JP2006515162A - 環状核酸ベクター、ならびに同ベクターの作製法および使用法 - Google Patents
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Abstract
持続的で高レベルのタンパク質発現を可能とする環状核酸ベクターを提供する。本発明の環状ベクターは、発現サイレンシング細菌配列を欠くことを特徴とし、また多くの態様では、対象となるベクターは、発現カセットに加えて一方向性の部位特異的組換え産物のハイブリッド配列を含む。対象となるベクターを、核酸(例えば発現カセット)の標的細胞への導入に用いる方法、ならびにこのような方法を実施するための調製物も提供する。対象となる方法および組成物は、研究応用および治療応用の両方を含む、多種多様な応用に使用できる。対象となる方法に使用するベクターを作製するための、効率が極めて高くて容易にスケールアップ可能な方法、ならびにこの方法を実施するための試薬およびキット/系も提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、参照として本明細書に組み入れられる、2002年8月29日に出願された米国仮特許出願第60/407,344号、および2003年4月16日に出願された米国仮特許出願第60/463,672号の申請日に先だって優先権を主張する(35 U.S.C. §119(e)に準拠)。
本出願は、参照として本明細書に組み入れられる、2002年8月29日に出願された米国仮特許出願第60/407,344号、および2003年4月16日に出願された米国仮特許出願第60/463,672号の申請日に先だって優先権を主張する(35 U.S.C. §119(e)に準拠)。
導入
発明の分野
本発明の分野は分子生物学であり、特に形質転換、また具体的には形質転換に使用されるベクターである。
発明の分野
本発明の分野は分子生物学であり、特に形質転換、また具体的には形質転換に使用されるベクターである。
発明の背景
「形質転換」として知られる、外因性の核酸配列(例えばDNA)の細胞への導入は、研究応用、合成応用、および治療応用を含むさまざまな生物工学および関連する応用に重要な役割を果たす。形質転換が重要な役割を果たす研究応用は、トランスジェニック細胞およびトランスジェニック動物の作製を含む。形質転換が重要な役割を果たす合成応用は、ペプチドおよびタンパク質、ならびに干渉RNAやリボザイムなどの治療用RNAの作製を含む。形質転換が重要な役割を果たす治療応用は遺伝子治療応用を含む。上記および他の応用では、形質転換が広い役割を果たすので、多種多様な形質転換プロトコルが開発されている。
「形質転換」として知られる、外因性の核酸配列(例えばDNA)の細胞への導入は、研究応用、合成応用、および治療応用を含むさまざまな生物工学および関連する応用に重要な役割を果たす。形質転換が重要な役割を果たす研究応用は、トランスジェニック細胞およびトランスジェニック動物の作製を含む。形質転換が重要な役割を果たす合成応用は、ペプチドおよびタンパク質、ならびに干渉RNAやリボザイムなどの治療用RNAの作製を含む。形質転換が重要な役割を果たす治療応用は遺伝子治療応用を含む。上記および他の応用では、形質転換が広い役割を果たすので、多種多様な形質転換プロトコルが開発されている。
多くの形質転換応用では、外因性のDNAを、同DNAにコードされたタンパク質の長期発現を可能とするように導入することが望ましい。外因性のDNAの長期発現は主に、外因性のDNAが標的細胞のゲノムに組込まれることで達成される。ゲノムへの組込みを可能とする1つの手段は、相同組換えを可能とするベクターを用いることである。相同組換えに依存する手法は、必要な相同性が常に存在するわけではない(つまり組換えが緩やかにしか生じない)ことなどから不利益をもたらす場合がある。したがって、相同組換えに基づくプロトコルは完全とは言えない。
したがって、ウイルスベクターを用いて外因性のDNAを細胞に導入後に、導入DNAが標的細胞のゲノムに組込まれる、別のウイルスベースの形質転換プロトコルが開発されている。使用可能なウイルスベースのベクターには、レトロウイルスのベクター(例えばモロニーマウス白血病ウイルスを元にしたベクター)などがある。使用可能な他のウイルスベースのベクターには、アデノウイルス由来のベクター、HSV由来のベクター、シンドビスウイルス由来のベクターなどがある。ウイルスベクターにはいくつかの長所があるものの、その使用は多くの状況で最適とは言えない。ウイルスベースのベクターの短所には、免疫原性、ウイルスに起因する合併症、ならびに組込みに伴う変異の問題などがある。
したがって、細胞を外因性の核酸で形質転換して、コードタンパク質の持続的な長期発現を可能とするさらなる方法の開発には関心が現在でも寄せられている。特に関心が寄せられるのは、ゲノムに組込まれることなく持続的なタンパク質の発現を可能とする、非ウイルス性のインビボ核酸輸送プロトコルおよびベクターの開発である(この場合ベクターは、ベクター上に存在する発現カセットの配列および方向に依存しないように持続的な発現を可能とする)。
発明の概要
持続的で高レベルのタンパク質発現を可能とする環状核酸ベクターを提供する。本発明の環状ベクターは、発現サイレンシング細菌配列を欠くことを特徴とし、また多くの態様では、本発明のベクターは、発現カセットに加えて一方向性の部位特異的組換え産物配列を含む。本発明のベクターを、核酸(例えば発現カセット)の標的細胞への導入に用いる方法、ならびに、このような方法を実施する際に使用される調製物も提供する。対象となる方法および組成物は、研究応用および治療応用の両方を含む多種多様な応用に使用できる。また、このようなベクターを作製する方法、ならびに同ベクターを作製するための試薬およびキット/系も提供する。
持続的で高レベルのタンパク質発現を可能とする環状核酸ベクターを提供する。本発明の環状ベクターは、発現サイレンシング細菌配列を欠くことを特徴とし、また多くの態様では、本発明のベクターは、発現カセットに加えて一方向性の部位特異的組換え産物配列を含む。本発明のベクターを、核酸(例えば発現カセット)の標的細胞への導入に用いる方法、ならびに、このような方法を実施する際に使用される調製物も提供する。対象となる方法および組成物は、研究応用および治療応用の両方を含む多種多様な応用に使用できる。また、このようなベクターを作製する方法、ならびに同ベクターを作製するための試薬およびキット/系も提供する。
特定の態様の記述
持続的で高レベルのタンパク質発現を可能とする環状核酸ベクターを提供する。本発明の環状ベクターは、発現サイレンシング細菌配列を欠くことを特徴とし、また多くの態様では、対象となるベクターは、発現カセットに加えて一方向性の部位特異的組換えの産物配列を含む。対象となるベクターを、核酸(例えば発現カセット)の標的細胞への導入に使用する方法、ならびにこのような方法を実施する際に使用される調製物も提供する。対象となる方法および組成物は、研究応用および治療応用の両方を含む多種多様な応用に使用できる。また、このようなベクターの作製法、ならびに同作製法を実施するための試薬およびキット/系も提供する。
持続的で高レベルのタンパク質発現を可能とする環状核酸ベクターを提供する。本発明の環状ベクターは、発現サイレンシング細菌配列を欠くことを特徴とし、また多くの態様では、対象となるベクターは、発現カセットに加えて一方向性の部位特異的組換えの産物配列を含む。対象となるベクターを、核酸(例えば発現カセット)の標的細胞への導入に使用する方法、ならびにこのような方法を実施する際に使用される調製物も提供する。対象となる方法および組成物は、研究応用および治療応用の両方を含む多種多様な応用に使用できる。また、このようなベクターの作製法、ならびに同作製法を実施するための試薬およびキット/系も提供する。
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明は、特定の態様の変形形態が作製可能であり、これも添付の特許請求の範囲に含まれるように、後述する本発明の特定の態様に制限されないことを理解すべきである。用いられる用語が、特定の態様を説明する目的で使用され、制限する意図がないことも理解すべきである。実際には本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって決定される。
本明細書および添付の請求項では、単数形の「1つの(a)、(an)」、および「その(the)」という表現は、文中で特に断らない限り複数の対象を含む。特に明記しない限り、本明細書に用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味をもつ。
値の範囲を示す場合は、個々の介在値が、特に明記しない限り下限の単位の10分の1まで、同範囲の上限と下限の間にあり、また記載された値の、他の任意の記載された値または介在値が本発明に含まれると理解すべきである。このような小さな範囲の上限および下限は、小さな範囲に独立に含まれる場合があり、また記載された範囲の中で任意の具体的に除外される限界に対しても本発明に含まれる。記載された範囲が、上限または下限の一方もしくは両方を含む場合、上限または下限の一方もしくは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
特に明記しない限り、本明細書に用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似の、または等価の任意の方法、装置、および材料は、本発明の実施または検討に使用可能であるが、好ましい方法、装置、および材料について以下に説明する。
本明細書で言及された全ての出版物は、過去に開示された発明に関連して使用される場合のある、出版物に記載された細胞系列、ベクター、方法、および他の発明成分を説明および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
方法
広い意味で本発明は、外因性の核酸を少なくとも1個の細胞(すなわち標的細胞)に導入する方法を提供する。標的細胞は例えば、インビトロ環境に存在するような、または多細胞生物に存在するような個々の細胞の場合がある。したがって対象となる方法は、インビボ法(外因性の核酸を多細胞生物に直接投与する方法)、またはインビトロ法(標的細胞もしくは標的細胞群を多細胞生物から除去した後に外因性の核酸に接触させる方法)の場合がある。
広い意味で本発明は、外因性の核酸を少なくとも1個の細胞(すなわち標的細胞)に導入する方法を提供する。標的細胞は例えば、インビトロ環境に存在するような、または多細胞生物に存在するような個々の細胞の場合がある。したがって対象となる方法は、インビボ法(外因性の核酸を多細胞生物に直接投与する方法)、またはインビトロ法(標的細胞もしくは標的細胞群を多細胞生物から除去した後に外因性の核酸に接触させる方法)の場合がある。
ある態様では、本発明は、外因性の核酸を多細胞生物(すなわち宿主)の複数の細胞に導入する方法を提供する(「複数」という表現は、ある態様では少なくとも約0.1%、通常少なくとも約0.5%を意味することがある)。
