NO321000B1 - Fremgangsmate for indusering av ekspresjon av tyrosinhydroksylase i nerveceller fra pattedyr-CNS, unntatt humane embryonale stanceller og en fremgangsmate for screening av et medikaments effekt pa dopaminerge celler, samt cellekultur og anvendelse av slike celler for behandling av neurologiske forstyrrelser. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for indusering av ekspresjon av tyrosinhydroksylose (TH) i nerveceller fra pattedyr CNS, unntatt humane embryonale stamceller, og en fremgangsmåte for screening av et medikaments effekt på dopaminerge celler. Oppfinnelsen angår også en cellekultur og anvendelse av en celle for behandling av neurologiske forstyrrelser.

Det er fastslått at den fenotypiske ekspresjonen og overlevelsen av differensierende nerveceller og overlevelse og metabolisme av etablerte nerveceller dirigeres av en rekke ekstracellulære signaler. Naboceller og prosesser som omgir nerveceller spiller en betydelig rolle ved reguleringen av celledifferensiering, metabolisk funksjon og overlevelse, i stor grad ved deres frigivelse av vekst- og andre regulerende faktorer.

Mange neurologiske sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom, er resultatet av degenereringen av spesifikke grupper av nerveceller. Når det gjelder Parkinsons sykdom, har degenerasjonen av en gruppe dopamin-holdige celler, som forbinder det ventrale tegmentum og substantia nigra (lokalisert i den vetrale del av mesencephalon, eller midthjernen) med striatum, vært trukket inn i etiologien ved tilstanden.

For å forstå de faktorer som resulterer i, eller kunne hindre, degenerasjonen av disse dopaminerge reaksjonsveiene, er vev som er oppnådd fra midthjerneområdet undersøkt i stor utstrekning. Embryonale, dopaminholdige neuroner, oppnådd fra midthjernevev, er vanskelige å dyrke da de dopaminerge neuronene ikke overlever godt under dyrkning. Disse kulturene oppviser imidlertid en forøket overlevelse og/eller en modifisert biokjemisk aktivitet når de dyrkes med et kondisjonert medium eller når de behandles med vekstfaktorer. Fostervev fra midthjernen er dyrket i kondisjonerte dyrkningsmedier (CM) oppnådd fra gliacellelinjen hos rotten B49, gliacellelinjen fra R 33 nerve retina og gliacellelinjen JS Schwanns cellelinje [Engele, J., et al., J. Neurosci. Res., 30: 359-371, 1991)]. I alle tre tilfeller øket CM overlevelsen av de dyrkede, dopaminerge neuronene signifikant. Den økede overlevelsen av de dopaminerge neuronene var ikke forårsaket av formeringen av dopaminerge celler, men ble tilbakeført til effektene av CM på eksisterende gliaceller oppnådd fra midthjernekulturen og de resulterende samvirkningene mellom gliacellene og de dopaminerge neuronene, eller en til en direkte virkning på de dopaminerge neuronene.

Dyrkning av midthjernevev fra fostret i CM fremstilt fra midthjerne astrocytter, eller samdyrkning av vevet på et sjikt av midthjerne-avledede astrocytter, redder dopaminerge neuroner fra død indusert av serumberøvelse. Astrocytter eller CM fremstilt fra astrocytter fra striatum og hjernebarken hadde signifikant svakere beskyttende effekter [Takeshima et al. J. Neurosci., 14(8): 4769-4779, (1994)]. I en rapport hadde CM oppnådd fra kortikale astrocytter ingen effekt på overlevelsen eller formeringen av dopaminerge celler, men forandret biokjemien av denne cellepopulasjonen, hvilket resulterte i en liten økning i deres opptak av dopamin [Gaul and Lubbert, Proe. R. Soc. Lond. B, 249: 57-63, (1992)].

Vekstfaktorer, av hvilke mange er til stede i CM fra nervevev, antas å være ansvarlige for regulering av dopaminerg neuron overlevelse og metabolisme, enten direkte, eller ved deres effekter på nærliggende celler. Vekstfaktorer som er rapportert å ha en direkte effekt på dopaminerg neuronoverlevelse omfatter interleukin-6 (TL-6) [Hama et al., Neurosci., 40(2): 445-452 (1991)], hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) [Hyman et al., Nature, 350: 230-232 (1991)], basisk fibroblast vekstfaktor (FGF-2, formelt referert til som bFGF) [Dal Toso et al. J. Neurosci., 8(3): 733-745 (1988); Ferrari et al. Dev. Biol. 133: 140-147 (1989)]; og gliacellelinje avledet neurotrofisk faktor (GDNF), utskilt fra cellelinjen til rotte B49 [Lin, L.G. et al., Science, 260: 1130-1132 (1993)], som alle spesifikt øker overlevelsen til dopaminerge neuroner i dissosierte midthjernekulturer fra rotte- eller musefostre uten å øke antallet neuroner eller gliaceller. GDNF øker den morfologiske differensieringen av dopaminerge neuroner dramatisk, hvilket resulterer i mer ustrakt neuritt utvekst og øket cellelegemestørrelse. Noen vekstfaktorer, slik som nervevekstfaktor (NGF) (Hatanaka and Tsuki (1986), Dev. Brains Res. 30:47-56), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) og interleukin.l (LL-1)

(Engele & Bohn (1991), Neurosci. ll(10):3070-3078); Mayer, E. (1993) Dev. Brain Res. 72: 253-258) og nervevekstfaktor (NGF) (Engele & Bohn, rapporteres å understøtte dopaminerg celleoverlevelse i midthjernevev fra fostret ved en gliacelle-formidlet mekanisme.

In vivo-undersøkelser indikerer at den ødeleggelse som forårsakes av mekaniske eller kjemiske lesjoner i de dopaminerge reaksjonsveiene mellom midthjernen og striatum kan reduseres signifikant ved behandling med epidermis-vekstfaktor (EGF) [Pezzoli et al., Movement Disorders 6(4) 281-287, (1991)] og BDNF (Hyman et al., se ovenfor). In vitro-behandling med cyklisk-AMP, men ikke FGF-2 eller NGF, øket overlevelsen av dyrkede, midthjerne dopaminerge neuroner som svar på kjemisk indusert degenerering forårsaket av l-metyl-4-fenylpyridinium (MPP<+>) [Hyman et al., se ovenfor; Hartikka et al., J. Neurosci. Res., 32:190-201, (1992)]. Selv om bruken av et FGF-2-stimulert astrocytt-CM øker dopaminopptak, har anvendelsen av dette CM ikke en beskyttende effekt når neuronene ble kjemisk skadet ved anvendelse av MPP<+>(Gaul og Lubbert, se ovenfor).

Mange av de celler som oppnås fra fostervev som normalt fremkaller dopaminerge neuroner (dvs. normalt dopaminerg vev), slik som midthjernen og luktelappen, vil eventuelt differensiere til dopaminerge neuroner under primære dyrkningsbetingelser. Et øket antall celler i vev som er oppnådd fra normalt dopaminerge områder i hjernen, kan imidlertid induseres til å differensiere til dopaminerge celler ved samdyrking med næringscellelag oppnådd fra nervevev. De dopaminerge neuronene fra luktelappen viser en 5 gangers økning i antall når fosterluktelappneuroner samdyrkes med lukte-epitelneuroner. Det antas at en løselig faktor, genrelatert kalsitoninpeptid (CGRP), som er til stede i epitelcellene, er ansvarlig for induksjonen av ytterligere dopaminerge neuroner i luktelappen [Denis-Donini, Nature, 339: 701-703, (1989)]. Samdyrking av fostervev fra neostriatum og substantia nigra hos rotter i en til tre uker på gliacelle-næringsceller oppnådd fra substantia nigra-området induserer ekspresjonen av dopaminerge celler slik det indikeres ved tyrosinhydroksylase-immunreaktivitet (TH+) i vev dyrket fra begge områder. Når de samme vev ble samdyrket med gliaceller fra neostriatum, ble det imidlertid observert dopaminerge celler bare i substantia nigra-vevet, men ikke i vevet fra neostriatum [Beyer et al., Neurosci. Lett., 128: 1-3, (1991)]. Den mekanisme som ligger bak tilsynekomsten av TH-IR i vev fra neostriatum (et område som ikke inneholder dopaminerge celler hos voksne) ble ikke bestemt. Det kunne imidlertid være forårsaket av induksjonen av TH+- celler i næringscelleret bestående av substantia nigra celler som svar på tilstedeværelse av vev fra striatum, av induksjonen av dopaminerge egenskaper i cellene fra striatum eller av fremme av overlevelse av dopaminerge celler i vev fra striatum, i det slike celler er rapportert å forekomme forbigående under utvikling i striatum (Tashiro et al (1989), Neurosci. Lett. 97: 6-10) og barken (Satoh og Suzuki (1990), Dev. Brain Res. 53: 1-5). Et lite antall TH+-celler (140 TH+ celler/cm^) er indusert i vev fra barken fra rottefoster ved anvendelse av en kombinasjon av BDNF og dopamin, i et dyrkningsmedium som inneholdt 10% kalvefosterserum. Færre TH+-celler ble observert når BDNF eller dopamin ble brukt alene (Zhou et al. (1994), Dev. Brain Res. 81:318-324). Noen få celler fra striatum fra musefostervev kan induseres til å uttrykke TH+ når de inkuberes med FGF-1 og et forøket resultat kan oppnås ved anvendelse av en kombinasjon av FGF-1 og en uidentifisert >10 kD fraksjon som er oppnådd fra muskelvev (Du et al.

