HU222040B1 - Eljárás humán porc, csont és neurális sejtvonalak előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás humán porc-, csont- és neurális sejtvonalelőállítására, amely abban áll, hogy i) differenciálatlan humánporcőssejteket, csontvelőstromasejteket vagy neurális sejteket olyanimmortalizálógénnel immortalizálnak, amely magában foglal vagykapcsolatos egy olyan szabályozóeszközzel, amely szabályozóeszközaktiválása megszünteti az immortalizálást, és hagyja adifferenciálatlan sejteket differenciálódni, ii) a fenti immortalizáltsejtek tenyésztésével homogén humán sejttenyészetet hoznak létre, iii)a szabályozóeszköz aktiválásával megszüntetik az immortalizálást ésaktiválják a differenciálódást, és iv) a fenti sejtek teljesendifferenciálódott humán porc-, csont- vagy neurális sejtekké valódifferenciálódását hagyják végbemenni, ebben a folyamatban a sejteketdifferenciálószernek teszik ki. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás humán porc-, csont- és neurális sejtvonalak előállítására.

Széleskörűen ismert, hogy előnyös lenne, ha olyan in vitro sejtmodellekkel bírnánk, amelyek az in vivő körülményeket szimulálják. Az lenne az ideális, ha a sejtmodellek tenyészetben szaporíthatok lennének, specializált szöveti funkciókat fejeznének ki, és a tenyésztési körülmények egyszerű manipulálásával lehetővé tennék alapvető biológiai problémák megoldását. Ezért nem meglepő, hogy a kutatók sok évet töltöttek az in vitro sejtmodellek tökéletesítésére vonatkozó kísérletekkel, és ezen munkájuk során felismerték, hogy a normális differenciálódott sejtek általában nem szaporodnak tenyészetben, és gyakran megszüntetik specializált funkciójuk kifejezését. Valójában Leonard Hayflick már 1965-ben közölte, hogy az emberi tüdőfibroblasztokat szövettenyészetben megfigyelve ezen sejtek lehetséges osztódásainak száma korlátozott. Hasonló megfigyelést tettek szövettípusok széles körére vonatkozóan, és lényegében arra a felismerésre jutottak, hogy minden típusú szövet vagy sejt jellemző számú osztódáson megy át, majd a sejt megöregszik vagy apoptózis következik be. Annak érdekében, hogy megkerüljék a sejt korral kapcsolatos pusztulását vagy elöregedését, a kutatók olyan aberráns tumorsejtvonalakat vizsgáltak, amelyek tenyészetben jóval az azonos szövettípushoz tartozó normális sejteknél szokásos szaporodási időn túli szaporodásra képesek, azaz a sejtek immortalizáltak. Előnyösen ezek az immortalizált sejtek megőrzik szövetfajlagos funkciók kifejezésére való képességüket. Ezért az immortalizált sejtek kedvező eszköznek tűnnek in vitro kutatásokhoz.

Valójában, történetileg a sejtvonalak létrehozása azon a megfigyelésen alapult, hogy a tumorsejtek nem mutatnak apoptózist. így a korai sejtvonalak csak tumorsejtekből származóak voltak, vagy spontán immortalizált sejtvariánsok, amelyek szövettenyészetben könnyen szaporodtak. Ezt követően az a felismerés, hogy bizonyos virusonkogének képesek különféle normál sejttípusoknak korlátlan szaporodási képességet kölcsönözni, a nem humán sejtvonalak gyors létrehozásához vezetett, ezen immortalizálógéneknek a kívánt normális sejttípusokba in vitro való transzfektálása révén. Az immortalizálógének különféle stratégiákkal vihetők be a sejtekbe, például transzfektálással és retrovírus által közvetített géninszercióval. így az immortalizálógének alkalmazása megkönnyítette a különféle szövetekből származó nem humán sejtvonalak széles körének biztosítását.

Az elmúlt 15 év alatt lehetővé vált differenciált funkcióikat megőrző nem humán sejtvonalak létrehozása normálsejtek kémiai karcinogénekkel [Stampfer M. R., Bartley J. C. 1985. Induction of transformation and continuous cell-lines írom normál mammary epithelial cells after exposure to benzo[a]pyrene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2394-2398], onkogénekkel [Amsterdam A., Zauberman A., Meir G., Pinhasi-Kimhi O., Suh B. S., Oren M. 1988. Cotransformation of granulosa cells with simian vírus 40 and Ha-RAS oncogene generates stable lines capable of induced steroiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7582-7586] és tumorvírusokkal [Vitry F., Camier M., Czemichow P., Benda P., Colién P., Tixier-Vidal A. 1974. Establishment of a clone of mouse hypothalamic neurosecretory cells synthesising neurophysin and vasopressin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3575-3579 és Isom H. C., Tevethia J., Taylor J. M. 1980. Transformation of isolated rat hepatocytes with simian vírus 40., J. Cell. Bioi. 85, 651-659] való transzformálásával. A kutatók arra is kísérletet tettek, hogy a differenciált funkciókat megőrző humán sejtvonalakat hozzanak létre onkogének [Yoakum G. H., Lechner J. F., Gabrielson E. W., Korba B. E., Malan-Shibley L., Willwy J. C., Valerio M. G., Shamsuddin A. M., Trump B. F., Harris C. C. 1985. Transformation of humán bronchial epithelial cells transfected by Harvey’ras oncogene. Science 227, 1174-1179] és tumorvírusok [Rhim J. S., Jay G., Amstein P., Price F. M., Sanford K. K., Aaronson S. A. 1985. Neoplastic transformation of humán epidermal keratinocytes by AD12-SV40 and Kirsten sarcoma viruses. Science 227, 1250-1252] alkalmazásával. Bár lehetséges olyan humán sejtvonalak létrehozása, amelyek bizonyos differenciált funkciókat megőriztek, ezek a sejtvonalak azonban legfeljebb néhány replikáción mentek át apoptózisukat vagy elöregedésüket megelőzően. Ebből következik, hogy az ilyen sejtvonalak in vitro vizsgálatok céljára csekély értékűek.

A nem humán sejtvonalak előállításában elért jelentős siker figyelembevételével bosszantó és frusztráló, hogy ez ideig nem sikerült ugyanezzel a technikával humán sejtvonalakat sikeresen előállítani, a sikeresen megjelölésen szövetfajlagos jellemzőiket megőrző immortalizált sejtvonalak nyerését értjük. Nyilvánvaló, hogy immortalizálás hiányában és szövetfajlagos jellemzők hiányában a létrehozott sejtvonalak nem alkalmazhatóak megbízható in vitro sejtmodellekként.

Érdekes megemlíteni, hogy immortalizált egérsejtvonalak előállíthatok a fenti eljárások bármelyikével, míg immortalizált humán sejtvonalak előállítása nem lehetséges. A különbség - részben - kapcsolatos lehet annak az organizmusnak a várható élettartamával, amelyből a sejtek származnak. Például egy egér várható élettartama mintegy 2 év, míg egy emberé mintegy 70-80 év, ezért lehetséges, hogy a várható élettartamban lévő ilyen jelentős különbség miatt a humán sejtreplikáció szigorúbb szabályozás alatt áll, és ez a szigorú szabályozás - részben - felelős lehet a differenciáit humán sejtvonalak előállításának általános sikertelenségéért.

Neurális sejtek immortalizálásának lehetőségeivel korábban már magunk is foglalkoztunk, ezen vizsgálataink patkánysejtekre vonatkoztak [Stringer B. M. J. és munkatársai: Raphé neural cell immortalized with a temperature-sensitive oncogene, Developmental Brain Research 79, 267-274 (1974)].

A találmány azon a nem várt felismerésen alapszik, hogy a várakozással ellentétesen lehetséges olyan immortalizált porc-, csont- és neurális humán sejtvonal előállítása, amely szövetfajlagos funkciót fejez ki, ha a találmány szerinti módon járunk el, ami abban áll, hogy éretlen, differenciálatlan vagy prekurzorsejteket alkalmazunk. Bár ilyen sejteket korábban használtak diffe2

HU 222 040 Β1 renciálódás tanulmányozására, senki nem ismerte még fel, hogy az ilyen sejtek rutinszerűen alkalmazhatók az érett differenciált fenotípusnál látható szövetfajlagos funkciók kifejezésére képes immortalizált humán sejtvonalak létrehozására.

