HU229841B1 - Antibodies against obm - Google Patents

Antibodies against obm Download PDF

Info

Publication number
HU229841B1
HU229841B1 HU0800628A HUP0800628A HU229841B1 HU 229841 B1 HU229841 B1 HU 229841B1 HU 0800628 A HU0800628 A HU 0800628A HU P0800628 A HUP0800628 A HU P0800628A HU 229841 B1 HU229841 B1 HU 229841B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
obm
antibody
protein
human
Prior art date
Application number
HU0800628A
Other languages
English (en)
Inventor
Masaaki Goto
Kanji Higashio
Masahiko Kinosaki
Fumie Kobayashi
Tomonori Morinaga
Nobuaki Nakagawa
Nobuyuki Shima
Ken Takahashi
Akihiro Tomoyasu
Eisuke Tsuda
Naohiro Washida
Kyoji Yamaguchi
Kazuki Yano
Hisataka Yasuda
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27525882&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU229841(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/JP1998/000172 external-priority patent/WO1998032871A1/ja
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of HU0800628D0 publication Critical patent/HU0800628D0/hu
Publication of HU229841B1 publication Critical patent/HU229841B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Description

A találmány arra a DNS--re is vonatkozik, amely kódolja ezt a fehérjét, vonatkozik továbbá ezen. DNS által kódolt aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjékre, eljárásra ezen. fehérje génmanipulácios technikák segítségével történő előállításra és ezen fehérjét * ' xd?m x sO n -- x xss n \x x ; ?x^ x n m
A találmány vonatkozik továbbá ezen fehérjét és DöS~t felhasználó szűrési eljárásokra, amelyek ezen fehérje expressziöját szabályozó anyagokra, ezen fehérje biológiai aktivitását gátló vagy szabályozó anyagokra vagy az ezzel a fehérjével létrejövő kölcsönhatás során a fehérje jelét ko z v e 111 ο r e c ep t o ro k r a i r á. n y u 1 n a k, v a 1 am i n t ν ο n a t k o z i k a szűrés során kapott anyagokra, illetve az igy kapott anyagokat tartalmazó gyógyszerészeti készítményekre,
A találmány ezen fehérje elleni antitestekre, az antitestek előállítására szolgáló eljárásokra és ezeket az antitesteket tartalmazó gyógyszerészeti kész!tményekre is vonatkozik.
A csont'-metabolizmus függ a osontképzódés szabályozásáért felelős osteobiastok és a osontreszorpciő szabályozásáért felelős osteoolastok Összaktivításátői. A csont'-metabolizmus rendellenessége a csontképződés és !&.
esontreazorpo:iő kiegyenső.lvoza.tianságábdl eredő következménynek tekinthető. · Az osteoporosisroi# a nypercsloemiarél# a Paget-körről# a rónai osteödyströphyröl# a krónikáé rhoumorthritisröi# az osteoarthristisről és más hasonló betegségekről tudjak# hogy a rendellenes cscnt-ueet ahold zmus velejáróid Az esteoporoeis s csont-onetabolizmus ilyen rendellenességo által okozott tipikus kór. Ez a betegség akkor lép fel# amikor aa osteoclastok általi csontreszorpcio aa osteoblastok általi cscntképzést meghaladja. A betegség mind a osont meozesedö anyagában# mind a csont mátrixéban bekövetkező csökkenéssel jellemezhető.. Bár ezen betegség .ne , ' -. ·> •ο·'· θ'.....'χη tisztázott# a betegség csontban tellépő fájdalmakat okoz# tőrékénnyé teszi őket és csonttöréshez vezethet» Ez a betegség egyre inkább szociális problémává vélik# mivel az idős emberek mennyiségének növekedésével nővel! az ágyhoz kötött idős személyek számát. Ezért sürgősen szükséges e betegség kezelésére terápiás ágenst kifejleszteni. A csonttömeg csökkenésének következtében kialakuló kört valöszinüleg a csentreezorpcic visszaszorításával# a csontképzödás feigyorsitásával vagy a. cscntreszorpciő és csontképződés közötti egyensúly javításával lehat kezelni. A csont képződés várhatóan növelhető a osont.képzö osteoblastok szaporodásának# differenciáoiöjánek vagy aktiváiásánek gyorsításával# illetve a csontot lebontó osteoclastok szaporodásának# difrerenoiácicjának vagy aktiválásának gátlásával. Az utóbbi években komoly érdeklődés irányult sz olyan hormonok# kis molekulatömege anyagok vagy fiziológiailag aktív fehérjék felé# amelyek ilyen aktivitást mutatnak és erőteljes alapkutatás ás .fejlesztés Indult meg ezen irányokba..
Az olyan gyógyszerek, mint a oaloitonln ágensek, a D3-~v.ltem.ln. aktív-forma. ágensai, oszt rádióit, iprszlavónt, K2 -vitamint rartalmaző hormonális ágensek és a biszfeezfonét vegyületek már ismertek, mint olyan gyógyszerein amelyek a csonttal kapcsolatos betegségek kezelésére es a kezelesi időszak rövidítésére alkalmasak, A D^-vitamin származékok aktív formái, az ösztradiol származékok és a másod! in illetve harmadik generációs biszíoszfonát vegyületek olyan klinikai vizsgálatai vannak folyamatban, melyek kitűnő hatékonyságú ás minimális mellékhatású terápiás ágensek kifejlesztését célozzák.
Ennek ellenére azt találták, hogy ezen ágenseket használó terápiák nem szükségszerűen klelégitőek a hatékonyság és terápiás eredmények szempontjából. Sürgető az igény a biztonságosabb és nagyobb hatékonysággal rendelkező ű.j terápiás ágensek kifejlesztésére, Eáhány, osont-métábólizmussál kapcsolatos betegségek kezelésére használt ágens mellékhatásaik miatt csak korlátozott mértékben használhatók, Továbbá a kettő vagy több ágenst kombinálva alkalmazó kezelések jelenleg a nsontmetaholizmussal kapcsolatos betegségek, mint példáéi az osteoporosis kezelésében a fő Irányvonalat jelentik. Ebből a szemszögből. tekintve az olyan gyógyszerek kifejlesztése kívánatos, melyek a szokásos gyógyszerektől eltérő hatésmeohanlzmnsokkal, valamint nagyobb hatékonysággal és minimális mellékhatásokkal rendelkeznek, hint azt fent említettük, a oson t-metabol izmust szabályozó aejtek az oataoblastók ás az ósteóolaatok. Ismeretes, hogy ezen sejtek szoros kölcsönhatással rendelkeznek, amit ^oonpllngí:f-nek neveznek, Különösen az osteoblast sztrömális sejtek által szekreta.it cikőkénekről, mint például az interlenkin 1 (11-1), 3 {IL3), 6 (11,-6) es 11 (Ih-ll), granaloeita. makrói ág™ kolónia.
stimuláló faktorról (Gb-CSF), makrót ág-kolónia. stimuláló faktorról (M-CSF), interfergn-y-röl (ΙΕΝ-γ), tumor nekrőzis faktor-a-rol (TBE-a? és transzformáló növekedési faktor-p-rdl (TGÉ-β) ismert, hogy gyorsítják vagy gátolják az osteoclastok differenoiáciöját vagy érését (Rassz: Disorders of Boné and Mineral Metabolism, 287-311, 1992;
Suda és másai.: Prinoiples of Boné Biology, 87-102, 1996;
duda és másai.: Fndoorine Reviees, 9, 266-270, 1995, Lacey és mtsai,: Endoorinology, Iád, 2369-2376, 1995). Leírták, hogy az osteoblast aztrémáiis sejtek fontos szerepet játszanak az ostecclastok differenciálódásában ás eresében, valamint az osteoclast funkciókban, mint például az érett osteooiastok általi csontreszorpcióban, éretlen osteoclast prekurzorokkal vagy érett osteoclastokkal fellépő sejt-sejt kontaktuson keresztül,
Az osteoclast differenoiácios faktornak (ODF, Buda és másai.: Bndoorine Rév., 13, 66-68, 1992? duda és mtsai,;
Boné 17, 373-913, 1333) nevezett faktorról ügy vélik, hogy az osteohlast sztrömális sejtek membránján ezpreaszálódik és sejt-sejt kapcsolaton keresztül részt vesz az osteooiastok képződésében. E hipotézis szerint az osteoclastok prekurzor sejtjeiben jelen van egy ODF . non ' ' ν ,. ,o, .\\\” ' χ . * . ' ' <
nem sikerült tisztítani vagy azonosítani. Továbbá nem jelent meg közlemény ezek jellemzőiről, működési mechanizmusukról vagy szerkezetükről. így az osteooiastok di fferenciáoiőj ában és érésében szerepet j átsző mechanizmus még nem eléggé tisztázott. Ezen mechanizmus felderítése nem csak az. alap orvos tudományhoz, hanem a csont-metabolizznj.s rendel lenessége ivei. kapcsolatos betegségek kezeléséhez szükséges új gyógyszerek kifejlesztéséhez is nagyban hozzájárulna,
A. feltalálok ezt a körülményt figyelembe véve kiterjedt vizagalatokat folytattak ée felfedeztek egy osteociaztogenesis inhihiclés faktort (OC.XF) az lbR-90 humán embrionális tüdő fibrobiastok tenyészet-fáptolajában (ATCC letéti arám: CCL186) (WÖ 96/26212}.
A feltalálóknak elkerült az OülF-ot kódoló DFS™t klónozniuk, állati sejtekben. rekombínáns OCIF-ot előállítaniuk éa a re kombi náns OCXF in vivő gyógyszerészeti hatásait (a csont “'métábólizmusban kifejtett jótékony hatás, stb,; igazolni. Az OCXF valöarlnnieg a esont^metsbeXlzmns rendellenes működésével kaposolatos betegségek megelőzésére vagy kezelésére szolgáld ágensként használható, amely a szokásos gyógyszerekhez képest nagyobb hatékonysággal és kevesebb mellékhatással rendelkezik.
A feltalálók egy olyan fehérje után kutattak, amely az osteocXastogenssis Inhihiolés faktorhoz (OCXF) kötődik, és felfedezték, hogy egy öClF-kdté fehérje speolfikusan expresszáródik az olyan osteeblast sztrőmális sejteken, melyeket olyan neontreszorpeiés faktor, mint a 6b~vitam.in aktív forrnál a és a parathyroid hormon íkTH) jelenlétében növesztettek, Ezenkívül a feltalálók megvizsgálták ennek az OCiF-kötő fehérjének a. jellemzőit és fiziológiai funkcióit és azt találták, hogy a fehérje egy olyan faktor biológiai aktivitásét mutatja, amely az osteoclastok éretlen őstenciánt prakarzérókból történő differenoiálődasat és érését segíti vagy előmozdítja, Ezek a felismerések vezettek a jelen találmány megalkotáséhoz, A találmány szerinti fehérjén végzett további vizsgálatok bebizonyították, hogy ez egy fontos fehérje, amely szabályozza az éretlen osteoclsat prekorzorokbél származó osteoolaatok differenoiálődáaát és érését az osteoblasi sztrómálls sejtek és 1 épsejtek ko-kultárális rendszerében. A jelen találmányban ismertetett sikerek, melyeket az osteociastok differenciálódását és érését segítő vagy eiómozdltó faktorként funkcionáló fehérje azonosításában és izolálásában, értünk, el, lehetővé tették a rendellenes osont-metabolizmushoz használható olyan űj gyógyszerre történő szűrést a találmány szerinti fehérje felhasználásával, amely a esont-métábólizmus mechanizmusán alapszik.
A találmány egy célja, hogy szolgáltasson egyrészt egy olyan új fehérjét (OCIF-kótő molekula vagy 03b), amely az osteociastogenesis inhiéioiés faktorhoz (OCIF) kötődik, másrészt egy olyan eljárást, amelynek segítségével ez a fehérje előállítható.
A találmány egy másik célja, hogy szolgáltasson, ezt a fehérjét kódoló ONS-t, szolgáltasson továbbá ezen DÖF által ködolt amínosav szekvenciát tartalmazó fehérjéket, illetve ezen fehérje előállítására szolgáló olyan eljárást, amely génmanipulációé technikákat használ és szolgáltasson ezen fehérjét tartalmazó gyógyszerészeti készítményeket, & találmány egy további célja, hogy olyan eljárásokat szolgáltasson, amelyek segítségével szűrni lehet ezen fehérje és DNS felhasználásával ?α>'λη anvaccua, amelyek ezen fehérje ezpresszióját szabályozzák, szűrni lehet ezen fehérje biológiai aktivitását gátló vagy szabályozó anyagokra, szarni lehet olyan receptorokra, amelyek a fehérjéhez való kötődés által a fehérje hatását közvetítik, célja továbbá olyan anyagok szolgáltatása, amelyeket a szűrés során kaptunk, illetve olyan gyógyszerészeti készimények szolgáltatása, amelyek ezen anyago kát tart alma zzak,
Egy további. találmányi ismérvnek megfelelően a találmány célja, hogy szolgáltasson ezen fehérje elleni antitesteket, az antitestek' előállítására szolgáló eljárásokat és ezen antitesteket tartalmazó gyógyszerészeti, készítményeket.
A találmány szerinti fehérje a következő fizikokémiai tulajdonságokkal és biológiai aktivitással rendelkezik, (a) Affinitás: spéciiikusan kötődik az osteoclastogenesis inhibiciős faktorhoz (öGlfj és nagy affinitást mutat az OCIF felé (dísszociácíős konstans a sej tmembránon: Kd s:: 10“:í M vagy kisebb) ;
(b) Molekulatömeg: körülbelül 30,000-40,OOÖ-es mólékulafömeggei rendelkezik nem-redukálő körülmények kozott végzett SDS-poliakrílamid géieloktroforézis (SDS-PAGEb segítségévei meghatározva és körülbelül 90. ööC—HŐ ♦ OOÖ-es látszólagos molekulatömeggel rendelkezik monomer alakú OCIF-hoz keresztkötve; és (c) Biológiai aktivitás; az osteoeiast differenciácíót és érést segítő vagy előmozdító aktivitást mutat olyan kokultúra rendszerben, amely egér osteoblast sztrőmális sejteket és egér lépnejtekét tartalmaz olyan csontreszorpcíés .faktorok jelenlétében, mint a Dx-vitamin aktív formája és a parathyroid hormon. (PTH),
Az SÍI egér osteoblast sztrőmális sejtvöüalbél és egér lépsejtekböl álló kokultára rendszer, amelyben jelen van a D-j-vitamin aktív formája vagy a PiH, jól ismert, o s t e ο c 1 a s t k.é p z ö d é sh e z v a 1 d 11 pi k n s . in v i t r o tenyésx.rendszerv A találmány szerinti fehérjét ezpresszálo sejtek meghatározhatok az OCIF olyan egér osteoblast sztrőmális sejtekhez vagy egér lépsejtekhez való kötődésének vizsgalatéval, amelyek növesztése a te-vitamin aktív formájának jelenlétében vagy hiányában történt. A találmány szerinti fehérje olyan fehérjeként adható meg, amely specifikusan az olyan osteoclast sztromáiis sejteken indukálódik, melyek egy osteotropikus faktor, mint például a Ds~-vitamin. aktív formája vagy a PTH jelenlétében voltak növesztve. Ezenkívül a kővetkező eredmények alapján találmány szerinti fehérje olyan fehérjeként adható meg, amely osteoolastok difíerenciáciőjat és érését segítő vagy előmozdító biológiai aktivitást mutat. Ezek alapján az osteoclast képződés dózisfüggő módon gátolt l-üöng/ml OCIF a fent említett koholtéra rendszerhez történd hozzáadása által, a Dv~vitárnin aktív formájának jelenlétében, illetve a D^-vitamin aktív formájának jelenlétében a találmány szerinti fehérje ST2 sejteken történő expressziöj ának. idöfűggése jól. korrelál a ko·-kultúrában történő osteoclast képződés időfüggősével. Ezenkívül az STz sejteken expresszáit találmány szerinti fehérje mennyisége korrelál a sejtek osteoclast képződést segítő képességével, és az ST2 sejteken az; OCIF találmány szerinti fehérjéhez való kötődése teljesen elnyomja az osteoclast képződést.
A találmány szerinti fehérje OCIF felé mutatott affinitása meghatározható az OCIF jelölésével és vizsgálható a jelölt OCIF állati sejtmembrán felületéhez történő kötődésével. Az OCIF jelölhető olyan hagyományos fehérje-jelölő eljárással, mint például a rádióizotőpos vagy a flucreseens jelölés. A tirozin amlnosavak ^T-tei történő jelölésé az OCIF radioizotőpokkai való jelölésének egy speeifikus példája. Olyan jelölési módszerek használhatók, mint például a jodogén eljárás, a klőramln-T eljárás és enzlmatikus módszerek. A jelölt OCIF állati, sejt felszíni membránjához való kötődése a szokásos módszerekkel vizsgálható. A kötődési asssy-hez használt tápközeghez a jelölt OCIF koncentrációjához képest 100” 4Ö0”Szoros mennyiségű jelöletlen OCIF-ot adunk, ez teszi lehetővé a nem-speoifikus kötődés kimérését, A specifikusan kötődött OCIF mennyisége kiszámítható úgy, hogy a nem-specifikus kötődés mennyiségét kivonjak a jelölt OCIF kötődésének teljes mennyiségéből. A sejtmemhránon expresszifödő találmány szerinti fehérje OCIF felé mutatott aktivitása meghatározható a jelölt OCIF mennyiségének változtatásával és a specifikus kötődés Scatchard -grafikon segítségével történő elemzésével.
A találmány szerinti fehérje OCIF felé mutatott affinitását meghatároztuk, ami hozzávetőlegesen iöö~~50ö pfh-nal mutatkozott. A találmány szerinti fehérje nagy, az osteociastogenesis inhibioíos faktor (OCIF) felé mutatott affinitással jellemezhető (a sejtmembránon mutatott dieszociáciös konstans: Ad :::: 10~* vagy kisebb) . Az OBM mc 1 e kn1a tömege mégha táró zható gélsz ürese s kromatográfiával, SDS--FAGS eljárással vagy más hasonló módszerrel. Az SDS-FAGF az előnyben részesített a pontos molekulatömeg méghatarozása érdekében. Az OSM redukáló körülmények. között egy hozzávetőleg 4 0.000-es (40.OOOiá .000} molekulatömegü fehérjének mondható.
A találmány szerinti fehérje megkapható az ST2 egér osteobiast sztrömális sejtvonalból, a FA6 egér preadipocita sejtvonaibéi, humán osteobiast sejtvonalakbői vagy más olyan osteobiast sejtekből, melyek az olyan emlősökből származnak, mint például az ember, az egér vagy a patkány, A találmány szerinti fehérje ekpreseziőját indukáló anyagokként olyan osteotropi kos faktoroké adhatók meg, mint a Dy-vitanin aktív formája (kálóitriol), a parathyroid hormon (FTH), az intorlenkin (.110--1, 11,-6, ILII, az öncostatín b, továbbá megadható a leukémia inhlbioiős faktor (LIF) , Ezeket az anyagokat 10''“; b koncentrációban <D3~ vitamin aktív formája és PTH), 10 ng/ml koncentrációban (IL-ll) vagy Ing/.ml koncentrációban (Oncostatin M) lehat adni.' Ar IL-O-ot előnyösen 20 ng/ml koncentrációban, 500 ng/ml koncentrációjú oldható XL-6 receptorral használják. Előnyösen olyen o~MEM Oáökörégben növesztett összefolyó ST2 egér osteoblast sziroméiis sejtvonal haszná Iható, amely tápközeghez 10!$ M aktív formájú D-s-vitamint, 10~? M dexamehazont és 10% magzati borjúszérumot adtunk. A kitenyésztett sejtek sejtkaparóval végzett lekaparással gyűjthetők össze. Az összegyűjtött sejtek -SOhA-on táróiba tők felhasználásig.
A találmány szerinti fehérje hatékonyan tisztítható az összegyűjtött sejtek membránfrakciöiböl. A membrántrakciók előálláthaték olyan hagyományos eljárás segítségével, amely intracelluláris sejtszerveoskék előállítására használatos. Többféle típusú proteáz inhibitor adható ahhoz a pofférőidéihez, amelyet a. membrántrakoiők elkészítéséhez használunk. A proteáz inhibitorok lehetnek például szsrin proteáz inhibitorok, tiöl proteáz inhibitorok és metaproteéz inhibitorok. Speciális példákként a AMSE, az APMSE, az ADTA, az o~ fen.antrol.in, a leupeptin, a nepsztatin A, az aprót inin és a szójabab tripszin inhibitor adhatók meg. A sejtek aomogenizálásához Daunce homogéntrátör, polytron homogenízátor vagy ultrahangos homogenizátör használható, A sejthomogenízátumot 0,5 M szacharózt tartalmazó puffét oldatban sznszpeodáltnk és 10 percen keresztül. 600 x g sebességgel centrifugáltuk a nucleus és a preoipitátumként megjelenő egyben maradt eejtek szétválasztásához. Ahhoz, hogy a membrántrakoiőkat preoipitátumként megkapjuk, a feiüiűszót 90 percen át ISO.000 x g sebességgel centrifugáltuk. Az így kapott membránfrakoíőt többféle típusú detorgenssel kezeltük, hogy a találmány szerinti
1.1 fehérjét a sejtméWihráriról eredményesén szolabilízáljuk. és extraháijuk, Sejtmembrán fehérjék szolubllizáiásához általánosén elterjedt detergensek használhatók, mint például a CHAPS (3-4í3~'Choíamidopropil)-~dimetdd.amöndo]-'Í~· propánszuifonát}, a Triton Χ-Ί00, a dlkkol és az n~okt.ii~ gilkozid. Előnyösen 0,5% CHAPS-m adtunk a membrántrakoiohoz és a keveréket a találmány szerinti fehérje szolubiiizálása céljából 4°C~oh 2 órán keresztül keverhettük. Az Így elkészített mintát 60 percen át 150.000 x g sebességgel centrifugáltuk, hogy felütéssóként megkapjuk a szoiubzlzzáit membrán frakciót..
á találmány szerinti fehérje a szolubilizált membránérakeléből tisztítható OCXF-fal összekapcsolt oszlop, gél vagy gyanta segítségével. Az immohí lizá.lt 0C1F lehet a WO 90/20217-ben leírt ldR-90 humán embrionális tüdő tibröblast kultúrákból izolált OC.X.F, vagy génmanipuláeiős el járások segítségével előállított rOCIF, Az rOCIF előállítható humán cDES, egér cbbS vagy patkány cDNS szokásos eljárás alapján expiesaziős vektorba történő bevitelével, az igy elkészített vektor olyan állati sejtekbe, mint a. CHO sejtek, a BHK sejtek vagy a Eamalwa sejtek, vagy rovarsejtekbe történő transzdukciojévaX az rOCXF előállítása céljából, és az rOCXF tisztításával. Az igy kapott OCIF hozzávetőlegesen €0 kPa (monomer forma} vagy 120 feDa (dimer forma} molekulatömegé. Immobilt záráshoz a dimer formájú OCIF az előnyben részesítet. Az olyan gélekre ás gyantákra, amelyekhez OCIF'-ot immobil .í zártunk, példaként adható meg az ECH Sepharose 43, az BAH Sepharose 48, a Thiopropyl Sepharose 63, a CHBr által aktivált Sepharose 9B, az aktivált CH Sepharose 48, az eposz által aktíváit Sepharose 6b, aktivált tioi Sepharose 4b (ezek a Pharmacia Co. gyártmányai}, a TSKgei AF-Epony Toyopal 650, a TSKgei AF~ ·'> a. Z.
Amino Toyopal. 650, a ISKgei AF-Forrnyl Toyopal 650, a TSKgel AF-Carboxy Toyopal 550, a TSKgel AF-Tre-syl Toyopal650 (ezek a Toaoh Corporation gyártmányai), as Amino-Cellulofine, a Carboxy-Céliuiofiné, az FMP által aktivált Celluiofine, a Formyl---Cellulofine (ezek a Seikagakn Kogyo Co. gyártmányai}, az Affigel. 10, az Affigel 15 éa az Affiprep 10 (ezek a BioHad Co. gyártmányai}> Olyan oszlopként, amelyhez OCXF-~ot immobilizáitunk, a HiTrap FHS-aktíváit oszlop (Pharmacia Co <), a TSKgel Tresyl-őBK (Tos.oh Corporation), atb.. adható meg. OCIF HiTrap EHS-aktívélt oszlophoz (1 ml, Pharmacia Co,) történő immobilizéiárának egy speciális példájaként a kővetkező eljárás adható meg. Bővebben, 13,0 mg OCXF-ot tartalmazó Imi 0,2 M NaHCCe/0,5 M NaCi oldatot (pH 8,3) injektáltunk az oszlopra, hogy elvégezzük a kapcsolási reakciót, mely szobahőmérsékleten történt és 30 percig tartott. 0,5 M etanolamxn/0,5 M HaCl (pH 8,3) és 0,1 H ecetaav/0,5 M HaCI (pH 4,0) oldatokat vittünk egymás után az oszlopra. Ezt követően az oszlopot ismét 0,5 M etanolamin/Ö, 5 M NaCi (pH 8,3) oldattal mostuk és az oszlopot egy érán 'nu.es.m\: szoba hőmérsékleten állni hagytuk, hogy a feleslegben lévő aktív csoportokat blokkoljuk. Az oszlopot, egymás után kétszer mostuk 0,5 M etanoiamin/0,5 M HaCl (pH 8,3) oldattal és 0,1 b ecetsav/0,5 M HaCl (pH 4,0) oldattal, és ezt követően 50 mM Tris/I H baCl/0,1% CHAFS oldattal (pH 7,5) mostuk, igy kaptunk. egy OCIF-immobilizált oszlopot. A találmány szerinti fehérje hatékonyan tisztítható «gy Ilyen módon elkészített -OCIF-immobilizált oszlop, vagy egy OCIFimmobilizált gél vagy gyanta segítségével.
'Kívánatos, hogy a fehérje tisztításához használt puffer oldatokhoz különböző fent említett proteáz inhibitorokat adjunk, hogy a találmány szerinti fehérje degradációját elnyomjuk, A találmány szerinti fehérje a fent említett szolubilízált membrántrakció OCTFimmobi líráit oszlopra 'töltésével vagy OClP-immohiiizáit géllel vagy gyantával történő összekeverésével, és a fehérje az oszlopról, gélről vagy gyantáról savval, különfcö zo fehérj e danatn r álő ágénsekke1, ka kod11a t pufferrel és hasonlókká! történő eiuálassai tisztítható. Kívánatos, hogy az elűeiohoz savat használjunk és az eiűciö után áronnál semlegesítsük, hogy a találmány szerinti fehérje denaturáciojáf minimalizáljuk« Az elúoióhoz használt saras oldatként 0,1 H glicin™· hidroklorid savóidat (pH 3,0), 0,1 M glicín~--hidroklorid savóidat (pH 2,0), 0,1 M nátrium-ultrát oldat (pH 2,0) és hasonlók adhatók meg,
A találmány szerinti fehérje tisztítható továbbá biológiai anyagokból származó különböző fehérjék tisztítására használatos szokásos tisztítási eljárásokkal és ezen fehérje f 1 zikokémiai tulajdonságait kihasználó különböző tisztítási eljárásokkal, A találmány szerinti fehérjét tartalmazó oldatok koncentrálására fehérjék t i sz t i t ás i e 1 j á résa 1 bo z na s zná 1 a tos ο 1 yan. s zokáso s technikák használhatók, mint például. az uitraszürés, fagyasztva szárítás és kisözss, Előnyös például az uitraszürés Cenfcricon-lö (HioKad Co,) felhasználásával, A. tisztításhoz különböző olyan szokásosan alkalmazott fehérjetisztitási technikák, kombinációját használtuk, mint az ioncserés kromatográfla, a gélszaréses kromatográfía, a ,,d.c;o k.cza m > m®, a reverz. fázisú kromatográfía és a preparativ eiektroforézis. Konkrétabban, a találmány szerinti fehérje tisztítása lehetséges a Esperese 12 oszloppal (Pharmacia Co,) végzett gélszaréses kromatográfla és a revére fázisú kromatográfía kombinációjával, A. tisztítás során a találmány szerinti fehérje detektálásához a találmány szerinti fehérje immohilizált OCXF falé matatott kötődési aktivitását vizsgáltak vagy az immobilizált OClB-hoz kötődő anyagot anti-öCIF antitesttel precrpltáltattak ás SDS' poliakrilamid géleiektroforézis segítségével vizsgáltuk.
A. kapott találmány szerinti fehérje olyan betegségek kezelésére hasznos ágens# amelyeket a esontmaetahol izmus rendellenessége okoz# mint az esteoporoeis# vagy hasznos reagens ezen betegségek kutatásához és diagnosztikájához>
A jelen találmány továbbá olyan áj fehérjét {0CXFkötő molekula vagy OBM) kódoló DMS-t szolgáltat# amely az osteoolastogenesis inhIbitiös faktorhoz kötődik# szolgáltat továbbá ezen Ddö által, kódolt aminosav sorrendet tartalmaző fehérjéket# továbbá ezen fehérje előállítására szolgáló eljárást# amely génmanipnlácíős technikákat használ ás ezen fehérjéket tartalmaző gyógyszerészeti készitményeket. őzen felni a találmány szűrési eljárásokat is szolgáltat# amelyek az OBM expressziéjának szabályozására szolgáló anyagokra irányulnak# szolgáltat olyan szűrésre vonatkozó eljárást# amely az OBM biológiai aktivitásának gátlására vagy módosítására szolgáié anyagokba irányai# vagy olyan recetorek szűrésére szolgáié eljárást# amelyek közvetítik az OBM OClF-hoz kötődésének hatását és olyan gyógyszerészeti készítményeket szolgáltat# amelyek a szűrés eredményeképpen kapott anyagokat tartalmazzák,
A találmány szerinti DBS által kódolt őj fehérje# az OBM a következő fizikokémlai tulajdonságokkal ás biológiai a kt1v11á s s a1 rendelke zik.
(a) specifikusan kötődik az osteoclastogenesis InhIbiolős faktorhoz (OCIF'-hoz) # (b) a molekulasúlya redukáló körülmények mellett SBB-PéGE módszerrel meghatározva hozzávetőlegesen 40,000 (±4,000) és körülbelül 90,OOö-llö,GOö-es látszólagos molekulatömeggel rendelkezik monomer alakú OGlF-hoz keresztkötve, és (c5 osteocXasé differenoláolót és érést segítő vagy előmozdító aktivitást mutat, a humán osteociastogenesis inhibiclós faktor (OCIF), amely az a találmány szerinti OCIF kőtő molekulát kódoló DNS azonosítására szolgáló próbaként és az OBM tulajdonságainak meghatározására szolgáló próbaként használatos, a BO 9B/Í621?'ben leírt 1HB-90 humán embrionális tüdő flbrobiast sejtvonal tenyészet™ táptalajából izolálható, OBFHet kódoló DNS izolálására és azonosítására használható továbbá rekombináns humán OCIF, rekombináns egér OCIF, rekombináns patkány OCIF és hasonlók, Fzen rekombináns OCIF fehérjék eiöáliithatők e fehérjéket kódoló DNS fragmensek expresszíos vektorokba hagyományos eljárások szerint történd bevitelével, állati sejtekben, mint például CHO sejtekben. Bök sejtekben vagy Namaiss sejtekben, vagy rovarsejtekben történő expresszlóval és ezek tisztításával,
Célfebérjét ködeié cDBF izolálására szolgáié módszerként (cDNS klónozás) az a módszer alkalmazható, amely tartalmazza a. fehérje parciális amínosav szekvenciájának meghatározását és a oél-cbBS hibrid!záoiő segítségévei történő izolálását az amínosav szekvenciának megfelelő nukleotid szekvencia felhasználásával, Fgy másik rendelkezésre álló eljárás, amely még abban az esetben Is használható, ha a fehérje amínosav sorrendje nem lomért, tartalmazza egy cDNS könyvtár sxpresszlös vektorban történő elkészítését, a cDhS sejtekbe történő bevitelét és a célfehérje expressziéjára irányuló szűrést a cél~cOd3 izolálása céljából. (expressziős klónozás i módszer, D’Andrea és rntsai,: Dell 57# 277-285, 1289; Fukanega éa rntsai«: Cell 61, 341-350# 1990), Az expresszien klónozás! módszer esetén a céltól függően olyan megfelelő gazdasejtek kerülnek kiválasztásra, mint a baktérium, élesztő, állati, sejtek és hasonlók, Sok esetben állati sejteket választunk ki gazdasejtként az olyan fehérjét, mint például a jelen találmány szerinti fehérjét kódoló oDNS klónozásához, amely fehérje elméletileg az állati sejtmembrán felszínén jelen van, Rendes körülmények között olyan gazdasejtek kerülnek kiválasztásra, amelyek nagy hatásfokkal képesek DNS transzfekclőra és a bevitt DNS nagyfokú expressziőját tudják megvalósítani. Az egyik ilyen állati sejt a COS--7 majom véséséit, amelyet a jelen találmányban használtaink. Mivel a COS-? sejtben SV40 T antigén expresszálőolk, az SViö repiikátoravai rendelkező plazmád többszörös kópiáié epi szóméként lehet jelen a sejtben, ezáltal nagy mennyiségű expresszié várható. Ezenfelül, mivel a óéifehérje COS-7 sejtek általi expressziőja. a DNS bevitelétől, számított néhány napon belül elér egy maximumot, a sejt gyors szűrésre alkalmas. Ezen gazdasejt nagy expressziős képességű plazmáddal való kombinációja rendkívül nagy mértékű génexprenszlét biztosit, A premoter az a faktor, amely egy plazmádon lévő gén expressziéjára a legnagyobb hatással van. Olyan promoterek, mint az SRa nrometer és a oitomegalovirusból származó promoterek nagyfokú ezpressziős promoterekként használatosak, Membráníehérjét kódoló cDNS-re irányuló expresszíós kiönozási stratégia segítségével végzett szűréshez olyan szűrési eljárásokat használtunk, mint a kötődési eljárás, a mosási ípanning) eljárás vagy a film emulziós él j árás,
A találmány vonatkozik az OClP-hoz specifikusan kötődő fehérjét {OBbj kódoló Dhű'~re, amely DNS-t az expressziós klónozási stratégia és a kötődési eljárás segítségével történő szűrés kombinációjával izoláltunk, vonatkozik az expresszéit fehérjére és vonatkozik a DOS vagy az expresszált fehérje felhasználásával végzett fiziológiailag aktív anyagok szűrésére, A találmány szerinti DBS által kódol OBM OCIF jelölésével és a jelölt OCIF állati sejt membránjának a felszínéhez való kötődésének a vizsgálatával detektálható. Az OCIF olyan hagyományos jelölő eljárásokkal jelölhető, mint a radioizotopos jelölő eljárás vagy a szokásos fehérjék jelölésére szolgáló fluorescens jelölő eljárás, OCXF radioizotőppal történő jelölésére specifikus példaként adható meg tirozinok :z'd-tel való jelölése. Olyan jelöléses eljárások, mint a jodogén eljárás, a klőramin~T eljárás és euzímatikas eljárások használhatók. Jelölt OCXF állati sejt membránjának felszínéhez való kötődése a szokásos eljárásokkal vizsgálható, A teszthez használt tápközeghez a jelölt OCIF koncentrációjához képest 100™ 4ö0'~szoros mennyiségű j élőiét len OClF-ot adunk, amely lehetővé teszi a nem-specifikus kötődés mennyiségének számszerűsítését:, Az OCIF specifikusan kötődött, mennyisége kiszámítható ügy, hogy a nem-specifikus kötődés mennyiségét kivonjuk a jelölt 0C1F kötődésének teljes mennyiségéből.
Feltételezésünk szerint kölcsönhatás lép fel az osteoclastok ciffereseiáciöiában szerepet játszó faktor és az. OCIF között< Frre a fel tevésre alapozva annak a fehérjének az izolálása céljából, amelyhez a rekombináns OCIF kötődik, a feltalálok az STz egér osteobiast sztrőmális sejtvonalből származó mABS segitségével készített expressziős könyvtárat szűrtek a következő eljárás szerint. Bővebben, az S12 mRNS felhasználásával szintetizált DKS-t bevittünk eey állati sejthez való expressziős vektorba és az inzerttel rendelkező vektort COS~7 majom vese sejtekbe vittük be, A COS-7 sejtekből ezpresszálődó célfehérjét próbaként felhasznált ^l-tel jelölt OCXF segítségévei szűrtük. Ennek eredményeként OClF-hoz specifikusan kötődő fehérjét kódoló DNS-t izoláltunk. Ezután ezen OClE-kctő molekulát (OCIF-binding meleoale; OBM) kódold DNS nukleotíd szekvenciáját meghatároztuk. Ezenfelül ezen. DNS által kódolt OBM-röi azt találtuk, hogy specifikusan és erősen kötődik az OCIB-hoz, a sejtmembránon,
A jelen találmány esetében a DNS hibridizációjához viszonylag enyhe körülményeket használtunk, például a DNSt egy nylon membránra vittük fel és szokásos eljárások segítségévei ahhoz immobilizéituk, és hibridizációs puffer oldatban hibridizáituk Izotóppal jelölt DNS próbával 407ööC~os hőmérsékleten körülbelül 2 orátöi egy éjszakáig terjedő időtartamon keresztül, majd ezt követte a 0, 5 x SSC-ben (0,075 M nátrium-klorid és 0,007S M nátriumcifrát) 45°ü~on, 10 percig tartó mosás. Konkrétan, nylon membrán kent Highbond N~t (.Amersham Co,) használtunk, erre vittük fel és ezen immobilizáituk a DNS-t, Ezután ^P-ral jelölt DNS próbával hibriöízáltuk a DNS~t egy gyors κ ο a v. v s' m ·- ' c '', keresztül, majd ezt követte a 0,5 z SSü-ben (0,075 d nátrium™klorid és 0,0075 M nátrium-cifrát) iő^C-on, 10 percig tartó mosás,
Az ST2 egér osteoblast sztrömális sejtvonalből és egér lépsejtökből álló kokultúra. rendszer, amelyben jelen van a Dy-vitamin aktív formája vagy a ETH, jól ismert, osteoclast képződéshez való tipikus in. vxtro tenyészrendszer> A. találmány szerinti fehérje megadható, mint az a fehérje, amely specifikusan az olyan osteoblast a z t roma 1 i s a ej te ken inda ká lobi k, ame 1 ye két. csontreszorpcíőt gyorsitö ágens, mint a D^-vitamin aktív formája vagy a PTH jelenlétében növesztettek, Ezenfelül abból a tényből következően, hegy az osteoclastok képződése a találmány szerinti DNS által kódolt fehérje olyan egér iépsejbekhez történő hozzáadásával stimulálod!k, amelyeket ügy növesztettek, hogy még a Ds~ vitamin. aktív formája. vagy a PTH is hiányzott a táptalaj bőr, a találmány szerinti. DNS által kódol OBM-et ügy tekinthettük, mint ami szerepet játszik az osteoclastok differenciáoiőjában és érésében.
