HUT50870A - Process for producing new recombinant and chimeric antibodies against human adenocarcinoma antigene - Google Patents

Process for producing new recombinant and chimeric antibodies against human adenocarcinoma antigene Download PDF

Info

Publication number
HUT50870A
HUT50870A HU891925A HU192589A HUT50870A HU T50870 A HUT50870 A HU T50870A HU 891925 A HU891925 A HU 891925A HU 192589 A HU192589 A HU 192589A HU T50870 A HUT50870 A HU T50870A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ser
thr
gly
lys
pro
Prior art date
Application number
HU891925A
Other languages
English (en)
Inventor
Lisa S Beavers
Thomas F Bumol
Robert A Gadski
Barbara J Weigel
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT50870A publication Critical patent/HUT50870A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/867—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody produced via recombinant dna technology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás uj DNS vegyületek és rekombináns DNS klónozó vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy a KS1/4 monoklonális antitestet kódolják, • · · ·
- 2 valamint a KSl/4-ből származó egér/humán kiméra antitesteket. A vektorok lehetővé teszik az uj DNS vegyületek expresszióját nem-limfaid eukarióta sejtekben.
A jelen találmány szerint előállithatók az uj klónozóvektorokkal transzformált gazdasejtek. A transzformált gazdasejtek kifejezik a rekombináns vagy kiméra KS1/4 antitesteket vagy ezek származékait. Az ismertetett DNS-vegyületek közül számos használható arra, hogy korábban sem a természetben, sem a laboratóriumban elő nem állított KS1/4 származékokat állítsunk elő vele, és a jelen találmányhoz tartoznak ezek a különleges molekulák .
A KS1/4 egy monoklonális antitest egy rágcsáló antitest amely specifikusan a 40.000 daltaon méretü , sejtfelületi antigénhez^; amely nagy sűrűségben található adenokarcinóma sejteken, valamint megtalálható normál epiteliális sejteken. Erről az antitestről igazolták, hogy hatékonyan használható a betegség in vitro detektálására , valamint az adeno karcinóma in vivő diagnosztizálására és kezelésére. Újabb vizsgálatok megerősítették, hogy a KS1/4 gyógyszer konjugátumok dózis-függő daganatnövekedés-gátló hatást mutatnak. Lásd Spearman et al. , 0. Pharmacol and Exp, Therapeutics, 241, 695-703 (1987); Bumol et al., Ceriani, R.L.xszerkesztette Immunological
Aproghes to the diagnosis and Therapy of Breast Cancer. New York and London: Plenum Press; 205-215 (1987); és Bumol a Reisfeld R.A. és Sell , S. szerkesztette Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, New York: Alán R. Liss, Inc; 257-259 (1985).
Rágcsáló antitestek emberben való alkalmazásából akkor adódik probléma, amikor a rákos beteg immunrendszere antitesteket képez a rágcsáló immunoglobulinokkal szemben. Ez az immunválasz nem jön létre minden kezelt betegben, de ha igen, akkor ennek eredményeként a [<ezelés hatékonysága fokozatosan csökken a többszörös dózisok tartományában. A beteg immunválasza okozhatja a rágcsáló antitest gyors kiürülését a véráramból. Ez a válasz vezethet rosszabb reakciókhoz is, mint például anafilaxishoz és szérumbetegséghez. Az immunogenitás kizárja az antitest többszörös dózisban való adagolását és igy csökkenti a kezelés klinikai értékét.
Humán monoklonális antitesteket nehéz előállítani, ezért az immunológiai problémák elkerülésére kiméra antitesteket készítenek. A kiméra antitestek az egyik fajból származó antigén specifikus vagy változó régióját tartalmazzák egy másik fajból származó konstans régióhoz kapcsolva. [Lásd 0; and Morrison Biotechniques , 4 214-221 (1986)]. Mivel az immunológiai reakcó gyakran • · «
a konstans régióval szemben alakul ki, ezért a rágcsáló konstans régiói humán konstans régióval helyettesítve nagymértékben csökken a páciens immunológiai reakciója. Ennélfogva a kiméra antitestekre nagy szükség van a betegség kezelésében.
A kiméra antitestekre vonatkozó általános elképzelést leírták, mégis adott specifitással rendelkező uj kiméra antitestek kiméra antitestek kifejlesztése még nem megoldott.
A jelen találmány olyan rekombináns DNS és aminosav szekvenciákkal foglalkozik, amelyek a teljes KS1/4 monoklonális antitest molekulát magukba foglalják. Ezeket a szekvenciákat úgy változtattuk meg, hogy a KS1/4gyel azonos szövetspecifitással rendelkező kiméra antitesteket expresszáljanak, de amelyek humán eredetű konstans régiókat tartalmaznak. A találmány szermti eljárás olyan terápiás hatású anyag előállítását teszi lehetővé, amely a KS1/4-gyel azonos szővetspecifitássál rendelkezik, de az immunológiai mellékhatásai nagymértékben lecsökkentek.
A jelen találmány tárgya továbbá a KS1/4 rekombináns DNS és aminosav szekvenciái. Ezeknek a szekvenciáknak az ismerete lehetővé teszi képzett szakemberek számára, hogy uj, a KS1/4 antigénnel szemben módosított affinitással rendelkező KS1/4 származékokat állítsanak elő.
···· ···· · • · · • ♦ · ····
- 5 A jelen találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns és kiméra KS1/4 előállítására nem-limfoid sejtvonalakban, ezzel megkerülve azt a gyakori problémát, amely a heterológ antitestek kifejeződéséből származik limfoid sejtekben.
A jelen találmányi leírás során a következő szakkifejezéseket használjuk.
A - dezoxiadenozin
Alá - alanin csoport
R
Ap - ampcillin rezisztens fenotipus, vagy a rezisztenciát kódoló gén maga
Arg - arginin csoport
Asn - aszparagin csoport
Asp - aszparaginsav csoport
C - dezoxicitozin
Kiméra antitest - olyan antitest, amely egy fajból, tipikusan egérből származó varábilis régiót tartalmaz, egy második és különböző fajból, célszerűen emberből származó konstans régióhoz kapcsolva
Cys - cisztein csoport dhfr - dihidrofolát reduktáz fenotipus, vagy a kódoló gén maga
Enh - BK vírusból származó erősítő szekvencia
G - dezoxiguanozin ···· ···· ' • · · _ · · · · • · · « • ·· · ·· ··· ··
Gin
Glu
Gly
G418R
His u R
Hm
Ile
IVS
KSA
KS1/4
Leu LP
Lys
Met
- glutamin csoport
- glutaminsav csoport
- glicin csoport
- G418 rezisztencia fenotipus, vagy a reziszten-
R ciát kódoló gén maga. Oelölhstő Km-rel.is,
- hisztidin csoport
- higromicin rezisztencia fenotipus vagy rezisztenciát kódoló gén maga
- izoleucin csoport
- int ront kódoló DNS,
- UCLA-P3 sejtek λ> 40 000 dalton méretű sejtfelületi glikoprotein antigénje, amelyet a KS1/4 monoklonális antitest felismer,
- hibridoma sejtvonalból származó monoklonális antitest, amely felismer P3-UCLA sejtek sejtfelületén található ^40 000 dalton méretű gli-r koprotein antigént
- leucin csoport
- az adenovirus késői promoterének promoter aktivitását hordozó DNS darab
- lizin csoport
- metionin csoport
MoAB monoklonális antitest ···· ····
- 7 Naszcensz fehérje - egy mRNS-ről transzlációval keletkező polipeptid, bármely poszt-transzlációs módosítás előtt pA - poliadenilezési szignált kódoló DNS- szekvencia
Phe - fenilalanin csoport pL - a lambda bakteriofág baloldali promoterének promoter aktivitását hordozó DNS szakasz
Pro - prolin csoport
Promoter - olyan DNS szekvencia, amely a DNS RNS-sé való átírását irányítja.
Rekombináns DNS klónozó vektor - bármely önálló replikációra képes ágens, ideértve de nem korlátozva magunkat plazmidokra és fágokra, ami olyan DNS molekula, amihez egy vagy több DNS-szakaszt lehet hozzáadni vagy adtak hozzá.
Rekombináns DNS expressziós vektor - bármely rekombináns DNS klónozó vektor, amelybe promotert építettek be.
Rekombináns KS1/4 - KS1/4 expresszióra képes vektorral transzformált sejtekben expresszálódott KS1/4 monoklonális antitest.
Replikon - olyan DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi plazmid vagy más vektor ···· ···
- 8 autonóm replikációját
Restrikciós fragment - bármely lineáris
DNS szakasz, amely egy vagy több restrikciós endonukleáz enzim hatására jön létre.
Érzékeny gazdasejt - olyan gazdasejt amely nem képes adott antibiotikum vagy más toxikus anyag jelenlétében növekedni, az adott anyag elleni rezisztencia-tulajdonságot kódoló DNS szakasz nélkül
Ser - szerin csoport
Strukturgén - bármely funkcionális polipeptidet kódoló
DNS szakasz,beleértve a transzlációs start és stopjeleket
T - dezoxitimidin
Te - tetraciklin - rezisztencia fenotipus, illetve az azt kódoló gén
Thr - treonin csoport
Trp - triptofán csoport
Tyr - tirozin csoport
Val - valin csoport
1, ábra; a pL32 plazmid készítésének sémája, A leírás céljai miatt az ábrák nem mérethelyesek,
2, ábra; a pNM 789 plazmid restrikciós és funkcioná- lis térképe • ··
3. ábra: a 120-as plazmid készítésének sémája
4, ábra: a pLllO-es plazmid készítésének sémája
5, ábra: a pBK neo 1 plazmid és a Bl< vírus restrikciós és funkcionális térképe
6. ábra: a pLP cat és a pBL cat plazmidok restrikciós és funkcionális térképe
7. ábra: a pLi33 plazmid készítésének sémája
8. ábra: a pLPC, pSV2hyg és pLPChygl plazmidok restrikciós és funkcionális térképe
9. ábra: a pBW25 plazmid készítésének sémája
10. ábra: a pBW32 plazmid készítésének sémája
11, ábra: a pLPChd és phd plazmidok restrikciós és funkcionális térképe
12. ábra: a pGI<C23lO és pG2A52 plazmidok restrikciós és funkcionális térképe
13. ábra: a CHKC2-6 és CHKC2-18 plazmidok restrikciós és funkcionális térképe
14. ábra: a CH2A5 és CH2A5FG2 plazmidok restrikciós és funkcionális térképe
15. ábra : a CH2A5IG3 és CH2A5IG4 plazmidok restrikciós és funkcionális térképe.
··*♦ ·«··
- 10 A jelen találmány tárgya olyan rekombináns DNS vegyület, amely monoklonális antitest könnyű láncát kódolja, amely könnyű lánc a KS1/4 monoklonális antitest könnyű lánca és lényegében a következő aminosav-sorrenddel rendelkezik:
Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val
Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile
Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin
Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
Ile Lys Arg Alá Asp Alá Alá Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
Ser Ser Glu Gin Leu Thr Ser Gly Gly Alá Ser Val Val Cys Phe
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp. Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile
Asp Gly Ser Glu Arg Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu
Alá Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
Arg Asn Glu Cys
A jelen találmány tárgya továbbá olyan rekombináns DNS vegyület, amely monoklonális antitest nehéz láncát kódolja, amely nehéz lánc a KS1/4 monoklonális antitest néhéz lánca és lényegében a következő aminosav-sorrenddel rendelkezik:
·♦··
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys
Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr
Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly
Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
Pro Thr Tyr Alá Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Alá Phe Ser Leu
Glu Thr Ser Alá Ser Thr Alá Phe Leu Gin Ile Gin Gin Pro Gin
Asn Met Arg Thr Met Alá Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile Ser
Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
Alá Lys Thr Thr Alá Pro Ser Val Tyr Pro Leu Alá Pro Val Cys
Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin Ser Asp
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp
Pro Ser Gin Ser Ile Thr Cys Asn Val Alá His Pro Alá Ser Ser
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Alá Pro Asn Leu Leu Gly Gly
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gin Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
Glu Val His Thr Alá Gin Thr Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Alá Leu Pro Ile Gin His Gin Asp
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
Leu Pro Alá Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
Val Arg Alá Pro Gin Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
Met Thr Lys Lys Gin Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr
Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp
Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
···· ···· • · ·· · · · • · · · · * • · · · · «*, • ·· · «·· · * , *
- 12 A jelen találmány tárgya a rekombináns monoklonális KS1/4 antitestek valamint a KS1/4 eddig ismeretlen aminosav és nukleotid szekvenciái. A DNS bázispár-képzés komplementer természete: miatt a kétszálu DNS molekula egyik láncának szekvenciája elég ahhoz, hogy a másik lánc szekvenciáját meghatározzuk. A KS1/4 könnyű láncának nukleotid szekvenciája a következő:
CAA ATT CTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT
CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA
AGT TAC ATG CTC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCG CCC AAA
CCC TGG ATT TTT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA TTC CCT GCT
CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ATA ATC
AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAT CAG
CGG AGT GGT TAC CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA
ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA
TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC
TTG AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT
GAT GGC AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT
CAG GAC AGC AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG
TTG ACC AAG GAC GAG TAT GAA CGA CAT AAC AGC TAT ACC TGT- GAG
GCC ACT CAC AAG ACA TCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC
AGG AAT GAG TGT
mig a KS1/4 nehéz láncának a nukleotid szekvenciája a következő:
·*·· ··*· 9
CAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG
MG CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT
ACC TTC ACA AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG ACT CCA GGA
AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACC TAC ACT GGA GAA
CCA ACA TAT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG
GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TTT TTG CAG ATT CAA CAA CCT CAG
AAT ATG AGG ACT. ATG GCT ACA TAT TTC TGT GTA AGA TTT ATT TCT
AAG GGG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACG TCA GTC ACC GTC TCC TCA
GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC TAT CCA CTG GCC CCT GTG TGT
GGA GAT ACA ACT GGC TCC TCG GTG ACT CTA GGA TGC CTG GTC AAG
GGT TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACC TTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC
CTG TCC AGT GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC
CTC TAC ACC CTC AGC AGC TCA GTG ACT GTA ACC TCG AGC ACC TGG
CCC AGC CAG TCC ATC ACC TGC AAT GTG GCC CAC CCG GCA AGC AGC
ACC AAG GTG GAC AAG AAA ATT GAG CCC AGA GGG CCC ACA ATC AAG
CCC TGT CCT CCA TGC AAA TGC CCA GCA CCT AAC CTC TTG GGT GGA
CCA TCC GTC TTC ATC TTC CCT CCA AAG ATC AAG GAT GTA CTC ATG
ATC TCC CTG AGC CCC ATA GTC ACA TGT GTG GTG GTG GAT GTG AGC
GAG GAT GAC CCA GAT GTC CAG ATC AGC TGG TTT GTG AAC AAC GTG
GAA GTA CAC ACA GCT CAG ACA CAA ACC CAT AGA GAG GAT TAC AAC
AGT ACT CTC CGG GTG GTC AGT GCC CTC CCC ATC CAG CAC CAG GAC
TGG ATG AGT GGC AAG GAG TTC AAA TGC ,\AG GTC AAC AAC AAA GAC
CTC CCA GCG CCC ATC GAG AGA ACC ATC TCA AAA CCC AAA GGG TCA
GTA AGA GCT CCA CAG GTA TAT GTC TTG CCT CCA CCA GAA GAA GAG
ATG ACT AAG AAA CAG GTC ACT CTG ACC TGC ATG GTC ACA GAC TTC
ATG CCT GAA GAC ATT TAC GTG GAG TGG ACC AAC AAC GGG AAA ACA
GAG CTA AAC TAC AAG AAC ACT GAA CCA GTC CTG GAC TCT GAT GGT
TCT TAC TTC ATG TAC AGC AAG CTG AGA GTG GAA AAG AAG AAC TGG
GTG GAA AGA AAT AGC TAC TCC TGT TCA GTG GTC CAC GAG GGT CTG
CAC AAT CAC CAC ACG ACT AAG AGC TTC TCC CGG ACT CCG GGT AAA
A jelen találmány tárgya továbbá rekombináns
DNS molekula, amely azzal jellemezhető, hogy kiméra ···· ···· · antitest könnyű láncát kódoló DNS, amely DNS egy könnyű láncot egy első emlős fajból származó antigén-specifikus variábilis régiót kódol, valamint egy második különböző emlős fajból származó konstans régiót, és az említett könnyű lánc variábilis régió aminosav-sorrendje a következő:
Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser
Pro' Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val
Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile
Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin
Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
Ile Lys Arg
A könnyű lánc variábilis régió nukleotíd szekvenciája a következő:
CAA ATT CTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT
CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA
AGT TAC ATG CTC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCG CCC AAA
CCC TGG ATT TTT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA TTC CCT GCT
CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ATA ATC
AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAT CAG
CGG AGT GGT TAC CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA
ΑΤΑ AAA CGT
····
- 15 A- találmány foglalkozik még a fent leirt könnyű lánc variábilis régió származékaival, az egyik ilyen
ármi az él· < ar linó sav sorren d je Ο ! követke z ő:
Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val
Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile
Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin
Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
Ile Lys Gly
Ennek a könnyű lánc variábilis régió származéknak a nukleotid sorrendje a következő;
CAA ATT CTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT
CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA
AGT TAC ATG CTC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCG CCC AAA
CCC TGG ATT TTT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA TTC CCT GCT
CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ATA ATC
AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAT CAG
CGG AGT GGT TAC CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA
ΑΤΑ AAA GGT
A találmány tárgya továbbá rekombináns DNS molekula, amely azzal jellemezhető, hogy kiméra antitest nehéz láncát kódoló DNS, amely DNS egy nehéz láncot, sgy első emlős fajból származó nehéz lánc variábilis régiót kódol, valamint egy második különböző emlős fajból származó konstans régiót, és az említett nehéz lánc variábilis régió aminosav-sorrendje a következő:
····
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys
Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr
Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly
Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
Pro Thr Tyr Alá Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Alá Phe Ser Leu
Glu Thr Ser Alá Ser Thr Alá Phe Leu Gin Ile Gin Gin Pro Gin
Asn Met Arg Thr Met Alá Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile Ser
Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
Ennek a nehéz lánc variábilis régiónak a nukleotid szekvenciája a következő:
CAG ATC CAG TTG GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG
AAG CCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT
ACC TTC ACA AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG ACT CCA GGA
AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACC TAC ACT GGA GAA
CCA ACA TAT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG
GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TTT TTG CAG ATT CAA CAA CCT CAG
AAT ATG AGG ACT ATG GCT ACA TAT TTC TGT GTA AGA TTT ATT TCT
AAG GGG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACG TCA GTC ACC GTC TCC TCA
A jelen találmány szerinti könnyű lánc és nehéz lánc molekulák egyaránt kapcsolódnak különböző szignál peptidekhez. Akönnyü lánc szignálpeptidjének aminosav szekvenciája a következő:
Met Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile
Ser Alá Ser Val Ile Met Ser Arg Gly
A szignál pepiid nukleotid szekvenciája a következő:
ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTT AGC TTC CTG CTA ATC
AGT GCT TCA GTC ATA ATG TCC AGA GGA
- 17 Ά nehéz lánc szignálpeptidjének aminosav sorrendje a következő:
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Alá Alá
Alá Gin Ser Alá Gin Alá
Ennek a szignálpep tidnek a nul< leotid szekven-
ciája a következő:
ATG GAT TGG CTG TGG AAC TTG CTA TTC CTG ATG GCA GCT
GCC CAA AGT GCC CAA GCA
A jelen találmány szerinti uj DNS vegyületek
cDNS klónokból származnak, amelyeket a KS1/4 monoklo* nális antitesteket termelő hibridóma sejtvonal mRNS-éből állítunk elő. A pGI<C23lO plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest könnyű láncának teljes kódoló szakaszát, a könnyű lánchoz kapcsolódó szignálpeptidet kódoló szakaszt, valamint a molekula 5' és 3' nem-transzlálódó régióját.
Az 5' nem-transzlálódó régió DNS szekvenciája:
5'-TC TGA CAG ACA CTA CTG TGC CTC GTC GGT TGG GAC CTA AAA GGG
CTA GTA GAA TCC GCA AGC TTT TTA ATC TCT CCA AAG AAG ATG ATG
TCC GCC AGT ATG TTG TCA GGA AGC CCT TAA ACA AAG AAG GTA ATT
AGC TAG GGA CCA AAA TTC AAA GAC AAG-3'
mig a 3’ nem-transzlálódó régió DNS szekvenciája:
··· a ····
5‘- • TAG AGA CAA AGG TCC TGA GAC GCC ACC ACC AGC
TCC CCA GCT CCA TCC TAT CTT CCC TTC TAA GGT CTT GGA GGC TTC
ccc ACA AGC GAC ATA CCA CTG TTG CGG TGC TCC AAA CCT CCT CCC
CAC CTC CTT CTC CTC CTC CTC CCT TTC CTT GGC TTT TAT CAT GCT
AAT ATT TGC AGA AAA TAT TCA ATA AAG TGA GTC TTT GCA CTT G-3
A pGKC23lO plazmidot szokásos módon lehet E.coli
Κ12 MM294/pGKC2310 törzsből izolálni, amely törzs a Northern Régiónál Research Laboratory (NRRL) Peoria, Illionis törzsgyűjteményben lett letétbe helyezve 1989. április 1-jén és lett az állandó törzs gyűjtemény része. Az E.coli K12 MM294/ pl<C23lO törzs tenyészetét az NRRL-től lehet beszerezni B-18356 sorszám alatt. A pl<C23lO plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között, a 12. ábrán mutatjuk be.
A pG2A52 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest nehéz láncának teljes kódoló szekvenciáját, a nehéz lánchoz kapcsolódó szignálpeptid kódoló szekvenciáját, valamint a molekula 5’ és 3' nem-transzlálódó régióit. A molekula által kódolt nehéz lánc IgG2A alosztályba tartozik.
Az 5* nem-transzlálódó régió DNS szekvenciája:
5’- TCG TTT GTC TTA AGG CAC CAC TGA GCC CAA GTC TTA GAC ATC- -3'
mig a 3 ' nem-transzlálódó r égió DNS- szekvenciája ι;
5'- TGA GCT CAG CAC CCA CAA AAC TCT CAG GTC CAA AGA GAC ACC CAC
ACT CAT CTC CAT GCT TCC CTT GTA TAA ATA AAG CAC CCA GCA ATG
CCT GGG ACC ATG TAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AGA GG-: 3'
···
- 19 A pG2A52 plazmidot szokásos módon lehet E.coli
K12 MM294/pG2A52 törzsből izolálni, amely törzs az NRRL törzsgyűjtéménynél lett letétbe helyezve 1988, április
1-én és lett az állandó törzsgyűjtemény része. Az E.coli «12 MM294/pG2A52 törzs tenyészetét az NRRL-től lehet beszerezni NRRL B-18357 sorszám alatt, A pG2A52 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 12, ábrán mutatjuk be,
A CHKC2-6 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest természetes könnyű láncú variábilis régióját kódoló cDNS szekvenciát, a könnyű lánchoz kapcsolódó szignál szekvenciát kódoló cDNS-t valamint a humán immunoglobulin könnyű láncú régiójának genomiális DNS szekvenciáját.
A CHKC2-6 plazmidot szokásos módon izolálhatjuk E.coli
K12 DH5/CHKC2-6 törzsből, amelyet szintén letétbe helyeztek az NRRL-nél 1988. április 1-jén és az állandó törzsgyűjtemény része lett. Az E, coli Κ12 DH5/CHKC2-6 tenyészet NRRL-B 18358 sorszám alatt szerezhető be az NRRL-től. A CHKC2-6 plazmid restrikciós és funkcionális a kisérő rajzok között a 13, ábrán mutatjuk be.
A CHKC2-18 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest könnyű láncú variábilis régiójának egy származékát kódoló cDNS szekvenciát, a könnyű lánchoz kapcsolódó szignál peptidet kódoló cDNS szekvenciát és a humán ···.
··...
immunoglobulin könnyű lánca konstans régióját kódoló genomiális DNS-t, Ennek a szekvenciának egy variánsa tartalmazza a kodon megváltoztatását a 3' végen, A természetes könnyű láncú variábilis régió a 3' végen egy arginin kodont tartalmaz, mig a CHKC2-18 plazmádban az azonos pozícióban lévő kodon glicin csoportot kódol. A CHKC2-18 plazmidot szokásos módon lehet izolálni E,coli Κ12 DH5/CHKC2-18 törzsből, amelyet szintén letétbe helyeztek az NRRL-nél 1988. április 1-jén és az állandó törzsgyüjtemény része lett. Az E.coli Κ12 DH5/CHKC2-18törzs tenyészetét NRRL B-18359 sorszám alatt lehet az NRRL-től beszerezni. A CHKC2-18 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 13, ábrán mutatjuk be,
A CH2A5 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest nehézláncu variábilis régióját kódoló cDNS szekvenciát az említett nehéz lánchoz kapcsolódó szignál peptidet kódoló CDNS kódoló szekvenciát, valamint az IgG1 humán immunoglobulin nehézláncu konstans régiójának genomiális DNS szekvenciáját. A CH2A5 plazmidot szokásos módon lehet izolálni E, coli I<12 MM294/CH2A5 törzsből.amelyet szintén letétbe helyeztek az NRRL-nél 1988, április 1-jén és az állandó törzsgyüjtemény része lett. Az E. coli K12 MM294/CH2A5 törzs tenyészetét NRRL··*· ···· ··· ···!
- 21 18360 sorszám alatt lehet az NRRL-től beszerezni, A CH2A5 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 14, ábrán mutatjuk be,
A CH2A5IG2 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest nehézláncu variábilis régióját kódoló cDNS-t a nehéz lánchoz kapcsolódó szignálpeptidet kódoló cDNS szekvenciát és az IgG2 humán immunoglobulin nehézláncu konstans régióját kódoló genomiális DNS szekvenciát, A CH2A5IG2 szokásos módon izolálható E.coli I<12 DH5/CH2A5 IG2 törzsből, anelyet szintén letétbe helyeztek az NRRL-nél 1988. április 1-jén és az állandó törzsgyöjtemény részévé tették. Az E.coli K12 DH5/CH2A5IG2 törzs tenyészetét NRRL B-18361 sorszám alatt lehet beszerezni az NRRL-től, A CH2A5IG2 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 14. ábrán mutatjuk be.
A CH2A5IG3 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest nehézláncu variábilis régióját kódoló cDNS szekvenciát, a nehéz lánchoz kapcsolódó szignál pepiidet kódoló cDNS szekvenciát .valamint az IgG3 humán immunoglobulin nehézláncu konstans régióját kódoló genomiális DNS szekvenciát, A CH2A5IG3 plazmidot szokásos módon lehet izolálni. E.coli K12 DH5/CH2A5IG3 törzsből, amelyet szintén letétbe helyeztek az NRRL-nél 1988. április 1-jén és az állandó törzsgyöjtemény részévé tették. Az E.coli Κ12 DH5/CH2A5/IG3 törzs tenyészetét NRRL B-18362 sorszám alatt ···· ···
- 22 lehet beszerezni az NRRL-től. A CH2A5IG3 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a
15. ábrán mutatjuk be.
A CH2A5IG4 plazmid tartalmazza a KS1/4 monoklonális antitest nehézláncu variábilis régióját kódoló cDNS szekvenciát, a nehéz lánchoz kapcsolódó szignálpeptidet kódoló cDNS szekvenciát és az IgG4 humán immunoglobujin nehézláncu konstans régióját kódoló genomiális DNS szekvenciát. A CH2A5IG4 plazmidot szokásos módon lehet izolálni E.coli K12 DH5/CH2A5IG4 törzsből, amelyet szintén letétbe helyeztek az NRRL-nél 1988. április 1-jén és az állandó törzsgyüjtemény részévé tették. Az E.coli Κ12 DH5/CH2A5IG4 törzs tenyészetét NRRL-B-18363 sorszám alatt lehet beszerezni az NRRL-től, A CH2A5IG4 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 15. ábrán mutatjuk be.
A jelen találmány szerinti, rekombináns l<Sl/4-et és származékait kódoló DNS vegyületek különösen előnyösen használhatók olyan vektorok előállítására, amelyekkel lehetséges emlős és más eukarióta sejtek transzformálása és különböző antitest láncok expressziója. Számos emlős gazdasejt rendelkezik a szükséges rendszerrel ahhoz, hogy a jelen találmány szerinti különböző antitest-láncok amino-terminális részén jelenlévő szignálpeptideket fel>· ·: *·;:···:
···· ··*· ,·* ···
- 23 ismerje és megfelelően feldolgozza. Néhány emlős sejt képes a poszt-transzlációs módosításokra, például az antitest molekuláknál megfigyelt glikozilezésre. Eukarióta gazdasejtek transzformálására számos különböző vektor létezik, és az alábbiakban példaként bemutatott speciális vektorokkal nem szándékozunk korlátozni a jelen találmány oltalmi körét.
A jelen találmány szerinti expressziós vektorokat, amelyek a rekombináns KS1/4 és ennek kiméra származékai előállítását irányítják, phd plazmidok felhasználásával állítottuk elő. A phd plazmidot számos, körforgalomban lévő kiindulási anyagból állítottuk elő. A phd plazmid restrikciós és funkcionális térképet a kisérő rajzok között, a 11. ábrán mutatjuk be,
A phd plazmid előállítása első lépéseként a pl<C283 plazmidot izoláljuk E.coli K12 BEl20l/pl<C283 törzsből. Ez a törzs NRRL B-1583O sorszám alatt érhető el az NRRL-nél (letétbe helyezve 1984 augusztus 3-án). A pl<C283, plazmid egy, lambda bakteriofágból származó lpp-pL hibrid promotert tartalmaz. Ezt a plazmidot E.coli Κ12 BE12O1 sejtekből lehet előállítani, mivel az a sejt tartalmaz egy, a sejt kromoszómális DNS-ébe integrálódott hőmérséklet-érzékeny Cl represszort, A pl<C283 plazmidból a szükségtelen lacZ részt kivágjuk, a plazmidot először PvuII restrikciós
:··· ··· enzimmel hasítva. Az emésztett DNS-hez ezután specifikus DNS-linkereket adunk» hogy a PvuII helyeket egyetlen Xhol hellyé alakítsuk, igy állítva elő a pKC283PX plazmidot. A pl<C283 és pl<C283PX plazmidok izolálásának részletes leírása az 1. illetve 2, példában található. A pl<C283 és pl<C283PX plazmidok restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között, az 1. ábrán mutatjuk' be. A 3. példában leírtak szerint a pl<C283PX plazmidot E.coli 1<12 MO ( ) törzsbe transzforrnáljuk. Az E.coli Κ12 MO (^+) törzs NRRL B-15993 sorszám alatt hozzáférhető az NRRL-nél (letétbe helyezve 1985 augusztus 14-én).
A pl<C283 PX plazmidot ezután BglII és Xhol restrikciós enzimekkel emésztjük. A vektor tisztítása után BglII és Xhol végekkel rendelkező DNS linkereket ligálunk a vektorba, igy kapjuk a pl<C283-L plazmidot. A BglII-XhoI linker egy Xbal helyet is tartalmaz. A pl<C283-L plazmid Xhol helyét ezután BamHI hellyé alakítjuk. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a pl<C283-L plazmidot teljesen megemésztjük Xhol enzimmel, ezután Klenow polimerázzal kezeljük, majd BamHI linkereket adunk hozzá, igy kapjuk a pl<C283-LB plazmidot, A p|<C283-L és pKC283-LB plazmidok készítésének részletes leírását
- 25 a 4. és 5. példákban mutatjuk be, A PKC283-L és pl<C283-LB plazmidok restrikciós funkcionális térképét a kisérő rajzok között, az 1, ábrán mutatjuk be,
A pl<C283PX plazmidból ezután kivágjuk az idegen E, coli DNS-t Sáli enzimmel való teljes emésztéssel, ezután a n)4,0 kb méretű vektort Klenow fragmenttel kezeljük, végül EcoRI linkereket adunk hozzá, Ligálással való visszazá rás után kapjuk a pl<C283PRS plazmidot. A pl<C283PRS plazmidot ezután PstI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük és a rU0,85 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentet izoláljuk. Analóg módon a pl<C283-LB plazmidot PstI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük és a rv3,0 kb méretű f ragmentet izoláljuk. A pl<C283PRS«ből számos *JO,85 kb méretű Pstl-Sphl fragmentet a pl<C283-LB rJ 3,0 kb méretű Pstl-Sphl vektor fragmentjébe klónozva kapjuk, a pL32 plazmidot, A pl<0283 PRS és pL32 plazmidok előállításának részletes leírása a 6, példában található. A pl<C 283PRS és pL32 plazmidok restrikciós és funkconális térképét a kisérő rajzok között az 1, ábrán mutatjuk be.