後述するように、多くのインビトロ態様では、対象となる方法は、対象となる方法に使用されるベクターの全身投与に基づく(「全身投与」という表現は、単に宿主の局所的な部位または領域以外にも接触するようにベクターを宿主に投与することを意味し、また「宿主の局所的な部位または領域」という表現は、宿主の総重量の約10%未満、通常は約5%未満の領域を意味する)。他のインビトロ態様では局所投与プロトコルを用いる。広い意味で、対象となる方法は、任意の核酸を宿主に導入する方法であるが、一般に外因性の核酸は、以下に詳述するように、産物(例えば対象タンパク質)をコードする発現カセットである。
ミニサークルベクター
本発明の特徴の1つは、方法でミニマル環状ベクター(ミニサークル)を用いて外因性の核酸(以下では便宜的に「発現カセット」と呼ぶ)を、標的となる細胞または細胞群に輸送することである。対象となる方法に使用されるミニサークルベクターは、2本鎖の環状DNA分子である。対象となる方法に使用されるミニサークルベクターの配列は、ベクター上に存在する発現カセットがコードするタンパク質の持続的で高レベルの発現を、発現カセットの配列および方向に少なくとも実質的に依存せずに可能とする提供する配列である。
本発明の特徴の1つは、方法でミニマル環状ベクター(ミニサークル)を用いて外因性の核酸(以下では便宜的に「発現カセット」と呼ぶ)を、標的となる細胞または細胞群に輸送することである。対象となる方法に使用されるミニサークルベクターは、2本鎖の環状DNA分子である。対象となる方法に使用されるミニサークルベクターの配列は、ベクター上に存在する発現カセットがコードするタンパク質の持続的で高レベルの発現を、発現カセットの配列および方向に少なくとも実質的に依存せずに可能とする提供する配列である。
すぐ上記に要約したように、対象となるミニサークルベクターの特徴は、一過性または短期の発現ではなく、同ベクター上の発現カセットがコードするタンパク質の持続的な発現を可能とすることである。「持続的な発現」という表現は、コード産物(例えばタンパク質)の発現が、対象となるベクターの投与後に、永久とは言わないまでも長期間持続する、検出可能なレベルであることを意味する。「長期間」という表現は、少なくとも1週間、一般的には少なくとも2か月間、またより一般的には少なくとも6か月間を意味する。「検出可能なレベル」という表現は、コード産物の発現が、治療濃度で、標的細胞または標的細胞を含む哺乳類(例えば哺乳類の血清)におけるコード産物を検出可能なレベルであることを意味する。これについては例えば、前出の実験セクションを参照されたい。pBluescriptプラスミドベクター(Stratagene Corporation、La Jolla、CA)を用いる対照と比較して、タンパク質の発現は、対照の少なくとも約2倍、一般的には少なくとも約5倍、またより一般的には少なくとも約10倍長い検出可能なレベルで、対象となる方法で一定期間持続する。コード産物は、容易に利用可能で当業者に周知の手法およびプロトコルで検出可能な場合に、検出可能なレベルであるとみなされる。以下の実験セクションでは、マウス血清中のヒト第IX因子タンパク質の代表的な検出可能なレベルについて触れる。
典型的には、上述の持続的な発現は、検出可能なレベルだけでなく高レベルでもある。ミニマルベクターは、投与に続く期間(例えば少なくとも約28日)の後に、ベクターの発現カセットにコードされたタンパク質が、宿主(例えば標的細胞や、宿主の血清中など)に高レベルで存在する場合に、高レベルの発現を可能とするとみなされる。コード産物のレベルは、これが検出可能な活性を示す(例えば表現型に影響を及ぼす)、例えば宿主で治療活性を示す場合に、本出願の目的に鑑みて「高い」とみなされる。特定の産物の発現レベルが高いか否かは、特定の産物の性質に応じて必然的に変動するが、当業者であれば、例えば、産物の発現が疾患症状の改善(例えば凝固時間の短縮)などの、宿主の表現型に対する所望の作用を十分示すか否かを評価することによって容易に決定できる。本発明のミニサークルベクターは、必要とされる高レベルのタンパク質発現を可能とするか否かを、後述するプロトコルにしたがって同ベクターを宿主に投与することによって、また例えば発現タンパク質が同タンパク質が産生される標的細胞から分泌される血液または血清中における、また非分泌型タンパク質の場合であれば標的細胞の組織溶解物中における所望の発現レベルを調べることで検討できる。
対象となる方法に使用されるミニサークルベクターは、対象となる方法において有用性を提供する複数のエレメントを含む。対象となるミニサークルベクターは、典型的にはクローニング部位(核酸を挿入可能な部位)としてはたらく、少なくとも1か所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位(制限酵素切断部位)を含む。HindIII、PstI、SalI、AccI、HincII、XbaI、BamHI、SmaI、XmaI、KpnI、SacI、EcoRIなどの制限酵素によって認識される部位を始めとする多様な制限酵素切断部位が当技術分野で周知であり、またベクターに含めることができる。多くの態様では、このようなベクターは、ポリリンカー(当技術分野ではマルチクローニングサイトとしても知られる)、すなわち上記の酵素のような多種多様な制限酵素で認識される、密に並べられた一連または連続の部位を含む。したがって多くの態様で、ベクターは、複数の制限酵素切断部位から成るマルチクローニングサイトを含む。マルチクローニングサイト中の制限酵素切断部位の数には幅があり、2〜15か所、または一般的には2〜10か所である。
使用する場合、ミニサークルベクターは典型的には、少なくとも1つの対象核酸、すなわち標的細胞に導入されて、例えば核酸が典型的には発現カセットとして存在する、詳しくは後述する標的細胞内でタンパク質として発現される核酸を含む。対象となるベクターは、核酸が、標的細胞/多細胞生物に対して内因性および/または外因性である塩基の配列を含む場合のある、さまざまな核酸を含む場合がある(外因性の配列は、標的細胞中に存在しない配列であり、また内因性配列は、導入前に標的細胞中に始めから存在する配列である)。いずれにしてもベクターの核酸は、標的細胞にとって外因性である。というのはベクターの核酸は、標的細胞以外の供給源に由来し、また後述する対象となる方法で細胞に導入されるからである。核酸の性質は、実施されるプロトコルの種類に応じて変わる。例えば研究応用では、外因性の核酸は、そのタンパク質産物の特徴が十分明らかにされていない新規遺伝子の場合がある。このような応用では、ベクターは、遺伝子の特徴を決定するために、遺伝子を標的細胞に安定に導入して細胞の表現型の変化を観察するために用いられる。あるいは、タンパク質合成応用では、外因性の核酸は、細胞が産生する対象タンパク質をコードする。ベクターを例えば遺伝子治療に使用する、さらに他の態様では、外因性の核酸は、治療活性を有する遺伝子(治療的有用性のある産物をコードする遺伝子)である。
ベクターにはさまざまな特徴が存在する場合がある。多くの態様では、ベクターは、少なくとも1つの転写活性のある遺伝子の存在を特徴とする。「転写活性のある遺伝子」という表現は、細胞内条件で発現可能なコード配列、例えば、対象となる方法によるベクターの導入対象となる標的細胞の細胞内環境における発現に必要とされる任意の必要な発現調節エレメントと併用されるコード配列を意味する。したがって、対象となるベクターの転写活性のある遺伝子は典型的には、一連のヌクレオチドまたはドメイン、すなわち使用可能に組み合わされる(すなわち、必要な転写媒介エレメントまたは転写調節エレメント(群)と使用可能に連結される)ヌクレオチドのコード配列を含む発現モジュールもしくは発現カセットを含む。発現モジュール内に存在する場合のある必要な転写媒介エレメントには、プロモーター、エンハンサー、終止およびポリアデニル化シグナルのエレメント、スプライシングシグナルエレメントなどがある。
好ましくは、発現モジュールまたは発現カセットは、広い宿主域で遺伝子の発現を可能とする転写調節エレメントを含む。このようなさまざまな組み合わせが知られており、具体的な転写調節エレメントには、Dijkemaら、EMBO J. (1985) 4:761に記載されているSV40のエレメント、Gormanら、Proc. Nat'l Acad. Sci USA (1982) 79:6777に記載されているラウス肉腫ウイルスのLTRに由来する転写調節エレメント、Boshartら、Cell (1985) 41:521に記載されているヒトのサイトメガロウイルス(CMV)のLTRに由来する転写調節エレメント、およびhsp70プロモーター(Levy-Holtzman, R.およびI. Schechter (Biochim. Biophys. Acta (1995) 1263: 96-98) Presnail, J.K.およびM.A. Hoy、(Exp. Appl. Acarol. (1994) 18:301-308))などがある。
多くの態様では、少なくとも1つの転写活性のある遺伝子またはモジュールが、多細胞生物に対する治療活性を有するタンパク質をコードする。このようなタンパク質には、第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、α1-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インターロイキン、サイトカイン、小型ペプチドなどがあるがこれらに限定されない。上記のタンパク質のリストは、哺乳類のタンパク質、また多くの態様ではヒトのタンパク質に関するものであり、上記タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、一般に当業者に周知である。
ある態様では、ベクターは、選択マーカーとして機能する、少なくとも1つの転写活性のある遺伝子または発現モジュールも含む。多種多様な遺伝子が選択マーカーとして使用されており、また対象となるベクターに選択マーカーとして使用される特定の遺伝子が主に利便性を考慮して選択される。既知の選択マーカー遺伝子には、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、CAD、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンセターゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子(例えばneor (アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子)のほか、発現が例えばβ-ガラクトシダーゼやGFPなどの検出可能な産物の出現を直接的または間接的に可能とする遺伝子などがある。
対象となる方法に用いられる、対象となるミニサークルベクターの重要な特徴の1つは、同ベクターが、ベクターの持続的な発現ではなく一過性の発現のみを引き起こしうる細菌プラスミド配列を含まないことである。発現は、上述のガイドラインにしたがって発現が持続的でない場合に一過性であるとみなされる。対象となるベクターから除去される細菌配列は、当業者であれば、以下の実験セクションに記載された評価アッセイ法で容易に決定することができる。
本発明のある態様の特徴の1つは、ベクターが、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの産物ハイブリッド配列をさらに含むことである。この産物ハイブリッド配列は、一方向性の部位特異的リコンビナーゼによる2つのリコンビナーゼ基質配列(例えば当技術分野で周知のattBおよびattP基質配列)の組換えの結果であり、attRまたはattL産物ハイブリッド配列のいずれかの場合がある。典型的には、産物ハイブリッド配列の長さは約10〜約500 bpである。ある態様では、産物配列は、インテグラーゼである一方向性の部位特異的リコンビナーゼの産物ハイブリッド配列である。対象となるインテグラーゼには、野生型のファージインテグラーゼまたはこの変異体などがあるがこれらに限定されない。具体的な、対象となる代表的なインテグラーゼには、ΦC31、R4、TP901-1、A118、ΦFC1などのインテグラーゼがあるがこれらに限定されない。