(1994) J. Neurosci. 14(12): 7688-7694).

Degenereringen av dopaminerge neuroner fra substantia nigra som karakteriserer Parkinsons sykdom behandles normalt ved anvendelse av farmakologisk intervensjon for å øke den avtagende, naturlige dopamintilførselen til striatum. Det er imidlertid problemer forbundet med medisinsk behandling, slik som utviklingen av toleranse overfor medisinering og mulige bivirkninger. Neurontransplantasjon, ved anvendelse av fostervev fra substantia nigra har vist et visst potensiale for å lindre eksperimentelt indusert Parkinsonisme hos gnagere og primater og hos noen mennesker med Parkinsons sykdom. Transplantatoverlevelsen er imidlertid dårlig og bare begrensede mengder dopaminergt fostervev er tilgjengelig. Ved gjennomsnitt kreves 4-10 nye menneskefostre for å oppnå tilstrekkelig antall dopaminerge neuroner for et enkelt humant transplantat (Widner et al., N Engl J Med 327:1556-1563 (1992)). Foretrukken behandling ville omfatte å hindre eller å redusere mengden av degenerasjon som opptrer. Så snart ødeleggelsen har oppstått, ville det være foretrukket å erstatte de tapte cellene ved implantering av nye dopaminerge neuroner ved anvendelse av celler som er oppnådd fra nerveceller som er formert i en kultur som fortrinnsvis er fra en ikke-tumor cellelinje, eller fra celler som ikke med hensikt er gjort udødelige for å indusere formering og, mest foretrukket, ville være oppnådd fra en pasients eget nervevev. En mindre inngripende behandling ville alternativt omfatte in vivo-manipulering av pasientens egen populasjon av nerveceller for å erstatte funksjonen til de ødelagte, dopaminerge neuronene.

I teknikkens stand foreslås at kulturer av dopaminerge celler kan oppnås ved anvendelse av glianæringscellelag, eller anvendelsen av visse vekstfaktorer eller kondisjonerte medier til midthjernevev og andre dopaminerge vev. Disse behandlingene kan indusere differensiering, øke overlevelsen eller forandre metabolismen til celler fra normalt dopaminerg vev som er dyrket in vitro. Dyrkningsmetodene for indusering av celler fra andre, ikke-dopaminerge hjerneregioner for å differensiere til dopaminerge celler er imidlertid begrenset. Mens det er vist at næringsceller fra områder slik som substantia nigra og luktelappen (områder som normalt inneholder en relativt høy populasjon av dopaminerge celler) kan anvendes for å indusere tilsynekomst av dopaminerge celler i visse sentralnervesystem (CNS)-vev fra fostre, er det ikke noe bevis på at celler fra ikke-dopaminergt nervevev skulle kunne anvendes som næringsceller i vevskultur beregnet på å indusere tilvekst av dopamin i vev, slik som striatum, som ikke normalt inneholder dopamin.

For noen formål, spesielt transplantasjons- og visse medisinscreeningsmetoder, ville det være fordelaktig å anvende fullstendig definerte dyrkningsbetingelser for å indusere differensieringen av dopaminerge celler. Det ville være spesielt fordelaktig dersom cellene ble oppnådd både fra dopaminerge og normalt ikke-dopaminerge nervevevskilder, for således å maksimere antallet dopaminerge celler som kan genereres fra et enkelt foster.

Det foreligger et behov på fagområdet for en pålitelig fremgangsmåte for indusering av nerveceller, oppnådd fra alle hjerneområder, fra vev oppnådd fra dyr av alle aldere, for å differensiere til dopaminerge celler i nærvær eller fravær av et næringscellelag. Spesielt ville det være fordelaktig å indusere ekspresjonen av dopamin i celler oppnådd fra områder som ikke normalt inneholder dopaminerge cellelegemer, slik som striatum, men som krever dopamin for normal funksjon.

Silani V. et al., Experimental neurology, vol 128,1994 New York, og EP 0 594 669 Bl beskriver fremgangsmåter for å dyrke nerveceller ved anvendelse av et kondisjonert gliacellemedium inneholdende bFGF.

Nylig er det vist at multipotente nervestamceller, oppnådd fra foster- og voksent vev, kan formeres in vitro for å generere store antall nervestamcelleavkom, som under egnede betingelser, kan differensiere til neuroner og gliaceller (PCT søknader nr. WO 93/01275, WO 94/16718, WO 94/10292 og WO 94/09119). Det ville være fordelaktig å generere dopaminerge celler fra de formerte avkommene av multipotente nervestamceller, oppnådd fra et hvilket som helst område av CNS.

Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for indusering av store antall nerveceller oppnådd fra normalt ikke-dopaminergisk vev til å differensiere, in vitro, til dopaminerge celler for å tilveiebringe en pålitelig kilde for dopaminerge celler for forskjellige anvendelser som transplantasjon til pasienter med dopamin mangel og for screening av medisiner. Det er ikke en del av foreliggende oppfinnelse å anvende humane embryonale stamceller til dette formål.

Det er et ytterligere formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for å indusere det udifferensierte, formerte avkom av multipotente nervestamceller oppnådd fra et hvilket som helst område i CNS som er kjent for å inneholde slike celler unntatt humane embryonale stamceller, til å differensiere til dopaminerge celler, for å tilveiebringe ubegrensede mengder av dopaminerge celler for transplantasjon, screening av medisin og andre formål.

I tillegg er det et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe vevsdyrkningsmetoder som anvender fullstendig definerte dyrkningsbetingelser, og således ikke krever nærvær av næringscellelag, kondisjonert medium eller serum, for å øke antallet dopaminerge celler oppnådd fra en enkel fosterhjerne unntatt vev som omfatter humane embryonale stamceller. Slike celler kunne ha spesielle anvendelser slik som transplantasjon til pasienter med dopaminmangler og for visse medisinscreeningsmetoder.

Disse og andre formål og trekk ved oppfinnelsen vil fremgå for fagmannen fra den følgende detaljerte beskrivelse og de medfølgende krav.

Ingen av de foranstående referanser antas å beskrive foreliggende oppfinnelse slik den kreves og antas ikke å være teknikkens stand. Referansene gis som bakgrunnsinformasj on.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for indusering av ekspresjon av tyrosinhydroksylase (TH) i nerveceller fra pattedyr-CNS, unntatt humane embryonale stamceller, in vitro, kjennetegnet ved dyrking av nervecellene i et dyrkningsmedium til hvilket det er tilsatt fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) og et eller flere medlemmer av den transformerende vekstfaktor Ø-familien, der nervecellene fra pattedyr-CNS inkluderer en eller flere multipotente nervestamceller avledet fra normalt ikke-dopaminergt nervevev og der ekspresjon av tyrosinhydroksylase i nervecellene induseres in vitro ved å bringe nervecellene i kontakt med dyrkingsmediet inneholdende nevnte vekstfaktorer.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for screening av en medisins effekt på dopaminerge celler, kjennetegnet ved at den omfatter: a) dyrking av nerveceller fra pattedyr-CNS ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for å indusere ekspresjon av tyrosinhydroksylase i nevnte nerveceller,

b) bringe nervecellene i kontakt med et medikament, og

c) måle responsen, utvalgt fra gruppen bestående av en dopaminerg respons og

celleoverlevelse av nervecellene, ved påvirkning av medikamentet.

