ES2194016T5 - Factores biologicos y celulas germinales neurales. - Google Patents

Factores biologicos y celulas germinales neurales. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA AUMENTAR EL NUMERO DE CELULAS ALARGADAS NEURONALES QUE DIFERENCIAN ENTRE ASTROCITOS, OLIGODENDROCITOS O NEURONAS. LOS METODOS COMPRENDEN LA PROLIFERACION DE CELULAS ALARGADAS NEURONALES AISLADAS EN UN MEDIO DE CULTIVO QUE TIENE UN PRIMER FACTOR DE CRECIMIENTO PARA PRODUCIR CELULAS PRECURSORAS. LAS CELULAS PRECURSORAS SE DIFERENCIAN ENTONCES EN ASTROCITOS, OLIGODENDROCITOS U HORMONAS EN UN SEGUNDO MEDIO DE CULTIVO, LIBRE DEL PRIMER FACTOR DE CRECIMIENTO, QUE CONTIENE UN SEGUNDO FACTOR DE CRECIMIENTO O COMBINACION DE FACTORES DE CRECIMIENTO.

Description

Factores biológicos y células germinales neurales.
Campo de la invención
La presente invención se dirige al cultivo, desarrollo y diferenciación de células germinales neurales usando diversos factores biológicos. Más particularmente la invención se refiere a un método para aumentar el número de células precursoras que experimentan diferenciación en un fenotipo particular mediante la exposición de las células a factores biológicos específicos o combinaciones de los mismos.
Sumario de la invención
Se describe un método de preparación de células diferenciadas a partir de células madre neurales de mamífero, cuyo método consiste en las siguientes etapas:
(a)
hacer proliferar al menos una célula madre neural de mamífero aislada del tejido de un donante, con la condición de que el tejido no derive de un embrión humano, en suspensión en un medio de cultivo libre de suero que contiene factor de crecimiento epidérmico como mitógeno que hace proliferar a dicha al menos una célula madre para producir células precursoras neurales, cuya al menos una célula madre responde al EGF y es capaz de producir progenie capaz de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, y
(b)
diferenciar las células precursoras neurales eliminando el mitógeno y cultivando dichas células precursoras neurales en un medio de cultivo inductor de la diferenciación libre de EGF para producir células diferenciadas, cuyo medio contiene un substrato sobre el que se pueden adherir las células precursoras neurales, siendo preparado dicho medio con un factor de crecimiento exógeno seleccionado entre el grupo consistente en CNTF, bFGF, BDNF y ácido retinoico.
Antecedentes de la invención
El desarrollo del sistema nervioso comienza en una etapa temprana del desarrollo fetal. La neurogénesis, la generación de neuronas nuevas, se completa en el periodo postnatal temprano. Sin embargo, las conexiones sinápticas implicadas en los circuitos neurales se alteran continuamente durante la vida del individuo, debido a la plasticidad sináptica y la muerte celular.
La primera etapa en el desarrollo neural es el nacimiento celular, que es la secuencia temporal y espacial precisa en la que las células precursoras o progenitoras proliferan y se diferencian. Las células en proliferación dan lugar a los neuroblastos, glioblastos y células germinales.
La segunda etapa es un periodo de diferenciación y migración de los tipos celulares en el que las células progenitoras se transforman en neuronas y neurogliocitos y emigran a sus posiciones finales. Las células que se derivan del tubo neural dan lugar a neuronas y neurogliocitos del sistema nervioso central (SNC), mientras que las células derivadas de la cresta neural dan lugar a las células del sistema nervioso periférico (SNP). Algunos factores presentes durante el desarrollo, como el factor de crecimiento nervioso (NGF), promueven el crecimiento de las células neurales. El NGF es secretado por células de la cresta neural y estimula el nacimiento y crecimiento de los axones neuronales.
La tercera etapa del desarrollo ocurre cuando las células adquieren cualidades fenotípicas específicas, tales como la expresión de neurotransmisores particulares. En este momento, las neuronas también extienden prolongaciones que forman sinapsis con sus dianas. Las neuronas no se dividen después de la diferenciación.
Finalmente, ocurre una muerte celular selectiva, en la que la degeneración y muerte de las células, fibras y conexiones sinápticas específicas "ponen a punto" el complejo circuito del sistema nervioso. Esta "puesta a punto" continúa durante la vida del hospedador. Más adelante en la vida, la degeneración selectiva debida al envejecimiento, infección y otras etiologías desconocidas puede llevar a enfermedades neurodegenerativas.