Ezután a pNM789 plazmidot állítjuk elő E.coli K12RV308/PNM789 törzsből, amelyet 1987 május 4-én helyeztek letétbe az NRRL-nél 8-18216 sorszám alatt, A pNM789 plazmid restrikciós és funkcionális térképet a kisérő rajzok között, a 2, ábrán mutatjuk be. A pNM789 ♦··· plazmidot részlegesen teljesen megemésztjük alkalikus foszfatázzal BamHI linkért ligálunk vektorba, igy kapjuk a midot ezután teljesen ciós enzimekkel és a Xbal-BamHI fragmente megemésztjük Xbal és /0 3,9 kb méretű vek mid 0,6 kb méretű pL32 plazmid rV3,9 kb kapjuk a pL47 plazmidot. tásanak részletes leírását a A 120 és pL47 plazmidok rest a 3. és 4. ábrán közöljük a
A pRl2 plazmid let-érzékeny pL represszor tetraciklin rezisztencia g 4 436 815 sorszámú Amerika, dalmi leírásban A pPRl2 plazmid rajzok között a helyet eltávolitj emésztjük PvuII restrikciós
BamHI restrikciós enzimmel, kezeljük. Ezután egy uj PvuII az emésztett, foszfatázozot
120 jelű plazmidot, A 120 megemészjük Xbal és BamHI t izoláljuk, A pL32 plazmidot
BamHI restrikciós enzimekkel tor-fragmentet izoláljuk.
A 120 méretű vektor-fragmentjébe
A 120 és pL47 plazmidok
6, és 7, rikciós és kis érő enzimmel, majd t pNM789 plazres t rikkódoló szintén és a plaza igáivá előállipéldában közöljük.
funkciós térképét rajzok között.
tartalmazza a cI857 hőmérséként és a pBR322-ből származó ént. A pPRl2 jelű plazmidot a Egyesült Allamok-beli szabaigénylik (1984 március 13.). és funkciós térképét a kisérő Az EcoRI hasítási először teljesen írják le és restrikciós
4.
ábrán mutatjuk be.
uk a pPR12 plazmidból
2.Ί megemésztve a plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel, majd Klenow fragmenttel kezelve, A vektort ezután ligálással visszazárjuk, igy kapjuk a pPRl2/yR1 plazmidot. A pPR12/\R1 plazmidot ezután Aval restrikciós enzimmel emésztjük, majd Klenow fragmenttel kezeljük. Az Aval enzimmel emésztett, Klenow framgenttel kezelt pPR12y\R1 plazmidot EcoRI linkerekhez ligáljuk. majd recirkularizálvakapjuk a pPRl2AR1 plazmidot, A pPR12A1 plazmid készitésének részletes leírását a 8. példában adjuk meg. A pPR12ARl plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között, a 4. ábrán adjuk meg.
A a/2 ,9 kb méretű Pstl-EcoRI f ragmentet izoláljuk a pPRl2AR1 plazmidból, miután a plazmid DNS-t PstI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük. A pL47 plazmidot PstI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a R2,7 kb méretű Pstl-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk. Egy külön reakcióban a pL47 plazmidot EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük és a rv 2,03 kb méretű EcoRI-BamHI fragmentet izoláljuk. A pL47 plazmidból származó 2,7 kb méretű Pstl-BamHI és a a/1,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikcióé fragmentet a pPRl2AR1 plazmidból származó ru 2,9 kb méretű Pstl-EcoRI restrikcióé fragmenthez ligáivá kapjuk a pL1!0 jelű plazmidot. A pL110 plazmid készitéeének rész···· ···· · • · ·
letes leírását a 9. példában mutatjuk be. A pl_l10 plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 4. ábrán mutatjuk be.
A jelen találmány szerinti Bl< erősítő (énKancer)-tipusu vektor tartalmaz egy BK erősitőadshovirus késői protomsr kazettát.plusz sgy higromioin rezisztenciát kódoló gént és egy rágcsáló dihidrofolát-rsduktáz (dhfr) gént. A BK vírus erősítő és az adsnovirus késői promoter lényegesen megnöveli egy rekombináns gén transzkripcióját eukarióta gazdasejtekben. A higromicin rezisztenciát kódoló gén eukarióta sejtekben használható szelekciós marksrként van jelen. A rágcsáló dihidrofolát reduktáz gén megfelelő körülmények között amplifikálódik a gazda kromoszómában. Ez az amplifikálódás, melyet Schimke ir le egy review-ban [Cell, 37. 705-713 (1984)1 olyan DNS szekvenciákat is érinthet, amelyek szoros közelségben vannak a dhfr génnel. A dhfr gén szelektálható marksr dhfr-negativ sejtekben és arra használható, hogy a DNS szegment kópia-számát megnövelje, a gazdasejtet fokozatosan növekvő koncentrációjú metoirexát hatásának kitéve.
A pLPChd plazmidot használhatjuk eukarióta sxprsseziós vektor előállítására, a jelen találmány szerinti uj KS1/4 expresszélása céljából. A pLPC hd plaz• · • · ···· *.··· · • · · • · · • · ··· • ·
- 29 tartalmazza a dhfr gént, az adenovirus 2-es tipusu promoterét és a BK vírus erősítőt. A BK vírust» amsly a BK vírus erősítőt tartalmazza, megvásárolhatjuk, vagy könnyen nagymennyiségben előállíthatjuk a 10. példában leírtak szerint. A BK vírus hozzáférhető még ATCC VR-837 sorszám alatt az Amsrican Typs C. ulture Collec» tion-nál. A BK vírus restrikciós és funkcionális térképét a kísérő rajzok között, az 5. ábrán mutatjuk be.
A BK virális genomot a pdBPV-MMTneo gén egy részével kombinálva állítjuk elő a pBKneol és pBKneo2 plazmidokat. A pdBPV-MMT neo plazmid , amely körülbelül 15 kb méretű és ATCC 37224 sorszám alatt hozzáférhető az ATCC-nél, tartalmazza a pBR322-ből származó replikont és béta-laktamáz gént, az egér metallotionein promotort olyan pozícióban, hogy egy neomicin rezisztencia enzimet kódoló gén expiesszióját irányítsa, valamint agy <v 8 kb méretű szarvasmarha papillóma vírus (BPV) DNS-t. A pdBPV-MMT neo plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztve két fragment keletkezik, egy n/8 kb méretű a BPV DNS-t tartalmazó fragment, és egy 7 kb méretű fragment, amely a többi említett szekvenciákat tartalmazza. A BK vírusban csak egy BamHI restrikciós hasítási hely van, és a pBKneol illetve pBKneo2 plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a pdBPV-MMTneo plazmid eJ7 kb ·· * · · · · · • · · · · ···· ···· ··· ·· · ·
- 30 méretű BamHI restrikciós fragmentjét BamHI restrikciós enzimmel linsarizált BK vírus DNS-hez ligáljuk. A pBK neo1 és pBK neo2 plazmidok előállítását (amelyek csak a BK vírus DNS orientációjában különböznek egymástól), a
11. példában írjuk Is. A pBKnsol egy 2,1 kb mérető Sall-HindLII fragmentet tartalmaz, mig a pBKneo2 egy ^1,0 kb mérető restrikciós fragmentet tartalmaz. A pBKneol restrikciós és funkconális térképét a kisérő rajzok között, az 5. ábrán mutatjuk be.
Mind a pBKneol és mind a pBKneo2 plazmid tartalmazza a BK virus teljes genomját, beleértve az erősítő szekvenciát, igy megfelelő tó-indulási alapként szolgálnak a jelen találmány szerinti expressziós vektorhoz.
Az expressziós vektor, a pBLcat plazmid egymás utáni elrendezésben tartalmazza a BK erősitő szekvenciát a humán adenovirus 2-es tipusu késői promoterrel, amelynek olyan az elhelyezése, hogy a kloramfenikol acetiltranszferáz enzim (CAT) expresszióját irányítja. A pSV2cat plazmid megfelelő forrása a CAT génnek és ATCC 37155 sorszám alatt hozzáférhető az ATCC-nél. A humán adenovirus 2-es tipusu DNS kereskedelmi forgalomban kapható, valamint ATCC VR-2 sorszám alatt hozzáférhető az ATCC-nél.
• · • · ·· · • de
- 31 A jellemző pBLcat plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a humán adenovirus 2-es tipusu DNS késői promoterét tartalmazó /v 0,32 kb mérető AccI-PvuII restrikciós fragmentet tompavégű Bell linkerekhez, kapcsoljuk, amelyek az AccI-PvuII restrikciós fragme%nek csak a PvuII végéhez kapcsolódnak. A kapott fragmentet ezután a pSV2cat plazmidból származó λ/4,51 kb mérető Accl-Stul restrikciós fragmenthez kapcsoljuk, igy kapjuk a pLBcat intermedier plazmidot. A kivánt pBLcat plazmidot úgy állítjuk elő, a pLPcat plazmidból, hogy a BK virus DNS-ének replikációt és erősítő szekvenciát tartalmazó <υΐ,28 kb méretű AccI-PvuII restrikciós fragmentjét a pLPcat plazmid /U4.81 kb méretű Accl-Stul restrikciós fragmentjéhez ligáljuk. A pBLcat plazmid előállítását a 12.példában^rjuk le. A pLPcat és a pBLcat plazmidok restrikciós és funkcionális térkepét a kísérő rajzok között a 6. ábrán mutatjuk be.
Ezután a pPL133 plazmidot állítjuk elő a pHC7, pSV2gpt és pSV2-béta-globin plazmidokból. A pHC7 plazmid egy humán C fehérjét kódoló DNS szekvenciát tartalmaz. A pHC7 plazmidot az E.coli K12RR1/pHC7 törzsből állíthatjuk elő, amely NRRL B-15926 sorszám alatt hozzáférhető az NRRL-nél (letétbe helyezve 1985. január 29-én). A pHC7 plazmidot Báni restrikciós enzimmel emésztjük, és egy a) 1 ,25 kb méretű restrikciós fragmentet izolálunk.
A pHC7 plazmidot ezután PstI restrikciós enzimmel hasítjuk, majd egy n/0,88 kb méretű restrikciós fragmentet izolálunk, linkereket adunk hozzá, majd a fragmentet újra hasítjuk Apai és BglII restrikciós enzimekkel, majd a aj 0,19 kb méretű Apal-BglII restrikciós fragmentet izoláljuk. A pSV2gpt plazmidot (ATCC 37145) HindlII és BglII restrikciós enzimekkel hasítjuk, majd egy ^5,1 kb méretű fragmentet izolálunk. Az a/1 ,23 kb méretű HindlII-Apal restrikciós fragmentet és a a) 5,1 kb méretű HindlII-BglII fragmentet ősszeligálva kapjuk a pSV2-HPC8 intermedier plazmidot. A pSV2-HPC8 plazmid előállításának részletes magyarázatát a 13. példában adjuk meg. Ennek a konstrukciónak a sémáját a kisérő rajzok között a 7. ábrán mutatjuk be.
A pSV2-HPC8 plazmidot ezután HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel hasítjuk, majd a a; 0,29 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk. Hasonlóképpen a pSV2HPC8 plazmidot és hasítjuk BglII és Sáli restrikciós enzimekkel, majd a ^1,15 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk. A pSV2-béta-globin plazmidot (NRRL B-15928, letétbe helyezve 1985 január 29-én) BglII és HindlII restrikciós enzimekkel hasítjuk, és a aj4,2 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk. Ezt a három fragmentet ősszeligálva kapjuk a pPLl33 plazmidot, A pPL133 plazmidot Hindin restrikciós enzimmel hasítjuk, majd alkalikus foszfatázzal kezeljük. A pBLcat plazmidot is hasit- • W · ···· «··« * • · ·· · · · • · · · · • ·····!
···· ··· ·· ,
- 33 juk HindlII restrikciós enzimmel és a λ/0,87 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk. Ezt a fragmentet ligáljuk a HindlII-mal hasitott( foszfátázott pPL133 vektorba, igy kapjuk a pLPC plazmidot. Mivel a pBLcat HindlII fragment két orientációban épülhet a pPLl33 plazmidba.meg kell jegyeznünk.hogy pLPC alatt azt a plazmidot ért jűk .amelyben egy ω 1 ,0 kbméretü Ndel-Stul4e3”'er'’^ megléte bizonyltja a helyes orientációt.
A pLPC plazmid a pLl33 plazmidhoz hasonlóan tartalmazza az erősítő szekvenciát, a korai és késői promotereket. T-antigén kötő helyeket valamint az SV40 replikációs origóját. A pL133 és pLPC plazmidok előállitésának részletes leírását a 13. és 14. példában adjuk meg. A pL133 és pLPC plazmidok restrikciós és funkconális térképét a kisérő rajzok között a 7. és 8. ábrán adjuk meg.
A pLPC plazmidban az SV40 elemek szorosan egymás mellett találhatók, és nehéz elválasztani őket. A T-antigén kapcsolódása a T-antigén kötő helyhez, amely szükséges az SV40 replikációjához, ismert,hogy meggyorsítja a transzkripciót az SV40 késői promoteréről, és meglepő módon hasonló hatással van a BK késői promotarre. Mivel az SV40 replikációs origót tartalmazó plazmidnak magas szintű T-antigén által vezérelt replikációja általában letális a gazdasejtre, ezért sem a pLPC sem a
pL133 plazmid nem marad fenn stabilan episzomális (extrakromoszómális) formában SV40 T-antigén jelenlétében, hanem a két plazmidnak inkább integrálódnia kell a gazdasejt kromoszómáiis DNS-ébe hogy stabilan fennmaradjanak. A BK erősítő régió teljes szerkezete nagyon haeonlit az SV40-ére, mivel a BK erősítő, a replikációs origó, a korai és késői promoterek, valamint a T-antigén kötő helyek BK analógja szintén egymás mellett található és nehéz elválasztani a BK vírus DNSen. Ha azonban BK T-antigén jelenlétében növekszik a plazmid, amely a BK replikéciós origót és T-antigén kötőhelyet tartalmazza, akkor nem replikálódik olyan mértékig, amely letélisnak bizonyul, és stabilan fennmarad episzómális formában a gazdasejtben. Ezenkívül a T-antigén által vezérelt replikációt használhatjuk a BK replikációs origót tartalmazó vektor kópiaszámának növelésére, olymódon, hogy szelekciós nyomás hatására több plazmid-kópia épül be a gazdasejt kromoszómáiis DNS-ébe. Valószínűleg a BK és SV40 T-antigének és megfelelő kötőhelyek közötti hasonló szerkezet-funkció összefüggés miatt a BK replikációt is stimulálja az SV40 antigén.
A rekombináns DNS expressziós vektor episzómális formában való fennmaradása nem mindig előnyöe a gazdasejt kromoezómájába való integrálódással szemben.
···· ··· ·· ···
- 35 Azonban egy eukarióta sejtekben is működő szelekciós marker hiánya miatt a pLPC plazmiddalkapott stabil eukarióta transzformánsok azonosítása nehéz, hacsak a pLPC plazmidot nem transzformáljuk más, szelekciós markert tartalmazó plazmiddal, Emiatt a pLPC plazmidot módosítottuk,hogy eukarióta gazdasejtekben szelektálható származék plazmidokat kapjunk· Ezt úgy végezzük, hogy a pLPC plazmidot egy higromicin rezisztencia gént tartalmazó plazmid^a pSV2 hyg egy részéhez ligáljuk. A pSV2 hyg plazmidot NRRL B-18039 sorszám alatt szerezhetjük be a Northern Régiónál Research Laboratory-tól (NRRL) (letétbe helyezve 1986 február 11én). pSV2 hyg plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 8. ábrán mutatjuk be·
A pSV2 hyg plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a nJ2,5 kb méretű BamHI restrikciós fragmsntet Izoláljuk, amely a teljes higromicin-rezisztsncia gént tartalmazza, majd Klenow enzymmel kezeljük (az E.coli DNS polimeráz I-ből szubtilizines hasítással előállítható nagy fragment) és a Klenow fragmenttel kezelt nJ5,82 kb méretű pLPC Ndel-Stul restrikciós fragmenthez ligáljuk, igykapjuk a pLPC hyg1 és pLPC hyg2 plazmidokat. A pLPChygl és pLPChyg2 csaka higromicin rezisztencia fragment orientációjában különbőznek egymástól. A pLPChygl plaz• ··
- 36 mid egy aj 5,0 kb méretű Hindui fragmentet tarfelmaz, mig a pLPChyg2 plazmid egy /v1,0 kb mérető fragmentet. A pLPChygl és pLPChyg2 plazmidok előállításának leírása a 15. példában található. A pLPChygl és pLPChyg2 restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között a 8. ábrán közöljük.
Ezután a rágcsáló dihidrofolát-reduktáz (dhfr) gént tartalmazó pBW32 plazmidot állítjuk elő. A pPA102 plazmidot (NRRLB-15834) letétbe helyezve 1984 augusztus 10-én) Tth111I restrikciós enzimmel hasítjuk és a a; 4,4 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk. Ezt a fragmentet Klenow enzimmel kezeljük, linkért adunk hozzá, majd a fragmentet Hindin és BamlII restrikciós enzimekkel kezelve agy a; 2,0 kb méretű restrikciós fragmentet kapunk. A pRC plazmidot állítjuk elő a pTPA102 plazmidból származó, n) 288 bp méretű Clal-EcoRI restrikciós fragmentet Clal-EcoRi enzimekkel hasított pKC7 vektorba ligáivá, A pKC7 plazmid ATCC 37084 sorszám alatt hozzáférhető az ATCC-nél.
A pRC plazmidot BamHI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fenti, pTPA102 plazmidból származó <v2,0 kb méretű restrikciós fragmeríhez ligáivá kapjuk a pTPA103 plazmidot, A pTPA103 plazmid előállítási eljárását a 16A. példában közöljük. Ennek az eljáráenak ···· ···· · • · · ···· ·
- 37 a sémáját a kisérőrajzok között a 9. ábrán mutatjuk be,
A pTPA103 plazmidot BglII restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd Ndel linkereket adunk hozzá. Ezt a keveréket ligáivá kapjuk a pTPA103 dér Ndel plazmidot. A pTPAlO3derNdel plazmidot Avall restrikciós enzimmel hasítjuk, majd egy /v1,4 kb méretű fragmentet izolálunk. Ezt a fragmentet Klenow enzimmel kezeljük, majd Hpal linkerek hozzáadása után EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk. A λ>770 bp méretű, trpO-t és a TPA aminoterminálie végét tartalmazó fragmentet EcoRI-Smal enzimekkel emésztett pUCl9 vektorba ligáivá kapjuk a pUCl9 TPAFE vektort. ApUC19TPAFE plazmidot részlegesen emésztjük Hpal restrikciós enzimmel, majd teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel. A kapott ^3,42 kb méretű HpalBamHI restrikciós fragmentet ezután a pTPA1O3 plazmidból származó a>1,O15-kb méretű Scal-BamHI fragmenthez ligáivá kapjuk a pBW25 plazmidot. A pBW25 plazmid előállítási eljárását a 16B példában Írjuk le. Ennek az eljárásnak a sémáját a kisérő rajzok között a 9. ábrán közöljük.
A pBW25 plazmidot Hindin és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítva, majd a kapott /V8iO bp méretű fragmentet HindlII-EcoRI enzimekkel hasított M13mp8
fágba (New England Biolabs) ligáivá kapjuk a pM8BW26 fágot. A pM8BW26 fágon ezután agy in vitro mutagenezis reakciót végzőnk (aminosavakat kódoló DNS-t hasítva ki), igy kapjuk a pM8BW27 fágot, A pM8BW27 fágot EcoRI és Ndel restrikciós enzimekkel hasítva kapjuk a rv 560 bp méretű restrikciós fragmentet. Egy rJ48 bp hosszúságú Ndel-Xbal linkért állítunk elő kémiai szintézissel, A pTPAlO3 plazmidot ezután EcoRI és BamHl restrikciós enzimekkel emésztjük és egy <v689 bp mérető fragmentet izolálunk, A 9, példa szerint előállított pl_110 plazmidot részlegesen emésztjük BamHl restrikciós enzimmel, majd teljesen emésztjük Xbal enzimmel és egy rJ6,0 kb mérető fragmentet izolálunk. Ezt a ru6,0 kb mérető vektor fragmentet a pTPA103 689 bp mérető fragmentjét, a pM8BW27 fág /v560 bp mérető fragmentjét és a íV48 bp mérető linkért összaligálva kapjuk a pBW28 plazmidot. A pBW28 plazmid előállítását a 16C, példában Írjuk le. Ennek az eljárásnak a sémáját a kisérő rajzok között a 10, ábrán mubatjuk be.
Ezután a pTPA301 plazmidot állítjuk elő a Ό2,0 kb mérető HindlII-BglII pTPA103 fragmentet a pSV2-béta-globin plazmid /v4,2 kb mérető HindlII-BglII fragmentjéhez ligáivá. A pSV2-dhfr plazmidot (ATCC37145) PvuII restrikciós enzimmel hasítjuk, BamHl linkerek hozzáadását köetően a λ) 1,9 kbméretű dhfr gén tartalmú ···· ···· • ·
- 39 fragmentet BamHI-gyel hasított .foszfatázozott pTPA301 plazmidba építjük, így kapjuk a pTPA303 plazmidot, A pTPA301 plazmidot EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel emésztve kapunk egy ω2,7 kb méretű fragmentet· A pTPA3O3 plazmidot ezután HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítjuk, igy kapunk egy nJ2340 bp méretű dhfr gént tartalmazó fragmentet. A pTPA 303 plazmidot HindlII és SstI restrikciós enzimekkel hasítva kapunk egy fVl ,7 kb méretű fragmentet, A pBW28 plazmidot XhoII és SstI enzimekkel hasítva egy nj680 bp méretű fragmentet kapunk, A pTPA301 plazmidból származó ^2,7 kb méretű EcoRI-BglII fragmentet, a pTPA303 plazmidból származó <ν2340 bp méretű HindlII-EcoRI fragmentet, a pTPA303-ból származó a; 1,7 kb méretű HindlIISstl fragmentet és a pBW28 plazmidból származó nJ 680 bp méretű Xhall-SstI fragmentet összeligálva kapjuk a pBW32 plazmidot. A pBW32 plazmid előállítási eljárását a 16D, példában írjuk le. Az eljárás sémáját a kisérő rajzok között a 10, ábrán mutatjuk be,
A pBW32 plazmid rv 1 ,9 kb méretű, dhfr gént tartalmazó BamHI fragmentjét izoláljuk, Klenow enzimmel kezeljük, majd EcoRI restrikciós enzimmel részlegesen emésztett pLPChygl plazmidba építjük be, igy kapjuk a pLPChd! és pLPchd2 plazmidokat . A pLPChygl ···· ···· ·
- 40 plazmid két EcoRI restrikciós enzim felismerési helyet tartalmaz, az egyiket a higromicin rezisztencia génben a másikat a pBR322 eredetű szekvencia részben, A dhfr gént tartalmazó fragmentet a pLPChygl plazmid pBR322 eredetű szekvenciájában lévő EcoRI helyre klónozzuk, igy kapjuk a pLPChdl és pLPChd2 plazmidokat. A jelen le írás során a pLPChdl plazmidot pLPChd plazmidnak nevezzük. A pLPChd plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 11. ábrán mutatjuk be. A pLPChdl és pLPChd2 plazmidok konstrukcióját, amely csak a dhfr gént tartalmazó DNS szegment orientációjában különbözik, a 17, példában közöljük.
A phd plazmidot ezután úgy állítjuk elő, . hogy a pLPChd plazmidot dam~ E.coli törzsbe transzformáljuk, majd onnan visszaizoláljuk. A pLPChd plazmidot ezután Bell restrikciós enzimmel emésztjük, és recirkularizálva kapjuk a phd plazmidot, A phd plazmid egy olyan delécióból származik .amely a pLPcat plazmid készítése során bevitt extra Bell linkerek, valamint a két szomszédos Bell restrikciós fragmentet távolítja el a pLPChd plazmidból, ,45 kb méretben. A KS 1/4 monoklonális antitest könnyű láncát kódoló teljes hosszúságú cDNSt tartalmazó DNS fragmentet a phd plazmidba ligáivá kapjuk a pL-KSL expressziós vek• ·· · tort. A pKGC231O plazmid 1100 bázispár méretű EcoRI fragmentjét Klenow enzimmel kezeljük, BamHI linkerekhez kapcsoljuk, majd a Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plazmidba ligáljuk. A phd és pL-KSL plazmid készítésének részletes leírását a 18. és 19. példában adjuk meg, A phd plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 11, ábrán adjuk meg.
A pH-KS plazmid egy jelen találmány szerinti vektor, amely a phd és pG2A52 plazmidból származik, A pG2A52 plazmid 1,6 kb méretű EcoRI fragmentjét izoláljuk, Klenow enzimmel kezeljük és BamHI linkereket kapcsolunk rá. Ez a fragment tartalmazza a KS 1/4 monoklonális antitest nehéz láncának teljes hosszúságú cDNS-ét. Ezt a fragmentet ezután Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plazmidba ligáivá kapjuk a pH-KS expressziós plazmidot.A pL-HD egy olyan expressziós vektor, amelyet a phd plazmidból és a CHKC2-18 jelű plazmidból állítunk elő, amely egy humán könnyű lánckonstans régiójához kapcsolt KS1/4 könnyű lánc variábilis régió származékát kódoló DNS-t tartalmaz, A CHKC2-18 plazmid rU1,3 kb méretű FnuDII-HindIII fragmentjét izoláljuk és Klenow enzimmel kezeljük. Ezt a fragmentet Bell enzimmel emésztett, Klenow enzimmel kezelt phd plazmidba ligáljuk, igy kapjuk a pL-HD ·· · ···· ···· · • · ·· · · · • 1 · · · * ·. · · · ···
- 42 expressziós plazmidot. A pH-KS é9 pL-HD plazmid készítésének részletes leírását a 20. és 21, példában mutatjuk be.
A pL -HD2 egy expressziós vektor, amelyet a phd plazmidból állítunk elő valamint a CHKC2-6 plazmidból, amely egy humán könnyű lánc konstans régióhoz kapcsolt KS1/4 könnyű lánc variábilis régió természetes szekvenciáját kódoló DNS szakaszt tartalmaz· A CHKC2-18 plazmid rv1 ,3 kb méretű FnuDII-HindlII fragmentjét izoláljuk és Klenow enzimmel kezeljük. Ezt a fragmentet ligáljuk Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plaztnidba, igy kapjuk a pL-HD2 expressziós plazmidot, A pH1-HD plazmidot, amely egy humán IgG1 konstans régiót kódoló genomiális DNS-hez kapcsolt KS1/4 nehézláncú variábilis régiót kódoló cDNS-t tartalmaz, a phd és CH2A5 plazmidból állítjuk elő. A CH2A5-plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd BamHl linkerekhez kapcsoljuk. A plazmidot ezután BamHl restrikciós enzimmel kezeljük és egy ^7,4 kb méretű restrikciós fragmentet izolálunk. Ezt a fragmentet ligáljuk Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plazmidhoz, igy kapjuk a pH1-HD expressziós plazmidot, A pL-HD2 és pH1-HD plazmidok előállításának részletes leírását a 22, és 23, példákban közöljük.
···· ···· a
- 43 A pH2-HD plazmidot, amely egy humán IgG2 konstans régiót kódoló gsnomiális DNS-hez kapcsolt KS1/4 nehéz-lánc variábilis régiót kódoló cDNS-t tartalmaz, phd és CH2AIG2 plazmidokból állítjuk elő. A CH2A5IG2 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd BamHI linkereket kapcsolunk hozzá. Ezután a plazmidot BamHI restrikciós enzimmel kezeljük egy rv 6,1 kb méretű restrikciós fragmentet izolálunk. Ezt a fragmentet ligáljuk Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plazmidba, igy kapjuk a pH2-HD expressziós plazmidot. A pH3-HD plazmidot, amely humán IgG3 konstans régiót kódoló genomiális DNS-hez kapcsolt KS1/4 nehéz lánc variábilis régiót kódoló cDNS-t tartalmaz, phd és CH2A5IG3 plazmidból állítjuk elő. A CH2AIG3 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd BamHI linkerekhez kapcsoljuk. A plazmidot ezután BamHI restrikciós enzimmel emésztjük és egy λ/7,4 kb méretű restrikciós fragmentet izolálunk. Ezt a fragmentet Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plazmidba ligáljuk, igy kapjuk a pH3-HD expressziós plazmidot. A pH2-HD és pH3-HD plazmidok részletes előállítási leirását a 24, és 25. példákban közöljük.
A pH4-HDplazmidot, amely humán IgG4 konstans régiót kódoló genomiális DNS-hez kapcsolt KS1/4
- 44 nehéz lánc variábilis régiót kódoló cDNS-t tartalmaz, phd és CH2A5IG4 plazmidokból állítjuk elő. A CH2A5IG4 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd BamHI linkerekkel kapcsoljuk. A plazmidot ezután BamHI restrikciós enzimmel emésztjük és egy 6,4 kb méretű restrikciós fragmentet izolálunk. Ezt a fragmentet ligáljuk Bell reetrikciós enzimmel emésztett phd plazmidba, igy kapjuk a pH4-HD expressziós plazmidot. Az előállítás részletes leírását a 26. példában közöljük.
A jelen találmány semmiképpen sem korlátozódik a bemutatott eukarióta promoterek használatára. Más promoterek, úgymint a homológ és heterológ immunoglobulin promoterek, az SV40 késői promoter, vagy eukarióta gének promotere, úgymint például az ösztrogén-indukálható csirke ovalbumin gén, az interferon gének, a glükokortikoid indukálható tirozin-aminotranszferáz gén, a timidin-kináz gén, a fő korai adenovirus gén, és az SV40 . korai promotere könnyen izolálható és módosítható, eukarióta gazdasejtekben antitestek előállítására tervezett rekombináns DNS expressziós vektorokban való felhasználásra. Eukarióta promoterek is használhatók tandem elrendezésben ilyen antitestek expressziójának irányítására. Továbbá nagyszámú retrovirusról ismert, hogy igen sokféle eukarióta gazdasejtet ·· • · ··♦· képes megfertőzni. A retrovirus DNS-ben lévő hosszú ismétlődő végszakaszok gyakran promoter aktivitást kódolnak, és a fent leirt BK erősitő-adenovirus késői promoters helyett használható KS1/4 és származékai expressziójának vezérlésére, A jelen szabadalmi leírás nem korlátozódik továbbá a példaként említett plazmidokban példaként szereplő aktuális szelekciós markerekre. Nagyszámú különböző szelekciós marker létezik, mind eukarióta, mind prokarióta gazdasejtek számára, amelyek használhatók a jelen találmány szerinti OWS molekulát (szekvenciát) tartalmazó rekombináns DNS klónozó vagy expressziós vektorban,
A különböző expressziós vektorok transzforrnálhatók és expresszálhatók különböző eukarióta, főleg emlős gazdasejtekben· Az e>p ressziós vektorok tartalmaznak E.coli replikációs origót, mivel általában E.coliból hatékonyabban lehet plazmid DNS-t izolálni, mint más gazdasejtekből. Antitestek expresszálódnak a gazdasejtekben, amelyekben az adott promoter az antitest strukturgén funkcióival kapcsolódik. A gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy számos eukarióta gazdasejt használható a különböző antitestek expresszálására a BK erősitő-adenovirus késői promoterének felhasználásával, ameddig a gazdasejt egy ·· • · ···· • ···· ···· · ·· · · · • · · · · • · · · ···’ ♦·< ·· · φ nagy DNS-virus azonnali-közeli géntermékét expresszálja. Mivel az azonnali-közeli génterméket akárhogy bejuttathatjuk a gazdasejtekbe, például plazmiddal vagy más vektorral való transzformáció utján, látszólag bármely eukarióta sejt használható a jelen szabadalomban leirt módszerrel. A jelen találmány szerinti eljárásban a humán sejtek az előnyös gazdasejtek, mivel a humán sejtek a BK virus természetes gazdasejtjei és a BK srősitőt stimuláló sejt-faktorokat tartalmazhatnak, Mig humán sejtek használhatók gazdasejtként, az adenovirus 12-transzformált AV12 aranyhörcsög sejtvonal, amely az E1A génterméket expresszálja a legelőnyösebb, és ATCC CRL9595 sorszám alatt hozzáférhető az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland), letétbe helyezve 1987 november 24-én. A normál transzformációs eljárást részletesen a 27. példában irjuk le.
