HU224713B1 - Method for producing recombinant virus - Google Patents
Method for producing recombinant virus Download PDFInfo
- Publication number
- HU224713B1 HU224713B1 HU0001762A HUP0001762A HU224713B1 HU 224713 B1 HU224713 B1 HU 224713B1 HU 0001762 A HU0001762 A HU 0001762A HU P0001762 A HUP0001762 A HU P0001762A HU 224713 B1 HU224713 B1 HU 224713B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- baculovirus
- genome
- cells
- adenovirus
- recombinant
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 83
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 232
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 169
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 165
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 102
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 38
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 33
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 7
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 20
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 11
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 7
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 7
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 6
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 6
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 6
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 6
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 6
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 6
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 6
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 6
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 6
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 6
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 6
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 6
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 6
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 6
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 6
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 6
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 6
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 6
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 6
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 6
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 6
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 6
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 6
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 6
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 6
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 6
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 6
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 6
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 3
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101150047856 Cav2 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010085330 Estradiol Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 2
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710200251 Recombinase cre Proteins 0.000 description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- -1 etc. Proteins 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 2
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066375 35 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108700040077 Baculovirus p10 Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 101710181863 Structural DNA-binding protein p10 Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000010464 virion assembly Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pens And Brushes (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás rekombináns vírusok előállítására. A találmány tárgyát képezik ezenkívül még az eljárás megvalósításához alkalmazott szerkezetek, a termelősejtek és az így termelt vírusok. A vírusok gének in vitro, ex vivő vagy in vivő klónozására és/vagy expressziójára szolgáló vektorokként alkalmazhatók.
Víruseredetű vektorokat széles körben alkalmaznak gének in vitro (rekombináns fehérjék termeléséhez, szűrőtesztek megvalósítására, gének szabályozásának vizsgálatára stb.), ex vivő, vagy in vivő (állatmodellek előállítására vagy terápiás megközelítésekben) klónozásához, átviteléhez és expressziójához. Ezek közül a vírusok közül különösen az adenovírusokat, az adenoasszociált vírusokat (AAV), a retrovírusokat, a herpeszvírusokat vagy a vakcíniavírust említhetjük meg.
Az Adenoviridae család emlősöknél és madaraknál igen elterjedt, és lipidtartalmú burokkal nem rendelkező, kétszálú DNS-vírusok több száz különböző szerotípusát foglalja magában, melyek szimmetrikus ikozaéderes kapsziddal rendelkeznek [Horwitz, in: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology, third edition ed. Philadelphia: Raven Publisher, 2149-2171 (1996)]. Ártalmatlanságukon túl az adenovírusok igen széles körű sejtes tropizmussal rendelkeznek. A retrovírusokkal ellentétben, melyek ciklusa a sejtosztódástól függ, az adenovírusok képesek mind aktív, osztódásban lévő, mind nyugalmi állapotban lévő sejteket fertőzni, és genomjuk episzomális formában fennmarad. Ezenfelül magas titerrel termelhetők (1011 pfu/ml). Ezek a lényeges tulajdonságok előnyös vektorrá teszik az adenovírusokat heterológ gének klónozásához és expresszálásához. A jelenleg alkalmazott vektorok a C típusú adenovírusokból, többek között a 2 és 5 típusú adenovírusokból, valamint a CAV-2 típusú kutyaadenovírusokból származnak, melyek molekuláris biológiája a legjobban ismert.
Az adenovírusok 36 kb lineráis genommal rendelkeznek, amely mindkét végén 103 bp inverz ismétlődő szekvenciával (ITR) végződik, és tartalmaz egy replikációs origót, valamint a bal ITR mellett elhelyezkedő kapszidképződési szignált [Shenk, Adenoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology, Philadelphia: Raven Publisher, 2111-2148 (1996)]. A vírus ciklusa során a gének három családja fejeződik ki:
- A közvetlen korai gének (E1, E2, E3 és E4), melyek a sejtgének szabályozásában vesznek részt, többek között lehetővé teszik, hogy a sejt S fázisba kerüljön (E1A), és meggátolják az apoptózist (E1B). Részt vesznek a korai vagy késői vírusgének szabályozásában is transzkripciós, splicing szinten, vagy a messzendzser RNS transzportja szintjén (E1A, E2A, E4). Szerepet játszanak a replikációban és az immunválasz elkerülésében is.
- A késleltetett korai gének (pIX és IVa2) a késői gének transzkripciójának szabályozásával (IVa2) vagy a virion összeállításával (pIX) kapcsolatosak.
- A késői gének (L1-L5) egy erős promoterből (MLP) íródnak át. Egy 28 kb elsődleges transzkriptum lehetővé teszi a vírusrészecskék összeállításában és érési folyamatában részt vevő különböző szerkezeti (core, penton, hexon) és nem szerkezeti fehérjéknek megfelelő transzkriptumok kialakítását alternatív splicinggal, és az 5 poliadenilációs hely alkalmazásával.
Adenovírusvektorokat alkalmaztak in vitro gének klónozásához és expresszálásához [Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York, 11 724, 187), transzgén állatok kialakítására (WO 95/22616], ex vivő gének átvitelére sejtekbe [WO 95/14785, WO 95/06120] vagy in vivő gének átvitelére sejtekbe [lásd többek között WO 93/19191, WO 94/24297, WO 94/08026],
Ami az adenoasszociált vírusokat (AAV) illeti, viszonylag kisméretű DNS-vírusokról van szó, melyek a fertőzött sejt genomjába stabil és viszonylag helyspecifikus módon beépülnek. Sejtek széles spektrumát képesek fertőzni anélkül, hogy a sejtek növekedésére, morfológiájára vagy differenciálódására hatással lennének. Másrészt úgy tűnik, nem vesznek részt emberi betegségek kialakításában. Az AAV-k genomját klónozták, szekvenálták és jellemezték. Ez körülbelül 4700 bázist tartalmaz, és mindkét végén egy körülbelül 145 bázisos inverz ismétlődő terület (ITR) található, amely a vírus replikációs origójaként szolgál. A genom fennmaradó része két alapvető területre osztható, melyek a részecskeképződésért felelős funkciókat hordozzák: a genom bal része, amely a vírusreplikációban és a virális gének expressziójában szerepet játszó rep gént tartalmazza, és a genom jobb része, amely a vírus-kapszidfehérjéket kódoló cap gént tartalmazza.
Az AAV-eredetű vektorok alkalmazását gének in vitro és in vivő átvitelére az irodalomban már leírták [lásd többek között WO 91/18088, WO 93/09239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528].
Ami a retrovírusokat illeti, ezek integratív, szelektíven az osztódó sejteket fertőző vírusok. Ezek tehát például a rákos vagy resztenózisos alkalmazásokhoz megfelelő vektorok. A retrovírusok genomja alapvetően két LTR-t, egy részecskeképződésért felelős szekvenciát és három kódolóterületet (gag, pol, env) tartalmaz. Rekombináns vektorok kialakítását és in vitro vagy in vivő alkalmazásukat az irodalomban széles körben leírták [lásd többek között Breakfield et al., New Biologist 3, 203 (1991), EP 453 242, EP 178 220, Bernstein et al., Génét. Eng. 7, 235 (1985), McCormick, BioTechnology 3, 689 (1985) stb.].
Rekombináns vektorként való alkalmazásukhoz számos víruseredetű konstrukciót előállítottak, melyek különböző kívánt géneket tartalmaztak. Ezekben a konstrukciókban a vírusgenomot úgy módosították, hogy a vírust képtelenné tegyék a fertőzött sejtben történő autonóm replikációra. így az irodalomban ismertetett konstrukciók olyan vírusok, melyekből genomjuk bizonyos, a replikációhoz elengedhetetlen területe hiányzik. Részletesen az adenovírusokról szólva az első generációs konstrukciók deléciót tartalmaznak az E1 régióban, amely a vírusreplikációhoz szükséges, és erre
HU 224 713 Β1 a területre építették be a heterológ DNS-szekvenciákat [Levrero etal., Gene 101, 195 (1991); Gosh-Choudhury et al., Gene 50, 161 (1986)]. Másrészt a vektorok tulajdonságainak javítására azt javasolták, hogy az adenovírusok genomjában más deléciókat vagy módosításokat is végezzenek. így a ts125 mutánsba bevezettek egy hőmérséklet-érzékeny pontmutációt, amely lehetővé teszi, hogy az E2 területen kódolt 72 kD DNS-kötő fehérjét (DBP) inaktiválják [Van dér Vliet et al. (1975)]. Más vektorok egy másik, a replikációhoz vagy a vírus terjedéséhez elengedhetetlen területen, az E4 régióban tartalmaznak deléciót. Azok az adenovírusvektorok, melyekben az E1 és E4 régió deletált, nagymértékben lecsökkent transzkripciós alapzajjal és a virális gének expressziójának alacsony szintjével rendelkeznek. Ilyen vektorokat írnak le például a WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/22378 számon közzétett bejelentésekben. Másrészt leírtak olyan vektorokat is, melyek a IVa2 gén területén tartalmaznak egy módosítást [WO 96/10088]. Ezenkívül leírták az úgynevezett „minimális adenovírusokat” vagy „pszeudoadenovírusokat” (vagy másként AdÁ) [WO 94/12649, WO 94/28152, WO 95/02697], melyek csak a vírusok termelődéséhez cisz-helyzetben szükséges területeket (ITR és részecskeképződésért felelős szekvenciák) tartalmazzák, és hiányzik belőlük minden kódolószekvencia, bár ezek termelése igen nehéz, amint a következőkben megmagyarázzuk.
Az AAV-kről beszélve a leírt vektorokból általában hiányoznak a Rep és Cap kódolórégiók, melyek a kívánt nukleinsavval vannak helyettesítve.
A retrovíruseredetű rekombináns vektorokban a gag, pol és env gének általában deletáltak, részben vagy egészben, és azokat egy kívánt heterológ nukleinsavszekvencia helyettesíti. Másrészt a rekombináns retrovlrusok tartalmazhatnak módosításokat az LTR-ek területén a transzkripciós aktivitás megszüntetésére, valamint meghosszabbított részecskeképződésért felelős szekvenciákat, melyek a gag gén egy részét is tartalmazzák [Bender et al., J. Virol. 61, 1639 (1987)].
Replikációdefektív tulajdonságukat figyelembe véve a különböző rekombináns vírusok termelése magában foglalja a genomból deletált funkciók transzkomplementálását. A transzkomplementáció pontosan a fő nehézségek kiindulópontja az ilyen vírusok termelése esetében, többek között a transzkomplementáló funkciók biztosítása.
Ebben a tekintetben két megközelítést fejlesztettek ki. Az első transzkomplementáló sejtvonalak kialakításán alapul, melyeket részecskeképző sejtvonalaknak neveznek. A második helper adenovírusok vagy helper plazmidok alkalmazásán alapul.
Különböző részecskeképződésért felelős sejtvonalakat alakítottak ki hiányos vírusok számára. Ezek a sejtvonalak képesek a virális vektorból hiányzó funkciókat biztosítani. Általában az ilyen sejtvonalak genomjukba integrált módon tartalmazzák a virális genomból deletált területet vagy területeket (E1, E2 és/vagy E4 például adenovírus esetében, gag, pol és/vagy env retrovírus esetében, rep és/vagy cap AAV esetében).
Az egyik hiányos adenovírusok termelésére ismert sejtvonal például a 293 sejtvonal, amelyben az adenovírus genomjának egy része van beépítve. Pontosabban a 293 sejtvonal humán embrionális vesesejtvonal, amely az 5 szerotípusú adenovírus (Ad5) genomjának bal szélét (körülbelül 11-12%) tartalmazza, amely rész magában foglalja a bal ITR-t, a részecskeképződésért felelős területet, az E1a és E1b régiókat tartalmazó E1 területet, a pIX fehérjét kódoló területet és a plVa2 fehérjét kódoló terület egy részét. Ez a sejtvonal képes transzkomplementálni az E1 régiójában hiányos rekombináns adenovírusokat, azaz amelyekből az E1 régió vagy annak egy része hiányzik, és képes magas titerű vírussarzsokat termelni. A sejtvonal képes permisszív hőmérsékleten (32 °C) többek között a hőmérséklet-érzékeny E2 mutációt hordozó vírussarzsokat termelni. Más, az E1 régiót komplementálni képes sejtvonalakat is leírtak, melyek többek között az A549 humán tüdőkarcinóma-sejteken [WO 94/28152] vagy humán retinoblasztómasejteken alapulnak [Hűm. Gén. Ther., 215 (1996)]. Másrészt az adenovírus több funkcióját transzkomplementálni képes sejtvonalakat is leírtak. Részletesen az E1 és E4 régiókat [Yeh et al., J. Virol. 70, 559 (1996); Cancer Gén. Ther. 2, 322 (1995); Krougliak et al., Hűm. Gén. Ther. 6, 1575 (1995)], és az E1 és E2 régiókat [WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071] komplementáló sejtvonalakat említhetjük meg.
Különböző sejtvonalakat írtak le hiányos retrovírusok termelésére is, amelyek általában a gag, pol és env gének kifejezésére képesek. Ilyen sejtvonalak például a PA317 sejtvonal [US 4,861,719], a PsiCRIP sejtvonal [WO 90/02806], a GP+envAm-12 sejtvonal [WO 89/07150], a BOSC sejtvonal [WO 94/19478] stb. Egy kívánt nukleinsavat tartalmazó rekombináns retrovírusok előállításához egy olyan plazmidot hozunk létre, amely többek között az LTR-eket, a részecskeképződésért felelős szekvenciákat és az említett nukleinsavat tartalmazza, majd ezt alkalmazzuk egy, a fentebb leírt részecskeképző sejtvonal transzfektálására, amely képes transz-helyzetben biztosítani a plazmidból hiányzó retrovirális funkciókat. A termelt rekombináns retrovírusokat azután a klasszikus módszereket alkalmazva tisztítjuk.