対象となるミニサークルベクターの全長は、上述の所望のエレメントを含むほどの十分な長さであるが、ベクターが標的細胞との接触によって(例えば細胞を含む宿主への全身投与によって)、同細胞内に侵入する能力を許容不可能なレベルで妨げたり実質的に阻害したりするほどの長さではない。したがって対象となるミニサークルベクターは、長さが一般に少なくとも約0.3 kbであり、少なくとも約1.0 kbの長さであることが多く、ベクターは10 kbまたはこれ以上の場合があるが、態様によってはこの長さを超えない。
上記のミニサークルベクターは、任意の簡便なプロトコルで作製することができる。対象となる方法に用いられるベクターの構築法の態様については後述する。
ベクターの投与
対象となる方法は、外因性の核酸配列を標的細胞に導入するのに望ましい多様な応用に使用可能であり、また発現カセットにコードされたタンパク質を標的細胞内で発現させることが望ましい場合に特に関心が寄せられる。既に触れたように、対象となるベクターはインビトロまたはインビボのプロトコルで投与可能である。
対象となる方法は、外因性の核酸配列を標的細胞に導入するのに望ましい多様な応用に使用可能であり、また発現カセットにコードされたタンパク質を標的細胞内で発現させることが望ましい場合に特に関心が寄せられる。既に触れたように、対象となるベクターはインビトロまたはインビボのプロトコルで投与可能である。
上述したように、対象となるベクターは多様な標的細胞に使用可能であり、多くの態様における標的細胞は、非細菌標的細胞であり、また真核生物の標的細胞であることもあり、これには植物および動物の標的細胞(例えば昆虫細胞、脊椎動物細胞、特に鳥類細胞(例えばニワトリ細胞)、魚類、両生類、および爬虫類の細胞、マウス、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラット、有蹄類、イヌ、ネコ、サル、およびヒトの細胞などを含む哺乳類の細胞)が含まれるがこれらに限定されない。
本発明の方法では、このようなベクターを標的細胞に導入する。任意の簡便なプロトコルを用いることが可能であり、プロトコルは、標的細胞の位置に依存して、インビトロまたはインビボにおけるベクターの標的細胞への導入を可能とする場合がある。例えば、標的細胞が、単離された細胞である場合、ベクターを、標的細胞の生存を可能とする細胞培養条件で、標準的な形質転換法で細胞に直接導入することができる。このような手法には、ウイルス感染、形質転換、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム沈殿法、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクター輸送などがあるが必ずしもこれらに限定されない。方法を選択する際は一般に、形質転換対象の細胞の種類、および形質転換が行われる環境(インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)を考慮する。このような方法に関する一般的な議論は、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley & Sons、1995に記載されている。
または、標的細胞または標的細胞群が多細胞生物の一部である場合、標的ベクターを、標的コンストラクトが例えばインビボまたはエクスビボのプロトコルで標的細胞(群)に入るように生物または宿主に投与することができる。「インビボ」という表現は、標的コンストラクトが動物の生きている身体に投与されることを意味する。「エクスビボ」という表現は、細胞または器官が体外で修飾されることを意味する。このような細胞または器官は通常、生きている身体に戻される。核酸コンストラクトの投与法は当技術分野で周知である。核酸コンストラクトは、カチオン脂質を用いて
、ウイルスベクターを用いて(Monahanら、Gene Therapy 4: 40-49、1997;Onoderaら、Blood 91: 30-36、1998)、または「裸のDNA」の取り込みなどの手法で輸送することができる。当技術分野で周知の細胞形質転換法(上記参照)を、核酸コンストラクトのエクスビボ投与に用いることができる。厳密な処方、投与型路、および投与量は経験的に選択される場合がある(例えば、Finglら、1975、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第1章、plを参照)。
、ウイルスベクターを用いて(Monahanら、Gene Therapy 4: 40-49、1997;Onoderaら、Blood 91: 30-36、1998)、または「裸のDNA」の取り込みなどの手法で輸送することができる。当技術分野で周知の細胞形質転換法(上記参照)を、核酸コンストラクトのエクスビボ投与に用いることができる。厳密な処方、投与型路、および投与量は経験的に選択される場合がある(例えば、Finglら、1975、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第1章、plを参照)。
ベクターの多細胞生物への投与経路は、系の成分を輸送するベクターの性質、輸送用媒介物の性質、多細胞生物の性質などを含む複数のパラメータに依存する(投与様式の一般的な特徴は、ベクター成分の、全身経路による標的細胞(群)へのインビボ輸送を可能とすることである)。特に重要な全身経路は、宿主の血管系(例えば動脈または静脈)にベクターを導入する血管経路であり、静脈内投与経路が多くの態様で特に関心を寄せられている。
任意の適切な輸送用媒介物を用いることが可能であり、輸送用媒介物は典型的には、薬学的に許容される担体、希釈剤、および/またはアジュバント中に存在する有効量のベクターを含む薬学的調製物である。ある態様では、水性の輸送用溶媒(例えば生理食塩水)を用いてベクターを投与する。したがって多くの態様では、ベクターを血管内(例えば動脈内または静脈内)に、水性の輸送用溶媒(例えば生理食塩水)を用いて投与する。
多くの態様では、ベクターを多細胞生物にインビボで多細胞生物の標的細胞に、ベクター上に存在する核酸の発現が十分起きる条件で導入されるように投与する。対象となる方法の特徴の1つは、上述したように、一過性の発現ではなく、ベクター上に存在する核酸の持続的な発現を結果的にもたらすことである。「持続的な発現」という表現は、検出可能なレベルにおける核酸の発現が、対象となるベクターの投与後に永久とは言わないまでも、長期間続くことを意味する。「長期間」という表現は、少なくとも1週間、一般的には少なくとも2か月間、またより一般的には少なくとも6か月間を意味する。「検出可能なレベル」という表現は、核酸の発現が、コードタンパク質を哺乳類(例えば哺乳類の血清中)で、治療濃度における検出可能なレベルにおける検出が可能なレベルにあることを意味する。これについては例えば、前出の実験セクションを参照されたい。pBluescriptベクターを用いる対照と比較して、タンパク質の発現は、対照と比較して、以下の対象となる方法では長期間(少なくとも約2倍、一般的には少なくとも約5倍、またより一般的には少なくとも約10倍長く)持続する。
対象となる方法の多くの態様の特徴は、上述した持続的な発現が、ベクターDNAの宿主標的細胞のゲノムへの組込みなしに達成されるということである。したがって、標的細胞に導入されたベクターDNAは、標的細胞のゲノム(すなわち標的細胞の1本もしくは複数の染色体)に組込まれない(挿入されない)。言い替えると、対象となる方法で導入されたベクターDNAは、対象となる方法で導入される標的細胞内に存在する染色体と融合しない、すなわち共有結合で結合しない。したがってベクターは、持続的な発現を可能とするエピソームベクターである、エピソームの状態で維持される。
対象となる方法で多細胞生物に投与されるベクターの特定の用量は、ベクターの性質、発現モジュールおよび遺伝子の性質、輸送用媒介物の性質などによって変わる。当業者であれば、用量は容易に経験的に決定することができる。例えば、生理食塩水溶媒中のベクターをマウスに静脈経由で投与する場合は、投与ベクターの量の幅は、多くの態様で一般的には約2〜100 μg/個体、また一般的には約10〜50 μg/個体である。対象となる方法は、さまざまな大きさの核酸を標的細胞に導入する際に用いることができる。一般に、対象となる方法で標的細胞に挿入されるDNAの大きさは約1〜12 kbであり、通常は約3〜10 kbであり、また時には約4〜8 kbである。
インビボプロトコルでは、対象となる方法で、多種多様な標的細胞に核酸を導入することができる。対象となる標的細胞は、筋肉、脳、内皮、肝臓の細胞などを含むがこれらに限定されない。多くの態様で特に重要な点は、対象となる方法を用いて、核酸を少なくとも宿主の肝細胞に導入することである。
有用性
対象となる方法は、標的細胞への核酸の導入が望ましい、さまざまな応用に使用できる。対象となるベクターおよび方法を使用できる応用には、研究応用、ポリペプチド合成応用、および治療応用などが含まれる。これらの代表的なカテゴリーの各応用について以下に個別に詳しく説明する。
対象となる方法は、標的細胞への核酸の導入が望ましい、さまざまな応用に使用できる。対象となるベクターおよび方法を使用できる応用には、研究応用、ポリペプチド合成応用、および治療応用などが含まれる。これらの代表的なカテゴリーの各応用について以下に個別に詳しく説明する。
研究応用
対象となる核酸導入法が使用できる研究応用の例には、特定の遺伝子の特徴を明らかにするように設計された応用などがある。このような応用では、対象となるベクターを用いて対象遺伝子を標的細胞に導入して発現させ、結果として得られる、挿入された遺伝子が細胞の表現型に及ぼす作用を観察する。このようにして、遺伝子の活性、および同遺伝子にコードされる産物の性質に関する情報を推定することができる。対象となる方法で、対象遺伝子の過剰発現および/または異所性発現が細胞内でもたらされて、こうした変異体発現パターンの作用を観察するモデルを作ることもできる。
対象となる核酸導入法が使用できる研究応用の例には、特定の遺伝子の特徴を明らかにするように設計された応用などがある。このような応用では、対象となるベクターを用いて対象遺伝子を標的細胞に導入して発現させ、結果として得られる、挿入された遺伝子が細胞の表現型に及ぼす作用を観察する。このようにして、遺伝子の活性、および同遺伝子にコードされる産物の性質に関する情報を推定することができる。対象となる方法で、対象遺伝子の過剰発現および/または異所性発現が細胞内でもたらされて、こうした変異体発現パターンの作用を観察するモデルを作ることもできる。
ポリペプチド合成応用
上記の研究応用に加えて、対象となる方法は、ポリペプチド(例えば対象タンパク質)の合成に使用することもできる。このような応用では、対象ポリペプチドをコードする遺伝子を、必要な、および/または所望の発現調節配列(例えばプロモーターなど)とともに含むミニマルプラスミドベクター(すなわち発現モジュール)を標的細胞に、ポリペプチドの発現の発現宿主としてはたらく標的細胞が存在する多細胞生物へのインビボ投与で導入する。インビボ投与後に、多細胞生物、および同生物に存在する標的宿主細胞を次に、組込まれた遺伝子が十分発現する条件で維持する。発現されたタンパク質を次に回収し、望ましいならば任意の簡便なプロトコルで精製する。