Egy immunoglobulin nehéz láncot kódoló expressziós vektorral transzformálva a AV12 sejtek szekretálják a processzált nehéz láncot a felQluszóba. Azonban könnyű láncot kódoló expressziós vektorral transzformált AV12 sejtek nem szekretálják a könnyű láncot, hacsak a sejtek nincsenek ko-transzformálva nehéz láncot kódoló expresszió vektorral. A jelen találmány szerinti különböző innumoglobulin láncokat expresszáló kiónok izolálási eljárását a 28. példában mutatjuk be. Működőképes
·· • · ···· ··· · • · ♦ · · • ····
KS1/4-et és származékait olyan AV12 sejtek felűluszójából lehet tisztítani, amelyek ko-transzformálva lettek könnyű és nehéz láncot kódoló vektorokkal. Ilymódon számos KS1/4 variánst lehet előállítani a jelen találmány szerinti különböző könnyű és nehéz láncok keverésével, összeillesztésével.
Az immunoglobulin könnyű- és nehéz-láncú molekuláinak nem-limfoid rendszerben való expressziója sokkal előnyösebb mint a limfoid rendszerben való expresszió. A monoklonális antitesteket hagyományosan limfoid rendszerekből például mielóma vagyhibridóma sejtekből izolálják és tisztítják. Ezek a sejtek gyakran expresszálnak nagymennyiségű heterogén antitestet. Ennek a jelenségnek az a magyarázata, hogy a limfoid sejtek maguktól is kiválasztanak antitesteket. Ha eltérő antitestet kódoló DNS-sel transzformálják vagy eltérő antitestet termelő sejtekkel fuzionál tatják , akkor az ilyen limfoid sejtek gyakran kettős kiválasztóvá válnak. A kettős kiválasztó ssjtvonalak számos hibrid molekuláris szerkezetű antitestet termelnek, amelyek jelentős része nem kívánatos. Ezeket a nem-kivánt hibrideket a terméktől ezután költséges és időigényes technikákkal kell elválasztani. A jelen találmány szerinti eljárás megkerüli a problémát, amennyiben a nem-limfoid'sejtek
maguktól nem szekretálnak antitest molekulákat. Ennélfogva a felüluszóba szekretált egyetlen antitest a kívánt homogén termék.
A bemutatott DNS-szekvenciák és plazmidok számos módosítása, variációja lehetséges. Például a genetikai kód degeneráltsága lehetővé teszi a polipeptidat kódoló régiókban a nuklaotidok helyettesítését, valamint a
ATT transzlációs stop-szignál helyettesítését
TAG ι t i
ATC vagy
TGA
I 11 ACT transzlációs stop-szignálokkal. Ezeket a szekvenciákat meghatározhatjuk a KS1/4 immár ismert aminosav vagy DNS szekvenciájából, és ismert, szintetikus eljárásokkal állíthatjuk elő. Ezeket a szintetikus eljárásokat lényegében Itakura és munkatársai [Science, 198, 1056 (1977)] valamint Crea és munkatársai [Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978)1 módszerével hajthatjuk végre. A szintetikus géneket és linkereket vagy Systec 1450 DNS szintetizátorral (Systec Inc. , 3816 Chandler Őrivé, Minneapolis, MN), vagy ABS 380A ·· ···· ···· · • · · • · « ··
DNS szintetizátorral (Applied Biosystem, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) állíthatjuk elő. A szakterületen számos más DNS-szintetizáló berendezés ismert, és használható szintetikus DNS-fragmentek előállítására. Ennélfogva a jelen találmány semmiképpen nem korlátozódik a bemutatott DNS szekvenciákra és plazmidokra.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti expressziós vektorokat eukarióta gazda-sejtek transzformálására használjuk, úgy, hogy a gazda-sejtek különböző könnyű- és nehéz-láncú struktúrákat expresszáljanak. Ha a gazdasejtet olyan vektorral transzformáljuk, amely a gazdasejtben működő promotert tartalmaz és ilyen immunoglobulin strukturgének transzkripcióját vezérli, valamint a gazdasejt rendelkezik a szignál-peptidek processzálásához szükséges sejt-mechanizmussal, akkor az ilyen sejtek érett antitesteket vagy antitest-láncokat szekretálnak. Más expressziós körülmények között, azaz ha a gazdasejtek csak immunoglobulin könnyű-láncot expresszálnak, akkor a könnyű láncokat a gazdasejtből kell izolálni.
Amint azt az előzőekben Jeleztük, a jelen találmány szerinti vektorok, módszerek és antitestek jelentős hatással lesznek a rák ellen vívott küzdelemre.
···· 9
- 50 A KS1/4 monoklonális antitestről kimutatták, hogy hatékony ágens az adenokarcinóma diagnosztizálásában, prognosztizálásában és kezelésében [Bumol, a Reisfeld, R.A. és Sell, S, szerk.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. New York, Alán R.Liss, Inc., 257-259 (1985)]. Spearman és munkatársai [□. Pharmacol and Exp. Therapautics, 241, 695-703 (1987)] munkájukban, amelyre az alábbiakban hivatkozni fogunk, leírták egy monoklonális antitest-vinca alkaloid konjugátum alkalmazását tumorok lokalizálásában és kezelésében. Ez a KS1/4-DAVLB (4-dezacetil-vinblasztin) konjugátum alkalmas volt tumor-növekedés gátlására [Bumol et al., a Ceriani, R.L. szerkesztette Immunological Approaches to the Diagnosis and Therapy of Breast Cancer New York and London: Plenum Press; 205-215 (1987)], amely eredményre a továbbiakban hivatkozni fogunk. Biokémiai és immunológiai kutatások kiderítették, hogy a jelen találmány szerinti rekombináns és kiméra KS1/4 molekulák ugyanolyan antigén reaktivitással rendelkeznek, mint a hibridóma sejtekből származó KS1/4 molekulák.
A rágcsáló antitestek használatából származó probléma azonban az, hogy ezek az antitestek gyakran immunválaszt váltanak ki emberekben. Ez előfordult né-
··»♦ · • · ♦ · ·
- 51 hány, KS1/4-es kezelést kapott betegnél. Ezt a problémát megoldhatjuk a jelen találmány szerinti kiméra antitestekkel, A KS1/4 konstans régióját humán eredetű konstans régióval helyettesítve a beteg immun-rendszerjsa kiméra antitest/^sajátjaként ismeri fel, igy kevesebb anti KS1/4 antitestet képez, A humán konstans régió alkalmazása továbbá segíti a komplement és egyéb-sejt válaszok aktiválódását.
A gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a KS1/4 eddig ismeretlen aminosav és DNS szekvenciája felhasználható uj, erős vagy gyenge affinitással rendelkező származékok előállítására. Az antitest különböző részeit lehet kivágni vagy mutáltatni uj antitestek előállítása céljából, vagy az egyik lánc egy részét másik láncból származó résszel lehet helyettesíteni, Röntgen-krisztallográfiás vizsgálatokkal lehet kimutatni, hogy az antitest melyik aminosavai vannak a KS1/4-hez kötődő antigén aminosavainak szoros közelésében. Protein-engineering módszer felhasználásával a KS1/4 módosítható olymódon, hogy az antigén negatív- csoportjaival szemben pozitív maradékok legyenek, Az ilyen megváltoztatott (engineered” ) antitestek módosított affinitást mutatnak a rák-betegekben lévő sejtfelszíni antigénekkel szemben.
···· ·<··· 0
- 52 A következő példák tovább illusztrálják a jelen szabadalmi leírást. A példák ismertetik a jelen találmány szerinti konstrukciók készítését, valamint ahol szükséges, ott az eljárások magyarázatát.
1. példa
A pKC283 plazmid izolálása
Az E. coli K12 BE12Ol/pKC283 törzs liofil ampullái NRRL-B1583O sorszám alatt hozzáférhetők a Northern Régiónál Research Laboratory-nál, Peoria, I^lionis, 61604.A liofil ampullák tartalmát 10 ml LB táptalajt (10 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-yeast extract és 10 g NaCl per liter; a pH-t 7,5-re állitjuk) tartalmazó csövekbe visszük át, majd két órán át 32 °C-on inkubáljuk, majd a táptalajba ampicillint teszünk 50/ug/ml koncentrációban és 32 °C-on éjszakán át inkubáljuk. Az E.coli K12 BE120l/pKC283 sejteket 32 °C-on tenyésztjük, mivel a sejtek egy hőmérséklet-érzékeny cl represszort tartalmaznak a kromoszómális DNS-bs integrálódva. Ha vad-tipusu lambda pL represszor gént tartalmazó, vagy lambda pL promotert nem tartalmazó sejteket használunk ebben a plazmid-izolálási eljárásban, amint azt a következő példákban ismertetjük, akkor az inkubálás hőmérséklete 37°C.
Az éjszakán át növesztett tenyészet kis részét olyan LB-agarra visszük (LB táptalaj, amely 15 g/1 Bacto-agart tartalmaz), amely 50/ug/ml ampicillint ···· ·« • · ····
- 53 tartalmaz, olymódon, hogy az E.coli K12 BE1201/KC283ból egyedi telepeket kapjunk. A kapott izolált telepet 10 ml LB + 50/ug/ml ampicillln összetételű táptalajba oltjuk, majd éjszakán át 32 °C-on inkubáljuk, erős rázatás közben. A 10 ml éjszakán át nőtt tenyészetet 500 ml LB + 50/ug/ml ampicillin tartalmú táptalajba oltjuk és 32 °C-on erős rázatás közben addig inkubáljuk, mig a tenyészet el nem éri a stacioner fázist,
A következő eljárást adaptáltuk [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)1.
A sejteket 4000 g, 10 perc, 4 °C paraméterekkel végzett centrifugálással elkülönítjük, majd a felűluszót elkülönítjük. Az elkülönített sejteket 100 ml jéghideg STE pufferral mossuk (0,1 M NaCl, 10 mMTris-HCl, pH 7.8j 1 mM EDTA). Mosás után a sejteket 10 ml 1_ oldatban szuszpendáljuk (50 mM glükóz; 25 mM Tris-HCl,pH8.Oj 10 mM EDTA), amely 5 mg/ml lizozimet tartalmaz és 10 percig állni hagyjuk szobahőmérsékleten. Húsz ml 2-es oldatot (0,2 N NaOH és 1 % SOS) adunk a lizozimmel kezelt sejtekhez, majd az oldatot óvatosan megkeverjük. Az elegyet jégen hagyjuk állni 10 percig.
A lizált sejt-keverékhez 15 ml jéghideg mólos kálium-acetátot adunk (pH 4,8), majd az oldatot óvatosan megkeverjük. Az oldatot jégen inkubáljuk 10 percig.
·· ···· ··
- 54 Az 5 mólos kálium-acetát oldatot úgy állítjuk elő, hogy 11,5 ml Jégecetet adunk 28,5 ml vízhez és 60 ml 5 mólos kálium-acetáthoz; a kapott oldat káliumra nézve 3 mólos,acetátra nézve 5 mólos.
A sejt-lizátumot Beckman SW27 rotorban (vagy annak megfelelő rotorban) centrifugáljuk 20 000/perc fordulatszámmal 20 percig 4 °C-on. A kromoszómális DNS és a törmelék a cső aljára ül ki. Körülbelül 36 ml felüluszót kapunk, ehhez 0,6 térfogat izopropanolt adunk, összekeverjük a kapott oldatot,szobahőmérsékleten hagyjuk állni 15 percig. A plazmid DNS-t szobahőmérsékleten lecentrifugáljuk (12 000 g, 30 perc). A felüluszót elöntjük, majd a DNS csapadékot 70 %-os alkohollal mossuk szobahőmérsékleten. Az etanolos mosóiét leöntjük, és a csa.padékot vákuum exszikkátorban szárítjuk. A csapadékot ezután 8 ml TE pufferben (10 mM Tris-HCl, pH 8,0;
mM EDTA) feloldjuk.
A DNS oldathoz 8 g CsCl-ot adunk. Körülbelül 0,8 ml 10 mg/ml koncentrációjú etidium-bromid vizes oldatot adunk a CsCl-DNS oldat minden 10 ml-éhez. Az oldat végső sűrűsége kürölbeíbül 1 ,55 g/ml, az etidium-bromid koncentrációja körülbelül 600/ug/ml, Az oldatot Beckman Type 50 centrifuga-csőbe tesszük, a tetejét paraf.fin-olajjal feltöltjük, lezárjuk, mejd 45 000/perc fór55 «·
V · ···· dulatszámmal 20 °C-on 24 órán át centrifugáljuk. Centriguálás után két DNS-csik látható normál fényben. A záró sapkát eltávolitva a csőről az alsó. DNS-csikot eltávolítjuk 21-es injekciós tűvel ellátott fecskendővel, amellyel átszűrjük a centrifuga-cső falát.
Az etidium-bromidot vízzel telített
1-butanolos extrakcióval távolitjuk el. A CsCl-t TE pufferrel szemben dialízissel távolitjuk el. Puffereit fenollal, majd kloroformmal végzett extrakció után a DNS-t kicsapjuk, 70 %-os etanollal mossuk, majd megszáritjuk. Körülbelül 1 mg pKC283 plazmidot kapunk, igy majd 4 °C-on tároljuk TE pufferben körülbelül 1/ug//ul koncentrációban. A pKC283 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között, az 1. ábrán mutatjuk be.
2« példa
A pKC283PX plazmid előállítása
Az első példa szerint előállított pKC283 DNS-ből körülbelül 10/ul-t elkeverünk 20^ul 10 x tömény közepes só-erősségű restrikciós pufferrel (500 mM NaClj 100 mM Tris-HCl, pH7,5j 100 mM MgCl2, 10 mM OTT); 20/ul 1 mg/ml koncentrációjú BSA-val, 5/ul PvuII restrikciós enzimmel (N 50 egység a Bethesda Research • · · ·
Laboratories (BRL) meghatározása szarint, ahonnal az összes, alábbiakban használt restrikciós enzimet be szereztük), majd 145/ul vizzal.majd a kapott reakcióelegyet 37 °C-on két órán át inkubáljuk. Az ismertetett restrikciós enzim-reakciókat rutinszerűen fenolos , majd kloroformos extrakcióval állítjuk le, amelyet a DNS kicsapása követ, egy etanolos mosás, majd a DNS oldása TE pufférben. Az ismertetett PvuII emésztés után a PvuII-vel emész tett pKC283 DNS-t kicsapjuk, majd 5^ul TE pufferben oldjuk.
Körülbelül 600 pikoról (pM) Xhol linkért (5'-CCTCGAGG-3 ’) viszünk kináz reakcióba 10/ul 5 x tömény kináz puffért (300 mM Tris-HCl, pH7,8; 50 mM MgClg és 25 mM DTT), 5/UÍ 5 mM ATP-t, 24 ^ul vizet, O,5/U1 T4 polinukleotid-kináz (a P-L^Biochemicals meghatározása szerint körülbelül 2,5 egység), 5/ul 1 mg/ml BSA-t és 5/Ul 10 mM spermidint tartalmazó elegyet 37 °C-on 30 percig inkubálva.
A kináz reakcióból kikerült körülbelül
12,5/ul Xhol linkért hozzáadjuk 5^ul PVuII-vel emésztett pKC 283 plazmid DNS-hez, majd 2,5/Ul 10 x tömény ligáz puffért (300 mM Tris-HCl, pH 7.6j 100 mM MgClg és 50 mMDTT), 2,5/ul 1 mg/ml koncentrációjú BSA-t, 7/Ul 5 mM koncentrációjú ATP-t, 2,5 ^ul (a P-L Biochemicals meghatározása szerint körülbelül 2,5 egység) T4 DNS li57
éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. A ligálási reakció után a reakció-elegy koncentrációját úgy változtatjuk, meg, hogy megfeleljen egy magas sótartalmú puffer összetételének (0,1 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl, pH7.5j
MMg Cl2 és 1 mM DTT). Körülbelül 10.ul (100 egység)
Xhol restrikciós enzimet adunk az elegyhez, majd a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk.
A reakciót leállítjuk az Xhol restrikciós enzimmel emésztett DNS-t kicsapjuk, feloldjuk, majd a leírtak szerint ligáljuk, azzal a különbséggel, hogy a ligáló elegyhez nem adunk Xhol linkért. A ligáit DNS a kívánt pKC283 PX plazmid. A pKC283 PX plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzol^kőzőtt az 1. ábrán mutatjuk be.
3. példa
Az E.coli K12 MO (lambda*)/pKC283PX előállítása
Az E.coli K12 M0(lambda+) törzset NRRLB15993 sorszám alatt lehet beszerezni a Northern Régiónál Research Laboratories-tól liofilizált formában. Az E.coli K12 M0(lambda+) törzs tartalmazza a vad-tipusu lambda pL Cl represszor gént, igy a jelen találmány szerinti pL-lpp hibrid promoterről nincs transzkripció E.coli K12 MO (lambda+) sejtekben. A liofil ampullákat felélesztjük, MO(lambda+) egyedi telepeket izolálunk, majd az 1. példa szerint MO(lambda+) sejtek 10 ml éjszakán át nőtt tenyészetét állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C, és a növesztő táptalajban nem használunk ampicillint.
Az éjszakán át növesztett tenyészetből ul-t használunk 5 ml LB táptalaj beoltására, amely mM MgS04-et és 10 mM MgClg-t is tartalmaz. A tenyészetet éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk erős rázatás közben. Másnap reggel a tenyészetet 10 mM MgSO4-et és 10 mM MgCl2-t tartalmazó 200 ml LB táptalajjal meghigitjuk.
A hígított tenyészetet 37 °C-on erŐ9 rázatás közben inkubáljuk, amíg az 550 nm-en mért elnyelés (Α^^θ) körül8 belül 0,5 lesz, amely körülbelül 1 x 10 sejt/ml sejtsürüséget jelent. A tenyészetet tiz percig jeges vízfürdőben hütjük, majd a sejteket lecentrifugáljuk 4000 g, 10 percig 4 °C-on. A sejt-üledéket 100 ml hideg 10 mM-os MgS04-ben szuszpendáljuk, majd újra kiülepitjük centrifugálással. A sejt-üledéket újra szuszpendáljuk 100 ml 30 mM-os CaClg-ben, és 20 percig jégen inkubáljuk.
A sejteket újra összegyűjtjük centrifugálással, majd 10 ml 30 mM-os CaCl2-ban reszuszpen59
dáljuk. A sejt-szuszpenzióból fél milliliteres alikvot részt adunk a 2. példában előállított DNS-hez;
a DNS-t 30 mM CaClg-ban oldjuk fel. A sejt-DNS keveréket jégfurdőben inkubáljuk egy órán át, hővel sokkoljuk 42 °C-on9O másodpercig, majd jégbehütjük körülbelül két percig. A sejt-DNS keveréket 10 ml LB táptalajban hígítjuk 125 ml-es lombikban, majd egy órán át 37 °C-on inkubáljuk. Száz mikroliteres alikvot részeket szélesztönk ampicillint tartalmazó LB agarlemezeken, majd 37 °C-on inkubáljuk a telepek megjelenéséig.
A telepeket elkülönítve tenyésztjük, majd az egyes telepekből nyert plazmid DNS-t restrikciós enzimes analízissel és gélelektroforézissel vizsgáljuk. A plazmid DNS izolálását az 1. példa szerinti eljárással végezzük, de kisebb méretben, a CsCl lépést kihagyva, amig a kívánt E.coli K12M0(lambda+) pKC283PX transzformánsokat azonosítjuk. A pKC283PX plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között az 1. ábrán közöljük.
···· ·
4, példa
Az E.coli K12M0(lambda*) pKC283-L előállítása
10/ug, az 1, példa szerint előállított pKC 283PX plazmid DNS-t oldunk 20^ul 10-szer tömény magas sótartalmú pufferben, majd 20/ul 1 mg/ml BSA-t, 5^ul ( d50 egység) BglII restrikciós enzimet, 5/Ul ( n?50 egység) Xhol restrikciós enzimet és 150/ul vizet adunk hozzá és a kapott reakció-elegyet két órán át inkubáljuk 37 °Con, A reakciót leállítjuk és a BglII-XhoI restrikciós enzimekkel emésztett DNS kicsapása után a DNS-t 5 ^ul TE pufferben oldjuk.
BglII és Xhol restrikciós enzimeknek megfelelő egyszálu végekkel rendelkező DNS linkért szintetizálunk és foszforilezzQk a végét, A foszforilezést a 2, példában leirt eljárás szerint végezzük. A DNS linker szerkezete a következő:
5'-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3’ llllllllllllllllll
3'-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5'
A fenti linkért egyszálu deoxioligonukleotidokból állítjuk elő a szakterületen ismert módon. Az egyszálu dezoxi-oligonukleotidokat kereskedelmi forgalomban lévő készülékekkel állít hatjuk éLŐ, például az Applied Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA94404)
- 61 - \ által forgalomba hozott 380A DNS-szintetizátorral, amely foszforamidit kémiát alkalmaz. A szakterdet más DNS-szintézis módszerek is ismertek. Az egyszálu DNS előállításának szokásos módosított foszfotriészter módszerét Itakura és munkatársai írják le (Science, 198, 1056 (1966)1 valamint Crea és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978)1. Emellett a DNS szintézisnek egy különösen előnyös módszerét is leírják [Hsiung et al,, Nucleic Acids Researc, 11 , 3227 (*1983) valamint Naraug et al,, Methods in Enzymology, 68, 90 (1980)1.
A linkért, valamint a BglII-XhoI restrikciós enzimekkel emésztett plazmidot a 2. példában leírt eljárással ligáljuk. A ligáit DNS a kívánt pKC283-L plazmid. .A pKC283-L plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között az 1.ábrán mutatjuk be. A pKC283-L DNS-t használjuk az E.coli K12M0 (lambda+) törzs^transzformálésára, és a kapott E.coli K12 M0(lambda+)/pKC283-L transzformánsokat lényegében a 3. példában leírt módszerrel azonosítjuk.
• · · ··· • · ·· •· •· ·······
5, példa
Az E.coli K12 MOClambda*) pKC283-LB törzs előállítása
Körülbelül 1O/ug, az 1. példában Isirt eljárással előállított pKC283-L plazmid DNS-t oldunk yUl 1 mg/ml BSA-t, 5/ul 50 egység) Xhol restrikciós enzimet és 155 ,ul vizet adunk hozzá, és a kapott reakció-elsgyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az Xhol-gyel emésztett pKC283-L plazmid DNS-t ezután kicsapjuk a reakció-elegyből 3 térfogat 95 %-os etanol és egytized térfogat 3 mólos nátrium-acstát hozzáadásával, 5 percig szárazjég-etanol fürdőben inkubálva az elegyet, majd lecentrifugáljuk. A kapott DNS-csapadékot 70 %-os etanollal mossuk, szárítjuk, majd 2 ^ul 10 x tömény nick-transzlációs pufferben fidjuk (0,5 M Tris-HCl,pH 7,2i 0,1 M MgSO^ 1 mM DTT), majd mindegyik dezoxinukleotid trifoszfátból 1/U1 2mM-os oldatot adunk hozzá, majd 15^ul vizet, 1/Ul ( a P-L Biochemicals meghatározása szerint 6 egység) Klenow fragmentet, amely az E.coli DNS polimeráz I nagy fragmentje, és végül 1 mg/ml koncentrációjú BSA-t
A kapott reakció-elegyet 30 percig inkubáljuk 25 °C-on, a reakciót az oldat 5 percig 70 °C-on tartásával állítjuk Is.
• ··
- 63 BamHI linkereket (4’-CGGGATCCCG-3 *) foszforilezünk és ligálunk Xhol restrikciós enzimmel emésztett, Klenow fragmenttel kezelt pKC283-L DNS-hez, a 2, példában leirt eljárás szerint, A ligálási reakció után a DNS-t körülbelül 100 egység BamHI enzimmel emésztjük 2 órán át 37 °C-on magas sótartalmú pufferben. A BamHI-es emésztés után a DNS-t ligáláshoz készítjük elő, lényegében a 2, példában leirt eljárás szerint,
A 5,9 kb méretű BamHI restrikciós fragmentet ligálással cirkularizáljuk majd E.coli K12M0(lambda+) törzsbe transzformáljuk, lényegében a 2, és 3, példákban leirt eljárások szerint. Az E.coli K12M0 (lambda+)/pKC283-LB transzformánsokat azonositjuk, majd a pKC283-LB plazmid DNS_t az 1. példában leirt eljárás szerint izoláljuk. A pKC283-LB plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között, az 1. ábrán mutatjuk be.
6, példa
Az E.coli K12MO(lambda4-) pL32 törzs előállitása Körülbelül 10^ug pKC283 PX plazmid DNS-t emésztünk Sáli restrikciós enzimmel magas sótartalmú pufferben, Klenow fragmenttel kezeljük, mejd EcoRI linkerekhez (5'-GAGGAATTCCTC-3*) ligáijuk, lényegében az 5. példa szerinti eljárást alkalmazva, azzal a különbséggel, hogy a kiindulási plazmid,a restrikciós enzimek és linkerek mások.
··
- 64 ~
EcoRI restrikciós enzimmel való emésztés utón, amelynek eredményeképpen egy <~2,1 méretű DNS-t eltávolitunk(a ^4,0 kb méretű EcoRI restrikciós fragmentet ligálással recirkularizáljuk, igy kapjuk a pKC283PRS plazmidot. A ligáit DNS-sel transzformálunk E.coli K12 MO(lambda+) sejteket, lényegében a 3. példában leirt eljárást alkalmazva. Az E.coli Kl2M0(lambda+)/pKC283PRS transzf ormánsok azonosítása után a pKC283PRS plazmid DNS-t izoláljuk az 1. példában leirt eljárás szerint. A pKC283PRS plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között az 1. ábrán közöljük.
Körülbelül 10/Ug pKC283PRS plazmidot emésztünk 200/ul magas sótartalmú pufferben körülbelül 50-50 egység PstI és Sphl restrikciós enzimmel. A reakció-elegyet körülbelül 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd 0,6 %-os alacsony olvadáspontu agarózon (FMC Corporation, Marina eolloids Division, Rockland, Maine 04841) elektroforeti záljuk 2-3 órán át /V130 V és /V 75 mA mellett Tris-acetát pufferben.
A gélt hig etidium-bromid oldattal festjük, és a ,~o,85 kb méetü Pstl-Sphl restrikciós fragmentet tartalmazó DNS csikót, amelyet hosszúhullámú UV-fénnyel teszünk láthatóvá, kivágjuk a gélből egy kis géldarabban.
A géldarab térfogatát súlya és sűrűsége alapján meghatározzuk, majd azonos térfogatú Tris-HCl, pH7.6 puffért adunk a géldarabot tartalmazó csőhöz, A géldarabot ezután 72 °C-ra melegítve megolvasztjuk, A pKC283PRS plazmid ^0,85 kb méretű restrikciós fragmentjéből körülbelül 1/ug-ot kapunk körülbelül lOO^ul térfogatban, Hasonló módon a pKC283-LB plazmidot PstI és PshI restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kapott λ! 3,0 kb méretű restrikciós fragmentet agaróz gélelektroforézissel izoláljuk és ligáláshoz előkészítjük.
A pKC283PRS plazmid /V0.85 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentjét a pKC283-LB plazmid a/3,0 kb méretű restrikciós fragmentjéhez ligáljuk, lényegében a
2. példában leirt eljárás szerint. Az összeligált DNS molekula a kivánt pL32 plazmid. A pL32 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között az 1. ábrán mutatjuk be, A pL32 plazmidot E.coli Kl2M0(lambda+) sejtekbe transzformáljuk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint. Az E.coli K12M0(lambda+)/pL32 transzformánsokból izoláljuk a pL32 plazmid DNS-t, lényegében az
1. példában leirt eljárás szerint, A pL32 plazmid DNSének elemzése kimutatta, hogy több mint egy EcoRI linker kapcsolódott a pKC283PY plazmid Klenow fragmenttel kezelt ···· ···· ·
- 66 Sáli végeihez. Egy vagy több EcoRI linker jelenléte nem érinti a pL32 plazmid vagy a pL32 plazmid származékainak használhatóságát, és egy Xhol restrikciós hely meglétével igazolható, amely akkor keletkezik, amikor két EcoRI linkért ligálunk egymáshoz. Más módszer szerint a pL32 plazmidot úgy állíthatjuk elő, hogy Sall-EcoRI emésztést és ligálást végzünk a pKC283-LB plazmid on ennek a példának az első pontja szerint.
7. példa
Az E.coli K12M0(lambda*)/pL47 törzs előállítása
Az E.coli Kl2RV308/pNM789 törzs NRRL B-18216 sorszám alatt hozzáférhető liofilezett formában a Northern Régiónál Research Laboratoriss-nál. A pNM789 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 2. ábrán közöljük. A plazmid DNS-t az 1. példában leirt eljárás szerint kivonjuk a tenyészetből, azzal a különbséggel, hogy a tenyésztés hőmérséklete nem 32 °C, hanem 37 °C.Tiz mikrogram pNM789 plazmid DNS-t oldunk 200/Ul PvuII pufferben (50 mM Tris-b'Cl (pH 7.5), 60 mM NaCl és 6 mM MgClg). Egy egység PvuII restrikciós enzimet adunk hozzá, és a reakció-elegyet 5 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az enzimet 10 perces 65 °C-on tartással inaktiválj ,uk. 30yul 10x tömény BamHI puffért (200 mM Tris67
-HCl (pH8.0), 1M NaCl és 70 mM MgCl2), 70/Ul vizet és egység BamHI restrikciós enzimet adunk hozzá és a reakció-elegyet 1 órán át 37 °C-on tartjuk.Ezt követi 5 egység alkalikus foszfatáz hozzáadása, majd egy 1 órás 65 °C-os inkubálás. A DNS fragmenteket 1 %-os agaróz gélen választjuk el, és az egyszeresen hasitott DNS fragmentet tisztitjuk.
Tompa véggel és BamHI véggel rendelkező DNS linkért szintetizálunk lényegében a 4. példában leirtak szerint. Ennek a linkernek a szerkezete (lásd 3. ábra) a következő:
5'-CTGTGCCTTCTAG-3' llllllinilU '-GACACGGAAGATCCTAG-5'
A linkért foszforilezzQk és a BamHI-PvuII enzimekkel emésztett pNM789 plazmidba ligáijuk, lényegében a 2. példában leirtak szerint. Ezt a ligáló elegyet használjuk E.coli K12RV308 sejtek transzformálására, majd a
3. példában leirt módon plazmidot izolálunk, a transzformánsokból. Azokat a plazmidokát választjuk ki, amelyek a megfelelő méretű PvuII fragmentet (494 bp) és Xbal-BamHI fragmentet (628 bp) tartalmazzák.Ezek közűi legalább kettőnek a nukleotid szekvenciáját meghatározzuk a BamHI és Smal hasítási he^ek között, és egy a kívánt szekvenciával rendelkező kiónt kiválasztunk. Ezt az átmeneti plazmidot je • · · · · · · löljük 120 plazmid elnevezéssel. A fenti eljárás sémáját, valamint a 120 plazmid restrikciós és funkciós tér képét a kisérő rajzok között a 3. ábrán mutatjuk be.
Az EK-BGH-t kódoló DNS izolálásához körülbelül
10/ug sótartalmú pufferben, körülbelül 50-50 egység Xbal és BamHI restrikciós enzimmel. Az emésztési termékeket agaróz gélelektroforézissel választjuk szét, és az EK-BGH-t kódoló n) 0,6 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk és ligáláshoz előkészítjük, lényegében a 6. példában leirt eljárás szerint.