Sejtvonalak alkalmazása azonban bizonyos hátrányokkal járhat. így nehéz, drága, és ipari méretekben nehézségekbe ütközik ilyen sejtvonalak kialakítása és értékelése. A sejtvonalaknak ugyanis stabilaknak és ipari méretekben alkalmazhatóknak kell lenniük. Ezenfelül a leírt sejtvonalak nehezen teszik lehetővé, hogy a fertőző vírusrészecskék (RCA) termelődését elkerüljük. Másrészt a sejtvonalak nem teszik lehetővé napjainkban, hogy az ipari felhasználás szempontjából kielégítő módon transzkomplementáljuk a nagymértékben hiányos vírusok genomját, amilyenek például a minimális adenovírusok, amelyekről korábban beszéltünk. Az adenovírus ugyanis különböző transzkripciós egységekbe szervezett genommal rendelkezik, melynek tér3
HU 224 713 Β1 beli és időbeli szabályozása nagyon összetett. Egy összes virális kódolóterületétől megfosztott adenovírus transzkomplementálása olyan módon, hogy az minden transzkripciós egységet elkülönülten fejezzen ki, konstitutív vagy feltételes módon egy sejtvonalból kiindulva nem valósítható meg kielégítő módon napjainkig. így sejtvonalakból kiindulva csak a genomnak egy kis része, amely az E1, E4, pIX régióknak és az E2 által kódolt három fehérjének (pol, DBP és p-TP) felel meg, fejeződött ki konstitutív módon. A genom fennmaradó része egy lényeges késői transzkripciós egységnek (MLTU) felel meg, amely egy 28 kb elsődleges transzkriptumból kiindulva szerkezeti és nem szerkezeti fehérjék összes messzendzserét termeli, és a genom replikációja után aktiválódik. Minimális adenovírusok kialakításához ezen területek transzkomplementálása elengedhetetlen. A sejtvonalak nem teszik lehetővé azt sem, hogy magas titerrel kapjunk rekombináns retrovírusokat,
A másik megközelítés szerint a hiányos vírusgenommal együtt kotranszfektálnak egy olyan szerkezetet (plazmidot vagy adenovírust), amely a komplementáló funkciókat hordozza. Részletesen hiányos rekombináns AAV-ket általában úgy állítanak elő, hogy egy humán helpervírussal (például adenovírus) fertőzött sejtvonalba kotranszfektálnak egy plazmidot, mely a kívánt nukleinsavszekvenciát tartalmazza az AAV két inverz ismétlődő területe (ITR) között, és egy másik plazmiddal, amely az AAV-t komplementáló funkciókat (rep és cap gének) hordozza. Ennek változatait írták le a WO 95/14771; WO 95/13365; WO 95/13392; és a WO 95/06743 számon közzétett bejelentésekben. Egy helper adenovírus alkalmazásának fő hátránya az, hogy megnövekedik az adenovírusvektor és a helper adenovírus közötti rekombináció veszélye, és hogy nehéz elválasztani a helper rekombinánsait a vírussarzsok termelése és tisztítása során. Helper plazmid, például egy Rep/cap plazmid alkalmazásának hátránya az, hogy a kapott transzfekciós szint nem teszi lehetővé, hogy magas titerrel termeljük a vírusokat.
A találmány új vírustermelő rendszereket ismertet, melyek lehetővé teszik e hátrányok kiküszöbölését. A találmány szerinti rendszer azon alapul, hogy a komplementáló funkciók biztosításához egy bakulovírust alkalmazunk.
A találmány szerinti termelőrendszer különösen előnyös módon lehetővé teszi, hogy a beállt komplementáló sejtvonalak alkalmazásától függetlenítsük magunkat, elkerüljük az RCA-k (fertőző vírusrészecskék) problémáját, és nagymértékben hiányos genomokat transzkomplementáljunk. Másrészt a találmány szerinti rendszer bármely, a kívánt vírussal és egy bakulovírussal fertőzhető sejt esetében alkalmazható, és így nagy alkalmazási rugalmassággal rendelkezik.
A találmány egyik tárgya tehát eljárás hiányos rekombináns vírusok termelésére, amely szerint egy kompetens sejtpopuláció sejtjeibe bevezetjük a hiányos rekombináns vírus genomját és egy bakuiovírust, amely a hiányos rekombináns genom transzkomplementálásához szükséges funkciók összességét vagy azok egy részét hordozza, a funkciók másik részét egy vagy több bakulovírus és/vagy a kompetens sejt szolgáltatja.
A találmány szerinti eljárás tehát a komplementáló funkciók biztosítására egy bakuiovírust alkalmaz. Különböző megközelítések lehetségesek. Először is, alkalmazhatunk olyan kompetens sejteket, melyek nem fejeznek ki a hiányos rekombináns genomot transzkomplementáló funkciót. Ebben az esetben vagy egy olyan bakuiovírust alkalmazunk, amely a hiányos rekombináns genom transzkomplementálásához szükséges funkciók összességét hordozza, vagy több bakuiovírust, melyek mindegyike hordoz a hiányos rekombináns genom transzkomplementálásához szükséges egy vagy több funkciót. Az is lehetséges, hogy olyan kompetens sejtpopulációt alkalmazunk, amely képes egy vagy több, a rekombináns genomból hiányzó funkció transzkomplementálására (részecskeképző sejtvonal). Ebben az esetben az alkalmazott bakulovírus vagy bakulovírusok kizárólag azokat a hiányos rekombináns genom transzkomplementálásához szükséges funkciókat hordozzák, amelyeket a kompetens sejtek nem transzkomplementálnak.
Amint a korábbiakban jeleztük, a találmány szerinti rendszer számos előnnyel rendelkezik az ipari alkalmazhatóság tekintetében (nincs szükség sejtvonalakra, nincs RCA stb.) és az alkalmazhatóság tekintetében (bármely típusú deléciót hordozó rekombináns vírusok, többek között nagymértékben hiányos adenovírusok termelése). Ezenkívül abban az esetben, amennyiben a bakulovírus nem replikálódik humán sejtekben, a kapott víruskészítményt nem szennyezi a bakulovírus. Ezenfelül mivel a bakulovírus filogenetikailag nagyon távol áll az adenovírusoktól, nem áll fenn a kettő közötti rekombináció vagy transzkomplementáció veszélye sem. A rendszer tehát lehetővé teszi, hogy előnyös módon hiányos vírusok koncentrált sarzsait termeljük, melyekben nincs RCA. A rendszer különösen előnyös hiányos rekombináns adenovírusok termelése esetén.
A bakulovírusok lipidburokkal rendelkező kettős szálú cirkuláris DNS-vírusok, melyek gerinctelenekre specifikusak. Prototípusuk, az AcNPV genomja 133 kb. Ezt a vírust gyakran használják eukarióta gének kifejezésére rovarsejtekben, két erős promoterből (polihedrin, Ph és P10) [King et Possee, The baculovírus expression system. London, Chapman & Hall (1992)]. Az AcNPV képes egyes emlőssejteket fertőzni, de a genom nem íródik át, és nem is transzlatálódik. A közelmúltban Hofmann és munkatársai [PNAS 92, 10 099 (1995)] kimutatták, hogy in vitro hepatocita sejtek transzdukálhatók tisztított, a LacZ gént kifejező rekombináns bakulovírussal. Nem mutattak ki sejtes toxicitást, még 1000-szeres fertőzési multipolicitással sem, és a cikkben leírt transzfekciós hatásfok 100 MOI esetében körülbelül 50%.
A bejelentésben kimutatjuk, hogy különböző sejttípusok fertőzhetők rekombináns bakulovírussal. Részletesen a bejelentésben kimutatjuk, hogy rekombináns bakulovírussal lehetséges humán eredetű sejteket fer4
HU 224 713 Β1 tőzni, amilyenek az immortalizált embrionális sejtek. A bejelentésben azt is kimutatjuk, hogy igen magas transzdukciós hatásfokot érhetünk el (>80%). A bejelentésben kimutatjuk azt is, hogy bevezethetünk egy bakulovírusba egy adenovírust transzkomplementáló funkciókat, és ezeket egy kompetens sejtpopulációban ki is fejezhetjük. A bejelentés így lehetővé teszi, hogy kimutassuk, hogy a bakulovírus olyan inért vektor, amely előnyösen alkalmazható vírusokat komplementáló funkciók átvitelére és kifejezésére emlős-, többek között humán sejtekben. A találmány szerinti rendszer más előnyei többek között (i) a nagy klónozási kapacitás, amely lehetővé teszi, hogy egy teljes adenovírusgenomot komplementáljunk, és (ii) a bakulovírust alkalmazó módszerek előrehaladott fejlettsége.
A vírust komplementáló funkciókat hordozó bakulovírust a következőkben helper bakulovírusnak is nevezzük. Ez különböző vírust komplementáló funkciókat hordozhat.
így a helper bakulovírus hordozhatja az adenovírus E1 régióját. Egy bakulo-E1-et első generációs adenovírusok, azaz E1 régiójában hiányos adenovírusok (AdΔΕ1) termelésére használhatunk, bármilyen is azok E3 régiója (azaz ΑόΔΕ1,ΔΕ3 hiányos vagy nem). Az első generációs hiányos rekombináns adenovírusok (E1 és adott esetben E3 régiójukban hiányos adenovírusok) termelése a találmány szerinti eljárás egyik különösen előnyös alkalmazását képezi. Amint a korábbiakban leírtuk, különböző sejtvonalakat ismertet a szakirodalom, amelyek képesek az E1 régiót transzkomplementálni (293 sejtek, A549 sejtek, 911 sejtek stb.). A sejtvonal genomjába beépített transzkomplementáló funkciókat hordozó terület és a termeltetni kívánt rekombináns vírus DNS-e között azonban léteznek homológ területek. Ezért a termelés során különböző rekombinációs események fordulhatnak elő, amelyek replikatív vírusrészecskéket, többek között E1+ típusú adenovírusokat hoznak létre. Szó lehet egy egyszerű rekombinációról is, amit a kromoszóma törése követ, vagy kettős rekombinációról. Ez a két utóbbi típusú módosulás odavezet, hogy a sejtgenomban található E1 régió visszaépül eredeti helyére az adenovírusgenomban. Másrészt figyelembe véve, hogy a 293 sejtvonal magas titerrel termel rekombináns vektorokat (nagyobb, mint 1012), megnő annak a valószínűsége, hogy ez a rekombinációs esemény bekövetkezik. Valóban, megállapították, hogy számos első generációs hiányos rekombináns adenovírusvektor-sarzs fertőzött volt replikatív vírusrészecskékkel, ami jelentős hátrány lehet gyógyászati felhasználásuk szempontjából. Ilyen részecskék jelenléte ugyanis terápiás készítményekben in vivő vírusszaporodáshoz és szabályozatlan szétterjedéshez vezetne, gyulladásos reakciók, rekombináció stb. veszélyével. A szennyezett sarasokat tehát nem lehet humánterápiában felhasználni.
A találmány lehetővé teszi, hogy ezt a hátrányt kiküszöböljük. A találmány egy megvalósítási módja szerint ugyanis az E1, és adott esetben E3 régiójában hiányos rekombináns adenovírus genomját kompetens sejtekbe vezetjük be, és ezeket a sejteket egyidejűleg vagy nem egyidejűleg az E1 régiót tartalmazó bakulovírussal is fertőzzük, ahol a bakulovírusban jelen lévő adenovirális E1 régió és a hiányos rekombináns adenovírus nem tartalmaz olyan homológ területet (átfedést), ahol rekombináció történhetne. így tehát ebben a megvalósítási módban gyorsan, beállt sejtvonalak nélkül termeltethetünk RCA-mentes első generációs rekombináns adenovírussarzsokat. Másrészt, amint a korábbiakban leírtuk, kompetens sejteknek egy bakulovírussal és az így kialakított RCA-mentes rekombináns adenovírussarasokkal történő együttes fertőzése révén ez utóbbiakat egy újabb termelési folyamat kiindulásaként is alkalmazhatjuk.
A helper bakulovírus hordozhatja az adenovírus E2 régióját vagy annak egy részét, többek között az E2a és/vagy E2b területeket is. Egy bakulo-E2-t alkalmazhatunk kompetens sejtekben E2 (AdAE2), és adott esetben E3 régiójában (ΑόΔΕ2,ΔΕ3) hiányos adenovírusok termeltetésére. Másrészt az adenovírus E1 régióját komplementálni képes kompetens sejtekben a bakulo-E2 lehetővé teszi E1 és E2 (ΑόΔΕ1,ΔΕ2), és adott esetben E3 régiójában (ΑόΔΕ1,ΔΕ2,ΔΕ3) hiányos rekombináns adenovírusok termeltetését. Ezenfelül az adenovírus E1 és E4 területeit komplementéin! képes kompetens sejtekben (például az IGPR2 sejtekben) a bakulo-E2 lehetővé teszi, hogy E1, E2 és E4 (AdAE1 ,ΔΕ2,ΔΕ4), és adott esetben E3 (ΑόΔΕ1,ΔΕ2,ΔΕ3,ΔΕ4) területeiben hiányos rekombináns adenovírusokat termeljünk.
A helper bakulovírus hordozhatja az adenovírus E4 régióját is (egészében vagy részben). Egy bakulo-E4-et kompetens sejtekben E4 (AdAE4), és adott esetben E3 (ΑόΔΕ4,ΔΕ3) régiójában hiányos adenovírusok termelésére alkalmazhatunk. Ezenkívül az adenovírus E1 régióját komplementéin! képes kompetens sejtekben a bakulo-E4 lehetővé teszi, hogy E1 és E4 (AdAE1,AE4), és adott esetben E3 (ΑόΔΕ1,ΔΕ4,ΔΕ3) régiójában hiányos rekombináns adenovírusokat termeljünk.