Recientemente, se ha aplicado el concepto de injerto de tejido neurológico al tratamiento de enfermedades neurológicas como la enfermedad de Parkinson. Los injertos neurales no sólo pueden evitar la necesidad de una constante administración de fármacos, sino también de los complicados sistemas de administración de fármacos que surgen debido a la barrera de la circulación del cerebro. Sin embargo, hay limitaciones a esta técnica. Primero, las células provenientes de una célula diferenciada de otro hospedador que se usan para los transplantes que portan moléculas en la superficie celular pueden inducir una reacción inmunológica en el hospedador. Además, las células deben estar en una etapa de desarrollo en la que son capaces de formar conexiones neurales normales con las células adyacentes. Por estos motivos, los estudios iniciales sobre el neurotransplante se centran en el uso de células fetales. Perlow y cols. describen el transplante de neuronas dopaminérgicas fetales en ratas adultas con lesiones del cuerpo negro estriado inducidas químicamente en "Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system", Science 204: 643-647 (1979). Estos injertos mostraban una buena supervivencia, crecimiento de axones y redujeron de forma significativa las anormalidades motoras en los animales hospedadores. Lindvall y cols., en "Grafts of fetal dopamine neurons survive and improve motor function in Parkinson's disease", Science 257: 574:577 (1990), demostraron que los transplantes neurales de neuronas productoras de dopamina mesencefálicas fetales humanas pueden restaurar la síntesis y almacenamiento de dopamina, y reducir la rigidez y bradiquinesia en pacientes que padecen al enfermedad de Parkinson. Freed, y cols. en "Transplantation of human fetal dopamine cells for Parkinson's Disease", Arch. Neurol. 47:505-512 (1990) muestran también la mejora de un paciente que recibió un transplante fetal.
Las referencias anteriores describen que el tejido cerebral fetal de mamífero tiene unas buenas características de supervivencia en el transplante inmediato. Se cree que la capacidad de supervivencia aumentada de las neuronas fetales se debe a la reducida susceptibilidad de las neuronas fetales a la anoxia comparada con las neuronas adultas, y también a la carencia de marcadores en la superficie celular de las células fetales cuya presencia puede llevar al rechazo del tejido injertado de adultos. Sin embargo, aunque se considera que el cerebro es un sitio inmulógicamente privilegiado, puede ocurrir algún rechazo del tejido fetal. Por lo tanto, la capacidad de usar tejido fetal está limitada, no sólo debido al rechazo del tejido fetal aislado de otro hospedador, y debido a la necesidad de fármacos inmunosupresores resultante, sino debido también a problemas éticos para obtener tejido fetal. Sin embargo, el tejido cerebral neonatal posee una capacidad limitada de supervivencia y las neuronas del SNC mamífero generalmente no sobreviven al transplante en el cerebro.
Aunque las neuronas del SNC adulto no son buenas candidatas para el neurotransplante, se ha demostrado que las neuronas del sistema nervioso periférico (SNP) de adultos sobreviven al transplante, y ejercen efectos neurotrópicos y gliotrópicos sobre el tejido neural en desarrollo del hospedador. Una fuente de tejido neural no del SNC para transplante es la médula suprarrenal. Los cromocitomas suprarrenales se originan en la cresta neural al igual que las neuronas del SNP, y reciben sinapsis y producen proteínas de transporte y enzimas similares a las neuronas del SNP. Aunque estas células funcionan de forma endocrina en la médula suprarrenal intacta, en cultivo estas células pierden su fenotipo glandular y desarrollan características neurales en cultivo en presencia de ciertos factores y hormonas de crecimiento (Notter y cols., "Neuronal properties of monkey adrenal medulla in vitro", Cell Tissue Research 244: 69-76 (1986)]. Cuando se injertan al SNC mamífero, estas células sobreviven y sintetizan cantidades significativas de dopamina que pueden interactuar con los receptores de dopamina en áreas adyacentes del SNC.