Rekombináns OBM előállítható a találmány szerinti DNS expresszibe vektorba történő bevitelével, amely egy plazmád előállítását célozza es a piazmid különböze sejtekbe vagy mikroorganizmusokba való bevitelével a rekombináns ÖBM ezpresszáiása céljából. Olyan gazdasejtként, amelyben a rekombináns OBM expresszáiődik, emlős sejtek, mint a GOS-7, Gnö, Namalea vagy baktériumok, mint az Bsoherichis coli használhatok. Az OBM-et lehet erpresszáitatni membránkötött formájú fehérjeként a teljes hosszúságú DNS felhasználásával, illetve szekréciós formájú vagy szolubiiis formájú fehérjeként a transzmembrán doxaént ködeié rész eltávolításával, Az elöálütött rekombináns OEM hatékonyan tisztítható olyan hagyományos tisztítási eljárások megfelelő kombinációjával, amelyek szokásos fehérjék esetében használatosak, mint például OQE ütésemül zs.it oszlopokat felhasználva az affinitás kxomatográfía, az ioncserés kromatográf ia. és a gélszüréses kromatográfla. Az így kapott találmány szerinti fehérje hasznos ágens a rendellenes csont-metabolizmus által okozott betegségek.
mint sx osteopetrosis kezelésére, vagy reagensként az i 1 y e n ő e t e g s é g e k k n t a t á s á h ο z é s d i a g η o s x t 1 k á j á h ο z , & találmány szerinti DNS által kódolt OEM. fehérje felhasználásával el lehet végezni a következő szűrési műveleteket; (1) OEM ezpressziőját szabályozó anyagok szűrése, ;í) OBM-hez specifikusan kötődő és az ÖSM biológiai aktivitását gátló anyagok szűrése és (3) esfceooiast prekurzor sejtekben jelenlevő és az OBM biológiai aktivitását közvetítő fehérjék (OEM receptorok; szűrése. Továbbá lehetséges ezen OEM receptorok felhasználásával antagonisták és agonisták kifejlesztése, A fent említett OEM vagy OEM receptor felhasználásával a kombinatorikus kémia segítségével az antagonisták vagy agonisták szűréséhez használatos peptid könyvtár állítható elő az alábbi eljárás segítségével. Bővebben, az egyik módszer egy hasításos eljárás (ham és mtsai,; Natúré 354# 82-84., lééi) ·· Ezen módszer szerint olyan szintetikus hordozókat (gyöngyöket) állítanak elő, amelyek mindegyike tartalmaz egy kötött specifikus aminosavat (egységet) és az előállításuk elkülönítve történik minden egység esetében. Az előállított hordozókat teljesen összekeverik és ez egységek számával megegyező részekre osztják. Ezt követően a következő egységeket kötik hozzájuk, Ezt az eljárást „nfí alkalommal megismétlik, hogy egy olyan könyvtárat állítsanak elő, amely „n* egységet kötött hordozókat tartalmaz, Ennek a szintetikus eljárásnak megfelelően mindegyik hordozőkészlet egy adott szekvenciával rendelkezik. Ezért lehetséges a találmány szerinti fehérjéhez specifikusan kötődő pepiidet azonosítani oly módon# hogy a találmány szerinti fehérje felhasználásával kiválasztják azt a hordozőkészlefcet, ami pozitív jelet ad ezen szűrési eljárás során és a hordozdkészleten kötött peptid aminosav sorrendjét .meghatározzák. Egy másik eljárás a fág bemutatás módszere, amely olyas fágokat használ, amelyek véletlenszerű aminosav , sorrenddel rendelkező peptídeket kódoló szintetikus DNS-r hordoznak, Az eljárásnak megvan az az előnye, hegy a könyvtárban a fent említett szintetikus peptid könyvtár eljárással összehasonlítva, a molekulák száma megnő, éa megvan ez e hátránya, hogy adott számú molekula esetében kisebb a változatosság, mivel lehetnek olyan részleges szekvenciák, amelyek hiányoznak a könyvtárból, ha a rágok nem képesek ezen szekvenciák ezpresszálásara. A fég bemutatás módszere esetében a találmány szerinti fehérjét felhasználó szűrő rendszer felhasználható a pepiidet szekvencia kódoló nu.kleotiö meghatározására, Ugyanis a találmány szerinti fehérjéhez specifikusan kötődé lápot mosási fpanning) eljárással koncentráljak, a kiválasztott fágot Escheriehia. coliban ampliflkáljuk és a peptiöet kódoló nukieotló. szekvenciát meghatározzuk. Továbbá O'SM vagy OBM receptor fele nagy speclfitast és nagy affinitást mutató peptid a fent (2)és O}-ban említett szűrő rendszer felhasználásával peptid könyvtárból szűrhető OEM vagy 0C1E jelenlétében végzett szűréssel, miközben az OBM vagy OCXF koncentrációját növeljük. Csak a pozitív hordozókészleiek vagy fágok kerülnek ezen a módon kiválasztásra. Például EEO (eritropoietinI-szerö aktivitást mutató alacsony molekulatömega peptid agonistákat szűrtek peptid könyvtárból erfhropöietio (EPO) receptor felhasználásával, az éritropeletin hematopoietíkus hormon, amelynek megvizsgálták a harmadlagos szerkezetét es erre a harmadlagos szerkezetre alapozva EPO-szerű aktivitást mutató alacsony molokuiatömegö anyagokat (antagomstékát} szintetizáltak (Nioholas és mtsai,: Science, 273, 428-463, 1326},
A korábbiakban az osteociastogenesis inhibicíős faktor (OC1F) segítségével felfedeztük# hogy sz ST2 osteoblast sztrómálís sejtvonalon specifikusan expresszálődík egy OCIF-kötö fehérje# amely sejteket olyan osteotrepikus faktor jelenlétében növesztettük# mint például a p3~v.itárain aktív formája vagy a parathyroid hormon (PTH), Azt találtok továbbá# hogy ez a fehérje olyan biológiai aktivitást matat.# amely éretlen osteoclast prekarzor sejtekből történő osteoclast differenciádét és érést segít vagy stimulál és tisztításával a fehérje számos fizikokémiai tulajdonságát és a biológiai aktivitását tisztáztuk. Annak érdekében# hogy összehasonlítsuk a találmány szerinti DNS által ezpresszált rekombináns ODN-et és a fent említett tisztított# OCJE-höz specifikusan kötődé természetes típusa fehérjét#· megvizsgáltak a két fehérje fizikokémiai tulajdonságait és biológiai aktivitásait. Eredményként a két fehérjéről megerősítettük# hogy Φ mindketten olyan membránkötött fehérjék# amelyek specifikusan kötődnek az OCX k~hoz, Φ FDS-áAGE el j árással. meghat ároz va molekulatömegük hozzávetőlegesen 40.000 és G látszólagos molekulátómegák körülbelül 90,000-110.000 monomer formájú OCIF-hoz keresztkötve. Nem esek ezen fizlkokémial tulajdonságok megegyezők# hanem mindkét fehérje olyan biológiai aktivitást mutat# amely osteociástok differenciádé jár vagy érését segíti vagy stimulálja# ami annak a \ddsx; sugallja# hogy ezek ugyanazon feliérjék. Széniéiül. a találmány szerinti DNS génmanipaládős teehni kák segi Őségévé 1 történd exoressziój ávai. előállított tisztított fehérje Cfekomöináns OBM) felhasználásával előállított nyűi antiOBM poliklonália antitestről megállapítottuk# hogy a fent említett tisztított természetes tipusu fehérjével keresztreakcióba lép éa gátolja ennek a tisztított természetes típusú fehérjének és az öölF-nak a specifikus kötődését ugyanazon módón, mint ahogy az antitest gátolja az OBM és az OCIF specifikus kötődését> Ezen eredmények alapján világos, hogy a találmány szerinti DOS által expresszált rekomblnáns OBb azonos az OClF-hoz specifikusan kötődé természetes típusú fehérjével.,
OCIF-hcz specifikusan kötődő és a természetes típusú vagy rekomblnáns egér OBM dózishoz hasonló módon az egér lépsejtekböl származó osteoclastok differanciácídját és érését elősegítő és stimuláld aktivitást mutató humán OCIF-kötő fehérjét {amit ezután humán OhH-nek fogunk hívni) kódoló gén (cDBS) izolálásához humán nyirokcsemőkpől származó m.RbS~ből előállított cObS könyvtárat szűrtünk, próbaként humán OBM cDBS fragmenst felhasználva, A humán OEM oubá fragmenst polimeráz láncreakció (BCR) segítségével kaptuk a fant említett eljárásnak megfelelően mind a humán nyirokcsomóból előállított. oDRS, mint templáfc, minő az egér Ohd cubS-böi előállított primer felhasználásával, Ennek eredményeképpen izoláltuk az OCIF-hoz specifikusan kötődő humán fehérjét kódoló cDbá-t és meghatároztuk ezt a humán OCXF-kÖtő fehérjemolekulát közölő oDRS (azaz a humán OBM-et kódoló cDEE) nukleotid szekvenciáját, Az egér OBM-hez hasonlóan, ennek a cDbS által kódolt humán OBM-nek megvannak azok a jellemzői, hegy a sejtmembránon erősen és specifikusan kötődik az OÜIF-hoz és egér lépsejtekböl származó osteoclastok differenciáciőöát és érését segítő és előmozdító aktivitással rendelkezik. Bővebben, a találmány új humán OBM fehérjét kódoló bhS-t szolgáltat, amely fehérje az osteoclastogenesis inhlbiciés faktorhoz (OCIF) kötődik, szolgáltat olyan fehérjét, amely a bbá által ködőit aminosav szekvenciával rendelkezik, szolgáltat egy olyan fehérje előállítására szolgáló génmanipulációé technikák segítségével végzendő eljárást, amely jellemzően, specifikusan kötődik az OCIA-hoz es jellemzően rendelkezik az egér lépsejtekből származó osteoclastok differenoiációját és e'esa; segítő és előmozdító aktivitással, szolgáltat ezt a fehérjét tartalmazó gyógyszerészeti készítményeket a csont-metabolizmus rendellenessége által okozott batagúégék keze léséhez, szolgáltat a humán OBM expressziedét szabályozó anyagok szűrésére szolgáié eljárást, szolgáltat a humán OBM aktivitását hozzákőtődése által gátló vagy moduláló anyagok szűrésére szolgáló eljárást, szolgáltat olyan receptorok szűrésére szolgáló eljárást, amelyek a humán OBM-hez kötődnek és az OBM hatását közvetítik, es szolgáltét ezen szűrések során kapott anyagokat tartalmazó gyógyszerészeti készítményeket.
A jelen találmány továbbá olyan űj humán OBM fehérjét kódoló DNS-t szolgáltat, amely specifikusan kötődik az OCIB~hoz és osteoclastok differenoiációját és érését segítő és előmozdító biológiai aktivitást mutat, szolgáltat olyan fehérjét, amely a DNS által kódolt aminosav szekvenciával rendelkezik, szolgáltat egy olyan fehérje előállítására szolgáló génmanipulácios technika segítségévei végzendő eljárást, amely jellemzően specifikusan kötődik az OCXF-hoz és jellemzően rendelkezik az osteoclastok differenoiációját és érését segítő és előmozdító aktivitással, és szolgáltat ezt a fehérjét tartalmazó nxxh? ' készítményeket a csont·'· metabollzmus rendellenessége által okozott betegségek kezeléséhez. Továbbá a találmány eljárást szolgáltat a ' c v'xxC ' se χ ... .η x a) sz ' ^x' c eljárást szolgáltat a humán OBM aktivitását hozzákőtődése által gátló vagy moduláló anyagok szűrésére, eljárást szolgáltat olyan receptorok szűrésére# amelyek a humán OBM~hez kötődnek és az OBM hatását közvetítik# szolgáltat humán OCXF-köfcő fehérje elleni antitesteket# és szolgáltat ezen antitesteket tartalmazó gyógyszerészeti készítményeket csont-metahoiizmus rendellenességét okozó betegségek megelőzéséhez vagy kezeléséhez,
Az ú. j # humán. OCIB-kötő fehér jemolekala (OBM.)# amelyet a találmány szerinti DBS kódol# a következő fizikokémlai tulajdonságokkal és biológiai aktivitással rendelkezik, (a) specifikusan kötődik az osteoolastogenesis i.nhibici.ős faktorhoz (OClfd (WO 96/26217), (b) a molekulatömege redukáló körülmények között végzett SDS-BAGB alj árassal meghatározva hozzávetőlegesen 40.0-00 Ciamlöö) és monomer formájú. OCXF-hoz keresztkötve hozzávetőlegesen 90,000-110.000 látszólagos molekulatömeggel rendelkezik és (c) osteoclastok difíerenciáclőját és éri co — \ a η n * .
segítő és
Az egér OGlF-k.ctd fehérjét kódoló egér OBM cDNB-t# amit próbaként használtunk a találmány szerinti humán OBMet kódoló cDBS izolálásához és azonosításához, a fent említett eljárás szerint lehet az STB egér osteoblast sztromális sej ivónál cDBS könyvtárából izolálni. A humán OBM cDdS ezpresszíőja során kapott fehérje tulajdonságainak és biológiai. aktivitásának meghatározásához szükséges humán. osteoclastogenesis inhibiciős faktort (OCIF) a WO 96/2-6217- számé szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint lehet előállítani 1MR-90 humán fiProhlast sejtvonal tenyészet-táptalajából történő izolálással vagy OCÍF-ot kődele DBS felhasználásával génmanipnlácíős technikák alkalmazásával. Rekombináns humán OC1F# rekombináns egér GCTF# rekombináns
6 patkány OCXF és hasonlók használhatók a humán OBM rulajdooségainak és biolögi al aktivitásának értékeléséhez, Szén rekombináns OClF-ok szokásos eljárásokkal megkaphatók, melyek szerint cDká-t ezpresszibs vektorba viszünk be, a cDNS-t állati sejtekben, mint például CHO sejtekben, BHK sejtekben vagy Hsmelus sejtekben, vagy rovarsejtekben expreaazáljak es az empresszált fehérjéket tisztítjuk,
A. következő eljárások használhatók a célfehérjét ködold humán cDFS izolálására (oöbd klónozás)„ Φ Eljárás, amely tartalmazza a fehérje tisztítását, a fehérje parciális amínosav sorrendjének meghatározását és a óéi™ cDNS hibridizációval történd izolálását az aminosav sorrendnek, megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó DhS fregmens próbaként való felhasználásával, Φ eljárás, amely még abban az esetben is alkalmazható, amikor nem. ismert a fehérje aminosav sorrendje, tartalmazza egy cühS könyvtár expresszién vektorban történd elkészítését, a ebbe könyvtár sejtekbe történő bevitelét és a cél-cDNS izolálásához a céltehérje expressziójára történd szűrést (expresszíos klónozás:1 lejárása es Φ a cél humán fehérjét kódold oöÜS humán sejtek vagy szóvetek felhasználásával, készített cbbS könyvtárból való izolálására szolgáló eljárás hibridizáció segítségével vagy polimeráz láncreakció (FCF) alkalmazásával emlősből (embertől különböző) származő fehérjét kódoló oDdü próbaként történd felhasználásával, amely fehérje ugyanazon jellemzőkkel és biológiai aktivitással rendelkezik, mint az emberből származő célfehériox feltételezve, hogy a klónozandó, esfoerbdl származó cDhS a cühS próbával összehasonlítva nagy homológ!svai reudelkezikx Azon. feltételezés alapján, hogy a humán düh cDHS az. egér OBk obbS'Sel összehasonlítva nagy homológ iával rendelkezik, egér OBd cbbS't próbaként segítségévei sejtek vagy OSM cDNS-ből a következe felhasználva Northern hibridizációs eljárás lehetséges annak meghstárczása, hegy mely szövetek termelnek humán OBM~«t» kgér készített eget OBM primer feihasznaiasaval eljárás segítségével humán OBM cDNS kapható. Humán OBM cDNS fragmentumok előállíthatok BOR eljárással humán OSMtermelő szövetekből, mint például humán nyirokcsomókból előállított cDNS, mint templát felhasználásával. Szén humán OBM cDMS fragmenseket próbákként használjuk a fent említett eljárás szerint azonosított humán OBM-termelő sejtek vagy szövetek cDNS könyvtárának szűréséhez. A találmány a humán OBM-et kódoló BMS-re vonatkozik, amely humán OBM jellemzője az OClF-hcz való specifikus kötődés és osteoolastck differenciáciőjat és érését segítő és előmozdítő aktivitást mutat. Mivel a találmány szerinti DNS által kódolt OSM membránkötött típusé fehérje, amely transzmembrán domént tartalmaz, ez a fehérje detektálható OCIF jelölésével és a jelölt OCIF olyan állati sejt felszínéhez való kötődésének vizsgálatával, amelyben a találmsmy szerinti oDMR eapresszálőáott. A fent leírt jelölési eljárás a fehérjék jelöléséhez hagyományosan alkalmazott radioízotöp vagy fluorescin felhasználásáva 1 használható OCIF jelölésére,
A találmány szerinti humán OBM cDNS által expresszáit fehérje molekulatömege meghatározható gélszhréses kromatográflaval, SBS-FAOE eljárással vagy más hasonló módszerrel. A molekulatömeg pontos meghatározása érdekében az SDB-BAOk eljárás használata kívánatos, miáltal a busán OBM redukáló körülmények között hozzávetőlegesen áü.öOö-es {lő.öööin, ööo) molekulatömegü fehérjének mutatkozott,
A találmány szerinti DNS hibridizációjához viszonylag enyhe körölményeket alkalmaztunk, például a DNS-t hagyományos eljárás szerint nylon membránra vittük és ahhoz immobilizáltuk, izotóppal jelölt próba DNS-sei hibrid!záituk hibridizációs pufferoidatban «G-vOÓOos hőmérsékleten körülbelül 2 óra - egy éjszaka időtartamon keresztül, ezt követően 0,5 x SSC-ben. (0,075 M nátriumklorid és 0,0075 M nátrium-cifrát) fS^C-on, 10 peroig mostuk. Konkrétan, nylon membránként Kighbond K-t (Amersham Co,) használtunk, erre vittük fel és ezen immobilizéltok a OBS-t, Ezután ^B-ral. jelölt DNS próbával hibrldizáltuk a DKS-t egy gyors hibridizációs pufferben (Amersham Co,) 650C-on, két órán keresztül, majd ezt követte egy 0,5 x SSC-ben 45°C~on, 10 percig tartó mosás.
Az ST2 egér osteobiast sztrőmális sejtvonalből és egér lépsejbekből álló kokuitűra rendszer, amelyben jelen van a D3-vitamin aktív formája vagy a PTH, jói ismert, osteociast képződéshez való tipikus in vitro tenyészrendszer, Az osteobiast sztrőmális sejtek és lépsejtek adhézíőja. általi kölcsönhatás és egy olyan osteotropibus faktor, mint a Cg-vitamin akt.lv formája vagy a PTH jelenléte az osteoclastok képződéséhez nélkülözhetetlen ebben az in vitro tenyészrendszerben, Ebben az ín vitro tenyészrendszerben a COS sejtek, a majom véséséjbek nem rendelkeznek osteociast képzést segítő képességgel, osteotropikus faktor hiányában a lépsejbektől szerzik az osteoclastok képződését segíts képességet, ha a találmány szerinti cDNS expresszáiődotf, mint ahogy azt az ST2 osteobiast sztrőmális sejtvonai tette* Annak alapján, hogy a találmány szerinti cDNS olyan fehérjét kódol# amely transzmembrán dómén formát tartalmaz, ez a cDNS szekréciós formában vagy ezt a transzmembrán öomént kódoló rész eltávolítása által oldható formában expresszálhatö. Igazoltuk, begy osteotrenikus faktorok hiánya esetén a humán OBM szekréciós formájának a fent említett in vitro ··'> ο tenyészrenösserhez történő hozzáadása esetéi, osteoelastok. tudnak képződni, Ezen eredmények alapján a találmány szerinti eEME által kódolt hunén OEM olyan faktorként adható meg, amely osteoelastok dif ferenciáciöjában. és érésében játszik szerepet.
A rekombinans humán őBh előállítható a. találmány szerinti eOMS expressziös vektorba történő bevitelével, humán OEM expresszíós plazmád előállításával, a plazmld különböző sejttörzsekbe történő bevitelével és az OEM sejtekben történő expresszálásával, Az expresszáiásához gazdasejtokként emlős sejtek, például a CöS-7, a CEO, a hamalua sejtek.
baktériumok, mint használhatók. Ebben
GÉB mint vagy coll például
Bsoheriohia az esetben lehetséges a teljes hosszúságé. öES felhasználásával az OEM membránkötött formájú fehérjeként vagy szekréciós formában vagy a transzmembrán demént ködeié rész el távolításával oldható formájú fehérjeként történő expresszálasa. Az Így előállított rekombináns OEM hatékonyan tisztítható szokásos fehérjék tisztitásához használatos hagyományos tisztítási eljárások, mint . például az affinitás kromatosráfis OClE-immobillzált oszlopok felhasználásával, ioncserés kromstográfia és gélszöréses kromstográéla megfelelő kombinációjával, Az Így kapott találmány szerinti humán OEM hasznos ágens s csoat-metabol1zmus rendellenessége, mint például az osteopetrosis által okozott betegségek kezeléséhez vegy reagensként ilyen betegségek kutatásához ás diagnosztikájához,
A következő szórási eljárások végezhetők el a találmány szerinti EME által kodo.lt OEb fehérje felhasználásával; (X; olyan anyagok szűrése, amelyek a humán OEM expressziőját tudják szabályozni, (2) olyan anyagok szűrése, amelyek specifikusan kötődnek a humán
OBM-hez és gátolják vagy módosítják az OBM biológiai aktivitását, és (3) olyat, humán fehérjék szűrése, amelyek, jelet vannak az osteociast prekurzor sejtekben és a humán OBM biológiai aktivitását közvetítik (barnán OBM receptor). Ezen humán OEM. receptor felhasználásával antagonísták éa agonisták kifejlesztése is lehetséges, A kombinatorikus kémiában a humán OEM vagy humán. OBM receptor felhasználásával antagonísták és agonisták szűréséhez szükséges peptid könyvtárak állíthatók elő ugyanazzal az eljárással, amit az egér OBM felhasználáséval végzett szűréshez használtunk. Fenéid könyvtárak egér OBM helyett humán OBM-mel. történő szűrése esetén kimagaslóan nagy speoifitásü és affinitásé pepiid kapható.
Bár ez az OBM, mint ahogy fent említettük, nagyon hasznos és az OBM koncentrációjának meghatározásához nélkülözhetetlenek az öBM-et speoifikusan felismerd antltestek és ezen antitestek felhasználásával végrehajtott enzim immunoassay, még nem állnak rendelkezésre olyan antitestek, amelyek az OBM koncentrációjának meghatározásához f eIhasznáIhatöak lennének. Ezenfelül az OBM vagy az sOEM biológiai aktivitását semiegesrtd anti-OBM antitest vagy anti-eOBM antitest feitételezhetden elnyomje az OBM vagy söBM aktivitását, konkrétan az osteociast képződés inöukálődáaának aktivitását, Ezek várhatóan hasznos terápiás ágensek a osont-“métábólizmus rendellenességének kezelésére, delieket, mindeddig nem álltak rendelkezésre II yen ant 1.1 e s t e k.
Tekintettel erre e helyzetre, a kiterjedt vizsgálatokat folytattunk. Ennek eredményéképpen a találtunk olyan antitesteket (anti-OBM/sOBM. antitesteket), amelyek mind az osteoclaetogenosls inhihieiés faktorhoz (OCIE) specifikusan kötődd membránkötött, fehérjét, az OBMínhibiciős memhránkdtött fehérjét# amelynek transzmembrán et# mind a szolcbilis Ötébe t (sOBB)# amelynek transzmembrán dóménja hiányzik# felismerik. Bonok megfelelően a találmány olyan antitesteket (anti'OBH/sOBb antitestek} sse.Xgáltat# amelyek mind az osteoolastcganesis faktorhoz (öClFj specifikusan kötődő az OBM-et# mind az eOBM-ef# coménjs hiányzik# felismerik;
szolgáltat továbbá ezek előállítására szolgáié eljárást; ezen antitestek felhasználásával az QBM és aOBd koncentrációjának meghatározására szolgáié eljárást; és a csont-metabelizmos rendellenességének következtében fellépő betegségek megelőzésére vagy kezelésére szolgáló ágenseket.
á találmány olyan antitestekre (anti-OBb/sOBB antitestek} vonatkozik# amelyek mind az eateoclasteganesis innibiclős faktorhoz
1X.1F5 ;pecifikosán kötődő membránkötött fehérjét# az OBM-et# mind a szolobilia ΟΒΜ·~ et (sÖBH}# amelynek transzmembrán dóménja hiányzik# felismerik? vonatkozik továbbá ezek elöáiiitására szolgáld eljárásra; ezen antitestek felhasználásával az ÓBB és aOBM kvantifikálására szolgáld eljárásra; és a neont'' métábólizmos rendellenességének következtében betegségek megelőzésére vagy ágensekre„ fellépő szolgáló kezelésére
A találmány o s t e o el a s t o g e ne s i a r a. kt 1 vitás t ma tat na k # szerinti antitestek az gyorsító aktivitást semlegesítő amely osteoctsstoyenesisb gyorsító aktivitás az ÓBB és sOBd biológiai aktivitása és az antitestek a következő -jellemzőkkel rendelkeznek;
a)olyan goltklonális antitest# amely mind az egér mind az egér sOBd-et felismeri (anti^egér
OBd/sOBd pol1klónális anitest}# ϋ -··>
b)olyan pollklonálie antitest, amely mind a humán OBM-nt, mind a humán sOBB-et felismeri (antiüyman OBH/söBM poXiklonális snüestj,
o)olyan monokionális antitestek, amelyek mind az egér OBfüet, mind az egér sOBB-at felismerik (anti-egér OBB/söBB monokionális anitestok),
d)olyan monokionális antitestek,· amelyek mind a humán OBB™etf mind a humán sOBB-et felismerik (anti-humán. OBB/sOBM monokionális anitestek), és ej olyan antühamán OBB/sOBB monokionális anitestek, amelyek mind az egér OBM falé, mind az egér sOBM felé kerasztreakoiot mutatnak, he olyan poiiklonális antitestet, amely mind az egér QBM-et mind az egér sOBB-et felismeri (ezt követően anti™ egér öBB/sOBH pollklonálie antitestnek nevezve), és az olyan poiiklonális antitestet, amely mind a humán OBB™et mind a nemen sö8B™et felismer: (ezt .Követően anti-humán OBB/söBB poiiklonális antitestnek nevezve) a következő eljárás szerint áiütöttük elő, A tisztított egér ÓBB, amit antigénként használtunk immunizáclőhoz, a fentebb említett eljárás szerint kapható meg. Bővebben, ST2 egér osteoblast sztrömális sejtvonalat a B^-vitamin aktív formájával kezeltünk és a eejtmembránon lévő OBB-et OC1B™ iaraobllizált oszlop és gélszaréses kromatografia segítségével tisztítottuk, igy kaptuk meg a természetes egér GBB™et (natív ÖBBÜ A fent említett egér ÖBM oBNS-t (SEy ID BO 15) vagy humán ÓBB oDES-t ÜEQ ID kö Íz) ezpreesziés vektorba vittük he szokásos módszerek szerint. A rekombináne egér OBB-et (BBO ID BO 1) éa a rakombináns humán ÖBB™st (SBQ ID NO 11) megkaphatjuk a oDNS állati sejtekben, mint például CBÖ sejtekben, BBK sejtekben.
3
Namaiua vagy COS-7 sejtekben, rovar sejtekben vagy Esoherichía coliban való ezpreeszáltatásával, éa ezek a. fent érül tettekkel megegyező tisztitási eljárások felhasználásával való tisztításával, Ezek ipe>unizáciéhöz antigénként használhatok fel, Ebben az esetben az egér OBM vagy humán OEM, amelyek membrán kótótt fehérjék, nagy mennyiségű és nagy koncentrációjú tisztítása sok laboratóriumi munkát igénylő feladat, Másrészről, mint ahogy fent említettük, az OBM-ről, amely egy membránkőtött fehérje és a szolehilis OBM-röi CsOBM) , .amelyet égy n*u\ um c „ ' r >' v m m ' ' co n égy tudjuk, négy majdnem egyformák az pstsogigst differenoiáeidban és érésben ezerepet játszó aktivitásukat tekintve, Az egér sOEM-et és humán sOBM-et, amelyek relatíve könnyen expresszáltatbatök és tisztíthatok nagy koncentrációban, fel lehet használni ismsxnizáciöhoz an t igének kén t, áz egér sOBM-et (SEC 10 NO lé) és humán sOBM-et {BEQ le NO 17) megkaphatjuk égy, hegy más szekréciós fehérjéből származó ismert szignál szekvenciát kódold nukleotíd szekvenciát holdunk az egér sOBM cDNS (SBQ 10 HO 18), illetve a humán sOBM oOMS {SBQ 19 NO 19) 5’ végének felső szakaszához, ezeket génmanipulációé technikák felhasználásával expressziős vektorba visszük, kifejeztetve ezáltal ezen fehérjéket olyan gazdasejtekben, mint például különböző állati sejtek, rovar sejtek vagy Esoherichía coli, és az igy kapott termékeket tisztitjuk, Az igy kapott imrnunizáciöhoz való antigéneket foszfáttal poffezeit kcnyhasöoldatban (BBS) feloldjuk, amennyiben szükséges, az oldat emuigeálása. céljából ugyanekkora térfogate Ereund-féle komplett hatásjavítóval keverjük, es szubkután módon adjuk be az állatoknak körülbelül hetente egyszer az állatok többször történő immun!záláeához,
Amennyiben az antitest titer eléri a maximumot, egy emlékeztető injekciót adunk be, Az emlékeztető injekció beadását követe 10 nap múlva vesszük le a vért. Az Így kapott antiszéramot ammőnium-szulfáttal kicsapatjuk, Az IgG frakciót anioncserélő kromatográfia vagy protein-A” vagy proféin-G-Sepharoee osz.lopkromafcográf ia felhasználásával tisztítjuk, miután kőfcc pufferrel (Binding Buffer^, Biorsd Co,) kétszeresen hígítottuk az antiszéramot, igy kapjuk az antí-egér vagy anti-humán OBM/sOBM po1i kiónál1a antitestet,
A találmány szerinti mencklcnális antitestek a következő eljárás szerint kaphatók meg, dgyanúgy, mint a poriklónális antitestek esetében, természetes egér OBb-et (natív OBM), rekombináns egér vagy humán OBM-et, vagy rekombináns egér vegy humán sO8M~et lehet immunogénekként felhasználni mencklcnális antitestek előállításához. Szokásos eljárásokkal hibridőmékát állítunk ele emlősök ezen antigénekkel való immunizálásával, vagy limfociták in vitro isszunizálásával es az immunizált sejtek mielőma sejtekkel történő fuzionáláséval, Az igy kapott hibridemé tenyészet íeldlúszóját szilárd fázisú BL1SA eljárással analizálva. kiválasztjuk az alaposan megtisztított antigéneket felismerő antitest termelő hibridómákat. Az Így kapott hibridómákat klónozzuk és megállapítható, hogy ezek. stabil. antitesttermelo hibridemé klónak, Ezen hibridómákat antitest termelés céljából növesztjük, Kis emlősöket, mint például egereket vagy patkányokat használunk általában hibridőmák előállításához. Az állatokat ügy immunizáljuk, hogy megfelelő oldószerben, mint például a fiziológiai sóoldat, megfelelő koncentrációra hígított antigént intravénásén vegy intraperitőniásan injekció formájában beadunk. Esetleg az antigénnel. együtt használható a Ereund-féle komplett hatásjavító. Ezeket általában hárem-négy alkalommal .injektáljuk, hetente egyszer vagy minden két hétben. Hárem nappal, aa utolsó immúnisáéi.6 után aa Immunizált állatokat felkoncoljuk. A kivett lépből szármaad splenoeitákat használjuk immunizált sejtekként. Az immunizált sejtekkel történő fúzióhoz való egér mielőma sejtekként a p3/x63™ AgS, a p3-dl, az ES-1, az MPC-.11, aa SP-2/0, aa Fö, a P3x63 Ag8.653, és az SÍ 94 adhatók mag, Patkány bői s a ár mázé sejtként az olyan sejtvonal, mint aa E-21Ö adható meg. Humán antitesteket humán B-iimfooitak in vitro immunizálásával állítunk elő és aa immunizált sejteket humán mielőma sejtekkel vagy EB vírussal transzformált sejtvonailal fuzionáljuk. Az immunizált sejtek és mielőma s e j t e k. f ű z i ő j á t s z o ka a os e 1 j á r a s o k a 1 a p j á η 1 e h e t elvégezni, mint a például Koeh.ler ás Mid.stein-íéLe eljárás (Koehler és mtsai.i Hature 256, 495-497 (1975}).
Elektromos pulzust használd eljárás is alkalmazható. Az immunizált limfooitákat és mielőma sejteket a szokásos, elfogadott arányban összekeverjük és egy olyan ECS-néiküli (magzati horjúszérum nélküli} tenyésztápközegben fuzionáljuk, amelyhez polietílén-giikolt adtunk, és egy EüS-tartalmn HAT szelekciós tápközegben növesztjük őket, hogy kiválasszuk a fuzionált sejteket (hibridőmákat}. A, következő lépésben szokásos antitest felismerő eljárás, mint például ELISA, plakk-technika, Ouchterlony-el j árás vagy aggregáelös módszer segítségével kiválasztjuk az antitest termeld hibridőmákat, hogy stabil hibridőmákat kapjunk, Az ilyen mádon <' d^ ' ,\a szerint szokásos növesztés! eljárás segítségével másodlagosan növeszthetjuk vagy fagyasztva tárolhatjuk. Hihridömát szokásos eljárás segítségével , növeszthetünk, hogy a. tenyészet fsialúszőját összegyíij fsuk, vagy emlősök hasüregébe ültethetjük, hogy a hasüreg! fluidomból megkapjuk az antitestet. A tenyészet flnidnmában vagy a hasnregi folyadékban lévő antitestet olyan szokásos eljárás szerint tisztíthatják, mint a kisőzas, ioncserélő és géiszüréses kromatográfia vagy protein-A- vagy proteinG affinitás kromatográfia. Antigénként sOBb felhasználásával kapott szinte mindegyik monok.ionálie antitest specifikusan fel tudja ismerni nem csak az sOBbet, hanem az OBM-et is (az ilyen antitesteket azt kővetően anti-OBb/sOBb monoklonális antitesteknek fogjuk nevezni). Szén antitestek felhasználhatok az OBb vagy sOBb kvantifikáiására. Az OBb vagy sOBb mennyisége kvantifikáíhatő ezen antitestek radioizotőppal vagy enzimmel való jelölésével és a jelölt antitestek radioimmunoassay (RIA) vagy enzimimmnnoassay (ΒΊΑ) néven ismert kvantifikáoiös rendszerekkel való vizsgálatával. Bzen kvantiflkáciés rendszerek felhasználásával biológiai mintákban, mint például vérben vagy vizeletben könnyedén meghatározható az sOBb mennyisége nagy érzékenységgel». Továbbá ezen antitestek felhasználásával végzett kötődési assay segítségévei nagy érzékenységgel könnyedén mérhető a szövethez vagy sejtfelszínhez kötődő OBb,
Amennyiben emberek gyógykezelésére használunk antitestet, kívánatos, hegy humán-típusa anti-humán OBb/sOBb antitestet használj nnk tekintettel az antigen!fásra. A humán-típusa anti-humán OBb/sOBb antitest előállítható a következő Φ, Φ vagy Φ eljárások alapján. Az Φ eljárás szerint humán perifériális vérből vagy lepböi gyűjtött, humán limfooitákat fmsmnizálnnk Ih-á jelenlétében humán OBb. vagy humán sOBb antigénnel. Az igy kapott immunizált humán limfooitákat KöR6/B5-tei (ATCC CRL1823) fuzionáljuk, amely egér és ember heterohlbridömája, és szűrjük, hogy hozzájussunk a célantitestet termelő híbridömákboz, Az igy kapott antitest-termelő hibridőmák által termelt antitestek humán típusú suti-humán OBM/aOBH monoklonáiis antitestek, Ezen antitestek közül karölnek kiválasztásra a humán ÖBMZs'ö'BM aktivitását semlegesítő antitestek, Ennek ellenére humán limfocitsk in vitte immun! tálasának möds záré vei általában, nehéz antigén fala nagy affinitást mutató antitestet előállítani, Ezért annak érdekében, hegy humán OEM és söBb felé nagy affinitást mutató monokínnális antitesteket kapjunk, szükséges, hogy a fenti eljárás segítségével kapott humán típusé anti-humán OBM/sOBB meneklonális antitestek affinitását megnöveljük. Ez a következő eljárás alapján végezhető el. Először egy humán típusú anti-humán OBd/sOBH monoklonáiis antitest CEE régiójába (pontosabban a CDE3 régiójába) véletlenszerű mutációt viszünk be, ami semlegesíti az OBH-et, de alacsony az affinitása, és a fágot a fehérje enpresszálasára készteti, A ragokat, amelyek képesek a humán OÜM/sOSM-hez erősen kötődni, fágmegjelenltési. eljárással kiválasztjuk olyan lemezek segítségével, amelyeken humán OBM/sOEH antigéneket irzsobi 11 zártunk. A kiválasztott fásokat Esoherichie coliban növesztjük. A nagy affinitást mutató COR aminosav szekvenciá. ját a tágban klónozott BBS nukleotid szekvenciájából meghatározzuk. Az Így kapott humán típusú anti-humán OBb/sÖBA monoklonáiis antitestet kódoló DNS-t omlós sejtekhez általánosan használt expressziös vektorba visszük a humán trpueü anti-humán OBN/sőBN monokionális antitestek előállítása. céljából, A nagy affinitást mutató éa a humán OBN/sOBM biológiai aktivitásának nemiégésitésére képes cél humán típusú anti-humán OBM/sOBM monoklonáiis antitestek ezen monoklonáiis antitestek közül választhatók ki, A © eljárás szerint egér típusú, antihumán OBM/sOBH monoklonélis antitesteket állítunk elő ugyanazon síédszer szerint, mint a jelen találmányban,
BALB/o egér felhasználásával (Koehier és mtsai.: Natúré 256, 495-49, 1975), és kiválasztják az olyan monokionáiis antitesteket, amelyek semlegesíteni tudják a humán OBM/sOBM biológiai aktivitását és nagy affinitást mutatnak. Ezek a nagy affinitása egér anti-humán OBH/sOBN monokionáiis antitestek humán típusúvá alakíthatók CDRátültetés eljárás {Wlnter és Milstein: Natúré 349, 293299, 1991; felhasználásával oly módon, hogy ennek CDs regiéit (CDE '1, 2 és· 3) a humán IgG GDP régióiba ültetjük. A 0 eljárás szerint humán perifériális vér iimfocitákat ültetünk be súlyos, kombinált immnnhiányos (SÓID) egérbe, Mivel az implantáit SCID egér humán antitesteket tud termelni (Mosier D. ,E. es mtsai,; Natúré 335, 256-259,
1988; Duohosal M. A, és mtsai,: Natúré 355, 253-262,
1992), ezért humán öEM-mei vagy sOSb-mel immunizált SCID egér szűrésével humán OBM/sOBM-re specifikus humán monokionáiis antitesteket előállítani képes iimfocitákat lehet összegyűjteni, A fent ismertetett humán antitestekre vonatkozó © eljárásban leirt módszer szerint fuzionáljuk az Így kapott iimfocitákat K6H6/B5-tei (ATCC CB.EI823), amely egér és ember heterohibriöőméja. Az igy kapott hibrldómákat szűrjük, hogy olyan hibrldómákat kapjunk, amelyek a cél humán monokionáiis antitesteket tudják termelni, .Az igy kapott hibrldómákat nagy mennyiségű cél humán monokionáiis antitest termelése céljából növesztjük. Az antitestek a fent említett tisztítási eljárással tisztíthatok. Lehetséges továbbá rekombináns humán mon o ki ο n a 1 i s a n 111 e s t n a g y me nny i s é gb en t. ö r t. é n o előállítása a cél humán monokionáiis antitestek termelésére képes hibridömából történd oDNB könyvtár előállításával oly módon, hogy a cél humán típusú monokionáiis antitesteket kódoló gént (ODNS) klónozással előállítjuk, ezen gént megfelelő erpressziös vektorba génmanipnlácíős technikák segítségével bevisszük ée a gazdasej tekben# mint különféle állati sej tekben# rovarsej Lekben vagy Escherichía coliban a monoklonális antitesteket enpresszáijuk, Nagy mennyiségű tisztított humán monoklonális antitest megkapható úgy# hogy ez előbbiek során kapott tenyészet íelnlűszójábői a fent említett tisztítási eljárások segítségévei tisztítjuk.
Az OBM/sOBM biológiai aktivitását semlegesíteni tudó antitestek megkaphatok ezen eljárás szerint előállított anti“OBM/sOBM monoklonális antitestekből. Az OBM/sOBM biológiai aktivitását semlegesítő antitestek hasznos ágensek lehetnek a osont-metabolizmus rendelienességenek kezelésére vagy megelőzésére az OBM/sOBM biológiai aktivitásának in vivő blokkolásának képessége által# konkrétabban az osteoclast. képződés indukciójának megelőzésére való képessege által. Az anti-OBM/sOBM antitestek az OBM vagy sOBM biológiai aktivitását semlegesítő aktivitása mérhető az osteooiast képződést gátló aktivitásának ín. vitro rendszerben történő meghatározásával. Részletesebben# a következő ín. vitro ostsoolastogenesis tsnyészrendszsr adható meg: Φ az ST2 egér osteoblast sztrőmális sejtvonal és egér lépsejtek kokul túra rendszere# amelyben jelen van a D3-vitárnán aktív formája és a. dezametazon#· © egy olyan kokuitűra rendszer# amely tartalmazza az OBM-et expresszáió COS··'? majomvese sejtvonalatf az OBM-et ezpresszáió sejtek formaldehiddel történő immobiiizáiását és ezen sejteken egér lépsejtek növesztését M-GSE jelenlétében és Φ egér lépsejtek tenyészrendszeret # amelyben rekombináns sOBM és M-CSE van jelen. Az snti-OBM/sOBM antitestek osteoolastogenesist gátló aktivitása s.oti'-OBM/sOBM. antitestek ezen. tenyészrendszerekhez különböző konoentrációkban történő hozzáadásával és az osteoclast képződésre kifejtett hatásuk, vizsgálatával, mérhető. Az anti~-OBM/sOBM antitestek osteociastogenesiet gátló aktivitása vizsgálható továbbá a esőn t-reszorpoiőt gátló aktivitásuk mérésével kísérleti állatok in vivő felhasználásával. Főképpen eltávolított petefészkű állati modell adott olyan állati modellként, amely progresszív osteoclast képződéssel rendelkezi k. Az anti-OBM/söBM antitestek osteocisstogenesist gátló aktivitása meghatározható az ant 1—08MZ sOBM antitestek Ilyen kísérleti állatoknak történő beadásával és a csontképzodes visszaszorítottságának (csontsűrűséget növeld aktivitás) számszerűsí lésével.
Az OBM/sOBM biológiai aktivitásának semlegesítésére képes ilyen módon kapott antitestek hasznosak gyógyszerészeti készítményekben, különös tekintettel csent-métábólizmus rendellenességének megelőzéséhez vagy kezeléséhez való gyógyszerészeti készítményekben, vagy i .1 ye n b e t e g s é ge k í mmun o 1 6 g i a i d i a gn ó z 1 s a h o z antitestekként, A jelen találmány szerinti antitesteket lehet beadni. Az ilyen készítmények embereknek vagy állatoknak biztonságosan beadhatók olyan gyógyszerészeti készítményekként, amelyek az egyik aktív komponensként az ÖBb-et és/vagy sOBM-et felismerő antitesteket tartalmazzák. A gyógyszerészeti készítmények formáiként az intravénás cseppet magukba foglaló injekciós ágenseket, kúp-ágenseket, nyelv alatt használatos ágenseket, bőr alatti abszorpciós ágenseket és hasonlókat adunk meg. Mivel a cklonális antitestek makromolekuiaris fehérjék, nemcsak mennyen tapadnak az üvegedényhez, mint a fiolához vagy fecskendőhöz, hanem fizikokémiaá faktorok, mint a hőmérséklet, pH vagy nedvesség hatására könnyen denatarálődnak. Azért a készítményeket stabiiízátcrok, pHbeáilitők, pufferelő ágensek, szoiubiiizálő ágensek vagy
4.1 detergensek hozzáadásával szükséges stabilizálni, Stabilizétorokként smincsavak, mint a glicin és alenin, szacharinok, mint a deztrán 40 és a cukoralkoholok, mint a szőréitől, manóitól mannőz és és xxütoi adhatók meg, nettó vagy hozzáadandó üzen stabilizátorok akér egyenként, akár több kombinációjában használhatók, A stabilizáiorok mennyisége előnyösen az antitest mennyiségének 0,öl-szorosától lOö-szoros, még előnyösebben 0,l-szeresétől lö-szeres mennyiségig terjed. Ezen stabíüzátorek hozzáadása megnöveli a folyékony készítmények vagy iicfiüzált termékek tárolási stabilitását, Faiterelő ágensekként megemlítjük például a foszfát paffereket és a cifrát puffereket, A. pofterelő ágensek nemmsak a liofiiizáit termékek visszsoldosakor kapott folyékony készítmények vagy vizes oldatok pHértékét állítják be, hanem az antitest stabilitását és oldhatóságát is növelik. Kívánatos, hogy a puffereié ágenst akkora mennyiségben adjuk a liofiiizáit termékből készített folyékony készítményhez vagy vizes oldathoz, hogy ennek koncénirániéja ImM-tói lOmM-ig terjedjen, Detergensre példákként a Foiiselbate 20-st, a Fulluronic F-őB-at és a pclietilén-gilkolt emeltjük. Különösen előnyős például a Foiiselbate 30, üzen detergenseket akár egyenként, akár kettő vagy több kombinációjaként lehet használni, A makromolekuláris fehérjék, mint például az antitestek, könnyen tapadnak az üvegedényekhez, Liofiiizáit termék visszaolöásával előállított folyékony készítményben vagy vizes oldatban lévő antitestek edényhez való tapadása, megelőzhető ilyen detergensek 0,Oöl-l,0%-os koncentrációban való hozzáadásával, A találmány szerinti antitesteket tartaimazö készítmények megkaphatók stabilizé torok, pufferelő ágensek vagy adszorpciót gátlő ágensek hozzáadáséval, Amennyiben. a készítményeket gyógykezelésre vagy állatok esetében basznál jak injekciós ágensként# az ilyen injekciós ágenseknek előnyösen 1-töi 2-ig terjedő ozmotikus nyomán aránnyal kell rendelkezniük. Az ozmotikus nyomás arány a készítmény előállítása során a náhrinm-klorid mennyiségének növelésével vagy csökkentésével állítható be. Égy készítményben az antitest mennyisége a betegségtől# a beadás módjától és hasonlóktól függően megfelelően beállítható, bmberek száméra a hamsa antitest dózisé változtatható az antitest humán OSM/eöBM fele mutatott affInitásának függvényében# különösen a humán OBM/sOBM disszooisoiés konstansának (Kd érték) függvényében. Minél nagyobb az affinitás (vagy minél kisebb a Kö érték)# annál kisebb dózist kell ez embernek beadni ahhoz# hogy egy bizonyos gyögyhatást elérjünk. Mivel egy humán-típu^ű' antitest a vérben hosszú# 20 napos féléiétidővel rendelkezik# elegendő ezt embereknek körülbelül ö#1-100 mg/kg dózisban egy 1-30 napos periódusban egyszer vagy többször beadni.
Az 1, ábra a 3, példában kapott# találmány szerinti egér OBM fehérje SDS-EAGB vizsgálatának eredményét mutatja,
A jelölések magyarázata;
(A) : 1, sáv; molekulatömeg mar kerek
2. sav; ügy részlegesen tisztított minta (Giy™
HC1 (pH 2# 0 ) elúöies f rakció) # amit D;#vitamin aktív formájának és deeametazonnak a jelenlétében növesztett ST2 sejtekből képiünk.