A helper bakulovírus hordozhatja az adenovírus E1 és E4 területeit is (egészében vagy részben). Egy bakulo-E1,E4-et kompetens sejtekben E1 és E4 (AdΔΕ1.ΔΕ4), és adott esetben E3 (ΑόΔΕ1,ΔΕ4,ΔΕ3) régióiban hiányos adenovírusok termelésére alkalmazhatunk, amint azt az 1. ábrán bemutatjuk.
Ezenkívül E1 és E4 régióiban hiányos vírusok kialakítására alkalmazhatunk két helper bakulovírust is, melyek közül az egyik az E1 funkciót, a másik az E4 funkciót fejezi ki részben vagy egészében.
Ugyanilyen módon a helper bakulovírus hordozhatja az E1, E2 és E4 régiókat is (egészében vagy részben), és adott esetben a késői géneket (L1-L5) tartalmazó területeket is.
A helper bakulovírus hordozhatja az AAV Rep és/vagy Cap területeit is. Egy bakulo Rep/Cap lehetővé teszi, hogy kompetens sejtvonalban komplementáljunk egy olyan AAV genomot, amelyből minden virális kódolórégió hiányzik (5. ábra).
A bakulovírus hordozhatja egy retrovírus gag, pol és/vagy env régióit is. Egy bakulo gag/pol/env lehetővé teszi, hogy egy kompetens sejtvonalban komplemen5
HU 224 713 Β1 táljunk egy minden virális kódolórégiótól mentes retrovírusgenomot. Alkalmazhatunk egy, a gag/pol régiókat hordozó, és egy második, az env régiót hordozó bakulovírust is.
Általános módon előnyös, ha a hiányos rekombináns vírusgenom és a bakulovírusban jelen lévő komplementálóterületek nem tartalmaznak átfedéseket. Ez lehetővé teszi, hogy a rekombináció és az RCA-k kialakulásának veszélyét elkerüljük. Ez különösen jelentős első generációs adenovírusok (AdAE1) kialakítása esetében. Ebben az esetben a bakulovirusba bevezetett E1 régiót úgy határozzuk meg, hogy ne legyen a rekombináns genommal közös szekvenciája. Ehhez például a rekombináns genomból deletálhatunk egy, a bakulovírusba beépített komplementálórégiónál nagyobb területet, amint a példákban bemutatjuk. Ez AdAE1 ,ΔΕ4 adenovírusok kialakítása esetében is előnyös.
így a találmány egy megvalósítási módjában a hiányos rekombináns vírusgenomot egy kompetens sejtbe vezetjük be, a sejteket egyidejűleg vagy elkülönülten egy bakulovírussal fertőzzük, amely a hiányos genom komplementálásához szükséges funkciókat vagy azok egy részét hordozza, ahol a bakulovírusban jelen lévő komplementáló funkciók és a hiányos rekombináns vírusgenom nem tartalmaz olyan homológ területeket, ahol rekombináció történhetne. Előnyösen a vírusgenom egy E1 régiójában hiányos rekombináns adenovírus genomja, és a bakulovírus egy olyan adenovirális területet hordoz, amely képes transzkomplementálni az E1 régiót. Egy másik változat szerint a vírusgenom egy E1 és E4 régióiban hiányos rekombináns adenovírus genomja, és a bakulovírus két olyan adenovirális területet hordoz, amelyek képesek az említett régiókat transzkomplementálni, vagy két olyan bakulovírust alkalmazunk, amelyek közül az egyik az E1 régiót transzkomplementálni képes adenovirális területet hordoz, a másik az E4 régiót transzkomplementálni képes adenovirális területet hordoz, a hiányos adenovírus genomjával homológ területek nélkül.
Egy különleges megvalósítási módban az adenovírus kódolórégióinak összességét egy vagy több helper bakulovírus hordozza. Egy különleges megvalósítási módban csak egy helper bakulovírust alkalmazunk, amely az adenovírus kódolóterületeinek összességét hordozza. Ilyen helper bakulovírust alkalmazhatunk például minimális rekombináns adenovírusok transzkomplementálására. Egy ilyen bakulovírus hordozhatja többek között az adenovirális genom összességét, a részecskeképző terület, és adott esetben az ITR-ek kivételével, amint a példákban bemutatjuk.
A komplementáló funkciók kialakítása
A helper bakulovírusba beépített komplementáló funkciók különböző szerotípusú vírusokból származhatnak.
Adenovírusokról szólva különböző szerotípusok léteznek, melyek szerkezete és tulajdonságai kissé eltérőek, de genetikai szerveződésük összehasonlítható. Részletesebben a találmány szerinti bakulovírusok kialakításához alkalmazott komplementáló funkciók egy humán vagy állati adenovírusból származnak.
Ami a humán eredetű adenovírusokat illeti, előnyösen a C csoportba tartozókat említhetjük meg. Még előnyösebben a különböző szerotípusú humán adenovírusok közül a találmány keretein belül előnyben részesítjük a 2 vagy 5 típusú adenovírusok (Ad2 vagy Ad5) alkalmazását. A 7 vagy a 12 típusú adenovírusokból származó területeket is alkalmazhatjuk, amelyek az A és a B csoportokba tartoznak. A különböző állati eredetű adenovírusok közül a találmány keretein belül előnyben részesítjük a kutyaadenovírusokat, többek között a CAV-2 adenovírus bármely törzsét (például manhattan vagy A26/61 törzs, ATCC VR-800). Más állati eredetű adenovírusokat említenek többek között a WO 94/26914 számon közzétett bejelentésben, melyet referenciaként építünk be.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a komplementáló funkció egy C csoportba tartozó humán adenovírus genomjából származik. Még előnyösebben az Ad2 vagy az Ad5 adenovírus genomjából származik.
A különböző komplementáló funkciókat hordozó területeket egy adenovírusgenomból a szakember számára ismert módszerek szerint enzimatikus hasítással kaphatjuk meg. Ezeket a területeket adott esetben módosíthatjuk is méretük csökkentésére vagy bizonyos szabályozóelemek (promoter, enhancer stb.) heterológ elemekkel történő helyettesítésére. Általános módon ezeket a területeket a következők szerint állítjuk elő. Egy adenovírus DNS-ét cézium-klorid-centrifugálással tisztítjuk, vagy in vitro egy prokarióta [WO 96/25506] vagy eukarióta [WO 95/03400] plazmidból kapjuk meg. Ezután a DNS-t a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk, és a kapott fragmentumokat, melyek a kívánt komplementáló funkciókat hordozzák, azonosítjuk és szelektáljuk. Az alkalmazott restrikciós enzimek megválasztása függ a kívánt komplementáló funkcióktól, és meghatározásukban segítségünkre vannak az adenovírusgenomok publikált szekvenciái és restrikciós térképei. így az E1 régiót izolálhatjuk egy olyan fragmentum formájában, amely az E1A promoter alatt mindkét E1A és E1B leolvasási keretet hordozza. Az E4 régiót izolálhatjuk egy olyan fragmentum formájában, amely a leolvasási keretek összességét hordozza, vagy olyan fragmentum formájában, amely csak egy részüket hordozza, előnyösen az ORF3 vagy ORF6 vagy ORF6-ORF6/7 kereteket.
Hasonló eljárásokat dolgoztunk ki az AAV és a rekombináns retrovírusok komplementálóterületeinek előállítására is. így az AAV rep és/vagy cap területeit különböző szerotípusú AAV-kből izolált virális DNS-ből kiindulva enzimatikus hasítással kaphatjuk meg. Előnyösen az AAV-2-ből indulunk ki. Retrovírusok esetében a gag, pol és/vagy env területeket szintén a molekuláris biológia klasszikus módszereivel kaphatjuk meg, különböző szerotípusú retrovírusokból kiindulva, amilyenek többek között a MoMuLV („Murin Moloney Leukémia Vírus”, amelyet MoMLV-nek is jelölnek), az MSV („Murin Moloney Sarcoma Vírus”), a HaSV („Har6
HU 224 713 Β1 vey Sarcoma Vírus”), az SNV („Spleen Necrosis Vírus”), az RSV („Rous Sarcoma Vírus”) vagy a Friendvírus.
A helper bakulovírus kialakítása A komplementálóterületeket hordozó fragmentumokat azután egy plazmidvektorba szubklónozzuk, ami lehetővé teszi kezelésüket (finomabb emésztések, szabályozószekvenciák hozzáadása stb.), például egy prokarióta vagy eukarióta szervezetben. A kapott végső fragmentumot, amely a komplementáló funkciót vagy funkciókat hordozza, ezután a helper bakulovírusba vezetjük be, a molekuláris biológia klasszikus módszereit alkalmazva. Pontosabban a fragmentumot két, a bakulovírus genomjának egy területével homológ szekvencia közé klónozzuk, majd a kapott framentumot vagy plazmidot a bakulovírus genomjával kotranszfektáljuk rovarsejtekbe (klasszikusan Sf9 és Sf21, amelyek Spodopterra frugipedra sejtek, de lehetnek Tn368 és High-FiveTM BTI-TN-5B1-4 (Gibco), Trichopulsiani sejtek, vagy bármely más bakulovírusokra permisszív és azok termelésére alkalmas rovarsejt]. A plazmid vagy fragmentum és a bakulovírusgenom közötti homológ rekombináció alakítja ki a kívánt rekombináns bakulovírust, amelyet a klasszikus módszerek szerint gyűjthetünk össze és tisztíthatunk [lásd többek között King et Possee: The baculovírus expression system. London, Chapman & Hall (1992)]. Rekombináns bakulovírusok kialakítására különböző ingázó vektorokat tartalmazó kitek vannak forgalomban és alkalmazhatók, a gyártók előírásait követve. Többek között alkalmazhatjuk a Clontech által forgalmazott pBAC ingázó vektorokat, a pAc vektorokat [Verne et al., Bio/Technology 6, 47 (1988), Phamingen, USA], a pBLue-Bac vektorokat (Invitrogen) vagy a pBSV vektorokat (Boehringer). A komplementáló funkciókat így a bakulovírus különböző helyeire építhetjük be, többek között a polihedringén vagy a p10 gén lokuszába. Másrészt különböző bakulovírustörzseket alkalmazhatunk, amilyenek többek között az AcNPV vagy Bombyx móri [Maeda et al., Natúré 315, 592 (1988)]. Másrészről az alkalmazott bakulovírust módosíthatjuk is tropizmusa javítására/megváltoztatására. Virális vektorok tropizmusát ugyanis modulálhatjuk azáltal, hogy felületi fehérjéiket megváltoztatjuk abból a célból, hogy (i) csökkentsük a tropizmust a virális fehérjéket egy specifikus ligandumhoz (immunglobulin könnyű lánc, GastrinReleasing-Peptid) fuzionáltatva, vagy (ii) megnöveljük azt, egy heterológ virális glikoproteinnel képzett pszeudotípusokat kialakítva [a vezikulás szájgyulladás, stomatit vesicular vírusának (VSV) G-je] [Liu et al., J. Virol. 70(4), 2497 (1996); Michael et al., Gene Ther. 2, 660 (1995)]. A közelmúltban kimutatták, hogy a bakulovírus felületi glikoproteinje (gp64) a VIH-vírus gp120 fehérjéjével fuzionáltatva képes volt a CD4 receptoron kötődni [Boublik et al., Bio/Technology 13, 1079 (1995)]. A gp64 ilyen módosítása nem érinti a bakulovírus életképességét rovarsejteken. Egy analóg szerkezet a VSV G-jével lehetővé tehetné a bakulovírus tropizmusának javítását emlőssejtek irányában, és így megnövelhetné Huh7 sejtek, valamint más sejtvonalak transzdukciójának hatékonyságát.
A helper bakulovírusban a komplementáló funkciók előnyösen egy heterológ (azaz a bakulovírustól eltérő eredetű) promoter irányítása alá vannak helyezve, amely a kompetens sejtekben működőképes. Ugyanis úgy tűnik, hogy a bakulovíruspromoterek nem teszik lehetővé, hogy a komplementáló funkciók megfelelő mértékű expresszióját érjük el rovarsejtektől eltérő sejtekben, és így nem a legmegfelelőbbek a találmány szerinti alkalmazások esetében. A promoter (homológ promoter) lehet a vírust komplementáló funkciók saját promotere (E1A, E4, E2, MLP promoterek adenovírus esetében, P5 vagy P19 promoterek AAV esetében, az RSV LTR-ének promotere stb.). De szó lehet bármely, az alkalmazott kompetens sejtben működőképes eltérő eredetű promoterről is. Ehhez például az ebben a sejtben kifejeződő gének promotereit, vagy az ismert általános promotereket, például a PGK gén promoterét, a CMV közvetlen korai promoterét, a herpeszvírus TK-génjének promoterét vagy az RSV LTR promoterét említhetjük meg. Szó lehet szabályozható promoterekről is, amilyenek például az MMTV-vírus promotere, egy hormonokra reagáló promoter, például egy GRE5 típusú, vagy egy tetraciklinnel szabályozható promoter. Előnyösen egy homológ, egy erős általános vagy egy indukálható promoterről van szó.
így a találmány másik tárgya egy rekombináns bakulovírus, amely genomjába beépített módon tartalmaz egy vírust komplementáló funkciót kódoló nukleinsavat egy heterológ promoter irányítása alatt. Részletesebben a komplementáló funkció egy olyan fehérje, amely az említett vírus termelődéséhez szükséges, és amelynek kódolórégiója inaktív (mutáns, deletált stb.) a hiányos vírus genomjában. Adenovírusok esetében a komplementáló funkciót az adenovírus E1, E2, E4, L1-L5, pIX és IVa2 területei által kódolt funkciók mindegyike vagy egy része közül választjuk, egymagában vagy kombinációban. AAV esetében a Rep és/vagy Cap, retrovírusok esetében a gag, pol és/vagy env régiók által kódolt funkciókról van szó. A nukleinsav előnyösen a virális genom egy olyan területének felel meg, amely tartalmazza a választott komplementáló funkciót kódoló területet. Részletesen egy Ad2 vagy Ad5 szerotípusú adenovírus, MoMLV vagy AAV-2 genomjának egy fragmentumáról van szó. Különösen előnyösen a nukleinsav tartalmazza a választott komplementáló funkciók expressziójáért természetes módon felelős promoterterületet is.