En la patente de Estados Unidos nº 4.980.174, el trasplante de células que contienen monoamina aisladas de la glándula pineal y de la médula suprarrenal de ratas adultas al cortex frontal de ratas dio como resultado el alivio de la impotencia aprendida, una forma de depresión, en el hospedador. En la patente de Estados Unidos nº 4.753.635, los cromocitomas y el tejido medular suprarrenal derivado de bueyes se implantaron el tronco cerebral o médula espinal de ratas y produjo la analgesia cuando se indujo al tejido o célula implantado a liberar sustancias que interactúan con los nociceptores (por ejemplo catecolaminas como dopamina). Se han injertado células de la médula suprarrenal de forma antóloga a los humanos, y han sobrevivido, produciendo una mejora de leve a moderada de los síntomas (Watts, y cols., "Adrenal- caudate transplantation in patients with Parkinson's Disease (PD): 1-year follow-up", Neurology 39 Supl 1:127 [1989]: Hurtig y cols., "Post-mortem análisis of suprarenal-medulla-to-caudate autograft in a patient with Parkinson's Disease", Annals of Neurology 25: 607-614 [1898]). Sin embargo, las células suprarrenales no obtienen un fenotipo neural normal, y son por lo tanto probablemente de uso limitado para trasplantes en los que deben formarse conexiones sinápticas.
Otra fuente de tejido para el neurotranspiante es a partir de líneas celulares. Las líneas celulares son células inmortalizadas que se derivan ya sea por transformación de células normales con un oncogén (Cepko, "Inmortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction", Ann. Rev. Neurosci. 12:47-65 [1989]) o por cultivo de células con características de crecimiento alterado in vitro (Ronnett, y cols., "Human cortical neuronal cell line: Establisment from a patient with unilateral megalencephaly", Science 248: 603-505 [1990]). Tales células pueden desarrollarse en cultivo en grandes cantidades para usarse para trasplantes múltiples. Se ha visto que algunas líneas celulares se diferencian al ser tratadas químicamente para expresar una variedad de propiedades neuronales como la formación de neuritas, membranas excitables y síntesis de neurotransmisores y sus receptores. Además, al diferenciarse, estas células parecen sen amitóticas, y por lo tanto no cancerosas. Sin embargo, el potencial de estas células para inducir respuestas inmunitarias adversas, el uso de retrovirus para inmortalizar las células, el potencial de reversión de estas células a un estado amitótico, y la falta de respuesta de estas células a las señales de inhibición del crecimiento normales hacen que las líneas celulares no sean óptimas para su uso generalizado.
Las células O-2A son progenitoras de neurogliocitos que dan lugar in vitro únicamente a oligodendrocitos y astrocitos de tipo II. Se ha demostrado que las células que parecen tener el fenotipo O-2A por inmunotinción in vivo remielinizan con éxito las neuronas desmilienizadas in vivo. Godfraind y cols., J. Cell Biol. 109:2405-2416 (1989). Se requiere la inyección de un gran número de células O-2A para remielinizar adecuadamente todas las neuronas diana in vivo, dado que parece que las células O-2A (al igual que otras preparaciones de neurogliocitos) no siguen dividiéndose in situ. Aunque las células progenitoras O-2A pueden desarrollarse en cultivo, actualmente la única técnica de aislamiento disponible emplea nervio óptico como materia prima. Esta es una fuente de bajo rendimiento, que requiere numerosas etapas de purificación. Existe un inconveniente adicional porque las células O-2A aisladas por los procedimientos disponibles pueden dividirse únicamente un número de veces limitado. Raff Science 243: 1450-1455 (1989).
Las líneas celulares O-2A trasformadas no son adecuadas para ser trasplantadas debido al hecho de que el proceso de trasformación lleva a una división celular controlada genéticamente (oncogén) al contrario que las líneas celulares primarias o las células germinales o células progenitoras en las que la regulación de la división es a nivel epigenético. Otros problemas potenciales adicionales incluyen la inestabilidad de las líneas celulares durante largos periodos de tiempo, y patrones aberrantes de diferenciación o de respuesta a factores de crecimiento. Goldman Trends Neuro. Sci. 15: 359-362 (1992).
La incapacidad en la técnica anterior de que el trasplante se integrara completamente en el tejido hospedador, y la falta de disponibilidad de células en cantidades ilimitadas a partir de una fuente fiable para ser injertadas son, quizás, las limitaciones mayores del neurotrasplante.
Por lo tanto, en vista de las deficiencias mencionadas anteriormente que acompañan a los métodos de la técnica anterior de cultivo y trasplante de células neurales, debería ser aparente que existe todavía una necesidad en la técnica de una fuente fiable de números ilimitados de células para el neurotransplante, que sean capaces de diferenciarse en neuronas y neurogliocitos.