上記の研究応用に加えて、対象となる方法は、ポリペプチド(例えば対象タンパク質)の合成に使用することもできる。このような応用では、対象ポリペプチドをコードする遺伝子を、必要な、および/または所望の発現調節配列(例えばプロモーターなど)とともに含むミニマルプラスミドベクター(すなわち発現モジュール)を標的細胞に、ポリペプチドの発現の発現宿主としてはたらく標的細胞が存在する多細胞生物へのインビボ投与で導入する。インビボ投与後に、多細胞生物、および同生物に存在する標的宿主細胞を次に、組込まれた遺伝子が十分発現する条件で維持する。発現されたタンパク質を次に回収し、望ましいならば任意の簡便なプロトコルで精製する。
したがって対象となる方法は、多細胞生物で対象タンパク質の量を少なくとも促進する手段となる。「少なくとも促進する」という表現は、この方法が、ある程度のタンパク質の初期量がベクターのインビボ投与に先だって存在する、多細胞生物中のタンパク質の量を増やすために用いられる状況を含む。「少なくとも促進する」という表現はまた、ベクターの投与に先だって多細胞生物が実質的にタンパク質を含まない状況も含む。「少なくとも促進する」という表現は、宿主に存在する特定のタンパク質の量が、少なくとも約2倍、一般的には少なくとも約5倍、またより一般的には少なくとも約10倍増えることを意味する。対象となる方法は、多細胞生物に存在するタンパク質の量を少なくとも促進するために使用できるので、対象となる方法は、農業分野における応用や薬学的調製物に関する応用のほか、ならびに以下に詳述する治療応用を含む、多種多様な応用に使用できる。
治療応用
対象となる方法は、ベクター上に存在する核酸にコードされた産物の持続的な発現をもたらすために、ベクターを用いて治療用核酸(例えば遺伝子)を標的細胞に導入する治療応用(遺伝子治療応用)にも使用できる。対象となるベクターは、さまざまな治療用核酸を輸送するために使用できる。対象となる治療用核酸は、遺伝的欠陥に基づく疾患状態に関連する遺伝子などの、標的宿主細胞中の欠損遺伝子を置き換える遺伝子(癌の治療に治療的有用性のある遺伝子など)を含む。遺伝的欠陥に基づく疾患条件の治療に用いられる具体的な治療用遺伝子には、第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、α1-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼなどの産物をコードする遺伝子などがある(用いられる上記タンパク質の特定のコード配列は一般に、投与対象の宿主で天然に存在するコード配列であり、ヒト宿主の治療にはヒトのコード配列が用いられる)。対象となる方法で輸送可能な癌治療用遺伝子には、リンパ球の抗腫瘍活性を高める遺伝子、発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を高める遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、トキシン遺伝子、細胞死関連遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列などがある。
対象となる方法は、ベクター上に存在する核酸にコードされた産物の持続的な発現をもたらすために、ベクターを用いて治療用核酸(例えば遺伝子)を標的細胞に導入する治療応用(遺伝子治療応用)にも使用できる。対象となるベクターは、さまざまな治療用核酸を輸送するために使用できる。対象となる治療用核酸は、遺伝的欠陥に基づく疾患状態に関連する遺伝子などの、標的宿主細胞中の欠損遺伝子を置き換える遺伝子(癌の治療に治療的有用性のある遺伝子など)を含む。遺伝的欠陥に基づく疾患条件の治療に用いられる具体的な治療用遺伝子には、第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、α1-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼなどの産物をコードする遺伝子などがある(用いられる上記タンパク質の特定のコード配列は一般に、投与対象の宿主で天然に存在するコード配列であり、ヒト宿主の治療にはヒトのコード配列が用いられる)。対象となる方法で輸送可能な癌治療用遺伝子には、リンパ球の抗腫瘍活性を高める遺伝子、発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を高める遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、トキシン遺伝子、細胞死関連遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列などがある。
対象となる方法は、例えば
に記載されているRNA産物(アンチセンスRNAやリボザイムなど)の発現にも使用できる。したがって対象となる方法は、例えばアンチセンスやリボザイムなどの治療用RNA分子を、宿主の標的細胞中に輸送するために使用できる。
に記載されているRNA産物(アンチセンスRNAやリボザイムなど)の発現にも使用できる。したがって対象となる方法は、例えばアンチセンスやリボザイムなどの治療用RNA分子を、宿主の標的細胞中に輸送するために使用できる。
対象となる方法の重要な特徴は、既に述べたように、対象となる方法をインビボ遺伝子治療応用に使用可能なことである。「インビボ遺伝子治療応用」という表現は、治療用遺伝子の発現が望ましい標的細胞または標的細胞群が、ベクター系との接触前に宿主から除去されないことを意味する。対照的に、対象となるベクターを多細胞生物に直接投与して、標的細胞に取り込ませた後に、標的細胞における遺伝子の発現が起こる。別の重要な特徴は、結果的に起こる発現が持続的であり、またベクターDNAが標的細胞ゲノムへ組込まれることなく起こることである。
キット
本発明は、標的細胞に核酸を輸送する、対象となる方法を実施する際に使用されるキットも提供する。対象となるキットは一般に、水性溶媒中に存在する場合のあるミニサークルベクターを含む。対象となるキットはさらに、水性の輸送用溶媒(例えば緩衝生理食塩溶液など)を含む場合がある。またキットは、ベクター中への核酸の輸送に使用される1種類または複数の制限エンドヌクレアーゼを含む場合がある。対象となるキットでは、上記成分を、宿主への輸送を目的として1種類の水性組成物中に混合される場合があるほか、異なるもしくは別個の組成物として(例えば別個の容器内に)分けることができる。任意選択でキットはさらに、水性組成物を宿主に輸送するための血管輸送手段(例えばシリンジなど)を含む場合がある(輸送手段は、水性組成物が事前に充填されている場合もあれば充填されていない場合もある)。
本発明は、標的細胞に核酸を輸送する、対象となる方法を実施する際に使用されるキットも提供する。対象となるキットは一般に、水性溶媒中に存在する場合のあるミニサークルベクターを含む。対象となるキットはさらに、水性の輸送用溶媒(例えば緩衝生理食塩溶液など)を含む場合がある。またキットは、ベクター中への核酸の輸送に使用される1種類または複数の制限エンドヌクレアーゼを含む場合がある。対象となるキットでは、上記成分を、宿主への輸送を目的として1種類の水性組成物中に混合される場合があるほか、異なるもしくは別個の組成物として(例えば別個の容器内に)分けることができる。任意選択でキットはさらに、水性組成物を宿主に輸送するための血管輸送手段(例えばシリンジなど)を含む場合がある(輸送手段は、水性組成物が事前に充填されている場合もあれば充填されていない場合もある)。
上記成分に加えて、対象となるキットはさらに、対象となる方法を実施するための指示書を含む。このような指示書は、対象となるキット内でさまざまな形状で存在する場合があり、このような形状の1つまたは複数がキット内に収められる場合がある。存在可能な指示書の指示書の1つの形状は、キットの包装や添付文書などに情報が印刷された適切な媒体または物質(例えば1枚の紙もしくは複数の紙)上の印刷情報である。さらに別の手段は例えば、情報が記録されたディスクやCDなどのコンピュータ可読媒体の場合がある。存在する可能性のあるさらに別の手段は、遠隔地から情報にアクセス可能なインターネット経由で使用可能なウェブサイトのアドレスである。任意の簡便な手段がキット内に収められる場合がある。
ミニサークルベクターの生成法
既に要約したように、上述したような対象となるミニサークルベクターを生成させる効率の極めて高い方法も提供する。この特定の方法の態様にしたがってミニサークルベクターを生成させる際には、一方向性の部位特異的リコンビナーゼのattB部位とattP部位に挟まれた対象発現カセットを含む親核酸に、隣接するattB部位およびattP部位を認識する一方向性の部位特異的リコンビナーゼを、一方向性の部位特異的リコンビナーゼが、上述の親核酸に由来するミニサークルベクターを生成する組換え段階に十分関与する条件で接触させる。「隣接する」という表現は、産物ミニサークルベクター中に存在する発現カセット(または他の対象配列)が、att部位(例えばattBおよびattP)をいずれかの側に、親核酸が以下の式で表されるように有することを意味する。
att部位の順序は一般的には重要ではない。att部位は、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの基質部位であり、当業者は通常これらをattB部位またはattP部位と呼ぶ。対象部位は、上述の特定のインテグラーゼリコンビナーゼ、ならびにこの変異体によって認識されるatt部位を含むがこれらに限定されない。
既に要約したように、上述したような対象となるミニサークルベクターを生成させる効率の極めて高い方法も提供する。この特定の方法の態様にしたがってミニサークルベクターを生成させる際には、一方向性の部位特異的リコンビナーゼのattB部位とattP部位に挟まれた対象発現カセットを含む親核酸に、隣接するattB部位およびattP部位を認識する一方向性の部位特異的リコンビナーゼを、一方向性の部位特異的リコンビナーゼが、上述の親核酸に由来するミニサークルベクターを生成する組換え段階に十分関与する条件で接触させる。「隣接する」という表現は、産物ミニサークルベクター中に存在する発現カセット(または他の対象配列)が、att部位(例えばattBおよびattP)をいずれかの側に、親核酸が以下の式で表されるように有することを意味する。
att部位の順序は一般的には重要ではない。att部位は、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの基質部位であり、当業者は通常これらをattB部位またはattP部位と呼ぶ。対象部位は、上述の特定のインテグラーゼリコンビナーゼ、ならびにこの変異体によって認識されるatt部位を含むがこれらに限定されない。
親核酸は、少なくとも部分的には作製法がインビトロ法かインビボ法のいずれかによって、多種多様な形状として存在する場合がある。したがって親核酸は、直線状の2本鎖の核酸、閉環状の核酸(複製における使用に適した細菌プラスミドなど)、ゲノムDNAに組込まれた状態などの場合がある。