Példaképpen a találmány tárgyát képezi egy bakulovírus, amely egy adenovírus E1 régióját vagy annak egy részét tartalmazza. Részletesebben egy olyan bakulovírusról van szó, amely az E1a, az E1b, vagy az E1a és E1b területeket tartalmazza. Az adenovírus E1 területe az Ad5 104. nukelotidjától (E1a promoter) a 4070. nukleotidjáig (E1b poliA) tart. Részletesen az E1a promoter TATA boksza a 470. nukleotid területén helyezkedik el, az E1a ATG kodonja az 560. nukleotid területén, az E1b stopkodonja a 3511. nukleotid területén. Példaképpen említhetjük azt a bakulovírust, amely
HU 224 713 Β1 a 391-3511. fragmentumot tartalmazza. Ez a helper bakulovírus különösen alkalmas olyan E1 régiójában hiányos rekombináns adenovírusok termelésére, amelyek a 391-3511. fragmentumnál nagyobb deléciót hordoznak. Többek között alkalmas első generációs adenovírusok termelésére, RCA nélkül, amelyek E1 régiójukban a 383-3512. nukleotidokat magában foglaló deléciót hordoznak.
Egy másik példa a találmány szerinti bakulovírusra egy olyan bakulovírus, amely például az adenovírus E1 és E4 területeit vagy azok egy részét tartalmazza. Az adenovírus E4 területe 7 nyílt leolvasási keretből áll, melyeket ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 és ORF6/7 jelölnek. A különböző ORF-ek által kódolt fehérjék közül az ORF3 és az ORF6 által termeltek teszik lehetővé a vírus „replikációját”, és így egy E4 régiójában hiányos adenovírus transzkomplementálását, még akkor is, ha az egész E4 régió hiányzik. Ezért a találmány szerinti helper bakulovírus előnyösen az egész E4 régiót tartalmazza, vagy annak csak egy részét, amely legalább az ORF3-at vagy az ORF6-ot tartalmazza. Az E4 régió különböző részeit enzimatikus hasításokkal vagy módosításokkal kaphatjuk meg a szakember számára ismert módszerek szerint. Részletesen az ORF6 leolvasási keretet az E4 régióból egy Bglll-Pvull fragmentum formájában izolálhatjuk, ami a 34 115-33 126. nukleotidoknak felel meg, és az ORF6-ORF6/7 leolvasási kereteket az E4 régióból egy Bglll-Bglll fragmentum formájában izolálhatjuk, amely az Ad5 34 115-32 490. nukleonjainak felel meg. A bakulovírus hordozhatja az ORF1-ORF7 leolvasási keretek összességét is (például egy 32 800-35 826. vagy egy 32 811-35 614. vagy egy 32 811-35 640. fragmentum formájában). Természetesen más fragmentumokat is meghatározhatunk az adenovírusgenomok publikált szekvenciái alapján. Egy csökkentett méretű E4 régiót hordozó bakulovírus alkalmazása előnyös, mivel lehetővé teszi olyan hiányos adenovírusgenom transzkomplementálását, amely az E4 régió nagyobb delécióját hordozza, és így nincs homológ területe, és ezáltal lehetővé teszi, hogy a rekombináció lehetőségét is elkerüljük.
Az egyik megvalósítási mód szerint a komplementáló funkciót vagy funkciókat kódoló nukleinsavat a helper bakulovírusba egy expressziós kazetta formájában vezetjük be. Ezt a megvalósítási módot a legegyszerűbb alkalmazni. Különösen a közvetlen korai génekben hiányos rekombináns adenovírusok, és hiányos rekombináns retrovírusok és AAV-k termelésére alkalmas.
Egy másik megvalósítási mód szerint a komplementáló funkciót vagy funkciókat kódoló nukleinsavat a helper bakulovírusba egy kivágható kazetta formájában vezetjük be, amely a kompetens sejtben egy replikatív molekulát hoz létre. A kazetta replikációja a sejtben lehetővé teszi, hogy a komplementálógének kópiaszámát előnyös módon megnöveljük, és így javítsuk a rendszer termelési szintjét. Ez a megvalósítási mód különösen nagy mértékben, többek között struktúrgénjeiben hiányos rekombináns adenovírusok termelésére alkalmas. Részletesen ez a megvalósítási mód különösen alkalmas minimális adenovírusok termelésére. A szerkezeti fehérjék mennyisége ugyanis korlátozó tényező nagymértékben hiányos (minimális adenovírus típusú) adenovírusok jelentős titerben történő termelése esetében. Ez a megvalósítási mód elsőként teszi lehetővé, hogy jelentősen megnöveljük a transzkomplementáló fehérjék, többek között az adenovírus szerkezeti fehérjék (melyeket az L1-L5 területek kódolnak) intracelluláris szintjét, egészen egy minimális adenovírus transzkomplementálásának mértékéig.
[gy a bejelentésben kimutatjuk, hogy szerkeszthetünk olyan rekombináns bakulovírusokat, amelyek egy olyan heterológ területet tartalmaznak, amely képes egy sejtben kivágódni, előnyösen indukálható és szabályozható módon, és így cirkuláris és replikatív (episzomális típusú) molekulát kialakítani.
A kivágást előnyösen egy helyspecifikus rekombinációs mechanizmussal valósítjuk meg, a sejten belüli replikációt pedig egy sejtosztódási állapottól független replikációs origóval biztosítjuk.
Előnyösebben a találmány szerinti eljárásban alkalmazott helyspecifikus rekombinációt két specifikus szekvencia útján kapjuk meg, melyek képesek egymás között rekombinálódni egy specifikus, általában rekombináznak nevezett protein jelenlétében. Ezek a specifikus szekvenciák megfelelő orientációban elrendezve közrefogják a bakulovírusban a komplementáló funkciókat kódoló szekvenciákat. így a találmány tárgya egy olyan rekombináns bakulovírus is, amely genomjába beépített módon tartalmaz legalább egy DNS-területet, amelyet két helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő, azonos orientációban elhelyezett szekvencia fog közre, ahol az említett DNS-terület legalább egy, a kompetens sejtekben működőképes replikációs origót és egy vírust komplementáló funkciót kódoló nukleinsavat tartalmaz.
A találmány keretein belül alkalmazott rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák általában 5-100, előnyösebben kevesebb mint 50 bázispárt tartalmaznak. Különböző szerkezeti osztályokhoz tartozhatnak, többek között a P1 bakteriofág rekombinázok családjába vagy egy transzpozon reszolváz családba.
Az 1 bakteriofág integrázainak családjába tartozó rekombinázok közül többek között a lambda fág integrázát [Landy et al., Science 197, 1147 (1977)], a P22 és F80 integrázát [Leong et al., J. Bioi. Chem. 260, 4468 (1985)], a Haemophilus influenzáé HP1 fág integrázát [Hauseret al., J. Bioi. Chem. 267, 6859 (1992)], a P1 fág Cre integrázát, a pSAM2 plazmid integrázát [EP 350 341] vagy a Saccharomyces cerevisiae 2 pm plazmidjának FLP rekombinázát említhetjük meg.
A Tn3 transzpozoncsaládba tartozó rekombinázok közül többek között a Tn3 transzpozon vagy a gd, Tn21 vagy Tn522 transzpozonok [Stark et al. (1992)] reszolvázát, a mu bakteriofág Gin invertázát, vagy plazmidok reszolvázát, például az RP4 pár fragmentumát [Abert et al., Mól. Microbiol. 12, 131 (1994)] említhetjük meg.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti rekombináns bakulovírusban a helyspecifikus
HU 224 713 Β1 rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák egy bakteriofágból származnak. Előnyösebben egy bakteriofág attachement szekvenciáiról (attP és attB szekvenciák) van szó, vagy ezek származékairól. Ezek a szekvenciák képesek egymással specifikusan rekombinálódni egy integráznak nevezett rekombináz jelenlétében. Példaképpen említhetjük többek között a lambda, P22, F80, P1, Haemophilus influenzáé HP1 fágok, vagy a pSAM2 vagy 2 pm plazmidok attachement szekvenciáit.
Még előnyösebben a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciákat a P1 fág rekombinációs rendszere képviseli. A P1 fág egy Cre nevű rekombinázzal rendelkezik, amely specifikusan felismer egy 34 bázispáros nukleotidszekvenciát, melyet loxP helynek neveznek [Sternberg et al., J. Mól. Bioi. 150, 467 (1981)]. Ez a szekvencia két 13 bp palindrom szekvenciából áll, melyeket egy 8 bp konzervatív szekvencia választ el egymástól. A helyspecifikus rekombinációt előnyösen a LoxP szekvenciákat vagy ezek származékait, és a Cre rekombinázt alkalmazva kapjuk meg.
A származék szekvencia kifejezés magában foglalja a fentebbi rekombinációs szekvenciák módosításával vagy módosításaival kapott szekvenciákat, melyek megőrzik azt a tulajdonságukat, hogy képesek a megfelelő rekombináz jelenlétében specifikusan rekombinálódni. így szó lehet a szekvenciák lerövidített, vagy épp ellenkezőleg, más szekvenciák (restrikciós helyek stb.) hozzáadásával meghosszabbított fragmentumairól. Szó lehet mutációval vagy mutációkkal, többek között pontmutációval kapott változatokról is.
A találmány egy különleges megvalósítási módja szerint a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák a P1 bakteriofág LoxP szekvenciái, a rekombináció pedig a Cre fehérje jelenlétében jön létre. Ebben a tekintetben a rekombináció úgy is létrejöhet, hogy a kompetens sejteket érintkezésbe hozzuk a Cre rekombinázzal, vagy úgy, hogy a Cre rekombinázt kódoló gént a kompetens sejtekben kifejezzük. Előnyösen a Cre rekombinázt a sejtben a megfelelő gén expressziójának indukálásával állítjuk elő. így a rekombinázt kódoló gént előnyösen egy indukálható promoter irányítása alá helyezzük, vagy szabályozható formában szerkesztjük meg. Ebben a tekintetben előnyösen a Cre és a szteroidhormon- (ösztradiol, progeszteron stb.) kötő dómén közötti fúziót alkalmazunk, amely lehetővé teszi, hogy a Cre aktivitását szabályozzuk, és így a rekombinációs eseményt kiváltsuk [Metzger et al., PNAS 92, 6991 (1995)]. Általánosabban a rekombináz expresszióját szabályozhatjuk bármely erős szabályozott vagy nem szabályozott promoterrel. Az expressziós kazettát a kompetens sejtekbe transzfektálhatjuk, vagy a kompetens sejtek genomjába épíhetjük be, amint a példákban bemutatjuk.
A rendszer tehát lehetővé teszi, hogy olyan replikatív molekulákat hozzunk létre, amelyek kompetens sejtekben magas szinten termelik a vírust, többek között az adenovírust komplementáló funkciókat. Az ilyen típusú konstrukció különösen nagy mértékben hiányos genomok, különösen a késői génekben hiányos adenovírusgenomok komplementálására alkalmas. így egy találmány szerinti konstrukció egy olyan bakulovírus, amely genomjába beépített módon tartalmaz legalább egy DNS-területet, amelyet két azonos orientációban elhelyezett LoxP szekvencia határol, ahol az említett DNS-terület legalább egy, a kompetens sejtekben működőképes replikációs origót és egy adenovírust komplementáló funkciót kódoló nukleinsavat tartalmaz. Előnyösen a komplementáló funkciók az Ε1, E2 és E4 régiókban lévő közvetlen korai géneket vagy azok egy részét tartalmazzák. Még előnyösebben a komplementáló funkciók a késleltetett korai géneket és a közvetlen korai géneket tartalmazzák. Előnyösen a komplementáló funkciók lehetővé teszik egy olyan adenovírus komplementálását, amelyből minden virális kódoló funkció hiányzik. Részletesen a komplementáló funkciókat az adenovírusgenom összessége alkotja, az ITR-ek és a részecskeképződésért felelős terület kivételével. Egy változat szerint a komplementáló funkciókat egy teljes adenovírusgenom alkotja, amelyből azonban a részecskeképződésért felelős terület hiányzik (Ad.Psi-). Ez a genom tartalmazza az ITR-eket, melyek kivágódás után a genom replikációjáért felelősek a kompetens sejtekben.
Az episzomális molekula replikációjának biztosítására tartalmaz tehát az alkalmazott kompetens sejtekben működőképes replikációs origót. Ez a replikációs origó előnyösen az adenovírus saját ITR-szekvenciáiból áll, melyek a molekula nagymértékű amplifikációját teszik lehetővé. De szó lehet más replikációs origóról is, amely előnyösen lehetővé teszi a kompetens sejtben a vírusgenom több mint 20-szoros amplifikálását. Példaképpen említhetjük az EBV-vírus Ori/EBNA1 origóját vagy a papillomavírus E2 régióját. Természetesen az adenovírus ITR-szekvenciái előnyösek.
A találmány szerinti eljárás megvalósítására a helper bakulovírust vagy bakulovírusokat általában olyan fertőzési multiplicitással (MOI) alkalmazzuk, ami lehetővé teszi, hogy sejtek nagy populációját fertőzzük anélkül, hogy szignifikánsan lecsökkenne a sejtek életképessége. Ez általában 10 és 1000 közötti értéket jelent. A MOI a sejtenkénti vírusrészecskék számának felel meg. A MOl-t szakember könnyedén beállíthatja az alkalmazott kompetens sejtek függvényében, alapvetően két kritérium alapján: a fertőzés hatékonysága és az esetleges toxicitás. Előnyösen a bakulovírus esetében alkalmazott MOI 20 és 500 közötti.