3, sáv; Egy részlegesen tisztított minta {olyhül (pb 2#ö) elnelos frakció)# amit tavi tamin aktív formájának ás dezametarosnak a hiányában növesztett FT2 sejtekből kaptunk, (B) : 1, sáv: mól ekei a tömön markerek
2. sáv: A találmány szerinti egér OBM fehérje a fordított fázisú nagy hatékonyságú f ο1yade kk roma tog ráf1 áva1 va 16 trést11áa után (3, példa),
A 2, ábrán a 4, példa szerinél, a jelölt OCIF
ST2 osteoblaat aztromális sejtekhez való kötődését vizsgálő aaaay eredménye látható,
A 3. ábra az 3,(1) példában említett különböző generációkból származő ST2 osteoblast sztrömális sejtek osteoclast képző képességét mutatja,
A jelölések magyarázata:
1: A körülbelül 10. szubkultúrából származó STz sejtek azon képessége, hogy az oeteoeiast képződést segítik,
2: A körülbelül 40, szubkultúrából származó ST2 sejtek szón képessége, hogy az ostooelsst képződést segítik,
A 4, ábra az 3,(2) példa szerinti, D3-vifamin aktív formája éa d.ezametazon. jelenlétében növesztett osteoblast szitáméi is sejtek sejtmembránján lévő találmány szerinti fehérje expressz16jártak időbeli változását mutatja.
Az 3, ábra az 3,(2) példa szerinti, a kokultúra rendszerben végbemenő osteoclast képződés időbeli változását mutatja,
A 6, ábrán az 5,(2) példa szerinti, OülF™fal történt kezelés esetén az osteoolast képződésre kifejtett inhibiclós hatás látható különböző tenyészperiődusokhan s kokultúra periódus során.
A ?. ábra a 6. példában említett iá“I~t®l jelölt OCIF és a találmány szerinti fehérje keresztketés tesztjének eredményeit szemlélteti.>
A jelölések magyarázata:
1, sáv: ^b-jeiöit OC1F--CDD1
2, sáv: '-jelölt OCIF-'-CDDl 8T2 sejtekkel keresztkötve
3, sáv: keresztkötött UV“jelölt OC1F-CDD1 jelöletlen OCIF föö-szores feleslegének a jelenlétében.
A 8. ábra a 9, példa szerinti. SDS-FAGE eredményét mutatj a,
A jelölések magyarázata:
1, sáv: pOBMOSI-gyel transzíeklált COS-7 sejtek fehérjéi, amelyeket immunepreclpitáltunk OCIF hiányában..
2, sáv: pOBbkal-gyel transzfektált COS-7 sejtek fehérjéi, amelyeket ixmaunopreelpitáltank OCIF jelenlétében.
A 9. ábra. a. lwI-teI jelölt OCIF pOBM231~gyel transzfektált COS-7 sejtekhez való kötődési képességének v1z sgá1a tána k e redménye11 mu tat j a.
A jelölések magyarázata:
1. és 2. sávok; a pOBM291-gyel traxxsz fektéit COS-7 sejtekhez kötődő ^I-fe! jelölt OCIF mennyisége,
3, és 4. sávok: a pöBM291-gyel transzfektált COS-7 sejtekhez kötődé ^°I-tél jelölt OCIF mennyisége iöö'-'szeros feleslegben jelen léve jelöletlen OCIF eseten,
A 10. ábrán, a 11. példában említett ·;?ΐ7·Ζο1 jelölt OCIF felhasználásával végzett keresztkötési teszt e redmé n y e Iá. t ha t ö«
A jelölések magyarázata.;
1, sáv; ;'^X-rei jelölt OCXF,
2, sáv; ;-F-tel jelölt OCXF pOBM291-gyel transzéaktáit
COS·-7 sejtekkel keresztkötve,
3, sáv; 'íí;>X-tsÍ jelölt OCXF pOBMz91 -gyei transzfaktáit
COS-7 sejtekkel keresztkötve 400-szoros feleslegben jelenlévő jelöletlen OCXF esetén,
A XI, ábra a 12. példában kapott Borthern Blott eredmenyét -mutatja.
A jelölések magyarázata;
1, sáv: olyan ST2 sejtekből származó FBS, amelyeket Dvitamin és dexametazon hozzáadása nélkül növesztettünk,
2, sáv: olyan STz sejtekből származó ABS, amelyeket D~ vitamin és dexametazon hozzáadásával növesztettünk,
A 12, ábra a 14.(2) példában közölteket szemlélteti, a kondicionált tápközegben, lévő fehérjék. OCXF kötő képességét mutatja különböző OCIF koncentrációk esetén,
A jelölések .magyarázata.;
O: pCFFá #; pCEF sOBM
A 13, ábra a 13.(2) példában leírtakat szemlélteti# a. kondicionált tápközegben lévő fehérjék OCXF kötő esetén.
A jelölések magyarázata; Oj pCFFi pCFP sOBH
A 14, ábra a 14,(2) példában leirt SOS-PAGE vizsgáia tnak az eredményét mutatj a, amelyet faoherlehía coliban expresszáit euer OBM-et és tíeredoxint tartalmazó f ú z i ő s £ e hé r j é v e 1 vé g e z t ü n k,
A jelölések magyarázata:
1, sáv; molekulatömeg mar-kerek
2, sáv; 01721ZpTrxFus-böl származó oldható fehérje frakciók,
3, sáv: GI724/pTrxOBM2S-höl származó oldható fehérje frakciók,
A 15. ábra különböző arányú oldható fehérje frakciók eseten matatja az OCIF-kötö képesseget a 14.(3) példában leírtak alapján.
A jelölések magyarázata:
□: 017 2 4 / pl r x fa s
Ö; G1724/pTrxOBM25
A 16, ábra az oldható fehérje frakciók (1%) OCIF-kötő képességét mutatja különböző OCIF koncentrációk esetén a
14. (3} pé1da a1ap j án.
A jelölések magyarázata:
D: G2724/pTrxFus
-O: 01724/pTrxOBMGö
A 17, ábra a találmány szerinti egér OBM cBNS expresszlőja során kapott egér OBM OClF-hox való specifikus kötődésének gátlását mutató ereőményeit és a természetes OCIF-kefő fehérje nyúl anti-egér OBM antitest segítségével történő tisztítását ábrázolja,
A jelölések magyarázata;
1; A cDhS antitest, ÓBB x ^I-OCIF jelenlétében való expresszálása által előállított tisztltotfc ÓBB,
2; Az antitest. x ^.I-QCIF jelenlétében a természetes fehérje.
3; A cDHS antitest, egér OBM x ;'&1-OC1F hiányában, való expresszálása. által előállított egér OEM,
4; Az antitest X i<;í5I-OCIF hiányában a természetes fehérje,
5: 3 x jelöletlen. OCIF (a ''^T-OClF-hoz képest 400-szoros mennyiségben).
6: 4 x jelöletlen OCIF (s -OCIF-hoz képest 400-szoros mennyiségben).
A 18, ábra a találmány szerinti cDNS által expresszált humán OEM fehérje SDS-PAGB vizsgálatának az eredményét mutatj a,
A jelölések magyarázata;
1, sáv; moiekulaxémeg markerek
2, sáv; phOBB-mei transzfektált COS-? sejtek (olyan expressziös vektor, amely a találmány szerinti cCHS-t tartalmazza; fehérjéi, amelyeket OCIF hiányában nyúl anti-OClF poliklonális antitesttel i mmu np r e c i p ,i t á 1t un k, .3, sáv; phOEB-mel transzfektált COS-? sejtek (olyan expressziős vektor, amely a találmány szerinti cöHS-t tartalmazza) fehérjéi, amelyeket OC.1F jelenlétében nyűi anti-OCIF poliklonális antitesttel immunprecipitáitunk,
A 19, ábra az OCIF olyan phOEM-mel transzfektált COS7 sejtekhez velő kötődésének vizsgálatai eredményét mutatja, amely sejtek a találmány szerinti cDBS.....t tartalmazó expressziős vektorok.
A. jelölések magyarázatéi '1, sáv: phOBM-mel transz fektéit COS-7 sejtek és U:sX“OCXF hozzáadása♦
2. sáv: phöSb-mel transzfektált COS-7 sejtek és ^I-OCIF hozzáadása 400-szöros mennyisége jelöletlen OCXF jelenlétében,
A 20 > ábra a humán OBM AÍ'd-<>CTF~otal végzett (monomer ' ' ' \e os m ' n c? : ο, x · v n <n \
OBM a találmány szerinti cDNS állal ködeit fehérje,
A jelölések magyarázata:
1, sáv: n5I™OCIF
2, sáv: A '^I-ÖCIE phOBM-mel transzfektált COS-7 sejtek membránján lévő fehérjékkel véghezvitt keresztkötések során kapott termékek,
3, sáv: A ^I-OOE phOBM-mel transzfektált COS-7 sejtek membránján lévő fehérjékkel véghezvitt keresztkötések során kapott termékek 400~szoroa mennyiségű jelöletlen OCXF jelenlétében.
A 21, ábra a 24,(2) példában közölteket szemlélteti, a fehérje (szekretert formájú hOBM) OCIF-kötö kapacitását mutatja a kondicionált tápközegben, különböző OCXF koncentrációk esetén.
A jelölések magyarázata:
O: olyan pCEF4-gyei transzfektált 293-EBFA sejtek kondicionált tápközege, amely nem tartalmaz olyan cDNS-t, amely a szekretált formájú humán OBM-et kódolja, ♦; olyan pCFFshöBM-mei transzfektált 293-F3NA sejtek kondicionált tápközege, amely tartalmaz olyan cBNS-t, amely a szekretált formájú humán OBM-et kódolja.
5
A 22, ábra a 23,(2) példában leírtakat szemlélteti, a fehérje (azekretáit formájú humán OBM) OCIE-kötő kapacitását mutatja a kondicionált tápközegben agy specifikus OCIF koncentráció esetén, mig a hozzáadott kondicionált cápkezeg mennyiségét változtattuk,
A j e 1 ο I é s e k ma g y a r á z a t a :
O: olyan pCEPi-gyel transzfektált 293-~ESFA sejtek kondicionált tápközege, amely nem tartalmaz olyan cDNS™'t, amely a szekretert formájú humán öBh-et kódolja.
olyan pCEPshOBMmnel transzfektált 293-SBNA sejtek kondicionált tápkózege,· amely tartalmaz olyan cDNS-t, amely a szekretert formájú, humán OBb-et kódolja.
A 23, ábra az Escherichia coliban expresszált humán GBEmet és ticredckint tartalmazó fúziós fehérje SDS---PAGE vizsgálatának eredményét mutatja,
A jelölések magyarázata;
1, sáv: molekulatömeg markerek
2, sáv: Escherichia coli G1724/pTrxEus~bó,i származó oldható fehérje frakciók,
3, sáv: Escherichia coli GI724ZpTrxhOBM-ből származó oldható fehérje frakciók,
A 24, ábra a 24,(3) példában leírtakat szemlélteti, a humán OBM--et és tioredoxint tartalmazd fúziós fehérje OCIF felé mutatott OClF-kötö képoaségét mutatja abban az esetben, amikor az Escherichia coliból származó oldható fehérje frakció mennyiségét, beleértve a hozzáadott, fúziós fehérjét, változtattuk,
A jelölések magyarázata.;
O; FaCheriebia coli G17 24/pl rxFus··· bői származó oldható fehérje frakciók.
·: Escheriehia coli GI724/pArxshOBM-bŐl származó oldható fehérje frakciók,
A 25, ábra a 24,(3} példában leírtakat szemlélteti, a humán GBM-et és tioredoxint tartalmazó fúzióé fehérje OCXF felé matatott, Escheriehia coliból származó oldható fehérje frakciókban meglévő OCIE-kötö képességét mutatja különböző koncentrációk esetén,
A j elölé s e k mag ya r á z a ta:
ö: Bscheriohia coli G1724/pTrxEus-bol származó oldható fehérje frakciók, •í Escheriehia coli GX721/pTrxshÖSM~böl származó oldható fehérje frakciók,
A 2é. ábra a humán OEM és humán söSM kvantifihálásának eredményét mutatja, amelyet szendvicsΕΧΑΒΑ eljárással végeztünk a találmány szerinti nyűi antihumán OBB/sOBM poliklónális antitest felhasználásával,
A j e I ő X é s e k ma g y a r á z a t a:
□; Humán OBM •: Humán sGBM
A 27, ábra a humán ÖBB és humán sOBM kvantifixálásának eredményét mutatja, amelyet szendvicsEiASA eljárással végeztünk a találmány szerinti anti-humán OBM/sőBb monokionáiis antitestek felhasználásával,
A jelölések magyarázata:
□ ; Humán (IBM •: Humán sOBM
A 22, ábra a egér ÓBB és sOBB kvantifikálásának eredményét mutatja, amelyet szendvfos-EXASA eljárással végeztünk a találmány szerinti anti-humán OEM/sOEM monoklonális antitestek felhasználásával, amelyek keresztreakcióba lépnek az egér OBM-mei és sOBb-mel,
A jeleiének magyarázata;
□: Humán OBb >: Humán sOBM
A 29. ábra az egér OBb-et és tioredo.zint tartalmazó fúzióé fehérje humán osteoolast-szeru sejtek képződésének stimulációjára irányuló aktivitását mutatja,
A 30, ábra az anti-OBH/sOBb antitest vitamin által stimulált csont-reszorpcíés aktivitásra gyakorolt gátlását mutatja.
A 31, ábra az anti-OBA/sOBb antitest prosztagiandinfb (PGBA által stimulált csont-reszorpciős aktivitásra gyakorolt gátlását mutatja,
A 32, ábra az anti-OBb/sOBb antitest parathyroid hormon (PTHj által stimulált csort-reszorpciős aktivitásra gyakorolt gátlását mutatja,
A 33. ábra az anti-OBb/sOBb antitest interieukin .1 α (11,-1) által stimulált onont-reszorpcids aktivitásra gyakorolt gátlását mutatja.
A találmányt a továbbiakban példákon keresztül ismertetjük részletesen, azonban az oltalmi kór nem korlátozódik ezekre a példákra.
A találmány szerinti fehérje előállítása ( 15 S12 sejtek nagyarányú termelése
Az ST2 egér osteoblast sztrőmális sejtvonalat (kiken Sejtbank RCÜÜ224) 10% magzati borjúsaérumot tartalmazó aMEM felhasználásával növesztettük. Egy 225 cm^-es tapadó sej ttenyészet szolgáló T~edénybe összefolyásig' növesztettünk ST2 sejteket és ezeket tripszinnel. kezeltük és a T-edényböl arattunk. Mosás után a sejteket öt darab 225 csd-es l-edenybe vittük át. Miután 60 mi ICT* M aktiv formájú D3-vitamint (kaloítríol)# 10'' M dexametatont ás
10% magzati borjűszérumot tartalmazó a~MEM~et hozzáadtunk# mindegyik edény sejtjeit 7-10 napon keresztül növesztettük Cö3'inkubátorban, Az igy növesztett ST2 sejteket sejtkaparó felhasználásával arattuk és felhasználásig ~ 8fbC~on táró1tűk.
(2) A membrán__frakció előállítása és a membránkötott fehérjek _s zο1ubilizalása
Az 1,(17 példában leirt ST2 sejtekhez (körülbelül 12 ml térfogat)# amelyeket nyolcvan darab 225 czh-es l-edény felhasználásával növesztettük# háromszoros térfogatú (36 mi) proteáz inhibitorokat (2 mM APMSEE# 2 mM EDTA# 2 siM ofenantrolin# 1 r;M ieupeptin# 1 pg/mi pepstatán A és löö egység/ml aprót inin) tartalmazö lömM lris-~HCi pufiért (pH 7# 2) adtunk. 50 másodperces erőteljes# vortex keverövel végzett, keverés után a sejteket 10 percig jégen hagytuk. A sejteket homogén!zátor (Dounoe Tissue örinder# A. fecskendő# Mheaton Soientiflc Go. ) felhasználásával homogenizáltuk, A homogenizált sejtekhez ugyanakkora térfogatú (48 ml) olyan 10 mM Tris-HCi puffért (pH 7# 2) adtunk# amely tartalmazta a fent említett proteáz inhibitorokat, 0,5 M szacharózt, 0,1 M kálium-kioridot, 10 mM magnézium-kioridot ás 2 mM kalcium-kloridot. Hevertetes után az elegyek 000 x g-vei 10 percen át 4öC~on centrifugáltuk, ezáltal elválasztva csapadékként a sejtmagokat és a nem-homogenízált .sejteket. A centrifugálás által kapott felülúszót 150.000 x ó-vei 90 percen át 4®C-on centrifugáltuk, hogy az STz aejtek membrántrakciőit csapadékként megkapjuk. Ehhez a metibránfrakelőhoz 8 ml olyan 10 mM Tris-HCl puffért (pH 7,2) adtunk, amely tartalmazta a fent említett proteáz inhibitorokat, 150 mM nátrium-kioridot és 0,1 M szacharózt. 200 μΐ 20%-os CHAPS (3“[i3-chdla.midcpropil) ~ áimetii.amonio]-l~propánszulíonát, Sigrna Co.) hozzáadása után az elegyek 2 órán keresztül 4*0-on kevertettük. Ezt követően a keveréket 150.000 x g-vel 60 percen át 4*C-on centr i. f uga 1 tok, dog y a szó iubi I. 1 z á 11 membrán f r a ke í ót feiüi.ászáként megkapjuk.
A találmány szerinti fehérje tisztítási!
(1) Az OCIE-Ímmobiiizált affinitás oszlop elkészítése
Miután a HiTrap EHS-aktsvait oszlopon (1 ml, a Pharmacia Co. gyártmánya) az izopropanolt 1 mM sósavra cseréltük, a EO 35/20217-ben leírt eljárás szerint előállított 13.,0 mg rekombináns OCIE-ot tartalmazó 1 mi 0,2 M MaH.CCk/0, S M MaCl oldatot (pH 3,3} vittünk fecskendő (5 ml, a Terumo Corp. gyártmánya) segítségévei az oszlopra, hogy 30 perc alatt szobahőmérsékleten lejátszódjon a kapcsolási reakció. Az oszlopra 3 mi Ö,5 M etanolamin/O, 5 M HaCl (pH 8, 3} oldatot, és 3 ml 0,1 M ecet sav ZO# 5 M MaCl (pH 4,0} Oldatot vittünk tel. háromszor felváltva# hogy a .feleslegben levő aktív csoportokat 1 na kt1vá1j u k , ma j d a ζ ο1da tct k1os a ré11 ü k ö ,5 M etanolamin/O,5 M hadi (pH 8,3} oldatra. Mintán 1 órán keresztül állni hagytak szobahőmérsékleten, az oszlopot kétszer felváltva mostak 0#5 ;M etanolamin/O,5 M haCl (pH 8# 3} és 0,1 M eoets&v/ő,5 M NaCl (pH 4,0) oldatokkal és az oldatot ezután 50 mM Tris/1 M Maül/0,1% CHAPS pn.fferre.1 (pH 7,5} cseréltük ki, (2} fi .......alóliÍfe tisztítása OCIFimmobiLizáit affinitás oszlop felhasználásárai
Hz OCIE-köro fehérje tisztítását 4öC-on végeztük# hacsak nem adtunk meg más hömérsekie térté két. A fent említett OClP-i^mcbilizáit affinitás oszlopot olyan 10 mM Tris-sésav pnfferrel (pH. 7, 2} hoztuk egyensályfca# amelyhez az 1.(21 példában leírt proteáz inhibitorokat, Ö,1S M MaCI-ot és 0,5% CHAPS-t unn íz ', 3 t\ \w xo leirt szol obiLizáit membrántrakció körülbelül 8 ml-ét az oszlopra vittük 0,01 ml/perc térfogatárammal. Ezt követően az oszlopot 100 percen keresztül 0,5 mi/porc térfogatárammal olyan 10 mM Tr.is-sösa.v pnfferrel. (pH 7,2} mostuk, amelyhez a fent említett proteáz inhibitorokat, 0# 15 M MaCi-ot és 0,5% CHAFS-t adtunk. Máj d ezután az oszlophoz adszorbeálodott fehérjéket 50 percen át 0,1 ml/perc térfogatárammal olyan 0,1 M glicirn-sdsav pnfferrel (pH 3,3} elváltuk, amely tartalmazta a proteáz inhibitorokat# 0,2 M nátrinm-'kioridot és 0,5% CHAFS-t, dgyanezen a módon az oszlophoz adszorbeálődott fehérjéket 58 perben át 0#l ml/perc tér fogat áramai elvan 0/1 M nátrium-nitrát puftérrel (pH 2,0} elváltuk, amely tartalmazta a proteáz inhibitorokat, 0,2 M nátrium55 kloridof és 0,5% CHAPS-t, Az eluétumot 0,5 ml-es frakciókban gyűjtöttük össze, Mindegyik frakciót azonnal semlegesítettük 2 M. Tris oldat hozzáadásával. Az ezen pufferek elhalásával kapott frakciókat (mindegyik frakció 1,0ml~S,ömi eluétumot tartalmazott) 50-100 ni-re koncentráltuk Centricon-10 (ez Amieon of 0,S,A. gyártmánya) f elhasználásával, Mindegyik koncentrál t frakció egy részéhez OCIF-ct adtunk és anti-OCIF poliklonális antitesttel immunprecipitaltuk, A kicsapatott frakciókat SFS-sei kezeltük és SDS-PAEE-ra vittük. Azon frakciókat (3-10 sorszámú frakciók), amelyekben a fehérje sávja az OC1F felé specifikus kötődési képességet mutat úgy tekintettük, -mint a találmány szerinti fehérje frakciói, (3) Atalálmány szerinti fehérje tisztítása gélszűzés s égd. f s égé ve i
A koncentrált OClF-kötö fehérjét (0,1 M giicin-sosav pufferrel (pH 3,3) történt eluáiás során kapott frakciókat) és 0,1 M nátrium-cifrát puffért (pH 2,0), amit a. 2,(2) példában állítottunk elő, Fuperose 12 HR10/30 oszlopra (1,0 z 30 cm, a Pharmacia Co, gyártmánya) vittünk, amit l.OmM Tris-HCi, '0,5 M MaCl és 0,5% CHAPS (pH 7,0) tartalmú oldattal egyensúlyba hoztunk és ezt az egyensúlyi puffért mobil fázisként felhasználva 0,5 ml/perc térfogatáramúi kifejlesztettük és mindegyik 0,5 ml-es frakciót összegyűjtöttük, A. találmány szerinti fehérjét tartalmazó frakciókat 027-32 sorszámú frakciók) ugyanazon eljárás szerint azonosítottuk, mint amit fent ismertet tünk, Mindegyik frakciót 0sntricon-10 (az Amieon terméke) felhasználásával koncentráltuk.
(4) Fordltott fázisú nagy hatékonyságú folyadé k k rosta t o g r á f i á v a 1 tő r t énfy t i szr í t á s
A gólszűréssel, tisztított fent említett GCiF-kötö fehérjét egy C» oszlopra. (2,1 x 250 mm, Vydac, USA) vittük, amit 0,1% trífluor-ecetsavval (TEA) és 30% acetonitrillel hoztunk egyensúlyba. Az oszlophoz kötődött fehérjéket az aoetonitril első 55 percben 30%-tői 55%™íg és a kővetkező 10 percben 55%-től 80%-ig terjedő lineáris gradiensével elváltuk 0,2 mi /perc térfogatárammal, Az elvált fehérjék csúcsait 215 nm~en mért optikai denzltás mérésével határoztuk meg, A különböző csúcsokhoz tartozó fehérjéket megvizsgáltuk abból a célból, hogy azonosítsuk a találmány szerinti, fehérjét tartalmazd frakciókat, és a. találmány szerinti fehérje nagymértékben megtisztított formáját kaptuk.
A.réib.iáléiiV áh.rrihid n.í.káÍ.lÍ£ÍÍ______^fehérje SDS-PAGE vz s g a. ζ a t a
A o—vitamin aktív formájának jelenlétében vagy hiányában növesztett ST2 sejtekből előállított szolubilízált membránfrakciót OCXf-immobilizált affinitás oszlopra vittük tisztítás céljából, A tisztított készítményt SDS-PAGE módszerrel vizsgáltuk, Hint az az 1 . ábrán (A) látszik, egy körülbelül 30,dOO-AO,050-es molekulatömegé fő fehérjesévot figyeltük meg egyedül a Cgvitamin aktív formájának jelenlétében növesztett ST2 sejtek, tisztitett kész!tményében, ami megerősíti, hogy az OCIE-hoz spectrikusan kötődé fehérje (azaz a. találmány szerinti tér m je) szelektíven tisztítható az
ÖG1F™ immobilízált affinitás oszloppal, Jóllehet, az OC1Fimmobil!sált oszlop hordozóihoz vagy távolságtartóihoz n em ~ s p e c i f i k u s a n ke t od ó η é h á n y f a h é r j e (a h a 1 á 1 má n y szerinti fehérjétől különböző; sávja megfigyelhető volt mindkét tisztított termekben. A találmány szerinti fehérjétől különböző fehérjéket a fent leírt eljárások szerint gélszűréssel és C.4 fordít ott fázisú kromatográfiával eltávolitottuk. Az Így kapott találmány szerinti nagy mértékben megtisztított fehérje SDS-PAGE képe az 1, ábrán (B) látható, A találmány szerinti nagy mértékben megélsztított fehérjét elektrcforetikus szempontból homogénnek. találtok és hozzávetőlegesen 30,000-90,000-es molekulatömeggel. rendelkezett,
OC!F osteoblestokhoz kötődésének vi zsgálata (l)%'2Ü~delőlt~ OC1F eléé Ili tás a
Az OCIF-ot jodogén eljárás segítségével '^l-tel jelöltük. Bővebben, 20 μ! 2,5 mg/ml. jodogén-kloroform oldatot tettünk egy 1,5 ml-es Sppendörf csőbe és 40öC”dh elpárologtattuk a kloroformot, Így kaptunk egy joöogénnei bevont csövet. A csövet háromszor mostuk 400 μΐ 0,5 M nátrium-foszfát pufferrei (Na-Pi, ph 7,0). 5 pl 0,5 A NaPi-t (pH 7,0) adtunk a csőbe. Az 1,3 pl (18,5 HBq) Na-^! oldat (AB2-Ő33H2Í), az Amersham Co, gyártmánya.) hczzáadáaa után azonnal a csőbe adtunk 10 pl 1 mg/ml rOOlF oldatot (monomer típusút vagy elmer típusul), A vertez keverővei végzett keverés után az elegyet 30 másodpercre szobahőmérsékleten állni hagytuk. Az oldatot egy olyan kémcsőbe vittük át, amely tartalmazott 80 μϊ 0,5 M Fa-Pi (pH 7,0} oldatban készített 10 me/ml kálium-· joáidot és 5 μϊ 5% marha szériánál humánt tartalmazó foszfáttal puríerert konyhasó oldatot és keverte!tok, A keveréket forgóoszlopra (1 ml, G~25 fine# a Pharmacia Co. gyártmánya} vittük, amit 0,25% marha széruma.lbum.int tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasooldattai hoztunk egyensúlyba, és az oszlopot 5 percen keresztül 2,000 rpm sebességgel centrifugáltuk< 400 μϊ 0,25% marna szérumalbumint tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasóoldatot adtunk az oszlopról eiuált frakcióhoz és az elegyet kevertettük. Ebbel kivettünk 2 μϊ-fc, hogy gamma számlálóval megmérjük a radioaktivitást. 10% TCA-val kicsapatott radioaktivitás mérésével meghatároztuk a Λ I··- tel jelölt OCIF radiokémiái tisztaságát. A l-tel jelölt OCIF biológiai, akti vitását a WO 96/26217-ben leírt eljárás szerint mértük meg. A. tel jelölt OCIF konoenfráoidját a következő eljárás szerinti BUSA módszerrel mértük, meg.
{2) .fo jlpfoal jelölt.....OCIF.....koncéntráclógágak mérése BUSA eljagágeal
Egy 98 lyukas immun lemez (MaxiSorp·^, a Nu.no Co. terméke} minden egyes lyukába a WO 95/26217 számú szabadalmi bejelentésben ismertetett antí-OCIF nyúl polikionélis antitestet 2 pg/ml koncentrációban tartalmazó XÖÖ μ! 50 mM MsHCCg (pH 9,0} oldatot adtunk. A lemezt egy éjszakán át lŐOos hőmérsékleten hagytuk állni. Miután az Oldatot leszívással eitavolitottuk, 500 pl Bicék Ace^ (Bnom Brand. Milk Products Co ., Etd.) ./foszfáttal pof terelt kcnyhasbeldatot (25/75) adtunk minden egyes lyukba. A lemezt ezután két órán keresztül szobahőmérsékleten állni, hagytuk. Miután az oldatot leszívással éltévelitöttűk, a
9 lyukakat háromszor mostuk foszfáttal puffereit konyhasőoidattsl, amely ö,01% Bolysorbate 80-t (B-BBS) tartalmazott. Ezt követően 300 μ.1 Biock Ace^/foszfáttal puffereit konyhasőoldatot (25/75) elkevertünk Λ~1-jelölt OCIF vagy standard OCIF készítményekkel és minden egyes lyukba adtunk ilyet. A lemezt ezután két órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk. Miután az oldatot leszívással eltávolítóttűk, minden lyukat hatszor mostunk 200 μι F-BBS-sel.
Perexidázzal jelölt nyal anti-OCIF poliklcnális antitestet tartalmazó 100 μΐ Black Ace'·^ (Snou Brand Milk Products Co., Ltd.)/foszfáttal puffereit konyhasőoldatot (25/75) adtunk minden egyes lyukba. A lemezt két érán reteszei 1 szobahőmérsékleten hagytuk állni. Miután az o 1 da t ot 1 e s z i v á s s a 1. e 11 á ν ο 111 o 1.1 u k , mi nd e η 1 y u ka t ha t s z o r mostunk 200 μΐ. P-BBS-sel. Ezt követően 100 μΐ TMB oldatot (nagy érzékenységű oldható TMB reagens, Soytek Co,) adtunk minden egyes lyukba. 490 nm-en mikrőlemez olvasóval megmértük minden lyuk. abszorbancláját. A '''l-jelölt OCIF koncentráolőját a standard OCIF készítmény felhasználásával készített kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg.
(3) OCIF_______ost eobiasfokhoz vagy lépsejtekhez kötődésének vizsgálata
ST2 egér osteobl.ast szt.rőmális sejtvonalat vagy lépsejteket 10”* M aktív formájú rb-vitamint fkalcitriol), >V.
illetve 10“' M dexametazont tartalmazó vagy nem tartalmazó# 10% magzati borjűszérumot (BBS) tartalmazó d-MEM-ben szuszpendáltank 4 x iö* sejt/ml (Biz sejtek) vagy 2 x 10* sejt/mi (lépsejtek} koncentrációra. Mindegyik sejtszuszpenziőt egy 24-lyukas míkrolemezbe inokuiáltűk. A sejteket 4 napon keresztül Ü02-inkubátorbsn növesztettük. Mintán a sejteket a-MFH-mel mostok# a 20 ng/ml fent leírt íz\l~tel jelölt OCIF-et (monomer forma vagy diner forma) tartalmazó# kötődési teszthez való tápközegböl (olyan aMÉM# amelyet 0#/2% marha szérnmalbuminnsi# 20 md KÉPES pafféról és 0#2% EaNs-dai egészítettünk kí) 200 pl-t adtunk minden egyes lyukba. Azokhoz a lyukakhoz# amelyeket a nem-spécitikon kötődés méréséhez használtunk# a 8 pg/ml rOCXF-ot (föO-szoros koncentrációban) és meg ezenfelül 20 ng/ml a2!.~jelölt OülF-ot tartalmazó# kötődési vizsgálathoz való tápközsg 200 pl-ét adtuk. A sejteket egy órán át CGyinkubátorban növesztettük és háromszor mostuk Imi foszfáttal pofterelt konyhasóoidstbán. Ezen eljárás során a lépsejtehet a 24 lyukas lemez minden egyes mosási lépésben végzett oentrifugéláae által mostuk# mivel a lépse j tek. nem-tapadé sejtek voltak, A mosás után a sejtek feloldása céljából 500 pi 0#l N EaOK oldatot adtunk minden lyukba és a lemezt 10 percen át szobahőmérsékleten hagytuk állni. Gamma számláié segítségével minden lyukban megmértük az RÍ mennyiségét.
Mint sz a 2, ábrán látható# a :Aal-jelölt OCIF nem kötődött a növesztett lépsejtekbez# azonban specifikusan csak azokhoz az osteoblast sztromális sejtekhez kötődött# amelyeket a Dp'vitamin, aktív formájának a jelenlétében növesztettünk. Az eredmények azt mutatták# hogy a találmány szerinti fehérje egy memPránkötött fehérje# amelyet a D^-vitámín aktív formája és a dexemetazon indukál, osteoblast sztromális sejteken,.
A telslmany szerinti teher je biológiai aktivitása (1.) Osteobiast sztrőmális sejtek által segített osteociast képződés
Az osteobiast sztrőmális sejtek osteociast képződést segítő képessége a keletkező osteoclastok borikősav rezisztens sav foszíataz aktivitásának (TRAP aktivitás) a mérésével határozható meg. Konkrétan, ddy egérből (8-12 hetes) származó lépsejteket (2 r 10b sejt/100 μΧ/lyuk) és STz egér osteobiast sztrőmális sejteket (5 x 10” sejt/löö μΐ/lyuk) olyan n-MEM-ben szuszpendáitunk, amihez 10° M aktív formájú D^-vitamint, 10'' M dexametazont és 10% magzati. borjuszérumofc adtunk, A sejteket 96-lyukú lemezekbe inokuiáituk és egy héten keresztül CO^inkubátorban növesztettük őket, Miután foszfáttal puffereit konyhaaöoldattal mostunk minden lyukat, 100 μΐ etanol/aceton {1:1; elegyet adtunk minden lyukba és a sejteket szobahőmérsékleten egy percen át ímmobilízAItűk, Az Ímmobilizálás után 5,5 md p-nitrofenol-foszfátot és 10 mM nátrium™tartarátok tartalmazó 100 μΧ 50 mM nitrát puffért (pH 4,5) adtunk minden lyukba, 15 perc szobahőmérsékleten, zaj lő reakció után 0,1 d NaOH oldatot adtunk mindegyik lyukhoz és egy mikrolemez olvasó segítségével 405 nm-en mértük az abszorbanciát, A 3. ábrán látható a körülbelül X0~es vagy 40-es passzálási számú STz sejtek általi osteociast képződés eredménye, miután a sejteket a Atkán Sejthankböi beszereztük. Az eredmények azt mutatják, hogy a nagyobb passzálási számú ST2 sejtek, hatásosabb osteociast képződést segítő képességet, mutatnak,
(.2) j-L.·.., yglélmény szerinti sétált....40147 kormán a D3™ v|t.amlnt és _ .)¾¾¾ ü égert tartajgaazé téülÉü Aar Aháálfrh.á | cé. ásst ~sztrömálls sejtek membránj áu. .történd enpressz ZájtbrÁáá.
es..........éz^^^ osteoeiast_________kégzjkfishók. cl tára rendszerben ^b.bé.ÉmlüAÉÉfeÉÍ-ür^IbbAÉÁÁ
Ugyanolyan módon, mint a 4« (3) példában, 7 napon keresztül növesztettünk ST2 osteoblast aztrőmslls sajteket aktív formájú Da-vitamin és dexametazon jelenlétében, Az öÜlF-kötési vizsgálatot ''<;l-fcel jelölt OCIF (monomer típus) .felhasználásával végeztük ügy# ahogy azt a 4,(1) példában ismertetett kísérletben leírtuk, A nem-spscifikus kötődést úgy határoztuk meg, hogy a ^X-OCIE és a 4 00szoros koncentrációban lévő jeleiétlen OCIF ST2 sejtekhez való kötődésének versengését mértük. Ennek eredményként megállapítottuk, hogy a Dx-vitamin aktív formája és dexametszon jelenlétében a ^l-tel jelelt OCIF specifikus kötődésének mennyisége nő a tenyéezlde nővekedésének megfelelően. Bővebben, mint ahogy az a 4, és c, ábrán látható, a találmány szerinti fehérje a Dx-vftamin aktív formája által az 0T2 sejtek felszínén a tenysszidö növekedésének megfelelően ezpresszálddott éa az expresszié a növesztés negyedik napján ért el maximumot» Másrészről az osteoeiast szeré sejtek úgy képződnek, hogy egér lépsejleket és ST2 sejteket aktív formájú D^-vltamin jelenlétében együtt növesztünk, TRáP (osteoclastok merker enzime)-pozitív egymagvű pre-östeoclsst-szeré sejtek a növesztés harmadik vagy negyedik napján képződnek, Differenoiáltabb és érett TRAR-pozitiv tdbbmsgvü sejtek a növesztés ötödik-hatodik napján képződnek, 2o vtr'bru' figyelhető meg a találmány szerinti fehérje expreeeziőjának időbeli változása és az osteoeiast képződése között.
osteoclast (3) yöőjfgral...........való____________itsfelts______...........gátolt képződés az együtt-rsáveszfes különböző idöszakaiben.
Annak érdekében, hogy világossá váljon, hogy a találmány szerinti fehérje az osteoclast képzésben szerepet játszó faktor, a sejteket különböző növesztés! periédaaokban 100 mg/ml OCXF-fal kezeltük a fenti 5,(2) példában leírt hat napos együtt-növssztási időtartam során (a hat napos időtartam két egymást kővető napján, kivéve az ötödik napot, amelyen egy egynapos perlödbet alkalmaztunk), Eredményként, mint az a 3. ábrán látható, azt kaptak, hogy a növesztés kezdetétől számított 45-96, érában végzett OCIF™kezelés, amikor a találmány szerinti fehérje 2T2 sejteken történő expressziója. maximális, a leghatékonyabb osteoolast képződés gátlására. Bővebben, azt. is megállapítottak, hogy az OCIF szabályozza az osteoolast képződést úgy, hogy a találmány szerinti fehérjén keresztül STz sejtekhez, kötődik,
A fenti kísérletek eredményei alapján a találmány szerinti fehérjéről megállapítottak, hogy aktív formájú Ds-vitamin ás dsxame fazon segítségévei osteoblast sztrömális sejtek sejtmembránján indukálódik és osteociastok di f főrend lelőj át vagy érését segítő vagy gyorsító biológiai aktivitást metet,
5, Bálde jelölt. OCIF és a találmány szerinti fehérje a z t ko t e s i t s s z t j e
A találmány szerinti fehérje még egyértelműbb azonosításához a találmány szerinti fehérjét ^'Ű-tel jelölt OCIF™fal keresztkötőttűk, STB egér osteoblast sztrömális sejtvonalat négy napon keresztül nevezztettünk D3~vítárnin aktív termája és dexametazon jelenlétében vagy hiányában ugyanazen a módon, mint azt a 4,(3) példában leírtuk. Mintán a sejteket 1 ml foszfáttal puffereit konyhasőoldattai mostuk, 35 ng/ml ^X-jelölt OCIF-ot (monomer forma) vagy 40 ng/ml, a SEQ XD MO 76 szekvencia szerinti fehérje (WO 96/26217) állati sejtekben végzett expres a z á X á s a serén kapót t ;'zl - j elei t OCX E-CDü 1 -· e t tartalmazó 200 pl kötési teszthez való tápközeget (olyan <x-MEM, amelyhez 0,2% marha széruma1bumint, 20 mM Hepes puffért, 0,2% hah3~Ot és 100 pg/ml kaparint adtunk) adtunk hozzájuk, Az előbb említett, kötési teszthez való tenyésztápközeget kiegészítettük továbbá 400-szoros konoentrációjé OCXE-fsl és a nem-specifikus kötődés meghatározása céljából a többi lyukhoz adtuk. Miután egy érán keresztül ÜCy-inkubátorban növesztettük Őket, mindegyik lyukat háromszor mostuk 100 pg/ml heparint tartalmazó 1 ml foszfáttal puffereit konyhasőoldattai. 100 pg/ml keresztkötö ágenst, DSS-t (diszukolnlmldil-azuberát, Pieree Ce.) tartalmazó 500 μ.1 foszfáttal puffezeit konyhasöoidatot adtunk minden egyes lyukhoz és a lemezt 10 percen keresztül 0öC-ön tari.ott.uk. a. lyukakat kétszer mostuk X mi foszfáttal puffereit konyhasőoldattai CbC-on. 1% Triton X-löö-at, 10 pM pepstatínt, 10 pM ieupeptint, 2 mM PMSF-et (fenilmetilazulfonil-fluorid), 10 pM antipein-t és 2 mM EbT.A~t tartalmazó 100 pl 20 MM Hepes puffért egyes lyukhoz, A lemezt « percen át szobahőmérsékleten a d t un k mi nde n feloldásához 30 sejtek hagytuk állni. Ezen mintákból szokásos eljárással. 15 pl-t kezeltünk SDS-sel nem-redukálö körülmények között és 3DS- poiiakrilamid géielektroforézíssel (4-20% poliakrllamid gradiens, a Daiichi Chemical Ce., Ltd. gyártmánya) vizsgáltuk. Az elektrororézís után a géleket megszáritothuk és BioMax MS filmre (.a Kodak gyártmánya) exponáltuk föioMax MS erösltöernyö (a Kodak gyártmánya) felhasználásával 24 érán keresztül -80öC-on, Az expozíció után a. filmet szokásos eljárással hívtuk elő. Egy 90.000ÜO.öOö molekulatömegű keresztkötött termék sávját figyeltük meg abban az. esetben, amikor a mX~jelölt OCIFot (monomer típus, öOkDa) használtuk, A ^X-jelölt ÖCXFCDD1 (31 kDa) esetén a körülbelül 70-80 kDa (átlagosan 78 kDa) molekulatömegű keresztkötött termék sávját figyeltük meg, mint az a 7, ábrán látható,
Az 812 sejteken, expresszált találmány szerinti fehérje
Oeatcharö di agram segít ségeve1 történő anai i zi se
A fent említett iA*X'~teI jelölt OCIF-ot (monomer típus) 1,000 pb koncentrációban a kötési teszthez való tenyésztápkőzeghez (olyan a-MEM# amely 0,21 marha szérumaibumint, 20 mM Hepes puffért és 0,2% Nafh-ot tartalmazott) adtuk, és a tenyésztápközeget sorozatosan f e 1 é r e h i g i t o t1 u k ο I. y an t e n y é s z t á p kö z e g g e I, ame .1 y n em tartalmazta a ^I-tai jelölt öCIF-ot, A nem-specifikus kötődés méréséhez valö oldatokat ügy állítottuk, elő, hogy e z e η o 1 da t o k h o z mé g 4 0 ö - s z o r o s kon o en t r á e i 6 j ű monomé r formájú OCXF-ct is adtunk. A fent említett# 4 napon keresztül 10”* M aktív formájú D^-vitárnán (kalcitriol) és lö?í b . öaxametszon jelenlétében növesztett ST2 sejteket (körülbelül 10-es passzálasi szám? tartalmazó lyukakhoz 200 μΐ igy előállított oldatot, adtunk, hogy ugyanolyan módon, mint azt a 4.(3) példában leírtuk# megbecsüljük a usl-jelölt OCIF kötődését. Az eredményeket Scarohard diagram analizísnek vetettük aia, hogy az OCIF és az OCIFkötő fehérje disszocianiős konstansát és az ST2 sejtenként meglevő OCXF-köto fehérje számát (helyét) meghatározzuk. Eredményként azt kaptuk# hogy az OCIF éa a találmány szerinti fehérje diaszociáciős konstansa 280 pb és az OCX 1'kötő fehérje ST2 sejtenként meglévő helyeinek száma hozzávetőlegesen 33,0ö0/sajt volt. Az 5,(1) példa során fellelt eredmény alapján, mely szerint a körülbelül 40-ea paeszálési számú ST2 sejtek által segített oeteoclast képződés nagyobb mértékű volt# mint a .körülbelül lö-es passzálási számnak által segített# a találmány szerinti fehérje körülbelül 4 0-ea passzálási számé 812 sejteken expresszi födött számát (helyét) határoztuk meg.. Ez a szám (hely) 5B,ü0ö/sejt volt és egyértelműen nagyobb veit, mint a lö-es passzálási számé Biz sejtek esetében, ami azt mutatja, hogy az 812 sejteken ezpresszálődott találmány szerinti fehérje mennyisége összefügg az osteoolast képződést segítő 'képességükkel. Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti fehérje egy olyan faktor, amely östeoclaatők differenoiáoiöját vagy érését segíti vagy indukálja.