Foreliggende oppfinnelse angår også en cellekultur, kjennetegnet ved at den omfatter differensierende eller differensierte dopaminerge celler i et dyrkningsmedium til hvilket det er tilsatt fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) og et eller flere medlemmer av den transformerende vekstfaktor beta-familien, der de dopaminerge cellene ikke er humane embryonale stamceller.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av en celle fremstilt ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av en neurologisk forstyrrelse ved å transplantere nevnte celle til en pasient i et CNS-område som trenger dopaminerge celler.

Beskrivelse av tegningene

Fig. 1. Subependymceller som oppdeles i den subventrikulære sonen hos voksne mus ble merket med gjentatte injeksjoner av BrdU i løpet av en 24 timers periode. I løpet av 30 minutter av den siste injeksjonen ble musene drept og hjernene fjernet. De subventrikulære sonene ble fjernet og de dissosierte cellene ble dyrket på poly-L-ornitin-belagte dekkglass ved anvendelse av fullstendig medium med eller uten kondisjonert medium oppnådd fra gliacellelinjen fra rotte B49 og FGF-2 (20 ng/ml). Tre dager etter utsåing ble cellene fiksert og behandlet for dobbeltmerket, indirekte immuncytokjemi for TH (Eugene Tech, polyklonal 1:1000) og BrdU (Amersham, monoklonal 1:100). BrdU-merkede celler (subependymceller som deles) som også var TH-immunreaktive forekom bare i forsøk i hvilke det kondisjonerte medium og vekstfaktor ble anvendt. (A) en enkelt BrdU-immunreaktiv celle (pil) som er TH-immunreaktiv (B, pil) antyder at de voksne, subependym celler som formeres kan induseres til å uttrykke TH i nærvær av det kondisjonerte medium og vekstfaktor. Fig. 2. Enkle, udissosierte seks dager gamle primært genererte neurosfærer ble sådd ut på poly-L-ornitin-belagte dekkglass i DMEM/F12 hormonblandingsmedium med kondisjonert medium oppnådd fra rottegliacellelinjen fra rotte B49 og FGF-2 (20 ng/ml). hnmuncytokjemisk analyse 24 timer senere avslørte nærvær av TH+-celler. (A) fasekontrastmikrogram av en neurosfære 24 timer etter utsåing. (B) samme sfære som i A, behandlet for TH-immunhistokjemi, avslører nærvær av minst en TH+-celle, med neuronmorfologi. Fig. 3. Enkle, udissosierte, seks dager gamle, andre passasjeneurosfærer ble merket med BrdU og sådd ut på et konfluent lag av astrocytter fra striatum. 24 timer etter utsåing ble cellene behandlet for dobbeltmerket, indirekte immuncytokjemi for TH (Eugene Tech, polyklonal 1:1000) og BrdU (Amersham, monoklonal 1:100). (A) En BrdU-immunreaktiv celle (pil) er (B) TH-immunreaktiv (pil). (C) TH-immunreaktive celler (piler) er også MAP-2-irnmunreaktive (D), og viser andre neuronegenskaper, i tillegg til morfologi.

In vitro induksjon av dopaminerge celler oppnådd fra primære celler oppnådd fra normalt ikke-dopaminergisk nervevev.

Uttrykket "dopaminergisk nervevev" refererer til vev fra områdene i CNS som i moden tilstand er kjent for å inneholde et betydelig antall av dopaminerge cellelegemer. Dopaminerge celler er nerveceller hvis nærvær i nervevev bestemmes ved tilstedeværelse av tyrosinhydroksylase (TH) eller tilstedeværelse av dopamindekarboksylase og/eller fravær av dopaminbetahydroksylase inne i cellene, polymerase kjedereaksjonsteknikker eller antistoffer rettet mot dopamin. Tyrosinhydroksylase er det hastighetsbegrensende enzymet i den biokjemiske reaksjonsvei som fører til dopaminproduksjon og anvendes vanligvis på fagområdet som en markør for dopaminerge neuroner. Dopaminergisk nervevev finnes i områder av retina, luktelappen, hypothalamus, dorsale motorisk nucleus, nucleus tractus solitarius, grå substans i periakvedukt, ventralt tegmentum og substantia nigra. Uttrykket "normalt ikke-dopaminergisk nervevev", slik det anvendes her, refererer til vevet fra områder av det utviklede CNS som ikke er dopaminergisk nervevev.

Ved anvendelse av de fremgangsmåter som er beskrevet her induseres primære celler oppnådd fra dissosiert nervevev til å uttrykke tyrosinhydroksylase. Uttrykket "primær nervecelle" refererer til en celle som er oppnådd fra nervevev som ikke er overført in vitro (til en sekundær kultur). Kulturer av primære nerveceller fremstilles ved å fjerne vev fra et dyr ved anvendelse av en hvilken som helst steril fremgangsmåte, dissosiering av vevet for å generere en suspensjon av primære celler og plassere cellene i et hvilket som helst medium som er kjent å understøtte overlevelsen av celler. De primære cellene eksponeres for et dyrkningsmedium omfattende vekstfaktorer som induserer dopaminproduksjon i celler oppnådd fra normalt ikke-dopaminergt nervevev. Uttrykket "vekstfaktor" refererer til en biologisk faktor (dvs. en biologisk aktiv substans som fungerer i CNS-celler) slik som et protein, peptid, en aminosyre, et lipid, et karbohydrat, en nukleinsyre, et nukleotid eller andre substanser med en vekst-, formerings-, differensierings- eller trofisk effekt på nerveceller, enten enkeltvis eller i kombinasjon med andre faktorer. En vekstfaktor som induserer dopaminproduksjon vil bindes til en reseptor på en celle og indusere at cellen begynner å uttrykke, eller øke dens ekspresjon av budbringer RNA (mRNA) for dopaminforløpermolekyler og enzymer som er involvert i dopaminproduksjon. En foretrukket vekstfaktor er et medlem av fibroblast vekstfaktorfamilien (for eksempel FGF-1 eller FGF-2) eller ekvivalente vekstfaktorer som kan bindes til FGF-reseptorer på cellene. FGF og ekvivalente vekstfaktorer kan anvendes enkeltvis eller i kombinasjon med andre vekstfaktorer. Vekstfaktorer tilsettes generelt i en konsentrasjon på ca 1 til 100 ng/ml, vanligvis ca 5 til 60 ng/ml. En optimal konsentrasjon er i området 10-30 ng/ml, i det 20 ng/ml er mest foretrukket. Når et medlem av FGF-familien anvendes kan heparansulfat, et glykosaminoglykan molekyl som letter bindingen av FGF til dens reseptorer tilsettes til dyrkningsmediet i en konsentrasjon på 0,2 ng/ml - 20 ug/ml, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,4 ng/ml - 4Hg/ml. Mest foretrukket er en konsentrasjon på ca 2 ng/ml. I en foretrukket utførelsesform omfatter dyrkningsmediet FGF i kombinasjon med et medlem av den transformerende vekstfaktor beta (TGF 6)-familien. TGFfi-familien omfatter basiske myelinproteiner (BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7), aktiviner A & B, dekapentaplegisk (dpp), 60A, OP-2, dorsalin, GDF (1, 3 og 9), nodal, MIS, inhibin a, transformerende beta-vekstfaktorer (TGF-fil, TGF-B2, TGF-B3, TGF-J35) og glia-avledet neurotrofisk faktor /GDNF) (se Atrisano et al. (1994) J. Blochemica et Biophysica Acta vol. 1222:71-80).

Dersom TH+-cellene skal anvendes for transplantasjonsformål eller visse medisinutprøvingsmetoder, foretrekkes det å anvende et fullstendig definert dyrkningsmedium som har de næringsstoffer og hormoner som er nødvendige for å understøtte overlevelsen av cellene. Ved "fullstendig definert" menes at alle bestanddelene i mediet er kjent. Mange definerte dyrkningsmedier er kommersielt tilgjengelige. Et foretrukket medium, her referert til som "fullstendig medium", omfatter en 1:1-blanding av Dulbeccos modifiserte Eagles medium og F12-næringsstoff (GIBCO) pluss 0,6% glukose, 2 mM glutamin, 3 mM natriumbikarbonat, 5 mM HEPES-buffer og en definert hormonblanding og saltblanding (Sigma; 10 volum-%) som omfatter 25 \ ig/ ml insulin, 100 [ Lg/ ml transferrin, 20 nm progesteron, 50 nm putresin og 30 nM selenklorid.