A vírusgenom indukálása
Amint a korábbiakban leírtuk, a találmány szerinti eljárás tartalmazza a helper bakulovírus és a rekombináns vírusgenom bevezetését kompetens sejtekbe. Ebben a tekintetben a hiányos rekombináns adenovírusgenomot különböző módokon vezethetjük be a kompetens sejtbe.
Először is szó lehet tisztított hiányos rekombináns adenovírusról, amely előnyösen RCA-mentes. Ebben az esetben a kompetens sejteket a hiányos rekombináns adenovírussal és a helper bakulovírussal fertőzzük. A rekombináns adenovírussal történő fertőzés le9
HU 224 713 Β1 hetővé teszi, hogy a kompetens sejtbe a megfelelő genomot vezessük be, amely azután RCA-mentes, magas titerű vírussarzsok termeléséhez amplifikálódik és pakolódik. Ez a megvalósítási mód különösen első generációs vírusok (AdÁE1 ,AdAE1 ,E3) kialakítása esetében előnyös. Ezeket a vírusokat ugyanis nehéz magas titerben termelni RCA-szennyeződés nélkül. A találmány szerinti eljárás szerint egy első generációs hiányos rekombináns adenovírusból kiindulva koncentrált, megnövekedett minőségű sarzsokat kaphatunk úgy, hogy egy kompetens sejtet az E1 régiót tartalmazó bakulovírussal kotranszfektálunk. Ez a megvalósítási mód genomjuk két vagy három alapvető területében (E1, E2, E4 többek között) hiányos vírusok termelése esetében is előnyös. Általánosan ez a megvalósítási mód előnyös, mivel az adenovírusfertőzés hatékonysága nagyon magas (magasabb a DNS-transzfekció hatékonyságánál), és így lehetővé teszi koncentrált sarzsok előállítását. Ebben a megvalósítási módban a rekombináns vírust és a rekombináns bakulovírust olyan fertőzési multiplicitással (MOI) alkalmazzuk, amely lehetővé teszi, hogy nagy sejtpopulációt fertőzzünk anélkül, hogy ez a sejtek életképességét jelentősen lecsökkentené. A bakulovírus esetében alkalmazott MOI azonos a korábban említettel (10 és 1000 közötti). Ami az adenovírust illeti, a MOI előnyösen 1 és 1000, előnyösebben 1 és 500, még előnyösebben 1 és 100 közötti. Az adenovírus esetében alkalmazott MOI a választott sejttípustól függően is változhat. A megfelelő MOl-intervallumot egy szakember könnyen meghatározhatja például egy adenovírust és egy elkülönült markergént hordozó bakulovírust alkalmazva a fertőzési hatékonyság és az esetleges kompetíció mérésére. Előnyösen az adenovírus MOI 50-nél kisebb, például 1 és 20 közötti. Egy másik különösen előnyös megvalósítási mód szerint a hiányos rekombináns adenovírusgenomot DNS formájában vezetjük be. Ebben az esetben a genomot transzfekcióval vezetjük be, adott esetben a transzfekciót megkönnyítő szer jelenlétében (lipidek, kalcium-foszfát stb.). Az így bevezetett rekombináns genomot in vitro különböző eljárásokkal állíthatjuk elő, részletesen E. coliban [WO 96/25506] vagy élesztőben [WO 95/03400], Ez a megvalósítási mód különösen egy hiányos vírus első, RCA-mentes sarzsának előállítására alkalmas, melyet azután magas titerű sarzsok termelésére alkalmazhatunk az előző megvalósítási mód szerint.
A hiányos rekombináns adenovírusgenomot bevezethetjük egy rekombináns bakulovírus alkalmazásával is. Ebben a megvalósítási módban a hiányos rekombináns adenovírusgenomot in vitro állítjuk elő például a korábbiakban ismertetett módon, majd egy bakulovírusba vezetjük be egy, a kompetens sejtben kivágható kazetta formájában. Ebben a megvalósítási módban a kompetens sejteket érintkezésbe hozzuk a hiányos rekombináns adenovírus genomját hordozó bakulovírussal és egy vagy több helper (a komplementáló funkciókat hordozó) bakulovírussal. Ez a megvalósítási mód nagymértékben hiányos rekombináns adenovírusok termelése esetében különösen előnyös. A rendszernek köszönhetően ugyanis a kompetens sejtek populációjába nagy mennyiségben vezethetjük be egy időben a nagymértékben hiányos genomot és a megfelelő komplementáló funkciókat.
Ebben a tekintetben a találmány szerinti eljárás magában foglalja tehát kompetens sejtek fertőzését a hiányos rekombináns adenovírus genomját hordozó bakulovírussal és egy vagy több, a komplementáló funkciókat hordozó helper bakulovírussal. A megvalósítási módban alkalmazott MOI szintén 10 és 1000 közötti mindegyik alkalmazott bakulovírus esetében.
Minimális adenovírusok előállítására a szakirodalomban kéttípusú konstrukciót készítettek: (1) a transzgént (β-galaktozidáz) az ITR-ek közé klónozták, és mindezeket egy egyedi restrikciós hely határolta, vagy (2) a bal és jobb ITR-t azonos orientációban a transzgén 5’-végére klónozták [Fisher et al., Virology 217, 11 (1996); Kumar-Singh et al., Hűm. Mól. Génét. 5, 913 (1996)]. A minimális adenovírusokat 293 sejtekben termeltették a linearizált (1) vagy cirkularizált (2) DNS transzfektálásával, a minigenom replikációjához és pakolódásához szükséges virális fehérjéket egy helpervírus (AdAE1) szolgáltatta transz-helyzetben. A minimális adenovírusok úgy viselkedtek, mint interferáló hiányos részecskék (ID), és progresszíven amplifikálódtak az egymást követő passzázsok során. A módszer alkalmazásakor felmerülő fő probléma a kétféle termelődött részecske elválasztása, amely a vírussarzs helpervírussal történő szennyeződéséért felelős, és az így kapott minimális adenovírusok nagyon alacsony titere (alacsonyabb 10® pfu/ml-nél).
A bejelentés először teszi lehetővé, hogy minimális adenovírusokat termeljünk úgy, hogy egy bakulovírust alkalmazunk az adenovírus minigenom biztosításához, és egy másik bakulovírust a transzkomplementáló funkciók összességének szolgáltatásához (komplementálógenom).
A rekombináns adenovírusgenomot előnyösen két olyan szekvencia közé építjük be a bakulovírusba, amelyek helyspecifikus rekombinációt tesznek lehetővé a kompetens sejtekben, amint azt a helper bakulovírus esetében leírtuk.
A bejelentésben egy olyan minimális adenovírusokat termelő rendszert ismertetünk, amely egy bakulovírust alkalmaz az adenovírus minigenom biztosításához a ΙοχΡ/Cre rendszer segítségével, és egy másik bakulovírust a transzkomplementáló funkciók összességének szolgáltatásához (komplementálógenom) szintén egy Cre loxP rendszer segítségével (lásd a 2-4. ábrákat).
Egy másik megvalósítási mód szerint a komplementáló funkciók biztosításához alkalmazott helyspecifikus rekombinációs rendszer eltér a rekombináns adenovírusgenom szállításához alkalmazottól. Részletesen a LoxP/Cre rendszert alkalmazhatjuk a hiányos adenovírusgenom szállítására, és az AttP/AttB rendszert a komplementáló funkció vagy funkciók biztosításához.
A találmány szerinti eljárás így lehetővé teszi, hogy olyan adenovírusvektort hozzunk létre, amelyből minden
HU 224 713 Β1 virális kódolószekvencia deletált, és csak az ITR-eket és a részecskeképződésért felelős jelet tartalmazza (minimális adenovírus). Ez a vektor elméletileg 37 kb exogén szekvenciát is hordozhat, míg a jelenlegi vektorok klónozási kapacitása nem haladja meg a 8,5 kb-t. így lehetővé válhat a megcélzott szövetben történő optimális expresszió eléréséhez nagyméretű gének klónozása, amilyen például a disztrotin (14 kb), minden szabályozóelemükkel együtt (promoter, enhancer, intronok stb.). Ezenkívül az immunogén virális szekvenciák hiánya megnövelheti a transzgén expressziójának idejét nyugalomban lévő szövetekben.
A hiányos AAV vagy retrovírus genomját szintén vírus, genom vagy plazmid formájában vezethetjük be, a fentebb leírt módszerek szerint.
Kompetens sejtek
A találmány szerinti eljárást különböző sejttípusok alkalmazásával valósíthatjuk meg. A találmány keretein belül „kompetens sejten értünk egy sejtet, amely a bakulovírus és a termelendő vírus fertőzésére nézve permisszív, és lehetővé teszi ez utóbbi esetében a produktív vírusciklust. A sejtek fertőzési kapacitását ezekkel a vírusokkal egy markergént, például az E. coli LacZ gént kifejező rekombináns vírusok alkalmazásával határozhatjuk meg. Előnyösen emlőssejtekről van szó, még előnyösebben humán eredetű sejtekről. Az alkalmazott kompetens sejtek lehetnek nyugalomban lévő sejtek, vagy aktív osztódó sejtek, beállt sejtvonalak vagy primer tenyészetek. Előnyösen az ipari alkalmazás szempontjából megfelelő emlőssejtekről van szó, azaz amelyeknek nincs ismert patogén tulajdonsága, tenyészthetők, és adott esetben tárolhatók a megfelelő körülmények között. Az alkalmazott sejtek előnyösen máj-, izom-, fibroblaszt-, embrionális, idegi, epiteliális (tüdő-) vagy okuláris (retina-) sejtek. Nem korlátozó példaképpen említhetjük a 293 sejteket vagy bármely kiegészítő komplementáló funkciót hordozó származékát (293E4, 293E3a stb.), az A549 sejteket, a HuH7 sejteket, a Hep3B sejteket, a HepG2 sejteket, a humán retinoblasztómasejteket (HER911), a HeLa-sejteket, a 3T3 sejteket vagy a KB-sejteket.
A találmány szerinti eljárás megvalósításához a rekombináns vírus és a bakulovírus genomját a kompetens sejtpopulációba egyidejűleg vagy időben eltolva vezethetjük be. Előnyösen a sejteket egyszerre hozzuk érintkezésbe a rekombináns vírus és a helper bakulovírus genomjával. In vivő replikatív molekulákat termelő rendszer esetében a rekombinázt előzőleg, egy időben vagy később adagoljuk vagy fejezzük ki.
A vírusok termelése általában a sejtek líziséhez vezet. A termelt vírusokat tehát a sejtlízis után arathatjuk le, az ismert tisztítási eljárások szerint. Ezután különböző módon szerelhetjük ki, a kívánt felhasználástól függően. Másrészt, hogy a vírussarzs az adott esetben nyomokban jelen lévő, a kompetens sejtekbe nem bekerült bakulovírussal (helper bakulovírus vagy a rekombináns vírusgenomot szállító bakulovírus) történő szennyeződésének kockázatát elkerüljük, a következő eljárásokat alkalmazhatjuk:
- Az adenovírusokat tisztíthatjuk kromatográfiásan az FR 96/08164 számú francia iratban leírtak szerint. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy az adenovírust bármely adott esetben jelen levő maradvány bakulovírustól elválasszuk.
- Az is lehetséges, hogy szerves oldószerekkel (például éter, kloroform) kezeljük a tisztított adenovírussarzsot. A bakulovírus ugyanis lipidtartalmú burokkal rendelkező vírus (glikoproteinburok), tehát nagyon érzékeny minden szerves oldószerre (amelyek kivonják a lipideket a burokból), míg ezzel ellentétben, az adenovírusnak nincs lipidtartalmú burka, és ugyanazok az oldószerek nincsenek hatással arra.
- Az is lehetséges, hogy CsCI-gradiensen történő tisztítással sűrűségük alapján választjuk el az adott esetben jelen lévő maradvány bakulovírusokat és a rekombináns vírusokat.
A három módszert egymástól függetlenül vagy együtt alkalmazhatjuk. Másrészt bármely más szakember számra ismert módszert is alkalmazhatunk.
A vírusok alkalmazása
Az így termelt vírusokat kívánt gének in vitro, ex vivő vagy in vivő klónozásához, átviteléhez és expressziójához használhatjuk. Ilyen kívánt gének például az enzimeket, vérszármazékokat, hormonokat, limfokineket: interleukinek, interferonok, TNF stb. [FR 9203120], növekedési faktorokat, neurotranszmittereket vagy ezek prekurzorait vagy szintézisük enzimjeit, trofikus faktorokat: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 stb., az apolipoproteineket: ApoAI, ApoAlV, ApoE stb. [WO 94/25073], a disztrofint vagy egy minidisztrofint [WO 93/06223] kódoló gének, a tumorszupresszorgének: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev stb. [WO 94/24297], a véralvadásban részt vevő faktorokat kódoló gének: VII, Vili, IX stb. faktorok, az öngyilkos gének: timidin-kináz, citozin-dezamináz stb., vagy egy természetes vagy mesterséges immunglobulint vagy annak egy részét (Fab, ScFv stb.) [WO 94/29446] kódoló gének stb. A kívánt gén lehet egy antiszensz gén vagy szekvencia is, melynek a célsejtben a sejtes mRNS-sel komplementer RNS-sé történő expressziója gének expressziójának vagy a sejtes mRNS transzkripciójának szabályozását teszi lehetővé. Ilyen szekvenciák a célsejtben például a sejtes mRNS-sel komplementer RNS-sé íródhatnak át, és így gátolhatják annak fehérjévé történő transzlációját, az EP 140 308 számú szabadalmi iratban leírt eljárás szerint. A kívánt gén lehet egy antigén tulajdonságú peptidet kódoló gén is, amely immunválaszt képes kiváltani, vakcinák kialakítása céljából. Szó lehet többek között az Epstein-Barr-vírusra, a HIV-vírusra, a hepatitis B vírusra (EP 185 573), az Aujeszky-betegség vírusára vagy tumorokra [EP 259 212] specifikus antigén peptidekről. A gén lehet bármilyen DNS (gDNS, cDNS stb.), amely egy kívánt terméket kódol, beleértve adott esetben a megfelelő expressziós jeleket (promoter, terminátor stb.).