Ezért fontos megjegyeznünk, hogy bár differenciálatlan sejteket alkalmaztak olyan sejtvonalak készítésére, amelyeket differenciálódási eljárás vizsgálatának céljára alkalmaztak olyan esetekben, amikor differenciálatlan sejtből akartak kiindulni, és a differenciálódáshoz vezető folyamatot akarták tanulmányozni, senki nem adott arra vonatkozó kitanítást, hogy a differenciálatlan sejtek forrásul szolgálhatnának sejtvonal létrehozásához, ha egyszerűen differenciált sejteket kívánnak tanulmányozni. Sőt, az a szokásos, hogy differenciált sejtből indulnak ki, és ezt a differenciált sejtet humán sejtvonal létrehozása céljából immortalizálják. Ezért érdekes megemlíteni, hogy a találmány a szokásos kitanításokkal ellentétes módszert nyújt.

Megjegyzésre méltó továbbá, hogy ha a differenciálódás folyamatának tanulmányozására differenciálatlan sejteket alkalmaznak humán sejtvonalak létrehozására, és ha szabályozható immortalizálószert, például SV40 nagy tumor T-antigént alkalmaznak, az eljárás mindig magában foglalja az immortalizálószemek a differenciálódás útjának előre megválasztott szakaszaiban való működésbe léptetését és hatásának megszüntetését (ki- és bekapcsolását), hogy a differenciálódás ezen meghatározott szakaszainak termékei a differenciálódási út feltérképezésére szolgáló markerek tekintetében azonosíthatók legyenek. Ezzel ellentétben, a találmány szerinti eljárás differenciálatlan sejtek alkalmazásában áll, amelyeket egy végső differenciálódás irányába haladó folytonos folyamaton hagyunk végighaladni, hogy a differenciált sejtet tanulmányozhassuk, ismételjük, látható, hogy a találmány szerinti eljárás a szokásos kitanítással ellentétes.

Fentiekből látható, hogy szükség van in vitro sejtmodellekként használható immortalizált humán sejtvonalak létrehozására, ennek megfelelően a találmány tárgya ilyen porc-, csont- és neurális sejtvonalak létrehozására alkalmas eljárás.

A találmány ennek megfelelően humán porc-, csont- és neurális sejtvonalak előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, amely eljárás abban áll, hogy

i) differenciálatlan humán porcőssejteket, csontvelőstromasejteket vagy neurális sejteket olyan immortalizálógénnel immortalizálunk, amely magában foglal vagy kapcsolatos egy olyan szabályozóeszközzel, amely szabályozóeszköz aktiválása megszünteti az immortalizálást, és hagyja a differenciálatlan sejteket differenciálódni, ii) a fenti immortalizált sejtek tenyésztésével homogén humán sejttenyészetet hozunk létre, iii) a szabályozóeszköz aktiválásával megszüntetjük az immortalizálást és aktiváljuk a differenciálódást, és iv) a fenti sejtek teljesen differenciálódott humán porc-, csont- vagy neurális sejtekké való differenciálódását hagyjuk végbemenni, ebben a folyamatban a sejteket differenciálószemek tesszük ki.

Az előzőekben említett szabályozóeszköz tekintetében elsősorban azt jegyezzük meg, hogy általa az immortalizálógén a találmány szerint úgy szabályozható, hogy a szabályozóeszköz aktiválása megszünteti az immortalizációt, és megengedi a differenciálatlan sejtek differenciálódását. Gének, így az immortalizálógének szabályozhatósága szakember számára ismert. Immortalizálógének esetén ezt esetenként a „feltételesen immortalizáló” megnevezéssel fejezik ki. Ilyen szabályozóeszközt ismertetnek például a WO 89/09816 közzétételi számú szabadalmi leírásban (McKay).

A fentiekből látható, hogy a találmány szerinti eljárásra differenciálatlan porc-, csont- vagy neurális sejtek alkalmazása jellemző, amelyeket annak érdekében alkalmazunk, hogy a kívánt teljesen differenciálódott humán porc-, csont- vagy neurális sejtvonalat nyerjük. Fentiekből következik, hogy a differenciálatlan sejtek megválasztása meghatározza a sejtvonal természetét, így például osteoblast-sejtvonalat csontvelőstromasejtek alkalmazásával nyerünk; osteoclast-sejtvonalat nyerünk hemapoietikus eredetű osteoclast-prekurzorok alkalmazásával. A fenti példákból látható, hogy egy adott sejtvonal természete meghatározható a találmány szerinti eljárásban alkalmazott differenciálódott sejtek típusa tekintetében.

Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy differenciálatlan porc-, csont- vagy neurális sejtek találmány szerinti eljárásban való alkalmazásánál a kapott immortalizált humán porc-, csont- vagy neurális sejtvonalak megőrzik annak a sejttípusnak a funkcionális jellemzőit, amelyből a sejtvonal származik. Ennek folytán sajátos módon képessé váltunk in vitro sejtmodelleként alkalmazható humán sejtvonalak létrehozására. Az általunk létrehozott sejtvonalak immortalizáltak és megbízhatóak.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az immortalizálást szokásos transzfekciós eljárás alkalmazásával éljük el, előnyösen olyan immortalizálószert alkalmazunk, amelynek immortalizálógénje onkogén, még előnyösebben az immortalizálószer egy vírusonkogén, amely a gazdasejt genomjába stabilan beépülhet.

Ideális esetben az immortalizálószer egy konstruktum, előnyösen egy retrovírus-konstruktum, amely egy olyan onkogént foglal magában, amely víruseredetű vagy humán eredetű. Bármely ismert onkogén alkalmazható, például a myc, ras, src stb.

Sejtek immortalizálására alkalmazható típusú vektorokat a WO 89/09816 számon közzétett szabadalmi leírásban (McKay) ismertetnek.

Más módon, az immortalizálást kiválthatjuk fizikai vagy kémiai eszközökkel, például az adott sejtet sugárzásnak vagy olyan kémiai reagenseknek kitéve, amelyekről ismert, hogy a fizikai vagy kémiai hatásoknak ki nem tett sejteknél szokásos normál mértékű sejtosztódásnál lényegesen nagyobb mértékű sejtosztódást váltanak ki.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a szabályozóeszköz környezeti körülményekre, például hőmérsékletre, pH-ra vagy ionkoncentrációra reagáló.

HU 222 040 Bl

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint az immortalizálószer és a szabályozóeszköz integráltak, azaz az immortalizálószer maga szabályozható. így az immortalizálószer és a szabályozóeszköz például egyetlen egységből áll, amely lehet például egy hőmérsékletre érzékeny onkogén. Más módon, az immortalizálószer és a szabályozóeszköz lehet két egymástól független egység is, de mindkét esetben ideálisan a szabályozóeszköz aktiválása/dezaktiválása egy közvetlen hatáson alapszik, például az egyik megvalósítási mód szerint az immortalizálószerre kifejtett reciprok hatáson. Például, ha a szabályozóeszköz aktivált, az immortalizálószer dezaktivált. Fordított módon, ha a szabályozóeszköz dezaktivált, az immortalizálószer aktivált. Ideális szabályozás érhető el a tenyésztési vagy környezeti körülmények tekintetbevételével például a találmány egy olyan előnyös megvalósítási módja mellett, amelynél hőmérsékletre érzékeny immortalizálószert alkalmazunk, és a szabályozást ily módon egy hőmérséklet-érzékeny kapcsoló képviseli úgy, hogy egy adott hőmérséklet körüli, feletti vagy alatti értéken az immortalizálószer aktiválódik, a kiválasztott sejttípust immortalizálja, de egy második adott hőmérsékleten, akörüli vagy afeletti hőmérsékleten az immortalizálószer dezaktiválódik, és így az immortalizálódás megszűnik, és végbemehet a differenciálódás, miáltal az adott sejttípus homogén populációja jön létre.

