが、配列番号44により表される、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
- 左IR/DRのヌクレオチド配列、シグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び右IR/DRのヌクレオチド配列を含む、請求項23から28のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項23から29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む、発現ベクター。
- 非ウイルスベクター又はウイルスベクターである、請求項30に記載の発現ベクター。
- 非ウイルスベクターである、請求項31に記載の発現ベクター。
- 最小DNA発現カセットである、請求項32に記載の発現ベクター。
- トランスポゾンドナーDNA分子である、請求項32又は33に記載の発現ベクター。
- 前記トランスポゾンドナーDNA分子が、Sleeping Beauty又はPiggyBacトランスポゾンドナーDNA分子である、請求項34に記載の発現ベクター。
- ミニサークルDNAである、請求項32から35のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項31に記載の発現ベクター。
- レンチウイルス又はガンマ-レトロウイルスベクターである、請求項37に記載の発現ベクター。
- 請求項11から22のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチド、及び/又は請求項11から22のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は請求項11から22のいずれか一項に記載のシグレック6結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞。
- ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット及び/又はベクターが発現する、請求項39に記載の免疫細胞。
- リンパ球である、請求項39又は40に記載の免疫細胞。
- 前記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、請求項41に記載の免疫細胞。
- 前記T細胞が、CD4+細胞又はCD8+細胞である、請求項42に記載の免疫細胞。
- 検出可能なマーカーを更に発現する、請求項39から43のいずれか一項に記載の免疫細胞。
- ヒト細胞である、請求項39から44のいずれか一項に記載の免疫細胞。
- (a)対象の血液試料から免疫細胞を単離する工程と、
(b)請求項23から29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項30から38のいずれか一項に記載の発現ベクターで免疫細胞に形質転換又は形質導入する工程と、
(c)任意選択で、形質転換又は形質導入した前記免疫細胞を精製する工程と
を含む、(組換え)免疫細胞を生成するための方法。 - 工程(b)において、1)請求項23から29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む転位エレメント及び2)トランスポゼース(をコードするポリヌクレオチド)を使用して免疫細胞を形質転換する、請求項46に記載の方法。
- 前記トランスポゼースが、Sleeping Beautyトランスポゼース又はPiggyBacトランスポゼースである、請求項47に記載の方法。
- 前記Sleeping Beautyトランスポゼースが、配列番号45に示すアミノ酸配列により表される、請求項48に記載の方法。
- 前記転位エレメントを、前記トランスポゼースの作用により前記免疫細胞のゲノムに組み込む、請求項47から49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫細胞がリンパ球である、請求項46から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、請求項51に記載の方法。
- 前記T細胞が、CD4+細胞又はCD8+細胞である、請求項52に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項46から53のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項46から54のいずれか一項に記載の方法により入手可能な、免疫細胞。
- 請求項39から45又は請求項55のいずれか一項に記載の複数の免疫細胞を含む、医薬組成物であって、複数の前記免疫細胞が、任意選択で、CD4+細胞及びCD8+細胞の混合物である、医薬組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項39から45若しくは請求項55のいずれか一項に記載の免疫細胞又は請求項56に記載の医薬組成物。
- 対象に投与される、がんを処置する方法における使用のための、請求項39から45若しくは請求項55のいずれか一項に記載の免疫細胞又は請求項56に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が静脈内に投与される、請求項57又は58に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記免疫細胞がリンパ球である、請求項57から59のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記リンパ球が、T細胞又はNK細胞である、請求項60に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記T細胞が、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞である、請求項61に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項58から62のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記がんが、シグレック6を発現するがんである、請求項58から63のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記がんが白血病である、請求項58から64のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記がんが、原発性急性骨髄球性白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、MALTリンパ腫又はクローン性マスト細胞疾患である、請求項58から65のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記がんがAMLである、請求項58から66のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- がんを処置する前記方法が、前記免疫細胞による前記がんのがん幹細胞の除去を含む、請求項58から67のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記がん幹細胞が、CD45dim細胞、好ましくは、CD45dimCD34+細胞、最も好ましくは、CD45dimCD34+CD38-細胞である、請求項68に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- がんを処置する前記方法が、前記免疫細胞による非がん性造血幹又は前駆細胞の除去を含まない、請求項58から69のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記がん幹細胞及び/又は前記非がん性造血幹若しくは前駆細胞の除去を監視する工程を更に含む、請求項68から70のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- がんを処置する前記方法が、同種造血幹細胞移植を含まないか、又は前記対象が、同種造血幹細胞移植後に前記がんの再発を有する対象である、請求項58から71のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記方法が、前記免疫細胞若しくは前記医薬組成物の投与後及び/又は前記免疫細胞若しくは前記医薬組成物による治療の終了後の更なる化学療法を含まない、請求項58から72のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- がんを処置する前記方法が、処置後に前記免疫細胞の枯渇を含まない、請求項58から73のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記方法が、
1)前記対象から得られたがん細胞上でのシグレック6の発現レベルを決定する工程と、その後、
2)前記免疫細胞又は前記医薬組成物を前記対象に投与する工程と
を含む、請求項58から74のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。 - シグレック6が前記がん細胞上で発現する場合にのみ、工程2)において投与される、請求項75に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記方法が、
(i)CD70に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなるCD70結合ポリペプチド、或いは
(ii)(i)に記載のCD70結合ポリペプチド、及び/又は(i)に記載のCD70結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は(i)に記載のCD70結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む免疫細胞
による更なる治療を含み、