A vírusokat in vitro a rekombináns fehérjék termelésére alkalmazhatjuk. Szintén in vitro alkalmazhatók a fe11
HU 224 713 Β1 hérjék hatásmechanizmusának, vagy a génexpresszió szabályozásának vagy promoterek aktivitásának vizsgálatára. Szintén alkalmazhatók in vivő állatmodellek vagy transzgén állatok kialakítására. Alkalmazhatók gének in vivő átvitelére is állatokba vagy emberbe, gén- vagy sejtterápiás megközelítésekben.
A találmányt a következő példák segítségével ismertetjük részletesebben, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, csupán illusztrációként szolgálnak.
Az ábrák ismertetése
1. ábra: Harmadik generációs (E1 és E4 funkciókra hiányos) hiányos rekombináns adenovírus bakulo-E1,E4 alkalmazásával történő termelésének vázlata.
2-4. ábrák: Minimális adenovírus termelésének vázlata, amely a hiányos adenovírusgenom bevezetéséhez egy első bakulovírust alkalmaz, és egy második bakulovírust a komplementáló funkciók bevezetéséhez.
5. ábra: Rep és Cap funkcióiban hiányos rekombináns AAV bakulo Rep/Cap alkalmazásával történő termelésének vázlata.
Példák
1. példa
Alkalmazott sejtek
A találmány keretein belül alkalmazott sejtek bármely sejtvonalból vagy sejtpopulációból származhatnak, amely adenovírussal vagy AAV-vel vagy retrovírussal és bakulovírussal fertőzhető, és terápiás célú felhasználásra alkalmas. Különösen a következőket említhetjük meg:
- 293 sejtvonal:
A 293 sejtvonal humán embrionális vesesejtvonal, amely az 5 szerotípusú adenovírus (Ad5) genomjának bal szélét (körülbelül 11-12%) tartalmazza, amely magában foglalja a bal ITR-eket, a részecskeképződésért felelős szekvenciákat, az E1a és E1b területeket magában foglaló E1 régiót, a pIX proteint kódoló régiót és a plVa2 proteint kódoló terület egy részét [Graham et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]. A sejtvonal képes transzkomplementálni az E1 régióban hiányos rekombináns adenovírusokat, azaz amelyekből az E1 régió vagy annak egy része hiányzik, és képes magas titerű vírussarzsok termelésére.
- A549 sejtvonal:
Az A549 sejtekből kialakították az adenovírus E1 területét komplementáló sejteket [Imler et al., Gene Ther., 75 (1996)]. Ezek a sejtek az E1 régió csökkentett, a bal ITR nélküli fragmentumát tartalmazzák egy indukálható promoter irányítása alatt.
- HER-sejtvonal:
A humán embrionális retinasejtek (HER) fertőzhetők adenovírussal [Byrd et al., Oncogene 2, 477 (1988)]. Ezekből a sejtekből kialakított adenovírus részecskeképző sejteket írtak le például a WO 94/28152 számon közzétett bejelentésben, vagy Fallaux és munkatársai cikkében [Hűm. Gene Ther., 215 (1996)]. Részletesebben a 911 sejtvonalat említhetjük meg, amely az Ad5 adenovírus genomjának E1 régióját tartalmazza a 79. nukleotidtól az 5789. nukleotidig a HER-sejtek genomjába beépítve. Ez a sejtvonal E1 régiójában hiányos adenovírusok termelését teszi lehetővé.
- IGPR2 sejtek:
Az IGPR2 sejtek a 293 sejtekből az E4 régió egy indukálható promoter irányítása alá helyezett működőképes egységének beépítésével kapott sejtek. Ezek a sejtek E1 és E4 régiójukban hiányos vírusok termelését teszik lehetővé [Yeh et al., J. Virol., 70 (1996)].
- VK-sejtek:
A VK-sejteket 193 sejtekből kapták, a teljes, egy indukálható promoter irányítása alá helyezett E4 régió és a pIX fehérjét kódoló terület beépítésével. A sejtek E1 és E4 régiójukban hiányos vírusok termelését teszik lehetővé [Krougliak et al., Hűm. Gene Ther. 6, 1575 (1995)].
- 293E4 sejtek:
A 293E4 sejtek 293 sejtekből kapott sejtek, a teljes E4 régió beépítésével. Ezek a sejtek E1 és E4 régiójukban hiányos vírusok termelését teszik lehetővé [WO 95/02697; Cancer Gene Ther., 322 (1995)].
- Az Sf9 és Sf21 sejtek lepidoptera embrionális sejtek. Ezek, valamint tenyésztési körülményeik a sejtgyűjteményekben hozzáférhetők (ATCC CRL-1711). Kereskedelmi forgalomban is kaphatók (Gibco). Lásd még King és Possee: The baculovirus expression system, London, Chapman et Hall (1992).
- Humán hepatocita sejtek:
A HepG2, Hep3B és HuH7 sejtek humán hepatokarcinómaeredetű sejtvonalak. Sejtvonalgyűjteményekben hozzáférhetők, és tulajdonságaikat például az US 4 393 133 és az US 4 393 133 számú szabadalmakban írják le.
- Humán KB-sejtvonal: Humán epidermális karcinómaeredetű sejtvonal, amely a tenyésztését lehetővé tevő körülményekkel együtt az ATCC-nél hozzáférhető (CCL17 számon).
- Humán HeLa-sejtvonal: Humán epitéliumkarcinóma-eredetű sejtvonal, amely a tenyésztését lehetővé tevő körülményekkel együtt az ATCC-nél hozzáférhető (CCL2 számon).
- W162 sejtvonal: Ezek olyan Verő sejtek, melyek genomjukba beépítve tartalmazzák az Ad2 adenovírus E4 régióját. A sejteket Weinberg és munkatársai írták le [PNAS 80, 5383 (1983)].
2. példa
Humán sejtek fertőzése rekombináns bakulovírussal
A példa a bakulovírusok azon tulajdonságát ismerteti, hogy képesek humán eredetű sejteket fertőzni.
Humán sejteket (többek között 293 sejteket vagy azok származékait) a LacZ gént az RSV LTR-e irányítása alatt kifejező rekombináns bakulovírusoldat külön12
HU 224 713 Β1 böző hígításaival fertőztünk. 48 órával a fertőzés után a kék sejtek megjelenését kimutattuk, és ez azt mutatja, hogy a sejtek fertőzhetők bakulovírussal.
3. példa
Az adenovírus E1 régióját kifejező bakulovírus és a megfelelő hiányos adenovírus kialakítása
3.1. Az E1 két expressziós kazettájának klónozása
Az AE2 plazmid a következőképpen jött létre: a
PCRII-be (Invitrogen) klónoztuk a pBRE1-en az
5’-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3’ és
5’-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3’ oligonukleotidokkal végzett PCR termékét. Ez a PCRtermék az Ad5 3198-3511. nukleotidjait tartalmazza, azaz az E1B régió 5’-végét. A pBRE1 plazmid az Ad5 1-5788. nukleotidjait tartalmazza a pBR322-be klónozva, amelyből körülbelül az 1300-2300. nukleotidok deletáltak.
Az AE3 plazmid az AE2 PCR-terméket tartalmazó Notl-Kpnl fragmentumának a Notl-Kpnl-gyel emésztett pCDNA3-ba (Invitrogen) klónozásának eredménye. Az Ad5 3198-3511. nukleotidjait tartalmazza, melyet a BGH poliadenilációs helye követ.
Az AE4 plazmid az AE3 Bglll-Pvull fragmentumának a pBRE1-be klónozásának eredménye. Az AE4 a következő E1 expressziós kazettát tartalmazó plazmid:
- az Ad5 1-3511. nukleotidjai, azaz a bal ITR, részecskeképződésért felelős szekvenciák, E1A promoter, ELAgén, E1B promoter, E1B gén,
- a pCDNA3-ból származó szarvasmarha növekedési hormon (BGH) poliA.
A pBRE1-et BstNI-gyel emésztettük, majd T4 DNS-polimerázzal is kezeltük a túllógó 5’-végek betöltésére, majd Xbal-gyel emésztettük. Az így kialakított fragmentumot, amely az Ad5 391-1339. nukleotidjait tartalmazza, a Smal-Xbal-gyel (nem metilált hely) emésztett pic20H-ba építettük be, és így az AE5 plazmidot kaptuk.
Az AE6 plazmid az AE5 EcoRI-Smal fragmentumának az EcoRI-Smal-gyel emésztett AE4-be klónozásának eredménye. Az AE6 a következő E1 expressziós kazettát tartalmazó plazmid:
-az Ad5 391-3511. nukleotidjai, azaz csökkent méretű E1A promoter, E1A gén, E1B promoter, E1B gén,
- a pCDNA3-ból származó szarvasmarha növekedési hormon (BGH) poliA.
3.2. A két E1 kazetta klónozása bakulovírusba
Az AE4 és AE6 plazmidok EcoRI-Sphl fragmentumait (miután a túllógó 5’ Sphl véget előzőleg tompává tettük T4 DNS-polimerázos emésztéssel) a pAcSG2 (Pharmingen) plazmidba klónoztuk az EcoRI és EcoRV helyek közé. Ez az AE14 és AE15 plazmidokat hozta létre. Ebben a két esetben az E1 régió a polihedringén lokuszába van beépítve (a polihedringén és promoter deletált).
Az AE14 és AE15 plazmidokat az AcNPV törzsből (Pharmingen) származó BaculoGold bakulovírus DNS-sel kotranszfektáltuk Sf9 rovarsejtekbe, hogy kialakítsuk a BacAE14 és BacAE15 rekombináns bakulovírusokat, amelyek a két E1 expressziós kazettát hordozzák a polihedringén lokuszába beépülve.
3.3. Egy új E1 deléciót hordozó rekombináns adenovírus klónozása
A pCO1 plazmidot [WO 96/10088] BstXI-gyel emésztettük, majd a 3’ túllógó vég eltávolítására T4 DNSpolimerázzal kezeltük, majd Rsal-gyel emésztettük. Az így létrehozott fragmentumot, amely az Ad5 3513-4607. nukleotidjait tartalmazza, az EcoRV-tel linearizált és borjú alkalikus foszfatázzal emésztett pBS-SK+-ba (Stratagene) vezettük be, és így az AEO plazmidot hoztuk létre.
A pMA37 plazmidot a következő fragmentumok ligálásával kaptuk:
- A pXL2756 sacB-t tartalmazó EcoRV-Nsil fragmentuma. A pXL2756 az EcoRI és Kpnl helyeitől megfosztott SacB kontraszelekciós génnel, a kanamicinrezisztencia-génnel, egy multiklónozóhellyel és egy ColE1 replikációs origóval rendelkezik.
- A pCO1 Ndel-Nsil fragmentuma (az adenoszekvenciákat tartalmazza).
- A pXL2756 Sáli (a túllógó 5’-véget T4 DNS-polimerázzal betöltve)-Asel fragmentuma (kanamicinrezisztens vektor).
A pMA37 tehát tartalmazza:
- a kanamicinrezisztencia-gént,
- az expresszáló baktériumnak szacharózérzékenységet biztosító SacB gént,
- az Ad5 1-382 (Hinfl) szekvenciáit, melyeket az Ad5 3446-4415. (Nsil) szekvenciái követnek; transzgén nincs.
Az AE11 plazmidot az AEO Xhol-Nsil fragmentumának a Sall-Nsil-gyel emésztett pMA37-be történő bevezetésével hoztuk létre. Ez tartalmazza:
- a kanamicinrezisztencia-gént,
- az expresszáló baktériumnak szacharózérzékenységet biztosító SacB gént,
- az Ad5 1-382 (Hinfl) szekvenciáit, melyeket az Ad5 3513-4415. (Nsil) szekvenciái követnek; transzgén nincs.
Az AE11 plazmidból kiindulva ingázó öngyilkos vektorokat hoztunk létre (a kívánt transzgén beépítésével), amelyek E. coliban történő rekombinációval lehetővé teszik a rekombináns adenovírusok kialakulását. Az AE11 nem tartalmaz homológ szekvenciát az AE6-tal. Az AE11 és AE4 plazmidokban közös az Ad5 1-382. (Hinfl) szekvencia az E1A felett, de nincs homológia a két plazmid között az E1 kazetta alatt. így nem alakulhatnak ki RCA-k az AE11-ben lévő E1 deléciót hordozó adenovírus és a BacAE14 vagy BacAE15 bakulovírusok közötti homológ rekombinációval.
3.4. Első generációs rekombináns adenovírus kialakítása
Elsőként BacAE14 vagy 15 sarzsokat állítottunk elő a klasszikus módszerek szerint. Ezután a kompetens sejteket (például HuH7) 5 pg Pacl-gyel emésztett pXL2822 plazmiddal transzfektáltuk [a pXL2822 plazmid az egész Ad5-öt tartalmazza, amelyből az E1 (382-3446.) és az E3 (28 592-30 470.) deletált, és tartalmaz egy CMV-p-Gal kazettát], és egy időben vagy
HU 224 713 Β1 egymás után 10-1000 MOl-val fertőztük a BacAE14 vagy 15-tel. Amikor a sejtek lizáltak, a transzfekciós felülúszót begyűjtöttük, majd „friss” kompetens sejteknél alkalmaztuk az Ad2822 adenovírus amplifikálására, melyeket előzőleg vagy egy időben a BacAE14-gyel vagy 15-tel fertőztünk (MOI 10-1000), és így tovább egészen egy Ad2822 sarzs kialakulásáig. Az Ad2822 további amplifikációját megkönnyíti a lacZ gén jelenléte a vírusban. Minden amplifikációs lépésben a felülúszót a W162-re nézve „pszeudotitráltuk”. A vírus genomját az amplifikáció során vizsgáltuk, hogy igazoljuk integritását. Végül ez a stratégia azzal az előnnyel rendelkezik, hogy nem jöhetnek létre RCA-k az így termelt adenovírussarzsokban. A szennyeződés hiányát is igazoltuk.