Előnyösen az immortalizálószer az SV40-T-antigén, amely permisszív, azaz a vírusgén aktív formában fejeződik ki 33 °C hőmérsékleten, de nem permisszív, azaz a vírusgén inaktív formában fejeződik ki 39 °C hőmérsékleten, így az ennek a szemek az alkalmazásával immortalizált sejtek a differenciálódás tekintetében hőmérséklet-érzékenyek.

Sajátos módon, sejtjeink SV40-T-antigén alkalmazásával transzformálva, nem permisszív hőmérsékleten differenciálódnak, és olyan kríziskörülményeket élnek túl, amelyeket jellemzően apoptózis követ. A krízis túlélése tekintetében sejtjeink immortalizáltak. Úgy véljük, hogy az immortalizált állapot annak következménye, hogy a találmány szerinti eljárásban differenciálatlan vagy prekurzorsejteket alkalmazunk.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a sejtek differenciálódása úgy megy végbe, hogy a sejteket differenciálószer, például osteoblastok termelésére szolgáló differenciálószer jelenlétében tenyésztjük, ilyen differenciálószerként D₃-vitamint alkalmazunk előnyösen K-vitamin jelenlétében.

Egy másik megvalósítási mód szerint a sejtek differenciálódása úgy megy végbe, hogy a sejteket például osteoblastok képződésének kedvező differenciálószer, így dexametazon jelenlétében tenyésztjük.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a sejtek differenciálódását differenciálószer, például adipocyták képződésének megfelelő differenciálószer jelenlétében hagyjuk végbemenni, ez a differenciálószer a nyúlszérum vagy annak kivonata.

A találmány egy még további előnyös megvalósítási módja szerint az említett humán porc-, csont- vagy neurális sejtvonal egy olyan biztonsági jellemzőt is magában foglal, amely lehetővé teszi a sejtvonal szelektív inaktiválását vagy elroncsolását. Ez a biztonsági jellemző akkor előnyös, ha a sejtvonalat transzplantáció céljára alkalmazzuk, vagy más esetben, ha egy egyedhez állandóan vagy időszakosan kapcsoljuk, neki adagoljuk vagy benne tároljuk. A biztonsági jellemző lehetővé teszi, hogy a sejtvonalat szelektíven inaktiváljuk, amin ártalmatlanná tételét értjük, vagy elroncsoljuk, olyan esetekben, ha úgy véljük, vagy bebizonyosodott, hogy a sejtvonal in vivő tumorkeltővé válhat, vagy egy egyedre bármely módon károsnak véljük.

A biztonsági jellemző előnyösen olyan gént foglal magában, amelynek termékei közvetlenül vagy közvetve a sejtvonal hatástalanítását vagy pusztulását okozzák. Például az ilyen gén lehet bizonyos szerek, például vírusellenes szerek jelenlétében citotoxikus terméket termelő gén. Az ilyen gének példájaként említjük a vírus-timidin-kinázt (vTK) kódoló gént. Ez a gén az előírt vírusellenes szert mohón alakítja citotoxikus köztitermékké. Egy másik biztonsági jellemzőként alkalmazható gén a citozin-dezamináz (CD)-gén. Ennek a génnek a terméke a sejtet az 5-fluor-citozin hatása által sebezhetővé teszi, és ezáltal a sejt pusztulását okozza.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a biztonsági jellemző az immortalizáló onkogénnel együtt fejeződik ki. Ez az elrendezés azért előnyös, mert azt jelenti, hogy az immortalizálógén nem képes kifejeződni a biztonsági jellemző hiányában és fordítva.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a biztonsági jellemzőül szolgáló gén az immortalizáló onkogéntől a 3’-terminális irányában helyezkedik el, ideális esetben, például egy poliovírus-eredetű belső riboszomális belépésihely-szekvencia (IRES) mellett, attól közvetlenül a 3'-terminális irányában. Ez az elrendezés biztosítja, hogy az immortalizáló onkogén transzkripcióját szabályozó promoter/enhancer elemek azonos módon szabályozzák a biztonsági jellemző transzkripcióját is.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy más elrendezés is alkalmazható az immortalizáló onkogén és a biztonságijellemző együttes kifejeződésének lehetővé tételére, az elrendezésre vonatkozó fenti példa nem szolgál a találmány oltalmi körének korlátozására.

A találmány egy további szempontját tekintve osteoblastsejtek termelésére szolgáló eljárásra vonatkozik, amely eljárás abban áll, hogy humán sejtvonalakat a találmány szerinti módon differenciálószer hatásának teszünk ki.

Differenciálószerként előnyösen D_rvitamint alkalmazunk, előnyösen K-vitamin jelenlétében.

Differenciálószerként előnyösen dexametazont alkalmazunk.

A találmány egy további szempontját tekintve adipocyták előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, amelyet humán sejtvonalakból a találmány szerinti eljárással, differenciálószer alkalmazásával végzünk.

Differenciálószerként előnyösen nyúlszérumot vagy annak extraktumát alkalmazzuk.

A találmány egy további szempontját tekintve olyan szer azonosítására vonatkozó eljárásra vonatko4 i

HU 222 040 Bl zik, amely adipocyták termeléséhez vezető differenciálódás stimulálásáért felelős, az eljárás abban áll, hogy humán sejtvonalat a találmány szerinti módon az adott szemek teszünk ki, és a differenciálódott fenotípus bármely jellemzőjét vizsgáljuk.

Előnyösen a fenti szert nyúlszérumból extrahálással nyerjük elválasztási eljárás alkalmazásával, például ionszeparálással, kromatografálással, fehéijekicsapással stb.

A találmány egy további szempontja szerint nyúlszérum adipocyták előállítására való alkalmazására vonatkozik, az adipocytákat egy sejtvonalból, előnyösen csontvelősejtvonalból vagy legalább egy prekurzorsejtből, előnyösen egy csontvelő-prekurzorsejtből állítjuk elő.

A találmány egy további szemponlja szerint olyan kompozícióra vonatkozik, amely egy differenciálódási folyamatot kiváltó szert tartalmaz. Az ilyen kompozíció előnyösen gyógyászati kompozíció.

A fenti szer előnyösen a differenciálódás folyamatát stimulálja.

Más módon, a fenti szer az adipocyták nyeréséhez vezető differenciálódást blokkolja vagy megelőzi.

Az osteoporosisban szenvedő betegek csontveleje gyakran zsírszövetet tartalmaz, ezt gyakran zsírvelőként nevezik. Ez a megfigyelés azzal az észlelésünkkel együttesen, hogy ugyanaz a humán csontvelőstromasejt adipocytákat és osteoblastokat is eredményezhet, azt a következtetést valószínűsíti, hogy az osteoporosis a csontvelőstromasejtek differenciálódási zavarának következménye lehet, amely abban áll, hogy a differenciálódás az osteoblastvonaltól az adipocyta-képződés javára tolódik el. Ez az információ ezért szakember számára útmutatást ad arra, hogy vizsgálja meg az ilyen differenciálódási eljárás szabályozására képes gyógyszerek biztosításának lehetőségét. Például normál nyúlszérum-szeparáló eljárások (ionos, HPLC, más kromatográfiás eljárások, fehérjekicsapás és elválasztás stb.) során alkalmazott szeparálószerek alkalmazhatók az adipocyta-sejtvonallá való differenciálódást kiváltó szer vagy szerek meghatározására. Ezek a szerek a differenciálódási eljárásban érintett intracelluláris jelátvivő utak felismerésére alkalmazhatók, és ezt követően olyan szerek kifejlesztésére, amelyek erre az útra hatnak. Ez az információ az obezitás szabályozására szolgáló szerek azonosításához is vezethet.

A találmány egy további szempontját tekintve a találmány szerinti eljárással előállított sejtekre vagy sejtvonalakra vonatkozik. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi legalább egy homogén, immortalizált humán sejtpopuláció, amely az immortalizálást megszüntető eszközzel bír, amellyel differenciált humán sejtek homogén populációját nyeljük.

A találmányt a továbbiakban példákban mutatjuk be humán csontsejtvonalra és a csatolt ábrákra való hivatkozással.