既に述べたように上記の方法は、インビトロまたはインビボ(例えば細胞内)で実施することができる。上記の方法をインビトロで実施する際は、必要な全ての試薬(例えば親核酸や部位特異的インテグラーゼなど)を反応混合物中に混合して、所望の産物ミニサークルベクターの、部位特異的リコンビナーゼによる生成が可能な十分条件で十分な期間維持する。典型的にはインビトロ反応では、反応混合物を約20〜40℃の温度で維持する。
ある態様では、上記の方法は、所望の産物ミニサークルベクターの、リコンビナーゼによる生成が、培養中の細胞内で起きるインビトロ法である。このような態様の例には、親核酸が、リコンビナーゼによるベクター産生段階に先だって細菌宿主中で複製されて多コピー数の親核酸を産生するプラスミドである態様などがある。
上記のインビボ態様では、第1段階では一般に、多数の親核酸を含む宿主細胞を最初に調製する。この段階は、親核酸として作用するプラスミドで宿主細胞(例えば大腸菌)を形質転換することで簡便に実施できる。結果として得られる形質転換宿主細胞を次に、宿主細胞が、上記のような多コピー数の親核酸を産生するのに十分な条件で維持する。
十分なコピー数の親核酸(例えばプラスミド)を有する宿主細胞に関しては、一方向性の部位特異的リコンビナーゼ活性(すなわち親核酸に由来する所望のベクターの産生に関与する活性)を、次に宿主細胞で発揮させる。所望のリコンビナーゼ活性を、任意の簡便なプロトコルで細胞内で発揮させることができる。ある態様では、リコンビナーゼ、またはリコンビナーゼの配列をコードする核酸を、例えば上述の手順で宿主細胞に導入することができる。あるいは、リコンビナーゼのコード配列は、宿主細胞中に既に存在するが、例えば誘導型プロモーターの制御下にあるために発現されていない場合がある。このような態様では、誘導可能なコード配列は、親核酸上に存在するか、別のエピソーム核酸上に存在する場合があり、または宿主のゲノムDNA中に組込まれている場合さえある。リコンビナーゼのコード配列に動作可能に連結可能な、代表的な対象となる誘導型プロモーターには、aracBADプロモーターやラムダpLプロモーターなどがあるがこれらに限定されない。このような態様では、宿主細胞に所望のリコンビナーゼ活性を付与する段階は、所望のリコンビナーゼの発現を引き起こす誘導型プロモーターを誘導する段階を含む。
宿主細胞中における所望のリコンビナーゼ活性の産生に続いて、結果として得られた宿主細胞を次に、リコンビナーゼ活性が親核酸から所望のミニサークルベクターの生成に関与するのに十分な条件および期間維持する。典型的には、宿主細胞を約20〜40℃の温度で維持する。
上述したような、リコンビナーゼによる親核酸からのミニサークルベクターの生成に続いて、産物ミニサークルを次に、その「合成」環境の残分(例えば反応混合物や宿主細胞など)から、望ましいならば分離することができる。産物ミニサークルを分離する任意の簡便なプロトコルを用いることができる。代表的なプロトコルを、以下の実験セクションで説明する。
所望の産物ミニサークルベクターと、親核酸の副産物環状残分の区別/分離段階を容易にするために、副産物を選択的に切断して直線化することができる。このような選択可能な切断を可能とするためには、制限酵素切断部位(例えばISce Iまたは他の適切な部位)を、リコンビナーゼによる組換え段階に続いて、副産物中に存在する親核酸中に提供することができる(この制限酵素切断部位を次に同制限エンドヌクレアーゼによって切断して、ミニサークルおよび親副産物の生成に続いて、反応混合物または細胞中が得られる)。上述したように、リコンビナーゼ活性を設けることによって、制限エンドヌクレアーゼ活性が、多種多様なプロトコル(例えば、エンドヌクレアーゼまたはこのコード配列を、親副産物の産生後に反応混合物/細胞に導入することで、または上述したように、反応混合物または細胞中に既に存在するが、誘導型プロモーターの制御下にあるために発現されていないエンドヌクレアーゼのコード配列の発現を誘導すること)によって適切な時期に発揮される場合がある。細胞内でベクターの産生が起こる、このような態様では、エンドヌクレアーゼは典型的には、宿主細胞に内因性ではないエンドヌクレアーゼであり、対象となる代表的な制限エンドヌクレアーゼにはISce I、I-Ceu I、PI-Psp Iなどがあるがこれらに限定されない。
上述のミニサークルベクター生成法の実施に使用される系も提供する。対象となる系は、典型的には少なくとも、親核酸またはこの前駆体(例えば、クローニング部位を挟むatt部位を有する核酸)、および宿主細胞を含む。ある態様では、親核酸はさらに、(例えば誘導型プロモーターの制御下にある)att部位を認識する一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列、および/または(例えば誘導型プロモーターの制御下にある)親副産物を切断する制限エンドヌクレアーゼのコード配列を含む。このような態様では、系は、誘導型プロモーターの性質に応じて誘導薬剤を含む場合もある。さらに他の態様では、系はさらに、上述した、リコンビナーゼの別の供給源および/または制限エンドヌクレアーゼを含む場合がある。
対象となる方法を実施する際に使用するキットも提供する。このようなキットは、この系の1つもしくは複数の上記成分(例えば親核酸、宿主細胞、誘導薬剤など)を含む場合がある。上記成分に加えて、対象となるキットはさらに、対象となる方法を実施するための指示書を含む。このような指示書は、対象となるキット内にさまざまな形状で収められる場合があり、このような形状の1つまたは複数がキット内に収められる場合がある。存在可能な指示書の1つの形状は、キットの包装や添付文書などに情報が印刷された適切な媒体または基材(例えば1枚の紙もしくは複数の紙である)上の印刷情報である。また別の手段は例えば、情報が記録されたディスクやCDなどのコンピュータ可読媒体の場合がある。存在する可能性のあるさらに別の手段は、遠隔地から情報にアクセス可能なインターネット経由で使用可能なウェブサイトのアドレスである。任意の簡便な手段がキット内に収められる場合がある。
以下の実施例は、説明目的で提供され、制限する目的はない。
実験
I.材料および方法
A.ベクターの構築
hAATミニサークルコンストラクトpBAD.φC31.RHB(図1a)を作製するために、本発明者らはφC31インテグラーゼをプラスミドpCMV.φC31 (Groth, A.C.、Olivares, E.C.、Thyagarajan, B.およびCalos, M.P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 97、5995-6000、(2000))から、プライマー
および
を用いて増幅し、PCR産物をpBAD/Myc-His (Invitrogen、Carlsbad、CA)のNcoI〜SacI部位に挿入して中間プラスミドpBAD.φC31を得た。本発明者らは、対応するDNAオリゴヌクレオチド(Grothら、前出)を用いてattBおよびattPを含め、これらをそれぞれSpeI〜KpnI部位に、プラスミドpRSV.hAAT.bpAのhAAT発現カセットに隣接するように挿入した(図2a)。attB結合部位およびattP結合部位ならびに発現カセットをpBAD.φC31のSacI〜KpnI部位に挿入してpBAD.φC31.RHBを得た。本発明者らは、pBS.sApoE.HCR.hAAT.hFIX+IntA.bpA
に由来する発現カセットを、発現カセットをXhoIで切断して除去した後にpBAD.φC31.RHBのSpeI部位に挿入することで、hFIXを発現するミニサークルを生成させるためにベクターpBAD.φC31.sApoE.hFIX (図1b)を作製した。
I.材料および方法
A.ベクターの構築
hAATミニサークルコンストラクトpBAD.φC31.RHB(図1a)を作製するために、本発明者らはφC31インテグラーゼをプラスミドpCMV.φC31 (Groth, A.C.、Olivares, E.C.、Thyagarajan, B.およびCalos, M.P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 97、5995-6000、(2000))から、プライマー
および
を用いて増幅し、PCR産物をpBAD/Myc-His (Invitrogen、Carlsbad、CA)のNcoI〜SacI部位に挿入して中間プラスミドpBAD.φC31を得た。本発明者らは、対応するDNAオリゴヌクレオチド(Grothら、前出)を用いてattBおよびattPを含め、これらをそれぞれSpeI〜KpnI部位に、プラスミドpRSV.hAAT.bpAのhAAT発現カセットに隣接するように挿入した(図2a)。attB結合部位およびattP結合部位ならびに発現カセットをpBAD.φC31のSacI〜KpnI部位に挿入してpBAD.φC31.RHBを得た。本発明者らは、pBS.sApoE.HCR.hAAT.hFIX+IntA.bpA
に由来する発現カセットを、発現カセットをXhoIで切断して除去した後にpBAD.φC31.RHBのSpeI部位に挿入することで、hFIXを発現するミニサークルを生成させるためにベクターpBAD.φC31.sApoE.hFIX (図1b)を作製した。
B.ミニサークルの生成
本発明者らは、ベクターを産生するミニサークルを用いて、大腸菌Top 10 (Invitrogen、Calsbad、CA)を形質転換した。この細菌を、New Brunswick Scientificインキュベーター(モデルC24、Edison、NJ)を用いて成長させた。本発明者らはL-(+)-アラビノースをSigma Chemical社(St. Lois、MO)から入手した。本発明者らは、アガロース電気泳動後のDNAバンドを、Bio-Red Laboratories(Hercules、CA)のQuant Oneを用いて定量した。本発明者らは、精製済みの発現カセットおよび2-断片DNAを、プラスミドpRSV.hAAT.bpAから文献記載の手順(Chenら、前出)で調製した。本発明者らは、全てのDNA調製物を対象に、TEに対して一晩かけて透析後に動物に投与した。
本発明者らは、ベクターを産生するミニサークルを用いて、大腸菌Top 10 (Invitrogen、Calsbad、CA)を形質転換した。この細菌を、New Brunswick Scientificインキュベーター(モデルC24、Edison、NJ)を用いて成長させた。本発明者らはL-(+)-アラビノースをSigma Chemical社(St. Lois、MO)から入手した。本発明者らは、アガロース電気泳動後のDNAバンドを、Bio-Red Laboratories(Hercules、CA)のQuant Oneを用いて定量した。本発明者らは、精製済みの発現カセットおよび2-断片DNAを、プラスミドpRSV.hAAT.bpAから文献記載の手順(Chenら、前出)で調製した。本発明者らは、全てのDNA調製物を対象に、TEに対して一晩かけて透析後に動物に投与した。
C.マウスにおける導入遺伝子の発現の決定
本発明者らは、6〜8週齢のC57BL/6マウスをJackson Laboratory (Bar Harbor、ME)から入手した。本発明者らは、DNAをマウスの肝臓に流体力学的な手法で導入した