Az OBM oühSklónozása (1} Azhány erese egér 612aejfcekhöl
Az ST2 egér osteobiast azt romái, is sejt vonalat (kiken Sejtbank, RCB0224) .10% magzati borjészerumot tartalmazó mMEM-ben (Oábeo BAL Co,} növesztettük. Az igy növesztett
ST2 sejteket egy 225 csr-ee tapadó sejttenyésztésre szolgáló T-edénybe összecntöftök és trípszinnel kezeltük a '1-edényből történd aratáshoz, A sejteket mostuk, majd öt darab 225 crö-es ϊ-edénybe vittük át, Mindegyik edénybe 60 ml. Í0e M aktív formájú O2-vitamint (kalcitrlcl, Wako Pere Chemicals Co., Ltd,), 10' M dexametazont és 10% magzati borjűszérumot tartalmazd α-ΜΕΜ-et adtunk és a sejteket 5 napon keresztül CCe-inkubátorban növesztettük, Az igy növesztett ST2 sejtekből kinyertük a teljes RNS-t 15OCEN (bakó Pere Chemicals Co., Ltd.) felhasználásával, A teljes RNS körülbelül 6-00 pg-·jóból coli A'ÜlNS-t készítettünk, egy oilgo(dT)-cellulóz oszlop (5’-3? Prímé Co,) segítségével. Körülbelül 8 pg poü AÜNS-t kaptunk, (2) Expresszlés könyvtár eüészüese
A 8,(1) példában kapott coli A'RNS 2 pg-jábél állítottunk elő duplaszáiú cDNE-t egy Creat Lencths oDNA Syntb.esis kit (Clonteen. Co,) segítségével az útmutatóban leírtak alapján. Bővebben, 2 pg poii AühS-t és oiigo(CT)(dN) prímért összekevertünk ée a keverékhez desztillált vizet adtunk úgy, hegy a végtérfogata 6,25 μΐ legyen, A körülbelül 3 perces, 7ö°C-bh történe inkubáció után a keveréket jégen 2 percig hütöttük, A keverékhez 2,2 μΐ desztillált vizet, 2,5 pl SE eisöszáias puffért (Firststrand buffer), 0,25 pl. 100 mM DTT-t (ditiotreitolt) 0,5pi Prime PNáz inhibitort (Id/ml) (5*-3* Prímé Cc.), 0,5 μΐ [uüsPÍ dCTP-t (Amersham Co ., 3000 Cí/mmo'l) desztillált vízzel ötszörösen higüva 2 uüi/pi készítéséhez, 0,65 pl dNTF-t (mindegyik 20 mMj és 1,25 pl (250 egység) bbbv (RNázff) reverz transzkriptázt adtunk. A keveréket 90 percen keresztül 42°C-o.n inkübáituk, majd ezután további
62,25 μΐ desztillált vizet, 20 μΐ SX másoöikszáias puffért (Seeond-strand bnffer), 0,75 μΐ dkTP-t (mindegyik 20 mM) és 5 pl másodikszálas enzimkoktélt adtunk hozzá, Az igy kapott keveréket két érán keresztül lő^C-on tartottuk. Ezt követően 7,5 egység T4DNS polimeréit adtunk ehhez a teakelékeverékhez, A 30 perces, ΙδΑΐ-οη végzett inkubáció után a reakciót 5 pl 0,2 B ΕΏΤΑ hozzáadásával állítottuk meg. Egy fenol-kloroformos kezelés után a terméket etanoilal. kiosapattuk, Az igy kapott dupla szálé oDHS végeihez egy EcoEl-Sail-Botl linkért (Clontech Co.) kapcsoltunk. Ezt kővetően a végeket teszteliIáitok és a terméket méret-frakcionaió oszlopra vittük, hogy megkapjuk az 500 bp-nál nagyobb hosszúságú cDNS-t, A DBE-t etanoilal kiosapattuk, vízben feloldottuk és pcDl-SR e.296~hoz ligáltük (Moleculsr ané Cellnlar Bíoiogy, 0, kötet, 4 66472 oldalak, 1268), amit EooAI restrikciós enzimmel (Takara Shuzo Co, ) vágtunk és ClAE-pal (borjú bei alkálifoszíatáz, Takara Shuzo Co,} kezeltünk, (3) Expressziös könyvtár____szűrése OCIF-hoz yalö kötődés seu.i tségével
Az XLz Blue BEE5 Esohsríchía coli törzset (Toyobo Co,, Idd,} a 8,(2) példában előállított DBS felhasználáséval transzformáltuk és L-Carbenisilön agaron (li tripton, ö,S% élesztőkivonat, 1% EaCi, 6ö pg/ml oarbenisilin, 1,5% agar} növesztettük 24 lyukas műanyag lemezeken úgy, hogy lyukanként körülbelül 100 kolónia keletkezzen, A tsanszformánsokat mindegyik lyukban. 3 ml Terr lf lc Eroth ampioillin tanyása tápközegben (1,2% tripton, 2,4% élesztékivonat, 0,4% glicerin, 0,017 M
XTbECy, 0,072 B fAHPCg, 100 pg/ml ampioillin) szuszpendál.tuk és 37°C-on egy éjszakén ét rézatás. mellett növesztettük, A sejteket a plazmid DBS QIAwell kittel (Qiagen Co.) történő előállítása céljából oeutrifugálás segítségével összegyűjtöttük, A DNS koncentrációját 260 nm-en mért abszorbancia segítségével határoztuk meg, A DNS~t etancllai végzett kicsapetással koncentrál tűk és desztillált vízben 200 ng/μΐ .koncéntrációban feloldottuk, ötszáz DNS készletet állítottunk elő, melyek mindegyiket körülbelül 100 kolóniából kaptuk és ezeket a készleteket használtuk COS~7 sejtekbe (kiken Sejtesek, RCBöSOO) történő transzfekcíőhoz, A COS-7 sejteket 8xiöi! sejt/lyuk sejtsürüséggel olyan DMEM-be oltottuk be, amely a 24 lyukas lemez mindegyik lyukában 10% magzati borjúszerumot tartalmazott és egy éjszakán át 3?°0~Όη COg-inkobátorban növesztettük őket. A következő napon eltávolítottak a tenyésztápközeget és a sejteket szérummmentes DMEM tenyéaztápközeggel mostuk. A fent leírt, plazmád DNS~t előzőleg OP1I-ME.H tenyésztápkőzeggei (Gibco BRL Co,) hígítottuk és lépőiectamin.e--n.sl. (transzfekoiős reagens., a Gibco DHL Co. gyártmánya) kevertük a Lipofeotamine mellé adott leirat szerint. A keveréket 15 perc elteltével mindegyik lyukba, a sejtekhez adtuk. Az itt használt lipofeotamine és DNS mennyisége lyukanként Ipg, illetve 4 μΐ, volt, 5 óra múlva a tenyész tápközege fc eltévolítörtük és mindegyik iynkba Imi 10% magzati borjűszérumot tartalmazó DMBM tenyésztápközeget (Gibco BRL Co.) adtunk, A lemezeket 2“' OOO < OS', 3 ' Ο -ΌΌ Ό, , ''' su inknbálruk. A transzfektált és 2-3 napon keresztül ezen a módon növesztett OOS-7 sejteket szérummmentos OtiEb tenyésztápközeggel mostuk. Ezt kővetően 200 pl olyan kötődési assay-hoz velő tenyésztápközeget (olyan s z é r umme n t e s DMEM t e n y é s z t áp köz eg, eme 1 y 0 , 2 % foo r j a szérumalbum.int, 20 mM Hepes puffért, 0,1 mg/ml hepariut és
0,02% NáN>~ot tartalmazott) adtunk minden lyukhoz, amelyhez 20 ng/ml ''5~T™teI jelölt OCXP-ofc adtunk hozzá. Miután COg-Inkubátorban (5% CO2) 37h3~on egy órán keresztül növesztettük őket, a sejteket kétszer mostuk 500 μΐ 0,1 mg/ml kaparint tartalmazd foszfáttal- pufferelt konyhasöoldattal, Mosás után minden lyukhoz 500 μΐ 0,1 h NaOH oldatot adtunk, A lemezeket a sejtek roncsolódásához 10 percen át szobahőmérsékleten hagytuk állni, A mennyiségét minden lyukban gamma.-számláló (Backard Co,; felhasználásával r, értük. Az összese; i 00 készlet a,.a:.ese során egy olyan üMS készletet találtunk, amely OClE-hoz specifikusan kötődd fehérjét ködeid oDNS-t tartalmazott, A cDMS-t tartalmazó DBS készletet tovább osztottuk és a fent ismertetett transzfekolós és szűrési eljárásokat megismételtük, hogy az OCXF-hoz kötődő fehérjét kódoló oDHS-t izoláljuk. Ezt a oDRS-t tartalmazó piazmiöot pQBM291-nek neveztük ..el,. Ezt a pl azmidot tartalmazó Escheriohia odil-t 1997. május 23-án a FERM 3B-5953 letéti számon pORM291-ként a „The National Instltute of Biosolenoe and Humán Technology, Agenoy of Industrial Science and Technology, Bioteohnology Labcratory’’-nál letétbe helyeztük.
Az OCXF ^X-tel történő jelölésére és a ^T-tel jelölt OCXF ELlS.A-val történő kvantitatív analízisére szolgaié eljárásokat az alábbiakban mutatjuk meg. Az OG1F '^I-tel történő jelölését a jodogén eljárás szerint végeztük el, 2ő pl 25mg/ml jodogén'kloroform oldatot adtunk egy 1,5 ml-es Eppendorf csőbe és a kloroformot 4ööC-on történő melegítéssel elpárologtattuk a jodogén bevonatú esd előállítása céljából, A csövet háromszor mostuk 400 pl 0,5 M nátrium-foszfát pufferrel (Ma-ki, pH 7,0} es 5 pl 0,5 M Na-Bl-t (pH 7,0; adtunk hozzá. Az 1,3 μΐ (18,5 MBq) Naoldat (OFE-033h30, Amersham Co. ) hozzáadása után azonnal a csőbe adtunk 10 μΐ 1 mg/mi rOCIF oldatot (monomer vagy dimer típus). Miután verten követővel megkevertük a tartalmát, a csövet szobahőmérsékleten 30 másodpercig áll. ni hagytak. A csőben lévő oldatot egy olyan csőbe vittük át, amelybe előzőleg 00 μΐ 10 mg/ml kálium-jodidot, 0,5 M Ea-Bi-t (pH 7,0) és
5% marha azérumaibumlnt tartalmazó 5 μΐ foszfáttal puffereit konyhasöoidatot (BSA-BBS) adtunk. Kevertetés után az elegyet egy forgőosziopra. (1 ml, G-25 fine, a Pharmacia Co. gyártmánya) vittük, amit BSA-BBS-aei hoztunk egyensúlyba és az oszlopot 5 percen keresztül 2000 rpm e e be s a é g g e1 oent r ifugá11uk. 40 0 μ 1 BS.A-ΡBS-t a dt un k a z oszlopról almáit frakcióhoz. Elkeverés után ezen oldatból mintaként kivettünk 2 ul-t, hegy gamma számlálóval megmérjük a jelölt OCIF segítségévei radlcaktivitást. Az igy előállított ^I-tel oldat radiokémiái tisztaságát 10% TCA k í c s ap a t c 11 rád .1 c a k t í v í t á s mé r é s év e 1 határoztuk meg. A izisI-~tel jelölt OCIF biológiai aktivitását a WO 96/25217-ben leírt eljárás szerint mértük meg. A ‘^l-tei jelölt OCIF koncentrációját ELISA segítségévei határoztuk meg a következők szerint. Bővebben, 100 pl 50 mM NaHCCg (pH 9, 6) oldatot, amelyben a
WO 96/26217-ben ismertetett enti-OClF nyél poliklonáiís antitestet 2 pg/mi koncentrációban feloldottuk, adtunk egy 96 .lyukas Immunlemez (Maxi Sorp^, a Neue Co. terméke) minden egyes lyukába. A lemezt egy éjszakán át 4°C-on. hagytuk állni. Miután az oldatot leszívással el távolltohtuk, 300 μΐ Blook Acé5* (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.}/foszfáttal puffereit konyhasöoidatot (25/75) (B-PBG) adtunk minden egyes lyukba. A lemezt ezután két órán keresztül szobahőmérsékleten állni '7 hagytuk.. Miután az oldatot leszívással eltávoz!tottuk, a lyukakat háromszor mostuk foszfáttal puffereit konyhasooidattal, amely 0,01% Polysorbaie Bö-t. (P-PBS.) tartalmazott. Ezt követően 100 pl Uí>X~t®X jelölt ÖCIF-ot vagy standard OCIP-ot tartalmazó S-PBS-t adtunk minden lyukhoz. A lemezt ezután két órán keresztül szebahőmérsékieten állni hagytuk. Miután az oldatot leszívással eltávolítóttűk, minden lyukat hatszor mostunk 200 μΐ P-PBS-sei. 100 μΐ, B-PBS-sei hígított peroxidázzai jelölt nyál anfci-öCIF poliklonális antitestet tartalmazó oldatot adtunk minden egyes lyukba, A lemezt két órán. keresztül szobahőmérsékleten hagytuk állni. Miután az oldatot leszí vással el távolitot tnk, minden lyukat hatszor mostunk 200 μΐ P-BBS-sel. Ezt követően 100 μΐ TMB oldatot (nagy érzékenységű oldható TMB reagens, Boytek Co.) adtunk minden egyes lyukba. Miután a lemezt szobahőmérsékleten 23 percen keresztül inknőáituk, minden lyukhoz 100 ui stopoldatot (Stopplng reagent, Seytek Co,) adtunk, 450 nm-en m. i kr ο 1 eme z el ve s óva 1 ma gmé r t a k ml nd e η 1 y u k.
ab s z o r b an c i á j á t. A “ 1 - j e 1 ο 11 0 C1F kon. o a n t r á c 16 j á t a standard OCIF készítmény felhasználásával készített kalibrációs görbe segítségével határoztak meg.
(4) Az OBM teljes amínosav sorrendjét kódoló cBNB nu F IMS f í sL J? F yonciá i én a 5 „ tár üdülésé z a s a
A 8., (3) példában kapott OBM oDMS nukleotid szekvenciáját egy Tag DyeDeoxy Terminator Cycle Seguencing kit (a Peruin Elmer Ce, gyártmánya) felhasználásával határoztuk meg. Bővebben, az inzert fragmens nukleotid sorrendjét közvetlenül határoztuk mag a pÖBM231, mint templát segítségévei, A körülbelül 1,0 kb és 0,7 kb hosszúságú fragmenseket, amelyeket a pOBM.291 BcoAi restrikciós enzimmel történő emésztése során kaptunk, a pBClB (Takara Shuzo Co.) piazmld. BcoRX helyére vittük be, Ezen fragmensek nukleotld sorrendjét is meghatároztok, A kővetkező prímereket használtuk: SRR2 primer# amelyet a pcDL-Sá a296-ba bevitt DNS fragmensek nukleotid sorrendjének meghatározásához használtunk# M13PrimerM3 és MlzRrimerRV (mindkettő a Takara Shuzo Co, gyártmánya)# amelyeket a püCIO plazmádba bevitt CHS fragmensek nukleotld sorrendjének meghatározásához használtunk és az OBM#8 szintetizált primer# amelyet az OBM elit nukleotld sorrendjének alapján terveztünk meg, üzen primerek szekvenciái a SEQ TD NO 3 - SEy ID át é alatt láthatok.
Továbbá az OBM oDNB meghatározott nukleotld sorrendje a SNO 10 NO 2 szekvenciaként látható és az ebből meghatározott aminosav sorrend a sby TD NO 1 s z a k va η c i a k é n t 1á thato, §, Példa
A talái.mányzrB£a.D.zd.............cpNS.AIXMMÉÉváJl, expressziéja
A pöBM231 plazmádét COS-? sejtekbe transzfektéitűk egy 6 lyukas lemez minden lyukába blpofeotamine felhasználásával és a transzfektált COS-7 sejteket két napon keresztül 10% magzati borjuszérumot tartalmazó DMENben növesztettük, A tápközeget oisztein-metionin mentes BMBM-mel (Dalnippon Selyaku Co,# htd,) cseréltük ki (300 pi/lyuk)# amely 5% dlalizált magzati borjuszérumot fartaimazott, A sejteket 15 percen keresztül növesztettük# majd ezt kővetően 14 pl Express Protein babéiing Mix-et (10 mCi/ml# a Nen Co, gyártmánya) adtunk hozzá, Mégy óra növesztés után 200 pl 10% magzati borjuszérumot tartaimaaö
DAEM-et adtunk hozza. Hajh egy óra növesztés után a sej tokot kétszer mostuk PBS-sel. Ezt követően 0,5 mi, 1% TrltonX-luO-st, 1% marha hemoglobint, 10 pg/ml leupeptint, 0,2 TX.U/ml aprotinint és 1 mh FMEF-et tartalmazó TEA puffért (0,14 A AaCi-ot és 0,025% Nalg-ot tartalmazó 10 mM Tris-HCl (pH 8,0;) adtunk hozzá és az elegyet egy érán keresztül jégen hagytuk állni, A sejteket plpettázással roncsoltuk és áhl-on 10 percen keresztül 3000 x g-vel. centrifugáltuk, hogy megkapjuk a felülészét, zöOpl hígító puffért (0,1% Tritonh-100-st, 0,la marha hemoglobint, 10 pg/ml leupeptint, 0,2 TlO'/ml aprotinint és 1 mh BABF-et tartalmazó TEA puffer) adtunk ezen felülészö 100 pl-éhez. Az elegyet egy érán keresztül áhl-on protein. A Eepharosezai (50 pi) rázattuk. Az Így kapott keveréket 1 percig, íÜ-on 1500 x g-vel centrifugáltuk, hogy ősszegyojtsük a fslülűszöt és ezáltal eltávolitottuk az(oka)t a frakció(kapu, amely nem.-speeifikusan adszorneélédott a Protein A Sepharose-hoz, OCIF-ot (1 pg) adtunk ezen feiöloszéhoz és a keveréket éhl-on egy érán át rázattuk, hogy végbezvigyük az OC1F OBA-hez történő kötődését. AntiΛ' XX XX. * Xx ' U'' x ' X'\ ' ' elegyet egy érán át ihl-on rázattuk, Ezt követően Protein A Sepharese-t (10 pl) adtunk hozzá és a keveréket egy további érán keresztül ÜC-on rázattuk, maid ezt követően egy 1 perces, 4*S~on 1500 x g-vel történő centrifogálással összegyűltörtük a csapadékot. A csapadékot kétszer mostuk hígító pufferei, kétszer marha hemoglobin mentes higito pufferrei, egyszer TEA pufferrei és egyszer 50 sál TrisHCi-val (ph 6,5). Mosás után 10% β-merkaptoetanolt tartalmazó EDE puffért (0,125 A Tris-HCl, 4% nátriumdódéulIszuifát, 20% glicerin, 0,002% hrőmfenol kék, pH
5
6# 8) adtunk a csapadékhoz. Az elegyet 5 percen, keresztül löQÜl-on melegítettük és SDS-PAGF-ra vittük (12#5% poliakrilamid gél# Daiiohi Chemical Cc.# htc,), A gélt szokásos eljárás szerint fixáltuk, Az izotóp jeleket Amplify^ (Amersham Co,) felhasználásával erősítettük és a mintát Bio Mar MA filmre (Kodak. Cö,) exponáltuk -Oö^G-on, Az eredmények. a 8, ábrán láthatok# ami azt mutatja# hogy a találmány szerinti oBBS által kódolt fehérje körülbelül 40.000-ee molekulatömeggel rendelkezik,
A tg. Iá Írná ny......szerinti......cDMS......ál tál, kódolt fehérje OCXF-hoz
10r tesd kö todase
A pOBMBOl plezmidot COS sejtekbe transz!aktáitok egy 24 lyukas lemez minden lyukába Lipofectamine felhasználásával, z-3 napos növesztés után a sejteket szérummmen.tes DHFM tenyésztápközeggel mostuk, A kötődési ássay-hez való 200 pl tenvésztápközeget (olyan szérumatentes DMEM tenyésztápközeg# amely 0#2i borjú szérumalcumint# 20 mM hepes-t.f 0#img/ml teparint és 0#2i MaMy-ot tartalmaz)# amelyet 20 ng/ml ubX~teI jelölt OCIFfai egészítettünk ki adtunk a lyukakba, A többi lyukba a kötődési assey-hez való 20-0 pl olyan tenyésztápközeget adtunk# amelyhez a .20 ng/ml. 'UöX~tel jelölt OClF-on felül 8 pg/ml jelöletlen. ÖClF-ot Is adtunk. Egy órás# 37®C-on COS~ inkubátorban. (51 CC?) történő növesztést követően a sejteket. kétszer mostuk 500 pl 0#Img/ml kaparint tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasooidattai, Majd 500 pl 0#Ü M MaOB-ot adtunk minden, lyukba és a lemezt a sejtek feloldása céljából 10 percen át szobahőmérsékleten állni
6 hagytuk. Minden lyukban megmértük gamma számlálóval a mennyiségét. Eredménykéné, mint ahogy az a 9, ábrán látható, azt kaptuk, hogy a ^‘T-tél jelölt OCTF csak azokhoz a sejtekhez kötődik, amelyekbe a pOBMlSI plazmídot transzfekzáituk, Ezenfelül megállapítottuk, hogy a kötődés nyilvánvalóan a (jelöletlen) ÖCXF 400-szoros koncentrációban történő hozzáadása által gátiődofcfc, Ezen eredmények azt mutatják, hogy a pOSMfál plazmádon lévő cDBS által kódolt OBM fehérje specifikusan kötődik a transzfektált COS-7 sejtek felszínén lévő OCXF-hoz..
il, Példa a 1<-'l-tel jelölt OC1E és atsiálnásy szerinti cDNS által ködeit fehérje keresztkötése ^X'-tel jelölt monomer tipasu OC1F és a találmány szerinti cDMS által kódolt fehérje keresztkorését azért végeztük el, hogy a találmány szerinti cDNS által kódolt fehérje jellemzőit még részletesebben megvizsgáljuk. Miután a pöBM291 plazmádét a 8.(3) példában használt eljárás szerint COS-7 sejtekbe transzfektáltuk, a fent ismertetett kötődési assay-hez való, ''I-tel jelzett OC1Fot tartalmazó (25 ng/ml) 2öö pi tenyéaztápközeget, adtunk a lyukakba, h többi lyukba olyan \o^ ό χ, * ' ' \ * tenyésztapkőzeget adtunk, amelyhez 4öC)~szorbs koncentrációban adtunk 'jelöletlen OCTF-ot a hozzáadott 12sl™bei jelölt OCIE-on felül. Egy órás 37ϋ-οη CXyínkubátorban (5% COm történd növésztea után a sejteket kétszer mostuk 500 pl 0,1 mg/ml heparint tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasóoldattal, 100 ng/ml keresztkötö ágenst, DES-t (öiszukcinimidil~'szuberát, a
Pierce Co , gyártmánya) tartalmazó 5öö μΐ foszfáttal palléréit konyhaeöoldatot adtunk a sejtekhez és ezt egy 10 perces 0°C-cn, lezajló reakció követte. A sejteket kétezer? mostok 1. ml hideg foszfáttal pofferelt konyhasót Idát tál (Ö°C), Ü Triton Χ-100-at (bakó Poré Chemicals Co,, Ltd,}, 2 mM PXSP-et (feniÍmetileznifenil™fluorid, Sigma Co, ) , köpd Fepstatinf (bakó Pere Chemicals Co,, Ltd,), .10 μΜ Leupeptint (Cakó Pere Chemicals Co,, Ltd.}, lö μΜ antipain~t (Wak.o Poré Chemicals Co,, Ltd,} és 2 mM EDTA-t (bakó Pere Chemicals Co,,· Ltd,) tartalmazó 100 pl 20 mM Hepes puffért adtunk hozzá, majd ezt követően a. lyukakat a sejtek feloldásához 30 percen át szobahőmérsékleten hagytuk állni, őzen mintákból. 15 μΙ-t a szokásos eljárás szerint EDE jelenlétében -redukáló körülmények között, melegítettünk és 4-20% poliakriiamid gradiens gél (Daiichi Pere Chemical Co,, Ltd,} felhasználásával SOSeiektroforézissei vizsgáltuk, Az elektroforézis után a géleket megszán!tettük és Sióban MS filmre (Kodak Co,) exponáltuk EioMax MS érzékenyitő ernyő (Kodak Co,} felhasználásával 24 órán keresztül -öö^C-on, Az exponált filmet szokásos eljárás szerint hívtuk elé, Eredményként, mint azt a 10, ábra mutatja, egy 90»000-1X0« 000 molekulasúlya sávot kaptunk a A‘;sX~teX jelölt monomer típusú OCXF és a találmány szerinti cSMS által kódolt fehérje keresztkötése jóvoltából, , Mida
WnáheynΛΦ1ορt ana 11 zi s
A növesztett ST2 sejteket egy 25 crü~es tapadó sejtndvesztésre szolgáló T—edénybe ősszeöntöttük, trípszinnel kezeltük és a T-edényből arattunk. Mosás után a sejteket egy 225 ob2~ős T-edénybe ültettük Át és 4 .napon keresztül Cöa-inkubátorban növesztettük őket 60 mi olyan a-MEM tenyésztápközegben, amely 10<! d aktív formájú D3~ vitamint, 10'? M dexametazont és 10% magzati borjuszérumot tartalmazott. Az Így növesztett ST2 sejtekből Xsogen (dako Fűre Chemicals Co,, Lfcd.) felhasználásával kivontuk az Összes RNS-t, Továbbá ugyanilyen mádon azokból az ST2 sejtekből is kivontuk az összes RNS-t# amelyeket aktív formájú D^-vitamin és dexametazon hiányában, növesztettünk, Miután 2,0 μΐ 5X géielektroforézis puffer oldatot (0,2 M morfolino propánézuifonsav, pH 7,0, 50 md nátrium-aoetét, 5 mM BDTA) es 3,5 μΐ formaldehidet és 10 μϊ formamidot hozzáadtunk mindegyik Összes RNS 20 pg-jáhez (4,5 μΐ) , az elegyekefc 15 percen át 55®C~on Inkubáltuk és eiektroforézissei megvizsgáltuk. Az elektroforézishez való gélt 1,Ö% agarözbol, 2,2 M deionizált formaldehidből, 40 md morfolino propánszulfonsavből (pH 7,0), 10 md nátriumaoetáthdi és 1 mM EDTA-böl állítottuk elő, Az elektroforézist 40 md morfolino propánszulfonsavből, pH 7,0, 10 md nátrium-acetétből és 1 mM EDTA-böl álló puffer oldatban végezzük el. Az elekfroforézis után az RNS-t nylon membránra vittük át. A pOBM291 EcoR.1 restrikciós enzimmel végzett emésztése során körülbelül 1,0 kb DNS fragmenst kaptunk, A hibridizációt ezen DNS fragmens felhasználásával végeztük, degaprime DNS jelölő kittel (Amersham üo,i jelölve és; próbaként m-^'F-dCTF-t (Amersham Co,) használva, Eredményként, mint az a '11. ábrán látható, megállapitottuk, hogy amennyiben ST2 sejteket aktív formájú 5g- vitamin és dexametazon jelenlétében, növesztettünk, a találmány szerinti oDNS által kódolt fehérje (OBM) génexpressziőja eresen indukált.
A t a X áImány szerinticONS általkódolt fehérje osteociast ké p z é s t s e q 11 ő kep e s s é ge
A. 8,(3) példában Ismertetett eljárás szerint O0BM291' et transzíektáitank COS sejtekbe. Három nap elteltével a trípszinlzáit sejteket centrifugális segítségével egyszer mostuk foszfáttal pufterelt konynasóoldattal, majd 1% paraformaldehldet tartalmazó HBS-seX fizáltuk szobahőmérsékleten 5 percen át, ezt követően centrlfngálás segítségévei BBS-sei hatszor mostuk, 700 pi IklCd/ml egér lépsejtet és 350 pi éXXCb/ml, 10''' M aktív formájú D3-~ vitamint, 10“'' M dezametazont és 10% magzati horjúszérnmct tartalmazó α-HBM tenyeszfapközegben szuszpendált ST2 sejtet adtunk egy 24 lyukas lemezbe, TC inzertet (huné Co.) raktunk minden lyukba, A fent leírt fizéit COS sejteket (350 pl) a fent említett tenyésztápkczeggel különböző koncentrációkra hígítottuk és a TC inzerthez OCIF oldatot 50 pl adtunk és 5 napon keresztül 37öC~on növesztettük őket. Eredményként megállapítottuk, hogy az OCIF osteociast képzést gátló aktivitása a találmány szerinti cúFB által kódolt fehérjével gátolható.
A.szekretált formájú OBM ezpresszioja
11) A szekretált forrná.jÁ.,,.fobd ezpresszlójához valö Akádalíi.
elkészítése
Primer ként OBM HF-et (SFQ ID NO 7} és OBM XE-et (SEQ ID NO 8) , templátként pOBM28'i~et felhasználva végeztünk. PCD reakciót. Az agaröz géleiektroforézis segítségével végzett tisztítás után a terméket Hindii! és EcoBX restrikciós enzimekkel emésztettük és tovább tisztítottuk agaröz gél.elektroforézis segítségévei. A tisztított pSeo TagA (Invitrogen Co,} ; v v \ ·.-· í u fragmenst (0,6 kb), a HindiII/FcoüT rragmensét kb} és a:
OBM cDNS
EcoEl/Pmael rragmensét (0,32 kb) egy ligálás kit ver, 2 (Takara Shuzo re a ko ié te r mé k
Co,) felhasználásával ligáitok. A felhasználás áv al transz forrnáltunk
Escheriohia coli DH5a~t, A plazmidokat az igy kapott ampicii kin rezi sztens törzsekből tisztítottuk alkáli SBC eljárással és restrikciós enzimekkel emésztettük, hogy kiválasszuk azt a plazmidot, amely 0,6 kb és 0,32 kb hosszúságú pSeo TagA-ba bevitt fragmenseket tartalmaz, A kiválasztott plazmidot ágy azonosítottuk, hogy a szekrétáit formájú OBM-et kódoló szekvenciával rendelkezik (nukieofcid sorrend: 338-1355 a SEQ ID NO 2-ben, aminosav sorrend; 72-316 a SPQ ID NO 1-ben), amit egy „dyeterminator cycle seguencing FS kit” (Peréin. Plmer Co,} segítségével végzett szekvenálással határoztunk meg. Ezt a plazmidot Nhel és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük, hogy a szekretált formájú OBM oDNB-t tartalmazó fragmenst (l.ökb) Izoláljók agaröz gélelektroforézissel, Ezt a fragmenst egy pCEP4 expresszlós vektor Nhel/Xhol fragmensébe (10,4 kb) (Invitrogen Co.) vittük be egy ligálási : kit felhasználásával es ennek reakciótérmékét transzforrná1tun k plazmidokat az rezisztens törzsekből tisztítottuk alkáli SOS eljárással és restrikciós enzimekkel emésztettük, hogy kiválasszuk azt az Sscheriehia coli törzset, amely tartalmazza a
Psoheriohia coli DHSa igy kapott amplcillin felhasználva sejteket, A szekretált formájú OBM expresszíös plazmádjót (pCEP sOBM) a megfelelő szerkezettel. A pCEP sOBM-et tartalmazó Esoheriohla coll törzset növesztettük és a pCEP sOSM-et „v A : ., s'» r -m mu n \ \ ι m i ön.
tisztítottuk.
(2) & gzekretélt formájú OBM expresszlőj a
293-SBBA sejteket szuszpendáltunk 10% B’CS-t tartalmazó IMBM-ben (TMDM-10% FCS) és egy kollagénnel bevont 24 lyukas lemezbe (a Sumitomo Bakelité Co.# Ltd. gyártmánya) ültettük !xlü'/2 ml/lyuk sejfsűrűséggel és egy éjszakán át növesztettük őket, A sejteket 1 μρ pCEP sOBMmai vagy pCEPi-gyei transzfaktaituk 4 μΐ Lípofectamine íG.iboo Co.) felhasználásával . Mintán 0,5 mi szérummentes IMDM-ben vagy Itó.DM-10% ECS-ben két napon keresztül növesztettük a sejteket, összegyűjtöttük a kondicionált tápközeget, A szekretált formájú OEM kondicionált tápközegben végzett ezpreeszlöját a következők szerint vittük véghez. A kondicionált tápközeghez annyi nátriumhidrogénkarbonátot adtunk, hogy végső koncentrációja 0,1 M legyen és az oldatot egy 56 lyukas lemezbe adagoltuk. A lemezt egy éjszakán át 4°C-on állni hagytuk, Így immobil!zálva az OBM-et a kondicionált tápközegben a 96iyukas lemezen, A lemezt PBS-sel (B-PBS) négyszeresére hígított Blook Ace^ (önöm Brand Máik Predudts Cd.# Ltd.) oldattal töltöttük fel és két órán át szobahőmérsékleten hagytuk állni, hegy a lemezen a visszamaradt kötőhelyeket blokkoljuk, Miután m_ .tor rvuvbo·' n xn · x oo' 'Ά μΐ 3-100 ng/ml OCIP-ot adtunk, a lemezt két órán át 3?*Con hagytuk állni, majd ezt követően 0,05% Tween 20-at (PBS-T) tartalmazó PBS-sel mostuk. Ezek után a WO96/26217ben ismertetett, B-PBS-sel hígított 100 μΐ perozidázzal
2 jelölt nyűi antí-OCXF poliklonális antitestet adtunk minden lyukhoz. Miután két órán át Sl^C-on állni hagytuk, a lyukakat hatszor mostuk PBS-T-vel. Ezt követően lyukanként 100 pl mennyiségű TMB oldatot (TMB oldható reagens, nagy érzékenységű, Soytek Co.) adtunk. hozzá és szobahőmérsékleten körülbelül 10 percen át hagytuk állni, ami után a reakciót 100 pl stop-oldat (Stopping reagent, Soytek Cd.) minden lyukhoz történd hozzáadásával leállítottuk. Egy rnikrolemez olvasó segítségével minden lyuk abszorbancláját 450 nm-en megmértük, áz eteomények a 12. ábrán láthatók, ami azt mutatja, hogy a 450 nm-en mért abszorbancia a hozzáadott OCIF koncentrációjának függvényében növekedett azon a lemezen, amely kondicionált tápközegében a pGSP sOBM-mel transzfektált sejtek voltak immobilizeIva. Másrészről az abszo.rbe.ncia szemmel látnatöan nem növekedett azon a lemezen, amely kondi ci oná11 tápkö zugéban a pCEPi veklórral t rans z fektéit sejtek voltak Inmiobilizáiva< A 13. ábra egy olyan kísérlet eredményeit mutatja, ahol az immobilizációhoz használt kondicionált tápközeg arányát Ö~9Ö% fartományban változtattuk és az OCIF egy specifikus koncentráciőját (50 ng/ml) adtuk hozzá. Látható, hogy a 458nm~en mért abs zorbancia a kondicionált t ápközeg növekedésének arányában növekedett azon a lemezen, amely kondicionált tápközegében a pCBP sSSM-mel transzfektált sejtek voltak izmiobiiizálva, míg ellenben az abszorbancia ilyen növekedése, nem. volt látható azon a lemezen, amely .kondicionált tápközegében a pCBPi vektorral transzfektált sejtek voltak immobilizálva. Ezen eredmények alapján megállapítottuk, hogy a pCEP sOBM-mei transzfektált sejtek kondicionált tápközegében termelődik a székiéiült formájú OBM.
Atipr edexln-OBM fűzi ás IMtaO e < Aráivalexpres szlój a (1) A tloredcxlngOBMfűzles fehérje JTrxgOBM)......expresszlós μ (2. ' .c -- ? ,\ 8nu ό , n( '' mM d2TB-f (Takars Shuzo Cck, 77,5 μΐ sterilizált desztillált vizet, 2 pi pOBM291 (10 ng/μΐ) vizes oldatot, 1 pl primer ΟΒΜ'5-at (100 yrvvh Sty ID NO 9), 1 pl primer OBM2aiR2-bf (100 pmoi/pl, fii ID 20 10) és 0,5 pi BxTag-r (5 u/pl) (lakara Shuzo Co.) kevertünk Ossza és egy mikrocentrifuga cseber reagáitattunk (BOR reakció). Miután 95*C-on 5 percig, 5ök>on egy másodpercig, Söhö-en egy percig> 7sB>on egy másodpercig és izbdon 5 percig reagáltettük, egy olyan ciklikus reakciót ismételtünk 25szer, esd 90°C-on egy percig, óO^C-on egy másodpercig, 55®C-en egy percig, 74®C-on egy másodpercig és 72®C-on 5 percig zajló reakciókból áll. Az összes reakciótólyadékbél egy körülbelül 750bp 025 fragmenst tisztítottunk 1% agerőz gélelektroforézis segítségévei QlACk il. gélextrakcios kit (Oiagen Co.) felhasználásával, A tisztított D2S fragmens teljes mennyiségét Sáli és ScoxI restrikciós enzimekkel (Tassra Shuzo Co.) emésztettük és egy 1.5% agaráz gélelektroforézisre vittük, hogy egy körülbelül 150 bp 02S fragmenst (1. fragmens) tisztítsunk ki, amit 20 pl sterilizált desztillált vízben feloldottunk. Ugyanezen a mádon egy körülbelül 580 bp 028 fragmenst (2. fragmens) kaptunk 4 pg pöBM291 BamHX és BcoRI restrikciós enzimekkel (Taksra Shuzo Co.) végzett emésztésével és egy körülbelül
3,6 kb DBS f r somén st (3. fragmens) 2 pg pTrXEna (Invitrogen Ce.) BamHX és SaXX restrikciós enAimekkel (Takara Shuzo Co.) végzett emésztésével, ezeket megtisztítottuk és 20 pl sterilizált desztillált vízben feloldottuk, A DBS fragmensek tisztiffsához QiaezII gélextrakoiöe kiket használtunk, Az 1-3, fragmenseket ,,DMA. llgation kit ver, 2” (Tékera Shuzo Ce,) feIhászáélávával 16öC-gn 2,S órán át tartó inkubáció segítségével ligáitok, A lígáciős reakeiőeiegy felhasználásával transzformáltunk GX724 Escherichia coli törzset (Xnvírngen Co,) a ThioFuzien Ezpression System (Invirogen Co,) használati útmutatójában leírt eljárás szerint. Egy olyan plazmáddal rendelkező mikroorganizmus törzset, Amelyben az com cohs fragmens inukleotiö sorrend; 35O-XXXX a SEC 10 NO 2-ben, aminosav sorrend; 76-316 a SEQ ID NO 1-ben) keretben fuzionált egy tioredoxin génhez, választottunk ki a kapott ampiciilin rezisztens transzformánsok kozni a restrikciós enzimekkel végzett emésztés során kapott restrikciós térképek vizsgálata és a ONE ezekvencia meghatározása segítségévei, Az így kapott mikroorganizmus törzset GI7 24/pirzOSMx3~nek neveztük el, ( ) OBM e zp r e s s z 16 j a Esc h a r l ob la . coliban
GX724/pTrxOBMES-öt illetve pTrz.Eu.s~t tartalmazó GI724~et (G1724/pTrxEus) hat órán keresztül 30*C~on rázstva növesztettünk 2 ? k'C-Ami csoob' (0,61 NaaHED«, 0,3% RHp-Tg, 0,051 NsCl, 0,11 EfgCl, 1,21 kazaminosav (Difco Go,), 1% glicerin, 1 mM MgClj? és 100 pg/ml ampiciilin (Sigma Co,), pH 7,4). 0,5ml táptalajt adtunk óö ml indukciós tenyésztésközeghez (0,61 NagHPOy, 0,31 KipPCg, 0,031 NaCl, 0,1% NihCl, 0,21 kazaminoeav, 0,51 glükóz, 1 mM MgCl^ és 100 pg/ml ampiciilin, pH 7,4) és rázatássa! BlbC-om növesztettük, felkor ez ODgöi>,^ elérte a körülbelül 0,5-08, 0,1 mgZml végső koncéntnáciéban Ltrlptofánt adtunk hozzá, önöd ezt kővetően további 6 órán keresztül 30öC~on vázaitok a tenyészetet, A tenyészet táptalaját 3000 x g sebességgel centrifugáltuk a sejtek, összegyűjtése céljából és ezt 12,5 ml BB3-ben (10 mái. foszfát paffén, 0,15 M MaCl, pH 7,4) szuszpenőáltuk, A sejtek roncsolásihez a sznszpenziót ultrahang generátorral (Ultrasonies Cc, > kezeltük, A roncsolt sejteket 7000 x g sebességgel 30 percen át centrifugáltak, hogy az oldható fehérje frakciónak megfelelő felnlusző folyadékot megkapjuk, 10 pl Ilyen oldható fehérje frakciót redukáld körülmények között SOS e le k t r o f o r é. z i s s a 1 me g v.i z s g á. 1 tan k egy 40 kOa moiakulatőmegn G1724/pTrxöBM25 oldható fehérje poliakrllamid (10%) , Ennek eredménye, hegy s á v o t t a 1 á 11 a n k a frakció fában, de ezt nem.
találtak meg a GX?24/pTzxBas oldható fehérje frakciójában (14, ábra). Követ kezéskapocs megállapítottuk, begy a tioreőozin és OBM fúziós fehérjéjét (Trx-CBM) expresszáltattak Fsoherichis coliban.