Az 1. ábrán a hőmérséklet és dexametazon (5 χ 10'⁷ mol/1) adagolásának hatását mutatjuk be csontvelőstroma- 7 klónsejtek lúgos foszfatázaktivitására.

Az 1. táblázatban a hőmérséklet és dexametazon hatását mutatjuk be mRNS kifejeződésére humán csontvelőstromasejtek immortalizált kiónjában.

A 2. ábrán megfestett, 33 °C hőmérsékletű, kezeletlen immortalizált humán csontvelőstromasejt-klón mikroszkópos képét mutatjuk be 100-szoros nagyítás mellett.

A 3. ábrán 5 χ 10~⁷ mol/1 dexametazonnal 39 °C hőmérsékleten kezelt, 39 °C hőmérsékletű, megfestett immortalizált humán csontvelőstromasejt-klón mikroszkópos képét mutatjuk be.

A 4. ábrán immortalizált humán csontvelőstromasejt-klón és egy vegyes populáció festését mutatjuk be 5 χ 10-⁷ mol/1 dexametazonnal és anélkül, 39 °C hőmérsékleten.

Az5. ábrán5xlO-⁷ mol/1 dexametazonnal 39 °C hőmérsékleten kezelt immortalizált humán csontvelősejtklón festését mutatjuk be.

A 6. ábra oszlopdiagram, amelyen különféle agonisták hatását mutatjuk be a 7. klón sejtjeinek cAMP-szintjére. A sejteket 5 percen át 1 mmol/1 IBMX-szel átitatjuk, majd 20 percig az agonista megfelelő dózisával kezeljük. A cAMP-szinteket Ε. I. A. módszerrel mennyiségileg határozzuk meg, az egyes kezeléseknél kapott cAMP-mennyiségeket a kontrolihoz (csak IBMX) hasonlítjuk, és annak százalékában fejezzük ki. Minden csoportot statisztikai analízissel hasonlítunk a kontrolihoz (Student t-teszt).

A 7. ábra oszlopdiagram, amelyen a 7. klón sejtjeinek 4 napos időtartalom alatt való osteokalcin-szintézise látható. A sejteket K-vitamin jelenlétében 4 napig l,25(OH)₂D₃-vitamin különböző koncentrációival kezeltük. A tápközeget eltávolítottuk, és az osteokalcin mennyiségét R. I. A. eljárással mértük, az osteokalcinszinteket ng osteokalcin/10 000 sejt szintre normalizáltuk.

A 8., 9., 10. és 11. ábrák színképek, amelyek a 7.

klón immortalizált csontvelőstroma-sejtvonal oil-red-0 színezékkel való festését mutatják. A 8. és 9. ábrákon a sejteket 10% nyúlszérummal 39 °C hőmérsékleten 3 napon át való kezelést követően mutatjuk be 100-szoros nagyításban. A 10. ábrán 10%-os nyúlszérummal 39 °C hőmérsékleten 3 napon át kezelt sejteket mutatunk be 200-szoros nagyításban. All. ábrán 10%-os magzati borjúszérummal 39 °C hőmérsékleten 3 napon át kezelt sejteket mutatunk be 100-szoros nagyításban.

A 12. ábra oszlopdiagram, amelyen dexametazon hatását mutatjuk be három immortali5

HU 222 040 Bl zált humán magzati sejtklón lúgos foszfatázaktivitására 39 °C hőmérsékleten 7 napon át végzett kezeléssel.

A 13. ábrán a terhesség 7-9. hetében lévő humán magzatból származó mintegy 600 pm hosszúságú combcsontot mutatunk be.

A 14. ábrán hőmérséklet-érzékeny SV40T onkogénnel immortalizált humán kortikális prekurzortenyészet sejtjeinek immunhisztokémiai analízisét mutatjuk be.

Csontvelöstromasejtekimmortalizálása

Humán trabeculacsontot olyan tápközegbe merítünk, amely EMEM mellett 10% magzati borjúszérumot, L-glutamint, továbbá lxpenicillin/sztreptomicint tartalmaz (minden anyag a Sigma Chemicals terméke), és az elegyet a csontvelő-sejtpopuláció szabaddá válása céljából keveijük. 24 órán át hagyjuk a stroma-sejtpopulációt a szövettenyésztő lombik (Costar, UK, Ltd.) felszínéhez tapadni, majd a tápközeget kicseréljük a meg nem tapadt sejtpopuláció eltávolítására. Ezt követően a megtapadt sejtpopulációt retrovírus-transzdukcióval transzfektáljuk nagy tumor (T)-antigénből származó majom 40 vírus hőmérséklet-szenzitív mutánsával. Ennek a szekvenciának a transzfektálására bármely szokásos módszer megfelelő (megfelelő promoterhez való kapcsolással, hogy az az expressziót irányítsa, például LTR promoterrel), például kalcium-foszfát DNS kicsapással, elektroporációval vagy mikroinjektálással, de alkalmazásának egyszerűsége folytán retrovírus-transzdukciót alkalmazunk.

Az immortalizált sejtek tenyésztése homogén sejtpopuláció nyerésére

Röviden, amfotropikusan csomagolt, a fenti konstrukciót és G418, geneticinnel szembeni rezisztenciamarkert tartalmazó retrovírus-részecskéket [Dr. M. O’Hare (Institute of Cancer Research, Royal Marsden Hospital, Lincoln’s Inn, Sutton, Surrey) és Professor P. Gallimore (The University of Birmingham, UK) szíves adománya] és 0,8 mg/ml végkoncentrációt kitevő polibrént (Sigma Chemicals) adunk a tápközeghez. A vírustitert úgy állítjuk be, hogy alacsony, 0,0002%os transzdukciós hatékonyságot adjon, egy-egy lombikban átlagosan 20 immortalizált sejtkolóniát eredményezzen, ahol minden kolónia egyetlen sejtből származik. A vírusadagolás után 2 órával a tenyésztő tápközeget friss tápközegre cseréljük ki. A tenyészeteket 33 °C hőmérsékleten tartjuk, ami az SV40-T-onkogén-termék aktív formájának megengedő (permisszív) hőmérséklete. A transzdukciót követően 5 nap múlva a tápközeghez 0,4 mg/ml geneticint adunk, és további 10 napig folytatjuk a tenyésztést, hogy kipusztítsuk azokat a sejteket, amelyek nem építették be a retrovírusvektort.

Az említett sejtek differenciálása

A transzdukciót követő 14-20. napokon azonosítjuk a replikálódó sejtek alkotta egyedi kolóniákat. A kiónokat a többi replikálódó teleptől való jó elhatároltságuk alapján szelektáljuk, minden kolónia sejtjeinek száma 100-1000 közötti. Ezeket gyűrűklónozással kivesszük, és 75 cm²-es lombikokban (Costar, UK Ltd.) közel összefolyóan benőtt felületűig tenyésztjük, ami egyetlen sejtre vonatkozóan mintegy 22 osztódásnak felel meg, majd ezt követően aliquot részeket lefagyasztunk. Ilyen módon létrehozott sejtekből álló mintákat szaporítottunk tenyészetben egy éven át, és egyes kiónok több mint 60 osztódáson (10¹⁸ sejt) mentek át. A mintákat felhasználtuk a sejtek jellemzésére is, és annak meghatározására, hogy bírnak-e érett osteoblastszerű sejtekké való differenciálódási képességgel. A differenciálódást úgy váltottuk ki, hogy a sejteket az onkogének nem permisszív hőmérsékletének (39 °C) és differenciálószer (például dexametazon vagy D₃-vitamin) hatásának tettük ki.

Szelektíven szabályozható biztonsági jellemzővel bíró humán sejtvonalak létrehozása A találmány egy másik előnyös megvalósítási módját képviseli sejtek homogén populációjának létrehozása retrovírus-transzdukcióval, olyan módon, hogy egy olyan biztonsági jellemzőt is beépítünk, amely lehetővé teszi a sejtek szükség esetén való szelektív elpusztítását. Ez előnyösnek tekinthető akkor, ha a sejteket betegekbe való transzplantációra használjuk olyan tünetek könnyítésére, mint például a neurodegeneratív rendellenességek, osteoporosis vagy osteoarthritis.