Dyrkningsmediet kan omfatte kondisjonerte medier (CM), som er et dyrkningsmedium som har blitt eksponert for levende celler og således inneholder substanser, slik som vekstfaktorer, som er frigitt fra cellene. Tilsetningen av CM gjør imidlertid dyrkningsmediet udefinert, og således ikke foretrukket når cellene skal anvendes for transplantasjonsformål og visse medisinutprøvingsmetoder. CM kan oppnås fra et hvilket som helst vev som kan dyrkes som vil indusere dopaminekspresjon i celler oppnådd fra normalt ikke-dopaminergt nervevev og/eller vil dempe effektene av en dopamininduserende vekstfaktor. En hvilken som helst mengde CM kan anvendes (0-100%). Generelt vil dyrkningsmediet omfatte fra ca 25 til 100% CM. Foretrukket CM er oppnådd fra gliaceller. Spesielt foretrukket er CM oppnådd fra rottegliacellelinjen B49 [Schubert et al., Nature, 249: 224, (1974)] og CM oppnådd fra astrocytter.

Primære cellekulturer sås ut, fortrinnsvis med en tetthet i området på ca 10^ til 10? celler/ml, mer foretrukket med en tetthet på ca 10^ celler/ml. Cellene kan så dyrkes i en hvilken som helst egnet beholder, slik som en vevsdyrkningskolbe, -brønn eller - petriskål. Beholderen kan ha eller ikke ha en overflate til hvilken celler kan feste seg. I tilfeller der det er ønskelig at cellene fester seg, er det generelt nødvendig å behandle dem med en substans som tilveiebringer en ionisk ladet overflate slik som poly-D-lysin, poly-L-ornithin, Matrigel, laminin, fibronektin og andre overflater som er kjente for å indusere festing av celler. Cellene kan feste seg til visse plastmaterialer. Når det anvendes glassubstrater, kan det imidlertid være ønskelig å behandle deres overflater. Når adhesjon ikke er ønsket, kan det anvendes glassubstrater eller noen ubehandlede vevsdyrkningssubstrater av plast. En poly-L-ornithin-behandlet dyrkningsbeholder utgjør en spesielt egnet overflate til hvilken cellene kan klebes. Alternativt kan cellene dyrkes sammen på et næringscellelag av en hvilken som helst type eller kombinasjon av typer av celler i motsetning til på et behandlet substrat. Foretrukket for samdyrking er et næringslag av andre nerveceller slik som neuroner, astrocytter eller oligodendrocytter oppnådd fra et hvilket som helst område av CNS.

Kulturene holdes så nær fysiologiske betingelser som mulig. pH skal være mellom 6 og 8. Fortrinnsvis mellom ca pH 7,2 til 7,6, mest foretrukket ved en pH-verdi på ca 7,4. Cellene skal holdes ved en temperatur som er nær fysiologiske nivåer, mellom 30 til 40°C, mer foretrukket mellom ca 32 og 38°C og mest foretrukket mellom ca 35 og 37,5°C. Cellene skal holdes i ca 5% CC»2,95% O2og 100% fuktighet. Dyrkningsbetingelsene kan imidlertid varieres. Tilsetningen av 1% føtalt bovint serum (FBS) resulterer for eksempel i en økning av antallet påviste TH+- neuroner etter at kulturer har vært samdyrket på et gliacellenæirngscellelag i 24 timer og øker også det påviste antall TH+-celler når cellene dyrkes i udefinert dyrkningsmedium i fravær av næringscellelag. En foretrukket utførelsesform er å dyrke primærceller i et dyrkningsmedium inneholdende CM oppnådd fra rottegliacellelinjen B49 og FGF-2 eller en kombinasjon av EGF og FGF-2. En foretrukket utførelsesform for celler dyrket i et definert medium for transplantasjon og andre formål er å dyrke primærvev direkte på en substratbelagt overflate, slik som poly-L-ornithin-belagte dekkglass, i et definert dyrkningsmedium (for eksempel fullstendig medium) og en kombinasjon av FGF-2 med aktivin eller BMP-2.

Induksjonen av dopaminerge celler bestemmes ved hjelp av anvendelse av en hvilken som helst metode som er i stand til å måle tilstedeværelse av dopamin, slik som immuncytokjemi ved anvendelse av antistoffer rettet mot dopamin, eller å måle den biokjemiske aktiviteten til dopaminerge celler ved å måle dopaminopptak. Tilstedværelse av forløpermolekyler som er involvert i syntesen av dopamin kan måles. For eksempel er immuncytokjemisk analyse for å påvise tilstedeværelse av tyrosinhydroksylase, eller analyser, slik som polymerasekjedereaksjon og in situ hybridiseringsteknikker som påviser mRNA for enzymer som medvirker i dopamin syntese anvendbare verktøy for måling av tilstedeværelse av dopaminerge celler. Identifisering av dopaminerge neuroner gjennomføres ved bruk av morfologisk analyse av neuroner eller ved dobbel- eller trippelmerking for å påvise tilstedeværelse av dopamin eller dopaminforløpere pluss immunreaktivitet for neuronspesifikk enolase (NSE), neurofilament proteinene tau-1 og MAP-2 eller for neu-N (et neuronalt kjerneantigen) eller B-tubulin og/eller bromdeoksyuridin (BrdU), som merker celler som deler seg aktivt.

In vitro induksjon av dopaminerge celler oppnådd fra multipotent nervestamcelleavkom som er formert in vitro fra embryonalt- og voksent pattedyr nervevev, unntatt humane embryonale stamceller.

Multipotente nervestamceller er rapportert og deres potensielle anvendelse beskrevet [Reynolds and Weiss, Science, 255: 1707 (1992); Reynolds et al., J. Neurosci., 12: 4565

(1992); Reynolds and Weiss, Restorative Neurology and Neuroscience, 4: 208 (1992); Reynolds and Weiss, Neuronal Cell Death and Repair, utg. Cuello (1993)]. Dessuten er nytten av disse cellene beskrevet i de publiserte PCT søknader nr. WO 93/01275, WO 94/16718, WO 94/10292 og WO 94/09119. Slik det anvendes her, refererer uttrykket "nervestamcelle" til en udifferensiert, multipotent nervestamcelle som kan induseres til å formeres in vitro i nærvær av en prolifereringsinduserende vekstfaktor slik som, amfiregulin, sur fibroblastvekstfaktor (aFGF eller FGF-1), basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF eller FGF-2, transformerende vekstfaktor alfa (TGFa) og lignende. Nervestamcellen er i stand til selvopprettholdelse, hvilket betyr åt for hver celledeling, vil en dattercelle også være en stamcelle. Dcke-stamcelleavkom (dvs. forløperceller) av en enkelt, multipotent nervestamcelle er i stand til å differensiere til neuroner, astrocytter (type I og type H) og oligodendrocytter. Nervestamcellen er således "multipotent" fordi dens avkom kan utvikles via flere veier som skiller seg fra hverandre.

Uttrykket "nerveforløper celle", slik det anvendes her, refererer til en udifferensiert celle som er oppnådd fra en nervestamcelle, som ikke selv er en stamcelle. Et trekk ved en forløpercelle som gjør at den kan skilles fra en stamcelle, er at den til forskjell fra en stamcelle har begrenset delingsevne og således ikke oppviser selvopprettholdelse. Den er bestemt i en spesiell differensieringsvei og vil, under passende betingelser, eventuelt differensiere til gliaceller eller neuroner.

Uttrykket "forløperceller", slik det anvendes her, refererer til avkommet fra nervestamceller, og omfatter således både forløperceller og datterceller av nervestamceller.

CNS-forløperceller oppnådd fra stamceller kan dyrkes ved anvendelse av metoder som er beskrevet i eksempel 3 nedenfor, og i de publiserte PCT-søknader som det er referert til ovenfor. Fra embryo, unntatt humant embryo, kan nervestamcelleholdig vev oppnås fra et hvilket som helst CNS-område, inkludert striatum, barken, septum, thalamus, ventral midthjerne og ryggmarg. Hos voksne oppnås imidlertid nervevev fortrinnsvis fra vev som omgir de forskjellige ventrikler og passasjer inne i CNS. Vev kan for eksempel oppnås fra områdene som umiddelbart omgir sideventriklene (første og andre) og tredje ventrikler i forhjernen, hjerneakvidukten, den fjerde ventrikkel og sentralkanalen. Stamceller fra nervevevet som reagerer på vekstfaktorer, dyrkes i et dyrkningsmedium i nærvær av minst en vekstfaktor. Mediet er fortrinnsvis et definert, serumfritt medium. Vekstfaktorer som kan anvendes for indusering av celledeling, enkeltvis eller i kombinasjon med andre vekstfaktorer, omfatter en hvilken som helst vekstfaktor som tillater forløperceller og deles, inkludert et hvilket som helst molekyl som bindes til en reseptor på overflaten av cellen for å utøve en trofisk, eller vekstinduserende effekt på cellen. Slike faktorer omfatter sure og basiske fibroblastvekstfaktorer (FGF-1 og FGF-2), epidermal vekstfaktor (EGF), en EGF-lignende ligand, amfiregulin, transformerende vekstfaktor alfa (TGF-a) og lignende. Cellen induseres til og deles og danner en klase av udifferensierte celler som ikke er immunreaktive for astrocyttmarkøren, glia-flbrillært surt protein (GFAP), neuromarkører, neurofilament (NF), mikrotubuliassosiert protein (MAP-2) og neuronspesifikk enolase (NSE); eller oligodendrocyttmarkørene, basisk myelinprotein (MBP) og galaktocerebrosid (GalC). Forløperceller inne i klasen er imidlertid immunreaktive for nestin, et mellomliggende filamentprotein som finnes i udifferensierte CNS-celler. Nestinmarkøren blekarakterisertav Lehndahl et al. [Cell, 60: 585-595 (1990)]. De modne fenotypene som er forbundet med de nervecelletyper som kan differensieres fra avkommet av forløpercellene er overveiende negative for nestinfenotypen.