本発明者らは、眼窩後部法でマウスの血液を定期的に採取し、血清中のhAATおよびhFIXの量を、ELISAにより文献記載の手順で決定した(Yant, S.R.ら Somatic integration and long-term transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat Genet 25、35-41.(2000))。全ての動物の取り扱いは、NIHおよびスタンフォード大学の動物実験ガイドラインに準拠した。
本発明者らは、6〜8週齢のC57BL/6マウスをJackson Laboratory (Bar Harbor、ME)から入手した。本発明者らは、DNAをマウスの肝臓に流体力学的な手法で導入した
本発明者らは、眼窩後部法でマウスの血液を定期的に採取し、血清中のhAATおよびhFIXの量を、ELISAにより文献記載の手順で決定した(Yant, S.R.ら Somatic integration and long-term transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat Genet 25、35-41.(2000))。全ての動物の取り扱いは、NIHおよびスタンフォード大学の動物実験ガイドラインに準拠した。
D.マウスの肝臓中におけるベクターDNA構造のサザンブロット解析
本発明者らは、塩析法で肝臓のDNAを調製した。hAATを発現する4つの形状のうちの1種類のベクターDNAを導入したマウスから回収した20 μgの肝臓DNAを、同ベクターを切断しないBglIIで、または発現カセット中の1か所を切断するHindIIIで切断した。本発明者らは、制限酵素で切断されたDNAを電気泳動(0.8%アガロースゲル)で分離し、これをニトロセルロース膜にブロットした。ベクターDNAを、p32-dCTPで標識したhAATのcDNAプローブとのハイブリダイゼーション後に、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージャー(Phosphoimager)で検出した。
本発明者らは、塩析法で肝臓のDNAを調製した。hAATを発現する4つの形状のうちの1種類のベクターDNAを導入したマウスから回収した20 μgの肝臓DNAを、同ベクターを切断しないBglIIで、または発現カセット中の1か所を切断するHindIIIで切断した。本発明者らは、制限酵素で切断されたDNAを電気泳動(0.8%アガロースゲル)で分離し、これをニトロセルロース膜にブロットした。ベクターDNAを、p32-dCTPで標識したhAATのcDNAプローブとのハイブリダイゼーション後に、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージャー(Phosphoimager)で検出した。
II.結果
A.ミニサークルの生成
本発明者らは、ヒトα1-アンチトリプシン(hAAT)、およびヒト第IX因子(hFIX)をそれぞれ発現するミニサークルベクターを生成させるための前駆体として、プラスミドpBAD.φC31.RHB (図1a)およびpBAD.φC31.hFIX (図1b)を構築した。
A.ミニサークルの生成
本発明者らは、ヒトα1-アンチトリプシン(hAAT)、およびヒト第IX因子(hFIX)をそれぞれ発現するミニサークルベクターを生成させるための前駆体として、プラスミドpBAD.φC31.RHB (図1a)およびpBAD.φC31.hFIX (図1b)を構築した。
φC31インテグラーゼによる組換えの誘導に最適な条件を決定するために、pBAD.φC31.RHBを含む形質転換細胞の1個のコロニーから得た一晩培養物(OD600が約2.50)を調製した。本発明者らは、1%の誘導物質L-(+)-アラビノースを細菌培養物に添加することで、最適インキュベーション温度が32℃であることを決定した(データは示していない)。しかしながら本発明者らは、L-(+)-アラビノースを一晩細菌培養物に添加することで誘導した場合は組換え効率が低いことを確認した(図1cおよび1d)。組換え効率は、細菌を新鮮なLBブロスに再懸濁後にL-(+)-アラビノースを添加することで大きく促進された。また、細菌培養物を、一晩培養物の容量と新鮮なLBの容量が4:1の比となるように再懸濁したところ、同比が1:1の場合と比較して、ミニサークルの収率はわずかに上昇した(図1cおよび1d)。ミニサークルの生成に最適な条件には、一晩培養物の、1% L-(+)-アラビノースを含む新鮮なLBブロスとの4:1の再懸濁、および細菌の32℃における振盪(250 rpm、60〜120分)しながらのインキュベーションなどがある。このミニサークルは大きさが親ベクターpBAD.φC31.RHBの約4分の1であったので、本発明者らは、このような培養条件では組換え効率が97%を上回ると推定した(図1d)。
本発明者らは、組換え型DNAを細菌培養物から、QiagenプラスミドDNAキットで精製し、細菌バックボーンサークルをNcoIで切断して直線化した後に、標準的な勾配CsClバンディング法(Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.(編)、Molecular Cloning:a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1989)でミニサークルを精製した。本発明者らは、約1〜1.5 mgの組換えDNAを得た後に、CsClによる精製を行い、150〜200 μgの精製済みミニサークルを、ミニサークル産生ベクターpBAD.φC31.RHBまたはpBAD.φC31.hFIXを用いて1,000 mlの細菌培養物から得た。
B.インビボにおけるミニサークルによる導入遺伝子の発現
hAATを発現するミニサークルが細菌由来のサイレンシングDNAをインビボで欠くか否かを判定するために、本発明者らは、このミニサークルDNAの発現プロファイルを、37 bpのattRハイブリッド部位以外はミニサークルと同じDNA配列を含む発現カセット、または発現カセットと細菌バックボーンの直線状DNA混合物、または等モル量の精製済みの直線状の発現カセットである、等モル量の非組換えプラスミドpRSV.hAAT.bpA (図2a)の発現プロファイルと、マウスの肝臓への形質転換後に比較した。
hAATを発現するミニサークルが細菌由来のサイレンシングDNAをインビボで欠くか否かを判定するために、本発明者らは、このミニサークルDNAの発現プロファイルを、37 bpのattRハイブリッド部位以外はミニサークルと同じDNA配列を含む発現カセット、または発現カセットと細菌バックボーンの直線状DNA混合物、または等モル量の精製済みの直線状の発現カセットである、等モル量の非組換えプラスミドpRSV.hAAT.bpA (図2a)の発現プロファイルと、マウスの肝臓への形質転換後に比較した。
本発明者らの過去の観察(Chenら、論文投稿中)と矛盾することなく、精製済みの発現カセットを投与したマウスから得たhAATの血清濃度は、DNAの注入から3週間後の時点で、2-断片DNAを注入したマウスと比較して3倍以上高く、またccDNA注入マウスの場合と比較して20〜43倍高かった(図2b、左のパネル)。ミニサークルDNAを投与したマウスは、精製済みの発現カセットを注入した個体と比較して10〜13倍多い血清hAATを産生した。これは、ccDNA注入群と比較して200〜560倍高い値であった。ccDNAを注入したマウスも当初、高レベルの血清hAATを発現したが、血清レポーターレベルは最初の3週間で710倍低下し、その後は低値が続いた。本発明者らの得たデータは、ミニサークルが最も効率の良いベクター形状であり、また持続的で高レベルの導入遺伝子産物を発現可能であることを明瞭に示している。
潜在的な治療効率を示すために、本発明者らは、ミニサークルを発現するhFIXを、対応する非組換え型プラスミドと比較した。このミニサークルを導入した動物では、高レベルの血清hFIXが発現され、血清1 mlあたり約12 μgのhFIX (正常時の2倍以上)で最長7週間(実験の長さ。図2b、右のパネル)にわたって安定した。高レベルの血清hFIXが、DNA注入の1日後に非組換え型プラスミドを投与したマウスで認められたが、血清中の治療用タンパク質は3週間で45倍以上減少し、その後は低下を続けた。
C.マウスの肝臓におけるミニサークルDNAのサザンブロット解析
過去の研究で本発明者らは、ccDNAまたは直線状DNAの注入後にDNA量に差を見出せなかったが(Chenら、前出)、本発明者らは、ミニサークルを注入したマウスでも結果は同じか否かを確認することにした。肝臓中のベクターDNAのコピー数を、さまざまな形状のhAATベクターDNAを注入したマウスで、注入から15週間後に決定した(図2b、左のパネル)。二倍体のマウスゲノムあたり約13〜20コピーのベクターDNAが各群で検出された(図3a)。過去の観察と矛盾することなく、本発明者らの得たデータは、血清hAATレベルの差が、マウスの肝臓におけるベクターDNAの量の多様性に起因するものではないことを示している。
過去の研究で本発明者らは、ccDNAまたは直線状DNAの注入後にDNA量に差を見出せなかったが(Chenら、前出)、本発明者らは、ミニサークルを注入したマウスでも結果は同じか否かを確認することにした。肝臓中のベクターDNAのコピー数を、さまざまな形状のhAATベクターDNAを注入したマウスで、注入から15週間後に決定した(図2b、左のパネル)。二倍体のマウスゲノムあたり約13〜20コピーのベクターDNAが各群で検出された(図3a)。過去の観察と矛盾することなく、本発明者らの得たデータは、血清hAATレベルの差が、マウスの肝臓におけるベクターDNAの量の多様性に起因するものではないことを示している。
過去に本発明者らは、環状プラスミドがマウスの肝臓で完全な環状として残ることを明らかにした(Chenら、前出)(Chenら、論文投稿中)。ミニサークルDNAがマウスの肝臓内で他の環状プラスミドのように挙動するか否かを確認するために、本発明者らはベクターDNAの分子構造をサザンブロットで解析した。ベクターの内部を切断しないBglIIによる切断で、本発明者らは、超らせん状ミニサークルの凝集体を示す多数のバンドの存在を確認した。これらのバンドは、ベクター中を1か所だけ切断するHindIIIで切断することで、1つの単量体に変換された(図3b)。したがって、切断されていない環状プラスミドと同様に、ミニサークルDNAは、マウスの肝臓内で完全なエピソーム環として維持されていた。また本発明者らの過去の観察と矛盾することなく、2つの直線化されたDNAは、23 kbのバンドとして確認される大きなコンカテマー、ならびに小さな環状分子を生成した(図3b)。
III.考察
本発明者らは、細菌DNA配列を欠く大量のミニサークルDNAベクターが、ファージφC31インテグラーゼによる組換えを利用することで大腸菌で生成可能なことを明らかにした。この手法は比較的簡単であり、収率は高く、また作製のスケールアップは容易である。本発明者らは、ミニサークルが、高くて持続的なレベルの導入遺伝子産物をマウスの肝臓で発現可能なことを確認した。ミニサークルは血清hFIXおよびhAATをマウスの肝臓で、非組換え型の親プラスミドと比べて45〜560倍高く発現していた。本発明者らが得た過去の結果(Chenら、前出)(Chenら、論文投稿中)と同様に、遺伝子発現にみられるこの差は、マウスの肝臓中のベクターDNAの量の変化と関連していなかったことは重要である。まとめると以上の結果から、細菌のバックボーンがエピソーム導入遺伝子の発現に阻害的な役割を果たすという結果がさらに確認される。直線状の精製済み発現カセットと比較して、ミニサークルDNAは血清hAATを10倍以上高いレベルで発現していた。この結果は、ミニサークルが導入遺伝子の発現に関して、おそらくその環状の形状のために最適なエピソームベクターであることを示唆している。あるいは、実質的な量の直線状発現カセットは、非相同末端結合段階におけるプロモーター、および/またはポリアデニル化DNA配列の部分的な喪失によって不活性化される可能性がある。