En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar una fuente fiable de células reguladas epigenéticamente para el trasplante, que sean capaces de diferenciarse en neuronas y neurogliocitos.
Es otro objeto de la invención proporcionar un método para influenciar la diferenciación de las células precursoras usando factores de crecimiento específicos.
Estos y otros objetos y características de la invención serán aparentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada y las reivindicaciones anexas a continuación.
Se cree que ninguna de las referencias anteriores describe la presente invención como se reivindica y no se presume que sea técnica anterior. Las referencias se ofrecen como información sobre los antecedentes.
Descripción detallada de la invención Definiciones
El término "célula germinal" se refiere a una célula no diferenciada que es capaz de proliferar y dar lugar a más células germinales que tienen la capacidad de generar un gran número de células progenitoras que pueden a su vez dar lugar a células hija diferenciadas o diferenciables.
El término "célula germinal neural" (SNC) se refiere a las células germinales de la presente invención, cuya progenie, en condiciones de cultivo apropiadas, incluye tanto las células progenitoras gliales como neuronales.
El término "células progenitoras" se refiere a las células no diferenciadas de la presente invención, derivadas de células germinales neurales, cuya progenie puede, en las condiciones apropiadas, incluir células progenitoras gliales y/o neuronales.
El término "oligodendrocito" se refiere a un neurogliocito diferenciado que forma la mielina que rodea los axones en el sistema nervioso central (SNC). Los oligodendrocitos son del fenotipo galactocerebrósido (+), proteína básica de mielina (+), y proteína ácida fibrilar glial (-) [GalC(+), MBP(+), GFAP(-)]
El término "neurona" se refiere a una célula que tiene el fenotipo enolasa neuroespecífica (+) o neurofilamento (+) [NSE(+) o NF(+)].
El término "astrocito tipo I" se refiere a un tipo de neurogliocito diferenciado con una morfología protoplásmica plana/tipo fibroblasto que es GFAP(+), A2B5(-), GalC(-), y MBP(-).
El término "astrocito tipo II" se refiere a un neurogliocito diferenciado que presenta una morfología de prolongaciones estrelladas de fenotipo GFAP(+), A2B5(+), GalC(-), y MBP(-).
El término "células progenitoras neuronales" se refiere a células que producen células hija que en las condiciones apropiadas se vuelven o dan lugar a neuronas.
El término "células precursoras de oligodendrocitos" se refiere a células que dan lugar a oligodendrocitos. Las células precursoras de oligodendrocitos pueden tener el fenotipo A2B5(+), O4(+)/GalC(-), MBP(-) y GFAP(-) [pero no se están limitadas a este fenotipo].
El término "neuroesfera" se refiere a un agrupamiento de células derivadas de células germinales neurales y cultivadas in vitro. Al menos algunas de las células son del fenotipo nestina (+). El agrupamiento está comprendido por células germinales y/o células progenitoras y puede o no incluir células diferenciadas.
El término "células precursoras" se refiere a las células vivas de la presente invención que se derivan de células germinales neurales que se hacer proliferar en un medio de cultivo que contiene un factor o factores de crecimiento, e incluye tanto células progenitoras como germinales. Las células precursoras típicamente crecen en forma de neuroesferas, pero pueden mostrar diferentes patrones de crecimiento dependiendo de las condiciones de cultivo.
El término "factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido u otra molécula que tiene un efecto de crecimiento, proliferativo, diferenciador o trópico.
El término "donante" se refiere al humano o animal que es la fuente de las células germinales neurales usadas en la presente invención, del que se excluyen los embriones humanos como fuente.
Descripción de las realizaciones preferidas Características fenotípicas
Se ha comunicado y descrito el uso potencial de las células germinales neurales (NSC). (Reynolds y Weiss, Science 255: 1707 (1992)). Se ha demostrado que las NSC dan lugar a neuroblastos (Reynolds y Weiss, Restorative Neuroloy & Neuroscience 4: 208 (1992)). Se sabe ahora que las NSC dan lugar también a los tipos celulares macrogliales principales (astrocitos y oligodendrocitos).