(3) A Trx-ΌΒΜ OCIF felé mutatott kötődési képessége
Az expresszált Trx-OBM OOlF-hoz történő kötődését a következő kísérlet szerint igazoltak. 10 mM nátriumhídrogénkarbonát oldattal SöOö-szeresére hígított antitioredexin antitestet (Invirogen Go,) adtunk egy 86 lyukas immaniemezrs (Bűne Co,) 100 pl/iyak mennyiségben., Miután egy éjszakén át 4öO-on állni hagytuk# a lyukakban lévő folyadékot eltáeolltettük, 200 pl, BBS-sel (BA-BBB) kétszeresére hígított Block Aoe^ (Snoe Brsnd. Műk Bredaots Co,., btd,) oldatot adtunk minden lyukba.. Mintán egy órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, az oldatot eltávolítottak és a fent ismertetett G1724/pTrxOBM2o-böl vagy Gi724/pTrxFus-ból származó oldható tekerj a frakciókat BA-FBE-sel hígítva különböző koncentrációkban minden lyukhoz 100 pl mennyiségben adtuk hozzá, Hintán két órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat háremszer mostuk BBS-T-vel és BA-FBS-sel hígított 100 pi öCIF-fal (100 ng/ml) töltöttük fel. Mintán két érán át azohahőmémékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat háromszor mostuk RBS-T-vel és BA-FBS-sel 2,OQO-szeresére hígított 100 pl peroxidázzai jelölt nyül anti-OClP poliklonáiís antitesttel (a MO 96/2621?~ben ismertetett) töltöttük fel. Mintán két órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat hatszor mostuk BBS-T-vel ás lOOpl TMB oldattal (TMB oldható reagens, nagy érzékenységű, Scytek Go.) töltöttük fel. Miután körülbelül 10 percre szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat lOOpl stop-oldattal (Stopping Reagent, .Scytek Cd,) töltöttük fel. Egy mikrolemez olvasó segítségével mindegyik lyuk ahszorfoanoráját megmértük 450 nm-en, Az eredmények a 15, ábrán láthatok, Nem volt abszorbanciabeli különbség a G1724/pTrxFus-ből származó hozzáadott oldható fehérje frakciót tartalmazó minta és ezen oldható fehérje frakció hozzáadása nélkül készített mints között. Másrészt az abszorbanola azon minták esetében az oldható fehérje frakció koncentrációjával arányosan megnőtt, amelyekhez a G1724/pTrxÖBM2ö-ból származó oldható fehérje frakciót adtuk. A másik kísérlet eredményei, amelyben az oldható fehérje frakció hlgitási mértékét állandó értéken (1%) tartottuk, ellenben BA-RBS-sei különböző koncentrációkra (O-löO ng/ml) hígított öClF-ot adtunk hozzá, a lö, ábrán láthatók, náthatö, hogy az OCXF bármely koncentrációjánál az abszorbanola alacsony maradt azon minták esetében, ahol a GX724/pTrxFuS'bci származó oldható fehérje frakciót
8?
használtunk, mig az abszorbancia. az OCIF koncentrációjával arányosan növekedett azon minták esetében, amelyekhez a G1724ZpTrxÖBM25~böl származó oldható fehérje frakciót adtuk. Ezen eredmények alapján megállapítottuk, hogy a GI7247pTrxO8M25-böl előállított Trz-OBM OCIF-hoz kötődő képességgel rendelkezik, (4) Trx-OEM-et termelő „.Ihuherlchla ..jjpií___________Bagymertekö növesztése
A GI724/pTr.köBM2S sejteket AHG-Amp agaron (0,63
Na2HFíb, 0,3% HlyPCh, 0,05% BaCI, 0,1% fügCl, 2% kazaminosav, 1% glicerin, 1 mM MgCls és 100 pgZml ampioillin, 1,5% agat, pH 7,4) szélesztettük platina oitőkaccsal, A sejteket egy éjszakán át 30oC-ön növesztettük, Az így növesztett sejteket 10 ml indukciós tápkőzegben sznszpendáituk, A szuszpenzloböl mindkettő 2 literes, 500 ml indukciós tápközeget tartalmazó Erlenmeyer lombikba 5 ml-t adtunk és 30öC-on rézatás közben növesztettünk. Amikor az elérte a körülbelül 0,8-öt, 0,1 mg/ml végső koncentrációban I-triptofént adtunk hozzá. A rázatva növesztést hat őrén kérésztől 30oC-on folytattuk, A tenyészet táptalaját 2ö percen keresztül 3000 x g sebességgel centrifugáltuk, hogy ősszegyüjtsük a sejteket, amelyeket 160 ml FBS-ben sznszpendálfunk, A szuszpenziőt ultrahangos generátorban (Gltrasonies Co.) kezeltük a sejtek roncsolása céljából, A felölüszé folyadékot 30 percen át 7000 z g sebességgel centrifugáltuk, hogy megkapjuk az oldható fehérje frakciót.
( v)- ^.vváh^hmmíob111 zaIt affinitásoszlop el képzi teae összekevertünk 2 g TSHgel AF~Toiesyi Toyopal 650-et (Tosoh Corp,) ée 35,0 mg, a WO36/262I7-ben ismertetett eljárás szeriét előállított rekombináns OCIF-ot tartalmazó <0 ml 1,0 M kálium-tesz fát puffért (pH 7,5), A keveréket egy éjszakán át 4®C-on finoman rázattuk, hogy végbemenjen a kapcsolási reakció, A reakciöeiegyet a felüiűszo eltávolításához centrifugáltuk, Annak érdekében, hogy a felesleges visszamaradt anyagokat inaktivárjuk, 40 ml 0,1 M Tris-HCl puffért (pH 7,5) sutunk a. kicsapatott Hordozóhoz és a keveréket egy órán keresztül finoman rázattuk szobahőmérsékleten. Az oszlopban lévő hordozót 0,0X1 poliszorbát Bö-at és 0,2 M HaCl-ot tartalmazó 0,1 M glicin-HCl pufferrel (pH 3,3) és 0,015 poliszorbát 80-at és 0,2 M HaClOt tartalmazó 0,1 A nátrium-citráf pufferrel (pH 2,0) mostuk. Az oszlopban lévő hordozót úgy hoztuk egyensúlyba, hogy kétszer feitdltöttük 0,01% poliszorbát 00-at tartalmazó 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,4), (ú) A_Trz-OBM_________tisztitáee__________Qh tv tágobi 11 zá 11 λ af£ in 11 jjy oszlop félhaagnúiáHOköá
Hacsak nem adtunk meg más hömérsékletérteket, a. TrnÖBM tisztítását 5oC-nn végeztük, A fent ismertetett OCXFimmchilizált affinitás hordozol (10 ml) és a 15,(4) példában előállított oldható fehérje frakciót (120 ml) összekevertük. Az elegyet egy éjszakán át finoman kevertetrük 4A2-on négy darab 50 ml-es centrifugacecben rotor segítségévei, Egy Sccno-columxü-t (belső átmérője; 1,5 cm, hossza: 13 cm, a Hlukad Oo, gyártmánya) feltöltöttünk a keverékben lévő hordozóval, Az oszlopot 300 ml, 0,01% poliszorbát Oö-at tartalmazó HBn-sel, 100 mi, 0,015 poliszorbát 80-at és 2 M HaCl-ot tartalmazó 10 mh nát r 1 um- foszfát p u £ f e r r e 1 (pH 7,0) ás X 0 0 mi, 0,01% poXiszorbát SO-at ée 0,2 M baCl-ot tartalmazó 0,1 51 glicin-HCI sorrendben fehérjéket tartalmazó pnfíerreX (pH 3,3) töltöttük fel ebben a Ezt követben az oszlopon adszorbeálődett
0,01% poliszorbát 30-at és 0,3 M HaCl-ot 0,1 M nátrium-cifrát pnfferrel (pH 2,0} előéltük. Az eluátumot 5 ml-es adagokban gyűjtötték össze. Mindegyik igy kapott frakciót azonnal semlegesítettük 10 térfogati 2 M Tris pof fez (pH 3,0) hozzáadáséval. Az elualt frakciókban a Trz-öBM jelenlétét vagy hiányát az előzőekben, a 15.(3} példában (OCIF felé matatott kötődési képesség) ismertetett eljárás szerint határoztak meg. A Trx-OBM-et tartalmazö frakciókat összegyűjtöttük es tovább tisztítottak.
(7} A TtugOBM .....fi gr ti. fása égigtűrésgeg.lt ségéyel
A 15.(3} példában, kapott körülbelül 25 ml Trx-OBM frakciókat oentrifugálásssl hozzávetőlegeseh 0,5 ml-re koncentráltak Centriplas 10 és Oentrioon 10 (Amieon Co.) felhasználásával. Ezt a mintát egy Saperose 12 HE 10/30 oszlopra (1,0 x 30 cm, Enarmacia Co.) vittük, amit előzőleg 0,013 poliszorbát 30-af tartalmazó EBB-sel hoztunk egyensúlyba» Az elválasztáshoz mozgó fázisként 0,öl% poliszorbát 80-at tartalmazó használtunk 0,25 ml/perc tárfogatárammal. Az oszlopról lejövő eXuátamot 0,25 m..l-es adagokban gyűjtöttük össze. Az Így összegyűjtött frakciókban levő Trx-CEM-et az előzőekben, a
15.(3) példában Ismertetett eljárás szerint és Phast System (Pharmacia Co.), valamint ezüstfestés eegitségével végzett SDS-poliakrilamid elektroforézissel (10-15% poliakrilamid gél, Pharmacia Co.) határoztuk tiszt ltott Trx-óBb-et tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és meghatároztuk a koncentráclőj át.
frakciók/ fehérje meghatározását standardként meg. A (20-23. Trx.'-OBM
A f e h e r j e ko n c e n t. r á c i ö marha széramaihumint felhasználva végeztük el, 00-Protein assay kit (BíoRad Co.) segítségével.
IS, Eélda
ÜMu.zÉBntnouhájp·,1.31 i tó tára pOBM291-et és peDb-SA <x298-ot COS-? sejtekbe transzfektáltuk Idpofect&mine {Gibco Co,) felhasználásával. A sejteket egy napon keresztül 10% FOS tartalmú OMEM-ben növesztettük, trlpezinizáltuk, hal CO sejt/lyuk mennyiségben 24-lyukű lemezekre fedölemezeken (15 mm-es kerek, a Matsunami Co, gyártmánya) széiesztett'öh és két napon át növesztettük, A tenyészlemezt EBS-sei egyszer mostuk, A sej tekét 1% pataformaldehid tartalmú BBS-sel fixáltuk, szobanömáreékleten 8 percen át, A lemezt, amelyekhez a fixált sejteket erősítettük, PbS-sel hatszor mostuk, majd ezt követően minden lyukhoz 700 pl-t adtunk abbéd az oldatból, amely ügy készült, hogy 10d M aktív formájú %~vi tamint, 10'! M dexametazont és 10% magzati borjűszérumot tartalmazd m-MEA-ben XxlöVml sejfsűrűséggel egér lépsejtokét szuszpendáltunk, Ainden lyukba Millicell PCE-et (Bíllipore Co,) helyeztünk, és s fent említett tenyésztápközeghen. szuszpendslt S12 sejtekből (IxlöVml) 700 pl-t adtunk a Millicell ECF-be, majd ezután hat napon keresztül 37°C-on inknbáltunk, A növesztés után a Miliicell tCF-et eltávolítottak, a lemezt FBB-sel. egyszer mostuk és a sejteket aoeton-etanol oldattal {50:50} egy percig fixáltuk. Ezután a borkösav rezisztens sav feszfátaz aktivitást (TRAP) mutató sejteket, amely aktivitás az osteooiastok specifikus jellemzője, heukocyto Aoiö Phosphatase kit (Sigma Co,) felhasználásával szelektíven festettük. A mikroszkópos megfigyelés eredményeképp azt kaptak, hogy azokba a lyukakba, amelyekbe a poDL-SB. mlsö-tai transz!aktáit COS-7 sej tehet fixáltunk, nem figyeltünk meg TBAP-pozitiv sejteket, Ezzel ellentétben 45±1S (átlag m száras, n-m) TEAB-pozitiv sejtet figyeltünk meg azokban a lyukakban, amelyekbe pöBM291-™gyel transzfektált COS-7 sejteket fixáltunk,. Továbbá azt is megállapítottuk, hogy ezen TRAP™ pozitív sejtekhez kaleltonin. kötődött. Ezen eredmények alapján bebizonyítottuk, hogy az OEM osteoolast képzést indukáló aktivitással rendelkezik.
A TsxOBM és a ezekrecélt forrná pa OBM osteoolast képzést
1nonkáüö_akt1yítösa
10* M aktív formájú D·,-vitamint, 10“s M dexametazont és 10% magzati borjúszérumot tartalmazó u-MEM-ben szuszpenöáitnnk axlöVml koncentrációban egér lepsejteket, A azuszpenzíőt 2<~lyukas lemezbe töltöttük, lyukanként 350 pl mennyiségben. Ezután minden lyukba a fisztitett Trx-OBM fent említett tenyésztápkdzeggel hígított 350 pl-ét (40 ng/mij, 350 pl elvan IMDM-10% FÜS-ben 293-EBBA sejtek növesztésével előállított kondicionált tápközeg a fent említett tenyésztapközeggel ÍÖ~-szereaére hígított oldatát töltöttük, amelybe pCEP sOEM-ot vagy püRém-et transzfektáltunk, vagy 350pl. csak a fent említett tenyésztápközeget töltöttük, Millióéi! PCF-et (Mlllipore Co,) helyeztünk minden lyukra, amelyhez a fent említett tenyésztápközegben szuszpondált ST2 sejtekből HxlöVml) áöö pl-fc adtunk. Hat napon, keresztül tartó inknháciö után az
V,.
eitávolitottuk a Mliiicell RÜE~st, A lemezt BBS-sel egyszer mostuk és a sejteket aoeton-etanol oldattal (50:5-0) egy percig fixáltuk. Ezután a barkósáé razisztens sav foszfátén aktivitást (!RAP aktivitási mutató sejteket beukooita Aoid Phosphatase kit (Sigma Co,) felhasználásával szeiektiven festettük·, á mikroszkópos megfigyelés eredményeképp azt kaptuk# hogy azokban a lyukakban# amelyekbe nem adtunk Tra-OBM-et# nem figyeltünk meg TPAF-aktivitáet mutató sejteket# míg !Ö6±21 (átlag l szoros# n-3) TEAP-pozitlv sejtet figyeltünk meg azokban a lyukakban# amelyekbe adtunk Irz-öRáh-et, hasonlóan# nem figyeltünk meg TPAs-aktivitást mulató; sejteket azokban a lyukakban# amelyekhez pCBRi-gyel transzfektált 2Β3~ΈΒΝΑ kondicionált tápközegét adtuk# míg 120±31 (átlag a szórás# n-3) TRAF-pozltiv sejtet figyeltünk meg azokban a lyukakban# amelyekhez pCBRsöRM-mel transzfektált 293-BBNA kondicionált képkózeget adtuk. Továbbá azt is megállapítottuk# hogy ezen TRAP-pozitiv sejtekhez kaiéitonin kötődött, Ezen eredmények bebizonyították# hogy a Trz-bBM és a szekrétáit formáié OBM osteoclast képzést Indukáld aktivitással rendelkezik.
oxpresszélt OBM fehérje ás azonossága (1) W.O.....éháfpoliklonália antitest készitéee három him japán fehér nyuiat (tömegük: 2,5-3,0 kg# a hitsyema Asbes Co, szállította) immunizáltunk a 14, (.6) es 14,(7) példákban 1emeetetett e1járas szerint e1óá11ltot1 tisztított OBM-mel (tioreóosin-OBM fúziós fehérje) oly módén, hegy hat alkalommal egy heten egyszer szubkután módon injektáltunk 1 ml/dózis ügy készített emulziót, hogy összekevertünk 200 pg/mi. tisztított OBM-et azonos térfogatú Freunö-íéie komplett hetesjavítóval (Bites Co.}. Az utolsó immun!záoiöt követé tizedik napon vért vettünk a nyelektől. Az antitestet a következük szerint tisztítottuk a szérumból. Az antlszérumhoz ammóninm-szuifátot adtunk, amit BBS-sel kétszeresére hígítottunk 40% (u/vá; végső koncentrációra, Miután egy órán ét 4h>on állni hagytuk, e keveréket 20 percen keresztül 0000 n g sebességgel centrifugáltuk, hegy csapadékot kapjunk, A csapadékot kis mennyiségű PB.Sban f eloldottuk, PBS-sel szemben 4ÚC~on dializáltuk és egy Protein O-Bepherose oszlopra (a Pharmacia Co, gyártmánya) töltöttük. Miután PBS-sel mostuk, az adszorbeálódott immunglobulin G-t 0,1 M giieirnHCX pnffer oldattal (pH 3,0} eluáltuk. Az eluétumot, azonnal semlegesítettük 1, 5 M Tris-HCi pufferrel (pH 8,7}., Mintán az elue.lt fehér jefrskolöket PBS-sel szemben dializáltuk, 2SÖ nm-en megmértek az abszorbanciát, hogy meghatározzuk a fehér jekoncentráeiét (BAS 1.3,5), Torma perezidázzal jelölt anti.-OBM antitestet készítettünk ma leImiddel aktivált perozidáz kit (Piarcé Co,) segítségével a kővetkezők szerint. 80 pg B-szukolnimid-Sseetii-tíoeeetssval adtunk Img tisztított antitesthez és szobahőmérsékleten, reagáltattuk 30 percen ét. Az igy kapott keverékhez 5 mg hidroxilamlnt adtunk, hogy az antitestet deaeetlláljuk, A módosított antitestet poliakrilamld kisózó oszlop segítségével frakciónáltűk, A fehérje frakciókat 1 mg maieimiddel aktivált peroaidázzal kevertük össze és egy órán át reagáltattuk szobahőmérsékleten, hogy megkapjak sz enzimmel jelölt antitestet, (2)
A η yő.l... ηη t ί- OBM po 11.0/pnál 1 s antitest azon képessége #
hogy a találmány szerinti cOMS által ezpresszált
fehérje (OBM) vagy a találmány szerinti természetes
típusú b ehérje OCIF -hoz történő specifikus kötődését
gátolja
A 15.(6) és 15,(7) példákban leirt eljárás szerint kapott tisztított OBM-et (tioredozin-OBM fuzionált fehérje) illetve a 2,(4) példa szerinti természetes típusé tisztított OCXF-kötő fehérjét 0#l M nátrium-karbonát pof f erben 2 pg/ml konoentráoíéra feloldottuk, Mindegyi k oldatból lyukanként 100 pl~nyi mennyiséget adtunk egy 9élyukas immuniemezre (a Manó Co, gyártmánya) , A lemezt egy éjszakán át 4QC-on állni hagytuk. Minden lyukhoz 2ÖÖ pl Söá-oe Biook Aoe-t adtunk es a lemezt szobahőmérsékleten egy órán ét állni hagytuk, Miután mindegyik lyukat háromszor mo^ . 0yl% Foiysolbate 20 tartalmú FBS-sei (F20-FBS)# 100 pl# 25%-os Block Aoe-Psn feloldott nyűi anti-OBM antitest oldatot adtunk mindegyik lyukhoz# amely oldatot B20-BBB-sei készítettünk 200 pg/ml konoentráclöra vagy mindegyik, lyukhoz 100 pl 25%-os Block Ace- (antitestet nem tartalmazd) oldatot adtunk# majd ezt kévetőén egy órán keresztül OO^C-on inkubáltnnk., Mindegyik lyukat B20-FBSsei háromszor mostuk és lyukanként lOöpl kötési teszthez velő oldattal (ö#21 borjú szérumalbumínt# 2ömM Képest és 0#l mg/ml heparint tartalmaző B20-FBS) töltöttük fel# amelyhez a 8.(3) példában leirt# 20 ng/ml UísX-tel jelölt OCXF-ot. adtunk. Másik lehetőségként minden lyukba lyukanként 100 pl másik kötési teszthez való oldatot adtunk# amely 8 pg/ml jelöletlen. OCÍF-ot tartalmazott a. 20 ng/ml AtóX-tel jelölt OCXF-on felül. Mintán ezen immunl emez eket 37M7-on egy érán át inkubáltuk# a lyukakat hatszor mostok PlO-FBS-sel, Minden lyukban megmértük a ''1 mennyiségét gamma számláiéval. Az eredmények a 17, ábrán mutatjuk meg. Mint sz az ábrán látható, sem a találmány szerinti oBNS felhasználásával expresszált tisztított OEM, sem. a természetes típusú OClF-hoz specifikusan kötődd fehérje ~ a találmány szerinti specifikusan kőtő fehérje, egyáltalán nem kapcsolódik a iA;3X~tel jelölt. OCIF-hoz abban az esetben, amikor nyál anti-OBM polikionáiís antitesttel kezeljük őket, ellenben mindkét fehérje hozzákötődött a i2'I~tel jelölt OCIF-hoz, ha ezeket nem kezeltük az antitesttel. Mindkét fehérje 1:í&i™tel jelölt OCIF-hoz való wodesorol· megállapítottuk, hogy egyértelműen specifikusak, mivel ezek a kötődések szignifikánsan gátoltak, ha jelöletlen. OClF-ot iöO-szoros koncentrációban (3 pg/ml) adtunk hozzájuk, A fent leírt eredmények alapján a nyúl antl-OBM polikionáiís antitest mind a találmány szerinti cDNS felhasználásával expresszált fehérjét, az OBM-et, mind a találmány szerinti természetes típusú OCIFkötő fehérjét felismeri és ezen fehérjék OClF-hoz. történő specifikus kötődését gátolja.
Bélda
A humán OBM chhSklónozása (1} Egér OBM...primer... készítésé
Az egér OBM primereket a font leirt példákban (OBM#3 és OBMáS) ismertetett eljárás alapján állítottuk elő és humán OBM coES szűréséhez használtuk, A szekvenciák a SFQ ID MO S és BBQ ID NO u szekvenciáiban láthatók, (2) A humán OBM cDMS fregmensPCk segítségévei_______történő
Izolálása
A humán OBM cDBS f ragsaensoket PCB felhasználásával, kaptuk sz Π h-hen készített egér OBM oDMS primerek ás a Humán Lymph hede Merathon kész cDNS (CXontech Co.), mint templát segítségévei. A BCx-t a kővetkező körülmények me11e 1t vego z tük e1?
löx Eh Tag puffer (Takara Shozo Cin ) 2 μΐ.
2,3 mM oETB Ι,β μΐ cDMO oldat 1 pl
EX Tag puffer (Takara Sbuzo Col) 0,2 pl
De a z t1I1á Xt viz 14,8 pl pM primer OBM# 3 0,2 pl pM pr?.mez: OBM#8 0,2 pl
Ezen elás tokát egy mi krocentr1 fogas csőben összekevertük és ÜahOon 2 percig elölnknbáltuk, majd ezt egy háromlépcsős reakció 90 ciklusa, követte, amely egy
95Al-on 30 percen át, SObT-on 30 percen át és 72bT-on 2,3 percen át tartó reakciókból állt. .A reakció után az oldatot 5 percen át 72öC~on inkubáltuk és az oldat egy részét agaréz géllel végzett elektrcforézlsnek vetettük alá. A font leírt egér OBM oDM8 primerek által, ampliíikélf DBS fragmenst (körülbelül 680 bp) figyeltünk meg.
(3) A DOB segl tségéve1 amp 11 f 1 kait Jaumánvκ OEM cDB3 fragmens_______tlsztitása___________és________a_________..........szekvencia.
meghatérozsaa a 19.(2) példában kapott humán OBM cDME fragmenst agaréz géllel végzett elektroforézissel elválasztottuk éa tovább tisztítottuk Qiaex gél extrakoió-s kit (Qiagen Co.) segítségével. Ismét elvégeztük a PCB.~t a humán OBM cDNS fragmens, mint templat és a fent leirt egér OBM oDNS primerek felhasználásával, hogy nagy mennyiségű humán OEM cDNS fragmenst állítsunk elé, A DNS fragmenst Qiaa.x gél extrakeiós kit segítségével tisztitettek ugyanolyan módon, mint feljebb, A tisztított humán OEM cDNS fragmens nukleotid sorrendjét Tag Dye Deoxy Terminator Cycie Seguencing FS kit (Berkin Elmer CoJ segítségével, primőrként 0BM#3-at és 0BM#8-at (SBQ ID NO §, illetve SEQ ID NO ói felhasználva határoztuk meg. Az egér OBM cDNS szekvenciajának megfelelő szakaszával összehasonlítva, a humán OBM cDNS fragmens nukleotid szekvenciája 80,7% homolégiát mutatott az egér OEM cDNS-ével, (4) Teljes he a a z uságú humán OEM cDNS szűrése a humán 03N cDNSfragmens(köfülééiül__________890_______fop),___________mint_________próba íelhaBfhálásával végzett hibridizáció segítségévei
Teljes hosszúságú humán OBM cDES-t szűrtünk a 19, (3) példában tisztított humán. OEM cDNS fragmens (körülbelül 890 bp) felhasználásával és dCTP-vel jelöltük
Megaprime DNA Eabeiing kit (.Amershem' Co.) segítségével, „Humán nyirokcsomó 5 ‘ -Stretch B.lus cDNA’’ könyvtárat (Ciontech Cm, USA) szűrtünk a DNS próba felhasználásával, A gyártó utasításai szerint, Escheríchia coli C600 Hfl törzset fertőztünk a rekömbinans fággai 15 percen át siklón, A fertőzött Escheríchia coii-t EB agamba (1% tryptone, 0,5% éiesztőkivonat, 1% NaCl, 0,7% agar) adtuk, amit 45OC~ cn melegítettünk. Az EB ugart olyan LB ugar lemezre Öntöttük, ami 1,5% ugart tartalmazott, Egy éjszakán át ElAi-on végzett -inkubáció után ByBond-lP^t (Amersham Co,) helyeztünk a lemezre, amelyen plakkek nőttek és körülbelül a filtert percre eiraktuk. A szokásos eljárás szerint alkálikus oldattal kezeltük, semlegesítettük és 2xSSC oldatba mártottuk,
I mmob i1i z á11u fc
A DNS-t ezután a filterre UV Crosslioker (Stratagene Co«) segítségéveiv Az így kapott filtert Bapid-hyb pnfferbe (Amersham Co.) merítettük. 15 perces 65*C-on történő előkezelés után a filtert·. Kspíd-hyb pufferbe helyeztük, amely a fent leirt hődenaturált humán ÓBA oDNS fragmenst (körülbelül 690 bp, 5xX0scpm/m!) tartalmazta. Egy éjszakán át áÜC-on végzett hibridizációt követően a filtert a zxSSC, IxSSC és 0,IxSSC oldatokkal .mostuk, ize ivek mindegyike tartalmazott 0,1% SDS-t, a mosásokat ebben a sorrendben végeztük, mindegyiket 15 percen át 65°C~on. Az Így kapott számos pozitív klánt tovább tisztítottuk a szűrés kétszeri ismétlésével. Egy inzerttel rendelkező klőní (körülbelül 2,2kb) kiválasztottunk a tisztított klánok közül és használtünk fel a kővetkező kísérletekben. Ezt s tisztított fágot khöBM-nek neveztük el. A tisztított xhOBM-böl körülbelül 10 pg DNS-t kaptunk Qiagen Lambda kit (Qiagen Co.) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint eljárva. A DNS-t Sáli restrikciós enzimmel emésztettük és agarőz géllel végzett elektroforézissel megvizsgáltuk, hogy elválasszuk s hOBM inzert oDNS-t (körülbelül 2,2 kb) . Ezt a Qiaex gél extrakoíős kit (Qiagen Co.) segítségével tisztított DNS fragmenst Ball restrikciós enzimei emésztettük és a pDC19 (MB1 Co.) piazmidba. vittük be ,.DNA ligetien kit ver. 2” (Takara Shuzo) felhasználásával, amit előzőleg Ball restrikciós enzimmel emésztettünk és defoszforíIái tünk. Az Így kapott DNS fragmenst tartalmazó pDülS-ce.l transzformáltunk Escherichla coli DE5d sejteket (Cíboo-SBL Co.), Az igy kapott transzformántt pDCIáhCBAnek neveztük el, A transzformánst növesztettük és a.
pUC19hO3M-et, amelybe bevitt ük a humán OBM cDNS-f (körülbelül 2,2 kb)# szokásos eljárással tisztítottuk.
·'5) ő humán OBM teljes aminosav sorrendjét kódolócDNS nukiéot id szekvéneiéyánah meghatárοzása
A 19.(4) példában kapott humán OBM cDNS nukieotid szekvenciáját Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequenoing ES kit (Perkin Elmer Co«) segítségével határoztuk, meg. Konkrétan, a bevitt fragmens nukieotid szekvenciáját templátként pUCláhOBM-et felhasználva határoztuk meg. Primőrökként a püClS'hOÖM-be bevitt DNS fragmens nukleonig sorrendjének meghatározásához Ml 3 Primer M3~at és Ml3 Primer KV-t (a Takar a Sbuzo gyártmányai) és a humán OBM cDBB fragmens (körülbelül 690 bp) nukieotid szekvenciája alapján tervezett szintetikus prímért, a humán OBM#B-at használtuk,
A felhasznált primerek nukieotid sorrendjét# az Mi3 Primer M3~at és az Ml3 Primer R7~fc a SEQ ID MO 4 és SEQ ID NO 5 sorszámú szekvenciájában látható. A humán OBM cDHS nukieotid sorrendjéből származtatott humán OBM. aminosav sorrend a SEQ XD NO 11-ben látható. A humán. OBM cDNS nukieotid sorrendje a SEQ ID MO 12 sorszámú szekvenciában látható.
Az Esoheriohla coli-t, amelyet a kapott humán OBM cDMS-t tartalmazó plazmiddal, a pDOlvhOBM-mel. transzformáltunk, letétbe helyeztük a „National Instltote of BiO/Seienee and kúrián Technology, Agenoy of Industriai Science and Teohnoiogy^-nái 1997. augusztus 13-án a EBEM BP-óöáS letéti számon.
100
Az OCIF______rád 1 o8 ódozása /jji-tel_______ás a____/Íílc.fé.é,.,,,,Íb.éÉl.ÍOCIF
ELI S A - yalvégzet t kv an t 11 a 11 y a π a 11 z lse
Az OCIF-et jodogén eljárással i<;íT-tei jelöltük. 20 μϊ 2,5 mg/ml. jodögén-kloroíorm. oldatot adtunk egy 1,5 mi-es Fppendorf csőbe es a kloroformot iö®C~on elpárologtattak, Így készítve egy jodogénnel bevont csövet, A csövet háromszor mostak 400 pl 0,5 d nátrium-foszfát puffer oldattal (Ba-Pi, pH 7,0), majd ezután hozzáadtunk 5 pl 0,5 M Ba-Pi-t (pH 7,0). Ebhez a csőhöz 1,3 μϊ (18,5 MBe) Ba'ÍS'Ö1 oldatot (Amersham Co, dBF-033H) adtunk, majd azonnal. 10 μϊ 1 mg/ml OCIF oldatot (monomer típus vagy d.lmer típus). Az elegyet vertet keverővei összekevertűk es szobahőmérsékleten 30 másodpercig állni hagytuk. Ezt az oldatot egy olyan csőbe vittük át, amelyhez előzőleg 80 μϊ, 10 mg/ml. kálium- j odadob és 5 pl, 5% marha tartalmazó foszfáttal pufferelt (BSA-FBB) tartalmazd 0,5 d Ba-Pi.-t (pH oldatot összekevertük és forgőoszlopra (1 ml, C-25 Sephadex fine, a Bharmaoia Co, gyártmányé) vittük, amit előzetesen BFA-PBü-sel hoztunk egyensúlyba és 5 percet át z.OOOrpm setességgel centrifugáltuk. Az eiuált frakciókhoz 400 μϊ BSA-FBS-t adtunk, után az oldat 2 μϊ-ét használtuk a radioaktivitás gamma számláiéval történd méréséhez. Az Így kapott ^X-tel jelölt OCIF oldatának rablókémiai tisztaságát úgy mértük meg, hogy a 101 triklcr-ecetsavval (TCA) kicsapatott frakciók radioaktivitását számláltuk.
s zé roma I bús; In t kon yha söo 1.de to t 7,0) adtunk„ Az oszlopról Elkeverés
A. ^l-tei jelölt OCXF biológiai aktivitását a WO B6/2ü217-hen ismertetett eljárás szerint mértük meg, A ”<;”l-tel jelölt OCIF koncentráoiöját a következők szerint végzett ΕΒΙΒΑ eljárással mértük meg. Konkrétan, a KO
101
B6/26217-ben leirt nyál anti-ÖCIF poliklonália antitestet 50 mM MaBCO3-han (pH P,6} 2 pg/ml koncentrációban feloldottuk és egy 06 lyukas icamnlemez (MaciSorolt a Munc Co, gyártmánya) minden lyukába 100 pl/lyuk mennyiségben adtuk, Mintán eren lyukakat 4öC-on egy éjszakén át állni hagytuk, az oldatot eltávolítottak» Ezt kővetően a lyukakat Biook Ace^ (Snoe Branö Milk Products C,, Lfcd.) vizes oldata és foszfáttal puffezeit konyhasóoldat (25:75} (B-PBS) keverékével töltöttük fel 200 pi/lyuk mennyicégben. Ezután a lemezt két órán keresztül szobahőmérsékleten állal hagytuk. Mintán az oldatot eltávolítottak, a lyukakat háromszor mostuk 0,01% Polysoivate 80-at tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasó oldattal (P-PBS}, Ezt követően ‘^l-tel jelölt ÖCXF mintát tartalmazó B-PBS-t vagy a standard OClF-ot adtak hozza 100 pl/lyuk mennyiségben. Ezután a lemezt két érán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, Az oldat eltávolítása után minden lyukat 200 pl P-PBS-sel hatszor mostunk, 100 pl/lyuk mennyiségben adtunk hozzá egy olyan oldatot, amely ügy készült, hogy perozidázzai jelölt nyűi an.ti-OCl.F poliklonális antitestet B-PBS-sel hígítottunk. A lemezt két őrén keresztül Szobahőmérsékleten állná hagytuk. Az óidat eltávolítása után a lyukakat 20o pl. P-PBS-sel hatszor mostuk. Ezt követően 100 pi/lyuk mennyiségben 1MB oldatot (1MB oldható reagens, nagy érzékenységű, Scytek Co,} adtunk hozzá. Miután 2-5 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, XÖÖ pl stop-oldatot (Btopping Beagent, Scytek Co,) adtunk minden lyukhoz. Egy mikrolemez olvasó segítségével 450 nm-en megmértük minőén lyuk ahszorbaneíáját, A 1£i>I-tei jelölt OCIF koncentrációját a standard ÖCXF felhasználásával készített kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg.
A találmány s z e r inti__cDNS__________által kódolt fehérje expr e ss z lőja (1) hOBM enpresszlóe vektor készítéss. állati s.e3lekhez
A pDChOBM-et Sáli restrikciós enzimmel emésztettük és i%~os agaróz géllel végzett ei&ktroforézis segítségével tisztítottunk egy DNS fragmenst (körülbelül 2,2kb). A DNS fragmens végeit DMA elunting kit (lakéra éhező Co.) segítségével tompítottuk le (tompított höBMcONS fragmens). A pcDb-SBíx236 expresszios plazmidot (Moleculsr and Celiular Siology, 3, kötet, 466-472. oldalak (1233); EccBI restrikciós enzimmel emésztettük, a tompító kit segítségével tompítottuk és a tompított hOBH cDNS frsgmsnssel ligáltuk a ©INA Ugat ion kit ver, 21’ felhasználásával, Escheriehia coli DRa-t transzformáltunk a il.gáeíós reakcióval, Az ennek eredményeképpen kapott amp.lcllX.in rezisztens transzformánsokban levő pia.zmi.dot restrikciós enzimmel végzett emésztésnek vetettük alá, hogy anallzálnassuk a DNS restrikciós térképet és meghatarózzuk a DNS szekvenciát. Ennek eredményeképpen kiválasztottunk egy olyan piazmíóot tartalmazó törzset, amelybe a hOBM cDNS-t az Sün promolerének megfelelő transzkripciós irányba vittük he. Ezt a mikroorganizmus törzset DBS α/phODM-nek neveztük el, (2} A humán QBM C0Sp7 sejtekben történő expressziéja
Az Escheriehia coli DKo íx/phOBM-et növesztettük és a chöBM plazmidot Diafilter Flasmid Midi kit (Qiagen Co.) sec; i tségével t iszti tettük., A phOBM-e t Lípcf eotamine
103 segítségével €05-7 sejtekbe transzfektáituk egy 5-lyukaa lemez lyukaiban és két napén át 10% magzati borjúszérumot tartalmazó DbEM-ben növesztettük eket. A tenyésztápközeget cisztáin éa metionin mentes tenyésztápközeggel (Dainippon Eelyaku Go., Ltd.) cseréltük ki, amelyhez 5% dializalt magzati bortűszerűmet adtunk (88 pi/iyuk). A sejteket 15 percen keresztül inkubaltuk, majd 14 pl Express Protein
Labeling Mix-et (ben Go., lömCi/ml; adtunk hozzá. Négy óra inkubáció után 2ö0 pl. 10% magz a t i be r j as z a rumot tarts Ima z.c DMEM-et adtunk minden lyukhoz. Egy éra növesztés után a sejteket kétszer mostuk PBS-sei, Ezt kővetően 0,5 ml, 1% Fritond-100-at, 1% marha hemoglobint# 10 pg/ml ieupeptint, 0,2 TlD/mi aprotinint és 1 mM PMEF-et tartalmazó TSA. puffért (0.,1.4 M NaCl-ct és 0,0255 Maig-ot tartalmazó 10 mb Tris-HCl (pH 8,0)) adtunk minden lyukhoz és az elegyeket egy órán keresztül jégen állni hagytuk. A sejteket pipettázássai kevertük es 4öC-on 10 percen keresztül 3000 x g-vel centrifugáltuk, hegy megkapjuk a felüiüszét, 200 pi higite puffért (0,1% TritonX-iöö-at, 0,1% marha hemoglobint, 10 pg/ml Ieupeptint, 0,2 TlO/ml aprotinint és 1 esd BbSF-et tartalmazó TSA puffer) adtunk mindegyik lyuk felülúszéjának 100 pl-éhez. Az igy kapott elegyeket egy érán keresztül á^G-cn protein A Sepharose-zal (50 pl) rázattuk és 1 percig, i^G-en 1,500 x g sebességgel centrifugáltuk, hogy. óssxegyöjtsök a felülaszökat és ezáltal eltávolitsuk azokat a fehérjéket, amelyek nemspecifikusán adszcrbeáiódtsk a Frotein A üepharcse-’hoz. x/u C d, Uk * k C,\ CG t λ G. '''CxC ádl-on egy érán át rázattuk, hegy megtörténjen a humán OEM és OCIF kapcsolódása. Ezután nyúl anti-OCXF pclikionáiis antitestet (58 pg) adtunk hozzá, majd az eiegyet egy érán
104 át 4°C-on rázattuk, Ezután Protein A Sepharose-t (.10 μΐ) adtunk az Így kapott oldathoz és ezt követően a keveréket egy további órán áfc 4°C~on rázattuk, Az igy kapott elegyeket egy 1 percig 4eC-oh 1,500 x g sebességgel centrifugáltok, hogy ősszegyüjtsük a csapadekokat. A csapadékokat kétszer mostuk hígító pofterel, kétszer marha hemoglobin mentes hígító pofiaméi, egyszer TSA pofferre! és egyszer 50 séf iris-HCl oldattal. (pH 6,5}. Miután 10% β·merkaptoePanelt tartalmazó SDS puffért (0,12.5 k! Tris-HCl, 4% nátrium-dodecidszulfát, 20% glicerin, 0,00.2% brémfenoi kék, pH 6,0) adtunk hozzá, az elegyes 5 percen keresztül 100öC-o.n. melegítettük és SDS-PAGE-ra vittük. (1..2,5% poliukriismid gél, Dallchi Púra Chemical. Co.). A gélt szokásos eljárás szerint fixáltuk és száritottnk. Miután az Izotóp jeleket Ampiify^ (Amersham. Co,) segítségével erősítettük, a maga zár ltot t gélt Bio Max ME film (Kodak Co.} felhasználásával -BOAl-on autoradiográf iás vizsgálatnak vetettük alá. Az eredmények a lő, ábrán, láthatók, ami azt mutatja, hogy a találmány szerinti cÖKS által kodéit fehérje körülbelül 4ö,0ö0~es molekulatömeggel rendelkezik.
A tai.álmány szerinti eüNS.....által.....kódolt fehérjo.ős az OCXF kapuselédás a
A phöBM-et, amit ugyanazon a módon tisztitottunk, mint a 21.(2} példában, egy 24 lyukas lemez minden egyes lyukában CCS-7 sejtekbe transzfektáltak Llpofectamine segítségével, Kettőtől, három napig terjedő időtartamú növesztés után a sejteket szérmsmentea öMBM-mel mostuk, A kötődési assay-hez velő 200 μΐ, 20 ng/ml A2sl-tel jelölt ÖCXF-ot tartalmazó tenyésztápközeget (olyan szérummentea DMFM tenyésztápkdzeg, amelyhez 0,2% marha szérumalbumint, 20 mM Hepes puffét oldatot, 0,1 mg/ml. kaparint és 0,2% haht-ot adtunk) adtunk a lyukakba, A többi lyukba a kötődőéi assay-hez való 200 μΐ olyan tenyésztápközeget adtunk, amelyhez a 20 ng/ml ^l-tel jelölt OCXF-on felül 8 pg/ml jelöletlen OCXF-ot is adtunk. Egy érés, üf^C-on CO;.inkubátorban (0% COS) történő inkubációt kővetően a sejteket kétezer mostuk 500 μΐ 0,1 mg/ml neparlnt. tartalmazó foszfáttal puffereit konyheeöoldattál, Majd 500 μΧ 0,1b haöH-ot adtunk minden lyukba és a lemezt a sejtek feloldása céljából 10 percen át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A lyukakban gamma s zámláiéval megmértü k a Aái>X radioaktlvitanát, Eredményként, mint ahogy az a 10, ábrán látható, megállapítottuk, hogy a inX~tel jelölt OCIF csak azokhoz a sejtekhez kötődik, amelyeket phOBM-mel transzfektáitunk, Ezenfelül megállapítottuk, hogy a kötődés szignifikánsan gátlédott a jelöletlen OCIF 400szoros feleslegben (800 gg/ml) történő hozzáadása által. Az itt leire eredmények alapján megái lapítottuk., hogy a fehérje, a phOBM-beu lévé cDMS által ködőit humán OHM specifikusan kötődik a Col-'7 sejtek felszínén lévő OCIF™ hOZ <
A.....mygtol.........Jojóit OCXF és a találmány szerinti oOMS által kp dpit,,,: áf.Q.Éá.í % Jib r f ébőMíkÉdm ^I-tel jelölt monomer típusú OCIF és a találmány szerinti oDHS által kódolt fehérje keresztkötését azért .106 végeztük el, hogy a találmány szerinti cDNS által kódolt f éhé r j e j e 1iemzöl t meg rés z 1 e te s ebben megv i zsgá I j uk. Miután elkészítettük a phöBM expressziét vektort és a 21.(1) és 21,(2) példákban használt eljárás szerint COS-7 sejtekbe transzfektáltuk, a fent ismertetett kötődési asssy-hez való, ^l-tel jelzett OCXF~ot tartalmazó (25 ng/mi) 200 pi tenyésztápközeget adtunk hozzá, A többi lyukba olyan kötődési teszthez való tenyésztápközeget adtunk, amelyhez iOö-szoros konoentrációban. adtunk jelöletlen OCX.B-ot a. hozzáadott ^X-teX. jelölt OClE-on felül. Egy órás 37®C-on ÜOs-inkuhátorban (5% COS) történő növesztés után a sejteket kétszer mostuk 500 ni 0,1 mg/ml heparint tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasőoldattai. 100 pg/ml keresztkötö ágenst, DSS~t (diszokcinim.iáii'~ szederét, a Piarcé Co, gyártmánya) 500 ni foszfáttal puffaréit kcnyhasőoidatban feloldottunk és a sejtekhez adtuk, majd ezt egy 10 perces 0oÖ~on végzett inkubáció követte, Ezen lyukakban lévő sejteket kétszer mostuk 1 mi jéghideg foszfáttal puffereit konyhasőoldattai, Mintán 1% Triton X-IOO-at (Wstko Pure Chemicals Co., Ltd,), 2 mM PMSP~et (fenilmef ilsznlfoni.l-fluorid, Sigma Ce,), 10 pb
Pepstatint (kake Pure Chemicals Co,, Ltd,), 10 pM
Leupeptínt (hako Fűre Chemicals Co ,, Ltd,), 10 pM antipain-t (Cakó Fűre Chemicals Co,, Ltd,) és 2 mii EDTA-t (bakó Pure Chemicals Co,, Ltd.) tartalmaző 100 pi 20 md Hepes puffén oldatot adtunk hozzájuk, a lyukakat a sejtek feloldásához 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagytuk,. Szén mintákat (15 pl-nyi mennyiségek) a szokásos eljárás szerint redukáló körülmények között S-DS-sel kezeltük és 4—20% poiiakrilamid gradiens gél (Oaiichi Fűre Chemical Co,, Ltd,) felhasználásával SDS-elektroforézisnek
107 vetettük alá. Az elektrofezézís után a géleket megszáritottuk és BioMax MS film (Kodak Co.) és BioMax M:S érzekenyito ernyő (Kodak Co,} felhasználásával 24 érán keresztül -SÖ^C-on autcradiográfiának vetettük alá. Az autoradiografiának alávetett filmet szokásos eljárás szerint divtuk elő. Eredményként, mint azt s 20. ábra mutatja, egy 20«000-110.000 molekulasúlyé sávot figyeltünk meg a jelölt monomat típusa OCIF és a találmány szerinti oDKS által ködőit fehérje keresztkötése jóvoltából.