A pL32 plazmidot is emésztjük Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel, a /v 3 ,9 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk és előkészítjük ligáláshoz. A pL32 plazmid íV3,9 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentjét a 120 plazmid rd 0,6 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentjéhez ligáljuk lényegében a 2. példában leirt eljárás szerint, igy kapjuk a pL47 plazmidot. A pL47 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 4, ábrán közöljük. A pL47 plazmidot E.coli K12M0(lambda*) törzsbe transzformáljuk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint, és az E.coli K12MO/Iambda+)/ pL47 transzformánsokat azonosítjuk. A pL47 plazmid DNS-t izoláljuk a transzformánsokból, lényegében az 1. példában közölt leírás szerint
8, példa
A pPR 12 plazmid tartalmazza a cI857 hőmérséklet-érzékeny pL represszor gént, valamint a pBR322 tetraciklin rezisztenciát kódoló génjét. A pPR1? plazmidot az 1984 március 13-án közzétett 4 436 815 sorszámú Amerikai Egyesölt Államok-beli szabadalmi leírásban közlik. A pPRl2 plazmid restrikciós és funkjconális térképét a kis érő rajzok között a 4. ábrán közöljük.
Körülbelül 1 pPRl2 plazmid DNS-t emésztünk körülbelül 50 egység EcoRI restrikciós enzimmel 200,ul magas sótartalmú pufferben 37 °C-on két órán át. Az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pPR12 plazmid DNS-t kicsapjuk és Klenow fragmenttel kezeljük lényegében az 5, példában leirt eljárás szerint, A Klenow reakció után az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett, Klenow fragmenttel kezelt pPRl2 plazmid DNS-t ligálással recirkularizáljuk, lényegében a 2, példában leirt eljárás szerint, A ligáit DNS molekulát, amely a kivánt pPRJ2/\R1 plazmid, használjuk E.coli K12RV308 törzstranszformálására, lényegében a 3, példában leirt eljárás szerint, azzal a különbséggel, hogy a szelekció tetraciklin rezisztencián alapul (5/ug/ ml) égnem ampicillin rezisztencián. Az E.coli K12RV308 törzs NRRL B-15624 sorszám datt elérhető az NRRL-nél, Az E.coli K12RV308/pPR12/\R1 transzformánsok azonosítása után a transzformánsokból pPRl2/\R1 plazmid DNS-t izolálunk
lényegében az 1. példában leirt eljárás szerint.
Körülbelül lO^ug PPR12A R1 plazmid DNS-t emésztünk körülbelül 50 egység Aval restrikciós enzimmel 200/ul közepes sókoncentrációju pufferbsn 2 órán át 37 °C-on. Az Aval restrikciós enzimmel emésztett pPR12/\R1 plazmid DNS-t kicsapjuk, majd Klenow fragmenttsl kezeljük, lényegében az 5. példában közölt eljárás szerint. A Klenow reakció után az Aval restrikciós enzimmel emésztett, Klenow fragmenttel kezelt pPRl2/\R1 plazmid DNS-t EcoRI linkerekhez ligáljuk (5'-GAGGAATTCCTC-3*), lényegében a 2. példában leirt eljárás szerint. A linker ligálása után a DNS-t kicsapjuk, majd körülbelül 50 egység EcoRI restrikciós enzimet tartalmazó 200/ul magas sótartalmú pufferben oldjuk. A kapott reakció-elegyet 37 °C-on körülbelül 2 órán át inkubáljuk. Az EcoRI-es emésztés után a reakció-elegyet agaróz-gélre visszük, majd a λ>5,1 kb méretű EcoRI restrikciós fragmentet lényegében a 6, példában leirt eljárással tisztitjuk. A 5.1 kb méretű EcoRI restrikciós fragmentet ligálással recirkularizáljuk, lényegében a 2.pélíéban leirt eljárás szerint. A ligáit DNS molekula a kivánt pPR12AR1 plazmid. A pPR12AR1 plazmid DNS-t E.coli K12RV308 törzsbe transzformáljuk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint, azzal a különbséggel, hogy a szelekció alapja nem az ampicillin rezisztencia, hanem a tetra···· • ···· ···· · ·· · · · • · · ♦ · • · · · ···· ··« ·· · · ciklin rezisztencia. Az E.coli K12RV3O8/pPR12ARi transzformánsok azonosítása után a pPR1/AR1 plazmid DNS-t izoláljuk, lényegében az 1. példában leirt eljárás szerint, A pPR12AR1 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 4, ábrán mutatjuk be.
9. példa
Az E.coli Kl2RV3O8/pL110 törzs előállítása
Körülbelül lO^ug pPRl2AR1 plazmid DNS-t szuszpendálunk körülbelül 50-50 egység PstI és EcoRI restrikgas sótartalmú inkubáljuk cös enzimet tartalmazó körülbelül 200/ul ma pufferben, majd a reakció-elegyet 37 °C-on körülbelül 2 órán át. A reakció elegyet ezután agaróz gélre visszük, majd a pPRl2AR1 plazmid a; 2,9 kb méretű restrikciós fragmentjét izoláljuk, majd ligáláshoz készítjük elő, lényegében a 6. példában leirt eljárás szerint.
Körülbelül
pL47 plazmidot emésztünk
PstI és BamHI restrikciós enzimekkel 2OO/U1 magas sótartalmú pufferben 37 °C-on két órán át. A Pstl-BamHI restrikciós enzimekkel emésztett DNS-t agaróz gélre visszük, és a /02,7 kb méretű Pstl-BamHI restrikciós fragmentet, amely a replikációs origót és az ampicillin rezisztencia gén egy részét tartalmazza, izoláljuk és ligáláshoz előkészítjük .lényegében a 6. példában leirt eljárás szerint. Egy külön reakcióban körülbelül 10^ug pL47 plazmid DNS-t emész···· ··· ♦· ··· · • · • · · • ··· ♦ ·
- 72 tűnk EcoRl és BamHI restrikciós enzimekkel 200/ul magas sótartalmú pufferben, és a N1,03 kb mérető EcoRI-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk, amely tartalmazza az uj transzkripciós és transzlációs aktiváló szekvenciákat, valamint az EK-BGH-t kódoló DNS-t, majd ligáláshoz készítjük elő, lényegében a 6. példában lairt eljárás szerint. A ,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragmentből 2/ug-ot kapunk, és ezt használjuk a pLlW plazmid előállításában.
A pL47 plazmid /ν'2,7 kb méretű Pstl-BamHI f ragmentjét, valamint /V1 ,03 kb méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragmentjét a pPR12AR1 plazmid (V2,9 kb méretű Pstl-EcoRI fragmentjéhez ligáljuk, igy kapjuk a pL1lO plazmidot, majd a ligáit DNS-sel E.coli K12RV308 törzset transzformálunk, lényegében a 2, és 3. példákban leirt eljárások szerint, azzal a különbséggel, hogy a transzformánsok, szelektálására nem ampicillin rezisztenciát használunk, hanem tetraciklin rezisztenciát.
Két PstI restrikciós enzim felismerési hely található az EK-BGH kódoló régióban, amelyet nem ábrázolunk a kisérő rajzok között bemutatott restrikciós és funkcionális térképeken. A pL110 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 4. ábrán mutatjuk be.
···· ···
10. példa
A BK vírus DNS előállítása
A BK vírus ATCC Vr-837 sorszám alatt hozzáférhető az American Type Culture Collectionnál. A vírust fagyasztva - szárított formában szállítják és Hank féle kiegyensúlyozott sóoldatban (Gibco, B175 Stalley Road, Grand Island , NY 14072) szuszpendáljuk, igy körülbelül c
plakk-képző egység (pfu)/ml titert kapunk. A BK vírus DNS előállításához választott gazdaszervezet a primer humán embironális vese-sejt (PHEK), amely beszerezhető a Flow Laboratories Inc.-tói (7655 Old Springhouse Road, Mc.Lean, VA22101) 0-100 katalógusszám alatt, vagy az M.A. Bioproducts-tól a 70-151 katalógusszám alatt.
Körülbelül 5 db 75 mm felületű polisztirol lombikot, amely körülbelül 106 PHEK sejt által képzett egybefüggő egysejtréteget tartalmaz, használunk a vírus előállítására. Mindegyik lombikhoz körülbelül 1 ml, 10 pfu/ml titerü BK vírus szuszpenziót adunk, majd egy órán át 37 °C-on inkubáljuk őket, ezután friss tenyésztő táptalajt (Dulbecco's Modified Eaglés Médium, Gibco, 10 % borjuk-magzat szérummal kiegészítve) adunk hozzá és a fertőzött sejteket 10-14 napig 37 °C-on inkubáljuk, mindaddig amig a vírus teljes citopatogén hatása mag nem nyilvánul. Ez a citopatogén hatás sejtvonalról sejtvonalra változik, valamint a vírustól is függ, ds rendszerint úgy nyilvánul meg, hogy a sejtek kikerekednek, összecsapzódnak és kiülnek a tenyésztő-edényből,
A vírust a sejtekből három lefagyasztási-felolvasztási ciklussaljlehet kiszabadítani, a sejttörmeléket 5000 g-vel végzett centrifugálással távolitjuk el. Az 1 liter felüluszó folyadékban levő vírust kicsapjuk és 100 g PEG-6000 hozzáadásával az oldat 4 °C-on végzett 24 órás inkubálásával összegyűjtjük, majd 20 percig 5000 g-vel centriguálva összegyűjtjük. A csapadékot az eredeti térfogat egy századrészét kitevő 0,1 x SSC pufferben oldjuk (1 x SSC = 0,15 M NaCl és 0,015 M Na-citrát, pH=7). A virus-szuszpenziót 15 ml telített KBr-oldatra rétegezzűk, majd 3órán át 75 000 g-vel centrifugáljuk. Centrifugálás után két csikót látunk a KBr oldatban. Az alsó csikót, amely a komplett viriont tartalmazza, összegyűjtjük, és Sephadex G-50 oszlopon sómentesitjök (Sigma Chemical Co,, P.O.Box 14508, St, Louis, MO 63178) TE-t (10 mM Tris-HCl, pH = 7.8 és 1 mM EDTA) használva eluáló pufferként.
Az oszlopról lejött, tisztított virionokat tartalmazó oldathoz nátrium-dodecil-szulfátot adunk.
1% koncentrációban} ezután pronázt adunk hozzá 100/ug/ml koncentrációban és az oldatot 2 órán át 37 °C-on inku• · ♦ · · báljuk. Az oldathoz ezután cézium-klóridőt adunk
1.56 g/ml sűrűség eléréséig, majd etidium-bromidot
100/ug/ml végkoncentrációban
Az oldatot Sorvall (DuPont
Inst. Products, Biomedical Oivision, Newton, CT 06470)
865 rotorban, vagy hasonló vertikális rotorban centrifugáljuk 24 órán át 260 000 g-vel. Centrifugálás után a vírus DNS csikját izoláljuk, majd ötször extraháljuk 100 mM Tris-HCl (pH7,8) oldattal telitett izoamil-alkohollal . A BK vírus DNS oldatát ezután TE pufferrel szemben dializáljuk, mindaddig, mig a DNS oldat 260 nm/ 280 nm abszorpciójának aránya 1,75 és 1,90 közé nem kerül. A QNS-t kicsapjuk a NaCl koncentrációt 0,15 M-ra állítva, két térfogat etanolt hozzáadva az oldathoz, majd az oldatot -70 °C-on tartjuk legalább két órán át és 12.000 g-vel 10 percig centrifugáljuk. A kapott BK virus DNS csapadékot TE pufferben oldjuk 1 mg/ml koncentrációban. A BK virus restrikciós és funkcionális tér képét a kisérő rajzok között az 5. ábrán közöljük.
11. példa
A pBKneol és pBKneo2 plazmidok előállítása
Az E.coli K12 HBlOl/pdBPV-MMTneo törzs ATCC
37224 sorszám alatt hozzáférhető liofilezett formában az American Type Culture Collection-től. A liofilezett sejteket 100/ug/ml ampicillint tartalmazó L-agarlemezekre szélesztjük és 37 °C-onaddig inkubáljuk, amig izolált telepek' nem nőnek ki.
Egy liter 50/ug/ml ampicillint tartalmazó
L táptalajba (10 g tripton, 10 g NaCl, 5 g yeast extráét literenként) oltunk egy E.coli Kl2HBlO1/pdBPV-MMTneo telepet és levegőztetés közben addig rázatjuk, amig a tenyészet °°590 értéke rJ 1 lesz, ekkor 150 mg kloramfenikolt adunk a tenyészethez. Az inkubálást újabb 16 órán át folytatjuk} a kloramfenikol hozzáadása gátolja a fehérje-sz tézist és igy gátolja a további sejtosztódást, de hagyja, hogy a plazmid-replikáció tovább folytatódjon.
Ebből a tenyészetből izoláljuk a plazmid DNS-t lényegében az 1. példában leirtak szerint és a kapott /V1 mg pdBPV-MMTneo plazmid DNS-t 1 ml TEpufferben izoláljuk és -20 °C-on tároljuk.
Körülbelül
5/ug (5/ul), a fentiek szerint előállított pdBPV-MMTneo plazmid DNS-t és körülbelül 5 /ug (5/ul) a 10. példában előállított BK vírus DNS-t emésztünk 37 °C-on2órán a’ következő összetételű oldatban:
2/ul 10 x tömény BamHI puffer (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HC1, pH = 7.9; 60 mM MgCl2 és 1 mg/ml BSA), 1 /U1 BamHI restrikciós enzim és 7 y-ul viz. A reakciót azonos térfogatú fenollal végzett extrakcióval állítjuk le, majd szt követi két kloroformos extrakció. Ezután mindkét ··
BamHI restrikciós enzimmel emésztett DNS-t kicsapjuk, centrifugálással összegyüjtjük,majd 5^ul vízben oldjuk.
Körülbelül 1/U1 10 x tömény ligáz puffért adunk 1/ul BamHI restrikciós enzimmel emésztett pdBPV-MMTneo plazmid és emésztett BK vírus ség) T4 DNS ligázt hez, és a reakciót
1/ul
BamHI
DNS-hez.
restrikciós enzimmel
Ezután
1/Ul ( 1000 egyés 6/ul vizet adunk a DNS keverékéjszakán át 16 °C-on inkubáljuk.
Az összsligált DNS molekulák a kívánt pBKneol és pBKneo2 plazmidok, amelyek csak a BK virus-DNS orientációjában különböznek egymá-stól. A pBKneol plazmid egy ^2,1 kb mé retű Sall-HindlII restrikciós fragmentet tartalmaz.
Az E^coli K12HB101 törzs NRRL B-15626 sorszám alatt hozzáférhető liofilezett formában,a Northern
Régiónál Research Laboratory-nál. Az E.coli K12HB101 sejtek tenyésztését, transzformációhoz kompotenssé tételét, valamint a fentiek szerint ligáit DNS-sel való transzformációját lényegében a 3. példában leírtak szerint végezzük. A transzformált sejteket 100/ug/ml ampicillint tartalmazó L-agarlemezekre szélesztjük. Az E.coli K12HB101/pBKneo1 és E.coli K12/pBKneo2 transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotipusuk és plazmid DNS-ük restrikciós analízise alapján azonosítjuk, A pBKneol ·· · ···· ···· · • · ·· · · · • · · · · · • · · · · ···· ···· ··· ·· · · plazmid re&trikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között az 5. ábrán mutatjuk be,
12, példa
A pBLcat plazmid előállítása
A, A pLPcat intermedier plazmid előállítása
Az adenovirus 2 (Ad2) viri_on DNS egy körülbelül 35,94 kb méretű kétszálu lineáris molekula. Az Ad2 késői promotert az Ad2 genom egy ro 0,3'16 kb méretű AcclPvuII restrikciós fragmentje formájában izolálhatJuk^ ez a aj0,32 kb méretű restrikciós fragment megfelel az Ad2 genom 5755 és 6701 sorszámú nukleotidja közötti szekvenciának. A kívánt rvO,32 kb méretű AccI-PvuII restrikciós fragment izolálása céljából az Ad2DNS-t először Ball restrikciós enzimmel emésztjük és a nj 0,32 kb méretű AccI-PvuII restrikciós fragment teljes szekvenciáját tartalmazó a>2,4 kb méretű Ball restrikciós fragmentet izoláljuk. Ezután a rv2,4 kb méretű Ball restrikciós fragmentet AccI és PvuII restrikciós enzimekkel emésztjük, hogy a kivánt fragmentet megkapjuk.
Körülbelül 50/ug Ad2 vírus DNS-t (hozzáférhető a BRL-nél vagy az ATCC-nél VR-2 sorszám alatt) oldunk 80/ul vízben és 10^ul 10x tömény Ball pufferben (100 mM Tris-HCl, pH = 7.6; 120 mMMgClg; 100 mM DTT és 1 mg/mlBSA) • ·«
met adunk az Ad2 DNS- oldatához és a kapott reakcióelegyet 4 órán át 37 °C-on inkubáljuk.
A Ball restrikciós enzimmel emésztett DNS-t agaróz gélre visszük és addig elektroforetizáljuk, mig a restrikciós fragmentek jól szét nem válnak. Az elektroforetizált DNS-t úgy tesszük láthatóvá, hogy a gélt hig (0,5/ug/ml) etidium-bromid oldattal festjük, és a fes tett gélt hosszu-hullámu ultraibolya fénnyel világitjuk meg. A DNS izolálására alkalmas egyik módszer a következő. Egy kis vágást ejtünk a gélben a kívánt fragment előtt, és egy kis darab NA-45DEAE membránt (Schleicher and Schnell, Keene, NH 03431) helyezünk mindegyik vágásba. A további elektroforézis során a DNS nem-kovalens módon kötődik a DEAE membránhoz. Miután a kívánt fragment hozzákötődött a DEAE membránhoz, a membránt eltávolítjuk és alacsony sótartalmú pufferrel öblítjük (100 mM KC1; θ,1 mM EDTA és 20 mM Tris-HCl, pH = 8). A membránt ezután egy kis kémcsőbe helyezzük és magas sótartalmú pufferba merítjük (1 M NaCl; 0,1 mM EDTA és 20 mM Tris-HC1, pH = 8), majd egy órán át 65 °C-on inkubáljuk, hogy a DNS-t eltávolitsuk a DEAE papírról. A 65 °C-os inkubálás után az inkubáló puffért összegyűjtjük és a membránt magas só-tartalmu pufferral öblítjük. A magas só·· ···>· —
tartalmú inkubáló pufferrel.
A magas sótartalmú DNS oldat térfogatát úgy változtatjuk meg, hogy a NaCl koncentráció 0,25 M legyen, majd az oldathoz három térfogat hideg, abszolút etanolt adunk. A kapott oldatot összekeverjük és 10-20 percre' -70 °C-ra helyezzük. Az oldatot ezután 15 percig 15 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A maradék só eltávolítása céljából másodszor is kicsapjuk a DNS-t, majd a csapadékot etanollal mossuk, szárítjuk és 20/ul TE pufferben oldjuk. ‘így körülbelül 3^ug-ot a kívánt Ad2 restrikciós fragmentből. A kapott tisztított fragmentet lO^ul TE pufferben oldjuk.
Az Ad2 a;2,4 kb méretű Ball restrikciós fragmentjéhez körülbelül 6/ul vizet és 2 ^ul 10x AccI puffért adunk (60 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 60 mM MgClg; 60 mM DTT és 1 mg/ml BSA). Miután a reakcióalegyhez körülbelül 2^ul ( AJ10 egység) AccI restrikciós enzimet adtunk, 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk az elegyet.
Az AccI restrikciós enzimmel végzett emésztés után a
DNS-t etanolos kicsapással összegyűjtjük majd 16/ul vízben és 2/ul 10x tömény PvuII pufferben (600 mM NaCl;
mM Tris-HCl, pH= 7,5, 60 mM MgC^: 60 mM DTT és 1 mg/ml BSA) oldjuk. Körülbelül 2^ul (körülbelül 10 egység)
PvuII restrikciós enzimmel a DNS oldathoz adása után a reakció-elegyet 37 °C-on két órán át inkubáljuk.
Az Ad2 AccI-PvuII restrikciós enzimmel emésztett n/2,4 kb méretű Ball restrikciós fragmentjét egy 6 % -os poliakrilamid gélre visszük és addig elektroforetizáljuk, mig a r\j 0,32 kb méretű AccI-PvuII restrikciós fragment, amely az Ad2 késői promotert tartalmazza, el nem válik a többi emésztési termék től. A gélt etidium-bromiddal festjük és UV fénnyel megvilágítjuk és a n>0,32 kb méretű PvuII-AccI restrikciós fragmentet tartalmazó géldarabot kivágjuk a gélből, összetörjük , majd szobahőmérsékleten 250/ul extrakciós pufferben áztatjuk (500 mM NH^OAc; 10 mM MgOAc;
mM EDTA és 0,1 % SDS). A következő reggelen a keveréket lecentrifugáljuk és az üledéket eldobjuk.
A felüluszóban lévő DNS-t etanollal kicsapjuk^ körülbelül 2/ug tRNS-t adunk hozzá, hogy teljessé tegyük a kivánt fragment kicsapását.
Körülbelül 0,2 kapunk a /v0,32 kb méretű AccI-PvuII restrikciós fragmentből , ezt 7/ul vízben oldjuk.
Körülbelü 0,25 ^ug (0,5/ul-ben) Bell linkért (5'-CTGATCAG-3’, New England Biolabs termék) foszforilezünk lényegében a 2. példában leirt eljárás szerint és a <vO,32 kb méretű AccI-PvuII restrikciós fragment • · • · ···· oldatához adjuk, majd 1^ul ( 1OOOegység) T4 DNS ligázt és 1/U1 1Ox tömény ligáz puffért adunk a DNS oldathoz és a kapott reakció-elegyet 16 °C-on éjszakán át inkubáljuk. A Bell linkerek az AccI-PvuII restrikciós fragmentnek csak a PvuII végéhez tudnak ligálódni. Későbbi DNS szekvenálással kiderült, hogy az AccI-PvuII restrikciós fragment PvuII végéhez négy Bell linker kapcsolódott. Ezeket az extra Bell linkereket BclI-es emésztéssel és újra ligálással el lehet távolítani, azonban az extra Bell linkereket nem távolitottuk el, mivel nem zavarják az extra linkért tartalmazó vektorok megfelelő működését.
Az E.coli Kl2HBlO1/pSV2cat törzs ATCC 37155 sorszám alatt hozzáférhető liofilezett formában az ATCC-nél és a pSV2cat plazmidot ezekből a sejtekből az
1. példában közölt leírás szerint izoláljuk. Körülbelül 1 mg pSV2cat DNS-t kapunk, ezt 1 ml TE pufferben oldjuk. Körülbelül 3^ug (3/ul) pSV2cat plazmid DNS-t adunk 2^ul 10x AccI pufferhez és 16/ul vízhez, majd ezután 3/ul (körülbelül 9 egység) AccI restrikciós enzimet adunk a pSV2DNS oldatához és a kapott rsakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az AccI restrikciós enzimmel emésztett pSV2cat plazmid DNS-t ezután
9 ···
Stul puffért (1,0 M NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH = 8.0j
100 mM MgCl2; 60 mM DTT és 1 mg/ml BSA) , 5/Ul vizet és körülbelül 2,ul (körülbelül 10 egység) Stul restrik ciós enzimet adva az oldathoz. A kapott reakcióelegyet órán át 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót fenolos extrakcióval, majd kétszeri kloroformos extrakcióval állit
kapunk,
emésztett pSV2cat plazmid DNS-t az Ad2 ^0,32 kbméretü
AccI-PvuII restrikciós fragment (Bell linkerekkel kiegészítve) ul-es oldatához adunk, ma
mény ligáz puffer, 15,υ1 viz és 2,ul (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligáz hozzáadása után a ligélási reakciót 16 °C-on éjszakán át inkubáljuk. A ligáit DNS molekula a kívánt pLPcat plazmid, amely úgy tartalmazza az Ad2 késői promoterét, hogy az képes legyen a kloramfenikol-acetiltranszferáz gén transzkripciójának és igy expressziójának vezérlésére. A pLPcat plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a
6. ábrán mutatjuk be.
A ligáit DNS-t használjuk E.coli K12HB101 sejtek transzformálására, lényegében a 3. példában közölt eljárás szerint. A transzformált sejteket 50/ug/ml ··· ·· ampicillint tartalmazó L agarra szélesztjűk; a plazmid DNS restrikciós analízisét használjuk az E.coli K12HB101/pLPcat transzformánsok azonosítására. A pLPcat plazmid DNS-t lényegében az 1, példában leirt eljárás szerint izoláljuk a transzformánsokból a további konstrukciók előállítása céljából,
B. A pBLcat plazmid előállítása
50,ul TE pufferben lévő körülbelül 88zug pBKneo!
plazmid DNS-t adunk 7,5^,ul 1Ox AccI pufferhez, 3O/U1 vízhez és 15.U1 (körülbelül 75 egység) AccI restrikciós enzimhez és a kapott reakció-elegyet 2 órán át inkubáljuk 37 °C-on. Az AccI restrikciós enzimmel emésztett BK vírus DNS-t agaróz gélre visszük, és a BK erősítő szakaszt tartalmazó /v 1 ,4 kb mérető fragmentet elválasztjuk a többi emésztési terméktől, A rv1 ,4 kb méretű AccI restrikciós fragmentet ezutén izoláljuk, lényegében a 12A, példában leírt eljárás szerint. A fragmentből körülbelül 5/Ug-ot oldunk 5/ul 10x tömény PvuII pufferben, hozzáadunk 45/Ul vizet és 5/Ul (körülbelül 25 egység) PvuII restrikciós enzimet, és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a PvuII restrikciós enzimmel emésztett DNS-t izoláljuk és llgáláshoz előkészítjük lényegében a Í2A. példában leirt eljárás szerint. Körülbelül 2/ug-ot kapunk a kívánt AH ,28 kb méretű AccI-PvuII fragmentből és ezt 5/ul TE pufferben oldjuk
a pLPcat plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet °C-on inkubáljuk. Az Acci restrikciós enzimmel emésztett pLPcat plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk és 5,ul
10x tömény Stul pufferben oldjuk, hozzá adunk 40,ul vizet és 5zul (körülbelül 25 egység) Stul restrikciós enzimet és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az Accl-Stul restrikciós enzimekkel emésztett pLPcat plazmid DNS-t néhányszor kicsapjuk etanollal, hogy megtisztítsuk a /v4,81 kb méretű Accl-Stul restrikciós fragmentet, amely az E.coli replikációs origót és az Ad2 késői promotert a másik restrikciós emésztési terméktől, ami egy 16 bp méretű fragment. A kívánt 4,81 kb méretű restrikciós fragmenből körülbelül 1,ug-ot kapunk, ezt
2O.ul TE pufferben oldjuk.
5/ul a74,81 kb méretű pLPcat Accl-Stul restrikciós fragmentet adunk 5,ul, a BK vírus /V 1 ,28 kb méretű Accl
-PvuII fragmentjét tartalmazó oldathoz. 3,ul 10x tömény ligáz puffer, 15zul viz és 2.ul (körülbelül 1000 egység)
T4 DNS ligáznak a DNS oldathoz adása után a kapott ligálási reakció-elegyet 16 °C-on éjszakán át inkubáljuk. A
- 86 ligáit DNS molekula a kívánt pBLcat plazmid, A pBLcat plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 6.ábrán közöljük.
A ligáit DNS-t használjuk E.coli K12HB101 sejtek transzformálására, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint. Az E.coli K12HB101/pBLcat transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízise alapján azonosítjuk. A pBLcat plazmid DNS-t s további munkákban használjuk, előállítását lényegében az 1, példában leirt eljárás szerinti végezzük.
13, példa
A pLl33 plazmid előállítása
A. A pSV2-HPC8 intermedier plazmid előállítása
A pHC7 plazmid a humán C fehérjét kódoló gént tartalmaz. Egy liter, 15 ^ug/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajt Oltunk E.coli K12RR1/pHC7 (NRRLB-15926) sejtekkel, majd a pHC7 plazmid DNS-t lényegében az
1. példában leirt eljárás szerint izoláljuk és tisztítjuk. A pHC7 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 7. ábrán mutatjuk be. Ezzel az eljárással körülbelül egy mg pHC7 plazmid DNS-t kapunk, ezt 1 ml TE pufferben oldjuk, majd -20 °C-on oldjuk.
• · 9 » · · • · · · · ···· ···· ··· ·· · · • ··
A pHC7 plazmid DNS oldatból SO^ul-t keverünk 5 /U1 ( /v50 egység) Báni restrikciós enzimhez, hozzáadunk 10^υ1 10x tömény Báni puffért (1,5 M NaClj 60 mM Tris-HCl, pH = 7,9j 60mM MgCl2 és 1mg/ml BSA) és 35 /ul vizet, majd addig inkubáljuk, amíg az emésztés nem teljes. A Báni restrikciós enzimmel emésztett pHC7 plazmid DNS-t 3,5 %-os poliakrilamid gélen elektro foretizáljuk (29:1 arányú akrilamid: bisz-akrilamid), amig a /v 1 ,25 kb méretű Báni restrikciós fragment elválik a többi restrikciós emésztési terméktől.
A 1 ,25 kb méretű Báni restrikciós fragmentet tartalmazó géldarabot kivágjuk a gélből, kémcsőbe tesszük és összezúzzuk. Egy ml extrakciós puffért (500 mM NH^OAc, 10 mM MgOAc, 1 mM EDTA, 1 % SDS és 10 mg/ml tRNS) adunk a fragmentet tartalmzó csőbe, majd a csövet éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. Centrifugálással uj eltávolítjuk a törmeléket és a felüluszót csőbe visszük át. A törmelétet egyszer mossuk 200/Ul extrakciós pufferrel, a mosó folyadékot egyesitjük az éjszakán át tartó extrakcióból származó első -felüluszóval. A felüluszót üveggyapoton, szűrjük át és két térfogat etanolt adunk hozzá. A kapott oldatot n/ίο percre etanol-szárazjég fürdőbe tesszük, majd a DNS-t centrifugálással kinyerjük.
····
kapunk a rv1 ,25 kb méretű Báni restrikciós fragmentből. A tisztított fragmentet lO.ul TE pufferben old juk és -2O°C-on tároljuk. A Báni restrikciós fragmsntet módosítani kell linker hozzáadásával, hogy előállíthassuk a pSV2-HPC8 plazmidot.
A linker mindegyik egyszálu részének öt-
10x tömény ligáz puffért, 10,ul 500,uM ATP-t és
7,5 ,ul vizet tartalmaz. A foszforilezési reakciót percig 37 °C-on tartjuk, majd 10 perces 100 °C-os inkubálással le_állitjuk. A teljes foszforilezés bizto sítása céljából a reakcióelegyet jégbe hQtjű k, 2/Ul
0,2 M ditiotreitolt, 2,5 ,ul 5 mM ATP-t és 15 egység
T4 polinukleotid kinázt adunk hozzá és további 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. A reakció leállításához az elegyet újabb 10 percig 100 °C-on tartjuk, majd jégbe hűt juk.