Las células germinales neurales pueden aislarse y cultivarse mediante el método de Reynolds y Weiss (referencia anterior). Brevemente, se induce la división de la célula germinal que responde al factor de crecimiento epidérmico (EGF), cuando se cultiva en un medio sin suero definido, y en presencia de un mitógeno como EGF o similares, dando lugar a un agrupamiento de células no diferenciadas. Los agrupamientos de células no son inmunorreactivos a GFAP, neurofilamento (NF), enolasa neuroespecífica (NSE) o MBP. Sin embargo, las células precursoras en el agrupamiento son inmunorreactivas a la nestina, una proteína filamentosa intermedia que se encuentra en las células del CNS no diferenciadas. El marcador de nestina fue caracterizado por Lehndahl y cols., Cell 60: 585-595 (1990). Los fenotipos maduros asociados con los cuatro tipos celulares que pueden diferenciarse de la progenie de las células precursoras son predominantemente negativas para el fenotipo de nestina.
En presencia continuada de un mitógeno como EGF o similares, las células precursoras en la neuroesfera continúan dividiéndose, dando como resultado un aumento del tamaño de la neuroesfera y del número de células no diferenciadas [nestina(+), GFAP(-), NF(-), NSE(-), MBP(-)]. En esta etapa, las células no son adherentes y tienden a formar los agrupamientos que flotan libremente característicos de las neuroesferas. Sin embargo pueden variarse las condiciones de cultivo de forma que aunque las células precursoras todavía expresen el fenotipo de nestina, no formen las neuroesferas características. Después de eliminar el mitógeno, las células se adhieren al sustrato (plástico o vidrio tratado con poliornitina), se aplanan, y comienzan a diferenciarse en neuronas y neurogliocitos. En esta etapa el medio de cultivo puede contener suero como suero bovino fetal (FBS) al 0,5-1,0%. A los 2-3 días, la mayor parte o todas las células precursoras comienzan a perder la inmunorreactividad a la nestina y comienzan a expresar filamentos intermedios específicos de neuronas o de astrocitos como indica la inmunorreactividad a NF o GFAP respectivamente.
La identificación de neuronas se logra usando la inmunorreactividad a la enolasa neuroespecífica (NSE) y las proteínas neurofilamentosas tau-1 y MAP-2. Debido a que estos marcadores son altamente fiables, continuarán siendo útiles para la identificación primaria de neuronas, sin embargo, las neuronas pueden identificarse también basándose en su fenotipo neurotrasmisor específico.
Usando métodos de inmunofluorescencia de marcaje doble e inmunoperoxidasa, pueden analizarse los cultivos de neuroesferas diferenciados para determinar la expresión de neurotransmisores o, en algunos casos, las enzimas responsables de la síntesis de neurotransmisores. De forma alternativa, puede realizarse la histoquímica de hibridación in situ usando sondas de ADNc o ARN específicas del neurotransmisor peptídico o los ARNm enzimáticos que sintetizan neurotransmisor. Estas técnicas pueden combinarse con métodos inmunocitoquimicos para mejorar la identificación de fenotipos específicos. Si fuera necesario, pueden aplicarse los anticuerpos y sondas moleculares analizadas anteriormente a procedimientos de transferencia de Western y Northern respectivamente para ayudar a la identificación celular.
De forma alternativa, pueden usarse métodos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en la identificación de fenotipos. La HPLC es particularmente útil para la identificación de numerosos neurotransmisores peptídicos pequeños y neurotransmisores de catecolamina e indolamina. Estas técnicas son altamente sensibles y pueden usarse en paradigmas de selección a gran escala que requieren volúmenes de muestra relativamente pequeños.
Además de la presencia de neuronas y astrocitos, un gran número de células que no expresan ni los filamentos intermedios específicos de neuronas ni de astrocitos, comienzan a expresar marcadores específicos de oligodendrocitos de una forma temporalmente correcta. Es decir, las células primero se hacen inmunorreactivas a 04 (un antígeno de la superficie celular), galactocerebrosido (GalC, un glicolípido de mielina) y finalmente, proteína básica de mielina (MBP). Estas células poseen también una morfología de oligodendrocito característica.
La presente invención proporciona un método para influenciar la proporción relativa de estos tipos celulares diferenciados mediante la adición de factores de crecimiento exógenos durante la etapa de diferenciación de las células precursoras. Usando métodos de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa de marcaje doble con diversos anticuerpos específicos de neurona y neurogliocito, puede determinarse el efecto de los factores de crecimiento exógeno sobre las células en diferenciación.
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Los efectos biológicos de los factores de crecimiento y trópicos están generalmente mediados por la unión a los receptores sobre la superficie celular. Se han identificado receptores de numerosos de estos factores y hay disponibles anticuerpos y sondas moleculares para receptores específicos.