A szekretált formájú OEM expresszié ja (1) A szekretált formájú^ humán QBM; expresszi ős_____plazmld el készí tése
Primerenként humán ODA SF-et (SSQ 1b 00 13} és egér OBM#P~at (SFQ 10 00 6} ás templátként pUClPhöBM-et felhasználva végeztünk PCP reakciót. Az agaröz géleiektreforézis segítségévei végzett tisztítás után a terméket 3P11 és HindXXI restrikciós enzimekkel emésztettük és tovább tisztítottuk agaröz géllel végzett e 1 akt ro f o r é z 1 s s ég 1 t s ó g é ve 1, h og y e g y t .1 s z 111 o 1t f ra gme n s t (0,27 kb) kapjunk. Arai restrikciós enzimmel részlegesen emésztettünk humán OEM oDBS-t és az egyik oldalon Dralgyei emésztett DOS fragmenseket agaróz géllel végzett elektroforézissel tiszfcitoftuk. A tisztított fragmenst tovább emésztettük Hindin restrikciós enzimmel. A 0,53 kb bral/EiUdlII fragmenst agaróz géllel végzett elektroforézissei tisztítottuk. A tisztítótt fragmenst a fent leirt PCP-bői származó 0,27 kb Spll/Hindlll fragmenssel ligáitűk a pSeo TagA (Invi.rogen Go.)
108
HindiII/EcoRI fragmenssel (5,2 kb) a „ligáidon kit ver, 2” segitségévei, A reakciótermék felhasználásával transzformáltunk Eschorlchía coli DH5a~t. A plazmidokat az í g y k a po fc fc amp i e i .111 n r e z i s z f on s t r a. n s z f o r má n a c kb61 tisztítottuk alkáli SDS eljárással és restrikciós enzimekkel emésztettük, hogy kiválasszuk azt a plazmidot, amely 0,27 kb és 0,53 kb pSec TagA-ha inzertként bevitt fragmenseket tartalmaz. Ezen plazmádról Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Seguencing FS kit (Perkin Elmar Co.) segítségével megáilapítottuk, hogy a szekretált humán OBMet kódoló szekvenciával rendelkezik. Ezt a plazmidot Nhei és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük, hogy a s z e k r e fc á 11 'marná n OBM c DE S - n e k me g f e 1 e 1Ö £ ra gme n s r i 0,8 kb) állítsunk elő agarőz géllel végzett eiektroforézis segítségével< Ezt a fragmenst egy pCEBi expresszibe vektor (Invitrogen Co.) Xhel és Xhol fragmensébe (10,4 kb) vittük be egy ligálási kit felhasználásával és ennek reakciőtermékét felhasználva transzformáltunk Ssoherichia coli DH5a sejteket, A. plazmidokat az igy kapott ampáéiIIin rezisztens trsnszformánsokbői tisztitottuk alkáli SDS eljárással és restrikciós enzimekkel emésztettük, hogy kiválasszuk azt az Esoheriohia colit, amely tartalmazza a szekretált formájú humán OBM expressziős plazmidját (pCEPshOBM), A pCEBshOBM-et tartalmazó Esoheriohia colit növesztettük és a pCSPshOBM-et ,,Qiaf liter plesmid midi kit?’ (Qiagen Co,) segítségével tisztítottuk, (2) p szekretái fc formájú OBM expressz lőj a
293-SBbA sej teket szuszpéndáltunk 10% FCS~t tartalmazó IMDM-ben (1MDM-I01 FOS) és egy kollagénnel bevont 24 lyukas lemezbe (a Sumitomo Bakelité Cc,# Ltd, gyártmánya) ültettük 2xX0~/2ml/lyuk sejtsürüséggel és egy éjszakán át növesztettük őket. A sejteket 1 pg pCEPshOBMmel vagy pCE2i™gye.i transzfektál tűk 4 pl lápot ec tárnán e (Gibco Go.) felhasználásával. Miután 0,5 ml szérummentes lMDM~ben vagy hővesztettük felülűszöját, napon keresztül a tenyészet
OBM tenyészet™
IMDM™lö% FCS™hen két őket, összegyűjtöttük A szekretált humán feiülüszöban végzett expressziéját a következők szerint vittük véghez, A tenyészet felüXűszőjához ennyi nátrium™ hidrogénkarbonátot adtunk# hogy végső koncentrációja 0#l M. legyen és az elegyeket egy 96 lyukas lemezbe adagoltuk. A lemezt egy éjszakán át Üüon állni hagytuk, igy immobllizáiva a humán OSM-et a tenyészet·!eiülúszokbsn a 96™Iyukas lemezen. A lemezt B8S™sel (B-PBS) négyszeresére hígított Bicék Ace^ (Snow Brand MiIk Products Co.# Ltd,} oldattal blokkoltuk és két órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. Miután minden lyukhoz B-PBS-ael hígított 3lüO ng/ml OCXP-ot adtunk, a lemezt két érán át 37°C™on állni hagytuk, majd 0,05% Poiysolvate 20-at (P-PBS) tartalmazó BBS™sel mostuk. Ezek után a WO9E/2621?™ben ismertetett, B™BBS™sel hígított 100 pl peroxidázzal jelölt nyúl anti™OClE poiiklonális antitestet adtunk minden lyukhoz, Miután két érán át 37£>on állni hagytuk, a lyukakat hatszor mostuk B™BBS™seÍ, Ezt követően lyukanként 100 pl mennyiségű TMB oldatot (TMB oldható reagens, nagy érzékenységű, Scytek Co.) adtunk hozzá és a keveréket szobahőmérsékleten körülbelül 10 percen át állni hagytuk. A reakciót 100 pl stop-oldat (0topping reagens, Scytek Oku) minden lyukhoz történd hozzáadásával állítottuk le, Bgy mlkrolemez olvasó segítségével minden lyuk abszorhanoiáját 450 nm-en megmértük» Az eredmények a 21, ábrán láthatók, ami azt mutatja# hogy a 450 nm-en mért abszoxbancla a hozzáadott OCXF koncentrációjának
1X0 függvényében növekedett azon a lemezen, amely kondicionált tápközegében a pCFPshOBM-'mei transzfektált sejtek voltak immobilizáiva. Másrészről nem lehetett abszorbancianövekedést látni azon lyukak esetében, amelyek kondicionált tápközegében a pCBPi vektorral transzfektált sejtek voltak immobilizálvs, A 22< ábra egy olyan kísérlet eredményeit matatja, ahol az immobilizációhoz használt kondicionált tápközeg arányát 5-90% tartományban változtattuk az OCIF konstans koncentrációiának (50 ng/ml) jelenlétében, A 450 .nm-en mért abszcrbanoia a kondicionált tápközeg aránya növekedésének· megfelelően növekedett azon a lemezen, amely kondicionált tápközegében a pCEPshOBM-mel transzfektált sejtek voltad immobiiizalva, míg- az abszorbancia ilyen növekedése nem volt látható azon a lemezen, amely kondicionált tápközegében a pCEP4 vektorral transzfektált sejtek voltak immobilizáiva, Ezen eredmények alapján megállapítottak, hegy a pCEFshÖBM-m.el tr&nszfáktált sejtek kondicionált tápközegében termelődik a szekretált formájú barnán OBM,
25, Fáiba
A tlőrédenin-humán OBM.........fúziós fehérje__________{Trn-hQBM) e xp r e s s z i <5 j a (1) A t ί o r ede n 1 n - h urnán OBM fűzi id__________tókúlBBlrM).
expressziós vektor elkészítése μΐ löd FxTag paffért. (Takara Shazc Co,), 3 ni lö mM dNTP-t (Takara Shazo Cob, 77,5 μΐ sterilizált desztillált vizet, 2 pl pöCIPhöBM (10 ng/μΐ) vizes cldatct, 1 pl primőrt, egér 0BMf3-at (Iöö pmol/pl, SEQ ID NO 3), 1 pl primer hOBM SaiB2-öt (100 pmol/pl, SFQ ID NO
111
14) és 0,5 μΐ EzTaq-f (5u/pi) (Takara Sbuzo üo.) kevertünk Össze éa egy mikrocentrifuga esőben reagáltettunk (PÜB. reakció), Miután 35°O~on 5 percig, 5ööC-on egy másodpercig, őoüi-on egy percig, 74*C~on egy másodpercig és 72*ü-on 5 percig reagá Itattuk, egy olyan ciklikus reakciót ismételtünk 25-szor, ami 96Ú>on egy percig, SOÜl-on egy másodpercig, sóAl-on egy percig, 74*C~on egy másodpercig és 72®C~oa-3 percig zajló reakciókból áll. A t e1j e s rea kc i öke v er é kbö1 Db S f ragmens t (7 5 0 bp) tiszt itcttank, A tisztított DNS fragmens teljes mennyiségét Suli (Takara Shuzo Co.) és BspHi (New England Bilabs Co,) restrikciós enzimekkel emésztettük és egy 1% agaröz géllel végzett elektrofe.rézisnek vetettük alá, hogy tisztított DNS fragmenst (1. fragmens, körülbelül 320 bp) kapjunk. A fragmenst 20 μΐ sterilizált desztillált vízben feloldottunk. Ugyanezen a módon, 4 pg nOülBhOBM Bemül és BspHi restrikciós enzimekkel (Takar a Shuzo Co,) való emésztésével kapott DNS fragmenst <2. fragmens, körülbelül 4 50 bp) és 2 pg pTrzEus (XnVitrogen Co.) Bambi és Sáli restrikciós enzimekkel (Takara Shuzo Co.) való emésztésével kapott DNS fragmenst (3. fragmens, körülbelül 3,6 kb) tisztítottunk és oldottunk fel 20 pi sterilizált desztillált vízben. A DNS fragmensek tisztításához Qiaexll gélértrakcíés kiket használtunk. Az 1-3, fragmenseket „DMA ligaticn kit ver. 2” (Takara Shuzc üo,) felhasználásával iüC-on 2,5 érán át tartó inkubáció segítségévei ligáitok, A ligáciös reakciöelegy felhasználásával transzformái tank CX724 Bscherichia colit (Invirogén Co,) a ThioFuslon Mkpfessióh System (Invirogén üo.) használati útmutatóiában leírt eljárás szerint. Egy olyan plazmiddal rendelkező mikroorganizmus törzset, amelyben az hOBM cDNS fragmens
112 keretben fuzionált e tioredoxln génhez# választottunk ki a kapott ampicillin razisztens transzformánsok közül a restrikciós enzimekkel végzett emésztés során kapott öüS restrikciós térképek vizsgálata és a DNS szekvencia meghatározása segítségével. Az igy kapott mikronrgenizmus törzset dI72s/pTrxhöSih-nek neveztük el.
(2? Tre-hOSM expressz lőj a Escherbzhia coliban
CX724 /pTrxhöBM-et i 1 letve pTrxPus-1 tar ta Imazö él 724 et (01724/pTrxEus) hat érán keresztül sCAC-on rázatva növesztettünk 2 ml RMG-Amp tápközegben (0# él XkuHáCh# 0#34 KH-> PÜg # 0 # 0 5 % Ma C1 # 0 # 1 % NH 01 # 2 % ka z am iηo e a v, 1 % glicerin# 1 mM MgClg és 100 úg/mi ampicillin# pH 7#-4). Táptalajt (0#5mlj adtunk 30 ml indukciós tápközeghez (ö#hk Na3HP<g# 0#3% 0#05% Hadi# 0#l% NH#Ci# ö#2% kazamlnosav# ü#ó% glükóz# 1 mM Mgül3 ée 100 pg/ml ampicillin# pH 7# 4 ) és rázatáaeai 30°C-on növesztettünk, Amikor az ODSo8,s;„ elérte a körülbelül 0,5-öt# ö#l mp/ml végső konoentrációban L-triptofánt adtunk hozzá# majd ezt követben további 6 órán keresztül SC^C-on rázatássál növesztettük, A tenyészet táptalaját 3000 x g sebességgel centrifugáltuk a sejtek összegyűjtése céljából# majd ezt 12# 5 mi FBS-ben szuszpendáituk, A sejtek ronoaoiásához a. szuszpenzlőt ultrahang generátorral (ültrasonlcs Co.) kezeltük, A roncsolt sejteket 7000 x g sebességgel 30 percen át centrifugáltuk# hogy az oldható fehérje frakciónak megfelelő felüluező folyadékot megkapjuk, 10 pi ilyen oldható fehérje frakciót redukáló körülmények között SDS poliakriiamid (lö%) eiektroforézissel megvizsgáltunk. Eredményként# mint azt a 23, ábra mutatja# egy 40 kPa molekulatómegü sávot találtunk a G1724/pTrxhOBM oldható fehérje frakciójában# de ezt nem. találtuk meg a
113
GI724/pTrxBas oldható fehérje frakciójában, Kb v e t k e z é s k épp e n ae g á 11 ap í t o 11 a k, ho gy a 11 o r e do x 1 n é s humán OBM fúziós fehérjéjét (Trx-hOBM) expresszáitattak Escheríshia coliban.
( -) & Trx-hOBM OCIF felé mutatott kötődési képessége
Az sxpreeszált Trx-hGBM OCIF-hoz történő kötődését a következő kísérlet, szerint igazoltuk. 10 mM nátriamhidroyénksrfoonát oldattal oOOö-szeresére hígított antitioredoxln antitestet (Invirogen Co,) adtunk egy 96 lyukas immaniemezre (bűne Co,) 100 μΐ/lynk mennyiségben, Miután egy éjszakán át 4°G-on állni hagytak, a lyukakban lévő folyadékot eltávolítottak. 200 μΐ, PBS-sel (BA-PBS) kétszeresére hígított Block Ács* (Snou Braad Milk Products Co,, Ltd.) oldatot adtunk minden lyukba. Mintán egy órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, a lyukakat háromszor mostak P-PBS-sel, A fent ismertetett GI724/pTrxhOBM-bol vagy GI729/pTrxFas-foél származó oldható fehérje frakciókat BA-PBS-sel hígítva különböző koncentráciékban minden lyukhoz 100 pi mennyiségben adtuk hozzá. Miután két. órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat háromszor mostak B-BBS-sel és BA-FBB-sel hígított 100 pl OCXF~fal (löö ng/mi) töltöttük fel, Miután két órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat háromszor mostuk P-FBS-sel és BA-PBS-sel 2,000-szeresére hígított löö μΐ peroxidázzal. jelölt anti-OCIF antitesttel (a Kö 96/26217-ben ismertetett) töltöttük fel. Miután két órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat hatszor mostuk P-FBS-sel és 100 μΐ TMB oldattal töltöttük fel. Miután körülbelül 10 percre szobahőmérsékleten állni hagytuk, mindegyik lyukat 100 μΐ stop-oldattal (Stopplng Reagent) töltöttük fel. Bgy mikrolemez olvasó segítségével mindegyik, lyuk abszorbancíáját megmértük 4.50 nm-en. Az eredmények a 24. ábrán láthatók. Nem volt abszorbanclabeli különbség a Gl7 24/pTrxFuS'ból származó hozzáadott oldható fehérje frakciót tartalmazó minta és ezen oldható fehérje frakció hozzáadása nélkül készített minta között. Másrészt az abezorbanoia azon minták esetében az oldható fehérje frakció koncentrációjávai arányosan megnőtt, amelyekhez a G1724ZpTrxhOBM-fcői származó oldható fehérje frakciót adtuk. A másik kísérlet eredményei, amelyben az oldható fehérje frakoió hlgitásl mértékét állandó értéken {1 %) tartottuk, ellenben BA-PPS-sel különböző koncentrációkra (0-100 ng/ml) hígított OClF-ot adtunk hozzá, a 25. ábrán láthatok. Látható, hogy az OCIF bármely koncentrációjánál az abezorbanoia alacsony maradt azon minták esetében, ahol a GI724/pTrmFus-böI származó oldható fehérje frakciót használtunk, mig az abezorbanoia az OCIF koncentrációjával arányosan növekedett azon minták esetében, amelyekhez a G17 2 4./ pl r x höBM - b ο I s z á r ma z 6 ο I dh a t ő f e h é r j e f r a k c .1 c t adtuk, Ezen eredmények alapján megállapítottuk# hogy a GI724ZpTrxhöBM-böl előállított Irx-hOBN OGIF-hoz kötődd képességgel rendelkezik.
(4) Trx-hOBM-et termelő Sscherlch.ia______coli...... nagymértékű növesztése
A G1724ZpTrxhOBM sejteket BMG-Amp agaron (0,6% Na2KPO4, 0,3% KB2BO4, 0,05% NaC.i, 0,1% NibCl, 2% kazamlnosav, 1,5% agar, pH 7,1) széieextettük platina oltökaccsal. A sejteket egy éjszakén át GOÓl-cn növesztettük. Az igy növesztett sejteket 10 mi indukciós tápközegben sznszpendaituk, A szuszpenzioból két darab 2.
s.' χ ! A . . •'x ' n . ' ' . ο ' .
.lombikba adtunk (mindegyikbe 5 ml-t) és aO^C-en rázatás közben növesztettük őket. Amikor az elérte a
11.5 körülbelül 0#5-öt# Ö#1 mg/ml végső koncertrációban. Ltriptofárt adtunk hozzá, A razstva növesztést hat órán kérész tül 30®C-on foiytatt.uk. A tenyészet táptalaját 20 percen keresztül 3000 x g sebességgel centrifugáltak# hogy összegyűltsük a sejteket# amelyeket lOOml PBS-bsn szuszpendáltünk. A szuszpenziőt ultrahangos generátorban (Oltrasonlos Co.) kezeltük a sejtek ronesolása céljából, A felülüsző folyadékot 30 percen át 7000 a g sebességgel centrifugáltuk# hogy megkapjuk az oldható fehérje frakciót.
' * ftk.. θη é ty irrsob 1.11 zá 11 a ff 1 n áfás o s z lop e 1 k.é s ζ 11 é s e
Összekevertünk 2 g TSXgel XF-Tolesy.1 Toyeoal. 650-et (foson Corp.) és 35#0 mg# a XO96/26217-ben ismertetett eljárás szerint előállított rekombináns OCIB-ot tartalmazó 40 ml l#0 M kálium-foszfát puffért (pH 7# a), A keveréket egy éjszakéi) ét 4®C-on finoman rázattnk# hogy végbemenjen s kaposoiási reakció, A reatcléelegyet a felülászö eltávolításához centrifugáltuk, Annak érdekében# hogy a feleslegben maradt aktív anyagokat inaktivál juk# 40 ml 0#1. M Tris-HCi puffért (pH 7#5) adtunk s kicsapatott hordozóhoz és a keveréket egy órán keresztül, finoman rázattnk szobahőmérsékleten.. Az oszlopban lévő hordozót OfOll poliezorbát BO-at és 0#2 M HaCi-ot tartalmazó Ö#1 M g)loin-HCi pufferrel (pH 3# 3; és ö#01% poiiszorbét SO-at és 0/2 M üaül-ot tartalmazó 0#l h nátrium-nitrát pufferrel (pH 2#ö) mostuk. Az oszlopban lévő hordozót úgy hoztuk egyensúlyba# hogy kétezer feltöltdttük 0#01é poiiszorbét Bó-at tartalmazó lö sé) nátrium-foszfát pufferrel. (pH 7# 4), (á) iJ-AérákÉBBBBllB/-gjgálf Izéit
I h a s zpá fásává .1 .1.16
Hacsak n® adtunk meg más hőmérsékletértéket, a TrxhOBM tisztítását 9°C-on végeztük, A fent ismertetett OCX?'immob i 1 1 z á. 11 a £ £ i n i t á s b o r d o z é t (10 m X) é s a 2 5. (4} példában előállított oldható fehérje frakciót (120 ml) összekevertük. Az elegyes. egy éjszakán át finoman kevertettük 4öC-on négy darab 50 ml~es oentrifugaosőben rotor segítségével. Egy Econo-columx?S¥i-t (belső átmérője;
l, 5 cm, hossza? 15 cm, a BloBad Co, gyártmánya) feltöltöttünk a keverékben lévő hordozóval. Az oszlopot 300 ml, 0,0.15 poliszorbát 30-at tartalmazó BBS-sel, 100
m. i, 0,015 poliszorbát 8Ö-at és 2 M MsCI-ot tartalmazó 10 mM nátrium- fesz fát pufferrel (pH ?,0) és 100 ml, 0,015 poliszorbát 80-at és 0,2 glioin-HCl pufferrel (pH sorrendben. Ezt kővetően fehérjéket tartalmazó
M BsCl-ot tartalmazó 0,1 M 3,3) töltöttük fel ebben a az oszlopon, abszorbeálödofct
0,015 poliszorbát 30-at és 0,2 M BaCl-ot 0,1 M nátrium-citráf pof fezre! (pH 2,0) eináítuk, Az aiuátumot 5 mi-es adagokban gyűjtöttük össze.
Mindegyik Így kapott frakciót azonnal semlegesítettük 10 térfogati 2 M Eris pof fér (pH 8,0} hozzáadásával, Az elvált frakciókban a Trx-bOBM jelenlétét vagy hiányát az előzőekben, a 25,(3) példában (OCIF felé Mutatott kötődési képesség) ismertetett eljárás szerint határoztuk meg. A
Trx-höBM-et tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és tovább tisztítottuk, (?) A. irxphOBM tisztítása gélszürés segítségével
A 25.(5) példában kapott körülbelül 25 ml Trm-hGBM frakciókat centrifuga iá asa1 no zzá ve tőiege sen 0,5ml-re koncentráltűk Centriplus 10 és Centrioon 10 (Amicon Co,} felhasználásával. Ezt a mintát egy Superose 12 BB 10/30 oszlopra (.1,0 r 30 cm, Bharnacia Co,) vittük, amit előzőleg 0,015 poliszorbát 80-at tartalmazó BBS-sel
117 hoztunk egyensúlyba. Az elválasztáshoz mozgó fázisként 0,01% poliszobbát 80-at tartalmazó BBS-t használtunk 0,25 ml/perc térfogatárammal, Az oszlopról lejövő eiuátumot 0,25 ml-es adagokban gyűjtöttük össze. Az Így összegyűjtött frakciókban .lévő Tra-hOBb-et az előzőekben, a 25,(3) példában Ismertetett eljárás szerint és SDC-BAGB eljárással határoztok meg, A tisztított Trr-hOBM-et tartalmazó frakciókat Összegyűjtöttük és meghatároztuk a Trx-höBM fehérje koncentrációját, A fehérjekoncéntráciö meghatározását standardként marha szérumalbnmint felhasználva végeztük el DC-Broteln assay kit (BioRad Co,} segítségével,
Mldá
11.01¾¾. BAÁe gc 1 a s t kép zés t Indukáló aktivitása uhOBM-et és pcDL-SR a/üo-ot COS-7 sejtekbe transzfektáltuk Lipofectamine íGiboo Co.) felhasználásával, A sejteket egy napon keresztül 10% FCS tartalmú DMEM-ben növesztettük, tripszinizáltok, 5x10^ sejt/lyuk mennyiségben 24-lyukú lemezekre fsddlemezeken (15 mm-es kerek, a Metsonami Co. gyártmánya) széieaztettük és két napon ét növesztettük. A tenyeszlemezt PBS~éél egyszer mostuk, A sejteket 1% varaformaldehid tartalmú FBS-sel fixáltuk, szobahőmérsékleten B percen át, A lemezt, amelyekhez a fixáit sejteket erősítettük, BBS-sel hatszor mostuk, majd ezt kővetően mindén lyukhoz 700 pl-t adtunk ebből az oldatból, amely úgy készült, hogy 10* M aktív formájú fb-vitasrlnt, Í0~? M dexametazent és 10% magzati borjnszörnmot tartalmazó a-MBM-ben lmÍ0&/ml sejtsürűséggel egér löpsejteket szuszpendáitank. Minden
118 lyukba. Mlilloeii ECE-et (Miliipore Co.) helyeztünk, és e fent említett tenyésztápközegben sznszpemöált 312 sejtekből (4xl<b/ml; 700 pl-t tétünk a Miliicell ECF-be, majd ezután hat napon keresztül 3700-on inkubáltunk, A növesztés után a Miliicell FCE-et eltávolitottuk, a lemezt PBS-sel egyszer mostuk ős a sejteket aoeton-etenol oldattal (50:50) egy percig fixáltuk. Bzután. a borkösev rezisztens sav se j te ke t, ame 1y foszfatáz aktivitás aktivitást (TxAP) mutató az osteoclastok specifikus jellemzője, Leukooita Aoid Phosphata.se kit (Slgma Co.) felhasználásával szelektíven festettük. A mikroszkópos megfigyelés eredményeképp azt kaptuk, hogy azokba a lyukakba, amelyekbe a pcDL-SE d296~tal transzfektált COS-7 sejteket fixáltunk, nem figyeltünk meg TBAP-pozitiv sejteket. Ezzel ellentétben S5H8 lariao ± szórás, n-3) TPAP-pozitiv sejtet figyeltünk meg azokban, a lyukakban, amelyekbe phCEM-mfel trensefektált COS-7 sejteket fixáltunk. Továbbá abból a tényből következően, hogy 'Uí>itei jelölt lazac kalcitonin (Amersham Co.) specifikusan kötődött ezen TBAP-pozItiv sejtekhez, igazoltuk a kalcitonin receptor expressziöját, Ezen eredmények alapján bebizonyítottuk, hogy a humán OEM, amely a találmány szerinti oDNS által ködeit fehérje, osteoclast képzést indukáló aktivitással rendelkezik,
A Trx-hOEM ős______a szekretá11 forma j ü_ humán OBM osteoc1 as t kÉErAőy Ih^j©® í b a k % v*tása
IXü M aktív formájú b3-vitamint, 10'' M dexametazont és 10% magzati bor jészémmot tartalmazó o-MEM-ben .1X9 szuszpendáitünk RxXOVmi koncentrációban egér Xépsejkeket, A szuszpenzlöt 24-lyukas lemezbe töltöttük# lyukanként 350 pl. mennyiségben. Ezután minden lyukba a tisztitett TrxhOBM fent említett tenyésztápkózeggel hígított 350 μΐ.-ét (40 mg/ml), .350 pl olyan IMDM-XQá FCS tenyésztapközegben 293-BBBA sejtek növesztésével előállított kondicionált tápközeg a fent említett tenyésztápközeggeX 10-szeresére hígított oldatát töltöttük, amelybe pCBPsbOBM-et vagy pCEPá-efc transzfektáltunk, vagy 350 pi csak a fent említett tenyősztápközeget töltöttük. Millióéi! PCF-et (Mllllpcre Co,) helyeztünk minden lyukra, amelyhez a. fent említett tenyésatápközegben szuszpendáit BT2 sejfékből HxXö'VmX) 600 pl-t adtunk·. Hat napon keresztül tartó növesztés után eltávolitattuk a hillioell BCF-ef. A lemezt PBS-ael agyszer mostuk es a sejteket aoaton-etanoi oldattal (50:30) egy percig fixáltuk. Ezután a borkősav rezisztens sav foszfatáz aktivitást (TRAB aktivitás) mutató sejteket „kenkocíta Add Phoschatase kit” (Sígma Co.) felhasználásával szelektíven festettük, A mikroszkópos magfigyelés eredményeképp azt kaptuk, hogy azokban a lyukakban, amelyekbe nem adtunk Trx-hOBM-et, nem figyeltünk meg TEAF-aktivitást mutató sejteket, mig 115113 (átlag a szórás, d; TRAP-pozltiv sejtet figyeltünk meg azokban a lyukakban, amelyekbe adtunk Trz-hOBM-et, Hasonlóan, nem figyeltünk meg TRAP-aktívitást mutató sejteket azokban a lyukakban, amelyekhez pCBPá-gyel transzfektált 295-FBNA sejtek kondicionált tápkózegát adtuk, mig 125A23 (átlag é szórás, n^3) TRAB-pozitiv sejtet figyeltünk meg azokban a lyukakban, amelyekhez pCEBshöBM-mel transzfektált 293-BBRA sejtek kondicionált tápközegét adtuk. Továbbá abból a tényből következően, hegy 'd-ts i jelölt lazac kaloitonin (Amersham Co.)
120 specifikusan kötődik őzen TRAF-pozitlv sejtekhez, igazoltuk a kaiéitonln receptor expresszioját.. Ezen eredmények bebizonyították, hogy a Trx-hOBB és a szekretált formájú hOBM osteociast képzést indokélő aktivitással rendelkérik.
2S, Bélda
E o 11 k. Iρη|. X1. e e n 111 e a t kéa z 11 é s a
A fent ismertetett eljárás alapján állítottunk old intrenogánként használt egér sOBM-et vagy humán sCBB-et,. Konkrétan, az egér aOBB. cDBS-t (az a cDNS (SBO 10 BO 10), amely az egér' sOBM-et (SEO 10 Bö 10) kódolja, amely nem rendelkezik az agár OBM membránkötb régiójával az Bterminálistől lefele a 72, aminosavig tartó aminosavak hiányának, következtében) vagy a humán sOBM. oDBE-t (az a oDBS (SBQ ID Bö 19), amely a humán söBM-et (SBO ID NO 17) kódolja, amely nem rendelkezik a humán. OBM membránkötő régiójával az B-terminelistdl lefelé a 71 . aminosavig tartó aminosavak hiányának következtében) a pSec TagA. expresszios vektor (InVitrogen Co.) Hindlll/BcoBV fregmeneével (5,2 kb) ligáituk, amely fragzsensben az immunglobulin k-láncának szignál peptldjét kódoló nukleotid szekvencia is benne volt, együtt az OBM oDBS BooOI/FmeC). fragmenaávei (0,02 kb), a „ligetien kit ver 2 (Takara. Shuzo Co.) felhasználásával,. A reakoiőte rmákkei Bsdheríohia coli DBÖa-t transzformáltunk, Az igy kapott ampieillin rezisztsns törzsekből kapott plazmidokat alkálié BOB eljárással tisztitottak ás restrikciós enzimmel emésztettük, hegy kiválasszuk, azt a plazmidot, amely a pSec TagA-he bevitt 0,0 kb és 0,22 kb fragmensskkel rendelkezik. Ezen plazmád szekvenciáját
121
Dyedeoxyfcerminator Cyole Seguencing ES kit (a Perkin Elmer Co, gyártmánya) felhasználásával határoztuk meg. Ennek eredményeképpen Megállapítottuk-^ hogy ez a plazmád az egér vagy humán sCBH-et kódold szekvenciával rendelkezik. Hintán a plazmidot Nhel/Xhol restrikcióé enzimekkel emésztettük, a szekréciós formájú OEM oDNS-nek megfeleld fragmenst (1,0 kb) kaptuk vissza agaróz géieiektroforázissel, Ezt a fragmenst a pCBF4 expressziős vektor (XnVltrogen Co,) Ehel/Ehol fragmensébe (10,4 kb) vittük he ligáciős kit segítségével, Escheriehia coli BBooo-t transzformáltunk a reakciőtermék felhasználásával, Az igy kapott ampicíllin ra?>sm.ens törzsekből a plazmldokst alkáli SOS eljárással tiszti tortok, Ezen plazmidekat restrikciós enzimmel végzett emésztéssel vizsgáltuk és kiválasztottuk a célszerkezettei rendelkező szekréciós típusú OEM expressziös plazmidot (pCEP sOBM) tartalmazó Escheriehia colit, A pCEP sOBM-mel rendelkező Escheriehia coli törzset növesztettük és a pCEP söBM-et Qiafilter piasmld midy kit (Qiagen Co,) segítségével tisztítottuk* Ezután 101 ECS-t tartalmazó lEEM-ben (1HBHΙΟΙ FCS) szaszpendáitunk 293-EBNA sejteket ée kollagénnel bevont 24-lyukú lemezekre (a Samitomo Bakelité Co., Ltd,) sxélesztettük eket 2x10 sejt/2 ml/lyuk sejtsürüeéggei. Egy éjszakán át tartó növesztés után a sejteket 1 pg pCEP sOBM-mel vagy pCEB4-gyeÍ transzformáltuk 4 pl Llpofeotamine (Gfbco Co.) segitaágével és tovább növesztettük őket két napon át 0,5 ml szérammentes IHDHben vagy IMbH-lOé FCS-ben, Visszanyertük a tenyészet feiulúszöját, A következők szerint szűrtünk rekombináns egér oldható CBH-xe (msöBM) vagy humán oldható OBE-re (hsOBM) nézve magas termelékenységű sejtvonalat, 0,1 H végső koncentrációban nátrlum-hidrogénkarbonátot adtunk ahhoz a tenyészet-felüló.szchcz, amely a várakozások . <ív s<szerint tartalmazta az meOBM-et vagy hsOBM-et, 100 μί tenyészet-íelülűszőt adtunk egy 96-lyukas immunlemez (Nuno Co,) minden lyukába éa egy éjszakán át 4°€~on állni hagytuk, igy a tenyészet-ielulűszőban lévő msOBM vagy hsOBM a lyukakra ímmotdiizálédott. Minden Ivükhöz 200 μ.1, FBS~sei (B-.PBS) négyszeresére hígított Biock Acew (Snow
Brand Műk Products Co., Ltd,) oldatot adtunk és a lemezeket két órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. Miután a lemezen mindegyik lyukat háromszor mostuk 0,1% poliszorbát 20~at tartalmazd PBS-sel (B-PBS), P-PSB-ael sorozatosan hígított mindegyik rekombináns OCIF (rOCIF) oldatból (3-100 ng/ml) 100 μΐ-t adtunk a lemezen lévő mindegyik lyukhoz, A lemezeket két órán á.t 37°C-on állni hagytuk. Miután, a lemezeket PBS-sel háromszor mostuk, BPSS-sei hígított. 100 μί peronidázzal jelölt antl-OCXF poliklonálís antitestet (MO 06/2621?) adtunk mindegyik lyukhoz. Mintám két órán át 3?*C~on állni hagytuk, a lyukakat hatszor mostuk P-PBB~sei, Ezt követően 100 μί TMB oldatét (TMB oldható reagens, nagy érzékenységű, SoyTek Co,.) adtunk a lemezen lévő mindegyik lyukhoz és a lemezeket körülbelül 10 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd a reakciót 100 μί stop-oldat (Stopping reagent, ScyTek Col) minden lyukhoz való hozzáadásával me gél. 111 o 11 u k« E g y mi kr ο 1 eme z ο 1 v a s ő megmértük minden lyuk abszorbanoiáját Megéllapitottuk, hogy az abszonbancis. a lm koncontráoiójaval arányosan nagymértékben n lemezek esetében, amelyekbe az msOBM-et termelő sej tvonal tenyészet-feiűlászőjában vagy hsOBM-et immohi1izéitek.
segítségével 450 nm-en, ráadott OCIF tkodétfc azon gy hsOBM-et ϊ vő ms OBM-e t .2(
A nagyfokú abszorbanpiabeii növekedést mutató sejtvonalat választottuk ki magas produktivitásé törzsként. Az ezzel kapcsolatos, msöBM-re vagy hsOBM-re nézve magas produktivitásé 293-EBMA sejteket nagyléptékűén növesztettük 5% FCS-t tartalmazó 1MDM tápközegben 25 T~ edény (1:-225) felhasználásával. Miután a sejtek összefolytak, friss tenyésztápközeget adtunk mindegyik T225 edényhez, edényenként 100 ml mennyiségben és a sejteket 3-4 napon át növesztettük, majd összegyűjtöttük a tenyészet-felülüszőt♦ Ezen eljárásokat négyszex? ismételtok meg, hogy 10 liter, msO3M-et vagy hsOBM-et tartalmazö tenyészet-felüiuszet kapjunk. Az SőS-poliakrilamid géiélaktroforézisen homogén sávot mutató (molekulatömeg: 52 kha) tisztított msöBM-et (10 mg) vagy hsOBM-et (12 mg) a tenyészet felüiűszohol kaptuk OGIF-immobilizéit oszlopon igy kapott használtuk antigént 1)0 pg/ml térfogatú.
végzet t affinitás kromatográfia. és gélszüréses kromatográfia segitségével a 25.(6} és 25.(7) példákban ismertetett élj áras szerint, Mindegy! k tisztított készítményt antigénként ixmmrnizáeíőhoz. Mindegyik kapott fehérje foszfáttal, puffereit konyhasoolöatban (BBS) koncentrációra feloldottuk és ugyanakkora
Frennd-féie komplett hatásjavítóval emulziflkaitűk. A három, japán fehér nyűi mindegyikét 1 mi emulzióval körülbelül egyszer egy héten szubkután módon immunizáltuk. Amikor az antitest titer elért egy csúcsot, egy emlékeztető injekciót adtunk be. A segédinjekeié beadását követé iö. napon levettük a teljes vért. A szérumot a protein A sepharose kroma tográfiához való kötő pufferrel (Blokád Co.} kétszeresére hígítottuk és ugyanezzel a pufferrel egyensúlyba hozott protein A oszlopra vittük fel, Miután az oszlopot ezzel a pufferrel bőven mostuk, az oszlophoz adszorbeélödott antí-sOBM antitestet egy eiuciős
124 pufforral (BioHad Co.) vagy 0,1 M giioin-BCl puff orréi pH 3,0, elnalfcak, Az eluátum azonnali semlegesítése erdőkében az oluátumot olyan kémcsövekbe gyűjtöttük, amelyek kis mennyiségű 1,0 M Tris-HCL-st (pB 8,0) tartalmaztak. Az elnátumct egy éjszakén át 4öC-on áializáltnk BBB-sel szemben. Az antitest oldat antitest tartalmát Loery módszere segítségével mértük meg, standard fehérjeként marha IgG-t használva, így I ml nyűi antiszéramböl sor emelni 10 mg, a tarazmany szerinti poxxkionalxs antitestet tartalmazó tisztÍrott immunglobulint (IgG) kaptunk,
O. Bé.lda
Az OBB és sOBb ELISA segítségével történő mérése űgj-J-klonélie^ antixest feidasznéiásáve 1
A 28, példábsn kapott nyúl anti-humán sOBb poliklonáiis antitest, mint szilárd fázisé antitest és enzim-jelölt antitest felhasználásával szendvics BLISA-t készítettünk, Lshikaea eljárása (Tshlkava és mtsai, J. Imrnuneassay, 4, kötet, 209-327# 1983) szerint peroxidázzsi (BOB) jóiéit antitestet készítettünk,
A 28, példában kapott anti-humán sOBb poliklonáiis antitestet 0,1 b BaBCCn-ban 2 pg/ml koncentrációra feloldottuk, Az igy kapott, oldat 100 pl-ét adtuk agy 98lyukas itasuUemez (Huné Co,) mindegyik lyukába, amit ezután egy éjszakén ét szobahőmérsékleten állni hagytunk. Azt követően .200 pi 80%-os Biock Ace'^-t (Snoe Brand bük Co,, Ltdb) adtunk mindegyik lyukhoz éa a lemezeket egy órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, A lyukakat 0,1%
125 poliszorbát 20-at tartalmazó BBS™seI (mosó poftér) háromszor mostuk,
A 26.. példában ismertetett eljárás szerint humán OBMet expresszáitattunk és a 2. példában ismertetett eljárás szerint tisztítottuk. A tisztított humán OBM™et és a 28, példában előállított tisztított humán eOBM™et sorozatosan hígítottuk az első reakclopuff ezrei. (40% Blook Ace-t és 0,1% poliszorbát 2(5™at tartalmazd 0,2 M Tris-HCi poffér, pH 7,2) és a lemezek mindegyik lyukába 150 pl ilyen hígított oldatot adtunk. A lemezeket két érán. keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk és a fent említett mosőpufferről háromszor mostuk, Ezt kővetően a második reakoiépuftőrrel (25% Blook Aoe-t és 0,1% poliszorbát 20™ at tartalmazó 0,1 M Tris™Hül poffér, pH 7,2) 1000™ szeresére hígított 100 μΐ PöD-jelölt sntí™humán sOBM polikionáiís antitestet adtunk a lemezek mindegyik lyukába. Miután a lemezeket két órán keresztül, szobahőmérsékis ten á11ni hagytuk, mindegyik lyukat háromszor mostuk a mosőpufferrel, Ezután 100 μΐ enzim szűnsztrát oldatot (2MB, SoyTek Co,) adtunk a lemezek mindegyik lyukába es a lemezeket 10 peroen. át állni hagytuk, majd ezt követően 1(5(5 μ'Χ reakciót leállító oldatot (8topping reagent, SoyTek Co«) adtunk hozzá, hogy megállítsuk az enzimreakciót. Egy mikroiemez olvasd felhasználásával megmértük minden lyuk abszorbanciáját 450 nm-'-en. Az eredmények a 26, ábrán iáehaték, A nyúl. anti™ ' , AO o'' χ. b Ό \ x ''xxO
BLISA majdnem egyformán ismerte fel a humán sOBM™et (molekulatömege körülbelül 32 kDa) és a humán OBM.....et (molekulatömege körülbelül 40 kOá) körülbelül. 12,5 k lö~* pmol/mX mérési érzékenységgel (humán OEM; körülbelül 500 pg/mi, humán aöBM; körülbelül 400 pg/ml), A 28. példában antitest
126 kapott nyűi antí-egér sOBM poliklonális felhasználásával végzett egér sOBM és egér OEM EL ISA eljárással végzett inérése alkalmas volt arra, hogy ugyanezen a módon végezzük el. Megállapítottuk, hogy rendkívül kis mennyisége egér sOBM vagy egér OEM a fent leírtakkal majdnem egyező érzékenységgel, mérhető.