前記免疫細胞が、好ましくはT細胞、例えば、CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はNK細胞である、請求項58から76のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。 - 前記CD70結合ポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなる、請求項77に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
- 前記方法が、
(i)TIM-3に結合する抗体若しくはその断片を含むか若しくはこれからなるか、又はキメラ抗原受容体(CAR)を含むか若しくはこれからなるTIM-3結合ポリペプチド、或いは
(ii)(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチド、及び/又は(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセット、及び/又は(i)に記載のTIM-3結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む発現ベクターを含む、免疫細胞
による更なる治療を含み、
前記免疫細胞が、好ましくはT細胞、例えば、CD4+T細胞若しくはCD8+T細胞又はNK細胞である、請求項58から78のいずれか一項に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。 - 前記TIM-3結合ポリペプチドが、キメラ抗原受容体(CAR)を含むか又はこれからなる、請求項79に規定の使用のための免疫細胞又は医薬組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20190301.0 | 2020-08-10 | ||
| EP20190301 | 2020-08-10 | ||
| EP21183475 | 2021-07-02 | ||
| EP21183475.9 | 2021-07-02 | ||
| PCT/EP2021/072160 WO2022034022A1 (en) | 2020-08-10 | 2021-08-09 | Siglec-6-binding polypeptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023537104A true JP2023537104A (ja) | 2023-08-30 |
Family
ID=77520718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023509569A Pending JP2023537104A (ja) | 2020-08-10 | 2021-08-09 | シグレック６結合ポリペプチド |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230287129A1 (ja) |
| EP (1) | EP4192873A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023537104A (ja) |
| CA (1) | CA3190797A1 (ja) |
| WO (1) | WO2022034022A1 (ja) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2005255423A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-29 | Tanox, Inc. | Diagnosis and treatment of SIGLEC-6 associated diseases |
| US20060269556A1 (en) * | 2005-04-18 | 2006-11-30 | Karl Nocka | Mast cell activation using siglec 6 antibodies |
| JP2010524851A (ja) | 2007-04-03 | 2010-07-22 | マイクロメット アーゲー | 種間特異的結合ドメイン |
| US8877199B2 (en) * | 2009-05-15 | 2014-11-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | B cell surface reactive antibodies |
| CA2984677C (en) * | 2015-05-01 | 2022-05-17 | The Regents Of The University Of California | Glycan-dependent immunotherapeutic molecules |
| WO2019134001A1 (en) * | 2017-12-29 | 2019-07-04 | City Of Hope | Meditope-enabled t cells |
| IT201800003464A1 (it) * | 2018-03-13 | 2019-09-13 | Ospedale Pediatrico Bambino Gesu | Cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+ |
-
2021
- 2021-08-09 CA CA3190797A patent/CA3190797A1/en active Pending
- 2021-08-09 WO PCT/EP2021/072160 patent/WO2022034022A1/en unknown
- 2021-08-09 JP JP2023509569A patent/JP2023537104A/ja active Pending
- 2021-08-09 US US18/019,238 patent/US20230287129A1/en active Pending
- 2021-08-09 EP EP21762396.6A patent/EP4192873A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022034022A1 (en) | 2022-02-17 |
| CA3190797A1 (en) | 2022-02-17 |
| US20230287129A1 (en) | 2023-09-14 |
| EP4192873A1 (en) | 2023-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2015357543B2 (en) | Chimeric antigen receptors targeting Fc Receptor-like 5 and uses thereof | |
| US20190298715A1 (en) | Immune effector cell therapies with enhanced efficacy | |
| US20220025001A1 (en) | Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof | |
| JP6417413B2 (ja) | 多様な腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性を誘発するキメラ受容体 | |
| JP2020178690A (ja) | 多部分シグナル伝達タンパク質およびその使用 | |
| US11059879B2 (en) | Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof | |
| JP2020513839A (ja) | Ｔｉｍ−１を標的とするキメラ抗原受容体 | |
| CN113039197A (zh) | 使用靶特异性融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法 | |
| KR20230129983A (ko) | 조작된 세포 요법을 위한 표적화된 사이토카인 구축물 | |
| US20210038659A1 (en) | Combination therapy using a chimeric antigen receptor | |
| CN112867498A (zh) | 使用嵌合抗原受体基因组编辑和转导t细胞以用于治疗t和b细胞恶性肿瘤的方法 | |
| WO2018111340A1 (en) | Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells | |
| EP4281100A2 (en) | Immunostimulatory cytokine combination and therapeutic use thereof | |
| US20220362299A1 (en) | Engineered natural killer cells and methods for using the same in immunotherapy and autophagy inhibiton techniques | |
| JP2023520572A (ja) | オルソゴナルな受容体を発現するようにゲノムが改変されたヒト免疫細胞 | |
| WO2021014022A1 (en) | Car-cd123 vector and uses thereof | |
| JP2023537104A (ja) | シグレック６結合ポリペプチド | |
| EP4259650A1 (en) | Car t cells for treating cd19+, cd20+ or cd22+ tumors or b-cell derived auto-immune diseases | |
| Zoine | Developing novel cellular and gene therapies for pediatric malignancies | |
| EP4301402A1 (en) | Bispecific antibodies enhancing cell mediated immune responses | |
| EP4121518A1 (en) | Engineered cell compositions and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230411 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240325 |