Pueden analizarse células germinales neurales para determinar la presencia de receptores de factor de crecimiento en todas las etapas de la diferenciación. En muchos casos, la identificación de un receptor particular definirá la estrategia a usar para hacer que las células se diferencien adicionalmente siguiendo rutas de desarrollo específicas añadiendo factores de crecimiento o tráficos exógenos.
Los factores de crecimiento exógenos pueden añadirse solos o en diversas combinaciones. Pueden añadirse también en secuencia temporal (es decir, la exposición a un primer factor de crecimiento influencia la expresión de un segundo receptor de factor de crecimiento, Neuron 4: 189-201 (1990). Los factores de crecimiento usados para influenciar la diferenciación de células precursoras in vitro seleccionados son los factores de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), el factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), y ácido retinóico.
La diferenciación de las células precursoras puede inducirse también mediante diversos sustratos además de poli-L-ornitina como colágeno, fibronectina, laminina, matrigel, etc.
Ejemplos Ejemplo 1 Propagación de células precursoras
Se decapitaron ratones albinos embriónicos de 14 días (E14) CD_{1} (Charles River) y se eliminaron el cerebro y el cuerpo estriado usando un procedimiento estéril. El tejido se disoció mecánicamente con una pipeta de Pasteur esmerilada al fuego en un medio sin suero compuesto de una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y mezcla de nutrientes F-12 (Gibco). Las células se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante, y se resuspendieron las células en medio DMEM/F-12 para el recuento.
Se suspendieron las células en un medio sin suero denominado en lo sucesivo "medio completo", compuesto de DMEM/F-12 (1:1) que incluía glucosa (0,6%), glutamina (2 mM), bicarbonato sódico (3 mM), tampón HEPES (ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperazinetanosulfónico) (5 mM) y una mezcla de hormonas y sales definida (para sustituir al suero) que incluía insulina (25 \mug/ml), transferrina (100 \mug/ml), progesterona (20 nM), putrescina (60 \muM), y cloruro de selenio (30 nM) (todas de Sigma excepto glutamina [Gibco]). Además, el medio contenía 16-20 ng/ml de EGF (purificado a partir de submaxilar de ratón, Collaborative Research) o TGF\alpha (humano recombinante, Gibco). Las células se plaquearon a 0,2 x 10^{6} células/ml en 75 cm^{2} de matraces con cultivo tisular (Corning) sin tratamiento previo del sustrato y se mantuvieron en una incubadora a 37ºC, humedad del 100%, aire al 85%/CO_{2} al 5%.
Cuando proliferaron las células, en las primeras 48 horas y a los 3-4 días in vitro (DIV), formaron pequeños agrupamientos, conocidos como neuroesferas, que se desprendieron del sustrato entre el DIV 4-6.
Después de 7 DIV, se eliminaron las neuroesferas, se centrifugaron a 400 rpm durante 2-5 minutos, y se disoció el sedimento mecánicamente para obtener células individuales con una pipeta de Pasteur esmerilada al fuego en 2 ml de medio completo.
Se volvieron a plaquear 1 x 10^{6} células en un matraz de cultivo de tejido de 75 cm^{2} con 20 ml de medio completo que contenía EGF. Se reinició la proliferación de las células germinales y la formación de neuroesferas nuevas. Este procedimiento puede repetirse cada 6-8 días.
Ejemplo 2 Diferenciación de neuroesferas
Se diferenciaron las neuroesferas usando los siguientes paradigmas. Las neuroesferas usadas para cada paradigma se generaron como se esquematiza en el Ejemplo 1. Todas las neuroesferas usadas se trasvasaron al menos una vez antes de su diferenciación.
Paradigma 1
Diferenciación rápida de neuroesferas
De 6 a 8 días después del primer trasvase, se extrajeron las neuroesferas y se centrifugaron a 400 rpm. Se eliminó el sobrenadante que contenía EGF y se suspendió el sedimento en medio completo sin EGF que contenía suero bovino fetal (FBS) al 1%.
Se plaquearon las neuroesferas (aproximadamente 0,5-1,0 x 10^{6} células/pocillo) sobre cubres de cristal recubiertos con poli-L-ornitina (15 \mug/ml) en placas de cultivo Nuclon de 24 pocillos (1,0 ml/pocillo). Después de 24 horas en cultivo, se transfirieron los cubres a placas de cultivo de 12 pocillos (Costar) que contenían medio completo con FBS al 0,5%. El medio se cambió cada 4-7 días. Este procedimiento de diferenciación se denomina "Paradigma de diferenciación rápida" o RDP.