Mint azt fent emlitettük, a 28, példában, készített találmány szerinti anti-humán sOBb polákionáll.a antitest egyformán képes felismerni mind a humán sOBb, minő a humán OEM antigéneket. Ezért ez antitestet anti-humán OBM/sOBM poliklonális antitestnek, neveztük el. Hasonló módon, a 28, példában készített anti-egér sOBb poliklonális antitest egyformán képes felismerni mind az egér sOBM, mind az egér ÓBB. antigéneket, boηok1oná11 a antitest kész1 teae
A 28, példában készített tisztított humán sOBM-et használtuk antigénként immunizáciéhoz, A tisztított humán sOBb-et fiziológiás konyhasóoldatban lő pg/mi koncentrációra feloldottuk. és ugyanekkora térfogatú Freund-fele komplett hatásjavítóval való összekeveréssel emui z1f ikálta k. Az emui z i ó t háromszor 20 0 pl dózisban, hetente egyszer adtuk be BALB/e egereknek intraperiténiásan immunizálás céljából. Ezt követően ugyanakkor a térfogatú Freund-féle komplett hatásjévitót adtunk 5 pg/mi humán sOBB-er tartalmazó fiziológiás konyhasóoIdáihoz és a keveréket eléggé emulzió1kaitűk, Ezt az smnrzíét 200 pi-es dózisban injektáltuk ind', seperi tóniasan BALB/o egerekbe hetente egyszer négy héten keresztül immunizálási célból« A negyedik rmmunizáeiő után egy héttel segédinjekeiéként Iöö pl, 10 pg/ml humán sOBM-et tartalmazó fiziológiás konyhasó oldatot adtunk be intravénásán a BABB/o egereknek. Három nap elteltével. kivettük a léget és eiválesztettuk a iépsejteket, A lépsejteket H3x63~Ag5,653 egér mielőma sejtekkel fuzíenáltettuk szokásos eljárás szerint (Aoehler, ÖL és MiXstein, ü,, Hatare, 256, 455 (1975)/. A szuezpendélt fuzionált sejteket 10 napon át hipoxanrint, aminopterint és timidint tartalmazó HAT tápkőzegben növesztettük, hintán a mlelóma sejtek elpusztultak és a hibridémák feltűntek, a HAT tápközeget aminopterin-mentea HAT tánközegre cseréltük és tovább folytattuk a s ej t nőve értést,
Akiyaááéáéága és áldnezás
A hlhridómá.k feltűnését lö nappal a 3 CL példában, ismertetett sejtfúzió után figyeltük meg, A következő eljárás szerint kiválasztottuk a humán aOBM-et nagy affinitással felismerő menoklonálie antitesteket és ezen antitesteket termelő hibridomákat az alább leirt javított szilárd fázisú BUSA felhasználásával. Továbbá ahhoz, hogy mind a humán sÖBM-st, mind az egér sOBM-efc felismerő antiOBM monoklenális antitestet kiválasszuk, a 27, példában készített egér eöBM-et használtuk fel antigénként a humán aGBA-en felül a szilárd fázisú BAIüA-hozx A humán sOBM-et, illetve ez egér sOBM-et 5 pg/ml kenoentráoiöban 0,1 M nátr inm-/h idrog én ka rbona t oldatban feleidottu k, Mindegy!k antidén -oldatból Sö pl-t adtunk egy 56 lyukas immnnlemez
126 (Nunc Co.) mindegyik lyukéba, A lemezeket egy éjszakén át 4°C~on állni hagytuk, hogy immobilizáijuk az antigéneket. Mindegyik lyukból eltávolitottuk az antigén oldatot. Ezután minden lyukat 200 μί. 50% Block Ace^-val (Snow Brand Műk Products Co., Ltd,) feltöltöttünk és azobahöméxsékleten egy érán át állni hagytunk. Miután minden lyukat 0,1% poliszorbát 20-at tartalmazó foszfáttal puftereit konyhasöoldattal (PBS~P) mostunk, 40 μί borjászérumot (Hiclone Inc,) adtunk minden lyukhoz, Ezután mindegyik hlhrldöma tenyészet-feiniűszöböl 10 μί-t adtunk a lyukakhoz és m lyukakat 80% borjűszérum jelenlétében szobahőmérsékleten két órán át inkubáituk. A 00% borjúszérum jelenlétében végzett szilárd fázisú ELISA oélja, tégy kiválasszuk azt a hibridemét, amely olyan antitestet termel, amely még magas fehérje koncentrációjú oldatban lévő nagyon kis mennyiségű humán sOBM-et vagy egér sÖBM-et is képes érzékelni, akar szérumból származó, ímmunreakeiéval in.terferálö anyag jelenlétében, azaz olyan hibridömát, amely humán sOBM™re vagy egér sQBM-re nézve nagy affinitásé antitestet tud termelni. Miután két érán. keresztül szobahőmérsékleten zajlott a reakció, a lemezeket PBS-P-vel mostuk és ezt követően 25% Block Ace-t tartalmazó fiziológiás konyhasöoldattal 5000-szeresére hígított peroxidázzal jelölt anti-egér IgG-bcI (KPA Co.) 50 μί-f adtunk minden lyukhoz. Két órás szobahőmérsékleten zajló reakció után. a. lemezt PBO-P-vel háromszor mostuk. Miután 50 μί enzim szubsztrát oldatot (TMB# ScyTek Co.) adtunk minden lyukhoz, a reakciót öt percen át folytattuk szobahőmérsékleten, Az enzimreakciót 50 pl stop-oldat (Stopping reagent, ScyTek. Co.) hozzáadásával állítottuk meg, A humán sOBM™et vagy egér sOBM-et felismerő antitesteket termelő hibridomékát a lyukak 450 nm-en
129 mikrolemez olvasóval (Immuno Reader Nö'2000^# Hoppon InterMed Co.) mért ahszorbanoíáján.ak mérése segítségével vá 1 a s z t o 1t u k k 1 < mutató választottuk ki»
A kiemelkedően nagy ahszorhanciát a n 1i1 e s t e ka t t a rme 1 e b. í h r í dómé ka t
Ezen hiferiáómék korlátozott hígítás!
eljárással végzett klónozását 3-5 alkalommal ismételtünk meg# hogy stabil hibridómákat hozzunk latra. Az igy kapott antitest-termelő hihridöma klórok közül választottuk ki a kiemelkedően nagy antitest produktivitást mutató hibridómákat.
(Monoklonáils antitesttermelése és tisztítása
A 31. példában kapott antitest-termelő hibridómákat növesztettük# azaz az olyan nagy affinitása antitestet termeld hibradomákat# amelyek felismerik a humán sOBM-et# illetve az olyan hibridómákat# amelyek egér sÖBM-mel keresztreaktivitást mutató antitestet termelnek. Mindegyik híbridőmát intraperíteniásan beültettük olyan BALB/o egerekbe (1 x 1Ö'V sej t/egér) # amelyeknek egy héttel előtte prisztánt (Aldorícb Co.) adtunk be. Körülbelül 2-3- héttel ezután összegyűjtöttük a felgyűlt hasvizet. A hasvízben lévő# a találmány szerinti humán sOBM-et vagy mind a humán sOBM-et ás egér sOBM-et felismeri monoklonális antitestet a a, px \ urna md am -db''* s r k.x, , ds vtnnn tisztítási eljárása szerint tisztítottuk Protein A oszlop reihaszna„ssavat. Így kaptuk a hasvizhöl a tisztított m ο η o k 1 on é 1 i a a n f i t e s t e t B r o f e i n A o s z 1 ο p k. r o ma t o g r é f í a (Rharma oi a Co,) seg11 sege ve 1.
33, Példa
A monoklonális antitest antigén speoifltása
A humán sOBM-et spécifikusan felismerő monoklonális antitest antigén spécifitosát és a mind a humán sOBM, mind az egér sOBM felé keresstreaktivitást mutató monoklonális an ti testet megvizsgál tűk humán sOBM, msmbr ánkötő réglóval rendelkező humán intakt OBM, egér sOBM és membránkötö régióval rendelkező egér intakt OBM felhasználásával, Több mint harminc különböző monoklonális antitestet kaptunk, A több reprezentatív antitesten végzett vizsgálatok eredményeit az '1. táblára Wan mutatjuk be. Eredményként azt találtuk, hogy a humán sOBM-et specifikusan felismerő legtöbb antl-bumán sOBM menoklonálls antitest s membránkötö régióval rendelkező humán intakt OBM-et is felismeri, őe nem az egér OBM-et és a membránkötő régióval rendelkező egér intakt OBM-et. Másrészt azt találtuk, hogy csak néhány olyan monoklonális antitestet kaptunk, amely mind a humán sOBM-et, mind az egér sOBM-et felismeri és azt, hogy ezen antitestek mind a humán OBM, mind az egér OBM felé keresztreaktivitást mutatnak. Ezen eredmények azt mutatják, hogy van egy általános antigén-felismerő hely, nevetatesen egy általános epitop minő a humán OBM-ben, mind az egér OBM-ben, Annak alapján, hogy immun antigénként humán sOBM-et felhasználva állítottunk elő a n 11-hurnán aOBM mono k1on á1i s ant i t a s tet, e z ug y aη11yen mértékben a membránkötö régióval rendelkező humán OBM-et is felismeriχ Az sntl-humán sOBM monoklonális antitestet ant'l-humán OBM/sOBM monoklonális antitestnek neveztük el , '1, Táblázat
131
H-OBM 1 ; H-OBM 2 4 •l· 4- 4 —·· —
H-OBM 3 e 4- - A.·.»
H-OBM 4 4 4- .... ....
H-OBM 5 ·: 4· - -
H-OBM 6 4' 4· ...
H-OBM 7 e 4' ... ....
H-OBM 8 V 4' - -
H-OBM 9 4 4- 4· 4-
H-OBM 10 4- 4 ... :-SS<·
H-OBM 11 4' v - ...
H-OBM 12 4· 4' .... -
H-OBM 13 4 4- 4- 4·
H-OBM 14 4- é ο··
hsOBM: humán Oldható OBM# .oo\ou\ , m * 1 ma OBM: egér oldható OBM# mOBM: egér membránkötött típusú OBM.
A monoklonális_______űratűn MAeníiiMnB.lÁl.BÁMn.l.sÁÁiÁnBÁ m e g h a t á r e z é a a
A találmány szerinti monoklonális antitest osztályát és' alosztályát az írosunglobulin osztály és alosztály analízis kit (Amersham Co.) segítségével, a mellékeit útmutató szerint határoztuk meg, A reprezentatív monoklonális antitesteken végzett vizsgálatok eredményeit a 2, táblázatban mutatjuk be. Mint az a 2, táblázatban látható, az anti-humán OBM/sOBM monoklonális antitestek többsége IgO: volt, a többi Igű és IgObfc. Mindegyik antitest könnyű lánca κ lánc volt.
Táblázat
Antitest IgO lge2;. 1. g; 3 IgA K J
H-OBM 0 -·- ... - -
H-OBM 9 4. *·* .... á
5-OBM 10 a - - ... a j
H-OBM ii .... ... - j
H-OBM 12 ... ... 'Γ ... .... a |
H-OBM 13 V., ... - ... 4
H-OBM 14 ... _1
A monokionális antitest öisszoclácú.ós_______konstansának (Kf, érték.) mérése
A monokionális antitest disszociácios konstansát ismert eljárás szerint (Beírasd Frigaet és mtsaiu: Journal of Immunologicai Mefchods, 77, 305-319, 1986) határoztuk meg. Eszerint a 32. példában kapott tisztított antitestet 40% Biock Ace-t és 0,1% poliszorbát Oö-at tartalmazó 0,4 M Tris-HCl. puírerben (elsődleges puffer, pH 7,4) 5 ng/ml koncentrációban ’ x uo ' r , n.
kapott tisztított humán oldható OEM (hsOSM) elsődleges pu f f e rben h. 1 g i t o 11 o 1da fcán.a. k, ame I y koncen t r áo iő tartománya 6,25 pg/mi-cől 10 pg/ml-ig terjedt, ugyanekkora térfogatával kevertük össze, Az elegyet 15 őrén ét 4eC-on állni hagytuk, hogy a hsOBM a monokionális antitesthez kötődjön. 15 őrá. elteltével a hsOBM-hez (10 pg/ml., 100 ui/iyuk) nem kötődött antitestet immobilizált szilárd fázisú EL1SA segítségével megmértük, hogy kiszámítsuk a monokionális antitest hsOBM felé mutatott disszociáciés állandóját, Továbbá ugyanezen eljárás szerint megmértük egy antitest msOBM felé mutatott affinitását azzal a különbséggel, hegy a HsOBM helyett msOBM-et használtunk, amely antitest egy nőnekicnális antitest hsOBM-re és a keresztreaktivítást egér oldható OBM (msOBM) tele is mutatja. Á 3« táblázatban láthatók azon antitestek disszociációé konstansai, amelyek mindegyik antigén felé nagy affinitást mutatnak és enzimetikus immunoeasay-hoz és kötési assay-hez használhatók.
3. Táblázat
Anti test Alosztály Antigén Dl s s zo c 1 á ο 1 é s ko n s t a n s | Ad(M)
H-OBM 1 Igéi(x) hsOBM 1 x líTA < kd < 1 x lö“n> |
H-OBM 4 Ige,(x) hsOBM 1 x 10’a < kd <' 1 x Kó;; 1
H-OBM 9 IgÖ:(x) hsOBM 1. χ 10* < kd < 1 x lö* |
H-OBM 9 msOBM 1 x ad < kd < 1 x lö”; |
Eredményként azt kaptuk, hogy a H-OBM 1 és H-OBM 4 disszooiáoiós konstansai (Ad), amelyek a humán oldható OBM-re (hsOBM) specifikus antitestek, 10''“ M nagyságrendben voltak, ami azt mutatja, hegy nagy az affinitásuk a hsOBM felé. Másrészt mind a baOBM-et, mind az egér oldható OBM-et (msOBM) felismerő H-OBM 3 antitest Kd értéke msOBM fele 10* M és hsOBM fele 10'* M nagyságrendben volt. Továbbá az 1. táblázatban lévő mindkét antigént felismerő másik antitest díaszooiáoiős konstansa, azaz a H-OBM 13 disszooiáoiós konstansa mindegyik antigénre nézve ugyanakkora volt, mint a H-OBM 9-re nézve, és ezen két antitest ugyanabba sz alosztályba tartozik. Ezen felismerések azon lehetőséget sugallják, hogy ezek mindegyik antigén ugyanazon epitópjat felismerő azonos antitestek.
134
A humán OBM és sOSM szendvics SLIÉA-yal______y ég ζ n 11 mé xé s 1 eljárása antl-humán OBM/sOBM..........^ΡΑΡΑΙΜΑΑόΙο...........^titestek í e 1 h a s ζ. n á I. a s á y a 1
A 35. példában kapott két nagy affinitása monoklonális antitest, a. H-OBM 1, illetve a K-ÖEM 4 szilárd fázisé antitestként és enzimjeiéit antitestként való felhasználásával készítettünk szendvics ELlSA-t, Az antitest jelölését maieimlddel aktivált perozidáz kit (Piers Co.) felhasználásával végeztük el. A H-OBM 1 antitestet 0,1 M nátrium-hidrogénkarbonát oldatban 10 pg/ml koncentrációra feloldottuk és ezen oldat 100 μΐ-ét adtuk egy Ρβ-iyukű immunlemez (huné Co.) minden lyukába. Miután az antitest irmsobiiizáladásához egy éjszakán át dhO-on állni, hagytuk, az oldatot eltávolítót tűk és 300 μ! 50% Biook Ace'^ oldatot adtunk a lemez minden lyukához, .Minden lyukat blokkoltunk a lemezen égy, hogy szobahőmérsékleten hagytuk állni két érán át. Blokkolás után a. lemezeket 0,1% poliszorbát 20-at tartalmazó foszfáttal puffereit konyhasőoldattal (BBS-P) mostuk. Humán OBM-et (hOBM), Illetve humán oldható OBM-et (hsOBM) hígítottunk 40% Biook Acé^-t (Snou Brand Milk Products Co., Ltd.) és 0,1% poliszorbát 20-at (Makó Pnre Chemicals Co., ktd,) x m 4 1 ' s < ' i x C ' | x ' ,' x's r \ é rt é ken (e .1 ad r eakciőpu f f er} kü iönböző koncén t ráci éj ű tesztmihták előállítása céljából. Ezen különböző koncentrációjú tesztmintákat adtuk lyukanként 100 μΐ. mennyiségben minden lyukhoz és a minden lyukra iwobiXizálf B-ÖBM X anti testtel reagál tatfcuk szobahőmérsékleten két órán ét tartó inkubációval. Hét óra elteltével a lemezeket PBS-P-vei mostuk. Ezt követően löd pi, 25% Biock Ace^-t és 0,1% poliszorbát 20-at 7,4-es pH értéken 0,2 M Trls-BCi pufferben (második reakciópufferj '* ''0 ő,
POD-aelölt H-OBM 4 antitestet tartalmazó oldatét adtunk minden lyukba, majd ezt követően tovább inkubáltuk szobahőmérsékleten két érán keresztül. A lemezeket ezután. BBS-P-vel mostuk és 100 μϊ enzim szubaztrát oldatot (TMB, OoyTeo Co,) adtunk minden lyukhoz, hogy beindítsuk az enzimreakciót♦ Az enzimreakciót 100 μϊ reakció stop-oldat (stopping reagent, ScyTek Co.) minden lyukhoz történő hozzáadásával állítottuk le. Egy mikrolemez. olvasó segítségével 450 um-en megmértük minden lyuk abszorbaneiáját, Az eredmények a 27, ábrán láthatók.
Eredményként megállapítottuk, hogy a 35> példában, előállított humán OBM/söBM-re nézve nagy affinitáséi. két anti-humán OBM/sÖBM monoklonális antitest, a B-OBM 1 és a H-OBA 4 felhasználásával készített szendvics BUSA egyformán ismeri fel a humán. OBM-et és a humán sOBA-et, valamint alkalmas nagyon kis mennyiséoü humán OEM vagy aOBA körülbelül 1,25 x inj-töi 2,5 x 10' pmol/ml (40 kba moleknlatőmegü humán ŰBM-re körülbelül 50-100 pg/ml és 3.2kOa molekalutömegü humán sOBM-re körülbeiOl 40-00 pg/ml) mennyiségi határig történő mérésére. Ezen két an ti '-.humán ÖBM/aOBM monoklonális antitestet, a B-OBA 1-et és H-OBM 4et termelő hibridőmukaé B-OBAl-nek H-OBA.4-nek neveztük el. B-OBH9-nek neveztük el azt a hibridómát, amely az egér OBA-et ás egér sOBM-et felismerő suti-humán OBM/sGBM monoklonális antitestet (B-O.BM 9} termeli és osteociast. képződést gátló aktivitással is rendelkezik. Ezen hibridömákat 1993. november 5-en a ΒΕΡΑ ΒΡ-δ264 (B-OBM1), BEÁM BB-52E5 (H-G8M4) és EEBM BP-5256 (H-ÖBM9) letéti számokon a „National Xnstitute of Bioseien.ee and Humán Technology, the Agenoy of Industrial Science and Technology$>-nál letétbe helyeztük.
Egér mérése egér OEM-et és egér sOBM-et felismerő anfcigbumán OBM/sOBM..........monoklonális............antitest fel has z, nőé á sav a 1
A 33. ee 35, példákban szilárd fázisú antitestként kapott, egér OBM-et és egér sOBM-et felismerő antl-humán OBM/sOBM monoklonális antitest (B-OBM 8), valamint a 28. példában, kapott antí-egér OBM/sOBM poliklonális antitest, mint enzimjeiéit antitest felhasználásával készítettünk szendvics Eh!SA-t, Az egér OBM-et, illetve egér sOBM-et az első reakoiopuffezrei hígítottuk, hogy a 35, példában lei makkal .megegyező módon különböző koncentrációjú elegyeket kapjunk és ezt követően a 36. példában leírt eljárás szerint megmértük az söBM-et, Az eredmények a 28, ábrán láthatók. Eredményként azt találtuk, hogy sz egér OBM ás egér sOBM ugyanúgy mérhető a H-OBM 9 felhasználásával, amely a találmány szerinti egér OBM-et és egér söBM-et felismerő antl-humán OBM/sOBM monoklonális antitest. Mint ahogy azt a 35, példa eredménye mutatja, ez a. H-OBM 9 antl-humán OBM/.sOBM mono klónál is antitest az egér sOBM felé nagy áisszocláciős konstanssal rendelkezik, áraz az egér sOBM felé Ősszehasonlíthatöan alacsony az affinitása. Ezen EL1HA assay érzékenysége az egér OBM (molekulatömeg? körülbelül 40 kDa) és egér sOBM mm ''uln zömén ? Vtulbelu. 33 \Dsm merően \o_ körülbelül z 13 ' otml ti p t r ?lbol \ ??u 0 ' v ?' dk o \ ' na r, egér sOBM-re) volt.
137 áz antitest.........
aktivitása
Ismeretes, hogy az osteoclast szere sejtek (OCL) egér Iépsejtok és ST2 sejtek (egér csontvelőből származó sztrömális sejtek, Bndocrinoiogy, 125, 1805-1813 (1988)) együ1t no vesztéséve1 iaduké1hatők. A koku1tura zenészerhez történő hozzáadása során tanulmányoztuk az ant.l-OBM/sOBM antitest CCL képződést gátlő képességét. Mivel az egér OBM ebben a kokuitűra rendszerben expresszáiődik, ebben a példában antitestekként olyan nyúl anti-egér OBM/söBM poliklonális antitestet használtunk, amely felismeri az egér OBM-et, valamint olyan anti-humán OBM/sOBM monoklonáiis antitestet (h-OBM 9) használtunk, amely mind a humán OBM, mind az egér OEM antigéneket felismeri, Egy Oá-iyukű lemez (Menő) minden lyukába 10% ECS-t tartalmazó a-MBM-mel sorozatosa?, hígított anti-OBM antitestből lyukanként 700 pl-t adtunk, továbbá minden lyukhoz adtunk a fent leirt tápközegben szuazpendált kim egér splenocitát (2 x ICC/mi) 350 pl/lyuk mennyiségben. Ezt követően 4 x lö'5 M Β^-νΙ támlát és 4 x 10'' M dexametazont tártál ma ző fent említett tenyésztápközegben tripszinizált és szuazpendált ST2 sejteket (8 x 10' aejt/ml) adtunk 350 μΐ/lynk mennyiségben minden lyukhoz, majd ezután hat napon keresztül 3700-οη növesztettük őket. Mintán a lemezeket egyszer PBS-sel mostuk, mindegyik lyukban fixáltuk a sejteket etanol és aceton (50:50) elegyével. egy érán át szobahőmérsékleten. A lemezeket levegőn megszorítóttűk és mindegyik lyukhoz 500 pl szubsztrát oldatot adtunk a rsukoeyte Aoid Phosphats.se kit (Slgma Co.) útmutatója szerint, majd 55 percen át 37*C-on ínkubáltuk. Csak a borkősav rezisztens sav foszfatáz aktivitást (TBAF aktivitás) mutató sejteket festettük ezzel a reakcibval.
138 amely aktivitás az osteoclastok specifikus jellemzője, A lemezeket egyszer mostok desztillált vízzel# levegős megszorítottak és megszámoltuk a TFAB-pozltiv sejteket. Az eredmények a 4, táblázatban láthatók. Mint az a 4. táblázatban látható# mind a nyűi anti-egér OBM/aOBM pollklonális antitest# mind az egér OBM-et felismerő H-OBM 9 anti-bumán OBM/sOBM monoklonális antitest dőzisfüggö módon gátolta az OCL képződést, ügy találtuk# hegy ezen antitestek osteociastogenesist gátló aktivitással r e n de 1 ke ζ n e k # mi r, t a z OCIF / 0 F G o s t e ο o 1 a s t o g e n e s i s t g á 11 ö faktor és Így Ígéretes terápiás ágensek csont-metabolizmns rendellenességi szimotómák kezeléséhez.
4, Táblázat
Antitest mennyisege (μα/ml) A TPAF-pozfelv múltinuk.1 eátumok száma
Nyúl anti-egér OBM/sOBM po1i kionáIis antitest Egér anti-bumán OBM/sOBM monok!oná11s antitest. sH-OBM 9)
0 11.55153 1050r45
10 510124 550125
100 10±3 15±4
(Átlag ± szórás# n-3)
A Trz-OBM humán osteocj.ast képződést 1nduká1ó aktivitása
Egészséges felnőttek vénájából gyűjtött teljes vérből állítottunk elő egymagvű. sejteket sűrűséggradienssel Bistopague (Sigma Co.) felhasználásával az ehhez mellékelt használati útmutató szerint. Az egymagva sejteket 1#3 x löVml sejtsűruseggel 10~? M dexametazont# 200 ng/m.l makrofág kolónia stimuláló faktort (The Green Cross
138
Corp.), 10% magzati borjuszérumot és a 15. példában kapott tisztított Trx-OBM-et (0--100 ng/ml} tartalmazó a-MEM-ben sznszpendaltuk. A sejtszuszpenziőt agy 48-l.ynkö lemez ' ' -a ; \ ' . o n . u ' , \ ' U o ' ' a sejteket 37oC-on három napon át növesztettük. Miután a táptalajt a fent említett tenyésztápközeggel kicseréltük, a sejteket négy napon keresztül 37°C~on növesztettük, A borkcsav rezisztsns sav foszfatáz aktivitással (TRAB aktivitás} rendelkező igy növesztett sejteket szelektíven festettük az 5. példában leírt eljárás szerint. A megfestett multinukleátuxeok számát mikroszkópos megfigyeléssel határoztuk meg. Az eredmények a 29. ábrán láthatók, Megállapítottuk, hogy a TRAP-pozitiv moltínukleátumok dőzisfüggő módon indukálódtak a Trx-OBM hozzáadása által, síig nem figyeltünk meg TRAP-pozitiv sejteket azokban a lyukakban, amelyekhez nem adtunk TrxOBM-et. Továbbá azt találtuk, hogy ezen TRAP-pozitiv múltinukTeát tanok pozitívak a vitronektin receptorra, amely az osteoclastok egy jellemzője. Ezenfelül amikor egy 4 8lyukú lemez mindegyik lyukában ugyanilyen sejtndvesztést végeztünk elefántosont darabkákon, gödörképződést figyeltünk meg csak a Trx-OBM jelenlétében az elefántcsont darabkákon. Ezen felismerések alapján a Trx-OBM humán osteociast képződést indukáld aktivitással rendelkezik.
Caont-reezorpclés aktivitás gátlása ant.l-OBM/sOSM antitest s e g i t s e g e v e 1
A terhesség 15. napján sxubkntán módon injektáltunk ddi egérbe (Jepen SI.C Co.} [”;Ca]~CaCl2 oldatot (Amershem
140
Co.) egerenként 25 pCÍ dózisban, hegy a magzat csontját ‘$ÍSCa-va.l jelöljük. A következő napon leöltük az egeret, hogy megkapjuk a ,, u, t - n <- \ -u ,V' és eltávolítottak a bőrt és izmot, hogy megkapjuk a hosszú csontokat, Eltávolítottnk a porcot, hogy megkapjuk a hosszú osontok szárát, A hosszú osontok szárát egy 24~ lyukas lemez minden lyukában egyenként áztattuk 0,5 ml, 0,2% marha szórurnaXbumint (Sigma Co,) tartalmazó tenyész tápközegben (SGJb tápközeg, Glbco BEL Co·,) és 24 órán keresztül 37°C-on 5% CO2~ban növesztettük. Az előnövesztés után a csontokat különböző friss tenyésztápközegekbe (0,5 ml) vittük át, amelyek mindegyike a különböző osont-reezorpciöe faktorok (Ds~vitamin, S2~ prés z t ag 1 andínők, pa r a t hy r o .1 d hormon, 1 n t e x ieukin 1 α) egyikét tartalmazta, valamint normái nyűi XgC-t (100 pg/mi; kontrollként) vagy a 23. példában előállított nyúl ,νύ -ο tz sPPM vol' \ ν' - ia ü ΐ < ··* >© , ' a ) v ' n s ' keresztül tovább növesztettük őket. A növesztés után a hosszú csontokat 0,5 mi 5% trikiőr-ecetsav (Wako Bűre Chemicals Co., Ltd.) vizes oldatába helyeztük és szobahőmérsékleten több, mint három érán keresztül állni hagytuk, hegy kaleinrsmentesIbsük Őket, A táptalajhoz és a trikiór-ecetsavas oldat eztraktumához (mindegyik 0,5 mi) 5 ml szclntíllátcrt (Aguasoi-2, Facsard Co.) adtunk, hogy megszórjuk a 4oCa radioaktivitását, amiből kiszámítottuk a csost-reazorpeiö által a , u , A c\o a ' ' ο ά üac .
MCa arányát. Az eredmények a 30-33, ábrákon láthatók. Eredményként azt találtuk, hogy a Ds-vitam.in (luá M) növeli a csont-reszorpciös aktivitást, de a nyúl antlGBM/ sOBM pol 1 k 1 oná 1 i s an t i te e t koncén t r á c 1. ő függő módon elnyomta a D.2-vitamin által stimulált ceont-reszorpciőt és teljesen gátolta a megnövekedett osont-reszorpoiőt 100 pg/ml koncentráció esetén (30.
ábra)
A.z Bs prosztaglendinok (10'” M) és a parathyroid hormon (1Ö0 ng/mi) szintén növelték a csont™reszorpcios aktivitást. Bér 100 ng/ml nyúl anti™OBM/sOBM poiiklonális antitest hozzáadása csaknem teljesen gátolta az Sb™prosztaglandinok és a patathyroid hormon által stimulált csont-reszorpciot (31, és 32, ábra) ,: Másrészről a pozitív kontroliként használt normál nyűi IgG (100 pg/ml) nem befolyásolta az Br~prosztsgianbinok és a parathyroid hormon által indukált csont-reszorpolós aktivitást. Az interieukin la (10 ng/ml) szintén, növelte a osont-roszorpoiét, de a nyűi anti™ OBM/aOBM poiiklonális antitest (100 pg/ml) hozzáadása szignifikánnan gátolta (33. ábra), őzen eredmények alapján világos, tőgy a jelen találmány szerinti antitest csont™ reszorpeiös inhibitorkánt elnőrendö anyag. A h-OBM 9 egér anti-hisaán OBM/sOBM antitest felhasználásával végzett hasonló kísérletből kapott eredmények megerősítették, hogy ez az antitest a nyál antl™OBM/sOBM pcliklonáiis antitesttel oaaknem megegyező osont™reszo.rpciét gátié hatást mutat.
ipari alkalmazhatéság
A jelen találmány az osteoclastogenesis inhlbioios faktorhoz (OC1B) specifikusan kötődő áj fehérjét, a fehérje előállítására szolgáié eljárást, e fehérje felhasználásával ezen fehérje enpressziőját szabályozd anyag szűrésére szolgáló eljárást, olyan anyag szűrősére szolgáié eljárást, amely gátolja vagy modulálja ezen. fehérje aktivitását, olyan receptor szűrésére szolgáld eljárást, amely ezen fehérje aktivitását hozzákőtcdése által közvetíti, ezen szűrési eljárások segítségévei kapott anyagot tartalmazó gyógyszerészeti kész Ϊ tményt,
142 antitestet ette a fehérjére és az antitest * ' .2^! x esont-metabolizmus rendelienességének ke telesére szolgáló ágenst sroigáitat..
Továbbá a jelen találmány az osteociastogenesis inhibiciós faktorhoz (OCIF) kötődé űj fehérjét (OCIF-kÖtő molekala) kódoló DNS-t# a DNS által kódolt aminosav szekvenciával rendelkezd fehérjét, a DNS felhasználásával génmanipulációs technikák segitségével az OCXF-hoz specifikusan kötődő fehérje előállítására szolgáló eljárást és osont-métábólizmus aoataetasia kezelésére szolgáid, a fehérjét tartalmazó ágenst szolgáltat, Ezentúl a találmány az öCIF-kőtő molekula ezpreeszlőjat szabályozó anyag szűrésére szolgáld eljárást, az OCXF-kotő molekulához való hozzákötődése által az aktivitását gátió vagy moduláló anyag szűrésére szolgáld eljárást, olyan receptor szűrésére szolgáld eljárást, amely az OCXE-kötő molekula aktivitását hozzákdtödéss által közvetíti, és ezen szűrési eljárások segitségével kapott anyagot
A jelen találmány továbbá az osteociaatogenesis inhibiciós faktorhoz, az OClF-hoz kdtddnl képes űj humán fehérjét (humán OCIF-kötő molekula, humán OBM) kohold DNSt, & DNS által, ködeit aminosav sorrendet tartalmazd fehérjét, egy olyan fehérje génmanipuláeiős technikák segitségével történő előállítására szolgáló eljárást, amely az OCIF-hoz való specifikus kötődés jellemzőivel es az osteociast differenoiácidt és érést segítő és előmozdító biológiai aktivitást mutató jellemzőkkel rendelkezik és a fehérje felhasználásával a esentmetabolizmus rendellenességének kezelésére szolgáló ágenst szolgáltat. Ezenfelül a találmány OCIF-kötő molekula, eupresszlőjét szabályozó anyag szűrésére szolgáló .143 eljárást, ez OCIFkötő molekula aktivitását hozzákötődésével gátló vagy moduláló anyag szűrésére szolgáló eljárást, olyan receptor szűrésére szolgáié eljárást, amely az OClF™kötö molekula biológiai aktivitását hozzákótődése által, közvetíti, ezen szűrési eljárások segítségévei kapott anyagot tartalmazó gyógyszerészeti készítményt, antitestet a humán OCXF-kötő fehérjére és az antitest felhasználáséval csontmetabolismns rendexlenesaégi szitántornak megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáié ágenst szolgáltat.
Továbbá a jelen találmány olyan antitesteket szolgáltat, amelyek mindkét antigént felismerik {antiOBM/sOBM antitestek), az egyik egy olyan memforánkötött fehérje, amely specifikusan kötődik ez OCIF-hoz (OCIF-kötö molekulát OBM) és a másik egy olyan oldható OBM (sÖBM), amely nem rendelkezik memhránkötő régióval, szolgáltat az antigén előállítására szolgáié eljárást, ezen antigének felhasználásával, az OBM és sOBb mérésére szolgáló eljárást éa az antitestet, mint hatékony komponenst felhasználva a osont-metabolizmus rendexlenesaégi szlmptomák megelőzésére és/vagy kezelésére szolgáló ágenst,
A jelen találmány szerinti eljárással készített fehérje és antitest gyógyszerekként és/vagy reagensekként hasznos kutatási és kísérleti célokra,
144 lyyétbe helyggfett..lA9)g£tfÍfao (1) A letéti szervezet neve és elme, amelyhez a mikroorganizmust letétbe helyeztük:
Agenoy of Induetrial Science and Technology 1-3, higashi 1--Chome, Tenknha-ahi, X ba ráki™ ken, Japán (postai írányitészém: 305)
A letéti szervezethez történt letétbe helyezés dátuma:
1997, májún 23.
A tetét.1 azám:
FARM BP-59Ö3 (2) A letéti szervezet neve és elme, amelyhez a mikroorganizmust letétbe helyeztük:
Agenoy of Xndustrial Science and Technology 1-3, Figashi l™Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán (postai irányifőszám: 305)
A letéti szervezethez történt letétbe helyezés dátuma:
19971 augusztus 131 A letéti szám:
FARM BP-6ÖS8 (3) A letéti szervezet neve és elme, amelyhez a mi kroorganizmust let étbe helyeztük:
Agenoy of Induetrial Science and Technology 1-3, Rigashi l™Chome, Téuknha™ahl, Ibaraki-ken, Japán. (poéta! irányítászám: 305)
A letéti szervezethez történt letétbe helyezés dátuma:
13971 november 5« (Eredeti letéti időpont)
A letéti szám:
FARM B3-F2Ő4 (4) A letéti szervezet neve és óimé, amelyhez mikroorganizmust letétbe helyeztük;
Ageucy of Industrísl Science and Technology 1-3, Higashi 1-Chome, Tsnkoha-shi, Ibaraki-ken., Japán {postai irányitőszám; 305)
A letéti szervezethez történt letétbe helyezés dátuma;
1997χ november 5. (Eredeti letéti időpont;
A leteti ezárna FARM BP-5265
A letéti szervezet neve és elme, amelyhez a mikroorganizsuiet letétbe helyeztük;
Agency of Indosfcrial Science and Technology 1-3, Rigaahí 1-Chome, Tsukuba-nhi, Ibaraki-ken, Japán (postai irányitészám; 305)
A letéti szervezethez történt letétbe helyezés dátuma;
1997. november 5. (Eredeti letéti időpont)
A letéti szán;;
EBEM BE™6266 ϊΑχχ z v e a o aa χ íjs sszs;; :: 1 · a Szer ve a ©a> bee e zz r 7? Ab 1 χ' az a a zen az. z. zz aziezz : xx Zz© x XX X X : '' az a z Z a g a x z az z « az z-Z a
Se A zazzZa á z. a a ex ·; Íz zárj z a z a a ex zz zx $
Azt az A A.rg Aza Ser Art Asz· Tar SÍ a Sas· Tyz Szz Azg Ser Ser
z e IS b
Sza Siz B a r öv Ser ara Jz'Z Slz >1 ars· Híz eb SSa Paz Sza
la az <ysS SS
ajz ars Alá sza Ser AZa ara ab ázz ASZ pz a A a z ZZS .Ab Alá
•ÓC. b’b b b AS
Sza ázz xzZ »1: fix ázz Z.: x ÁZZ ázz br Y .. VK SIS SS.Z L$U 51a eb
az SS eb
bz bl Cw Sár be Alá ázz PSs asz. A· sz Ars Ab Sas azt
Se SS b
Az? ázz Asz azg be Sár Sza A'ZZ szz Bz HAS Sas PZZ tar Ara
aa .·,.· \.· SS
be Szz a v A-A >; tea z 1 e Sir Asz Alá Stz S Λ Sl Asz Sár Tar Lee
az BS 105
·> > V
V > * « χ * * * ¢, «. X «« X » « φ < Λ >< <. X ΑΑ
'! 4Ó-
Ο·// rser hit Atl r TlrBer ••leve ,.v á '...' i: légi Ser GB Arg( lég- Bt (ILts : Siá
Alig Π :: 7 e- :: reáliái ee :i:: 1 dg
:<·: Ad.·
((AB p(eAá((G(Lá eíG AB BI G La : BliiLLá Lee GiBiÜIb igüü (Aái Gig
ige .·, BB ....... 185
(Stá GB Arg (FB Ser eig Alá Be AB lá t BeLeLá (GB ser Λ· Λ : i re
AB r :: el (Be
Lsu Ást Gál Aid 61A Ári GB' Lgs Be (GG e A lá GB Lee Be (Alá
; re < 1 (lAÜ Arit :: 165
ΒΒ Ser Ahr ara Arii Alá Alá Ser Be (ere Ser G B Ser Is L gá ;
lü ,L. ISA
Bi Sár ün Ser Ser Trg ______ ért Be Get Are Ság' (Tre AlB Lgs I le
Be (Be ( ? Be
Ser Ase Met Üli Lee Ser Aee Gag ege Lee Art BA Be alá Aág
AGG 2 Le DAL (
Bg B:e Tgr egr Lee Bt AB Ara Be Cge 8 Le Arg Lis H is GB
215 BB l i i :: . . ( tne
w Ser llg Ser Sál rrs GB Aep igr Lee Gén Lee lei Vei Tgr
BABA AGA . :' B 4 :S
όν<.·η B v Aütü
BA: va) Lgs Tiit Ser ele Lee (LLs Fr a Sár Ser les lse Les Sál
B ISO átá
Lgs SIg alt Ser Bar L es Aáá Gr A Ser Bg Α» Ser GB ele 1B
2SG Be Be
SSe tgr Ser 1B áeá Iái SG y ( Gi,g üie Be Agg Les Ana Alá Gig
··»:»· < V : ::ia ágii eer
χ * χ φ χ χ <
* <
ki el a ült olo: Bet 1 1 a SÍ e 7 a 1' Bar 'Jva Rt a Bet Bak' Bea ásy S r o 'BaB ISIS B)B ' SÍ11 BanBB G1 j :e::íBoBBiss la·· B B''B BsaBl iát Sla Asy 11a Tar :·Τοο1θοοΒθθ' Sla Fis IzaBzolBeio·· ia 1 le v 1 a· a z a a vésa a s a o az száz: a azazveazz& lazzz«: IBIS 7 ' ez sáv® a aOs. lázz.®®; nzfea a ás á s a 1 aazás áe-zsl agá® eán ozez- ás áslzGazls áázass® a®®® zsáii-zsz áaaáaz'ssászí
aalsszSS s ΟΤοΤΟΑΙΧΟ sOCGGGGGGG sOsBGGBslG esssssAsso TszTGsBsBS se
i s as iáSeiSí ábesssseae ásássBsBe eeeasoaess SssGsBaasT OCGGGCCCCS 10
sssoa ikáka SSSááSS:a:SS sAieáAGGTG sssaSsleaS aosÁGATGGG 100
OAsssSGGGG GGBSGáGGAs AGOAGSeGSz seBGBABBBB GGGGBSasle CÁCCssCTB! BOG
eesssssssa ssseossss z BSBSBTBsár s z® ásssess ClsClsWO isGatBásss 101
SBáSfíáGsTB sesAseálGe STOGSTTsGT GTASzossá GCBlAGABBs iáGöaasás u·' l-'V
át i ássázáa GAoAsslGáO BBTaGTtáB TBSÁntesáG· áBassBsáás AiasessAse ;Λ,·,
TlsOaGGAG i asas la ss Más; saasa BAoaCláCG! sast ss sasa GGAssiTGáA «
AGAAeaGáH SASGGGGBGS Tssállsss ΑΒζΟΟΑΑΙΑζ ATTsTSGGGO· saBáGGGGTT BŐS
szsaszSái® GGAGOlálGa áOGaAGGtls A1SSZ i SSá; S Sáááá.áZá SAGGGAAssO 000
OjS? ű ιιιββββ- ιβββ®
BBBBB BTII'ff iBllBCSk tlSBBsB· BB«®7 ClOft BBffiBB ŐBÖAM GSOIŰB áBTBBB ttilf 1KBÍO BB71BB CMOTűü-' ΜΟΒ COBŰBŰ B272T67BlBCBiBei BkBBGB BBBBSB »11« BBWBB MBSBB BBSeGB WiOi lű SB MBBBB BBBOB' W1MBBÍ ΙΒΒΒΒΤ BBBBB ««111 BBBá» KllOT B2k®gB SS®» TöBBBB 1BBBB87 áB77«K W7BBSB ©«BOB 1»<1 áBBB» BBBBB «BIBB áffilö BBWBB OBBOBkBBWBs g«B ©BBBffi BÍBGBO IBWBIB BSsBBB BBBB'B Iffiiil 262ΪΒΒΒ < f KIS iiffi® 1WS1 BBBBB BBBB1B BBW 6BBGBB Í«SS BBBO7W B6BBSB TsBWBGB litóll B6BOBS BBWB©
2BBB7B MffiSSB ©BBBB WBBBff ΟΜΠΜΒ BBBBB BIOSBB SBBBBs TBsBBB BB7B7B BOB BTWBBá BOBBÁ MBOiBl BBBBlr IBfiá» ;
2©
728
7©
18© ;B®
1«
BB
12©
B©
B©
IBS
©Bwwh ssbB® s k '
s s svSíic zs 2'isesms::. 81
ásBavsssB: 11süss ΐ π uk1B ssa s
B gs lógás : kis sár Is 1
lfel.sksds 1 Írass : agrár sBás l
Ssskssns-la::
ZssInt s 2 B&s 0137
kyaou.kaSwe^S' s.
8K»ZSS:o/·
Msükké > Ik / i1. o o se : n ak is coca v
AAACGCAAAA
Szék 0:1.0 S vak vwova S ne kvene-la >i, 0 ZS .;. 0 ke kelő van·: IöMMö/ ( )
Molekula típusa..: egyéb nukleinsav /szintetikus DNS/ Szekvencia;
kciaiu-SrC.nana v·.·· ..'οό.?