本発明者らは、細菌DNA配列を欠く大量のミニサークルDNAベクターが、ファージφC31インテグラーゼによる組換えを利用することで大腸菌で生成可能なことを明らかにした。この手法は比較的簡単であり、収率は高く、また作製のスケールアップは容易である。本発明者らは、ミニサークルが、高くて持続的なレベルの導入遺伝子産物をマウスの肝臓で発現可能なことを確認した。ミニサークルは血清hFIXおよびhAATをマウスの肝臓で、非組換え型の親プラスミドと比べて45〜560倍高く発現していた。本発明者らが得た過去の結果(Chenら、前出)(Chenら、論文投稿中)と同様に、遺伝子発現にみられるこの差は、マウスの肝臓中のベクターDNAの量の変化と関連していなかったことは重要である。まとめると以上の結果から、細菌のバックボーンがエピソーム導入遺伝子の発現に阻害的な役割を果たすという結果がさらに確認される。直線状の精製済み発現カセットと比較して、ミニサークルDNAは血清hAATを10倍以上高いレベルで発現していた。この結果は、ミニサークルが導入遺伝子の発現に関して、おそらくその環状の形状のために最適なエピソームベクターであることを示唆している。あるいは、実質的な量の直線状発現カセットは、非相同末端結合段階におけるプロモーター、および/またはポリアデニル化DNA配列の部分的な喪失によって不活性化される可能性がある。
ミニサークルDNAを用いることで転写サイレンシング作用は克服されるので、導入遺伝子の発現は、細胞***または細胞死時を除いて失われないと考えられる。プラスミドDNAをいくつかの脂質DNA複合体とともに輸送すると、細菌DNA中に存在するCpGジヌクレオチドに対する免疫応答のために、導入遺伝子の発現の喪失が起こると仮定されている。本発明者らは過去に、これがDNAの喪失がないために本発明者らの研究では生じる可能性が低いこと、また類似の発現プロファイルが正常マウスおよび免疫不全マウスで見出されることを確認した(Chenら、前出)(Chenら、論文投稿中)。プラスミドが核生成を起こす場合があり、またエピソームの状態で、肝臓(Chenら、前出)だけでなく、心臓(Gal, D.ら、Direct myocardial transformation in two animal models. Evaluation of parameters affecting gene expression and percutaneous gene delivery. Lab Invest 68、18-25.(1993))、および骨格筋(Wolff, J.A.、Ludtke, J.J.、Acsadi, G.、Williams, P.およびJani, A. Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle. Hum Mol Genet 1、363-369.(1992))でも数か月間または数年間維持されることが詳しく報告されている。ミニサークルに由来する導入遺伝子の発現の持続が、以上の器官、および他の器官においても低い細胞代謝回転率で達成可能であると考えることは妥当である。
IV.細菌培養物からのミニサークルDNAベクターの1段階カラム精製
A.要約
約1 mgのミニサークルDNAベクターを生成させ、Qiagen DNAキットで(追加処理なし)、1000 mlの細菌培養物からの純度が96%を上回る、細菌培養物からのミニサークルDNAベクターの1段階カラム精製プロトコルの有用性について以下に説明する。以下のプロトコルでは、臨床用の大量のミニサークルベクターを生成させることができる。
A.要約
約1 mgのミニサークルDNAベクターを生成させ、Qiagen DNAキットで(追加処理なし)、1000 mlの細菌培養物からの純度が96%を上回る、細菌培養物からのミニサークルDNAベクターの1段階カラム精製プロトコルの有用性について以下に説明する。以下のプロトコルでは、臨床用の大量のミニサークルベクターを生成させることができる。
B.プラスミドコンストラクト
図4aは、本研究に用いるコンストラクトp2xBAD.φC31.hFIX.Isce Ig+sを産生するミニサークルを図式化したものである。2コピーのインテグラーゼφC31遺伝子と、1コピーの制限酵素Isce I遺伝子はいずれも、araC/BADプロモーターの制御下に配置されている。発現カセットsApoE.hFIX.bpAはattBとattPに挟まれ、I-Sce I制限酵素切断部位(I-Sce I)が同じコンストラクト中に含まれる。プラスミドのバックボーンは、pUC DNA複製起点(UC)およびアンピシリン耐性遺伝子(AmpR)を含むpUC19である。
図4aは、本研究に用いるコンストラクトp2xBAD.φC31.hFIX.Isce Ig+sを産生するミニサークルを図式化したものである。2コピーのインテグラーゼφC31遺伝子と、1コピーの制限酵素Isce I遺伝子はいずれも、araC/BADプロモーターの制御下に配置されている。発現カセットsApoE.hFIX.bpAはattBとattPに挟まれ、I-Sce I制限酵素切断部位(I-Sce I)が同じコンストラクト中に含まれる。プラスミドのバックボーンは、pUC DNA複製起点(UC)およびアンピシリン耐性遺伝子(AmpR)を含むpUC19である。
C.ミニサークルの調製
プラスミドp2X (BAD.φC31).hFIX.Isce Ig+s (図4a)を用いてTop 10細菌を形質転換した。形質転換細菌のコロニーを、10 mg/mlのアンピシリンを添加した200 mlのLBブロス中で、標準的な細菌成長法で一晩成長させた。この細菌をさらに一晩、1500 mlのLB/アンピシリン含有ブロス中で成長させた。細菌を遠心し、1%のL-アラビノースを含む新鮮なLBブロス中に4:1の比で再懸濁し、上記手順で持続的に振盪(250 rpm、1時間)しながら32℃でインキュベートした。次に細菌の半分を続けて32℃でさらに2時間インキュベートし、もう半分を37℃で2時間インキュベートした。細菌を遠心し、Qiagenキットで処理してプラスミドDNA調製物を得た。
プラスミドp2X (BAD.φC31).hFIX.Isce Ig+s (図4a)を用いてTop 10細菌を形質転換した。形質転換細菌のコロニーを、10 mg/mlのアンピシリンを添加した200 mlのLBブロス中で、標準的な細菌成長法で一晩成長させた。この細菌をさらに一晩、1500 mlのLB/アンピシリン含有ブロス中で成長させた。細菌を遠心し、1%のL-アラビノースを含む新鮮なLBブロス中に4:1の比で再懸濁し、上記手順で持続的に振盪(250 rpm、1時間)しながら32℃でインキュベートした。次に細菌の半分を続けて32℃でさらに2時間インキュベートし、もう半分を37℃で2時間インキュベートした。細菌を遠心し、Qiagenキットで処理してプラスミドDNA調製物を得た。
図5は、ミニサークルベクターDNAの純度を示す。各0.8 μgのDNAを、BglIIおよびEcoNIで切断した。いずれも、発現カセット中、または細菌バックボーン中をそれぞれ1回切断する酵素である。レーン1に見られる1.4 kbと12.3 kbのバンドは、非組換え型プラスミド(図4a)の制限酵素切断産物であり、上述の2つの異なる組換え制限条件に由来するレーン2およびレーン3に見られる4.1 kbのバンドと、12.3 kbよりわずかに小さいバンドはそれぞれ、直線化されたミニサークル(図4b)と細菌DNA(図4c)であった。
DNAバンドの定量(Quant One of Bio-Rad、Hercules、CA)の結果、レーン2およびレーン3におけるミニサークルの純度は、それぞれ96%と97%であることがわかった。
D.考察
細菌培養物からのミニサークルDNAベクターの1段階カラム精製法によって、臨床用ミニサークルの大規模生成が可能となる。この手法は時間および材料を節約するので対費用効果に優れている。さらに重要な点は、臨床用の大量のミニサークルベクターの生成を、臭化エチジウムなどの毒性物質を使用することなく可能とする点である。この1段階プロトコルでは、ミニサークル生成コンストラクト中にあらかじめ組込まれたI-Sce I制限酵素切断部位を切断することで環状DNAを直線化する制限酵素を発現させるためにI-Sce I遺伝子を含める。直線化されたDNAが次に細菌のヌクレアーゼで分解されることで、ミニサークルは、市販のキットで精製可能な唯一のエピソームDNAとなる。こうしてφC31とI-Sce Iの両遺伝子がaraCBADプロモーターによって駆動されて、2種類の酵素が、誘導物質であるL-アラビノースの添加に伴い同時に誘導されるようになる。したがって、環状の細菌DNAの直線化、およびφC31によるミニサークル生成は同時に起こり、結果的に、非組換え型プラスミドの部分的な喪失に至るために、ミニサークルDNAの収量は低くなる。しかしながら本発明者らは、早期の直線化/分解の割合(%)が、リコンビナーゼφC31の効率が極めて高くて比較的安定なために限られていると考えている。φC31は、組換え反応を30〜60分間でほぼ完了する可能性がある。これとは対照的にI-Sce I酵素は不安定であり、その半減期もわずか5分間である。細菌中のI-Sce I酵素は高レベルに至らなかった。また本発明者らは、2コピーのφC31リコンビナーゼを用いて、ミニサークル生成のさらなるスピードアップと、さらに早期の直線化/分解の減少を図っている。
細菌培養物からのミニサークルDNAベクターの1段階カラム精製法によって、臨床用ミニサークルの大規模生成が可能となる。この手法は時間および材料を節約するので対費用効果に優れている。さらに重要な点は、臨床用の大量のミニサークルベクターの生成を、臭化エチジウムなどの毒性物質を使用することなく可能とする点である。この1段階プロトコルでは、ミニサークル生成コンストラクト中にあらかじめ組込まれたI-Sce I制限酵素切断部位を切断することで環状DNAを直線化する制限酵素を発現させるためにI-Sce I遺伝子を含める。直線化されたDNAが次に細菌のヌクレアーゼで分解されることで、ミニサークルは、市販のキットで精製可能な唯一のエピソームDNAとなる。こうしてφC31とI-Sce Iの両遺伝子がaraCBADプロモーターによって駆動されて、2種類の酵素が、誘導物質であるL-アラビノースの添加に伴い同時に誘導されるようになる。したがって、環状の細菌DNAの直線化、およびφC31によるミニサークル生成は同時に起こり、結果的に、非組換え型プラスミドの部分的な喪失に至るために、ミニサークルDNAの収量は低くなる。しかしながら本発明者らは、早期の直線化/分解の割合(%)が、リコンビナーゼφC31の効率が極めて高くて比較的安定なために限られていると考えている。φC31は、組換え反応を30〜60分間でほぼ完了する可能性がある。これとは対照的にI-Sce I酵素は不安定であり、その半減期もわずか5分間である。細菌中のI-Sce I酵素は高レベルに至らなかった。また本発明者らは、2コピーのφC31リコンビナーゼを用いて、ミニサークル生成のさらなるスピードアップと、さらに早期の直線化/分解の減少を図っている。