A biztonsági jellemző lehetővé teszi, hogy a transzplantátumot szelektíven elpusztítsuk, például az olyan helyzetekben, ha a transzplantált anyag in vivő daganatképzővé válna. Ennek megvalósítására szakember számára számos módszer ismert. Például vírus-timidin-kináz (vTK)-gén adagolása a ts-SV40-T transzdukciós sejtekhez megfelelő promoter szabályozása alatt azzal az eredménnyel jár, hogy az SV40-T-t kifejező sejtek ugyancsak kifejezik a vTK-gént. Ez a gén mohón alakítja át az előírt vírusellenes gyógyszereket, például a ganciklovirt vagy aciklovirt olyan citotoxikus köztitermékekké, amelyek elpusztítják azt a sejtet, amelyben kifejeződnek. Az ilyen öngyilkos gének különösen előnyösek az implantátumok szükséges esetben való elpusztítására.

Egy másik ilyen molekula biztonsági kapcsoló a citozin-dezamináz (CD)-gén. A citozin-dezaminázt kifejező sejtek 5-fluor-citozin iránt érzékennyé válnak, és annak jelenlétében elpusztulnak, míg a citozin-dezamináz-gént ki nem fejező sejtek érintetlenek maradnak. A találmány előnyös megvalósítási módja nem korlátozódik a vTK és CD negatív szelekciós markerekként való alkalmazására, mivel szakember ezeket a markereket alternatív markerekkel könnyen helyettesítheti.

A találmány azon előnyös megvalósítási módjának, amelynél a sejtekbe egy olyan biztonsági mechanizmust viszünk be, amely negatív szelekciós komponensként szolgál, további szempontja a biztonsági komponensnek az immortalizáló onkogénnel együttes kifejeződése. Ez különösen előnyös, mivel azt jelenti, hogy az immortalizálógén nem valószínű, hogy kifejeződhet a negatív szelekciós biztonsági mechanizmus hiányában és fordítottan. A vektorkonstrukciók létrehozásában jártas szakember képes ilyen konstrukció létrehozására. Például a negatív szelekciós gént (például CD-t vagy vTK-t) az immortalizálógéntől a 3’-terminális irányában helyezhetjük el, és például egy poliovírus-eredetű belső

HU 222 040 Β1 riboszómális belépésihely-szekvencia (IRES) mellett, attól a 3’-terminális irányában. Ily módon ugyanaz a promoter/enhancer elem szabályozza az immortalizálógén transzkripcióját és a biztonsági elem transzkripcióját is. Ez annak következménye, hogy az előbbiek egy komplett egységként íródnak át, beleértve ebbe az egységbe az IRES szekvenciát is, amely közöttük helyezkedik el. Az IRES szekvencia megengedi a tőle a 3-terminális irányában lévő szekvencia transzlációját, ami a tőle az 5’irányban lévő szekvenciáétól különböző proteint kódol. Az ilyen vektor létrehozása - az ötlet ismeretében szakember ismereteinek körén belül esik.

Humán csontvelőstromasejtek funkcionális jellemzőit kimutató vizsgálatok

Az ezzel az eljárással létrehozott és egy éven át tenyészetben szaporított kiónok jellemzése azt mutatja, hogy a sejtek megőrizték azokat a tulajdonságaikat, amelyek egy osteoblast-prekurzorvonaltól elvárhatóak, és differenciálódásra való stimulálás mellett az érett osteoblast fenotípusát eredményezik.

A csont termeléséért felelős differenciálódott csontvelősejtek osteoblastok néven ismertek. Az osteoblastaktivitás ismert indikátora a lúgos foszfatázaktivitás mérése, amely egy, a csonttermelésben vagy a hidroxiapatit-ásványok termelése esetén aktív enzim.

Az 1. ábrán látható, hogy az immortalizált csontvelőstromasejtek a permisszív 33 °C hőmérsékleten mintegy 0,3 p-NP/mg protein/óra lúgos foszfatázaktivitást fejtenek ki. Ha ezeket az immortalizált sejteket a permisszív 33 °C hőmérsékleten dexametazon differenciálószer hatásának tesszük ki, a lúgos foszfatáz aktivitásában csak gyenge növekedést észlelünk, azaz a lúgos foszfatáz aktivitása mintegy 0,5 p-NP/mg protein/óra értékre növekszik.

Ettől eltérően, a fentivel azonos immortalizált sejtek a 39 °C nem permisszív hőmérsékleten differenciálószer hiányában fokozott lúgos foszfatázaktivitást mutatnak. Tényszerűen, a lúgos foszfatázaktivitás mintegy 0,9 p-NP/mg protein/óra értékre növekszik. Ezért úgy tűnik, hogy a 39 °C nem permisszív hőmérsékleten differenciálódás következik be, és a differenciált sejttípusra jellemző enzimaktivitás megnövekszik. Az aktivitás további növekedése észlelhető, ha az immortalizált csontvelőstromasejteket a nem permisszív 39 °C hőmérsékleten dexametazon differenciálószer jelenlétében tenyésztjük. Ilyen körülmények mellett a lúgos foszfatázaktivitás mintegy 2,5 p-NP/mg protein/óra értékre növekszik. Ez az aktivitás mintegy 5-szöröse annak, amit akkor kapunk, ha a sejteket a permisszív 33 °C hőmérsékleten dexametazon differenciálószer hatásának tesszük ki.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a találmány szerint immortalizált sejtek szelektíven differenciálhatók a 39 °C nem permisszív hőmérsékleten, és a differenciálódás eredményeként az osteoblastokéhoz hasonló funkcionális jellemzőkkel bíró sejtek képződnek, más szóval, a differenciálódás osteoblastok képződéséhez vezet.

Összegezve, az onkogének számára nem permisszív 39 °C hőmérsékleten differenciálószerek, például dexametazon vagy D₃-vitamin jelenlétében lényegében megnövelik (felfelé szabályozzák) lúgos foszfatázaktivitásukat (1. ábra).

Az 1. táblázatban bemutatott eredmények az előzőekhez hasonlóan azt mutatják, hogy a találmány szerint immortalizált csontvelőstromasejtek működő osteoblastokká való differenciálódásra késztethetők. A táblázatból mRNS humán csontvelőstromasejtek immortalizált kiónjában való kifejeződése látható. Vizsgálatokat folytattunk abból a célból, hogy azonosítsuk az immortalizált állapot tipikus jellemző ágenseit. Ezeket az ágenseket az 1. táblázat legszélső bal oldali oszlopában tüntetjük fel. A 33 °C-os permisszív hőmérsékleten az immortalizált humán csontvelőstromasejtek az interleukin-3 és az interleukin-4 kivételével mindegyik ágenst kifejezték. Dexametazon alkalmazásával ezen a hőmérsékleten az ágensek kifejeződésének azonos mintáját nyeljük, azonban az interleukin-la és interleukin-ΐβ, valamint GM-CSF-kifejeződés némi csökkenése és a TNFa-kifejeződés némi növekedése jelentkezik.

Ezzel ellentétben, a nem permisszív 39 °C hőmérséklet alkalmazásakor jelentős különbséget észlelünk az ágens mRNS kifejeződés mintájában. Az előzőekhez hasonlóan interleukin-3 és interleukin-4 nem fejeződik ki. Azonban, nem fejeződnek ki az előző esetben kifejeződő interleukin-la, interleukin-ΐβ, interleukin-8, GM-CSF és TNFa sem. Azonban még ezen a hőmérsékleten is kifejeződik az interleukin-6 és a kollagén 1. A nem permisszív 39 °C hőmérsékleten a dexametazon fokozza az interleukin-6 és interleukin-8 kifejeződését, de csökkenti a kollagén-1 kifejeződését.