4. példa
Az adenovírus E1 és E4 régióit kifejező bakulovírus kialakítása
4.1. E1,E4 bakulovírus (Bac.E1-E4) kialakítása
Az alkalmazott eljárás a következő: Az E1 és E4 régiókat ellentétes orientációban klónoztuk a polihedringén (Ph) lokuszába a pBacPAAK8 ingázó vektorba (Clontech, USA), és így a pBacE1-E4-et kaptuk. A rekombináns bakulovírust ezután a klasszikus módszerekkel izoláltuk a pBacE1-E4 és a BacPAK6 bakulovírus Sf9 sejtekbe történt kotranszfekciójával [Kitts et Possee, Biotechniques 14(5), 810 (1993)]. Az E1 és E4 régiók jelenlétét a rekombináns bakulovírusgenomban ezután PCR-rel igazoltuk a fertőzött Sf9 sejtekből kiindulva. Az E1 és E4 transzkripcióját a tisztított rekombináns bakulovírussal fertőzött Huh7 sejtekben RT-PCR-rel vizsgáltuk citoplazmatikus RNS-ből kiindulva.
Az E1-E4 bakulovírus kialakításához különböző E1 régiót hordozó fragmentumokat építhetünk be. A példában alkalmazott fragmentumok a 3. példában a bakulovírus-E1 esetében leírtakkal azonosak, és az E1 régiót saját promoterük (csökkentett E1 promoter és E1b promoter) irányítása alatt tartalmazzák. Az alkalmazott E4 fragmentumok a következők:
- Maell-Mscl 327 220-35 835. fragmentum, ami a teljes E4 régiót tartalmazza,
- Bglll-Pvull 34 115-33 126. fragmentum, ami az ORF6-ot tartalmazza,
- Bglll-Bglll 34 115-32 490. fragmentum, ami az ORF6-ORF6/7-et tartalmazza,
- Pvull-Alul 34 801-334 329. fragmentum, ami az ORF3-at tartalmazza.
A fragmentumokat vagy az E4 promoter irányítása alá helyeztük, vagy más promoter, többek között a HSV-TK, DNV vagy LTR-RSV promoterek irányítása alá.
Az itt megadott helyzetek a vad típusú Ad5 adenovírus szekvenciájára hivatkoznak, amint azt publikálták és adatbázisokban hozzáférhető. Bár bizonyos kisebb eltérések létezhetnek a különböző szerotípusú adenovírusok között, ezek a helyzetek azonban általában átvihetők más szerotípusokra, többek között az Ad2, Ad7, Ad12 és AdCAV-2-re.
4.2. Az AdAE1í\E4-LacZ transzkomplementálása a
Bac.E1-E4-gyel
Az AdAE1AE4-LacZ termelését úgy értük el, hogy a kompetens sejtekbe a 4.1. példa szerint előállított E1,E4 bakulovírust vezettük be (lásd az 1. ábrát). Megvizsgáltuk az AdAE1AE4-LacZ tisztított Bac.E1-E4-gyel történő transzkomplementálással való termelésének optimális körülményeit kompetens sejtekben. Az AdAE1AE4-LacZ titerét β-galaktozidáz transzdukciós egységek számában (t.d.u.) határoztuk meg W162 sejtvonalban, és a kapott transzkomplementálási hatékonyságot az IGPR2 részecskeképző sejtvonaléval hasonlítottuk össze.
5. Az adenovírusgenom egészét komplementáló bakulovírus kialakítása
Bár több protein egyidejű expresszióját, amely 13 kb szekvenciát is jelenthet, már leírták egyetlen vírusból [Belyaev et Roy, NAR 21, 1219 (1993)], a bakulovírusklónozás maximális kapacitása nem nagyon dokumentált. A példa azt mutatja be, hogy klónozhatjuk a részecskeképző szignáljától megfosztott (Ad.Psi-) adenovírusgenomot két loxP hely között [loxP-ITR-ITR-től E4-ig-loxP] a bakulovírusba. A Cre rekombinázt indukálható vagy nem indukálható módon kifejező kompetens sejtek (Cre vagy Cre-ER sejtvonalak, lásd 7. példa) fertőzése ezzel a rekombináns bakulovírussal és a Cre rekombináz aktiválása lehetővé teszi az adenovírusgenom kivágódását és cirkularizálódását. Ez azután képes átírni a korai géneket, replikálódni, és a késői géneket aktiválni, de nem képes részecskéket kialakítani, és így helperként szolgál a minimális adenovírus termelése során (lásd a 2-4. ábrákat). Ebben a rendszerben a minimális adenovírusok termelése két bakulovírussal történő fertőzésen, és két loxP helyek közötti rekombinációs esemény megvalósulásán alapul. Ez a megközelítés azzal az előnnyel rendelkezik, hogy nem hoz létre adenovírusrészecskéket a helpervírusból.
Az Ad.Psi- genom kialakítását E. coliban végeztük. Ehhez az Ad5 adenovírus teljes genomját egy prokarióta klónozóvektorba klónoztuk, a szomszédos ITR-ekkel együtt. A Psi szekvenciát enzimatikus hasítással és ligálással, vagy irányított mutagenezissel deletáltuk. Ezután egy LoxP szekvenciát vezettünk be az adenovírusgenom mindkét oldalára, azonos orientációban. A kapott szerkezetet (loxP-ITR-ITR-APsi-től E4-ig-loxP) ezután egy ingázó vektorba klónoztuk, amely lehetővé teszi a rekombinációt egy bakulovírussal, a 3. példában leírt módszer szerint. A kapott rekombináns bakulovírust, melynek neve BacAd.Psi-, a klasszikus módszerek szerint izoláltuk.
6. példa
A hiányos adenovírusgenomot kivágható formában tartalmazó bakulovírus kialakítása A példa egy olyan bakulovírus kialakítását ismerteti, amely lehetővé teszi kompetens sejtekben a hiányos adenovírusgenom szállítását. Pontosabban a rekombináns adenovírusból az összes kódolórégió hiányzik, és csak az ITR-ek és a Psi maradt meg (minimális adenovírus vagy AdA).
HU 224 713 Β1
6.1. A minigenom (AdA) kialakítása E. coliban
Kialakítottunk egy p(loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMVLacZ-pA)-loxP) plazmidot. Ehhez az adenovírus ITR-szekvencia egy másolatát izoláltuk enzimatikus emésztéssel és/vagy amplifikáltuk PCR-rel, majd a 5 pGY63 adenovírus ingázó vektorban lévő ITR-Psi szekvencia fölé klónoztuk. Ez a vektor a pCO1-ből származik [WO 96/10088], és tartalmazza a LacZ gént a citomegalovírus közvetlen korai promoterének irányítása alatt (P.CMV), az SV40 vírus poliadenilációs helyével (pA) lezárva, mindez az ITR-Psi és a pIX-et kódoló gén közé klónozva. A vektor (ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA) területét (amely egy minimális adenovírus genomjának felel meg) ezután enzimatikus hasítással izoláltuk, és a pBS246 plazmid (Gibco) multiklónozóhelyében lévő 15 LoxP helyek közé klónoztuk, és így a p(loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP) plazmidot hoztuk létre. Ezután teszteltük az adenovírus minigenom termelésének és pakolódásának képességét cirkuláris DNS-ből kiindulva, a plazmidnak a Cre rekombinázt kifejező AdAElAE4-gyel (AdCre) fertőzött IGPR2 sejtvonalba történő transzfekciójával. A minimális adenovírusokat amplifikáltuk a transzfekciós felülúszónak néhány egymást követő IGPR2 sejtvonalba történő átoltásával. Ezután tisztítottuk cézium-klorid-gradiensen történő izo- 25 piknikus centrifugálással, és mennyiségét pszeudotitrálással határoztuk meg W162 sejtvonalon. Természetes, hogy a LacZ gént könnyen helyettesíthetjük bármely más kívánt nukleinsawal, a molekuláris biológia klasszikus módszereit alkalmazva.
6.2. A kivágható minigenom klónozása egy bakulovirusba
Az AdA minigenomot a két loxP hely között tartalmazó fentebb leírt szerkezetet a bakulovírus P10 lokuszába klónoztuk a pAcUWI ingázó vektorba (Pharmin- 35 gén, USA). Az így termelődött Bac.AdA bakulovírust ezután a klasszikus módszerek szerint termeltük és izoláltuk Sf9 sejtek kotranszfektálásával, a korábban leírtak szerint, és felületük fenotípusa alapján (fehér) szelektáltuk azokat, X-Gal festés után. A bakulovírus tehát tartalmazza a nagymértékben hiányos adenovírusgenomot, melyet két azonos orientációjú loxP hely fog közre.
6.3. Az Ad A termelése a BacAdPsi- bakulovírussal történő transzkomplementálással Kompetens sejteket fertőztünk egyszerre a BacAdPsi- bakulovírussal (az 5. példában írtuk le), amely az adenovírusgenom transzkomplementáló funkcióinak összességét hordozza, és a Bac.AdA bakulovírussal (fentebb írtuk le), amely a pszeudoadenovírusgeno- 50 mot hordozza. A Cre rekombinázt vagy a fehérje tápközeghez adagolásával, vagy a sejteknek egy, a Cre-t kifejező plazmiddal vagy vírussal (bakulovírus) történő transzfekciójával, vagy a sejtvonal genomjába stabilan beépült kazetta expressziójával (például a 7. példában leírt) biztosítottuk. A minimális adenovírust a BacAd.Psi- bakulovírussal és a felülúszóval fertőzött sejttenyészet felülúszójának egymás utáni átoltásával amplifikáltuk, majd tisztítottuk és titráltuk a korábban idézett 10 eljárások szerint. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy egyetlen vírusként az AdA-t kapjuk meg, ami lehetővé teszi ennek izolálását és tisztítását a klasszikus módszerekkel. Ezenkívül a kapott titer ipari alkalmazásra megfelelő.
7. A Cre fehérjét kifejező sejtvonal kialakítása
Létrehoztunk egy, a Cre fehérjét indukálható vagy nem indukálható módon kifejező sejtvonalat, a találmány szerinti bakulovírusban (például a Bac.AdA és a 20 BacAd.Psi-) a loxP helyek közötti rekombináció hatékonyságának megnövelésére és a Cre kifejeződésének szabályozására. Ebben a szerkezetben a Cre egymagában fejeződik ki, vagy egy C-terminálisán az ösztradiolreceptor (ER)-kötő doménnel fuzionált formában [Metzger et al. (1996), korábban idézve], egy általános, előnyösen erős, indukálható vagy nem indukálható promoter irányítása alatt. Részletesebben az alkalmazott promoterek a pGRE5 promoter, a metallotioninpromoter, az SV40 promoter vagy a HSV-TK-gén promo30 tere.
Az ilyen Cre sejtvonalak kialakításához a kompetens sejteket két plazmiddal kotranszfektáltuk, az egyik tartalmazta a Cre expressziós kazettát (Cre vagy Cre-ER), a másik egy szelekciós marker expressziós kazettáját (Neo). A G418 rezisztens kiónokat szelektáltuk, a Cre-aktivitást a p(P.CMV-loxP-ATG.stop-pALoxP-LacZ) plazmid kiónokba történő transzfektálásával teszteltük. Ez a plazmid a LacZ gént tartalmazza, amely inaktivált, mivel a promoter (P.CMV) és a LacZ 40 kezdete közé három leolvasási fázisban stopkodonokat és az SV40 vírus poliadenilációs helyét építettük be, melyeket két loxP hely határol. A Cre expresszióját a kiónokban induktor (ösztradiol) jelenlétében vagy hiányában a β-galaktozidáz-aktivitás alapján mutattuk ki, 45 melyet a két loxP hely közötti rekombináció vált ki. így több olyan kiónt szelektáltunk, amely stabilan kifejezi a Cre-ER fúziós fehérjét vagy önmagában a Cre fehérjét a lentebb megadott promoterekkel és kompetens sejtekkel. Ezek a kiónok alkalmasak a találmány szerinti vírusok termelésére.
| Kompetens sejtek | HSV-TK promoter | SV40 promoter | MMTV promoter | GRE5 promoter | ||||
| Rekombináz | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER |
| 293 | #1 | #7 | #13 | #19 | #25 | #31 | #37 | #43 |
| IGPR2 | #2 | #8 | #14 | #20 | #26 | #32 | #38 | #44 |
| Huf7 | #3 | #9 | #15 | #21 | #27 | #33 | #39 | #45 |
HU 224 713 Β1
Táblázat (folytatás)
| Kompetens sejtek | HSV-TK promoter | SV40 promoter | MMTV promoter | GRE5 promoter | ||||
| Rekombináz | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER |
| HepG2 | #4 | #10 | #16 | #22 | #28 | #34 | #40 | #46 |
| HER | #5 | #11 | #17 | #23 | #29 | #35 | #41 | #47 |
| Vera | #6 | #12 | #18 | #24 | #30 | #36 | #42 | #48 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (23)
1. Eljárás hiányos rekombináns vírusok előállítására, azzal jellemezve, hogy kompetens sejtpopulációba bevezetünk egy hiányos rekombináns vírusgenomot és egy bakulovírust, amely a hiányos rekombináns vírusgenom transzkomplementálásához szükséges funkciók összességét vagy azok egy részét hordozza, a funkciók másik részét egy vagy több másik bakulovírus és/vagy a kompetens sejt szolgáltatja.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakulovírus a hiányos rekombináns vírusgenom transzkomplementálásához szükséges funkciók összességét hordozza.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakulovírus a hiányos rekombináns vírusgenom transzkomplementálásához szükséges funkciók egy részét hordozza, a funkciók másik részét a kompetens sejt szolgáltatja.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hiányos rekombináns vírusgenom transzkomplementálásához szükséges funkciókat több bakulovírus hordozza.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hiányos rekombináns vírus egy hiányos rekombináns adenovírus.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírus genomja az E1, E2, E3, E4, L1-L5, pIX és IVa2 funkciók közül egy vagy több funkcióban hiányos, és a bakulovírus a hiányos rekombináns genom transzkomplementálásához szükséges funkciók összességét hordozza.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírus genomja az E1, E2, E3, E4, L1-L5, pIX és IVa2 funkciók közül egy vagy több funkcióban hiányos, és a bakulovírus a hiányos rekombináns genom transzkomplementálásához szükséges funkciók egy részét hordozza, a funkciók másik részét egy vagy több másik bakulovírus és/vagy a kompetens sejt szolgáltatja.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírusgenom E1 régiójában hiányos, és a bakulovírus az adenovírus E1 régióját vagy annak egy részét hordozza.