□óllehet külön lettek foszforilezve a
DNS linker két külön láncát összekeverjük a kináz reakció után. A láncok egymás mellé illesztéséhez a kináz reakcióelegyet 10 percig 100 °C-on inkubáljuk /0150 ml vizet tartalmazó vízfürdőben. Ezután az inkubálás után a vízfürdő fűtését kikapcsoljuk és hagyjuk szobahőmér··»· ·· ··
sékletre hűlni, ami egy körülbelül három órát igénybevevő folyamat. A foszforilezett DNS-t tartalmazó csövet a vízfürdővel éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ez az eljárás egymás mellé illeszti az egyszá^u DNS-eket. A készített linké r szerkezete:
'-AGCTTTGATCAG-3'
I I II II I I '-AACTAGTCCACG-5'
A linkért további felhasználásig -20 °C-on tároljuk
8/ug ,25 kb mérető Báni fragmentet adunk rj 50/ul linkerhez ( a>500 pikomól), majd ehhez az elegyhez 1 /ul T4 DNS ligázt ( aj500 egység), 10 ^ul 10x tömény ligáz puffért és 29^ul vizet adunk, majd a kapott reakció-elegyet 4 °C-on éjszakán át inkubáljuk. A reakciót 10 perces 65 °C-os inkubálással állítjuk ligáz ligáz le. A
DNS-t kicsapjuk, Na-acetátot adva az oldathoz 0,3
M végkoncentrációban, ehhez két térfogat etanolt adunk, etanol
-szárazjég fürdőbe tesszük, majd lecentrifugáljuk a csapa dékot
A DNS csapadékot 10^ul 10x tömény Apai reakció pufferben oldjuk (60 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl,pH=7,4j mM MgClg és 60 mM 2-merkapto-etanol) hozzáadunk 5 ^ul ( a? 50 egység) Apai restrikciós enzimet és 85/ul vizet majd a reakció-elegyet két órára 37 °C-ra tesszük. A reakciót • ·· • · · ··*· ··· ·· ezután a fentiek szerint leállítjuk és a DNS-t kicsap juk. A DNS csapadékot lO^ul 10x tömény Hindin reakció-pufferben oldjuk, 5/ul ( Λ)50 egység) HindlII restrik ciós enzimet adunk hozzá és 85/Ul vizet, majd a reakció-elegyet két órára 37 °C-ra tesszük. A HindlII restrik ciós enzimmel végzett emésztés után a reakció-elegyet
3,5 %-os políakrilamid gélre visszük és a-M ,23 kb méretű HindlII-Apal restrikciós fragmentet izoláljuk, lényegében a 12A. példában közölt eljárást követve. A kí vánt fragmentből körülbelül 5^ug-ot kapunk, azt 10^ul TE pufferben oldjuk, majd -20°C-on tároljuk.
A pHC7 plazmid DNS-ből ötven/Ul-t elegyítünk 5/ul ( rJ50 egység)PstI restrikciós enzimmel, hozzáadunk 10/ul 10x tömény PstI reakció-puffért Tris-HCl, pH = 7.5; 100 mM MgCl2 és 1 vizet és a kapott reakció-elegyet két (1,0 M NaCl; 100 mM mg/ml BSA), 35/ul órán át 37 °C-on inkubáljuk. A PstI restrikciós enzimmel emésztett pHC7 plazmid DNS-t ezután 3,5 %-os políakrilamid gélen elektroforetizáljuk, majd a kivánt <x>0,88 kb méretű fragmen tet a fent leírt eljárás szerint tisztítjuk. Körülbelül
5/ug-ot kapunk a kivánt fragmentből, ezt lO^ul TE pufferben oldjuk és -20 °C-on tároljuk.
A körülbelül 5/ug-nyi mennyiségű nJ0,88 kb mérető PstI fragmentet hozzákeverjük λ) 50/Ul, a következő ···♦ ·
összetételű linkerhez, amelyet automata DNS -szintetizátorral állítunk elő.
5'-GTGATCAÁ-3 ’
I I I II I II ’-ACGTCACTAGTTCTAG-5'
Körülbelül 1^ul T4 DNS ligázt ( /V1O egység), 1O/U1 1Ox tömény ligáz puffért és 29/Ul vizet adunk a DNS keverékhez és a kapott ligálási reakció-elegyet éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk.
A ligálási reakciót az elegy 10 perces °C-os inkubálásával állítjuk le. A ligáit DNS ki csapása után a DNS-csapadékot 10/ul 10x tömény Apai ( n)50 egység) Apai restreakció-puf f e rben oldju k, 5/ul rikciós enzimet és 85/ul vizet ció-elegyet két órára 37 °C-ra adunk hozzá, majd a reak tesszük. A reakciót ezután leállítjuk, majd a DNS-t újra kicsapjuk. A DNS csapadékot ezután 10^ul 10x (1 M NaCl; 100 mM Tris-HCl, tömény BglII reakció-puffer
100 mM 2-merkapto-etanol és pH = 7,4; 100 mM MgClg;
mg/ml BSA) 5/ul ( 50 egység)
BglII restrikciós enzim és 85/ul viz összetételű elegyben oldjuk .majd a reakció-elegyet két órára 37 °C-ra tesszük, A BglII restrikciós enzimmel végzett emésztés után a reakció-elegyet 3,5 %-os poliakrilamid gélre visszük, és a kívánt a/ 0,19 kb méretű Apal-BglII res trikcós fragmentet izoláljuk, lényegében a fent leirt • ···· ···· · ·· · · ·
·..· · · eljárás szerint. A kívánt fragmentből körülbelül /ugot kapun!
10/ul TE pufferben oldjuk majd -20 °C-on tároljuk.
Körülbelül lO^ul pSV2gpt plazmid (ATCC 37145) oldunk lO^ul 10x tömény HindlII ció-puffer, 5^ul (rj50 egység) HindlII restrikciós enzim és 85 ^ul HgO összetételű oldatban a reakció-elegyet 2 órára 37 °C-ra tesszük. A reakDNS-t rreakés ció-elegyben 0,25 M Na-acetát koncentrációt állítunk be.majd két térfogat etanol hozzáadása és etanol-szárazjég fürdőben végzett inkubálás után a DNS csapa dérkot centrifugálással kinyerjük. A DNS csapadékot W^ul 10x tömény BglII puffer, 5/Ul ( r^50 egység) BglII restrikciós enzim és 85/ul viz összetételű, oldatban oldjuk, majd a reakció-elwgyet két órán át 37 °C-ra helyezzük. A BglII restrikciós enzimmel végzett emésztés után a reakció-elegyet 1 %-os agaróz-gélra visszük és a fragmenteket elektroforézissel elválasztjuk. A gélt etidium-bromiddal festjük és ultraibolya fénnyel tesszük láthatóvá, majd a kívánt λ25,1 kb méretű HindlII-BglII fragmentet tartalmzó csikót kivágjuk a gélből és dializáló hüvelybe tesszük. Az elektroforézist ezután addig folytatjuk, amig a DNS kilép az agarózból. A DNS-t tartalmazó puffért kiszívjuk dializáló hüvelyből, fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd a DNS-t kicsap juk. A csapadékot 1O/U1 TE pufferben oldjuk, igy tároljuk a pSV2 gpt plazmid 5^ug mennyiségű /ν'5,1 kb méretű HindlII-BglII restrikciós fragmentjét.
A nji ,23 kb méretű HindlII-Apal restrikciós fragmentből két^ul-t a #^0,19 kb méretű Apal-BglII és a rJ5,1 kb méretű HindIII-BglII fragmentből 3/ul-t fragmentből 2/ul-t mény ligáz puffer, összekeverünk, majd 1O/ul 1Ox tolóul T4 DNS ligáz ( λ>500 egység) és 82/ul víz összetételű oldatban 16 °C-on éjszakán át inkubáljuk. A Ugálással kapott DNS-molekula a kívánt pSV2-HPC8 plazmid, A pSV2-HPC8 plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 7. ábrán közöljűk
Az E.coli K12RR1 (NRRL B-1521O) sejteket a transzformációra alkalmassá (kompetenssé) lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint tesszük. A fentiek szerint előállított ligáit DNS-t használjuk a sejtek transzformálására, majd a transzformációs keverék alikvot részét 100/ug/ml ampicillint tartalmazó L-agarlemezre szélesztjűk. A lemezeket ezután 37 °C-on inkubáljuk. Az E.coli Kl2RR1/pSV2-HPC8 transzformánsokat plazmid DNS-Ok reetrikcós analízisével azonosítjuk.
• ··· ·
- 94 B. A pL133 plazmid előállítása
A pSV2-HPC9 plazmidból ötveryug-ot oldunk 10/Ul 10x tömény Hindin reakció-puffar, 5^ul ( rv50 egység) HindlII restrikciós enzim és 85/ul viz összetételű oldásban, majd a reakció elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. A HindlII restrikciós enzimmel végzett emésztés után a DNS-t kicsapjuk, majd a DNS csapadékot 10/ül 10x tömény Sáli reakció puffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl,pH= 7,9; 60 mM
MgCl2; 60 mM merkapto-etanol és 1 mg/ml BSA), 5/ul ( r-J 50 egység )SalI restrikciós enzim és 85/Ul viz összetételű oldatban oldjuk. A kapott Sáli reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk, A HindlII-Sall restrikciós enzimekkel emésztett pSV2-HPC8 plazmidot
3,5 %-os poliakrilamid gélre visszük, majd addig elektroforetizéljuk, amig a kívánt ^0,29 kb méretű HindlII-Sall restrikciós fragment elválik a többi reakció-terméktől, A kívánt fragmentet izoláljuk a gélből;
a fragmentből körülbelül 2^ug-ot kapunk, ezt lO^ul TE pufferben oldjuk.
ötven^ug pSV2-HPC8 plazmid DNS-t 10/ul 10x tömény BglII reqkció-puffer, 5/Ul (50 egység) BglII restrikciós enzim és 85/Ul viz összetételű oldatban oldunk, majd a kapott reakció-elegyet két órán ···>
···· · °C-on inkubáljuk. A BglII restrikciós enzimmel végzett emésztés után a DNS-t kicsapjuk, a DNS csapa dékot 1O/ul 1Ox tömény Sáli reakciópuffér, S/ul ( /V5O egység) Sáli restrikciós enzim és 85,ul viz összetételű oldatban oldjuk. A kapott Sáli reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. A Sall-BglII restrikciós enzimekkel emésztett pSV2-HPC9 plazmidot ezután 3,5 %-os poliakrilamid gélre visszük, és addig elektroforetizáljuk, amíg a kívánt ru 1,15 kb méretű Sall-BglII restrikciós fragment el nem válik az emésztési reakció többi termékétől. Arj1,15 kb méretű Sall-BglII restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből; a kapott körülbelül 8/ug fragmentet lO^ul TE pufferben oldjuk.
DNS-t (NRRL B-15928) oldunk 10,ul 1Ox tömény HindlII reakció-puffér, 5,ul (/^50 egység) HindlII restrikciós enzim és 85,ul viz összetételű oldatban, ma ció-elegyat 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A reakció-elegyben ezután 0,25 M Na-acetát koncentrációt állítunk be, majd két térfogat etanol hozzáadása és etanol-szárazjég fürdőben való inkubálás után a DNS csapadékot centrlfu^lással kinyerjük. A HindlII restrikciós enzimmel emésztett pSV2-béta-globin plazmidot ···· ···· ·
···· • · • ·· ·
10/ul 10x tömény BglII puffer, 5^ul (^50 egység)
BglII restrikciós enzim és 85/ul víz összetételű oldatban oldjuk, majd a reakció-elegyét két órán át 37 °C-on oldjuk, A BglII restrikciós enzimmel vég zett emésztés után a reakció-elegyet 1 %-os agaróz gélre visszük és a fragmenteket elektroforézissel elválasztjuk, A kívánt ^4,2 kb méretű HindlII-BglII restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből; a kívánt fragmentből körülbelül
5/ug-o
kapunk, ezt
1O/U1 TE pufferben oldjuk.
A pSV2-HPC8 plazmid 0,29 kb méretű HindlII-Sallfragmentjéből két ^ul-t, a pSV2-HPC8 plazmid ,15 kb méretű Sáli- BglII fragmentjéből 2/ul-t és a pSV2-béta-globin plazmid rv 4,2 kb méretű HindlII-BglII fragmentjéből 2^ul-t összekeverünk, majd összeligálunk a 13A. példában lsirt eljárás alapján. Az összeligált DNS molekula a kívánt pLl33 plazmid. A pLl33 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok közitt a 7, ábrán mutatjuk be, A kívánt E.coli K12RR1/ pL133 transzformánsokat a 16A, példában leirt eljárás szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pSV2-HPC8 plazmid helyett pLl33 plazmiddal transzformálunk.
- <37 14. példa
A pLPC plazmid előállítása
Körülbelül 20^ug pBLcat plazmid DNS-t oldunk 1O/U1 1Ox tömény Hindin reakció-puffer és 80/ul viz összetételű oldatban. A pBLcat plazmid DNS oldatához körülbelül 10/ul ( ό100 egység) Hindii! restrikciós enzimet adunk és a kapott reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. A Hindin restrikciós enzimmel emésztett pBLcat plazmid DNS-t agaróz gélra visszük, és addig elektroforetizáljuk, amíg a aj 0,87 kb méretű HindlII restrikciós f ragment, amely a BK erősítő szakaszt és az Ad2 késői promoterét tartalmazza, el nem válik a többi emésztési terméktől; ezután a 0,87 kb méretű fragmentet izoláljuk és előkészítjük ligáláshoz, lényegében a 12A. példában közölt leirás szerint, A kívánt fragmentből körülbelül 2/ug-ot kapunk, ezt 5/ul TE pufferben oldjuk.
Körülbelül 1 ,5/ug pL133 plazmid DNS-t oldunk 2/ul 10x tömény HindlII pufferben és 16/ul vizben. Körülbelül 1/U1 ( aj10 egység) HindlII restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, és a kapott reakció-elegyet 37 °C-on inku báljuk két órán át. A DNS-t ezután lOO^ul-rs hígítjuk TE pufferrel, és borjúból alkalikus foszfatázzal kezeljük, lényegében a 7. példában leirt eljárás szerint. A HindlII restrikciós enzimmel emésztett pL133 plazmid DNS-t kétszer • 9
extraháljuk fenollal, egyszer kloroformmal, etanollal pufferben oldjuk
A pBLcat plazmid /MJ.87 kb méretű Hindii!
restrikciós fragmentjéből körülbelül ul-t adunk ,5 /ul Hindin restrikciós enzimmel emésztett pL133 plazmidhoz, majd 1 zul 10x tömény ligáz puffért, 1 zul ( 1000 egység) T4 DNS ligázt és 1,5zul vizet adunk a
DNS oldathoz, és a kapott reakció-elegyet 16 °C-on éjszakán át inkubáljuk. Az összeligált DNS molekula a kívánt pLPC plazmid. A pLPC plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 8. ábrán mutatjuk be.
A ligáit DNS-t használjuk E.coli K12HB101 törzs transzformálására, lényegében a 3. példában leirt eljárás ezerint. A transzformált sejteket ampicillin-tartalmu L-agarlemezre szélesztjűk, és az ampicillinrezisztens transzformánsok plazmid DNS-ét restrikciós enzimes emésztéssel analizáljuk az E.coli K12 HB101/pLPC transzformánsok azonosítása céljából. A BK erősítő szekvenciát és az Ad2 késői promotert tartalmazó rjO,87 kb méretű HindlII restrikciós fragmentet a Hindin restrikciós enzimmel emésztett pLl33 plazmidba két különböző orientációban építhetjük be, és azt a konstrukciót nevezzük pLPC-nek, amely egy ^1 ,0 kb méretű Ndel-Stul restrikciós fragmentet tartalmaz.
····
15. példa
A pLPChygl és pLPChyq2 plazmidok előállítása
Az E.coli K12RR1/pSV2hyg törzs NRRL
B-18039 sorszám alatt hozzáférhető a Northern Régiónál
Research Labora tóidnál. A pSV2hyg DNS-t ,a sejtekből az
1. példában leirt eljárás alapján nyerjük ki. A pSV2hyg plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 8. ábrán mutatjuk be.
oldott
Körülbelül lO^ug lO^ul TE pufferben pSV2hyg plazmid DNS-t adunk 2^ul 10x tömény BamHI hez és 6/ul vízhez. A DNS-oldathoz körülbelül 2^,ul (körülbelül 20 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk, majd a kapott reakció-elegyet 37 °C-on két órán át inku pufferbáljuk. A reakció-elegyet először fenollal extraháljuk, majd kétszer kloroformmal. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett pSV2hyg DNS-t agaróz gélre visszük, majd a körülbelül 2,5 kb méretű restrikciós fragmentet lénye gében a 12A. példában leirt eljárással izoláljuk.
Körűbelül 5/Ul 10x tömény Klenow puffért (0,2 mM mindegyik dezoxinukleotidból, 0,5 M Tris-HCl, pH « 7,8j 50 mM MgClg; 0,1 M 2-merkapto-etanol és lOO^ug/ ml BSA) és 35^ul vizet adunk a BamHI restrikciós enzimmel emésztett pSV2hyg plazmid DNS-hez. Majd körülbelül egység Klenow enzimet (körülbelül 5^ul, a BRL kisze-
100 relésében) adunk a DNS keverékhez és a reakcióelegyet 16 °C-on 30 percig inkubáljuk. A Klenow fragmenttel kezelt BamHI restrikciós enzimmel emésztett pSV2hyg plazmid ÖNS-t egyszer extraháljuk fenollal és egyszer kloroformmal, majd etanollal kicsapjuk. A kívánt fragmentből körülbelül 2/ug-ot kapunk és ezt 5/ulTE pufferben oldjuk.
Körülbelül 10/ug (10^ul) pLPC plazmid DNS-t adunk 2^ul 10x Stul pufferben és 6/ul vizhsz. A DNS oldathoz körülbelül 2^ul (<-10- egység) Stul restrikciós enzimet adunk, majd a reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A Stul restrikciós enzimmel emésztett pLPC plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyerjük, majd 2^ul 10x tömény Ndel reakció-puffer (1,5 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl, pH = 7,8j 70 mM
MgClg; 60 mM 2-merkapto-etanol és 1 mg/ml BSA) és 16/U1 viz összetételű oldatban oldjuk. Körülbelül 2/ul ζ lOegység) Ndel restrikciós enzimet adunk a Stul-restrikciós enzimmel emésztett plazmid DNS-hez, majd a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk.
Az Ndel-Stul restrikciós enzimekkel enésztett pLPC plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk,centrifugálás
8al kinyerjük, majd 5/ul 10x tömény Klenow puffer és 40/ul viz összetételű oldatban oldjuk. A DNS oldathoz kö·♦ • · ··· ···
101
majd a kapott reakció-elegyet 16 °C-on 30 perc után agaróz gélre visszük és a v 5,82 kb méretű Ndel-Stul restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből. A kívánt fragmentből körülbelül 5 ,ug-ot kaA pSV2hyg plazmából származó ^2,5 kb méretű Klenow-fragmenttel kezelt, BamHI restrikciós f ragmsnt j éből körülbelül 2.ul-t keverünk körülbelül
1,ul, a pLPC plazmidból származó /v5,82 kb méretű Klenow fragmenttel kezelt Ndel-Stul restrikciós fragmenttel.
majd a DNS oldathoz adunk körülbelül
10x töm ligáz puffért, 2^ul T4 DNS ligázt (ívlOOO egység), 1 ,ul T4 RNS ligázt (zvi egység ) és 14,ul vizet. A k izet. A kapott reakció-elegyet éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk.
Az összeligált DNS molekulák a kivánt pLPChygl és pLPChyg2 plazmidok, amelyek csak a ro2,5 kb méretű, Klenow fragmenttel kezelt BamHI restrikciós fragment beépűlési orientációjában különböznek. A pLPChygl plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 8. ábrán közöljük, A ligáit DNS-t használjuk E.coli K12HB101 törzsek transzformálására, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint, A kivánt E.coli K12HB101/pLPChyg1 és E.coli Kl2HB101/pLPChyg2 transzformánsokat ampicillin-tartalmu L agarlemezre széleszt• ♦·
- 102 jük, majd plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízisével azonosítjuk.
16. példa
A pBW32 plazmid előállítása
A. A PTPA103 intermedier plazmid előállítása
A pTPA plazmid a humán szöveti plazminogén aktivátor (TPA) kódoló szekvenciáját tartalmazza. A ρΤΡΑ1Ο2 plazmidot E.coli K12 MM294/pTPA102 törzsből lehet izolálni, amely törzs NRRL B-15834 sorszám álatt hozzáférhető a Northern Régiónál Rseearch Laboratorynál. A pTPA 102 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 9. ábrán közöljük. A pTPA plazmid DNS-t lényegében az 1. példában leirt eljárás szerint izoláljuk.
Körülbelül 50^ug ρΤΡΑ1Ο2 plazmid DNS-t (körülbelül 50/ul TEpufferben) adunk lO^ul 10x tömény Tth 1111 reakció-puffér (0,5 M NaCl; 80 mM Tris-HCl, pH = 7,4; 80 mM MgCl,,; 80 mM 2-merkapto-etanol és 1 mg/ml BSA) és 80/ul viz összetételű oldatban oldjuk. Körülbelül 10/ul ( n) 50 egység) Tth111I restrikciós enzimet adunk a DNS-oldsthoz és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 65 °C-on inkubáljuk. A reakció-elegyet agaróz gélre visszük, majd izoláljuk a gélből a a/4,4 kb méretű Tthmi restrikciós fragmentet, amely a TPA kódoló
103 szekvenciát tartalmazza. A többi emésztési terméket.
a 3,1 é9 0,5 kb mérető restrikciós fragmenteket kidobjuk. A kívánt <v 4,4 kb mérető Tth11ll restrikciós fragmentből körülbelül
10/ug-ot kapunk, ezt lO^ul TE pufferben oldjuk.
A 4,4 kb méretű Tth111I restrikciós fragmentet, tartalmazó mény Klenow puffért és
5/Ul Klenow ció-elegyet enzim ( további oldathoz körülbelül 5/ul 10x tö30/ul vizet adunk, majd további egység) hozzáadása után a reakpercig inkubáljuk 16 °C-on. A
Klenow reakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk, majd
3/ul 10x tömény ligáz puffer és 14^ul viz összetételű oldatban oldjuk.
következő szekvenciáju BamHI linkereket:
'-CGGATCCG-3 '
I IUIIH '-GCCTAGGC-5' , foszforilezzük, majd a következő eljárással készítjük elő ligáláshoz. Négyéül linkért ( ^2^ug) oldunk 20,15/Ul vízben, 5/ul 10x tömény kináz’ puffért adunk hozzá (500 mM Tris-HCl, pH= 7,6 és 100 mM MgClg)» két percig 90 °C-on inkubáljuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük. Az elegyhez 5/Ul f^-P-ATP-t ( λ/20/uCí), 2/ul 1M DTT-t és 5 /U1 polinukleotid kinázt (n/10 egység) adunk,majd ···. .* ···: ·*·· t •í.. ·.*· ··
104 °C-on 30 percig inkubáljuk. Ezután 3,35/ul 0,01 M ATP-t és 5/ul kinázt adunk hozzá, majd a reakciót további 30 percig hagyjuk futni 37 °C-on. A radioaktív
ATP segít annak eldöntésében, hogy a linker ligálódott-e a cél DNS-be .
A foszforilezett
BamHI linkerből lO^ul-t adunk a rO 4,4 kb méretű Tth111I méretű restrikciós fragment oldatához, majd 2^ul T4 DNS ligáz ( r\J 1000 egység) és 1/ul T4 RNS ligáz (/02 egység) hozzáadása után a ligálási reakciót éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk, A ligáit DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 5^ul 10x tömény HindlII pufferben oldjuk és 40/ul hoz körülbelül 5/ul (λ>50 enzimet adunk és a kapott 2 órán át inkubáljuk.
vizet adunk hozzá. A DNS-oldategység) HindlII restrikciós reakció-elegyet 37 °C-on
A HindlII restrikciós enzimmel emésztett
DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 10/ul 10x tömény BamHI puffer és 90/ul víz összetételű oldatban oldjuk. Körülbelül 10/ul ( /0100 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, majd a kapott reakció-elegyet 37°Con inkubáljuk két órán át.A BamHI restrikciós enzimmel végzett emésztés után a reakció-elegyet agaróz gélre visszük, majd a <0 2,Ot méretű BamHI-HindlII restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből, A kívánt fragmentből kö105 .··. ···:····:
·*·· ♦.·.· ;* ···· rülbelül 4/ug-ot kapunk, ezt körülbelül 5/ul TE pufferben oldjuk.
A pTPA103 plazmid előállítása céljából a PTPA102 plazmidból származó a/2,0 kb méretű BamHI-HindlII restrikciós fragmentet a BamHI-HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pRC plazmidba építjük be. A pRC plazmidot úgy állítjuk elő, hogy egy ni 288 bp tartalmazza a méretű EcoRI-ClalVrestrikc iós fragmentet, amely az
E.coli trp operon promoter és operátor (trpPO) szekvenciáját EcoRI-Clal restrikciós erzimekkel emésztett pKC7 plazmidba építjük be. A pKC7 plazmid az ATCC 37084 sorszám alatt az American Type Culture Collectionnál hozzáférhető E.coli K12 Nl00/pKC7 törzsből állítható elő. A trpPO szekvenciát tartalmazó rv 288 bp méretű EcoRI-Clal restrikciós fragmentet az E.coli K12 ΜΜ294/ΡΤΡΑ102 (NRRL B-15834) törzsből izolálható ρΤΡΑ1Ο2 plazmidból állítjuk elő. A pKC7 és ρΤΡΑ1Ο2 plazmid DNS-t az emésztett sejtvonalakból állíthatjuk elő lényegében az 1. példában közölt eljárás szerint.Ez a pj 0,29 kb méretű EcoRI-Clal restrikciós fragment tartalmazza a transzkripciós aktiváló szekvenciát, valamint a transzlációs aktiváló szekvencia legnagyobb részét azE,'3oli trp génből, szekvenciája a következő:
···· ··· ·♦ ···· ···· · • · ····
106
20 30 4050
5'-AATTCACGCT GTGGTGTTAT GGTCGGTGGT CGCTAGGGTG CCGACGCGCA ι Γιι I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3’-GTGCGA CACCACAATA CCAGCCACCA GCGATCCCAC GGCTGCGCGT
70- 80 90100
TCTCGACTGC ACGGTGCACC AATGCTTCTG GCGTCAGGCA GCCAATCGGA I I I I I I I I I I I I I I 11 I I I I I I I I I I I 11 I I I I I I I I I I I I I 11 I I I I I I AGAGCTGACG TGCCACGTGG TTACGAAGAC CGCAGTCCGT CGGTTAGCCT
110 120 130 140150
AGCTGTGGTA TGGCTGTGCA GGTCGTATAA TCACCGCATA ATTCGAGTCG
TCGACACCAT ACCGACACGT CCAGCATATT AGTGGCGTAT TAAGCTCAGC
160 170 180 190200
CTCAAGGCGC ACTCCCGTTC CGGATAATGT TTTTTGCTCC GACATCATAA llllllllll llllllllll llllllllll llllllllll llllllllll GAGTTCCGCG TGAGGGCAAG GCCTATTACA AAAAACGAGG CTGTAGTATT
210 220 230 240250
CGGTTCCGGC AAATATTCTG AAATGAGCTG TTGACAATTA ATCATCGAAC llllllllll llllllllll I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I llllllllll GCCAAGGCCG TTTATAAGAC TTTACTCGAC AACTGTTAAT TAGTAGCTTG
260 270 280287
TAGTTAACTA GTACGCAAGT TCTCGTAAAA AGGGTAT-3' llllllllll llllllllll llllllllll I I I I I I I ATCAATTGAT CATGCGTTCA AGAGCATTTT TCCCATAGC-5' így, a pRC plazmid előállítása céljából körülbelül 2^ug , lO^ul TE pufferben oldott pKC7 plazmidot adunk 2^ul 10x tömény Clal puffer (0,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH = 7.9; 60 mM MgClg és 1 mg/ml BSA) és 6/ul víz elegyéhez. Körülbelül 2^ul ( Λ) 10 egység) .··. .: ···; ····.
···· .:. ·..· · ····
- 107 Clal restrikciós enzimet adunk a pKC7 plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A Clal restrikciós enzimmel emésztett pKC7 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 2^ul 10x tömény EcoRI puffer és 16/ul víz elegyében oldjuk. Körülbelül 2/ul ( D10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk a Clal restrikciós enzimmel emésztett pKC7 plazmid DNS oldatához, és a kapott reakció-elegyet két órán át 37 °Con inkubáljuk.
Az EcoRI-Clal restrikciós enzimekkel emésztett pKC7 plazmid DNS-t egyszer fenollal,majd kétszer kloroformmal extraháljuk. A DNS-t ezután etanollal kicsapjuk, és 3/ul 10x tömény ligáz puffer és 20/ul viz elegyében oldjuk. A pKC7 plazmid restrikciós és funkciós térképe a Molecular
Cloning kézikönyv 8. oldalán található (Cold Spring Harbor
Laboratory, 1982)
Körülbelül 20^ug pTPA102 plazmid körülbelül 20/ul-es TE pufferes oldatát lO^ul 10x tömény Clal puffer és 60/ul viz elegyéhsz adjuk. A pTPA 102 plazmid DNS-hez körülbelül lO.ul ( a/50 egység)ClaI restrikciós adunk, ' enzim et Vmajd a kapott reakció-elegyet 37 °C-on inkubáljuk 2 órán át, A Clal restrikciós enzimmel emésztett pTPA102 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 10/ul 10x tömény
108
adunk a Clal restrikciós enzimmel emésztett ρΤΡΑ1Ο2 plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet 37 °C-on inkubáljuk 2 órán át.
Az EcoRI-Clal restrikciós enzimekkel emésztett pTPAlO2 plazmid DNS-t egyszer fenollal extraháljuk, majd 7 %-os poliakrilamid gélra visszük, és addig elektroforetizáljuk, amig a trpPO szekvenciát tartalmazó 288 bp méretű'EcoRI-Clal restrikciós fragment elválik a többi emésztési terméktől. A n, 288 bp méretű EcoRI-Clal restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből; kürölbelül l^ug-ot kapunk a kívánt fragment ből, ezt 5zul TE pufferben oldjuk és a fentiek szerint előállított EcoRI-Clal reetrikciós enzimekkel emésztett pKC7 plazmid DNS oldatához
Körülbelül 2 ,ul ( <~ 1000 egység) T4 DNS ligázt adunk a DNS keverékhez, és a kapott ligálási reakciót 16 °C-on inkubáljuk órán át. A ligáit DNS molekula a kívánt pRC plazmid DNS,
A ligáit DNS-t használjuk kotApetens E.coli
K12[HB101 sejtek transzformálására, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint. A transzformált sejteket
109 és az ampicillin rezisztens transzformánsokat plazmid
DNS-ük restrikciós enzimes analízisével vizsgáljuk, hogy a kívánt E.coli K12HBiO1/pRC telepeket azonosítsuk. Az E.coli K12HBl0lZpRC transzformánsokból a pRC plazmid DNS-t lényegében a 2, példában Isirt eljárás alapján nyerjük ki.
Körülbelül 2^ug pRC plazmid DNS 2^ul TE pufferes oldatát 2^ul 10x tömény HindlII puffer és 16 /U1 víz oldatához adjuk. A Hindui restrikciós enzimből körülbelül 2^ul-t ( /0 10 egység) adunk a pRC plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet 37 °C-on in kubáljuk két órán át. A Hindin restrikciós enzimmel emésztett pRC plazmidot etanollal kicsapjuk, majd 2^ul 10x tömény BamHI puffer és 16/ul víz elegyében oldjuk. Körülbelül 2^ul ( /010 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a HindlII restrikciós enzimmel emésztett pRC plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet 37 °C-on inkubáljúk2 órán át.
ABamHI-HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pRC plazmid DNS-t egyszer extraháljuk, fenollal, majd kétszer kloroformmal. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 3^ul 10 tömény ligáz puffer és 20^ul viz ele···
110 ··♦· ···· · • · ·
- · · · · ϊ ···· gyében oldjuk. A pTPAi02 plazmid ^2,0 kb méretű HindlII-BamHI restrikciós fragmentből ^4/ug-ot ( N 5/UÍ TE pufferben) adunk a BamHI-HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pRC plazmid DNS oldatához. Körülbelül 2^ul ( d 1000 egység) T4 DNS ligázt adunk a DNS elegyhez és a kapott reakció-elegyet 16 °C-on inkubáljuk 2 órán át. A ligáit DNS molekula a kivánt ρΤΡΑ1Ο3 plazmid DNS.
A nemkivánt transzformánsok számának csökkentése céljából a ligáit DNS-t Ncol restrikciós enzimmel emésztjük, amely hasítja a pRC plazmidot, de nem hasítja a pTPAlO3 plazmidot. A ligáit DNS Ncol restrikciós enzimmel való emésztése csökkenti a nemkivánt transzformánsok számát, mivel a linearizált DNS sokkal kisebb frekvenciával transzformálja az E.coli-t mint a zárt, cirkuláris DNS. A ligáit DNS emésztéséhez a DNS-t elő ször etanollal kicsapjuk, majd 2/ul 10x tömény Ncol puffer (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl pH = 7,8; 60 mM
MgCl2 és 1 mg/ml BSA) és 16/ul
Körülbelül 2/ul ( a) 20 egység) viz elegyében oldjuk.