I det fortsatte nærvær av et mitogen slik som EGF, FGF eller lignende, fortsetter forløpercellene i neurosfæren å dele seg hvilket resulterer i en økning i størrelsen av neurosfæren og antallet udifferensierte celler [nestin (+), GFAP(-), NF(-), MAP-2(-), NSE(-), MBP(-), GalC(-)]. På dette stadium er cellene ikke adherende og har en tendens til å danne frittflytende klaser som er karakteristisk for neurosfærer. Dyrkningsbetingelsene kan imidlertid varieres slik at selv om forløpercellene fortsatt uttrykker nestin-fenotypen, danner de ikke de karakteristiske neurosfærene.

Differensiering av cellene kan induseres ved hjelp av en hvilken som helst metode som er kjent på fagområdet som aktiverer kaskadene av biologiske hendelser som fører til vekst, som omfatter frigivelse av inositoltrifosfat og intracellulært Ca<2+>, frigivelse av diacylglycerol og aktiveringen av proteinkinase C og andre cellulære kinaser, og lignende. Behandling med forbolestere, differensierings-induserende vekstfaktorer og andre kjemiske signaler kan indusere differensiering. Differensiering kan også induseres ved å så ut cellene på et fast substrat slik som kolber, plater eller dekkglass belagt med en ionisk ladet overflate slik som poly-L-lysin, poly-L-ornithin og lignende.

Andre substrater kan anvendes for å indusere differensiering slik som kollagen, fibronektin, laminin, matrigel og lignende. Differensiering kan også induseres ved å etterlate cellene i suspensjon i nærvær av en formeringsinduserende vekstfaktor, uten reinitiering av formering (dvs. uten dissosiering av neurosfærene).

En foretrukket fremgangsmåte for indusering av differensiering av nervestamcelle avkommet omfatter å dyrke cellene på et fast substrat i et dyrkningsmedium som er fritt for den prolifereringsinduserende vekstfaktoren. Etter fjerning av den prolifereringsinduserende vekstfaktoren kleber cellene til substratet (for eksempel poly-ornithinbehandlet plast eller glass), flater ut og begynner å differensiere til neuroner og gliaceller. På dette stadium kan dyrkningsmediet inneholde serum slik som 0,5-1,0% føtalt bovint serum (FBS). For visse anvendelser, dersom definerte betingelser kreves, vil imidlertid ikke serum anvendes. I løpet av 2-3 dager begynner det meste av eller alt nervestamcelleavkom å tape immunreaktivitet for nestin og begynner og uttrykke antigener som er spesifikke for neuroner, astrocytter eller oligodendrocytter som indikert ved immunreaktivitet for henholdsvis MAP-2, GFAP og GalC, ved anvendelse av immuncytokjemiske teknikker som er vel kjente på fagområdet.

Som oppsummering er CNS-stamceller isolert fra en rekke embryonale, unntatt humane, og voksne CNS-områder inkludert striatum, ryggmargen, hjernestammen og hypothalamus. I hvert av disse tilfeller oppviser den isolerte CNS-stamcellen selvoppholdelse og genererer til slutt et stort antall differensiert avkom som omfatter neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Stamceller er således til stede i flere områder i CNS hos voksne pattedyr-CNS og kan dyrkes, in vitro, for å oppnå et stort antall udifferensierte nerveceller, der differensiering kan reguleres ved anvendelse av vekstfaktorer og/eller andre biologiske faktorer. De udifferensierte cellene (enten som en cellesuspensjon eller intakte neurosfærer) proliferert ved anvendelse av disse teknikkene, kan dyrkes for å generere dopaminerge celler ved anvendelse av de sammen fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor for induksjonen av dopaminerge neuroner i primært nervevev.

Transplantasjon av dyrkede, dopaminerge celler

Terapeutiske preparater omfattende rensede populasjoner av differensierte, dopaminerge celler, oppnådd fra primærkultur eller fra det formerte forløperavkom av nervestamceller kan fremstilles og administreres til områder av hjernen hos en mottaker som mangler dopamin. Alternativt kan det fremstilles terapeutiske preparater omfattende differensierende celler som er dyrket i et dyrkningsmedium som induserer dannelse av dopaminerge celler. Preparatet administreres til det hensiktsmessige hjerneområdet, hvor cellene implanteres før fullføring av differensieringsprosessen. Etter implantasjonen kan differensieringen av dopaminerge celler fullføres in vivo. Preparatet kan omfatte rensede celler, fremstilt ved anvendelse av en hvilken som helst egnet rensemetode. Preparatet kan også omfatte andre typer av nerveceller. En hvilken som helst egnet fremgangsmåte for implantasjon av dopaminerge celler eller forløperceller nær området med dopaminmangel kan anvendes. Fremgangsmåter som beskrives i US-PS 5.082.670 for injeksjon av cellesuspensjoner, slik som fibroblaster, i CNS kan anvendes for injeksjonen av de differensierte, dopaminerge cellene som er fremstilt ved hjelp av de dyrkningsmetoder som er beskrevet her. Ytterligere fremgangsmåter og metoder kan finnes i Neural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorklund og Stenevi, utg., (1987). Xeno- og/eller allo-transplantasjoner kan kreve anvendelse av immunsuppresive teknikker eller induksjon av vertstoleranse for å øke overlevelsen av de implanterte cellene.

I noen tilfeller kan det være mulig å fremstille differensierende eller differensierte, dopaminerge celler fra en mottakers eget nervesystem (for eksempel fra vev fjernet under biopsier). I slike tilfeller kan de dopaminerge cellene genereres i kultur fra nervestamcellenes avkom. Cellene fra det dissosierte nervevev dyrkes i nærvær av en formeringsinduserende vekstfaktor slik som EGF eller FGF. Etter egnet økning av antallet bringes forløpercellene i kontakt med en vekstfaktor eller en kombinasjon av vekstfaktorer og/eller et kondisjonert medium eller kombinasjoner av kondisjonerte medier, som induserer differensieringen av dopaminerge celler. Cellene formeres og dopaminekspresjon induseres fortrinnsvis ved anvendelse av et definert dyrkningsmedium. Et preparat omfattende de differensierende eller differensierte, dopaminerge cellene administreres til passende områder i mottakerens hjerne. Preparatet kan i tillegg omfatte vekstfaktorer eller andre komponenter som øker cellenes overlevelse etter implantering.

Medisinscreening ved anvendelse av dyrkede, dopaminerge celler

De dopaminerge cellene som fremstilles ved anvendelse av de fremgangsmåter som er beskrevet her kan også anvendes for å utprøve effektene av medisiner og andre forbindelser på dopaminerge celler. De screeningsmetoder som er beskrevet i samtidige US-søknader nr. 08/311,099 og nr. 08/339,090, kan anvendes. Generelt måles effekten av medisinene og andre forbindelser på de differensierende eller differensierte cellenes evne til å produsere og/eller metabolisere dopamin.