9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírusgenom E2 régiójában hiányos, és a bakulovírus az adenovírus E2 régióját vagy annak egy részét hordozza.
10. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírusgenom az E4 régiójában hiányos, és a bakulovírus az adenovírus E4 régióját vagy annak egy részét hordozza.
11. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírusgenom E1 és E4 régióiban hiányos, és a bakulovírus az adenovírus E1 és E4 régióját vagy azok egy részét hordozza.
12. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírus genomjából minden virális kódolórégió hiányzik, és a bakulovírus ezek transzkomplementálásához szükséges funkciók összességét hordozza.
13. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakulovírus az adenovírusgenom összességét hordozza, a részecskeképződésért felelős terület és adott esetben az ITR-ek kivételével.
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakulovírusban jelen lévő komplementáló funkciók és a hiányos rekombináns vírusgenom nem tartalmaznak olyan homológ területeket, ahol rekombináció végbemehet.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kompetens sejtekbe bevezetünk egy E1 és adott esetben E3 régiójában hiányos rekombináns adenovírusgenomot, a sejteket egyidejűleg vagy elkülönülten egy, az adenovirális E1 régiót hordozó bakulovírussal fertőzzük, ahol a bakulovírusban jelen lévő adenovirális E1 régió és a hiányos rekombináns adenovírusgenom nem tartalmaz olyan homológ területeket, ahol rekombináció mehet végbe.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakulovírus az Ad5 adenovírusgenom 391-3511. nukleotidjait tartalmazó fragmentumát hordozza, és az E1 régióban hiányos rekombináns adenovírus ennél nagyobb deléciót hordoz.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakulovírus az Ad5 adenovírusgenom 391-3511. nukleotidjait tartalmazó fragmenst hordozza, és a hiányos rekombináns adenovírus az E1 régiójában a 383-3512. nukleotidokat magában foglaló deléciót hordozza.
18. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hiányos rekombináns vírusgenomot a sejtbe
HU 224 713 Β1 az említett genomot hordozó adenovírussal történő fertőzés útján vezetjük be.
19. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hiányos rekombináns vírusgenomot a sejtbe transzfekcióval vezetjük be.
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hiányos rekombináns vírusgenomot a sejtbe a komplementáló funkciókat hordozó bakulovírustól eltérő rekombináns bakulovírussal vezetjük be.
21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kompetens sejtpopuláció májsejtek, izomsejtek, fibroblasztok, embrionális sejtek, epiteliális sejtek, okuláris sejtek vagy idegsejtek populációja.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az epiteliális sejtek tüdő epiteliális sejtek és az
5 okuláris sejtek retinasejtek.
23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kompetens sejtek populációját 293 sejtek vagy ezek bármely kiegészítő komplementáló funkciót hordozó származéka, az A549, HuH7,
10 Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa- vagy KB-sejtek közül választjuk ki.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9614278A FR2756297B1 (fr) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | Procede de production de virus recombinants |
| PCT/FR1997/002073 WO1998022607A1 (fr) | 1996-11-22 | 1997-11-18 | Procede de production de virus recombinants |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001762A2 HUP0001762A2 (hu) | 2000-09-28 |
| HUP0001762A3 HUP0001762A3 (en) | 2002-01-28 |
| HU224713B1 true HU224713B1 (en) | 2006-01-30 |
Family
ID=9497899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001762A HU224713B1 (en) | 1996-11-22 | 1997-11-18 | Method for producing recombinant virus |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6387670B1 (hu) |
| EP (1) | EP0946741B1 (hu) |
| JP (1) | JP4686670B2 (hu) |
| KR (1) | KR100719645B1 (hu) |
| AT (1) | ATE317908T1 (hu) |
| AU (1) | AU731106B2 (hu) |
| BR (1) | BR9713388B1 (hu) |
| CA (1) | CA2271438C (hu) |
| CZ (1) | CZ293947B6 (hu) |
| DE (1) | DE69735274T2 (hu) |
| ES (1) | ES2260803T3 (hu) |
| FR (1) | FR2756297B1 (hu) |
| HU (1) | HU224713B1 (hu) |
| IL (1) | IL129686A (hu) |
| NO (2) | NO323937B1 (hu) |
| SK (1) | SK286900B6 (hu) |
| WO (1) | WO1998022607A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA9710516B (hu) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2375119A1 (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-07 | Genovo, Incorporated | Compositions and methods for production of recombinant virus using a carrier vector derived from a nonmammalian virus |
| US6793926B1 (en) | 1999-05-27 | 2004-09-21 | Genovo, Inc. | Methods for production of a recombinant adeno-associated virus |
| AU5448400A (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-18 | Mount Sinai School Of Medicine, The | A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors |
| GB9919409D0 (en) | 1999-08-18 | 1999-10-20 | Univ Oxford Brookes | Baculovirus expression system |
| JP2006515162A (ja) | 2002-08-29 | 2006-05-25 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 環状核酸ベクター、ならびに同ベクターの作製法および使用法 |
| GB0702695D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Production of vectors |
| GB0702694D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Vectors |
| EP2019143A1 (en) | 2007-07-23 | 2009-01-28 | Genethon | CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors |
| EP2058401A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-05-13 | Genethon | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors |
| EP2249950B1 (en) * | 2008-03-05 | 2014-10-15 | Council of Scientific & Industrial Research | A polymeric hybrid membrane |
| EP2287323A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Association Institut de Myologie | Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors |
| EP2292781A1 (en) | 2009-08-17 | 2011-03-09 | Genethon | Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions |
| CN102884196B (zh) * | 2010-04-01 | 2015-05-06 | 肖卫东 | 重组病毒载体的结构及其制备 |
| JP2013523175A (ja) | 2010-04-14 | 2013-06-17 | イーエムディー・ミリポア・コーポレーション | 高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法 |
| US9677088B2 (en) | 2012-05-09 | 2017-06-13 | Oregon Health & Science University | Adeno associated virus plasmids and vectors |
| TWI702955B (zh) | 2012-05-15 | 2020-09-01 | 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 | 使用腺相關病毒（ａａｖ）ｓｆｌｔ-１治療老年性黃斑部退化（ａｍｄ） |
| CA2877428A1 (en) | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Association Institut De Myologie | Widespread gene delivery of gene therapy vectors |
| EP3039129B1 (en) * | 2013-08-30 | 2018-06-27 | Amgen Inc. | High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells |
| AU2015231439B2 (en) | 2014-03-17 | 2019-11-14 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells |
| KR20170137730A (ko) | 2015-03-02 | 2017-12-13 | 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 망막 추상체에 폴리뉴클레오타이드의 유리체 내 전달을 위한 조성물 및 방법 |
| GB2545763A (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Adverum Biotechnologies Inc | Mutant viral capsid libraries and related systems and methods |
| JP2021503960A (ja) | 2017-11-27 | 2021-02-15 | コーダ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド | 神経疾患のための組成物および方法 |
| US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
| WO2019161365A1 (en) | 2018-02-19 | 2019-08-22 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for restoring f8 gene function and methods of use thereof |
| WO2020160508A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Oregon Health & Science University | Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids |
| WO2021035179A1 (en) | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Coda Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for neurological diseases |
| TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
| GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
| JP2023545731A (ja) | 2020-10-07 | 2023-10-31 | アスクレピオス バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド | 肢帯型２ｉ（ｌｇｍｄ２ｉ）を含むジストログリカノパチー障害を処置するためのフクチン関連タンパク質（ｆｋｒｐ）の治療的アデノ随伴ウイルス送達 |
| WO2023212298A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease |
| WO2023212294A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof |
| WO2023212293A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0441897A4 (en) * | 1988-11-14 | 1992-06-24 | Us Health | Parvovirus capsids |
| US5559099A (en) * | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| AU702830B2 (en) * | 1994-09-23 | 1999-03-04 | General Hospital Corporation, The | Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell |
-
1996
- 1996-11-22 FR FR9614278A patent/FR2756297B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-18 BR BRPI9713388-4A patent/BR9713388B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 DE DE69735274T patent/DE69735274T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 JP JP52328298A patent/JP4686670B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 AU AU52261/98A patent/AU731106B2/en not_active Expired
- 1997-11-18 CZ CZ19991822A patent/CZ293947B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 HU HU0001762A patent/HU224713B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1997-11-18 WO PCT/FR1997/002073 patent/WO1998022607A1/fr active IP Right Grant
- 1997-11-18 CA CA2271438A patent/CA2271438C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 AT AT97947083T patent/ATE317908T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 US US09/308,398 patent/US6387670B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 ES ES97947083T patent/ES2260803T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 KR KR1019997004531A patent/KR100719645B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 EP EP97947083A patent/EP0946741B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 IL IL12968697A patent/IL129686A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 SK SK666-99A patent/SK286900B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-11-21 ZA ZA9710516A patent/ZA9710516B/xx unknown
-
1999
- 1999-05-21 NO NO19992464A patent/NO323937B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-09 US US10/141,491 patent/US20030022356A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-04-15 NO NO2013009C patent/NO2013009I1/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL129686A0 (en) | 2000-02-29 |
| CZ182299A3 (cs) | 1999-08-11 |
| IL129686A (en) | 2005-12-18 |
| HUP0001762A2 (hu) | 2000-09-28 |
| KR20000057202A (ko) | 2000-09-15 |
| SK286900B6 (sk) | 2009-07-06 |
| AU5226198A (en) | 1998-06-10 |
| KR100719645B1 (ko) | 2007-05-17 |
| ATE317908T1 (de) | 2006-03-15 |
| CZ293947B6 (cs) | 2004-08-18 |
| FR2756297B1 (fr) | 1999-01-08 |
| FR2756297A1 (fr) | 1998-05-29 |
| US6387670B1 (en) | 2002-05-14 |
| SK66699A3 (en) | 2000-02-14 |
| CA2271438A1 (fr) | 1998-05-28 |
| NO992464D0 (no) | 1999-05-21 |
| NO2013009I1 (no) | 2013-04-29 |
| NO992464L (no) | 1999-06-23 |
| DE69735274T2 (de) | 2006-10-12 |
| JP4686670B2 (ja) | 2011-05-25 |
| NO323937B1 (no) | 2007-07-23 |
| AU731106B2 (en) | 2001-03-22 |
| HUP0001762A3 (en) | 2002-01-28 |
| ES2260803T3 (es) | 2006-11-01 |
| JP2001503993A (ja) | 2001-03-27 |
| WO1998022607A1 (fr) | 1998-05-28 |
| BR9713388B1 (pt) | 2009-01-13 |
| CA2271438C (fr) | 2010-10-26 |
| DE69735274D1 (de) | 2006-04-20 |
| EP0946741B1 (fr) | 2006-02-15 |
| ZA9710516B (en) | 1998-06-10 |
| EP0946741A1 (fr) | 1999-10-06 |
| BR9713388A (pt) | 2000-03-21 |
| US20030022356A1 (en) | 2003-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4686670B2 (ja) | 組換えウイルスの製造方法 | |
| US6878549B1 (en) | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy | |
| HU224679B1 (hu) | Rekombináns adenovírusok és felhasználásuk adeno-asszociált vírusok (AAV) előállítására, komplementáló sejtvonalak és a rekombináns adenovírusokat tartalmazó gyógyszerkészítmények | |
| SK282843B6 (sk) | Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom | |
| US20070166286A1 (en) | Self-rearranging DNA vectors | |
| US6630322B1 (en) | Generating replicating molecules in vivo | |
| WO2000073424A1 (en) | A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors | |
| MXPA99004449A (en) | Method for producing recombinant virus | |
| CA2388365A1 (en) | Helper vectors and cell lines for the production of pseudoadenoviral vectors | |
| WO2000072887A1 (en) | A novel packaging cell line for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors | |
| AU7560500A (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy | |
| KR100537142B1 (ko) | 복제성분자의 생체내 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20051206 |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR Free format text: FORMER OWNER(S): CENTELION, FR; GENCELL SA,, FR; RHONE-POULENC RORER S.A., FR |
|
| AA1S | Information on application for a supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: ALIPOGENE TIPARVOVEC (GLYBERA: DEFECTIVE ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR CARRYING A LIPOPROTEIN LIPASE, PRODUCED IN A BACULOVIRUS); REG. NO/DATE: EU/1/12/791/001 20121025 Spc suppl protection certif: S1300013 Filing date: 20130422 Expiry date: 20171118 |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: SANOFI, FR Free format text: FORMER OWNER(S): AVENTIS PHARMA S.A., FR; CENTELION, FR; GENCELL SA,, FR; RHONE-POULENC RORER S.A., FR |