Ncol restrikciós enzimet adunk a DNS -oldathoz, és a kapott reakció-elegyet órán át 37 °C-on inkubáljuk.
···
111
A ligáit, majd Ncol restrikciós enzimmel emésztett plazmid DNS-t használjuk E.coli K12RV308 (NRRL B-15624) törzs transzformálására. Kompetens E.coli K12RV308 sejteket és a kompetens sejtek transzformálását lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint végezzük. A transzformációs elegyet 100/ug/ml ampicillint tartalmazó L agarlemezre szélesztjük. Az ampicillin rezisztens transzformánsoknak megvizsgáljuk a koinamicin érzékenységét , mivel a pRC plazmid tartalmaz kanamicin rezisztencia cpnt, a pTPA1O3 plazmid nem. Az ampicillin rezisztens kanamicin érzékeny transzformánsokból izolálunk plazmid DNS-t és a plazmid DNS-t restrikciós enzimes analízissel vizsgáljuk az E.coli Kl2RV3OS/pTPAlO3 transzformánsok azonosítására. A pTPA103 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 9. ábpán közöljük. A pTPAlO3 plazmid DNS-t az E.coli K12RV3O8/pTPAlO3 sejtekből állítjuk elő, lényegében az
1. példában leirt eljárás szerint.
B. A pBW25 intermedier plazmid előállítása
Körülbelül 1,ug
TE pufferben készült oldatát 2.ul 1Ox tömény BglII reakciópuf fe rhez és 16zul vízhez adjuk. Körülbelül .··. .: ···:····· ···· *.é· :* ·»·»
112
1/ul ( 5 egység) BglII restrikciós enzimet adunk a pTPAiO3 plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elsgyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk, A BglII restrikciós enzimmel emésztett pTPA103 plazmid DNS-t eta-
nollal kicsapjuk és 5/ul 10x tömény Klenow puffer
valamint 44 ^ul viz 1/U1 Klenow enzimet elegyében oldjuk. KöríxbelQl ( rJ 1 egység) adunk a BglII restrik-
ciós enzimmel emésztett ΡΤΡΑ103 plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 16 °C-on inkubáljuk. A Klenow-fragmenttel kezelt BglII restrikciós enzimmel emésztett pTPAlO3 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk'; majd 3/ul ÍOx tömény ligáz puffer és 22^ul víz elegyében oldjuk.
Körülbelül 2^ul ( r/0,2/ug) foszjorile-
zetlen Ndel linkért (New England Bilabs), amelynek nukleotid szekvenciája a következő:
5'-CCATATGG-3' llllllll '-GGTATACC-5' adunk a Klenow fragmenttel kezelt, BglII restrikciós enzimmel emésztett pTPA103 plazmid DNS oldatához, 2/ul ( η) 1OOO egység) T4 DNS ligáz és 1/ul ( í\) 2 egység) T4 RNS ligázzal együtt, és a kapott ligálási reakciót 4 °C-on éjszakán át inkubáljuk. A ligálással össze♦ ···
- 113 zárt DNS molekula a pTPA103derNdeI plazmid, amely lényegében azonos a pTPAlO3 plazmiddal, azzal a különbséggel, hogy a pTPAlO3derNdeI plazmidban egy Ndel restrikciós enzim felismerési hely van ott, ahol a ρΤΡΑ1Ο3 plazmidban egy BglII restrikciós enzim felismerési hely van.
A ligáit DNS-sel E.coli K12RV308 kompetens sejteket transzformálunk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint, A transzformált sejteket ampicillin-tartalmu L-agarlemezre szélesztjük és az E.coli K12RV308/pTPA103derNdeI transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízisével azonosítjuk. A pTPA1O3derNdeI plazmid DNS-t izoláljuk a transzformánsokból további felhasználás céljára, lényegében az 1. példában leirt eljárás szerint.
Körübelül lO^ug pTPAl03derNdeI plazmid DNS 10/ul TE pufferben.íészült oldatát 2^ul 1Ox tömény Avall reakció-puffer (0,6 M NaCl; 60 mM Tris-HcL, pH= 8,0, 0,1 M MgClg; 60 mM 2-merkapto-etanol és 1 mg/ml BSA) és 6/Ul víz elegyéhez adjuk. Körülbelül 2^ul ( N10 egység) Avall restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °Con inkubáljuk. Az Avall restrikciós enzimael emésztett DNS-t agaróz gélre visszük, és addig elektrofore
- 114 tirzáljuk, amig a <vi,4kb méretű restrikciós fragment elválik a többi restrikciós emésztési terméktől.
A pTPA103der.Ndel plazmid 1 ,4 kb méretű Avall restrikciós fragmentjét izoláljuk a gélből; a kívánt fragmentből körülbelül 2^ug-ot kapunk, ezt 5^ul TE pufferben oldjuk.
Körülbelül 5/ul 10x tömény Klenow puffért, 35/ul vizet és 5/ul (^5 egység) Klenow enzimet adunk a 1 ,4 kb méretű Avall restrikciós fragment oldatához és a kapott reakció-elegyet 16 °C-on inkubáljuk 30 percig. A Klenow enzimmel kezelt DNS-t etanollal kicsapjuk,majd 3/Ul 10x tömény ligáz puffer és 14^ul viz elsgyében oldjuk.
Körülbelül 2^ug,
Hpal linkért:
következő szekvsnciáju
5'-CGTTAACG-3 * 11111111
3'-GCAATTGC-5 ’ a 2, példában közölt eljárás szerint foszforilezzük.
A foszforilezett linkerből körülbelül lO^ul-t adunk a pTPAl03derNdeI plazmid Klenow-fragmenttel kezelt
Ai 1 ,4 kb méretű Avall restrikciós fragmsntjéhsz 2/ul ( λ) 1000 egység) T4 DNS ligázzal és 1/U1 (rJ 1 egység) T4 RNS ligázzal együtt és a kapott reakció-slegyet
- 115 éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk.
A ligáit DNS-t először egyszer fenollal extraháljuk, majd kétszer kloroformmal etanollal kicsapjuk, majd 2/ul 1Ox EcoRI puffer és 16/ul viz elegyében oldjuk. Körülbelül 2^ul ( 10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 37 °C~on inkubáljuk. Az EcoRI restrikciós enzimmel emésztett DNS-t először egyszer extraháljuk fenollal, majd kétszer kloroformmal, etanollal kicsapjuk, majd 3/ul 10x ligáz puffer és 20/ul viz elegyében oldjuk, A körülbelül 770 bp méretű fragment, amely a trpPO-t és a TPA amino-terminális részét kódolja, egy EcoRI véggel és egy tompa véggel rendelkezik és az EcoRI-Smal enzimekkel emésztett pUC19 ρΐ,θζmidba ligáljuk, igy kapjuk a pUC19TPAFE plazmidot.
Körülbelül 2^ul pUCl9 plazmidot (kapható a Bethesda Research Laboratories-nál) oldunk 2^ul 10x tömény Smal pufferben (0,2 M KC1; 60 mM Tris-HCl, pH= 8,0; 60mM MgClg· 60 mM 2-merkapto-etanol és 1 mg/ml BSA) valamint 16/ul vízben. A DNS oldathoz körülbelül Z/ul (aj10 egység) Smal restrikciós enzimet adunk és a kapott reakció-elegyet 2 órán át 25 °C-on inkubáljuk.
A Smal restrikciós enzimmel emésztett pUC19 plazmid DNS-t ·· « ··
116 etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyerjük, majd
2/ul 1Ox tömény EcoRI puffer és 16/ul viz elegyében old juk. A Smal restrikciós enzimmel emésztett pUC19 plaz mid DNS oldatához körülbelül 2^ul (<v10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk, majd a kapott reakció-elegyet órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az EcoRI-Smal restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmid DNS-t egyszer fenollal extraháljuk majd utána kétszer kloroformmal és 5/ul TE pufferben oldjuk.
Az EcoRI-Smal restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmid DNS-t hozzáadjuk a pTPAlO3derNdeI plazmidból származó 770 bp méretű EcoRI és tompa véggel rendelkező restrikciós fragment oldatához. A DNS elegyhez körülbelül 2 ^ul ( v 1000 egység) T4 DNS ligázt adunk, és a kapott reakcióelegyet éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk. A ligáit DNS-molekula a kívánt pUCl9TPAFE plazmid. A pUC19TPAFE plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 9. ábrán közöljük.
A pUC19TPAFE plazmid készítésében felhasznált, EcoRI és Smal felismerési szekvenciákat tartalmazó pUC19 többszörös klónozó hely a lacZ« fragment kódoló szekvenciájában található. Azokban a sejtekben, amelyek a lacZ /\M15 mutációt, a β-galaktozidáz gént kódoló lacZ génben lévő mutációt tartalmaznak a lacZ « fragment
117 expressziója lehetővé teszi funkcionális fi-galaktozidáz molekula expresszióját és igy lehetővé teszi, hogy a sejtek elhidrolizálják az X-Gal-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-B-D-galaktopiranozid), egy színtelen vegyületet, indigó szinü hidrolízis termékké. A ρϋ019. többszörös klónozó helyére DNS-t beépítve a lacZ « fragment kódoló szekvenciája megszakad és az ilyen plazmidot tartalmazó, lacZ/\M15 mutációval rendelkező sejtek nem képesek az X-Gal-t elhidrolizálni. A pUCl9TPAFE plazmidot tartalmazó ligáié eleggyel kompetens E.coli K12RR1/\M15 (NRRL B-15440) sejteket transzformálunk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint.
A transzformált sejteket 100/ug/ml ampicillint tartalmazó L-agarlemezre szőlésztjük, amely emellett még 40/ug/ml X-Gal-t és 1 mM IPTG-t is tartalmaz. A színtelen telepeket tovább tenyésztjük és plazmid DNS-t izolálunk belőle; az E.coli K12RR1/\M15/ pUC19TPAFE transzformánsokat plazmid DNSOk restrikciós enzimes analízisével azonosítjuk, A pUC19TPAFE plazmidot további felhasználás céljából izoláljuk az E.coli Kl2RR1/\M15/pUC19TPAFE sejtekből, lényegében az 1. példában leirt eljárást követve.
Körülbelül 7/ug pUC19TPAFE plazmid 20/Ul TE pufferbenjkészült oldatát 10/ul 10x tömény Hpal reak118 ció-puffer (0,2 MKC1}. 0,1 M Tris.HCl,pH=7 ,4 és
0,1 M MgClg) és 70/Ul'víz elegyéhsz adjuk. Körülbelül 3/ul ( Ό6 egység) Hpal restrikciós enzimet adunk a PUC19TPAFE DNS-hez, és a kapott reakció-elegyet 20 percig 37 °C-on inkubáljuk. A rövid inkubáció· idő célja az, hogy részleges Hpal emésztést érjünk el. A reakció-elegy térfogatát 1x tömény BamHI puffer (150 mM NáCl; 10mM Tris-HCl,pH=8.0 és 10 mM
MgClg, a sókoncentráció emelés^, inaktiválja a Hpal restrikciós enzimet) hozzáadásával 150/ul-re emeljük.
A Hpal restrikciós enzimmel részlegesen emésztett plazmid DNS oldatához körülbelül 1^ul ( N16 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakció-elegyet 90 percig 37 °C-on inkubáljuk.
A BamHI restrikciós enzimmel teljesen, a Hpal restrikciós enzimmel részlegesen emésztett pUC19TPAFE plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, 1,5 %-os a^aróz gólra visszük, és a <03,42 kbméretü Hpal-BamHI restrikciós fragmentet, amely a replikációs origót, a β-laktamáz gént és az összes TPA-kódoló részt tartalmazza a pUC19TPAFE plazmidból, izoláljuk a gélből a kívánt fragmentet tartalmazó géldarabot kivágva, megfagyasztva, majd a folyadékot kipréselve a géldarabból. A DNS-t etanollal kicsapjuk az oldatból, A kívánt fragmentből körülbelül 1^ug-ot kapunk, ezt 20/ul TE pufferben szuszpendáljuk.
119 Körülbelül 10/ug pTPA103 plazmid lO^ul TE pufferben készült oldatát lO^ul lOxScal reakció-puffer (1,0 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH= 7,4;
mM MgClg, 10mM DTT és 1 mg/ml BSA) és 80/ul víz elegyében oldjuk, A pTPAlO3 plazmid DNS oldatához körülbelül 3/ul ( fü18 egység) Scal restrikciós enzimet adunk és a kapott reakció-elegyet 90 percig 37 °C-on inkubáljuk, A raakció-elegy térfogatát 150 ^ul-re állítjuk 1x tömény BamHI reakció-puffer hozzáadásával, ez után körülbelül 1/ul ( λ/16 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk az elegyhez, és 90 percig 37 °C-on inkubáljuk.A DNS-t etanollal kic®pjuk, centrifugálással kinyerjük, majd elektroforézishez előkészítve feloldjuk.
A Scal-BamHI restrikciós enzimekkel emésztett pTPA103 plazmid DNS-t 1,5 %-os agaróz gélre visszük, és addig elektroforetizáljuk, amig a a/1,015 kb méretű Scal-BamHI restrikciós fragment elválik a többi restrikciós emésztési terméktől. A pTPAlO3 plazmid a TPA-karboxi-terminális részét kódoló /V 1,015 kg méretű Scal-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből; a kívánt fragmentből körülbelül 0,5 ^ug-t kapunk.
Iáit vízben oldjuk.
desztilA pUC19TPAFE plazmidból származó 3,42kb
méretű BamHI-Hpal restrilc iós fragment
2/ul-ét 2/ul, ·· ·····
- 120 a ρΤΡΑ1Ο3 plazmidból származó /V1 ,015 kb méretű Scal-BamHI restrikciós fragmenthez adjuk,majd 2^ul 10x tömény ligáz puffért és 1/U1 ( Weiss egység,· a ligáz előállítója a Promega Biotec, 2700 S, Fish Hatchery adunk hozzá
Road, Madiron, WI53711) T4 DNS ligáztY^s a kapott reakció-elegyet 16 °C-on éjszakán át inkubáljuk. Az összeligáit DNS molekula a kívánt pBW25 plazmid, A pBW25 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 9. ábrán mutatjuk be.
A ligáit DNS-t használjuk E.coli K120M105 törzs (kapható a BRL-nél) transzformálására, amelyet transzformációhoz kompetenssé lényegében a 3, példában leirt eljárással tettük, azzal a különbséggel,hogy az eljárásban 50 mM CaClg-ot használunk, A transzformált sejteket 100/ug/ml ampicillint tartalmazó BHI (Difco Laboratories, Detroit.MI) táptalajra szélesztjök, és az E.coli K12 0M105/pBW25 transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízise alapján azonosítjuk, A további felhasználás céljára a pBW25 plazmidot lényegében az 1, példában leirt eljárás szerint állítjuk elő.
·· • ··
121
A TPA kódoló régió helyspecifikus mutagenezise és a pBW28 plazmid előállítása
Körülbelül 5^ug pBW25 plazmid lO^ul üvegben desztillált vizzel készült oldatát adjuk körül-
és a kapott reakció-elegyet 90 percig 37 °C-on inkubáljük, Körülbelül ( nj24 egység) EcoRI restrikciós énzimet és 10-ul 1 mólos Tris-HCl (pH = 7,6) oldatot adunk a HindlII restrikciós enzimmel emésztett pBW25 plazmid DNS-hez és a kapott reakció-elegyet 90 percig inkubáljuk 37 °C-on, Az EcoRI-HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pBW25 plazmidot etanolos kicsapással töményitjük, 1,5 %-os agaróz gélre visszük, majd addig elektroforetizáljuk, amig a rU810 bp méretű EcoRI-HindlII restrikciós fragment elválik a többi emésztési terméktől. A a;810 bp méretű EcoRI-HindlII restrikciós fragmentből körülbelül 0,5 /ug-ot izolálunk a gélből, ligáláshoz előkészítjük és 20/ul üvegbenjdesztillált vizzel feloldjuk.
Az M13 mp8 DNS (kapható a New England Bio35,ul üve desztillált vizzel oldunk, és 1O,ul 10x tö-
·· • ···· ···· •
• · ·· · • •
• • · ♦ •
···· • · · ··· ·· • • ··
122 mény HindlII puffer és 55/Ul viz elegyébenoldunk. Körülbelül 1/U1 (^20 egység) HindlII restrikciós enzimet adunk az M13 mp 8 DNS oldatához, majd a kapott reakció-elegyet 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. «örül belül 3/Ul ( <v24 egység) EcoRI restrikciós körülbelül 10 /U1 1M Tris-HCl-t (pH = 7.6) Hindii! restrikciós enzimmel emésztett M13 enzimet és adunk s és a kapott reakció-elegyet egy órán át 37 mp8 DNS-hez °C-on inkubáljuk, A HindlII-EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett
M13 mp8 DNS-t etanolos kicsapással kinyerjük, felold jük gél-elektroforézishez és a restrikciós fragmentet gél-elektroforézissel izoláljuk. Körülbelül 1/ug-ot kapunk a M13 mp8 nagy EcoRI-HindlII restrikciós fragmentjéből, majd 20/ul üvegben desztillált vízben oldjuk. Az M13 mp8-ból származó nagy EcoRI-HindlII rstrikciós fragmentből 2/ul-t, 2^ul 10x tömény ligáz puffért, 12/ul vizet és 1/ul ('*>1 Weiss egység) T4 DNS ligázt adunk 3/ul, a pBW25 plazmidból származó rV810bp méretű EcoRI-HindlII restrikciós fragmenthez, és a kapott ligálási reakciót éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk.
E.coli 0M103 sejteket (a BRL-től vásárolható) teszünk kompetenssé és transzformálunk a ligáló eleggyel, lényegében a BRLM13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual-ban leírtak szerint, azzal a különb···· ···· · • · · • · · ··♦· ·· ·
- 123 séggel, hogy a transzfekcióhoz használt DNS mennyisége változó volt. A rekombináns tarfoltokat a β-galaktoridáz ec-fragmentjét kódoló gén inszerciós inaktiválódása alapján azonosítjuk, ami abban nyilvánul meg, hogy a sejteknek megszűnt az X-gal-t hasitó képessége, igy szintelenek maradnak. Screening céljára hat fehér tarfoltot oltunk át 2,5 ml L táptalajba, amihez 0,4 ml E.coli K12 DM103 sejtszuszpenziót adunk, amelyet minimál táptalajon állitunk elő, hogy a törzsek ne veszítsék el a logaritmikus fázisban a proAB-t hordozó F episzómát. A tarfolt tartalmú oldatokat 8 órán át inkubáljuk 37 °C-on levegőztetett rázógépen. 1,5 ml-es aUkvot részekből centrifugálás után RF DNS-t izolálunk, lényegében a lúgos mini-screen éljárásálapján [Bimbóim and Doly, Nuc. Acids Rés, 7, 1513 (1979)].Minden egyes tenyészet maradékát 4 °C-on tároljuk. A kivánt pM8BW26 jelű fág tartalmazza a pBW plazmid 810 bp méretű EcoRI-HindlII restrikciós fragmentjét az M13mp8 fág 7,2 kb EcoRI-HindlII restrikciós fragmentjéhez ligáivá.
Körülbelül ötven ml logfázisu E.coli DM103 sejtet fertőzünk pM8BW26-tal és 18 órán át 37 °C-on inkubáljuk egy levegőztetett rázóberendezésben, A fertőzött sejteket kis-sebességü centrifugálással kiülepitjük, majd egyszálu pM8BW26 plazmid DNS-t izolálunk a tenyészet felüluszójából, az Instruction manual-ban meg·· • · ···· ···· ···· • · • φ « · · ·· · ·· ·· ···
124 adott eljárást felnagyítva. Az egyszálu pM8BW26 fágot mutagenizáljuk lényegében Adelman és munkatársai leírása alapján EDNA, 2 (3), 183-193 (1983)1, azzal a különbséggel, hogy a Klenow reakciót szobahőmérsékleten végezzük 30 percig, majd 37 °C-on 60 percig, utána 10 °C-on 18 órán át. Ezután az S1 nukleázos kezelést 20 °C-on végezzük, a puffer sókoncentrációja fele annak amit az előállító javasol, és az M13 szekvenáló prímért (BRL) használjuk. A szintetikus oligodezoxinukleotid primer, amelynek használatával a natív TPA 87-es és 261-es aminosava közötti részt kivágjuk, a következő összetételű:
'-GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA-3 *.
A kapott mutagenezis keveréket használjuk E.coli K120M103 transzfektálására , lényegében az előbb ismertetett fertőzési eljárás szerint. A kívánt mutánsokat az RF DNS restrikciós enzimes analízisével és Maxam-Gilbert féle szekvenálással azonosítjuk. A kívánt mutánst, amelyből a natív TPA 87-261-es aminosavait kódoló szekvenciát kivágtuk, pM8BW27 jelzéssel látjuk el.
A pBW28 plazmid előállításához számos
DNS fragmentre van szükségünk. Ezek közűi a frageentek közül az elsőt úgy állítjuk elő, hogy körülbelül 20/ug
···· ··· ' ·· φ
125
Ndel restrikciós enzimet adunk a pM8BW27 plazmid DNS. oldatához és a kapott reakció-elegyet két órán át 37 °Con inkubáljuk. Az Ndel restrikciós enzimmel emésztett pM8BW27 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, centrifugáés 90/ul víz elegyében oldjuk. Az Ndel restrikciós enzimmel emésztett pM8BW27 plazmid DNS-hez EcoRI restrikciós enzimet adunk, majd a kapott reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az EcoRI-Ndel restrikciós enzimekkel emésztett pM8BW27 plazmid DNS-t agaróz gélen elektroforetizáljuk, amíg a deléciót tartalmazó TPA kódoló szekvenciát tartalmazó rJ 560 bp méretű Ndel-EcoRI restrikciós fragment el nem válik a többi emésztési terméktől. Az
560 bp méretű Ndel-EcoRI restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből; a kívánt fragmentből kapott körülbelül 0,5 /ug-ot 20/ul üvegkészülékben desztillált vízzel oldjuk.
A pBW28 plazmid előállításához szükséges második fragmentet automata DNS szintetizátorral állítjuk elő, egy-egy láncot megszintetizálva egyszerre.
A két komplementer láncot, amelyek hibridizálva képeznek egy Xbal és Ndel átfedést, a 2. példában leirt eljárás szerint foszforilezzük és illesztjük egymáshoz. A linker ···· ··
126 szerkezete a következő:
Xbal '-CTAGAGGGTATTAATAATGTATCGATTTAAATAAGGAGGAATAACA-3 *
TCCCATAATTATTACATAGCTAAATTTATTCCTCCTTATTGTAT nJöi
A pBW28 plazmid előállításához szükséges harmadik fragmentet úgy állítjuk elő, hogy /v 20^ug pTPAlO3 plazmid 20^ul TE pufferben készült oldatát
10/ul 10x tömény BamHI puffer és öO^ul viz elegyéhez adjuk. Körülbelül W^ul ( <\>50 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a pTPA103 plazmid DNS oldatához és a ka pott reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk.
A BamHI restrikciós enzimmel emésztett pTPA103 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyerjük, majd 1O/ul 10x tömény EcoRI puffer és 80/ul viz elegyében oldjuk. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett pTPAlO3 plazmid DNS oldatához körülbelül lO^ul ( a)50 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk, és a kapott reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. A BamHI-EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett
PTPA103 plazmid DNS-t agaróz-gélra visszük, rajd addig elektroforetizáljuk, amíg a rJ689 bp méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragment, amely a TPA karboxi-terminális •••· ···· ·
127 részét tői. A mentet tartalmazza, elválik a többi emésztési termék gélből körülbelül 0,5 ^ug n)689 bp méretű fragizolálunk, majd lO^ul üvegkészülékben desz tillált vízzel oldjuk.
A pBW28 plazmid előállításához szükséges utolsó fragmentet a pL110 plazmidból izoláljuk, amelynek előállítását a 9, példában írjuk le. Körülbelül 25/ug pLl10 plazmid DNS 25/ul TE pufferben készült oldatát 10/ul 10x tömény Xbal reakció-puffer (0,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7.9; 60 mM MgClg és 1 mg/ml BSA) és 55/ul viz elegyében oldjuk. A pL110 plazmid DNS oldatához körülbelül lO^ul ( ró 50 egység) Xbal restrikciós enzimet adunk és a kapott rsakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az Xbal restrikciós enzimmel emész tett pL110 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyerjük, majd lO^ul és 89/Ul viz elegyében oldjuk, ség) BamHI restrikciós enzimet
10x tömény BamHI puffer Körülbelül 1/UÍ (cd 5 egyadunk az Xbal restrikciós enzimmel emésztett pL110 plazmid DNS-hez, és a kapott reakció-elegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, hogy részleges BamHI emésztést kapjunk. Az Xbal restrikciós enzim mel teljesen(BamHI restrikciós enzimmel részlegesen emésztett pL110 plazmid DNS-t agaróz gélre visszük, és addig elektroforetizáljuk, amig a 6,0 kb méretű Xbal-BamHI
128 fragment tisztán elválik a többi emésztési terméktől.
A(J6,0 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből; a a; 6,0 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós f ragmentből körülbelül 0,5/ug-ot kapunk, ezt 40/ul, üvegkészülékben desztillált vízzel oldjuk. Ez a a26O kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragment az EK-BGH kódoló rész kivételével a teljes pL110 plazmidot tartalmazza.
A pBW28 plazmid előállításához a következő fragmenteket keverjük össze:
körülbelül 0,1 /ug
6,0 kb méretű BamHI-Xbal restrikciós fragment a pL110 plazmidból; körülbelül 0,05/ug ( N2^ul) /v 560 bp méretű Ndel-EcoRI restrikciós fragment a pM8BW27 plazmidból;
körülbelül 0,1/ug (rv2/ul) 689 bp méretű EcoRI-BamHI restrikciós fragment a pTPA103 plazmidból; és körülbelül
0,02/ug (cv1/ul) a aJ 45 bp méretű Xbal-Ndel szintetikus linkerből. Körülbelül 2/ul 10x tömény ligáz puffért és 1/U1 ( aj 1 Weiss egység) T4 DNS ligázt adunk a DNS keverékhez, majd a kapott ligálási reakciót 4 °C-on éjszakán át inkubáljuk. Az összeligált DNS molekula a kivánt pBW28 plazmid. A pBW28 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 10. ábrán mutatjuk be.
A ligáit DNS-t kompetens E.coli K12MM294 (NRRL B-15625) törzs^transzformálására használjuk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint, azzal a különb·· • ···· ···· · ·· · · ·
129 seggel, hogy az eljárás során 50 mM CaClg-t használunk. Mivel a pBIA/28 plazmidon megtalálható a lambda pL promoter és a hőmérséklet-érzékeny lambda pL represszort kódoló gén, a transzformációs eljárás és a transzformánsok tenyésztése némileg eltérő. A transzformáció és az ezt követő tenyésztés során a sejteket nem tesszük ki 32 °c-nál magasabb hőmérsékletnek. A kívánt E.coli K12 MM294/pBW28 transzformánsokat tetraciklin-rezisztens, ampicillin érzékeny fenotipusuk és plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízise alapján azonosítjuk.
D. A pBW32 plazmid előállítása
DNS-t (NRRL B-15928) oldunk 10,ul 10x tömény HindlII reakció-puffér, 5,ul (<^50 egység) HindlII restrikciós ció-elegyet 2 órára 37 °C-ra tesszük. A reakció-elegybe annyi LiCl-ot teszünk, hogy koncentrációja 0,15 M legyen, majd 2,5 térfogat etanol hozzáadása és etanol-szárazjég fürdőben való inkubálás után a DNS-t centrifugálással ülepítjük.
A DNS csapadékot 10,ul 10x tömény BglII reakció-puffér, 5zul ( rv 50 egység) BglII restrikciós
····
- 130 -elegyet két órára 37 °C-ra tesszük. A BglII restrikciós enzimmel végzett emésztés után a reakció-elegyet 0,85 %-os agaróz gélre visszük, és a fragmenteket elektroforézissel szétválasztjuk. A gél-ben lévő DNS-t etidium-bromiddal és ultraibolya fénnyel lát hatóvá tesszük, és a o>4,2 kb méretű HindlII-BglII restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből az előzőekben leírtak szerint.
Körülbelül 5^ug keletkezik a kí vánt n/4,2 kb méretű HindlII-BglII restrikciós frag mentből, ezt lO^ul vízben oldjuk. A TPA-t kódoló ρΤΡΑ1Ο3 plazmid <V2 kb méretű HindlII-BamHI restrikciós fragmentjét izoláljuk, lényegében az előzőek szerint. A pTPAlO2 plazmidból körülbelül 5^ug a) 2 ,0 kb méretű HindlII-BamHI restrikciós fragmentet kapunk, ezt 10/ul vízben oldjuk , majd -20 °C-on tároljuk.
A pSV2-fi-globin plazmid a) 4,2 kb méretű BglII-HindlII restrikciós fragmentjéből 2 ^ul- és a ρΤΡΑ1Ο3 A>2,0 kb méretű HindlII-BamHI fragmentjéből 4/ul-t összekeverünk, majd 2^ul 10x tömény ligáz puffer 11/U1 víz és 1/U1 T4 DNS ligáz ( a>500 egység) elegyében 4 °C-on éjszakán át inkubáljuk. Az összeligált DNS molekula a kívánt ρΤΡΑ3Ο1 plazmid. A ligáit DNS-sel kompetens E.coli K12RR1 sejteket (NRRL B-15210) transzformálunk, lényegében a 3. példában leirt eljárás sze • ·* ·· *··· ···· · • · · · · ···· ··, ·, · J ····
- 131 rint. A plazmid DNS-t kinyerjük az E.coli K12 RR1/ pTPA30i transzformánsokból az 1. példában leirt eljárást alkalmazva. A pT.PA3O1 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 10. ábrán közöljük.
A pSV2-dhfr plazmid tartalmazza a dihidrofolát reduktáz (dhfr) gént, amely alkalmas transzformált eukarióta sejtek transzformálására, valamint a dhfr génhez kovalensen kapcsolt DNS amplifikálására. Tíz mikrogram pSV2-dhfr plazmidot (E.coli K12HB1O1/ pSV2-dhfr, ATCC 37146 törzsből izolálva) elegyítünk 10/ul 10x tömény PvuII pufferrel, 2^ul (<v20 egység) PvuII restrikciós enzimmel valamint 88/ul vízzel és a kapott reakció-elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót fenol és kloroform extrakcióval leállítjuk, majd a PvuII restrikciós enzimmel emésztett pSV2-dhfr plazmid DNS-t kicsapjuk és centrifugálással kinyerjük.
BamHI linkért (5'-CGGATCCCG-3') foszforilezünk és készítünk elő ligáláshoz a következő eljárás szerint. 1/Ug linker 5/ul vizes oldatához a következőket adjuk: 10/ul 5x tömény kináz sóoldat (300 mM Tris-HCl, pH= 7,8; 5 mM MgClg és 25 mM DTT), 5/ul 5 mM ATP, 5^ul BSA (1 mg/ml), 5^ul 10 mM spermidin.
···· ·
• · ····
132 19/U1 víz és 1/ul polinukleotid kinéz (10 egysé-g/^ul). Ezt a reakció-elegyet 60 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd -20 °C-on tároljuk. A PvuII restrikciós enzimmel emésztett pSV2-dhfr plazmidból öt^ul-t ( <v5/ug) és 12/ul ( /V0,25/ug) foszforilezett BamHI linkért összekeverünk, majd 11/ul ( rvlOOO egység) T4 DNS ligáz elegyében éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk.
Tizéül 10x tömény BamHI reakció-puffért
10/ul ( n/50 egység) BamHI restrikciós enzimet és 48/Ul vizet adunk a ligáló elegyhez, amit ezután 3 órán át °C-on inkubálunk. A reakció-elegyet 1 %-os agaróz gélre visszük, majd a kívánt 1,9 kb méretű fragmentet, amely a dhfr gént tartalmazza, izoláljuk a gélből. Az ezekben a példákban végrehajtott összes linker-kapcso lást agaróz gélen rutinszerűen tisztítjuk, hogy csökkent sük a többszörös linker szekvenciák előfordulásának valószínűségét végső vektorban.
mentet
10/Ul TE pufferben oldjuk.