Eksempel 1: formering av primære kulturer

Hjernene fra fostre hos albino mus El4 ble plassert i fosfatbuffret saltløsning (PBS) og dissekert for å isolere striatum, hjernebark og midthjerne. Nervevevet ble mekanisk dissosiert i serum-fritt medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og F12-næringsstoff (GIBCO), ved anvendelse av en flammebehandlet Pasteur pipette. Celler ble sådd ut med en tetthet på 10<*>>celler/ml og poly-L-ornitin-belagte (15 ug/ml; Sigma) dekkglass i 24 brønners Nuclon dyrkningsskåler i et volum på 0,5 ml/brønn av fullstendig medium eller dyrket sammen på et glianæringscellelag. Vekstfaktorer og/eller kondisjonerte medier og/eller 1% serum ble tilsatt brønnene som angitt i eksempel 6. Cellene ble inkubert ved 37°C i en fuktet atmosfære med 95% luft og 5% co2. ;Eksempel 2: induksjon av tvrosinhydroksvlase- ekspresion i celler som er oppnådd fra den subventrikulære sonen hos voksne. ;For å merke celler som formerer seg i sub-ependymet i det subventrikulære området av hjernen, ble voksne CDj-mus gitt 5 injeksjoner med BrdU (Sigma, 120 mg/kg) i steril saltløsning, administrert med 2 timers intervaller [Morshead and van der Kooy, J. Neurosci., 1:49 (1992)]. 30 minutter etter den siste BrdU-injeksjonen ble dyrene drept. Striatum ble fjernet, oppdelt i 1 mm ringseksjoner og plassert i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF; 124 mM NaCl, 5 mM KC1,1,3 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 26 mM NaHC03og 10 mM D-glukose (pH 7,35~280 mOsmol), luftet med 95% CC7ved romtemperatur. Etter 15 minutter i aCSF ble de subventrikulære sonene mikrodissekert ut, delt i små stykker og overført til en roteringskolbe (Bellco Glass) med en magnetomrører, inneholdende en svak Ca2-aCSF-løsning (124 mM NaCl, 5 mM KC1, 3,2 mM MgCl2,0,1 mM CaCl2,26 mM NaHCC>3 og 10 MM D-glukose (pH 7,35~280 mOsmol), 1,33 mg/ml trypsin (9000 BAEF (beræoyl-I^argininetylester) enheter/mg), 0,67 mg/ml hyaluronidase (2000 enheter/mg) og 0,2 mg/ml kynurensyre. Denne løsning ble luftet med 95% CC>2/5% O2ved 32°C til 35°C. Etter 90 minutter ble vevsseksjonene overført til normal aCSF i 5 minutter og så overført til DMEM/F12-medium inneholdende 0,7 mg/ml ovomukoid (Sigma). Vevet ble mekanisk findelt med en varmesmalnet Pasteur pipette. Celler ble sentrifugert ved 400 rpm i 5 minutter og resuspendert i fullstendig medium med eller uten kondisjonert medium fra rottegliacellelinjen B49 (se eksempel 5) og FGF-2 (20 ng/ml). De ble sådd ut på poly-L-ornithibelagte dekkglass i 24-brønners Nuclon vevskulturskåler og inkubert ved 37°C, 100% fuktighet, luftet med 95% CC-2/5% C7, i 3 dager. Cellene ble så fiksert og behandlet for dobbeltmerket, indirekte immuncytokjemi for TH og BrdU, som angitt i eksempel 10. Tilstedeværelse av BrdU-merkede celler, som også var TH-IR, bare i de celler som var behandlet med CM og FGF-2 (fig. 1), tyder på at voksne prolifererende celler fra subventrikulærsonen kan induseres til å uttrykke TH i nærvær av CM og vekstfaktor. ;Eksempel 3: isolering og formerin<g>av embr<y>onale stamceller ;A. Muse stamceller ;Albino muse fostre (Charles River) fra dag 14 (E14) ble halshugget og hjerne og striatum fjernet ved anvendelse av en steril fremgangsmåte. Vevet ble mekanisk dissosiert med en flammebehandlet Pasteur pipette i fullstendig medium. Cellene ble sentrifugert ved 800 rpm i 5 minutter. Supernatanten suget av og cellene igjen suspendert i DMEM/F-12-medium for telling. Cellene ble resuspendert i fullstendig medium med 16-20 ng/ml EGF (renset fra museunderkjever, Collaborative Research) eller TGFa (human rekombinant, Gibco), sådd ut med 0,2 x 10^ celler/ml i 75 cm^ vevsdyrkningskolber (Corning) uten forbehandling med substrat og oppbevart i en inkubator ved 37°C, 100% fuktighet, 95% luft/5% CO2. Cellene delte seg i løpet av de første 48 timene og etter 3-4 dager in vitro (DIV), dannet de neurosfærer som løftet seg av substratet mellom 4-6 DIV. ;Etter 7 DIV ble neurosfærene fjernet, sentrifugert med 400 rpm i 2-5 minutter og pelleten ble mekanisk dissosiert i enkelt celler, med en flammebehandlet Pasteur-glasspipette i 2 ml fullstendig medium. 1 x 10<*>>celler ble igjen sådd ut i en 75 cm^ vevsdyrkningsflaske med 20 ml av det EGF-holdige fullstendig medium. Delingen av stamcellene og dannelse av nye neurosfærer ble reinitiert. Denne fremgangsmåten kan gjentas hver 6-8 dager.

B. Humane stamceller

Følgende eksempel skal ikke oppfattes dit hen at humane embryonale stamceller er en del av oppfinnelsen, men er gitt som eksempel på dyrking av celler for videre bruk i eksempel 11.

Forhjernevev fra humant foster (10,5 uker etter unnfangelse), oppnådd etter ordinær abort prosedyre, ble mekanisk dissosiert med en varmepolert Pasteur-pipette og plassert 1 fullstendig medium. Cellene ble sentrifugert med 800 rpm i 5 minutter, supernatanten sugd av og cellene resuspendert i DMEM/F-12-medium for telling. Cellene ble resuspendert i fullstendig medium med 20 ng/ml EGF (Chrion Corp) og 10 ng/ml FGF-2 (R&D, System), sådd ut ved ca 1,5 x IO<6>celler/ml i dyrkningsflasker (Nunclon Tl75) uten substratforbehandling og oppbevart i en inkubator ved 37°C, 100% fuktighet, 95% luft/5% CO2. Cellene delte seg etter 5 dager og på dag 10 startet de å danne neurosfærer som løftet seg av substratet fra dag 21.

Etter 15 DIV ble neurosfærene fjernet og sentrifugert med 1500 rpm i 7 minutter. Pelleten ble mekanisk dissoisert til enkeltceller ved findeling 150 ganger i 2 ml fullstendig medium. Cellene ble tellet og 1,5 x 10^ celler/ml ble igjen sådd ut i hver av flere dyrkningsflasker (Nunclon T175), med 25 ml fullstendig medium inneholdende EGF og FGF-2, som ovenfor. Delingen av stamcellene og dannelse av nye neurosfærer ble reinitiert. Denne fremgangsmåten kan gjentas (dvs. cellene kan overføres) hver 2-3 uker.

Eksempel 4: Fremstilling av glianæringscellelag.

Et astrocytt glianæringscellelag ble fremstilt fra striatumvev oppnådd fra mus etter fødselen (0-24 timer). Nervevevet ble dissekert ut, findelt og overført til et 15 ml sentrifugerør inneholdende DMEM/F12 (1:1)/10% FBS. Vevet ble dissosiert ved findeling med en flammebehandlet glasspipette og sådd ut i Corning dyrkningsflasker inneholdende 20 ml DMEM/F12/10% FBS ved en tetthet på 150.000 celler/ml. Når de primære astrocytt gliacellene ble konfluente, ble cellene dissoisert (ved anvendelse av trypsin-EDTA) og sådd ut igjen med 200.000 celler/cm^ på poly-L-ornitinbelagte dekkglass i 24 brønners dyrkningsskåler. Etter 3-4 dager ble konfluens gjenetablert. Celler som ble oppnådd fra dyrkningen av primærvev (eksempel 1) eller 6 dager gamle BrdU-merkede, andre passasje-neurosfærer (eksempel 3) ble vasket to ganger og resuspendert i nytt medium (nytt for serum, EGF eller BrdU) før samdyrking av cellene eller neurosfærene på astrocyttnæringscellelagene (eksempler 6 og 7).

Eksempel 5: fremstilling av kondisjonert medium

Kondisjonert medium (CM) ble fremstilt fra astrocyttiske celler eller fra en rottegliacellelinje B49 [Schubert et al., Nature, 249: 224, (1974)]. Et næringscellelag av astrocyttgliaceller ble fremstilt (eksempel 4). Det astrocyttiske laget ble overført en gang før oppsamling av CM. Rottegliacellelinjeceller B49 ble dyrket under samme betingelser som de astrocyttiske cellene. Konfluente kulturer av astrocytter eller rottegliacellelinjer B49 ble vasket en gang med PBS og to ganger med serumfritt fullstendig medium og inkubert i 20 ml av samme medium. CM ble oppsamlet 24,48 og 72 timer etter inkuberingsstart og sentrifugert med 1000 til 2000 omdreininger pr minutt for å fjerne eventuelle celler eller avfall. CM ble lagret ved -80°C.