Ha a fenti 2 kifejeződési mintát, azaz az immortalizált sejtek kifejeződését és a differenciálódott sejtek kifejeződését az osteoblastszerű sejtek kifejeződéséhez hasonlítjuk, azt látjuk, hogy a nem permisszív 39 °C hőmérsékleten szaporított sejtek, azaz az úgymond differenciálókörülményeknek kitett sejtek szinte azonos kifejeződési mintát mutatnak, mint az osteoblastszerű sejtek. Az egyetlen különbség abban áll, hogy az osteoblastszerű sejtek interleukin-8-at kifejeznek, míg a differenciálódott humán csontvelőstromasejtek ezt az ágenst csak dexametazon jelenlétében fejezik ki.

A fenti adatok azt mutatják, hogy az immortalizált humán csontvelőstromasejtek 39 °C hőmérsékleten differenciálódásra késztethetők, és ha differenciálódtak, olyan jellemzőkkel bírnak a proteinkifejezés tekintetében, amely majdnem azonos az osteoblastszerű sejtek jellemzőivel. Ezek az adatok ezért azt a következtetést sugallják, hogy az immortalizált humán sejtvonalak osteoblastok termelését eredményező differenciálódásra bírhatok.

Összegezve, citokin- és növekedésifaktor-kifejeződésre vonatkozó vizsgálataink azt mutatják, hogy a sejtek differenciálatlan állapotban IL-la-t és IL— 1 β-t, valamint IL-6-ot, IL-8-at, GM-CSF-t és TNFa-t, továbbá I típusú mátrix proteinkollagént fejeznek ki. Dexametazonnal vagy D₃-vitaminnal 7 napos időtartamon át való kezelést követően az IL-Ία- és β-, valamint a GM-CSF-, TNFa- és az I típusú kollagénkifejeződés elvész. Továbbá, az IL-6- és IL-8-kifejeződés D₃-vitamin és dexametazon mindegyikének jelenlétében

HU 222 040 Β1 fennmarad. Továbbá, egyik állapotban sem észlelhető IL-3- vagy IL-4-kifejeződés. Érdekes módon, az ezen sejteknél differenciálószerrel való kezelést követően

1. táblázat

Dexametazon és hőmérséklet hatása mRNS kifejeződésére humán csontvelőstromasejtek immortalizált kiónjában

mRNS	Jelenlét 33 °C-on	Dex hatása	Jelenlét 39 °C-on	Dex hatása	Primer OB-szerű sejtek
| IL-la	Igen	-	Nem		Nem
1 IL-Ιβ	Igen	-	Nem		Nem
1 IL-3	Nem		Nem		Nem
IL-4	Nem		Nem		Nem
1 IL-6	Igen	N. H.	Igen	+	Igen
| IL-8	Igen	N. H.	Nem	+	Igen
GM-CSF	Igen	-	Nem		Nem
1 TNFa	Igen	+	Nem		Nem
Kollagén I	Igen	N. H.	Igen	-	N. V.

+=A kifejeződés növekedése

-=A kifejeződés csökkenése

N. H.=Nincs hatás

N. V.=Nem vizsgáltuk

Dex: 5 χ 10^-7 mol/1 dexametazon 7 napon át

Továbbá, azt tapasztaltuk, hogy ha a transzdukciónak kitett sejtklónokat az onkogének nem permisszív hőmérsékletén differenciálószerek (például D₃-vitamin vagy dexametazon) és 10 mmol/1 B glicerin-foszfát hatásának teszünk ki, a tenyészet 20 nap elteltével osteokalcin proteint fejez ki és mineralizálódik (2., 3.,

4. és 5. ábrák).

A 2. ábrán differenciálatlan immortalizált humán csontvelőstromasejtek láthatók 33 °C hőmérsékleten. Látható, hogy az ábrán nincs nyoma mineralizációnak vagy osteokalcin proteinnek.

Ezzel ellentétben, a 3. ábrán differenciálószerek hatásának az onkogének nem permisszív 39 °C hőmérsékletén kitett immortalizált humán csontvelőstromasejtek láthatók. Nyilvánvalóan észlelhető a mineralizáció. Ez a jellemző a differenciálódott sejtet jelzi, és így jelzi azt, hogy a találmány szerinti immortalizált humán csontvelőstromasejt-klónok olyan teljes differenciálódásra késztethetők, hogy az érett fenotípust kifejezzék.

A 4. ábrán ismét immortalizált humán csontvelőstromasejt-klón és vegyes immortalizált sejtpopuláció festését látjuk, mindkettőt 39 °C hőmérsékleten, dexametazon jelenlétében, illetve hiányában. Látható, hogy 39 °C hőmérsékleten a differenciálószer hiányában viszonylag kis differenciálódás következik be. Azonban, differenciálószer jelenlétében a differenciálódás jelentős növekedése következik be, és így mineralizálódás észlelhető. Továbbá látható, hogy a fenotípus-jellemzők mind az egyes populációban, mind az egyetlen kiónban észlelhetők.

Az 5. ábrán egyetlen klón differenciálókörülmények mellett, azaz 39 °C hőmérsékleten dexametazon differenciálószerjelenlétében való festését mutatjuk be.

azonosított citokin/növekedési faktor profil tükrözi a differenciálódott humán osteoblastszerű sejtek primer tenyészetben látható profilját (1. táblázat).

A 2., 3., 4. és 5. ábrák adatai azt mutatják, hogy a sejtek teljes differenciálódásra késztethetők oly mértékben, hogy az érett osteoblast fenotípusát kifejezzék.

A 6. ábrán további bizonyítékát láthatjuk annak, hogy az immortalizált, majd a találmány szerint differenciált csontvelőstromasejtek fenotípusukat tekintve az osteoblastokhoz hasonló differenciált sejteket termelnek. A 6. ábrán a differenciált sejtek gyűrűs-AMP-válasza látható két agonista iránt, nevezetesen prosztaglandin E2 (PGE2) és paratiroid hormon (ΡΊΉ) iránt. Az adatok azt jelzik, hogy az agonistával szemben tiszta gyűrűs-AMP-válasz jön létre, ami az osteoblastvonal sejtjeinek jellemző válasza.

A 7. ábrán további bizonyítéka látható annak, hogy az immortalizált csontvelőstromasejtek differenciálódáson átmenve osteoblastőssejteket képeznek. A 7. ábrán D₃-vitamin hatását mutatjuk be K-vitamin jelenlétében osteokalcin protein kifejeződésére a találmány szerinti immortalizált humán csontvelőstromasejtekben radioimmunológiai vizsgálattal (Nichols Institute) meghatározva. D₃-vitamin hiányában az osteoblast-differenciálódás markere, az osteokalcin nem fejeződik ki (lásd a kontrollt). A csontsejt-differenciáló szer, a D₃-vitamin azonban az osteokalcin dózisfüggő kifejeződését indukálja.

Ezért, adatainkból mineralizálódásra vonatkozó adatainkkal (2-5. ábrák) és lúgos foszfatázra vonatkozó adatainkkal (1. ábra) együttesen látható, hogy a differenciálódott sejtek osteoblastőssejtek.

A 8., 9., 10. és 11. ábrák fényképek sorozatai, amelyek bizonyítékot nyújtanak arra vonatkozóan, hogy a találmány szerinti immortalizált osteoblast-prekurzorsejtek más körülmények mellett adipocytákká is diffe8

HU 222 040 Β1 renciálódhatnak. Ez fontos, mivel megerősíti azt a tényt, hogy valóban prekurzorsejtekkel bírunk, és összhangban van azzal a központi dogmával, amint ezt feltételezik, hogy a csontvelőstromasejtek adipocytákat is eredményeznek, mivel a csontvelő korai prekurzorai képességgel bírnak arra, hogy a csont- vagy az adipocytadifferenciálódási úton haladjanak a stimuláció természetétől függően.

A 8., 9. és 10. ábrán világosan látható, hogy a nyúlszérum, vagy a nyúlszérumnak legalább egy ágense kiváltja az adipocyta-sejtek termelése irányában haladó differenciálódási folyamatot, amint azt a vörös színeződés mutatja. All. ábrán látható, hogy nyúlszérum hiányában nem jelenik meg vörös színeződés, jelezve, hogy nincs adipocyta-képződés. Ez az eredmény további bizonyítékát szolgáltatja annak, hogy a csontvelő korai prekurzorsejtjei képesek lehetnek adipocyták vagy osteoblastsejtek termelése irányában való differenciálódásra.