Szekvencia scyonane; S ezekvénéin nennka ; le a k v
Szekvencia tanúsa: oulieiáenv 1 szalu lopokcgia:lineáris ke.knknka típusa: egyéb znülainsy v /kziinzevikns esi/ y y.y η y a a c c a a
CAGCWkACAk
SVVkS.VC
S z ek'v vn c ve S z ek véne l a Svekvenniv kSkkikkiOa./ c hvkznay ek 1ipunn: n uk1aináne eke. ke : ( ka no le g'iu I l i n?epy 1 v
Molekula 111 leve ' e-gfék-uikl.einsév /Mzln'feliiie' IMII elek vs>neié'1 :
Viliiül 71A17ÍC1C1 IC 21
Sieivsneia sorszáma: 7
Székveroia hossss; 21 eek vsán is 1 ipnsa ;: nukle insav síéin 1 / - 1 iofs(ieglé:.p 1 inkáira· 1 7 1 (
Mirskiia llpéséa epféb e-uklelnnél laaiiieiikéi MISI ls e k ves e lse k ' : ' ·ΐη.:1\1Ί. ’... l éÁ' :.Ί U <..
mse i ven e ra a e r e anman f Sínkvéneié lisaise: 27 S e ok ve ne is 71 p isa ; n uk Is i ns s< v 1 asllae l ' 7 >
Te se 1 léié s ! in sár 1 se '
More isis len s: rgvas inkleinssv /szinieiikes ufSZ mis ne r a <
lllCSllSle 1111111177 AA1U1G
SLnfekvénsia a ere el más s Imekveeela keisis/r 27 <.<. A « X
S fc * φ > <· *
fez sfe. ve az la fe i azsz ;r r p.a V fe a ip se a fefe : fe fe .szá'ia feiraa :: :: fe feji:: yfe: :: Λ fez (ferfe-fe ::rfe-fe r .:: 4 gfefeferfe
Topológia;1fegaárfea
Moizfeu fea fe fe;paaa ;: agy fe fe aokfes isaa'z fe zz la bais.k zs' rfefefeg Szekvencia:
AfedifefeiiiiAC iGfeUCiiACi fe o fezekfeso la aorszaros : '. izekvenais. hasasa: 33 a fen i i szaza szklefesse v szála i s a fe z. sz la-: 1 ia aás is
Molekula laposa: eyysb aakiefeasav
Pzfeaieis. kas sás/'
Szel fes sefea;
..... ί::.·:-.Λ-·'... *.·.’ Ί fe .;' fe:.... ..'ίο z a 1 ve c fe a assz záros: fel fezekvazais hossza : 317 feyskvzssie ii sasa: sagaosav fe
S:ZS...t.O<
To zoli yfea: 1ipa ás is
Balek a ia 1 i aasz : rhshe rfe y a fezskvaacfea :
*·*«*♦ $ » * < <· Φ
&Β Art Árt Air Ser Bl : lArg Ate Ser Sít Ars Brr IIB - B let Arg‘ Sly Ser 15 Bit
érit Afe t fi / Sly Sly Art Sir Bar Art BAB Sít Sly ?rt let Hit Alt
All SS r 1 tSS : Bl' A SS II
Sre Bmr: Arö Ft el Alt ere lile Sík Art Art Bit Bit Ser' Arg'-Ser fel
SS SS 15
Ate Sá l Als A, öl let sly let Sly let t sy Sla lel Bei Ity s Bér ráír
SS 1 ' N :B'B «..··<.·' 60
Ab lö t Akt Akt Syr Bit Ary Alt Sík fel Art Art Aea Arg - Be Ser
® SS ·*?··:: SS
Sím Ary SSs Ser -HB Gye i V fyr Are Be Let Ate Sat art Sít Art
SS ep 05
ára Aep Ake S í t Aep 'Brr Brr lóit Sí t Ser ti a Att lka Aye let- Be
ISA 165 Bit
Sö At-t Ser 6yr Art Arg 1 le Syr Sir Alt Brr Gin Sly Alt Vti sir
115 1» let
Gye Sít let Sl.a irt Bt W Sly Ser Sít il i s Be A.rg Alt Sít Ars
ISA let BB
Art Sri: öl tep< Sly Ser ere Lee Aep let A It Sye Ars Ser Art let
1« ·: y*’ ?\ ISS lse
Sít A la Sir Art Aké * zz Alt al t let Brr i 1 e Art Bt lat Art Be Art
Ser Sly Ser ire Sy r Aki Ser Aeer Ser Ser Irt A t S? Art Hi t Ar t Aty aiy
1® itt ÁSS
> φ * m < φ
V ΦΦ λ Φ Φ •V '· Φ
aki JTa ©lea Bee ©BSkB rlföT Sala eke Ser ess © aa : Lka Lee Be 'Var
Bán szae sss
isS.íi S-'s is ©Be Be eke BBe Sir Les Tar Ba íBsBa ilia OOar B e a Sa a
© j-LOBi BI a ©:BBO;
SBi Be: Bee Ser B.a ÁS'P Se a Be 'BP' 3 i a eve Lee Ba Les kei Bi
225 23 © ©©te ©2Bi
<s a ka s Be .Ba The Ser Be Be Be Pro Ser See Brr lka Lee Met
20 250'' ©3.0
eve as v SB Ser aar saa ; - Be Ser GO Ase Ser See? eke Sj. s eke
2 Se ©Se 223
ele Bea Be Be Vei Be ©B eke eke kW Lee Ari Ser Be Sas Be
BOB ... < v.·· 23© 535'
sla Or Be Be Vei Ser lse eea See Lee Lee lse ko Áss- Sla- .Aa©
239 235 230
3& Be Be eae Bb B a eh© ©as reá Ara Be Bp Ιο©
Bek au©© la :.ϊ> Ζ © ?'ί ν ©<' ,3© ©S3 Sí © V Sí S S.· 3. Sí .;. Sí Si3 .í. Sí eorszássas 13 kosazs; BB t i ip se® ; ask 1 B. a a a a le aaIa<1aa 1l a ©2 ria
Mai a a elás áieaaa:: ©úfk sül k ipa ess Osakva así ia s
S* > Λ,.** !4,
.. .. Μ ί; 999999; Μ; 9,999990099 2 999 29 ZZAB 9 49229 229; 999 99.-2 22Β92Ά A (iA 9 2 AAAA 22 SSAASGSSAG OGSzGAAAAi SASA AAGz W 4 AASS A AGAGG SSGSSGCÜG AAAGSAASAS SAzGASAASS GzfSAGffiTA SSÍGSSTSaGaSSSSÍSSGSSSSGSTGSGSSÍ^ üSSAAAAGfG 2 9 9: 9-299229 9Β9ί2:9222λ99 99 42 ( Ai 9 99 -92942.-22292. 9 292<99,99 9Zp. 9A9BA 9Α'ί'Γ 9 ,
GáüaGGSGA STSAGTGGAlsGSASHSAATt nSAGASSSSSAiGAAAATSSSAGAfSrfSAA^ SACAAAAA’AA sGSAAAAzSAAAAAíAGAAAA) OaAaASSSG ATTGöSIW SÁSSffiAü9 OAGSGCSTTO aAGSSSSWT SSAAAAAAAA fOGAAGAW GTSSü® AAASAAAATS ASAGAAAASA MSSSAWG AGA2S2SSG2 AGSzAAGAAG 2SAAAAA9AS SAGGAAGSO 9«9®SÜ SSoxGSTOA ÜÜMÜlc WAGÖSAG ASÜASGAW WWüGAS saAATAAATS Ϊ9Ϊ99Ϊ9Ϊ99 STACCAW CGGGGTTGGG CA2AG2SAGG GAÁGAAGAST ζΑΓΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAzSAA AGIBASSAG saxssaw aoaaoísta TGGGáaSATS SSOWSAASA- SSSAxSAAAS TAG AGGASSA ASSSAüSAS AGsAAGS AGA AGtAASGGGA SAASAAAASA AAAASAöSAS SAAGAiAASA ASSfASASGA AGSzSASSAA AAAaAGAASC AAOAASWS GSAAAAGAAA OAAAAA'OA ΑΑΤΓΓΑΑΑ'ΪΑ GGASAaAGGT AGGASSA ΤΠ TIAAAGiGAS GGSASSSASA S8GSG2A22 AAGSAGAAGA SGÁAGGOSSG saaagtggaa GGSSSSAGS AÍSSAACAbA ATnAAGAAl SüAAAgiTG SASASSöSS. SASA zö
ISO
A 2 SÓZÁS
ÜSS)
SASA
4.20
ÖGÜ
ÁSS
AGA
SAS
AGG
AGG
SAS
O2A4
OSA
9- Z 9 9 9 2 9,4 9 9.9. 2 2-22 924 242. 9 A A
9Z9zveή999 Ai z z zzz ; A ?
Az azvonz Az 0 A p9.9® 9 : 09.99 A z IS S S '2
A 22 A A. 99
Sz> 9 9 A. A b'Az 9 1 A 952-222.2
SAxlzSzílz 09 Api9 ZZ 9 Z 292 A A 9909. 9 X999 9 AZ Z 999 99 0 A A
G·' Aa io '· ;G'G A « X < « X φ
ΟΑΟΤοο.χχ·0·ΟΤ οϋϋοο.’Ζ z ϊ
Székvénala o ovo zárna x) 1 ay .yyy yyy y χ yy - : .: y) y χ i; χ.
Basa vsa aía hossza ;: yk
Szekvencia 1 szalu i ip ás s : ook io is aa á x a) p x y - y
Topológia; xiaaár is
ho lakaia i i ρ a a a: a gpoi e a ak 1 e χ z aa v ./ a z<xs i oá i( ; az
ázekooko la ;
»á ζ-,οΡΡΧ. ο -.Λ.·,.a. .0X0. ·λΡο.;:·ΟΡΖ.Λ. 0.0.0.0:0..000,..0 Ο'ΧΟΡ a a
Szekvencia sora zárna. ·: 15
Óz ok va k a is. oosrzao pá'T
Százvoooxo i x p ás a ; k a k i s i es s ο-
1 szálé.
Topológia *: χ xkoáxás
áslekola X ipSZO: ΟΡΡΟ hOso-kO:
azokγοοο io.;
ayysyyyyyo χοζροοοζοο ·.· χ :θ.·χοοΜο y 0 000... ΐώ OS : ί, Z vt y 000.0 y y y X 0 000X0
ΙΕΤΧΙοοοο oxolclKoy οΚΒΑοΤ
ΟΧΟΡοχ i yyA OOSXΧ,ΟΟ ΐ 0 y ΐ ί ?.,;,· i 0; ZO
KOáBÖ IMMI OITWW y;áo koeSi fi BMJnaM yy yiiΧΟΧΥΟ 0000ooi 0 ya vSkOOok y s y
ΧΖΟΟΧΟΟΟΟΙ ÓtaΟΟΟοΟΟΖ θΖθΧΡΟ·ΧΟΟ oi ΐ:ΐοο010ΤΤ ÜyyffiCMT ίροίΒοό© ük álSTooiel ISI® áoKTyáe 1W ; XίΟΟΖοοΟΟ οΟόχοΟΟioo ΧίΟΟΡΟΧΟΧί a ZOO όΤοχζοΜΙΙ tSxiióiái xÓikooTTla 344 x <sas yy yy: yyi χΐιχορχ· ya: ooxyeáy ars οζοχίχζχχο χοοίχοοΟχο ·οχοο;χθ a.· a exo ♦ X
VVAGA I ;,· oAo 1 in I na 1 bOA 2 sáv ; tó LOVt- 1icGAlalOo ggogavöoaa. t® agaggo ficü'iíir AeGalGAli GTCACTCTGT oCGGiGGGTA OCAOOATGGA OGÜ'TGGnCGA
AiVAAOOOíyK AAV1 aaUhí i 12x20 AAO A ί 901 Ζ VÖK 1 luGMAü AiGAAAGAiG GoGAAsGoTA GGhAGAvAnT 'ciGGGGAAAA GGAGGAGGAG' AAGGGGAAGf fGGGÜAAGG AAáAACTGA CoGGCAAuG TGAaTTCGAC TGuATTCCA AÁGCTGCGAG CTGGTGAAGA. AAGTAOCAu CAGoTSTChA IAGGaAGAS GSAGGTAGo TGGGOffiAn AAAGuGAGG
LAAnLnililO : 400
TiGGGAiiAA 1 pl»
gaagaggwa AGGÓ
nAAGAouGGj zGGG
SAziGzvSAill : ize
í Z® ,fs.j •·,'ΡΛ
íwovveö < GV;
oGGAhlGGTC Gin
'Jv i · ’v.Ui n Ve
Λ .1 ΙΑ' ' :: Gél
Szekvencia. seeazáaa; 16 Szekvencia hosszas 244 Szekvencia típusés aminosav z. ezaio köze leple; linóAnia le i e k ο 1 a A1 p c na; f e h e .n j e Szekvencia:
Alk. Gin sú Asp Pro Agg Arg lln Ser GG a Asz ser Thr Hl s Cys Fhe .1 5 10 15
Isi Ang tls kék Ing Asn HA s II a fen Aia nit iniGls Asg e® W S Ao ' SG zen oh
Tor l® Prn Asp S® Cos Arc Arc Met Lys Gl «·χ y-x
•φ
1 b Fit Sir Byl Be Fai Sin ily Flipé Ua Fia Fa sia a Fal CB Pro
: FF· Be ο IS rSOri ·
Ira FripPbe •Ser By Fia PB Fia Bt Mer I01B Fli yFSe r e A Lee aa a
55 bBF ma Bel
BF FBI Be Frg Fi? Lya Pre Pia Fia Gin Pre PFe AB Hi s Le a Tar
SS SF Q'F
I IelFsa Fia Fia Ser 11.e Pre Ser By Ser Fis Lya Fai Tar Len Ser
1» BO
Se r Po Tyr Fia Far Fry By By Fia Fia Be Ser Air Mer Br Lee
FIS .120 ΐ χ A
yer F o s GFy Lyr tea Ara W! Asa Gin AB Siy p?> w~ Tyt Lee Ppr
ISO ,< ··.··;·>.·? : F« F
Ft A ÁSS > JF Gye Far Ara Hír líra Bar Tar Ser Oly Ser Vei ara Tar
ΒΟ
100
Bi
Fae Tyr Lee ele tea ISI Mer Bi Tar Fel Vei Be 2? a Brr Ser iie #,y $ B'S Be
Fre Ser Ily Fsa Fae lei Les oly By Ser Tar GB Fsa Tra Ser
11 Se Be BO
By Asa Ser Siar ebe Pia Ple Ser Be Asa Vei őri By Píré ebe
1SS SGe SS
Lye Lee Ao Fia &r ara Be Be Sej Be Ba Fai Ser' Ss ara Ser;
2B e; li a
Lee Lee Ara ere PB; Ss re '- Λ* áí- Bt Tyr Fae By FB Fae apa Fái
SS 2S5 240
φ <·
Gin Aap Σ1 a Aon özeive ó ci& som z ama: 17' v z e κ. v a s c s a a. o a s s a : 2 4 0 ázskveaois típusa: aminosav 1 szála
Topológia.:; iVoaó.rVa Aoio.voata: VópttoA; á'onávjo a ooofe'vonois í '
áll fii L ' Sói .óói Ibi V 1 ÁSÓ b'i 1b Bit ÓVA 10 obi Sly tói bb.. bs- v vö Ab
bt it i vb von bb Los bo Övo Mió Aló ób voo Öli ÓÓÓ óit bit
bt Z bb.
Imi Óla bt VI1 isi bit lm öiOV vb VIA Asp Aov Ö7s Mii Ótó ib
•ib vb AM lo
bijfb·· vbv Öv ö vi ób bb Ibi bb VAS- Sió 1,00 bb Ab Mii 110 tol
Au olt Bei §b. ii 0: bot •ν' 1 iii ób 01 í i Ivs Ála Hb w lói ÁÓO bi Bal Ibi
00 Ά,\ tó Á 0 . iö
apj ipa lót Ól Ó: 17'7 A ll pop Ili loo Ha JAs Sva Mii Mis Ali íaa
bb « bi A
ó ·τη óva alt vb lói 1 V ... bvbb Sí..,..,. : v·: a a a lAi Ö.b lót Ali óit bi M77 Ab Ibi
vb 1« vb
10 V- lói . ó Γ 'b>b Μ Mit· Aso bi 7b .·» vb Ali 177 bő· Mb'vv AAA Isi.
X <
1 15 //-777///3 / fo/Afo fo :: 12G
Tar kis Ser Asa GPy L/s Les fos Vei Asa Gla Ásó Oly 7 y T/r T/r
130 ··· / / i»3/l:77 fo foifo -3/
foss '377 Be ÁSS fo s 7/S LOv 177 /1 i s hi3 ess Tar Per Gly Asa les
14S ISO 155 //fol
kik ifor OTs T/r Les Gin Les Isi Val T/r Val Tar L/s Tar Ser fos
165 fofo 7 1 /135 7
L/S fok 770 Ser ssr fos Tar Les Isi l/s 01/ 01/ Sár Tar L/s T/r
133 135 i 90
Trp Ser Cly Asn Ser Öla Phe fos Fis T/r Sár fos áss Fai Gr/ 01/
: 205 205 /305- //
Pás Pao foyτ les Ara Ssr Öl/ Öle Gin fos Per fos Gfofoai ser Áss
210 215 ars
Pro 'Ser Lee Les Áss Pro Asr sir Ara Alá Tar T/r Pho Oly Alá Pás
SÓT fo<Ofo 230 ess fo-'O<< 240
l/s Va; Ár/ ásó Tla Ásó
245
8:Tekvooo7e aoőszenοί 18 Szekvencia hossza ; 733 Székvessis 1leness neki elvesv ,í. s sa<ο s
Toporogis ; ssnsmo
BTlsksia kiesse: 3SS3 nhhS-koz fo.'iG fo\fo VuH'?; fo·· J/& 3 <· Λ «<··><
«ί® smiM® iiWsiiü 1®«» aora’ni 056806® »
< isSTGsksa Üffiöl TiffiüÖÉ ii aSkai allía kaki; zakkZk O6a8aT6a62· i 06
/ afíea wisüxüi 666666®® a665aa8a6a2®566®GG6^ (8G5G658G6sa 506·
((1BIIW 5®®68aaa »»KT 06«szak WiiSzhiN 058808882) 62®
sztkk.haksa Sk;aΛΗ; z a zOGGaaOG ' Z< ,··: ,p-r-.;v.r ,·-. .·< ; A _< A ··<.·-;. ,.x χ .-> ,?x . .,v v \, ··; .· l· χΛ ®O ΟV v Á \O\0 BO ak8;6szaz8 ®|
ücüíIü? ®owoá 11»? 600500 aazkaakazi 2686666265 666
a58kk8k®a Stkk6hzGkz 65®60zkk6 SSkkkkaikk ssaaOkGGk 8668666866 426
'imcOT üstmüf TiGszOzGG GkOkOOG s6azasskk6 asWlka 428
/ imis ©eiiffiGT GwaiiO 66®ζ®686 256666065 666052662 646
ML Í'tóoá skaakszzks aizzkkkk® 26G56G6566: 6200660 55650062 668-
; a aSZkk.k ÍZ; i i ;;®a Zka : iOikkGGO 086608® 685666θ8ζ 68X25666X6 655
688kk6zGz2 Gz6i ®2ssk zaGGskOkk S8iSZBkaSl kaJ az s azaz 8058886X8 6®
66605606 6a®6: : 3®
3se z ss zz zz s a ráz asm s ü
ozzkszzaiz hossza; •®x <!· --
a ar s ν a na a z a 1 p as z : a aha olasz
s zzzs o
Tas a is g ás.I í z a z z is
Az i s húzz z a pssz ; aO B zwii-hzx·
a s as va a azs ;
.•\ A .·' ;'·; ·' .··>· λ ·’''··'· ·;'· A ·''.··,·-. .•z y w .; .·'? «aőzOs® 00856526 65258858® •v X ® .< A UÜÜŰ 6 X X V Χ·Ό
:.··'.' Ο'Ά.·'<,·\ : .ν .' '. .' ··*>;·>,·\:ζ .··« > TTWaÜZss kaka aa a isa ks8s lakk es 2X6666808 -
X * *sx φ <
> V Φ «ί
X Φ XX Φ
ATACCTGATT CATGTAGGAG AAHAAACAG GCGTTTCAAG GA6GTGTGCA AAÁCCAATM tAAb A' b A íW t í Mí A b AAbA b t Abbb í bAbíb bbAbAbAAAb bb A'bbb bbíb A y bbb AgATSo bbXbA bt bbb bbAAbsb'bAb· bAAbb b b bAA bfb bbAbbbb.A· b bab bbA bt A bAblA AbAAb bbfAbbSAbÁ bΒΙΑΙΑbbb btbBaBaa bbvAffbAbbAllAxü'iblbΚΑΚΑΒΙΑ· Κ'ΒΒία ΚΑΚΙΚΚ' KISAKbo AKAKKK Klb WASf AbAAllAKAB KI KKaIT aKAKA KI bKWA'I A KI KAKACAAt A KAAAtAK Ali AIAKK ΚΑΑΙΑΙΑΙΑ AAKAKAbA AAAltlKAA IKaIAAAAA· KAKKKAí AAAKbiKAb itb bAtAbbb bbíbtbSAbbbb AbbAAbAAtb AAbbAbbbb 1 bAbbbAAJ. bt bbAAbKbAA minKA AAKKAAK AIIAAAAAK AAtKAA KA lAKAlAbKA ÁAAKttAAA ΙΑΚΑΙΑΙΙΑ AKKAKAA AbAKAAKt 1AAKKAAA KKBAKny ·ΓΚΚΚΚαυ ΑΑΑΙΑαΚΑΙ AAAAAKAAíK A b A bb»
Byb aBW
K®A w
dél;
b Ab
KI
AK
A® bbbb
ÓzTlNhi hgyszárm 121300628

Claims (10)

  1. Szahada km igénypon tok.
    5. Monokionális antitest, amely a S'EQ 119 NO:'11 és/vagy SEQ 119 \O:17 aminosav szekvenciából alá; humán OBM tehene felismerésére képes, azzal jellemezve, hogy nevezeti·.monokionális antitest disszoeláclós konstansa a SEQ-ID NOd.7hen mutatott ammosav szekvenciából álló fehérjére 10 íM) és b.O' (Mi közötti es képes az osteoclast képződés Indukcióját gátéira..
  2. 2. Az 1. igénypont szermh antitest, azzal jellemezve, hegy nevezett antitest felismeri a SEQ lis .MOuv aminosav szekvenciából á Hó humán sÖBM. fehérjét, képes gátéira a \ \ e ' w m -. \e m x ' m e w e^ m ?\,e '' (OCO-9 és kénes az osteociast kepz<sóes .indukemjat gátolni.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy nevezett antitest a SBQ Ili hiOdh-ben mutatott aminosav szekvenciából álló tehene biológiai aktivitását semlegesíti, ahol a biológiai aktivitás az osteoclast képződés indukciója vagy csonheszorpcios aktivitás.
    1. Az 1. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy nevezett antitest löt) ng/ml koncentrációban gátolja az osteoclast képződést.
    fe Az k igenvpont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy nevezett andtesi- 10 pg/mi kmu en s rác lóban gátolja az osteoclast képződést.
  4. 6. Az 1. - a. igénypontok bármelyike szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy nevezett antitest igC.
  5. 7. A ő. igénypont szedni; antitest, azzal jellemezve, hogy nevezett antitest IgGl vagy igém.
    fe Az t., 6, és 7. igényponfokbérmelylke szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy
    V \ ' \O X XX 'χ X
  6. 9. Az k és o. · 8. igénypontok bármelyike szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy
    V X ' - xg 'xx x' ' 'x '·'' ' x
  7. 10, Az 1, és 6. -· A igénypontok bármelyike szerinti ami test, azzal jellemezve, hogy nevezet: érni test egy rekombináns humán monokionáiis antitest,
  8. 11, Az 1, - lö. igénypontok bármelyike szerinti antitest,- azzal iellemezvo, hogy nevezett monokionáiis antitest nem ismeri tel a SEQ ID \O:ί-ben mutatott aminosav szekvenciából ábo fehépét és a SEQ iü NO:16-ban mutatott aminosav szekvenciából álló iehénén
  9. 12, Az I. -10. igénypontok bármelyike szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy .nevezett monokionáiis antitest keresztreagá) rád a SEQ ID NO:!-ben mutatott aminosav szekvenciából álló tehenevek minő a SEQ ID NOh 6-ban mutatott aminosav szekvenciából álló .tehénével.
    Iá Gyógyszerészeti kom pozíció, azzal jellemezve.: hogy az 1. -12. igénypontok bármelyike szerinti antitestet tartalmazza.
  10. 14. Az 1. - 12. igénypontok, bármelyike szerinti antitest a kővetkező csoportból választott csontmetabnlizmus rendellenesség kezelésére vagy megelőzésére való alkalmazáshoz:
    (a) osieoporosis;
    tbihypercaleemiay t.y y,y--y,y: ryy,;; yyAvvv· ééázvvéáéélzvzzyzzyééuzzélztvtév (c; Faget-kór:
    I ó) mosás osteoo ystropnia;
    le) krónikus rheumatoid arthritis; és (ti osteoarthritlslá- Antitest a 14, igénypont szerint; alkalmazáshoz, azzal íeilornozve, hogy nevezett antitest a következő csoportból választott specifikus alkalmazásra való:
    la) csontsőröség növelése;
    lb) rsoetreszorpciő gá 1 láss;
    (G osíeodasi képződés gátlása;
    (di osteodast képződés .6'cmkclolanak gátlása; és (e; az osteoclasíogenesis OFM/sOBld gyorsulásának semleges·lese.
HU0800628A 1997-04-15 1998-04-15 Antibodies against obm HU229841B1 (en)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9780897 1997-04-15
JP15143497 1997-06-09
JP21789797 1997-08-12
JP22480397 1997-08-21
JP33224197 1997-12-02
PCT/JP1998/000172 WO1998032871A1 (fr) 1997-01-22 1998-01-19 Procede pour la polymerisation de composes phenoliques ou similaires et utilisation de ce procede

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU0800628D0 HU0800628D0 (en) 2010-06-28
HU229841B1 true HU229841B1 (en) 2014-09-29

Family

ID=27525882

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0000717A HU229476B1 (en) 1997-04-15 1998-04-15 Antibodies against obm
HU0800628A HU229841B1 (en) 1997-04-15 1998-04-15 Antibodies against obm
HUS1400027C HUS1400027I1 (hu) 1997-04-15 2014-05-07 OBM elleni antitestek

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0000717A HU229476B1 (en) 1997-04-15 1998-04-15 Antibodies against obm

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS1400027C HUS1400027I1 (hu) 1997-04-15 2014-05-07 OBM elleni antitestek

Country Status (21)

Country Link
US (7) US7527790B2 (hu)
EP (3) EP1657255B1 (hu)
JP (7) JP3523650B2 (hu)
KR (1) KR100496063B1 (hu)
CN (1) CN1138786C (hu)
AT (1) ATE328006T1 (hu)
AU (1) AU735355B2 (hu)
CA (2) CA2257247C (hu)
CY (1) CY2010017I2 (hu)
DE (2) DE69834699T3 (hu)
DK (1) DK0911342T4 (hu)
ES (1) ES2263204T5 (hu)
FR (1) FR10C0048I2 (hu)
HU (3) HU229476B1 (hu)
IL (1) IL127115A (hu)
LU (1) LU91759I2 (hu)
NO (2) NO322632B1 (hu)
NZ (1) NZ332995A (hu)
PT (1) PT911342E (hu)
RU (1) RU2238949C2 (hu)
WO (1) WO1998046644A1 (hu)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
US20050147611A1 (en) * 1995-12-22 2005-07-07 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
US7632922B1 (en) * 1995-12-22 2009-12-15 Amgen, Inc. Osteoprotegerin
DE69738811D1 (de) 1996-12-13 2008-08-14 Schering Corp Oberflächenantigene aus Säugern
DE69738841D1 (de) 1996-12-23 2008-08-28 Immunex Corp Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
CN1138786C (zh) 1997-04-15 2004-02-18 三共株式会社 识别破骨细胞形成抑制因子结合蛋白的抗体及制备和用途
US5843678A (en) * 1997-04-16 1998-12-01 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins
AU2011202547B2 (en) * 1997-04-16 2014-08-28 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins and receptors
IL132304A0 (en) 1997-04-16 2001-03-19 Amgen Inc Osteoprotegerin binding proteins and receptors
US6316408B1 (en) * 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
EP2009025B1 (en) * 1998-05-14 2011-07-27 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
BR9914834A (pt) 1998-10-28 2001-08-14 Snow Brand Milk Products Co Ltd Agente de tratamento de patobolismo ósseo, e, método para intensificar a atividade de fator inibidor de osteoclastogênese
AUPQ314799A0 (en) * 1999-09-29 1999-10-21 University Of Western Australia, The Bone cell factor
US20030103978A1 (en) * 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
AU3868001A (en) † 2000-02-23 2001-09-03 Amgen Inc Antagonistic selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
MXPA03002443A (es) 2000-09-22 2004-12-06 Immunex Corp Ensayos de clasificacion para agonistas o antagonistas del activador receptor de nf-kb.
WO2002062990A1 (fr) * 2001-02-07 2002-08-15 Sankyo Company, Limited Anticorps et utilisation de cet anticorps
WO2002079256A1 (fr) * 2001-03-26 2002-10-10 Sankyo Company, Limited Anticorps et son utilisation
EP1377610A2 (en) 2001-04-03 2004-01-07 Société des Produits Nestlé S.A. Osteoprotegerin in milk
CA2451955C (en) 2001-06-26 2015-09-29 Abgenix, Inc. Antibodies to opgl
CA2481074A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Amgen Inc. Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors
WO2004052233A2 (en) * 2002-12-10 2004-06-24 Schering-Plough Ltd. Canine rankl and methods for preparing and using the same
US20050009097A1 (en) * 2003-03-31 2005-01-13 Better Marc D. Human engineered antibodies to Ep-CAM
US7318925B2 (en) 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
WO2005016111A2 (en) 2003-08-08 2005-02-24 Abgenix, Inc. Antibodies directed to parathyroid hormone (pth) and uses thereof
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
PT2311873T (pt) 2004-01-07 2018-11-20 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Anticorpo monoclonal específico para m-csf e respetivos usos
TWI359026B (en) * 2004-02-12 2012-03-01 Sankyo Co Pharmaceutical composition for the osteoclast rela
PE20070684A1 (es) 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
DK1991694T3 (da) * 2006-02-13 2016-08-01 Fluidigm Canada Inc Genekspressionsanalyse med grundstoftagget oligonukleotid
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
EP2020445B1 (en) 2006-05-12 2013-01-02 Keio University Detection of inflammatory disease and composition for prevention or treatment of inflammatory disease
WO2008044797A1 (fr) 2006-10-11 2008-04-17 Oriental Yeast Co., Ltd. Animal modèle d'ostéopénie
KR101235439B1 (ko) 2006-10-11 2013-02-20 오리엔탈 이스트 컴파니 리미티드 가용형 ｒａｎｋｌ과 에피토프 태그의 융합 단백질을 포함하는 시약
WO2008044379A1 (fr) 2006-10-11 2008-04-17 Oriental Yeast Co., Ltd. Modèle animal de perte osseuse
CN101772351B (zh) 2007-06-05 2013-01-02 东方酵母工业株式会社 新的骨量增加药
WO2009048072A1 (ja) 2007-10-11 2009-04-16 Daiichi Sankyo Company, Limited 破骨細胞関連蛋白質Ｓｉｇｌｅｃ－１５を標的とした抗体
WO2010053610A2 (en) * 2008-07-30 2010-05-14 Emergent Biosolutions, Inc. Stable anthrax vaccine formulations
US9435811B2 (en) 2008-09-30 2016-09-06 Oriental Yeast Co., Ltd Inducer of chondrocyte proliferation and differentiation
SG174606A1 (en) * 2009-03-30 2011-11-28 Hoffmann La Roche A method for avoiding glass fogging
KR101690340B1 (ko) 2009-04-09 2016-12-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
WO2011017294A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Schering Corporation Human anti-rankl antibodies
EP2434285A1 (en) 2010-09-22 2012-03-28 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Breast cancer diagnostics
EP2433644A1 (en) 2010-09-22 2012-03-28 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Breast cancer therapeutics
EP2625205A2 (en) 2010-10-05 2013-08-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody targeting osteoclast-related protein siglec-15
US20130280260A1 (en) * 2010-10-13 2013-10-24 Tokyo Women's Medical University Osteoclastogenesis inhibitor containing anti-vdac antibody
WO2012133914A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 オリエンタル酵母工業株式会社 Ranklアンタゴニストを含む癌免疫増強剤
KR102100307B1 (ko) 2012-03-21 2020-04-14 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인간 림프 기관-유래 억제성 기질 세포의 분리 및 용도
CA2868959A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Cdr-modified anti-siglec-15 antibody
US9493562B2 (en) 2012-07-19 2016-11-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-Siglec-15 antibodies
CN102788817B (zh) * 2012-08-24 2015-04-08 中煤科工集团重庆研究院有限公司 超低温环境下可燃气体***特性实验研究方法
CA2920376A1 (en) 2013-08-07 2015-02-12 Martin Blomberg JENSEN Methods and composition comprising denosumab or an antibody or antigen binding domain, fragment or derivative thereof, immunoreactive with a rankl/opgbp peptide for use in the treatment, prevention or alleviation of male infertility
US10357559B2 (en) 2013-12-27 2019-07-23 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Temperature stable vaccine formulations
KR101982782B1 (ko) * 2016-09-13 2019-05-28 주식회사 이앤에스헬스케어 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
CN108410990B (zh) * 2018-05-30 2021-07-06 中国医学科学院北京协和医院 Igfbp3在制备诊断i型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用
CN111205354B (zh) * 2020-01-22 2021-01-22 天津科技大学 一种提高异源蛋白分泌量的信号肽突变体及其构建方法与用途
CN111333709B (zh) * 2020-03-17 2023-09-08 吉林大学 旋毛虫肌幼虫期丝氨酸蛋白酶抑制剂的b细胞表位多肽、杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4710457A (en) * 1983-06-29 1987-12-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibody for human hematopoietic glycoproteins and method
US4710473A (en) * 1983-08-10 1987-12-01 Amgen, Inc. DNA plasmids
WO1986000922A1 (en) 1984-07-30 1986-02-13 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral gene transfer vectors
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5846534A (en) * 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
JP2877509B2 (ja) 1989-05-19 1999-03-31 アムジエン・インコーポレーテツド メタロプロテイナーゼ阻害剤
JP3356775B2 (ja) * 1990-11-30 2002-12-16 セルトリックス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ＴＧＦ―βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成タンパク質の使用
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
CA2068389A1 (en) 1991-05-13 1992-11-14 Masahiko Sato Method for inhibiting bone resorption
MX9204303A (es) * 1991-07-23 1993-11-01 Rhone Poulenc Rorer Int Factor regulador del crecimiento de osteoclasto.
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5623053A (en) * 1992-01-10 1997-04-22 California Institute Of Technology Soluble mammal-derived Fc receptor which binds at a pH ranging from about 5.5 to 6.5 and releases at a pH ranging from about 7.5 to 8.5
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
DK0639079T3 (da) 1992-04-30 2000-06-13 Amgen Inc Fremgangsmåder til behandling af interleukin-1- og tumornekrosefaktor-medierede sygdomme
US5585479A (en) * 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA
US5578569A (en) * 1993-03-12 1996-11-26 Tam; Cherk S. Method of increasing bone growth
US5457035A (en) * 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
ES2157991T3 (es) 1993-09-14 2001-09-01 Merck & Co Inc Cadn que codifica una nueva proteina humana, la tirosin-fosfatasa.
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
EP0727211A1 (en) 1995-02-10 1996-08-21 Smithkline Beecham Corporation Use of src SH2 specific compounds to treat a bone resorption disease
IL117175A (en) 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
WO1996028546A1 (en) 1995-03-15 1996-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
US7094564B1 (en) * 1995-03-15 2006-08-22 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
US20030166097A1 (en) * 1995-03-15 2003-09-04 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
WO1997000318A1 (en) 1995-06-07 1997-01-03 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
US5843901A (en) * 1995-06-07 1998-12-01 Advanced Research & Technology Institute LHRH antagonist peptides
WO1997000317A1 (en) 1995-06-07 1997-01-03 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
US6613544B1 (en) * 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US6369027B1 (en) 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5662948A (en) * 1996-01-29 1997-09-02 Chrysler Corporation Adjustable and removable trimline inserts for a molding tool
US6750091B1 (en) * 1996-03-01 2004-06-15 Micron Technology Diode formation method
JPH1057071A (ja) 1996-08-19 1998-03-03 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法
DE69738811D1 (de) * 1996-12-13 2008-08-14 Schering Corp Oberflächenantigene aus Säugern
FR2757507B1 (fr) 1996-12-20 1999-01-29 Inst Francais Du Petrole Procede de separation de paraxylene comprenant une adsorption avec injection d'eau et une cristallisation
EP0951546A2 (en) * 1996-12-20 1999-10-27 The Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use for osteoclast inhibitory factors
US6271349B1 (en) * 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
DE69738841D1 (de) * 1996-12-23 2008-08-28 Immunex Corp Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie
CN1138786C (zh) 1997-04-15 2004-02-18 三共株式会社 识别破骨细胞形成抑制因子结合蛋白的抗体及制备和用途
US5843678A (en) * 1997-04-16 1998-12-01 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins
IL132304A0 (en) * 1997-04-16 2001-03-19 Amgen Inc Osteoprotegerin binding proteins and receptors
US6316408B1 (en) * 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
EP0980432A1 (en) 1997-05-01 2000-02-23 Amgen, Inc. Chimeric opg polypeptides
WO1998054201A1 (en) 1997-05-29 1998-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like protein 8
US6087555A (en) 1997-10-15 2000-07-11 Amgen Inc. Mice lacking expression of osteoprotegerin
US6790823B1 (en) 1998-04-23 2004-09-14 Amgen Inc. Compositions and methods for the prevention and treatment of cardiovascular diseases
EP2009025B1 (en) 1998-05-14 2011-07-27 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
WO2001003719A2 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
KR20010085996A (ko) 1999-09-03 2001-09-07 스티븐 엠. 오드레 암 및 암관련 골손실을 예방 또는 치료하는 조성물 및 방법
US20030144187A1 (en) 1999-09-03 2003-07-31 Colin R. Dunstan Opg fusion protein compositions and methods
US20030103978A1 (en) * 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
CA2451955C (en) * 2001-06-26 2015-09-29 Abgenix, Inc. Antibodies to opgl
CA2481074A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Amgen Inc. Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
JP4230993B2 (ja) 2009-02-25
DE69834699D1 (de) 2006-07-06
DE69834699T2 (de) 2007-05-16
WO1998046644A1 (en) 1998-10-22
JP4355357B2 (ja) 2009-10-28
ES2263204T3 (es) 2006-12-01
NO985848L (no) 1999-02-15
US7192718B2 (en) 2007-03-20
US20080187540A9 (en) 2008-08-07
HU0800628D0 (en) 2010-06-28
ATE328006T1 (de) 2006-06-15
HUP0000717A2 (hu) 2000-06-28
DK0911342T4 (da) 2013-07-29
CY2010017I2 (el) 2012-01-25
CA2257247C (en) 2012-09-11
AU6851898A (en) 1998-11-11
LU91759I2 (fr) 2011-01-24
JP2012041345A (ja) 2012-03-01
US20120329671A1 (en) 2012-12-27
JP5285751B2 (ja) 2013-09-11
CY2010017I1 (el) 2011-02-02
NO2010021I2 (no) 2015-03-09
EP0911342A4 (en) 2002-11-27
EP0911342B1 (en) 2006-05-31
KR100496063B1 (ko) 2005-06-21
CN1138786C (zh) 2004-02-18
PT911342E (pt) 2006-08-31
CA2781623A1 (en) 1998-10-22
IL127115A (en) 2013-08-29
ES2263204T5 (es) 2013-10-14
EP1657255B1 (en) 2014-07-30
US20050208580A1 (en) 2005-09-22
CA2257247A1 (en) 1998-10-22
FR10C0048I2 (fr) 2013-08-16
NZ332995A (en) 2000-07-28
JP3523650B2 (ja) 2004-04-26
US20100136011A1 (en) 2010-06-03
US7527790B2 (en) 2009-05-05
NO2010021I1 (no) 2011-01-10
IL127115A0 (en) 1999-09-22
JP2013139465A (ja) 2013-07-18
JP3935861B2 (ja) 2007-06-27
CN1222917A (zh) 1999-07-14
JP2005176847A (ja) 2005-07-07
JP2004041195A (ja) 2004-02-12
US20050003457A1 (en) 2005-01-06
JP4878616B2 (ja) 2012-02-15
DK0911342T3 (da) 2006-08-21
JP2009029834A (ja) 2009-02-12
NO985848D0 (no) 1998-12-14
EP0911342B2 (en) 2013-05-22
HU229476B1 (en) 2014-01-28
EP2336168A1 (en) 2011-06-22
AU735355B2 (en) 2001-07-05
NO322632B1 (no) 2006-11-06
LU91759I9 (hu) 2019-01-02
US20070009520A1 (en) 2007-01-11
EP0911342A1 (en) 1999-04-28
DE69834699T3 (de) 2013-11-14
AU735355C (en) 1998-11-11
JP5593407B2 (ja) 2014-09-24
JP2009013177A (ja) 2009-01-22
US20030176647A1 (en) 2003-09-18
EP1657255A1 (en) 2006-05-17
RU2238949C2 (ru) 2004-10-27
KR20040004509A (ko) 2004-01-13
US20030208045A1 (en) 2003-11-06
DE122010000049I1 (de) 2011-05-05
FR10C0048I1 (hu) 2011-01-14
US7449185B2 (en) 2008-11-11
HUS1400027I1 (hu) 2016-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229841B1 (en) Antibodies against obm
Ge et al. LEAP2 is an endogenous antagonist of the ghrelin receptor
WO2011053822A2 (en) Notch inhibition in the treatment and prevention of obesity and metabolic syndrome
EP2467491A1 (en) Methods of using cd44 fusion proteins to treat cancer
Nehmé et al. The expression pattern of the Na+ sensor, Nax in the hydromineral homeostatic network: a comparative study between the rat and mouse
CN104011069A (zh) 心力衰竭及相关病症的治疗
US20210113687A1 (en) Methods for treating inflammation
CA2919477A1 (en) Compositions and methods for modulating thermogenesis using pth-related and egf-related molecules
Xu et al. Induction of osteogenesis by bone-targeted Notch activation
CN103228295A (zh) 一种限制急性心肌缺血后微血管损伤的方法
Ko et al. A novel modified RANKL variant can prevent osteoporosis by acting as a vaccine and an inhibitor
US8440185B2 (en) Compositions and methods for the treatment of immunologic disorders
JP4118336B2 (ja) メルトリン
JPWO2007049624A1 (ja) 癌の予防・治療剤
Tarallo et al. A placenta growth factor 2 variant acts as dominant negative of vascular endothelial growth factor A by heterodimerization mechanism
CN113866416A (zh) 可溶形式Tim3在免疫检查点阻断治疗抵抗的应用
WO2015125922A1 (ja) 抗ｒａｎｋｌ抗体
JP2013216635A (ja) Ｔｒｅｍ−１活性阻害剤
US10064915B2 (en) Fusion protein comprising albumin and retinol-binding protein
US20180221442A1 (en) Inhibition of bone loss and inhibition of arthritis by cthrc1
US9701732B2 (en) Fusion protein comprising albumin and retinol-binding protein
de Haan Inflammation in adverse cardiac remodeling: Is there impact to gain?
Kröger The Role of Sensory Neuropeptides during Experimental Hepatitis
WO2010141985A1 (en) Methods of treatment
JP2003052384A (ja) 新規レセプタータンパク質及びそのｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
FA9A Lapse of provisional patent protection due to relinquishment or protection considered relinquished