Eksempel 6: In vitro induksjon av TH- IR i celler oppnådd fra primærkultur

Paradigma 1: primærkulturer oppnådd fra vev fra striatum og hjernebark ble fremstilt som angitt i eksempel 1. Fullstendig medium (kontroll), EGF (20 ng/ml; Chiron), rekombinant FGF-2 (20 ng/ml; R&D Systems), et kondisjonert medium av en kombinasjon av EGF pluss FGF, astrocytt (ACM) eller rottegliacellelinjen B49 (BCM, se eksempel 5) ble tilsatt enkeltvis eller i kombinasjoner til enkelte brønner ved tid for utsåing (tid, t=0). 1% FBS (Upstate Biotechnology Incorporated) ble tilsatt til 50% av brønnene som ikke mottok kondisjonert medium. Immuncytokjemisk analyse for påvisning av TH+-celler (eksempel 5) ble foretatt 24 timer etter utsåing. Resultatene er oppsummert i tabell 1. Tilsetningene av 1% FBS til de CM-frie brønnene forårsaket en tre gangers økning i antallet TH+-celler notert i nærvær av vekstfaktorer. Kombinasjonen av FGF-2 pluss BCM ga de beste resultatene, hvilket resulterte i generering av i gjennomsnitt mer enn ca 5.000 TH+ celler/cm^.

Paradi<g>ma 2: celler oppnådd fra primærkultur (eksempel 1) ble vasket to ganger og resuspendert i nytt medium før samdyrking av cellene på astrocyttnæringscellelag (eksempel 4) i nærvær av fullstendig medium (kontroll) eller fullstendig medium pluss EGF, FGF-2 eller en kombinasjon av EGF og FGF-2 (20 ng/ml av hver vekstfaktor), 1 um BrdU og 1% FBS. Indirekte immuncytokjemi (eksempel 10) ble utført på celler som var dyrket i 24 timer. En signifikant økning i TH-IR ble påvist i celler fra striatum som var samdyrket i nærvær av FGF-2 eller EGF pluss FGF-2 når de ble sammenlignet med celler som var dyrket bare i fullstendig medium. En liten, men signifikant økning ble observert i nærvær av EGF alene. Primære celler som var oppnådd fra barken viste en lignende respons og EGF og FGF alene (en signifikant økning sammenlignet med kontrollverdiene, men den største økningen i TH-IR ble observert ved anvendelse av EGF og FGF-2 sammen. Som angitt ved BrdU-opptak, er få celler fra midthjernen mitotisk aktive, selv i nærvær av vekstfaktorer. Resultatene er oppsummert i tabell II.

Eksempel 7: In vitro- induksjon av TH- ekspresion ved anvendelse av et definert d<y>rkningsmedium

Primærkulturer oppnådd fra vev fra striatum og hjernebark unntatt humant embryonalt stamcellevev ble fremstilt som angitt i eksempel 1. Fullstendig medium (kontroll), FGF-2 (20 ng/ml, R&D systems), BMP-2 (50ng/ml; Chiron Corp.) og aktivin (50 ng/ml, Chiron Corp.) ble tilsatt enkeltvis eller i kombinasjon (fullstendig medium pluss FGF-2 og BMP-2 eller fullstendig medium pluss FGF-2 og aktivin) til enkeltbrønner ved tiden for utsåing. Immuncytokjemisk analyse for påvisning av TH+-celler (eksempel 10) ble foretatt 24 timer etter utsåing. Resultatene er oppsummert i tabell 3. Kombinasjonen av FGF-2 pluss aktivin eller FGF-2 pluss BMP-2 ga de beste resultatene, hvilket resulterte i generering av i gjennomsnitt ca 5.000 TH+-neuroner pr cm<2>.1 motsetning til dette ga kontrollen, omfattende fullstendig medium alene, et gjennomsnitt på 2 TH+-celler pr cm2.

Eksempel 8: in vitro- induksjon av TH- IR i nervestamcelle- avledet forløpercelleavkom ved anvendelse av kondisjonert medium

Paradi<g>ma 1: enkle, udissosierte, 6 dager gamle primært genererte neurosfærer (se eksempel 3) ble sådd ut på poly-L-ornitin-belagte dekkglass, i fullstendig medium med eller uten CM som er oppnådd fra rottegliacellelinje B49 (eksempel 5) pluss 20 ng/ml FGF-2, og inkubert ved 37°C i 5% CO2,95% luft, 100% fuktighet. 24 timer etter utsåing avslørte indirekte immuncytokjemi for TH+ (se eksempel 10) nærvær av TH+-celler, med prosesser og neuronal morfologi, i de brønner som inneholder CM og FGF-2 (fig. 2), men ikke i de brønnene som inneholdt bare fullstendig medium.

Paradi<g>ma 2: enkle, udissosierte, 6 dager gamle, andre passasje-neurosfærer (eksempel 3) ble merket med BrdU, vasket to ganger og resuspendert i nytt medium for samdyrking av neurosfærene på astrocyttnæringscellelag (eksempel 4) i nærvær av fullstendig medium eller fullstendig medium pluss FGF-2 (20 ng/ml). Indirekte immuncytokjemi (eksempel 10) ble utført på celler som var dyrket i 24 timer. TH-IR-celler med neuronal morfologi som farget positivt for MAP-2, ble observert i de neurosfærer som var dyrket med FGF-2. Flere av TH+-cellene viste BrdU-irnmunreaktivitet (figur 3).

Eksempel 9: in vitro- induksjon av TH- IR i avkom avledet fra nervestamcelle ved anvendelser av definert medium

Enkle, udissoiserte, 6 dager gamle, primær genererte neurosfærer (se eksempel 3) spres på poly-L-ornitin-belagte dekkglass, i fullstendig medium med en kombinasjon av 20 ng/ml FGF-2 og 20 ng/ml BMP-2 eller en kombinasjon av 20 ng/ml FGF-2 og 20 ng/ml aktivin (eksempel 7), og inkubert ved 37°C i 5% CC7,95% luft, 100% fuktighet. Antallet dopaminerge neuroner bestemmes ved TH-immunreaktivitet (eksempel 10).

Eksempel 10: Immuncvtokiemi

Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter fulgt av tre vaskinger med PBS i 10 minutter hver. Cellene ble inkubert med et primært anti-TH-antistoff (kanin polyklonal, 1:1.000, Engene Tech International Inc.: eller 1:100, Pel-freeze) fremstilt i PBS/10% normalt geiteserum/0,3 Triton X-100 i 2 timer ved 37°C. Etter 3 vaskinger med PBS, ble geite-anti-kanin-rhodamin (Jackson) påført i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. I noen tilfeller ble MAP-2 (Boehringer-Mannheim) anvendt for å identifisere neuroner. Cellene ble så vasket tre ganger i 10 minutter hver i PBS, skylt med vann, plassert på dekkglass og glassene ble dekket ved anvendelse av Fluorosave (Calbiochem) som tellemedium. Antallet dopaminerge neuroner ble bestemt ved å telle TH-immunreaktive (TH+) pr cm<2>, under 200x forstørrelse.

Eksempel 11: transplantasjon av dopaminerge celler

A: transplantasjon av celler oppnådd fra d<y>rkede, humane nervestamceller i en musemodell av Parkinsons sykdom

Følgende eksempel skal ikke oppfattes dit hen at humane embryonale stamceller er en del av oppfinnelsen, men skal vise at transplantasjon av dopaminerge celler kan anvendes ved behandling av Parkinsons sykdom.

Forhjeme stamceller fra humant foster deles i en kultur som angitt i eksempel 3B og overføres 35 ganger. Tre dager før transplantasjonen fjernes de flytende neurosfærene og behandles i henhold til en av to fremgangsmåter for å forøke neuronal differensiering til en TH-fenotype. I den første TH-forøkningsmetoden behandles cellene som beskrevet i eksempel 10 ovenfor (med 1 um BrdU tilsatt til mediet). På transplantasjonsdagen vaskes cellene, løsnes med trypsin/EDTA og behandles så med trypsininhibitor. Cellene suspenderes i HBSS med en tetthet på 20 x 10^ celler/milliliter for transplantasjon. I den andre TH-forøkningsmetoden plasseres cellene i ubehandlede flasker, som får neurosfærene til å forbli flytende. Dyrkningsmediumskomponentene er de samme som i den første metoden. På transplantasj onsdagen skylles cellene, findeles lett og suspenderes så i HBSS med en densitet på 21 x 10^ celler/ml for transplantasjon. Alle cellene lagres ved 4°C under transplantasj onsperioden.