Ezután körülbelül 15/U1 (M1/ug) pTPA plazmid DNS-t BamHI restrikciós enzimmel emésztjük a fentiek szerint. Mivel egyetlen BamHI hasitási hely van a pTPA30l plazmidon, ezért a BamHI restrikciós enzimmel végzett emésztés lineáris ρΤΡΑ3Ο1 plazmid DNS-t eredményez. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett pTPA301 plazmidot
···· ··
- 133 etanollal kicsapjuk és 94^ul vízben szuszpendáljuk, hozzáadunk 5/ul 1M Tris-HCl-t, pH = 9,0; és 1^ul borjubél alkalikus foszfatázzal (Colláborátive Research, Inc., 128 Spring Street, Lexington, MA 02173) foszfatázozzuk 65 °C-on 45 percig, A DNS-t fenol kloroform eleggyel extraháljuk, majd kloroform:izoamil-alkohol eleggyel, etanollal kicsapjuk, majd 20/ul vízben oldjuk. Tizéül (A;0,25/ug) foszfatázozott ρΤΡΑ3Ο1 plazmidot adunk 5/ul ( ^1,5/ug) dhfr gént tartalmazó BamHI restrikciós fragmenthez, 3/ul 10x tömény ligáz pufferhez, 3/ul ( <v1500 egység) T4 DNS ligázhoz és 9/Ul vízhez. Ezt a ligáló elegyet 15 °C-on éjszakán át inkubáljuk; a ligáit DNS a kivánt pTPA303 plazmid DNS.
A pTPA303 plazmiddal E.coli K12RR1 (NRRL B-15210) sejteket transzformálunk, és a kapott E.coli K12 RR1/pTPA303 transzformánsokat ampicillin-rezisztens fenotipusuk és plazmid DNS-ök restrikciós enzimes analízise alapján azonosítjuk, A pTPA303 plazmidot a transzformánsokból lényegében az 1, példában leirt eljárással izoláljuk. A pTPA303 plazmid plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 10, ábrán mutatjuk be.
Hogy a pTPA30l plazmidból izoláljuk azt a 2,7 kb méretű EcoRI-BglII restrikciós fragmentet, amely a pBR322 replikációs origót és a β-laktamáz gént ···· ···' .
• · · • · ·* :.
**»
- 134 kódoló szekvenciát tartalmazza, körülbelül 10/Ug pTPA301 plazmid DNS_t emésztünk 4oO/ul össztérfogatban 20 egység BglII restrikciós enzimmel 1x tömény BglII pufferben 37 °C-on. A BglII restrikciós enzimmel végzett emésztés után a Tris-HCl koncentrációját 110 mM -ra állítjuk, majd a BglII restrikciós enzimmel emésztett DNS-hez 20 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk. Ezt a reakció-elegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az EcoRI-BglII restrikciós enzimmel emésztett DNS-t agaróz gélre visszük, és addig elektroforetizáljuk, amíg a λ)2,7 kb méretű EcoRI-BglII restrikciós fragment elválik a többi emésztési terméktől, majd a/v2,7 kb méretű fragmentet izoláljuk és ligáláshoz előkészítjük.
A dhfr gént tartalmazó restrikciós fragment izolálásához a pTPA303 plazmidot HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük és a aj 2340 bp méretű fragmentet, amely a dhfr gént tartalmazza, izoláljuk és kinyerjük.
Hogy a pTPA303 plazmidból a TPA karboxi-terminális részét és a SV40 promotert tartalmazód kb méretű HindlII és SstI restrikciós fragmentet izoláljuk, a pTPA303 plazmidot egyszerre emésztjük HindlII és SstI restrikciós enzimmel 1x tömény HindlII pufferben. Az Ai1 ,7 kb méretű fragmentet izoláljuk á gélből és ligáláshozjelőkészit jük.
····
135 ··
Hogy a pBW29 plazmidból izoláljuk a módo sított TPA amino-terminális részét kódoló rV 680 bp méretű XhoII (összeligálható a BglII véggel)-SstI mid DNS-t emésztünk XhoII enzimmel 1x tömény XhoII pufferben (0,1 M Tris-HCl, pH = 8.0; 0,1 M MgClg, 0,1 %“ Triton X-100 és 1 mg/ml BSA). Az XhoII restrikciós enzimmel emésztett DNS-t etanollal kicsapjuk, majd SstI enzimmel megemésztjük. Az XhoII-SstI restrikciós enzimekkel emésztett DNS-t akrilamidra visszük ésa kívánt fragmentet izoláljuk a gélből, majd ligáláshoz előkészítjűk.
A fenti fragmentekből: a ρΤΡΑ3Ο1 plazmid
a) 2,7 kb méretű EcoRI-BglII restrikciós fragmentje, a pTPA303 plazmid f7 2,34 kb méretű EcoRI-HindlII restrikciós fragmentje, a pTPA303 plazmid rJ 1 ,7 kb méretű Sstl-HindlII restrikciós fragmentje és a pBW28 ^0,68 kb méretű Sstl-ShoII restrikciós fragmentje, mindegyikből körülbelül 0,1-0,1/ug-ot keverünk össze, majd ezeket összeligálva kapjuk a pBW32 plazmidot. A ligáló elegyet használjuk E.coli K12 MM294 törzstranszformálására a 3. példa szerint, azzal a különbséggel, hogy az eljárásban 50 r..M CaCl2-ot használunk. A transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotipusuk és plazmid DNS-ük analízise alapján azonősítjük. A pBW32 plazmid DNS-t az E.coli K12 MM294/ pBW32 transzformánsokból állítjuk elő, lényegében az
1. példában közölt eljárás szerint, A pBW32 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 10. ábrán közöljük.
136
17, példa
A pLPChdl és pLPChd2 plazmidok előállítása
Körülbelül 20^ug pBW32 plazmid 20^ul TEben készült oldatát 10^ul 10x tömény BamHI pufferhez és 60,ul vízhez adjuk. Körülbelül adonjí—
BamHI restrikciós enzimeXa pBW32 a kapott reakció-elegyet két órán
10/ul ( /V5O egység) plazmid oldatához, és át 37 °C-on inkubáljuk. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett pBVi/32 plazmid DNS-t etanollal kicsapjuk, centrifugálással ki nyerjük, majd 5/ul 10x tömény Klenow puffer, 45/ul víz és 2/ul ( /v1000 egység) Klenow enzim oldatában oldjuk. A reakció-elegyet 30 percig 16 °C-on inkubáljuk, a reak ció-elegyet agaróz gélre visszük, majd addig elektro foretizáljuk, amig az emésztési termékek teljesen szétválnak. A dhfr gént tartalmazó nM ,9 kb méretű, Klenow fragmenttel kezelt BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk a gélből és ligáláshoz előkészítjük a 12A. példában leirt eljárás alapján. A kívánt fragmentből körülbelül
137 ···· ···
( <V50 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk a pLPC hyg1 plazmid DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet körülbelül 10 percig 37 °C-on inkubáljuk. A rövid reakció-idő célja, hogy részleges EcoRI emésztést kapjunk. a pLPChygl plazmidban két EcoRI restrikciós enzim felismerési hely van, az egyik a higromicin rezisztenciát (HmR) kódoló szekvenciában, és az a cél, hogy a dhfr gént tartalmazó restrikciós fragmentet a pLPChygl plazmidnak abba a restrikciós helyébe illesszük be, amely nincs a HmR génben. Az EcoRI enzimmel részlegesen emésztett pLPChygl plazmid DNS-t agaróz gélre visszük, és addig elektroforetizálju k, amig az egyszer hasított pLPChyg 1 plazmid DNS elválik az érintetlen plazmid— tói, valamint a többi emésztési terméktől. A lineáris (egyszer hasított) DNS-t izoláljuk a gélből és ligáláshoz előkészítjük, lényegében a 12A, példában lairt eljárás szerint. Az EcoRI enzimmel egyszeresen hasított pLPChyg 1 plazmidból körülbelül 2/ug-ot izolálunk, majd 25/Ul TE pufferben oldjuk. Ehhez az oldathoz körülbelül
5,ul ( a/25 egység) Klenow enzimet, 5,ul 10x tömény
·· ·♦·· ···· ·
Λ * · ♦··· ·· ···
138 reakció'-elegyet 60 percig inkubáljuk 16 °C-on. A Klenow enzimmel kezelt, EcoRI enzimmel részlegesen emésztett DNS-t kétszer fenaDLal extraháljuk majd egyszer kloformmal, utána etanollal kicsapjuk és 25/ul TE pufferben oldjuk.
A pBW plazmid 1 ,9 kb méretű,Klenow f ragmenttel kezelt BamHl restrikciós fragmentjéből körülbelül
5/Ul-t sitott és az EcoRI restrikciós enzimmel egyszeresen hapLPChygl DNS-ből körülbelül 5/ul-t összekeverünk,
majd a DNS oldathoz 1/ul 10x tömény ligáz puffért, 5^ul
vizet, 1/U1 ( 500 egység) T4 DNS ligázt és 1/ul (zv>2 egy-
ség) T4 RNS ligázt adunk, és a kapott reakció-elegyst éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk. Az összeligált DNS molekulák a pLPChdl és pLPChd2 plazmidok, amelyek csak a
1,9 kb méretű, a dhfr gént tartalmazó fragment orientációjában különböznek.
A ligáit DNS-t használjuk kompoetens E.coli K12HB101 sejtek transzformálására, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint. A transzformált sejteket lOO^ug/ml ampicillint tartalmazó L-agarra szélesztjűk, és az ampicillin rezisztens transzformánsok plazmid DNS-eit vizsgáljuk eestrikciós enzimes analízissel, hogy az E.coli K12HBl0l/pLPChd1 és az E.coli K12HBl0l/pLPChd2 transzformánsokat azonosítsuk. A jelen leírásban a pLPChdl ·”· ·! ···· ···· · • · · · · ···· «·· ·β>· j· ····
139 plazmid a pLPChd jelölést kapta, A pLPChdplac plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 11, ábrán mutatjuk be, A pLPChdl és pLPChd2 plazmid DNS-eket a megfelelő transzformánsokból izoláljuk, lényegében az 1. példában leirt eljárás szerint,
18, példa
A phd plazmid előállítása
A phd plazmid előállításához a kiindulási anyagként szolgáló pLPChdl plazmid DNS-t olyan E.coli gazdasejtből kell izolálni, amelyből hiányzik az adenin me-ti'láz, amit például a dam gén kódol, amelynek a terméke az 5'-GATC-3‘ szekvenciában lévő adenin csoportot metilezi. Az E.coli K12GM48 (NRRL B-15725) törzsben nincs működőképes metiláz, ezért ez megfelelő gazdaszervet a phd plazmid előállításában kiindulási anyagként használt pLPChdl plazmid DNS előállításához.
Az E.coli K12GM48 sejtek tenyésztését és transzformációra kompetenssé tételét, valamint az E.coli K12GM48 sejtek pLPChygl plazmiddal való transzformálását a 3, példában leirt eljárás szerint végezzük. A transzformált sejteket ampicillint tartalmazó L agarra szélesztjűk, és az ampicillin rezisztens E.coli K12GM48/ pLPChdl transzformáns telepek közűi egyet kiválasztunk a
·· **·; ···· · • · -·:.
···· ···
140 pLPChdl plazmid DNS előállításához, az 1. példában leirt eljárás szerint. Körülbelül 1 mg pLPChdl plazmid DNS-t izolálunk, majd körülbelül 1 ml TEpufferben old juk.
Körülbelül 2^ug pLPChdl plazmid DNS
2/Ul TE pufferes oldatát 2^ul 10x tömény Bell puffer (750 mM KC1; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,4; 100 mM MgCl2;
mM DTT és 1 mg/ml BSA) és 14^ul viz elegyéhez adjuk. A pLPChdl plazmid DNS oldatához körülbelül 2^ul ( n)lO egység) Bell restrikciós enzimet adunk, majd a kapott reakció-elegyet két órán át 50 °C-on inkubáljuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet egyszer fenollal, majd kétszer kloroformmal extraháljuk.
A Bell restrikciós enzimmel emésztett pLPChdl plazmid DNS-ből körülbelül l^ul-t adunk 1/ul 10x tömény ligáz puffer, 8/ul viz és 1^ul ( 500 egység)
T4 DNS ligáz elegyébez. A ligáló reakció-elegyet éjszakán át 16 °C-on inkubáljuk, az összeligált DNS molekula a kívánt phd plazmid. A phd plazmid úgy keletkezik, hogy a pLPcat plazmid készítése során bevitt extra Bell linkereket kivágjuk, valamint a pLPChd1-ben lévő két szomszédos Bell restrikciós felismerési hely által határolt a?1 ,45 kb méretű fragmentet. A phd plazmid restrikciós ·· • e
141 és funkcionális térképét a kisérő rajzok között, a
11. ábrán mutatjuk be. A phd plazmid megkönnyíti a je- len szabadalom szerinti Bl< vírus erősítő szekvencia-adenovirus késői promoterről bármely DNS szekvencia expresszióját, mivel az expresszálandó DNS-t könnyen be lehet illeszteni az expresszióhoz megfelelő helyzetben a phd plazmid egyetlen Bell helyére.
A ligáit DNS-t használjuk az E.coli
K.12GM48 törzs transzformálására, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint. A transzformált sejteket ampicillin-tartalmú L agarra szélesztjök, és az ampicillin -rezisztencia E. coli Kl2GM48/phd transzformánsokat plazmidjuk restrikciós enzimes analízise alapján azonosítjuk.
19. példa
A pL-KSL plazmid készítése
A pGKC2310 plazmid KS1/4 rágcsáló monoklonális antitest könnyű láncát kódoló teljes hosszúságú cDNS-t tartalmazza. Az E.coli Kl2MM294/pGKC2310 törzs NRRL B-18356 sorszám alatt hozzáférhető a Northern Régiónál Research Laboratory-nál. A pGKC231O plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a
12. ábrán mutatjuk be. A tenyészetből a plazmid DNS-t
142 ··· ···· lényegében az 1. példában közölt eljárással állíthatjuk elő, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C.
A pGKC231O plazmidból körülbelül 5,ug-ot emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, lényegében a 8. példa szerint, ezután Klenow fragmenttel kezeljük az
5. példában leirt eljárás szerint. Ezután BamHI linkereket (New England Biolabs) adunk a DNS fragmentekhez, lényegében a 2. példában leirt eljárás szerint. A DNS-t végül agaróz gélen elektroforetizáljuk majd tisztítjuk a 12, példában leirt eljárás szerint. A kívánt rj 1 ,1 kb méetü fragmentet etanollal kicsapjuk, majd 5/ul TE-ben oldjuk.
tünk Bell restrikciós enzimmel, lényegében a 18. példában leirt eljárás szerint, majd a 12. példában leirt eljárás szerint elektroforetizáljuk és tisztítjuk.
A pGKC23lO plazmid EcoRI restrikciós enzimmel anésztett, Klenow fragmenttel kezelt, linkerrel módosított a) 1,1 kb méretű DNS fragmentet a Bell restrikciós enzimmel kezelt phd plazmidba ligáljuk, lényegében a 2. példa szerinti eljárás alapján. Ezzel a ligáló eleggyel E.coli sejteket transzformálunk lényegében a 3. példában szereplő eljárással, A plazmidot ezután az 1. példában szeieplő eljárás szerint izoláljuk a sejtekből, majd a
143 helyes orientációjú plazmidnak a pL-KSL jelölés adjuk.
20. példa
A pH-KS plazmid előállítása
A pG2A52 plazmid a KS1/4 rágcsáló monoklonális antitest nehéz láncát kódoló teljes hosszúságú cDNS-t tartalmaz. Az E.coli Kl2MM294/pG2A52 törzset
NRRL B-18357 sorszám alatt a Northern Research Laboratory-tól lehet beszerezni. A pG2A52 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között, a 12. ábrán mutatjuk be. A plazmid DNS-t a tenyészetből lényegében az 1. példában közölt eljárással izoláljuk, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C.
Körülbelül 5^ug pG2A52 plazmid DNS-t emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel lényegében a 8. példában közölt eljárással, majd Klenow enzimmel kezeljük, az 5.
példában közölt eljárás alapján. Ezután BamHI linkere ket (New England Biolabs) adunk a DNS fragmenthez, a
2. példában közölt eljárás alapján. A DNS-t végül agaróz gélen elektroforetizáljuk, majd a 12, példában közölt eljárás szerint tisztítjuk. A kívánt 1 ,6 kb méretű fragmentet etandLal kicsapjuk oldjuk.
majd
5/Ul TE pufferben
Körülbelül 1/Ug phd
Bell restrikciós enzimmel a 18.
plazmidot emésztünk példában közölt eljárás _ - · e · · ···· ·:· ·..· ·* :.:.
.
- 144 szerint, majd a 12. példában közölt eljárás szerint elektroforetizáljuk és tisztítjuk. A pG2A52 plazmid rJ 1 ,6 kb mérető, EcoRI restrikciós enzimmel emésztett,
Klenow enzimmel kezelt, linkerrel módosított DNS fragmentjét ezután Bell restrikciós enzimmel emésztett phd plazmidba ligáljuk, lényegében a 2, példában közölt eljárás szerint. A ligáló elegyet ezután E.coli sejtekbe transzformáljuk, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint. A plazmidot ezután az 1. példában közölt eljárással izoláljuk a sejtekből és a megfelelő orientációval rendelkező plazmidnak a pH-KS jelölést adjuk.
21. példa
A pL~HD plazmid előállítása
A pCHKC2-18 plazmid egy humán könnyű lánc konstans régióját kódoló genomiális DNS fragmenthez kapcsolva tartalmazza a KS1/4 rágcsáló monoklonális antitest könnyű láncának variábilis régióját kódoló cDNS fragmentet. A pCHKC2-18 plazmid által kódolt variábilis régió egyetlen aminosav eltérést tartalmaz a természetben előforduló KS1/4 monoklonális antitest variábilis régiójához képest. A vad-tipusu variábilis régióban a karboxi-terminális aminosav egy arginincsoport, mig a pCHKC2-18 plazmid által kódolt fehérjében ez a csoport •· • · ···♦
145 egy glicin csoport. Az E.coli K12DH5/pCHKC2-18 törzs
NRRL B-18359 sorszám alatt hozzáférhető a Northern Ré giónál Research Laboratory-nál. A pCHI<C2-18 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 13, ábrán közöljük. A plazmid DNS-t lényegében az 1. példában leirt eljárással izoláljuk a tenyészetből, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C.
Körülbelül 5^ug pCHKC2-18 plazmidot emésztünk lényegében a 8. példában leirt szerint, azzal a különbséggel, hogy FnuDII restrikciós enzimet és 10x tömény FnuDII reakció-puffert (60 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl (pH 7,4) és 60 mM MgCl2) használunk. A DNS-t ezután Hindii! restrikciós enzim és !0x tömény HindlII reak ció-puffer (500 mM NaCl, 500 mM Tris-HCl (pH 8,0) és
100 mM MgCl2) felhasználásával emésztjük, majd a <v 1,3 kb méretű FnuDII-HindlII fragmentet izoláljuk, agaróz gélből, lényegében a 12, példában leirt eljárás szerint. Etanolos kicsapás, majd feloldás után az 5* túlnyúló végét a HindlII helynek Klenow fragmentet használva feltöltjük, lényegében az 5. példában közölt eljárás szerint.
Kő rűlbelűl
0,5/Ug
Bell restrikciós enzimmel kezelt phd plazmidot (izolálása a 20. példa szerint)
46 szintén Klenow fragmenttel kezeljük, az 5. példában közölt eljárás szerint. A pCHK22-18 plazmid ,3 kb méretű FnuDII-HindlII restrikciós enzimekkel hasított, feltöltött végű fragmentjét a phd plazmid Bell restrikciós enzimmel hasított, feltöltött végű vektor-fragmentjébe ligáljuk, lényegében a 2, példában leirt eljárás szerint. Ezzel a ligáló eleggyel transzformálunk E.coli sejteket, lényegében a 3. példában leirt eljárás szerint, A plazmidot ezután az 1. példában leirt eljárással izoláljuk a sejtekből, és ahelyes orientációjú plazmidot (bizonyítéka a a) 840 bp méretű Maell-Stul fragmant) pL-HD jelzéssel látjuk el.
22. példa
A pL-HD2 plazmid előállítása
A pCHKC2-6 plazmid a KS1/4 monoklonális antitest könnyű láncának variábilis régióját kódoló DNS fragmentet tartalmaz egy humán könnyű lánc konstans régióját kódoló genomiális DNS fragmenthez kapcsolva. A pCHKC2-6 plazmid által kódolt variábilis régió aminosav-sorrendja megegyezik a természetes KS1/4 monoklonális antitest aminosav-sorrendjével. Azonban a pCHKC2-6 plazmid DNS-ben a karboxi-terminális arginint egy CGT triplett kódolja, mig a természetes szekvenciában ezen
- 147 .
a helyen CGG kodon van. Az E.coli K12DH5/pCHKC2-6 törzs NRRL-B-18358 sorszám alatt hozzáférhető a Northern Régiónál Research Laboratory-nál. A pCHKC2-6 plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között a 13. ábrán mutatjuk be.
A tenyészetből a plazmid DNS-t az 1. példában közölt eljárással vonjuk ki, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C. A pCHKC2-6 plazmidot ezután FnuDII és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, Klenow fragmenttel kezeljük, majd Bell restrikciós enzim mel emésztett feltöltött phd plazmidba ligáljuk, lényegében a 21. példában közölt eljárás szerint. A kapott plazmidot ezután E,coli-ba transzformáljuk, onnan kivonjuk és térképezzük, lényegében a 21. példában közölt leírás alapján. A megfelelő 840 bp méretű Maell-Stul fragmentet tartalmazó plazmid jele pL-HD2.
23. példa
A pH1-HD plazmid előállítása
A pCH2A5 plazmid KS1/4 rágcsáló monoklonális antitest nehéz láncának variábilis régióját kódoló cDNS fragmentet tartalmaz, humán immunoglobulin IgG1 nehéz láncának konstans régióját kódoló genomiális DNS fragmenthez kapcsolva. Az E.coli K12MM294/pCH2A5 törzset NRRL B-18360 • · · ·
14θ sorszám alatt szerezhetjük be a Northern Régiónál Research Laboratory-tól, A pCH2A5 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között, a 14, ábrán mutatjuk be, A tenyészetből a plazmid DNS-t az 1, példában leirt eljárás szerint izoláljuk, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C,
Körülbelül 1O^ug pCH2A5 plazmid DNS_t emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, lényegében az 5, példában leirt eljárás alapján, A DNS-t Klenow fragmenttel kezeljük és BamHI linkért (New England Biolabs) adunk hozzá, lényegében a 2, példában leirt eljárás szerint, majd a DNS-t BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, lényegében az 5, példában leirt eljárás szerint, A rj7,4 kb méretű BamHI-EcoRi/BamHI restrikciós fragmentet ez után agaróz gélből izoláljuk, a 12, példában leirt eljárás szerint. Ezt a fragmentet ezután a Bell restrikciós enzimmel emésztett phd vektorba (20, példa) ligáljukz lényegében a 2, példában közölt eljárá s szerint, A DNStezután E.coli-ba transzformáljuk, visszaizoláljuk és a megfelelő orientációval rendelkező plazmidot (ennek bizonyítéka a n; 780 bp méretű MaelII-StuI restrik ciós fragment) pH1-HD jelzéssel látjuk el.
149
24. példa
A pH2-HD plazmid előállítása
A pCH2A5IG2 plazmid egy rágcsáló KS1/4 monoklonális antitest nehéz láncának variábilis régióját kódoló DNS-t tartalmaz, a humán IgG2 immunoglobulin nehéz láncának konstans régióját kódoló genomiális DNS fragmenthez kapcsolva. Az E.coli K12DH5/pCH2A5IG2 törzs NRRL B-18361 sorszám alatt hozzáférhető a Northern Régiónál Research Laboratory-nál. A pCH2A5IG2 pőLazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 14. ábrán mutatjuk be, A tenyészetből a plazmid DNS-t az 1. példában leirt eljárással vonjuk ki, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C.
Körülbelül lO^ug pCH2A5IG2 plazmid DNS-t emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, lényegében az
5. példában leirt eljárás szerint. A DNS-t Klenow enzimmel kezeljük, és BamHI linkért (New England Biolabs) adunk hozzá, lényegében a 2. példában leirt eljárás szerint és a DNS_t BamHI restrikciós enzimmel kezeljük az 5. példában leirt eljárás szerint. A<v6,1 kb méretű BamHI-EcoRI/BamHI restrikciós fragmentet ezután izoláljuk agaróz gélből, a 12. példában közölt leírás szerint, /
Ezt a fragmentet ligáljuk Bell restrikciós enzimmel emésztett phd vektorba (20. példa) , a 2. példában közölt el-
150 járás szerint. A DNS-t ezután E.coli-ba transzformáljuk, visszaizoláljuk, majd a megfelelő orientációjú plazmidot (ennek bizonyítéka egy 780 bp méretű MaelII-Stul fragment) pH2-HD jelzéssel látjuk el.
25. példa
A pH3-HD plazmid előállítása
A pCH2A5IG3 plazmid a KS1/4 rágcsáló monoklonálös antitest nehéz láncának variábilis régióját kódoló cDNS fragmentet tartalmaz, humán IgG1 immunoglobulin nehéz láncának konstans régióját kódoló genomiális DNS fragmenthez kapcsolva. Az E.coli Kl2DH5/pCH2AIG3 törzs NRRL B-18362 sorszám alatt hozzáférhető a Northern Régiónál Research Laboratories-nél. A pCH2A5IG3 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között, a 15. ábrán mutatjuk be, A plazmid DNS-t- az 1. példában leirt eljárás alapján izoláljuk a tenyészetből azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37°C .
Körülbelül lO^ug pCH2A5IG3 plazmid DNS-t emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel az 5. példában leirt eljárá szerint. A DNS-t Klenow fragmenttel kezeljük és BamHI linkért (New England Biolabs) adunk hozzá, a 2, példában leirt eljárás szerint, és a DNS-t BamHI restrikciós enzimmel emésztjük az 5. példában leirt eljárás szerint. A rJ7,4 kb méretű BamHI-EcoRI/BamHI restrikciós
- 151 fragmentet agaróz gélből izoláljuk a 12. példában leirt eljárás szerint. Ezt a fragmentet ezután Bell restrikciós enzimmel emésztett phd vektorba (20, példa) ligáljuk, a 2. példában leirt eljárás szerint.
A DNS-t ezután E.coli-ba transzformáljuk, visszaizoláljuk, majd a helyes orientációjú plazmidot (ennek bizonyítéka a λ>780 bp méretű MaelII-StuI restrikciós fragment) pH3-HD jelzéssel látjuk el.
26. példa
A pH4-HD plazmid előállítása
A pCH2A5IG4 plazmid a KS1/4 rágcsáló monoklonális antitest nehéz láncának variábilis régióját kódoló cDNS fragmentet tartalmaz a humán IgG4 immunoglobulin nehéz láncának konstans régióját kódoló genomiális DNS fragmenthez kapcsolva. Az E.coli K12DH5/pCH2A5IG4 törzs NRRL B-18363 sorszám alatt beszerezhető a Northern Régiónál Research Laboratories-nál. A pCH2A5IG4 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 15. ábrán mutatjuk he.
A plazmid DNS-t az 1. péld sn leirt eljárás alapján izoláljuk a tenyészetből, azzal a különbséggel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C.
·· • ·
52
Körülbelül
10/Ug pCH2A5IG4 plazmid DNS-t emésztünk az 5. példában közölt eljárás szerint. A
DNS-t Klenow fragmenttel kezeljük és BamHI linkért (New England Biolabs) adunk hozzá a 2. példában leirt eljárás szerint és a DNS-t BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, az 5. példában leirt eljárás szerint. A
Ό6.1 kb méretű BamHI-EcoRI/BamHI restrikciós frag mentet agaróz gélből izoláljuk a 12. példában leirt eljárás szerint. Ezt a fragmentet Bell restrikciós enzimmel emésztett phd vektorba (20. példa) ligáljuk, a 2, példában leirt eljárás szerint. A DNS-t ezután E.coli-ba transzformáljuk, visszaizoláljuk a plazmidot és a helyes orientációjú plazmid (ennek bizonyítéka a oj 780 bp méretű Maelll-Stul fragment) pH4-HD jelzéssel látjuk el.
27. példa
Expressziós vektorokkal transzformált eukarióta qazdasejt előállítása
A jelen találmány szerinti expressziós vektorok tartalmazzák az 1987. december 4-én benyújtott 07/129,028 sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli, Attornex Codket X-6606A szabadalmi leírásban közölt BK erősítő szekvenciát, amely szabadalom eredményeire referenciaként hivatkozunk. A BK erősítő szekvencia stimulálja a • ·
- 153 gén-expressziót a E1A géntermék jelenlétében. Mivel a 293 sejt konstitutivan expresszálja az E1A génterméket(a 293 sejt hatékony gazdája a jelen találmány szerinti expressziós vektoroknak. A 193 sejtek 5-ös tipusu adenovirussal transzformált humán embrionális vesesejtek (megjegyezzük, hogy bármely tipusu adenovirus használható az E1A géntermék szolgáltatására), és CRL1573 sorszám alatt hozzáférhetők az ATCC-nél. A jelen találmány szerinti expressziós vektorok sok különböző sejtben funkcionálnak, d<kor is, ha az E1A géntermék nincs jelen. Az E1A gén-terméket be lehet még juttatni az ElA-t nem termelő sejtekbe az E1A gént tartalmazó vektorral való transzformációval, mechanikusan tördelt adenovirus DNS-sel való transzformációval, vagy adenovirus fertőzéssel.
Az alább közölt transzformációs eljárás a 293 sejtekre vonatkozik, mint gazda-sejtvonalra; az eljárás azonban általánosan alkalmzható a legtöbb sejtvonalra. A 293. sejtek CRL 1573 sorszám alatt hozzáférhetők az χ
ATCC«nél 25 mm -es palackban, amely körülbelül 5,5 x
1O6 sejt egybefüggő egysejtrétegét tartalmazza Eagle’s Minimum Essential Medium-ban, amelyet 10 % hővel inaktivált lószérum egészíti ki. A palackot 37 °C-on inkubáljuk, a tápközeget hetente kétszer cseréljük. A sejteket a tápközeg eltávolításával átoltjuk, mossuk
154
Hank's Balanced Salts oldattal (Gibco), 0,25 % tripszint adunk hozzá 1-2 percre, uj tápközeggel öblítjük, leszívjuk, majd uj palackokba tesszük át 1:5 vagy 1:10 átoltási arányban,
A transzformálás előtt egy nappal a sejteket
0,7 χ 106 sejt/lemez mennyiségben átoltjuk, A tápközeget transzformálás előtt négy óránként cseréljük, TE pufferben oldott steril, etanollal kicsapott plazmid DNS_t használunk 2x tömény DNS-CaCl2 oldat előállítására, amely 40/ug/ml DNS„t és 250 mM CaCl2-t tartalmaz, 2x tömény
HBS-t készítünk, amely 280 mM NaCl, 50 mM Hepes és 1,5 mM nátrium-foszfát összetételű, pH = 7,05-7,15. A 2x tömény DNS-CaCl2 oldatot cseppenként adjuk azonos térfogatú steril 2x HBS-hez. Egy 1 ml-es, gyapot-dugós steril műanyag pipettát teszünk a 2x tömény HBS-t tartalmazó keverő-csőbe, és a csövön átfujva buborékokat bocsátunk át az oldaton, miközben DNS-t adunk hozzá. A kalciumfoszfát-DNS csapadékot keverés nélkül hagyjuk kialakulni szobahőmérsékleten 30-45 perc alatt.
A csapadékot ezután a műanyag pipettával óvatosan pipettázva összekeverjük, majd lemezenként egy ml csapadékot adunk közvetlenül 10 ml, a befogadó sejteket fedő növesztő táptalajhoz. Négy órán át 37 °C-on inkubálva a tápközeget 10 % borjumagzat szérummal kiegészített DMEM táptalajjal helyettesítjük, és a sej teket további 72 órán át hagyjuk inkubálódni a szelekciós nyomás alkalmazása előtt.