上述の発明は、本発明者によって観察された非常に思いがけない結果の産物である。具体的には、本明細書に記載された本発明者らによる研究が行われる以前は、環状ベクター(例えばプラスミド)が、持続的で高レベルのタンパク質発現をもたらさない場合があると考えられており、またそのように観察されてもいた。本明細書に記載されているように、細菌配列を環状ベクターから除去することで、本発明者らは予想に反して、持続的で高レベルのタンパク質発現をもたらす環状ベクターを得ることができた。本願の出願時における本発明者らの知見では、細菌由来のサイレンシング配列をベクターから除去することで環状ベクターから持続的で高レベルの発現を達成可能か否かは全く不明であった。
核酸を標的細胞に移す改善された方法が本発明によって提供されることは、上記の結果および考察から明らかである。具体的には本発明は、ウイルスベクターを使用せず、また標的細胞ゲノムへの組込みを必要としないが、持続的で高レベルの遺伝子発現をもたらすことによって先行技術の核酸移動法に関するいくつかの利点を提供する、効率の極めて高い導入遺伝子発現ベクターを提供する。対象となる方法に用いられるベクターを産生させる、効率が極めて高く、また容易にスケールアップ可能な方法も提供する。したがって本発明は当技術分野に大きく貢献する。
本明細書に引用された全ての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願が、具体的かつ個別に参照として本明細書に組み入れられると指定されるのと同じように、参照として本明細書に組み入れられる。任意の出版物の引用は、出願日に先だって提供されるものであり、本発明が、先行発明により、それらの出版物を事前の日付にする権利を有することを了承したものとして判断されない。
前述の発明を、理解を助けること目的として説明および実施例を挙げて、ある程度詳細に述べたが、任意の変更および修正が、添付の特許請求の意図または範囲から解離することなく加えられる場合があることは、本発明の内容に鑑みて当業者には容易に明らかになる。
Claims (55)
- 細胞中に存在する場合に持続的で高レベルの発現を可能とする発現カセットを含む、細菌由来の転写サイレンシング配列を欠く環状ベクター。
- 一方向性の部位特異的リコンビナーゼの産物ハイブリッド配列を含む、請求項1記載の環状ベクター。
- 一方向性の部位特異的リコンビナーゼがインテグラーゼである、請求項2記載の環状ベクター。
- インテグラーゼがφC31である、請求項3記載の環状ベクター。
- 長さが約0.3 kb〜約10 kbである、請求項1記載の環状ベクター。
- 2本鎖である、請求項1記載の環状ベクター。
- デオキシリボ核酸ベクターである、請求項1記載の環状ベクター。
- 請求項1記載の複数の環状ベクターを含む組成物。
- 複数の環状ベクターが、薬学的に許容される輸送用溶媒中に存在する、請求項8記載の組成物。
- 標的細胞中に、細菌由来の転写サイレンシング配列を欠く環状ベクターを導入する段階を含む、発現カセットを標的細胞に導入する方法であって、該環状ベクターは発現カセットを含み、細胞中に存在する場合に、発現カセットの持続的で高レベルの発現を可能とする、方法。
- 導入する段階をエクスビボで行う、請求項10記載の方法。
- 導入する段階をインビボで行う、請求項10記載の方法。
- 標的細胞が、血管を有する多細胞生物中に存在する、請求項12記載の方法。
- 細菌由来の転写サイレンシング配列を欠く環状ベクターを血管を有する多細胞生物に全身投与することで、発現カセットにコードされたタンパク質を、標的細胞中で高レベルで発現させる段階
を含む、発現カセットにコードされたタンパク質が、標的細胞中で高レベルで持続的に発現されるように、血管を有する多細胞生物の標的細胞に発現カセットを導入する方法であって、
該環状ベクターは発現カセットを含み、標的細胞中に存在する場合に、発現カセットの持続的で高レベルの発現を可能とする、方法。 - 投与する段階が静脈経由である、請求項14記載の方法。
- 血管を有する多細胞生物が哺乳類である、請求項14記載の方法。
- 標的細胞が肝細胞である、請求項14記載の方法。
- 細菌由来の転写サイレンシング配列を欠く環状ベクターの水性剤形を静脈経由で哺乳類に投与することで、タンパク質を肝臓標的細胞中で高レベルで発現させる段階
を含む、哺乳類の肝臓標的細胞中でタンパク質を高レベルで持続的に発現させる方法であって、
該環状ベクターは発現カセットを含み、細胞中に存在する場合に、発現カセットの持続的で高レベルの発現を可能とする、方法。 - ベクターが、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの産物ハイブリッド配列を含む、請求項18記載の方法。
- 以下を含む、請求項10記載の方法を実施するためのキット:
(a)請求項1記載のベクター;および
(b)請求項10記載の方法におけるベクターの使用に関する指示書。 - 以下の段階を含む、発現カセットを含む環状核酸ベクターの調製法:
一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識されるattB部位とattP部位に挟まれた発現カセットを含む親核酸を、一方向性の部位特異的リコンビナーゼと、発現カセットを含む環状核酸ベクターが十分産生される条件で接触させる段階。 - 親核酸が細菌配列を含む、請求項21記載の方法。
- ベクターが、一方向性の部位特異的リコンビナーゼの産物ハイブリッド配列を含む、請求項21記載の方法。
- インビトロで行う、請求項21記載の方法。
- 細胞内部で行う、請求項21記載の方法。
- 親核酸が細胞内でエピソーム状の核酸である、請求項25記載の方法。
- 親核酸が細胞のゲノムDNA中に組込まれる、請求項25記載の方法。
- 親核酸が一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列が誘導型プロモーターの制御下にある、請求項28記載の方法。
- リコンビナーゼの発現を誘導する段階をさらに含む、請求項29記載の方法。
- 細胞を親核酸で形質転換する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 親核酸が、細胞に内因性でなはい制限エンドヌクレアーゼによって認識される制限エンドヌクレアーゼ切断部位、および誘導型プロモーターの制御下にある制限エンドヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼの発現を誘導する段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
- 産物環状ベクター核酸を単離する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 以下の段階を含む、発現カセットを含む環状核酸ベクターの調製法:
(a)以下を含む、宿主細胞を作製する段階:
(i)一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識されるattB部位とattP部位に挟まれた発現カセットを含む親核酸;および
(ii)第1の誘導型プロモーターの制御下にある一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列;
(b)一方向性の部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導して、環状核酸ベクターを宿主細胞中で産生させる段階;ならびに
(c)産物核酸ベクターを、宿主細胞の残分から分離して、環状核酸ベクターを産生させる段階。 - 親核酸が宿主細胞のゲノムに組込まれる、請求項35記載の方法。
- 親核酸がエピソーム状で宿主細胞中で維持される、請求項35記載の方法。
- 親核酸が、第1の誘導型プロモーターの制御下に一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む環状2本鎖DNA分子である、請求項37記載の方法。
- 親核酸が、宿主細胞に内因性ではない制限エンドヌクレアーゼによって認識される制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含む、請求項38記載の方法。
- 親核酸が、第2の誘導型プロモーターの制御下に制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項39記載の方法。
- 一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識されるattB部位とattP部位に挟まれたクローニング部位を含む核酸。
- クローニング部位がマルチクローニングサイトの一部である、請求項41記載の核酸。
- クローニング部位が発現カセットを含む、請求項41記載の核酸。
- 核酸が、第1の誘導型プロモーターの制御下に一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む、請求項41記載の核酸。
- 核酸が、核酸によって形質転換される宿主細胞に内因性ではない制限エンドヌクレアーゼによって認識される制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含む、請求項41記載の核酸。
- 核酸が、第2の誘導型プロモーターの制御下に制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項45記載の核酸。
- 一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識されるattB部位とattP部位に挟まれたクローニング部位を含む核酸で形質転換される宿主細胞。
- クローニング部位がマルチクローニングサイトの一部である、請求項47記載の宿主細胞。
- クローニング部位が発現カセットを含む、請求項47記載の宿主細胞。
- 核酸が、第1の誘導型プロモーターの制御下に一方向性の部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む、請求項47記載の宿主細胞。
- 核酸が、核酸によって形質転換される宿主細胞に内因性ではない制限エンドヌクレアーゼによって認識される制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含む、請求項47記載の宿主細胞。
- 核酸が、第2の誘導型プロモーターの制御下に制限エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項51記載の宿主細胞。
- 以下を含むキット:
(a)一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識されるattB部位とattP部位に挟まれたクローニング部位を含む核酸;および
(b)請求項21記載の方法における核酸の使用に関する指示書。 - キットが宿主細胞をさらに含む、請求項53記載のキット。
- 以下を含む、請求項21記載の方法の実施に使用される系:
(a)一方向性の部位特異的リコンビナーゼによって認識されるattB部位とattP部位に挟まれたクローニング部位を含む核酸;および
(b)宿主細胞。
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