A fényképeken a találmány szerinti immortalizált csontvelőstroma-sejtvonal, a 7. klón, olaj-vörös-0 (Oil-red-O) színezése látható (ez a színezék a zsírsejtek egyik markere). A színezés a normál nyúlszérumot tartalmazó (de magzati boíjúszérumot nem tartalmazó) tápközeggel való 3 napos kezelést követően történt, mutatva, hogy a csontvelőstroma-sejtpopuláció, amely D₃vitamin és/vagy dexametazon jelenlétében az osteoblast differenciálódási úton halad, megfelelő körülmények mellett tenyésztve adipocytává való válásra képes. Ez megerősíti a találmány szerinti immortalizált sejtek prekurzor állapotát.

A fenti színezésen kívül változást mutattunk ki fajlagos gén kifejezésekben is. Először, lipoprotein-lipáz (LPL, amely az adipocyták egy korai markere) kifejeződése azonosítható nyúlszérummal való kezelés esetében néhány nap után. Másodszor, az I típusú kollagén kifejeződése, amely az osteogenvonal egy markere, a normál nyúlszérummal való kezelés néhány napja után eltűnik. Az LPL-kifejeződés és az I típusú kollagén eltűnése ezért további bizonyítékot szolgáltat a képződött humán csontvelőstromasejtek bipotens természetére vonatkozóan. Ezért úgy véljük, hogy valódi prekurzorsejteket alkalmazunk humán sejtvonalaink létrehozására.

A 12. ábrán magzati csontból származó három emberi csontvelőstroma-sejtvonal lúgos foszfatázszintjeit mutatjuk be. Alapszinten egyik sem bír lúgos foszfatázaktivitással (kontroll), de ha 7 napon át dexametazonnal stimuláljuk, a három klón közül kettőben (a 10. és a 14. kiónban) kiváltható a lúgos foszfatázaktivitás kifejeződése. A kulcshelyzet az, hogy dexametazon távollétében nem mutatható ki lúgos foszfatázaktivitás. így ezeket a prekurzorokat nem szelektáltuk a lúgos foszfatázkifejeződés alapján. Mind a 10., mind a 14. klón dexametazon és foszfát jelenlétében 14-20 napos tenyésztés után mineralizálódik. A visszamaradó klón, a 2. klón nem késztethető dexametazonos kezeléssel lúgos foszfatázaktivitás kifejezésére, nem is mineralizálódik tenyészetben.

A 13. ábrán a terhesség 7-9. hetében lévő humán magzatból származó mintegy 600 pm hosszúságú combcsontot mutatunk be. A combcsontot 14 napon át tenyésztettük, hogy a replikálódó sejtpopulációt hagyjuk kiterjedni, ami a combcsont minden tájánál kiáramlásként látható. Ez a retrovirális hőmérséklet szenzitív onkogén-transzdukcióval való sejtimmortalizálást megelőző állapot. Az ábra így annak a sejtpopulációnak a természetét mutatja, amelyet az egyes találmány szerinti sejtvonalak készítésére alkalmaztunk.

A humán csontvelőstroma-sejtvonal hosszú élettartama

A találmány szerinti eljárás alkalmazásával nem várt módon azt találtuk, hogy az előállított humán sejtvonal sikeresen differenciálódik olyan funkcionális sejtekké, amely sejtek elkerülik a krízist és így az apoptózist. A sejtvonal ezért folytonosan túlélő, az általunk előállított humán csontvelőstroma-sejtvonal 40 osztódáson ment át egy 1 éves időtartam alatt 10⁹ sejtet produkálva ezalatt. A sejtvonal továbbra is életben van, és a sejtvonal sejtjei továbbra is mutatják a differenciálódott sejtek szövettípusára jellemző funkcionális jellemzőket. így képesek voltunk olyan immortalizált humán sejtvonal létrehozására, amely funkcionális jellemzőit megőrző differenciált sejteket tartalmaz.

Porcőssejt-sejtvonalak

Hasonlóan az osteogeneredetű, adipocytaúton való differenciálódásra képes prekurzorsejtek létrehozásához, létrehoztunk olyan porcőssejt-sejtvonalakat is, amelyek differenciálószerek, például dexametazon jelenlétében hipertrófiás porcsejtekké válnak.

A sejtvonalakat retrovirális hőmérséklet szenzitív onkogéntranszdukcióval hoztuk létre az előzőekben leírtak szerint, kiindulási anyagként humán magzati szövetek alkalmazásával (előzetes etikai jóváhagyás alapján).

Ezen sejtvonalak némelyike képes arra, hogy bármely differenciálódást kiváltó faktor jelenléte nélkül tenyészetben mineralizálódjon, ennek folytán ezek már differenciálódottak. Továbbá, egyes sejtvonalak nem mutatnak alapszinten a differenciált sejttípusokkal kapcsolatos aktivitást. Annak kimutatására, hogy ezek a differenciálatlan sejtvonalak hipertrófiás porcsejtek létrehozására bírhatok, dexametazon differenciálószert adtunk az immortalizálást követően egyetlen sejt klónozásával kapott sejtklónok tápközegéhez. Dexametazonnal való néhány napos kezelést követően kimutattuk, hogy a kiónok némelyike X típusú kollagént fejez ki, ami a hipertrófiás porcsejtek egy markere. Ezekben a sejtekben nem fejeződött ki I típusú kollagén, ami egyértelműen mutatja, hogy ezek a sejtek nem csontőssejt-eredetűek. A sejtek reagáltak továbbá l,25(OH)₂D₃-ra, és lúgos foszfatázaktivitás magas szintjeit fejezték ki, amik a hipertrófiás porcsejtszerű fenotípus további markerei. Ha a tenyészetet 10-14 napon át egyrétegű tenyészetként 39 °C hőmérsékleten, az onkogének nem permisszív hőmérsékletén és hozzáadott β-glicerofoszfát hiányában tenyésztjük, a tenyészet mineralizálódik.

Ez az adat ismét egyértelműen mutatja, hogy differenciálatlan vagy valódi prekurzorsejteket alkalmazunk humán sejtvonalak előállítására, és hogy a prekurzorsejtek eredete meghatározza a differenciálódott sejtvonal fenotípusát.

HU 222 040 Bl

Neurális sejtvonalak

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint immortalizálásra szánt idegszövetet a terhesség 8-12. hetében lévő humán magzati anyagból preparáltunk ki, ez a közel optimális kor az előagyi sejtek, így például a striatális neuronok és bizonyos kérgi neuronok immortalizálására (retrovirális transzdukció révén), mivel ezek a sejtek erre a korra in vivő még nem mennek át végső replikációikon, így ezek még képesek a retrovirális onkogén saját genomjukba való beépítésére és stabilan való kifejezésére.

A 8-12 hetes magzati központi idegrendszerből (CNS) hét régiót preparáltunk ki, ezek a kéreg, a striatum, a hipotalamusz, a rostroventrális középagy, a caudoventrális középagy, a medulláris agytörzs és a gerincagy dorzális és ventrális szarvai. Az ezekből a régiókból elkülönített sejteket számos különböző szubsztráton (zselatin/polilizin, fíbronektin, bevonat nélküli műanyag) szélesztettük, és egy meghatározott tápközegben inkubáltuk (Stringer és munkatársai, 1994). A sejteken geneticin rezisztenciamarkerhez (G418) kötött szabályozottan kifejezhető onkogént (ts-SV40T) kódoló amfotrop vírussal (PA 317-CMV48T, P. Gallimore, University of Birmingham, UK), az általunk szokásos módon (Stringer és munkatársai, 1994) transzdukciót hajtottunk végre.

Mivel az emberi CNS idegsejtprekurzorok fibroblaszt növekedési faktort (FGF) tartalmazó tápközegben bizonyos mértékű belsőleg irányított replikációs potenciállal bírnak, előnyösnek találtuk, hogy mind a transzdukción átment, mind a nem transzdukált sejteket egyaránt ugyanabban a tenyészedényben hagyjuk szaporodni. Ily módon elérhető friss humán anyag hiányában lehetőségünk van arra, hogy a meglévő sejteket egyszerűen retranszfektáljuk, hogy új kiónokat hozzunk létre. Ennek megfelelően, ha a sejtek már elérték az összenövöttség állapotát, a tenyészeteket átoltjuk, és egy részüket későbbi felhasználásra lefagyasztjuk.