Paradigma 2
Diferenciación de neuroesferas disociadas
De 6 a 8 días después del primer trasvase, se extrajeron las neuroesferas y se centrifugaron a 400 rpm. Se eliminó el medio que contenía EGF y se suspendió el sedimento en medio completo sin EGF que contenía FBS al 1%. Se disociaron mecánicamente las neuroesferas para obtener células individuales con una pipeta de Pasteur esmerilada al fuego y se centrifugaron a 800 rpm durante 5 minutos. Se plaquearon entre 0,5 x 10^{6} y 1,0 x 10^{6} células sobre cubres de cristal recubiertos con poli-L-ornitina (15 \mug/ml) en placas de cultivo Nuclon de 24 pocillos (1,0 ml/pocillo). El medio de cultivo sin EGF que contenía FBS al 1% se cambió cada 4-7 días.
Paradigma 3
Diferenciación de neuroesferas individuales
Se lavaron las neuroesferas para eliminar el EGF mediante transferencias en serie a través de cambios de medio sin EGF. Se plaqueó una neuroesfera individual sobre cubres de cristal recubiertos con poli-L-ornitina (15 \mug/ml) en una placa de 24 pocillos. El medio de cultivo utilizado era medio completo con o sin FBS al 1%. El medio se cambió cada 4-7 días.
Paradigma 4
Diferenciación de neuroesferas disociadas individuales
Se lavaron las neuroesferas para eliminar el EGF mediante transferencias en serie a través de cambios de medio sin EGF. Se disoció una neuroesfera individual mecánicamente en un tubo de centrifugado Eppendorf y todas las células se plaquearon en una placa de cultivo de 35 mm. Se utilizó medio completo con o sin FBS al 1%.
Ejemplo 3 Efecto de los factores de crecimiento sobre la diferenciación de neuroesferas
Se examinaron los efectos de CNTF, bFGF, BDNF y ácido retinóico sobre la diferenciación de las neuroesferas usando los paradigmas de diferenciación descritos en el Ejemplo 2.
CNTF
Se ensayó el efecto de CNTF en los paradigmas 1 y 3. Para ambos paradigmas se añadió CNTF al comienzo del experimento con una concentración de 10 ng/ml o diariamente con una concentración de 1 ng/ml.
En el paradigma 1, la adición de CNTF aumentó el número de células inmunorreactivas a la enolasa neuroespecífica (NSE) además del número de células inmunorreactivas a tau-1, lo que sugiere que el CNTF tiene un efecto sobre la proliferación, supervivencia, o diferenciación de neuronas. Los análisis preliminares con anticuerpos que reconocen los neurotransmisores GABA y la Sustancia P sugieren que no aumenta el número de células que contienen estas proteínas. Esto sugiere que se está produciendo un fenotipo neuronal diferente.
Se usaron tres anticuerpos diferentes dirigidos contra o4, galactocerebrósido (GalC) y proteína básica de mielina (MBP) para estudiar el efecto de CNTF sobre los oligodendrocitos del paradigma 1. El CNTF no tuvo efecto sobre el número de células O4(+), pero hubo un aumento en el número de células GalC(+) y MBP(+) comparado con el control. Así parece que el CNTF juega un papel en la maduración de los oligodendrocitos.
En un experimento, las neuroesferas se diferenciaron como se esquematiza en el paradigma 1 pero nunca se añadió suero al medio de cultivo. Mientras que el efecto del CNTF sobre las neuronas y los oligodendrocitos no era aparente en presencia de suero, hubo un aumento de la proliferación de astrocitos protoplásmicos planos. Por lo tanto, el CNTF afectará la diferenciación de astrocitos en diversas condiciones de cultivo.
En el paradigma 3, la adición de CNTF dio como resultado un aumento de las células NSE(+).
BDNF
Se analizó el efecto de BDNF usando el Paradigma 3. Se dio un aumento del número de neuronas NSE(+) por neuroesfera. De forma adicional hubo un aumento en la ramificación neuronal y la migración de las neuronas desde la esfera.
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bFGF
Se analizó el efecto de bFGF usando los paradigmas 2 y 4. En el paradigma 2, se añadieron 20 ng/ml de bFGF al comienzo del experimento y se tiñeron las células 7 días después. El bFGF aumentó el número de células GFAP(+) y el número de células NSE(+). Esto sugiere que el bFGF tiene un efecto proliferativo o de supervivencia sobre las neuronas y los astrocitos.