Som en Parkinsons sykdomsmodell mottar verts-Wister-rotter (ca 275 g, Charles River) ensidig administrering av 4 ni av en løsning med 2 ug/ul 6-OHDA (6-hydroksydopamin, Sigma) for å skade de dopaminerge neuronene i substantia nigra compacta på samme side. 16 dager senere mottar de transplantater av det humane stamcelleavkom til den ipsilaterale striatum. 5 dyr mottar celler behandlet som i den første TH-forøkningsmetoden og 5 dyr mottar celler som er behandlet som i den andre forøkningsmetoden. Dyrene drepes etter 1 uke, 6 uker og 3 måneder.

Dyrene perfunderes transkardikalt med aldehyder, hjernevev fjernes og deles i 10 nm tykke seksjoner og vev monteres så direkte på mikroskopglass. Dobbelte immunofargingsteknikker anvendes for lysmikroskopi for å identifisere transplanterte celler (BrdU+) som inneholder tyrosinhydroksylase (TH+) ved bruk av antistoffer mot BrdU og TH. Forskjellig fargede substrater gjør det mulig å identifisere dobbelt-merkede celler hvilket indikerer at en populasjon av de transplanterte cellene differensierte til neuroner med en dopaminerg fenotype.

B_i Parkinsons sykdom er en tilstand som erkarakterisert veddegenerering av den dopaminerge veien til striatum og oppstår på grunn av minskede dopaminnivåer i dette området. Tilstanden erkarakterisert vedmuskulær stivhet, skjelving og andre bevegelses abnormaliteter. Forløperceller, fremstilt fra humant fostervev formeres (eksempel 3B) og induseres for å differensiere til dopaminerge celler (eksempel 10). Dopaminerge celler injiseres stereotaktisk i striatum hos en Parkinson-pasient. Booster-injeksjoner kan gis om nødvendig. Alternativt fremstilles forløperceller fra nervevev oppnådd fra en biopsi av Parkinsons-pasientens hjerne og induseres til å differensiere til dopaminerge celler (eksempel 7 eller 8) og injiseres stereotaktisk i pasientens striatum. Alternativt kan forløperceller dyrkes i nærvær av et dyrkningsmedium som induserer dannelse av dopaminerge celler og implanteres i Parkinson-pasientens striatum der forløpercellene differensierer, in vivo, til dopaminerge celler. Forbedret bevegelseskontroll anvendes for å måle suksessen med transplantasjonen.

Eksempel 12: medisinscreening ved anvendelse av d<y>rkede dopaminerge celler Prozac, en medisin som er meget brukt ved behandlingen av psykiatriske sykdommer, tilsettes til dyrkede, dopaminerge celler fremstilt som angitt i eksempler 6, 7, 8,9,10 i konsentrasjoner som varierer fra 1 ng/ml til 1000 ng/ml. Virkningene av medisinen i forskjellige konsentrasjoner med hensyn til cellemetabolisme og- overlevelse undersøkes.

Alle referanser, patenter og patentsøknader som er sitert her inntas som referanse.

Claims (26)

1. Fremgangsmåte for indusering av ekspresjon av tyrosinhydroksylase (TH) i nerveceller fra pattedyr-CNS, unntatt humane embryonale stamceller, in vitro,karakterisertved dyrking av nervecellene i et dyrkningsmedium til hvilket det er tilsatt fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) og et eller flere medlemmer av den transformerende vekstfaktor B-familien, der nervecellene fra pattedyr-CNS inkluderer en eller flere multipotente nervestamceller avledet fra normalt ikke-dopaminergt nervevev og der ekspresjon av tyrosinhydroksylase i nervecellene induseres in vitro ved å bringe nervecellene i kontakt med dyrkingsmediet inneholdende nevnte vekstfaktorer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat dyrkingsmediet er definert og dyrkingsmediet omfatter et medlem av den transformerende vekstfaktor p-familien valgt fra gruppen bestående av aktivin og benmorfogenetisk protein-2.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat nervecellene dyrkes på en ionisk ladet overflate valgt fra gruppen bestående av poly-D-lysin, poly-L-ornitin, MATRIGEL, laminin og fibronektin.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3,karakterisert vedat det normalt ikke-dopaminerge nervevevet er valgt fra gruppen bestående av subventrikulærsonen, striatum og barken.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat dyrkningsmediet ytterligere omfatter gliacellekondisjonert medium.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6,karakterisert vedat dyrkningsmediet videre omfatter serum.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6,karakterisert vedat nervecellene dyrkes i fravær av et næringscellelag.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7,karakterisert vedat nervecellene er avkom av minst en multipotent nervestamcelle formert in vitro i nærvær av en prolifereringsinduserende vekstfaktor utvalgt fra gruppen bestående av amfiregulin, epidermal vekstfaktor, fibroblastvekstfaktor og transformerende vekstfaktor alfa, og der den multipotente nervestamcelle er i stand til å frembringe avkom som er i stand til å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat den multipotente nervestamcellen er oppnådd fra postnatalt eller voksent nervevev.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter dyrking av nervecellene med en ionisk ladet overflate valgt fra gruppen bestående av poly-D-lysin, poly-L-ornitin, MATRIGEL, laminin og fibronektin, og der dyrkriingsrnediiirn er definert.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat medlemmet av den transformerende vekstfaktor p-familien er valgt fra gruppen bestående av aktivin og benmorfogenisk protein-2.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert veddyrking av nervecellene med et næringscellelag og der dyrkingsmedium omfatter gliacellekondisjonert medium til hvilket det er tilsatt fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2).

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat næringscellelaget er oppnådd fra normalt ikke-dopaminergt nervevev fra velutviklete CNS-områder som ikke består av dopaminerg nervevev.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12 eller 13,karakterisert vedat dyrkingsmediet videre omfatter serum.

15. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-14,karakterisert vedat nervecellene er av minst en multipotent nervestamcelle som er formert in vitro i nærvær av en prolifereringsinduserende vekstfaktor utvalgt fra gruppen bestående av amfiregulin, fibroblastfaktor og transformerende vekstfaktor alfa, og der den multipotente nervestamcelle er i stand til å frembringe avkom som er i stand til å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisert vedat det normalt ikke-dopaminerge vevet er valgt fra gruppen bestående av subventrikulærsonen, striatum og barken.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisert vedat dyrkningsmediet videre omfatter gliacellekondisjonert medium.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat dyrkningsmediet videre omfatter serum.

19. Fremgangsmåte for screening av en medisins effekt på dopaminerge celler,karakterisert vedat den omfatter: a) dyrking av nerveceller fra pattedyr-CNS ifølge fremgangsmåten ifølge krav 1 for å indusere ekspresjon av tyrosinhydroksylase i nevnte nerveceller, b) bringe nervecellene i kontakt med et medikament, og c) måle responsen, utvalgt fra gruppen bestående av en dopaminerg respons og celleoverlevelse av nervecellene, ved påvirkning av medikamentet.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat responsen bestemmes ved å måle nevnte nervecellers evne til å produsere eller metabolisere dopamin.

21. Cellekultur,karakterisert vedat den omfatter differensierende eller differensierte dopaminerge celler i et dyrkningsmedium til hvilket det er tilsatt fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) og et eller flere medlemmer av den transformerende vekstfaktor beta-familien, der de dopaminerge cellene ikke er humane embryonale stamceller.

22. Cellekultur ifølge krav 21,karakterisert vedat medlemmet av den transformerende vekstfaktor P-familien er valgt fra gruppen bestående av aktivin og benmorfogenetisk protein.

23. Cellekultur ifølge krav 21 eller 22,karakterisert vedat dyrkningsmediet er definert.

24. Cellekultur ifølge et hvilket som helst av kravene 21 til 23,karakterisert vedat de dopaminerge cellene er avledet fra CNS hos et menneske.

25. Anvendelse av en celle fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 19 for fremstilling av et medikament for behandling av en neurologisk forstyrrelse ved å transplantere nevnte celle til en pasient i et CNS-område som trenger dopaminerge celler.

26. Anvendelse ifølge krav 25 der den neurologiske forstyrrelsen er Parkinsons sykdom og administreres til pasientens striatum.