155
Azoknál a plazmidoknál, amelyek nem tartalmaznak eukarióta sejtekben működő szelekciós markereket, a transzformációs eljárás során plazmid-keveréket használunk: egy expressziós vektort, amelyből hiányzik a szelekciós markor; és egy olyan expressziós vektort, amely eukarióta sejtekben működő szelekciós markert tartalmaz. Ez a ko-transzformációs technika lehetővé teszi azoknak a sejteknek az azonosítás t, amelyek mindkét transzformáló plazmidot tartalmazzák,
A higromicin rezisztenciát kódoló gént tartal-r mazó plazmiddal transzfektált sejtek esetén higromicint
rációban, A sejteket azután 37 °C-on 2-4 hétig inkubáljuk, 3-4 naponként cserélve a tápközeget, A kapott hígromicin-rezisztens telepeket kűlön-külön palackokba visszük át, jellemzés céljából, A neomicin (G 418 is használható neothicin helyett) rezisztens telepek szelek cióját a higromicin-rezisztens sejtek szelekciójára leirt eljárás szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy neomicint használunk 400/ug/ml végkoncentrációban és nem higromicint. A 293 sejtek dhfr pozitívak, igy a 293 transzformánsokat, amelyek a dhfr gént tartalmazó plazmidokat hordozzák, nem szelektálhatjuk közvetlenül a dhfr pozitív fenotipus alapján, ami a sejteknek azt • ··
- 156 a képességét jelenti, hogy képesek hipoxantint és timint nem tartalmazó táptalajon nőni. Azokat a sejtvonalakat, amelyekből hiányzik a működőképes dhfr gén és dhfr tartalmú plazmiddal vannak transzformálva, a dhfr+fenotipus alapján szelektálhatjuk,
A dihidrofolát-reduktáz (dhfr) génnek szelekciós markerként való alkalmazása dhfr-deficiens sejtvonalba gén vagy plazmid bejuttatásakor, valamint a metotrixát ezt követő alkalmazása a plazmid kópia-számának amplifikálására, jól ismert a szakirodalomban. Habár a dhfr szelektálható és ampilifiká-1ható markerként való alkalmazását a dhfr-termelő sejtekben nem tanulmányozták alaposan, a szakirodalomban fellelhető bizonyítékok azt sugallják, hogy a dhfr gén használható szelekciós markerként dhfr-termelő sejtekben valamint gén- amplifikálásra, A jelen találmány alkalmazását nem korlátozza a használt szelekciós marker. Sőt, amplifikálható markerek, úgymint a metallotionein gének, adenozin-dezamináz gének, vagy a multigén rezisztens család tagjai, példa rá a P-glikoprotein is használható. A 293 sejteknél előnyösen azzal a vektorral transzformálunk, amely szelekciós markert tartalmaz, például a higromicin B rezisztencia gént, majd metotrexátot alkalmazva amplifikálunk, amit ····
- 157 nem használhatunk rágcsáló dhfr-tartalmú plazmidok szelekciójára 293 sejtekben.
Az AV12 sejtvonalat (ATCC CRL 9595) a 293 sejtek transzformálására leirt eljárás alapján transzformáljuk. Az AV12 sejtek konstitutivan kifejezik az E1A génterméket, igy előnyös gazdaszervezetei a jelen találmány szerinti eukarióta expressziós vektoroknak. Azonban a 293 sejtektől eltérően, az AV12 sejteket közvetlenül szelektálhatjuk metótrexáttal (200-500 mM) rágcsáló dhfr gént tartalmazó vektorral való transzformálás után. Egy nehéz lánc expressziójához az AV12 sejteket bármely, nehéz láncot kódoló expressziós vektorral kell transzformálni. Azonban a nehéz lánc nem választódik ki a felüluszóba, ha az AV12 sejtek nincsenek ko-transzformálva egy könnyű láncot kódoló vektorral. A könnyű láncok kiválasztódnak a gazdasejtekből könnyű láncot kódoló vektorral való transzformálás után. Ilymódon a könnyű és nehéz láncok különböző kombinációit expresszáljuk az AV12 sejtek ko-transzformációjával és szelekciójával. Egy komplett szerkezetű, kiválasztott immunoglobulinra való vizsgálathoz kiválasztott nehéz lánc jelenlétét kell vizsgálni.
158
28. példa
Immunoglobulin termelés vizsgálata
A 27. példában előállított metotrexát rezisztens transzformánsokat 100 mm-es szövattenyésztő csészében növesztjük, néhány száz sejtklón/szövettenyésztő csésze, sűrűségben, A tápközeget leöntjük, majd a sejteket kétszer leöblítjük 5-5 ml Hank's Balanced Salt oldattal (Gibco). 0,45 %-os steril agar oldatát (Sigma Type 4 agaróz, katalógus-szám // A3643, Sigma Chemical Co. , P. 0. Box 14508, St. Lous , M053178) úgy készítjük el, hogy 1 ml 1,8 %-os agart (47 °C) 3 ml Dulbeccós Modified Eagle's (DME) Salts (Gibco) oldattal keverünk össze, majd ebből a 0,45 %-os agar oldatból 2 ml-t rétegzünk a sejtekre.
Nitrocellulóz szűrőket (Schleicher and Schuell, Inc., Keene, NH 03431) forralunk, majd 2 órán autokláv, ózzuk, hogy a sejtekre toxikus nedvesítő anyagot eltávolitsuk. A szűrőket ezután az agar-rétegre helyezzük. A légbuborékokat eltávolítjuk, és a lemezeket 1-3 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A szűrőket, amelyeket a telepek későbbi azonosítása céljából, a lemezen való eredeti elhelyezkedés jelölése céljából megjelöltünk, eltávolítjuk és PBS-be helyezzük (50 mM Tris-HCl, pH= 7,2; és 150 mM NaCl).
I
159
Hogy a sejteket életben tartsuk a csészében miközben a szűrőket analizáljuk, a sejteket 8 ml következő összetételű eleggyel rétegezzűk le: 2 ml 1,8 %-os agar (47 °C), 2 ml DME sók (37 °C)és 4 ml, 20 % borjumagzat szérumot tartalmazó DME sók (37 °C). A sejteket ezután 37 °C-on inkubátorba helyezzük,
A szűrőkön minden mosást és reakciót úgy végzünk, hogy a szűrők rázó-asztalon vannak, A szűrőket először blokkoljuk, szobahőmérsékleten inkubálva 5 % tejet tartalmazó PBS-ben, A szűrőket ezután négyszer öblítjük PBS-sel (5 perc/öblües), 10/ul/ml koncentrációjú biotinilezett kecske anti-humán nehézlánc (Vector Laboratories, Inc,, 30 Ingold Rd. , Burlingame, CA 94010) poliklonális antitest 2,5 %-os szarvasmarha szérum albuminban lévő oldatából annyit adunk a szűrőhöz, hogy elborítsa azt,majd 1 órán át 37 °Con inkubáljuk.
Poliklonális antitestet azzal az eljárással állíthatunk elő, melyet E,A, Kábát közöl a Structural Com.cepts in Immunology and Immunochemistry című könybsn (kiadó Holt Rhinehart and Winston, 1968). Monoklonális antitestet, amely szintén használható a vizsgálatban a következő irodalmi hivatkozások szerint állíthatunk elő. Kohler and Milstein, Natúré, 256, 495 (1975);
····
160
696 895 sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás EPO Pub, No. 205046? Laurell et al, , FEBS, 191 (1 ), 75 (1985); Suzuki et al,, □. Biochem, , 97 , 127-138; és EPO Pub. No. 138222. Az ebben a vizsgálatban használt avidin D és biotilezett tormaperoxidáz (HRP) a Vectastatin kit-ből származik (Vector Laboratories, Inc.) A biotin is a Vector Laboratories, Inc, ,-töl származik,
A szűrőket négyszer mossuk 4 °C-on PBS-sel, Ezután avidin D-t és biotinilezett tormaperoxidázt készítünk és a Vectostatin kit-ben (Vector Laboratories) talált használati utasítás szerint a szűrőkhöz adjuk, A szűrőket ezután HRP-konjugált avidin D-vel inkubáljuk 1 órán át 4 °C-on (hosszabb inkubálási idő használható, például éjszakán át, ha kismennyiségű fehérje szekretálódik); a szűrőket ezután négyszer mossuk PBS-sel 4 °C-on,
A szűrőkön lévő indikátor szin előhívásához körülbelül 30 mg HRP színhívó reagens (4-klór-1-naftol, Sigma) jéghideg abszolút metanolban oldott oldatát adjuk 50 ml PBS-hez és 30/ul 30 %-os HgOg-höz. Ezt az elegyet a nitrocellulóz szűrőkhöz adjuk, amelyeket szobahőmérsékleten addig inkubálunk, amig a szin meg nem jelenik. A találmány szerinti antitestből a legtöbbet kiválasztó telepeket megjelöljük a szűrőkön, nemcsak azon • ·
- 161 az alapon,hogy melyiknél jelenik meg leghamarabb a szin, hanem a filteren lévő sötétebb foltok alapján.
Miután a szűrőket előhívtuk a szűrőket az eredeti lemezekkel egyeztetve meghatározzuk, hogy melyik telephez melyik folt tartozik a szűrőn. A legtöbb antitestet szekretáló telepeket kiválasztjuk, és az antitest előállítására használjuk.
A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a fenti vizsgálati módszer csak illusztrátiv jelleggel mutatja be az erősen szekretáló sejtvonalak kiválasztási módszerét. Az eljárás során különböző vizsgálati módszereket használhatunk sikerrel. Például dupla-antitest reakciót használhatunk, amelyben a biotinilezett kecske anti humán nehéz-lánc antitestet kecske anti-humán nehéz-lánccal (IgG) és biotinilezett anti-kecske IgG antitesttel helyettesítjük.

Claims (2)

1. Eljárás KSA megkötésére képes antitest láncok expressziójára transzformált vagy transzfektált sejtekkel, azzal jellemezve , hogy
a) a következő aminosav-szekvenciával rendelkező könnyű láncot kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő:
Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Alá Asp Alá Alá Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gin Leu· Thr Ser Gly Gly Alá Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Alá Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
c)
b) az emésztett vektort emlős gazdasejtbe transzfektáljuk vagy transzformáljuk, és az említett gazdasejtet az említett könnyű láncú gén expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
- 163 -
2, Eljárás KSA megkötésére képss antitest láncok expressziójára transzformált vagy transzfektált sejtekkel, azzal jellemezve, hogy
a) a következő aminosav-szekvenciával rendelkező nehéz láncot kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő;
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Alá Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Alá Phe Ser Leu Glu Thr Ser Alá Ser Thr Alá Phe Leu Gin Ile Gin Gin Pro Gin Asn Met Arg Thr Met Alá Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp .Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Alá Lys Thr Thr Alá Pro Ser Val Tyr Pro Leu Alá Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val. Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gin Ser Ile Thr Cys Asn Val Alá His Pro Alá Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Alá Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gin Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Alá Gin Thr Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Alá Leu Pro Ile Gin His Gin Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Alá Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
164
Val Arg Alá Pro Gin Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp He Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
b) az említett vektort emlős gazdasejtbe transzformáljuk vagy transzfektáljuk és
c) az említett gazdasejtet az említett nehéz lánc expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
3. Eljárás KSA megkötésére alkalmas antitest lánc-származékok expressziójára transzformált vagy transzfektalt sejtekkel, azzal jellemezve, hogy
a) az 1. igénypont szerinti aminosav szek- venciát kódoló DNS molekula mutációjával keletkező könnyü-lánc származékot kódoló gént tartalmazó rekombinánc DNS vektort állítunk elő,
b) az említett vektort emlős gazdasejtbe transzfektáljuk vagy transzformáljuk,
c) az említett gazdasejtet az említett könnyű -lánc származék expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
··
- 165 -
4, Eljárás KSA megkötésére alkalmas antitest lánc-származékok expressziójára transzformált vagy transzfektált sejtekkel, azzal jellemezve, hogy
a) a 2. igénypont szerinti aminosav szekvenciát kódoló DNS molekula mutációjával keletkező nehéz-lánc származékot kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő,
b) az említett vektort emlős gazdasejtbe transzferáljuk vagy transzformáljuk,
c) az említett gazdasejtet az említett nehézlánc származék expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
5. Eljárás KSA megkötésére képes variábilis régiókat tartalmazó kiméra antitest láncok expressziójára transzfektált vagy transzformált fejtekkel, azzal jellemezve, hogy
a) a kö Vet kező arc linó sav -SZ! 3 kve inci áva 1 rendelkező könn yü- lánc vs ι riá bil is régiót kód' oló gént tart alm azó rekomb iná ns i DNS vek :tor t állítunk elő: Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
• ··· ·
166
b) az említett vektort emlős gazdasejtbe tansz- fektáljuk vagy transzformáljuk és
c) az említett gazdasejtet az említett könnyü-
-lánc gén expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a rekombinánc DNS vektor a 21. példában leirt pL-HD plazmid.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzfektált vagy transzformált sejt egy AV12 sejt.
8. Eljárás KSA megkötésére alkalmas variábilis régiókat tartalmazó kiméra antitest láncok expressziójára transzfektált vagy transzformált sejtekkel, azzal jellemezve, hogy
a) a következő aminosav szekvenciával rendelkező könnyű lánc variábilis régiót kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő.
Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu AI4 Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
···· ···· ···· ·
167 az említett vektort transzferáljuk vagy transzformáljuk egy emlős gazdasejtbe és az említett gazdasejtet az említett könnyű -lánc gén expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
9. Eljárás KSA megkötésére’.alkalmas variábilis régiókat tartalmazó kiméra antitest láncok expressziójára transzfektált vagy transzformált sejtekkel, azzal
jellemezve , hogy - θ) a következő aminosav szekvenciával rendelkező: nehéz-lánc variábilis régiót kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk
előf
Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Alá Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Alá Phe Ser Leu Glu Thr Ser Alá Ser Thr Alá Phe Leu Gin Ile Gin Gin Pro Gin Asn Met Arg Thr Met Alá Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
b)
c) az említett vektortemlős gazdasejtbe transzferáljuk vagy transzformáljuk, és az említett gazdasejtet az említett nehéz-lánc gén expressziójára alkalmas körülmények ··
- 168 között tenyésztjük,
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS vektor a 23, példában leirt pH1-HD plazmid, a 24, példában leirt pH2-HD plazmid, a 25. példában leirt pH3-HD plazmid, vagy a
26, példában leirt pH4-HD plazmid,
11. A 10, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzfektált vagy transzformált sejt egy AV12 sej t.
12. Eljárás KSA megkötésére képes variábilis régiókat tartalmazó kiméra antitestek expressziójára transzfektált vagy transzformált sejtekkel, azzal jellemezve , hogy
a) a következő aminosav-szekvenciával rendelkező könnyű lánc variábilis régiót kódoló gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő:
Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser -Val Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
169
b) , a következő aminosav-szekvenciával rendel- kező nehéz lánc variábilis régiót kódoló rekombináns DNS vektort állítunk elő:
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Alá Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Alá Phe Ser Leu Glu Thr Ser Alá Ser Thr Alá Phe Leu Gin Ile Gin Gin Pro Gin Asn Met Arg Thr Met Alá Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
vagy
c) az említett könnyű lánc variábilis régiót kódoló gént és az említett nehéz lánc variábilis régiót kódoló gánt tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő, és
V
d) az említett a) és b) vektorokat, illetve az említett c) vektort emlős gazdasejtbe transzformáljuk vagy transzferáljuk, és
e) az említett gazdasejtet az említett variábilis régiókat kódoló gének expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük.
13. Eljárás KSA megkötésére képes variábilis régiókat tartalmazó kiméra antitestek expressziójára transzfektált vagy transzformált sejtekben, azzal jellemezve, • · a következő aminosav-szekvenciával rendelkező könnyű lánc variábilis régiót kódoló
170 -
gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk •t ·* elő: Gin Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ile Met Ser Alá Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Alá Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Phe Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu Alá Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
Ile Lys Gly és
b) a következő aminosav-szekvenciával rendelkező· nehéz lánc variábilis regiót kodolo gént tartalmazó rekombináns DNS vektort állítunk elő:
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly. Glu Pro Thr Tyr Alá Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Alá Phe Ser Leu Glu Thr Ser Alá Ser Thr Alá Phe Leu Gin Ile Gin Gin Pro Gin Asn Met Arg Thr Met Alá Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile Ser Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
vagy
c) az említett könnyű lánc variábilis régióját kódoló gént és az említett nehéz lánc variábilis régiót kódoló gént tartalmazó rekombi- • · ···· náns DNS vektort állítunk elő, és
- 171 -
d) az említett a) ésb) vektorokkal illetve az említett c) vektorral emlős gazdasejtet transzformálunk vagy transzfektálunk, és
e) az említett gazdasejtet az említett variá- bilis régiókat tartalmazó gén expresszióját lehetővé tevő körülmények között expreszszáljuk.
1 14« A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) plazmid a pL-HD plazmid és a b) plazmid a pHl-HD plazmid.
15. A 13.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) plazmid a pL-HD plazmid és a b) plazmid a pH2-HD plazmid.
16. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) plazmid a pL-HD plazmid, és a b) plazmid a pH3-HD plazmid.
17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) plazmid a pL-HD plazmid és a b) plazmid a pH4-HD plazmid.
18. A 14-17. igénypontok bármelyike sze- rinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált
- 172 vagy transzfektált sejt az AV12 sejt,
19. Eljárás rekombináns és kiméra antitest láncok expressziójára rekombináns nem-limfoid gazdasejtben, azzal jellemezve .hogy
1) az említett gazdasejtek a következő összetételű rekombináns DNS expressziós vektorral vagy vektorokkal transzformáljuk:
a) tartalmaz egy az említett nem limfoid sejtben működőképes promotert és transzlációs aktiváló szekvenciát; és
b) egy rekombináns vagy kiméra antitest láncot vagy láncokat kódoló DNS szekvenciát, amely DNS szekvencia az említett promoterhez és aktiváló szekvenciához az expressziónak megfelelő pozícióba van helyezve; és
2) az 1) lépésben transzformált említett gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely alkalmas rekombináns vagy kiméra immunoglobulin láncok expressziójára.
20. A 19, igénypont szerinti eljárás.
azzal jellemezve,hogy a rekombináns gazdasejt vagy a
293 vagy az AV12 sejt.
···· ···· ·
173
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. lépésben a rekombináns gazdasejt az AV12 sejt.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS expressziós vektor a pL-HD, pH2-HD, a pH3-HD vagy pH4-HD plazmid.
HU891925A 1988-04-21 1989-04-20 Process for producing new recombinant and chimeric antibodies against human adenocarcinoma antigene HUT50870A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/184,522 US4975369A (en) 1988-04-21 1988-04-21 Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT50870A true HUT50870A (en) 1990-03-28

Family

ID=22677247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU891925A HUT50870A (en) 1988-04-21 1989-04-20 Process for producing new recombinant and chimeric antibodies against human adenocarcinoma antigene

Country Status (14)

Country Link
US (1) US4975369A (hu)
EP (1) EP0338767A3 (hu)
JP (1) JPH02211877A (hu)
KR (1) KR900016459A (hu)
CN (1) CN1037174A (hu)
AU (1) AU621600B2 (hu)
DK (1) DK187889A (hu)
HU (1) HUT50870A (hu)
IL (1) IL90016A0 (hu)
NZ (1) NZ228801A (hu)
PH (1) PH26945A (hu)
PT (1) PT90312A (hu)
RU (1) RU1780541C (hu)
ZA (1) ZA892840B (hu)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0364096B1 (en) 1988-09-06 2000-03-08 Xoma Corporation Gene expression elements and the production of chimeric mouse-human antibodies
IL89490A0 (en) * 1988-11-17 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against metal chelates
WO1991006649A1 (fr) * 1989-11-07 1991-05-16 The Green Cross Corporation Fragment de gene de la region v d'un anticorps de souris et preparation d'anticorps chimeriques par l'utilisation dudit fragment de gene
GB9022543D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
AU1337092A (en) * 1991-01-29 1992-08-27 Brigham And Women's Hospital A cdna encoding the type i iodothyronine 5' deiodinase
US5272078A (en) * 1991-01-29 1993-12-21 Brigham And Women's Hospital CDNA encoding the type I iodothyronine 5'deiodinase
US20050196400A1 (en) * 1991-05-06 2005-09-08 Xoma Technology Ltd. Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5756096A (en) * 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
MX9204374A (es) * 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5877289A (en) * 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US6004555A (en) * 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US6036955A (en) * 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
US6749853B1 (en) * 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US6093399A (en) * 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
FR2724320B1 (fr) * 1994-09-13 1996-12-20 Transgene Sa Nouvel implant pour le traitement des maladies acquises
US6440418B1 (en) * 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
US6001358A (en) * 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
CA2257357C (en) 1996-06-07 2010-04-13 Neorx Corporation Humanized antibodies with modified glycosylation
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) * 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US6348581B1 (en) 1996-10-31 2002-02-19 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-TAG-72 monoclonalantibodies
DK0966533T3 (da) 1997-02-07 2010-01-04 Us Gov Health & Human Serv Aktivitetsafhængig neurotrof faktor III (ADNF III).
US6893636B2 (en) * 1997-02-20 2005-05-17 Biogen Idec Ma Inc. Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US7033589B1 (en) 1997-02-20 2006-04-25 Biogen Idec Ma Inc. γ-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US7147854B2 (en) * 1997-06-23 2006-12-12 Yes Biotech Laboratories Ltd. Topical treatment of psoriasis using neutralizing antibodies to interleukin-8
AU763719B2 (en) * 1997-12-08 2003-07-31 Merck Patent Gmbh Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
WO1999059578A1 (en) 1998-05-19 1999-11-25 Research Development Foundation Triterpene compositions and methods for use thereof
US6350452B1 (en) 1998-09-24 2002-02-26 Promega Corporation Apoptosis marker antibodies and methods of use
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
US20030143233A1 (en) * 1999-06-07 2003-07-31 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US20030103948A1 (en) * 1999-06-07 2003-06-05 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US7144991B2 (en) 1999-06-07 2006-12-05 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
EP1731531B1 (en) 1999-08-09 2012-05-30 Merck Patent GmbH Multiple cytokine-antibody complexes
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
CA2410188A1 (en) * 2000-06-06 2001-12-13 Idec Pharmaceutical Corporation Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof
AU2001271729B2 (en) 2000-06-29 2007-01-04 Merck Patent Gmbh Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
US20060148732A1 (en) * 2000-11-17 2006-07-06 Gutterman Jordan U Inhibition of NF-kappaB by triterpene compositions
KR20090010127A (ko) 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE60239454D1 (de) * 2001-05-03 2011-04-28 Merck Patent Gmbh Rekombinanter, tumorspezifischer antikörper und dessen verwendung
DE60238435D1 (de) * 2001-10-26 2011-01-05 Scripps Research Inst Gezielte thrombose durch gewebefaktor polypeptiden
PT1454138E (pt) 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CN104225610B (zh) 2002-07-15 2017-03-01 得克萨斯大学体系董事会 与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的选定抗体及其治疗用途
WO2005016232A2 (en) 2002-08-01 2005-02-24 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US20040053363A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-18 Thomas Ryll Method for production of a multimeric protein by cell fusion
US20040053359A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-18 Thomas Ryll Method for production of a multimeric protein by cell fusion
JP4033390B2 (ja) * 2002-10-30 2008-01-16 独立行政法人科学技術振興機構 不死化ナチュラルキラー細胞株
RU2366664C2 (ru) 2002-12-17 2009-09-10 Мерк Патент Гмбх Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2
EP2397189B1 (en) 2003-11-14 2015-03-18 Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods of modulating immunity
BRPI0417916A (pt) 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
AU2005206277B2 (en) 2004-01-22 2011-06-23 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
WO2007094754A2 (en) 2005-01-27 2007-08-23 The Regents Of The University Of Califordnia Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
RU2432962C2 (ru) 2005-01-27 2011-11-10 Чилдрен'З Хоспитал Энд Рисерч Сентер Эт Окленд Вакцины с использованием везикул на основе gna 1870 широкого спектра действия для профилактики заболеваний, вызываемых neisseria meningitidis
PT1966245E (pt) 2005-12-30 2011-08-31 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida
CA2699394C (en) 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
MX2010005104A (es) 2007-11-09 2010-08-04 Peregrine Pharmaceuticals Inc Composiciones de anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular y metodos.
EP3029061B1 (en) 2008-06-18 2017-09-13 The Texas A&M University System Mesenchymal stem cells, compositions, and methods for treatment of cardiac tissue damage
US20110177614A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for detecting cancer
CA2787755A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Tolerx, Inc. Immunoregulation by anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments
EP2525813B1 (en) 2010-01-20 2017-01-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments
AU2011230590C1 (en) 2010-03-26 2016-09-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to MUC16 and methods of use thereof
EP3848394A1 (en) 2010-04-09 2021-07-14 Critical Care Diagnostics, Inc. Soluble human st-2 antibodies and assays
JP2013525420A (ja) 2010-04-29 2013-06-20 ナスバックス リミテッド 抗ｃｄ３免疫分子療法により肝炎を治療する方法および組成物
CA2809363A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Abbott Laboratories Hiv core protein specific antibodies and uses thereof
US20120148559A1 (en) 2010-12-01 2012-06-14 Board Of Regents The University Of Texas System Compositions and method for deimmunization of proteins
WO2013151649A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
EP2836514A4 (en) 2012-04-13 2015-12-30 Childrens Medical Center TIKI INHIBITORS
WO2014093417A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for regulating erythropoiesis
US10081673B2 (en) 2013-03-14 2018-09-25 Ffe Therapeutics Llc Compositions and methods for treating angiogenesis-related disorders
MX2017006167A (es) 2014-11-12 2018-03-23 Siamab Therapeutics Inc Compuestos que interactúan con glicanos y métodos de uso.
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
RU2758113C2 (ru) 2015-03-17 2021-10-26 Мемориал Слоан-Кеттеринг Кэнсер Сентер Антитела к muc16 и их применение
CN108139375A (zh) 2015-06-26 2018-06-08 贝斯以色列女执事医疗中心股份有限公司 靶向髓样衍生的抑制细胞中的四跨膜蛋白33(tspan33)的癌症疗法
MX2018005061A (es) 2015-11-12 2019-02-28 Siamab Therapeutics Inc Compuestos de interacción con glicanos y métodos de uso.
PT3383920T (pt) 2015-11-30 2024-04-15 Univ California Entrega de carga útil específica para tumores e ativação imune utilizando um anticorpo humano que tem como alvo um antigénio altamente específico da superfície das células tumorais
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
MX2019010202A (es) 2017-03-03 2019-10-02 Seattle Genetics Inc Compuestos que interactuan con glicano y metodos de uso.
CN108727494A (zh) * 2017-04-25 2018-11-02 成都贝爱特生物科技有限公司 一种靶向筛选外源基因双整合位点提高人c5单抗表达产量的方法
WO2019018744A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS
US20200283537A1 (en) 2017-11-14 2020-09-10 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for making and using bispecific antibodies
TW202015726A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
CU20200089A7 (es) 2018-06-01 2021-07-02 Novartis Ag Moléculas de unión contra bcma
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
EP3972993A1 (en) 2019-05-21 2022-03-30 Novartis AG Variant cd58 domains and uses thereof
JOP20210309A1 (ar) 2019-05-21 2023-01-30 Novartis Ag جزيئات ربط بـ cd19 واستخدامتها
US20230340086A1 (en) 2019-06-19 2023-10-26 Christopher Roland Oelkrug Antibody-mediated neutralization of beta-lactamases
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
TW202124446A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 瑞士商諾華公司 與ｅｎｔｐｄ２抗體之組合療法
EP4058481A1 (en) 2019-11-15 2022-09-21 Pliant Therapeutics, Inc. Compositions and methods for activation of integrins
US20210284743A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Tiziana Life Sciences Plc Compositions of il-6/il-6r antibodies and methods of use thereof
WO2021255189A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Tiziana Life Sciences, Plc Compositions and methods for augmenting chimeric antigen receptor (car) t cell therapies
CN116406274A (zh) 2020-07-30 2023-07-07 迪赞纳生命科学公开有限公司 用于治疗冠状病毒的cd3抗体
CN116419747A (zh) 2020-08-07 2023-07-11 福蒂斯治疗公司 靶向cd46的免疫偶联物及其使用方法
CA3199839A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
IL302569A (en) 2020-11-06 2023-07-01 Novartis Ag CD19 binding molecules and their uses
WO2022162569A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
PE20240086A1 (es) 2021-04-14 2024-01-16 Villaris Therapeutics Inc Anticuerpos anti-cd122 y usos de estos
US20220332822A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Tiziana Life Sciences Plc Subcutaneous administration of antibodies for the treatment of disease
WO2023064942A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Tiziana Life Sciences Plc Methods of suppressing microglial activation
IL312584A (en) 2021-11-09 2024-07-01 Sensei Biotherapeutics Inc ANTI-VISTA antibodies and their uses

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0173494A3 (en) * 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
EP0245949B1 (en) * 1986-04-09 1997-10-29 Eli Lilly And Company A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer
DE3751908T2 (de) * 1986-07-07 1997-02-06 Centocor Inc Chimärisches Murine-Mensch-Immunoglobulin, spezifisch für tumorassoziertes 17-1A Antigen

Also Published As

Publication number Publication date
DK187889D0 (da) 1989-04-19
EP0338767A3 (en) 1991-07-17
PH26945A (en) 1992-12-03
US4975369A (en) 1990-12-04
IL90016A0 (en) 1989-12-15
AU621600B2 (en) 1992-03-19
DK187889A (da) 1989-10-23
ZA892840B (en) 1990-12-28
PT90312A (pt) 1989-11-10
JPH02211877A (ja) 1990-08-23
NZ228801A (en) 1991-05-28
EP0338767A2 (en) 1989-10-25
KR900016459A (ko) 1990-11-13
RU1780541C (ru) 1992-12-07
CN1037174A (zh) 1989-11-15
AU3318989A (en) 1989-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT50870A (en) Process for producing new recombinant and chimeric antibodies against human adenocarcinoma antigene
AU711882B2 (en) Chimeric kanamycin resistance gene
US6270993B1 (en) VEGF-binding polypeptide
RU2249617C2 (ru) ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ ДНК ГЕНА ХОМЯКА EF-1α
JP2644447B2 (ja) ポリペプチドの合成方法
JP2004254697A (ja) 殺菌／浸透性が向上した安定なタンパク質生成物およびそれを含む薬剤組成物
CA2024607C (en) Recombinant dna method and host cells
JPS63503275A (ja) ファクター８：ｃの製造方法
CA2189774A1 (en) Recombinant hk2 polypeptide
Whang et al. Expression of the Epstein-Barr virus gp350/220 gene in rodent and primate cells
JP2001503252A (ja) タンパク質の高レベル発現
WO1989001037A1 (en) Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system
KR0159107B1 (ko) 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포
EP0319570B1 (en) Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene and use thereof
WO2019038197A1 (en) IMPROVED TRANSPOSASE POLYPEPTIDE AND USES THEREOF
JP2774298B2 (ja) ヒト腺がん抗原の発現ためのｄｎａ化合物、該化合物を含有するベクター、およびそれを発現させる方法
EA001092B1 (ru) Выделенные последовательности днк, кодирующие капсидные белки l1 и l2 папилломавируса человека типа 18, вектор для экспрессии последовательностей днк, способ получения вирусоподобных частиц и способ индуцирования иммунного ответа
Taylor et al. Carbohydrate-recognition domains as tools for rapid purification of recombinant eukaryotic proteins
EP1042467B1 (en) Non-identical genes and their application in improved molecular adjuvants
EP0225177B1 (en) Dna sequence coding for human tissue plasminogen activator
JP2001258565A (ja) 遺伝子の発現を促進させ得る核酸
IE60641B1 (en) Human protein s, a plasma protein regulator of hemostasis
JPH04501954A (ja) ドロソフィラ細胞におけるｈｉｖ蛋白の発現
WO1996003434A1 (fr) Facteur de differenciation/proliferation de megacaryocytes
JP2006094861A (ja) Ｖｅｇｆ結合性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
DFC9 Refusal of application