Az átoltott sejteket geneticinnel kezeljük, hogy a nem transzdukált sejteket elpusztítsuk, 10-12 nap múlva kis telepek válnak láthatóvá. Minden kiónból egyetlen G418-rezisztens transzdukált sejtet veszünk ki szaporításra. Annak érdekében, hogy ezt megvalósíthassuk, kifejlesztettünk egy olyan módszert, amellyel elérhetjük, hogy a sejtek a korai kritikus szaporodási (expanziós) szakaszban jobban túlélnek, és gyorsabban szaporodnak. Az eljárás abban áll, hogy sejt-lyuk inszertekben (Corning) táprétegként alkalmazott hordozósejtekkel együtt tenyésztjük őket. Ha a klónozott sejtek száma eléri a mintegy 100-200-at, önhordozóvá válnak, osztódási sebességük észlelhetően megnő. Ebben az állapotban a hordozósejteket tartalmazó inszertek többé nem szükségesek, és eltávolíthatók. Néhány homogén kiónt izoláltunk ily módon, bár még több száz heterogén, vegyes klónnal bírunk fagyasztott vagy folytonosan szaporított állapotban. Az egyetlen sejtből szaporított kiónokat 1994 májusában végzett első tenyésztésük óta folyamatosan szaporítjuk.

Egy emberi agykéregből származó klón differenciálódását elemeztük legrészletesebben. Ennek a kiónnak a sejtjeit 24 lyukú lemezekre szélesztettük, és az onkogén permisszív hőmérsékletén, 33 °C-on 2-3 napig tenyésztettük. A sejteket a nem permisszív 39 °C hőmérsékleten különböző szerek és más sejttípusok jelenlétében szaporítottuk. Ezek között volt ideg növekedési faktor, csillés neurotrop faktor (CNTF), agyi eredetű neurotrop faktor, gliasejtvonal-eredetű neurotrop faktor (GDNF), FGF, epidermális növekedési faktor, vérlemezke-eredetű növekedési faktor, retinsav és különböző szérumok. Ilyen körülmények alkalmazásával 14 nap elteltével a sejteket fixáltuk, és immunhisztokémiai úton egy sorozat sejt típusú fajlagos antitesttel, így neurofilament, neuronfajlagos enoláz, glia fibrilláris sav protein, mielinoligodendrocita glikoprotein, nesztin, vimentin és CDllb (jelző mikroglia) alkalmazásával szkrineltük. Azt találtuk, hogy a prekurzorklón gliaeredetű neurotrop faktorok jelenlétében való inkubálása után mind morfológiai, mind immunokémiai szempontból nyilvánvaló az idegi (neuronális) fenotípus (lásd a 14. ábrán). A csillós neurotrop faktorral (CNTF) való inkubálás ehelyett astrocytaszerű fenotípust eredményezett. Érdekes módon, bár a prekurzorsejtek homogének, egyetlen sejtből szaporítottak, úgy tűnik, hogy különböző meghatározott körülmények mellett legalább két különböző fenotípussá alakulhatnak. A multipotenciának ez a fajtája ellentétes a patkányeredetű raphe Honjainknál tapasztalt multipotenciával, ahol egy körülményegyüttes egy homogén idegsejti (neuronális) fenotípus kifejeződését eredményezte [7. Stringer B. M. J. és munkatársai: Raphé neural cell immortalized with a temperaturesensitive oncogene, Developmental Brain Research 79, 267-274 (1974)]. Feltehetően az agykérgi klón többes fenotípusa az agykérgi fejlődésnek azt a korai állapotát tükrözi, amelyben a prekurzorokat izoláltuk, ekkor a sejtek elkötelezettsége az egyedi differenciálódási utak iránt még kisebb. Ebből a kiónból nesztint és vimentint is azonosítottunk.

A 14A. ábrán az onkogén nem permisszív hőmérsékletén, 39 °C hőmérsékleten gliaeredetű neurotrop faktor jelenlétében inkubált homogén prekurzorsejtekből differenciálódás után kapott tenyészet látható. A prekurzorok némelyike (nyíllal jelölve) fényes (phase bright) morfológiájú, és neuronszerű enoláz-immunreaktivitással bír, ami a neuronok jellemző markere. Nagyobb nagyítást mutatunk be a 14B. ábrán. Más sejtek azonban ettől eltérő fenotípusúak. A CNTF-vel inkubálással astrocytaszerű fenotípust nyertünk. Azonos prekurzorokat csillós neurotrop faktorral inkubáltunk (lásd a 14C. ábrán). Ezek már nem mutatnak semmiféle neuronfajlagos enoláz-immunpozitivitást. Szembetűnő azonban a GFAP-immunreaktív rostok hálózatának (az astrocyták egy markere) uralkodóvá válása, a legtöbb sejt pozitív.

Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy a differenciálatlan sejtek jelentős sikerrel használhatók fel emberi porc-, csont- és neurális sejtvonalak létrehozására, és hogy az ilyen sejtvonalak differenciálódott fenotípusának természetét a differenciálatlan sejtek természete és egyes esetekben annak a differenciálószemek a természete szabja meg, amelynek a humán sejtvonalat kitesszük.

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás humán porc-, csont- és neurális sejtvonal előállítására, azzal jellemezve, hogy

   i) differenciálatlan humán porcőssejteket, csontvelőstromasejteket vagy neurális sejteket olyan immortalizálógénnel immortalizálunk, amely magában foglal vagy kapcsolatos egy olyan szabályozóeszközzel, amely szabályozóeszköz aktiválása megszünteti az immortalizálást, és hagyja a differenciálatlan sejteket differenciálódni, ii) a fenti immortalizált sejtek tenyésztésével homogén humán sejttenyészetet hozunk létre, iii) a szabályozóeszköz aktiválásával megszüntetjük az immortalizálást, és aktiváljuk a differenciálódást, és iv) a fenti sejtek teljesen differenciálódott humán porc-, csont- vagy neurális sejtekké való differenciálódását hagyjuk végbemenni, ebben a folyamatban a sejteket differenciálószemek tesszük ki.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immortalizálógénként vírusonkogént alkalmazunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy onkogénként retrovírus-onkogént alkalmazunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a környezeti körülményekre reagáló szabályozóeszközt alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egymással integrált immortalizálógént és szabályozóeszközt alkalmazunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az integrált immortalizálógén és szabályozóeszköz egy hőmérséklet-érzékeny egységet alkotnak.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hőmérséklet-érzékeny egységként egy onkogént alkalmazunk.
8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy immortalizálógénként SV40-T-antigént alkalmazunk.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás továbbá magában foglalja differenciálatlan humán sejtek immortalizálását egy immortalizálószerrel, és az említett sejtvonal szelektív inaktiválását és/vagy elpusztítását lehetővé tevő biztonsági eszköz alkalmazását.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás magában foglalja a sejtvonalnak egy olyan génnel való transzfektálását, amely bizonyos szerek jelenlétében citotoxikus hatást kelt és/vagy citotoxikus terméket eredményez.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett génként vírus-timidin-kinázt kódoló gént alkalmazunk.
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett génként citozin-dezaminázt kódoló gént alkalmazunk.
13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immortalizálószer transzkripciója a biztonsági eszköz transzkripcióját is eredményezi.
14. 14. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy differenciálószerként csillós neurotrop faktort, gliasejt neurotrop faktort, agyi eredetű neurotrop faktort, idegnövekedési faktort, fibroblasztnövekedési faktort, epidermális növekedési faktort, vérlemezke-eredetű növekedési faktort, retinsavat és/vagy szérumot alkalmazunk.
15. 15. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy differenciálószerként D₃vitamint, K-vitamint - önmagában vagy D₃-vitaminnal kombinálva —, dexametazont és/vagy nyúlszérumot vagy extraktumát alkalmazzuk.