En el paradigma 4, se añadieron 20 ng/ml de bFGF al comienzo del experimento y se ensayaron 7-10 días después. El bFGF indujo la proliferación de las células precursoras generada por la célula germinal que responde a EGF. Indujo la división de dos tipos diferentes de células, los neuroblastos y células progenitoras bipotenteses. Los neuroblastos produjeron, de media, 6 neuronas, mientras que la célula bipotentes produjo aproximadamente 6 neuronas y varios astrocitos.
En estudios previos, se observó que cuando se plaquean a baja densidad (2500 células/cm^{2}), la adición de EGF hasta el día 7 in vitro (DIV) podía iniciar la proliferación de la célula germinal, pero no si se aplicaba después de 7 DIV. Las células del cuerpo estriado (E14, 2500 células/cm^{2}) se plaquearon en ausencia o presencia de 20 ng/ml de bFGF. Después de 11 DIV, se lavaron los cultivos y se añadió medio que contenía 20 ng/ml de EGF. Después de 4-5 DIV, en cultivos cebados con bFGF, más del 70% de los pocillos examinados contenían agrupamientos de células en proliferación de las que se desarrollaban colonias con las propiedades morfológicas y antígenas de las células generadas mediante EGF. Los cultivos que no habían sido cebados con bFGF no mostraron proliferación en respuesta al EGF. Estos hallazgos sugieren que las células germinales que responden al EGF poseen receptores de bFGF que regulan su supervivencia a largo plazo.
Ácido retinóico
Se analizó el efecto del ácido retinóico 10^{-7}M usando el paradigma 1. Hubo un aumento en el número de células NSE(+) y tau-1 (+), lo que sugiere que el ácido retinóico aumenta el número de neuronas.
Ejemplo 4 Detección del receptor trkB en células germinales neurales
Se examinó la expresión de la familia trk de receptores de neurotropina en neuroesferas generadas mediante EGF mediante análisis por transferencia de Northern. Se aisló el ARNm total de neuroesferas estriadas generadas mediante EGF de ratón y rata. Tanto las neuroesferas de rata como de ratón expresaron niveles altos de ARNm del receptor trkB, pero no expresaron ARNm de trk ni de trkC. En los experimentos preliminares, se plaquearon neuroesferas individuales de ratón generadas mediante EGF sobre cubres de cristal recubiertos con poli-L-ornitina y se cultivaron en ausencia o presencia de 10 ng/ml de BDNF. Cuando se examinaron después de 14-28 días in vitro, se plaquearon las neuroesferas en presencia de células NSE(+) que contenían BDNF con prolongaciones extensas y altamente ramificadas; no se observaron células NSE(+) bien desarrolladas en ausencia de BDNF. La activación del receptor trkB en neuroesferas generadas mediante EGF puede potenciar la diferenciación, supervivencia y/o crecimiento de neuritas a partir de neuronas recién generadas.
Ejemplo 5 Detección de la fosfoproteína de membrana GAP-43 en células germinales neurales
La proteína asociada al crecimiento (GAP-43) es una fosfoproteína de membrana específica de sistema nervioso que se regula por disminución durante el desarrollo. Originariamente, se creía que GAP-43 era neuroespecífica, sin embargo, trabajos recientes indican que esta proteína puede expresarse al menos de forma transitoria durante el desarrollo en algunos astrocitos, oligodendrocitos y células de Schwann. En este momento no se conoce el papel de GAP-43 en la macroglia. Se investigó la expresión transitoria de GAP-43 en neurogliocitos generada a partir de las células germinales que responden a EGF derivadas del cuerpo estriado murino embriónico y adulto. Se indujo la diferenciación de los neurogliocitos (astrocitos y oligodendrocitos) plaqueando las células precursoras en un medio que contenía FBS al 1% sin EGF. Entonces se sondearon las células con anticuerpos específicos de GAP-43, nestina, GFAP, O4, y GalC. Para identificar las células que expresan GAP-43, se juntaron los anticuerpos en diversas combinaciones usando métodos de inmunofluorescencia de marcaje doble.
Durante los dos primeros días después del plaqueo, hubo un nivel de expresión de GAP-43 de bajo a moderado en casi todas las células (planas, bipolares y estrelladas), pero a los 3-4 días después del plaqueo, el nivel de expresión de GAP-43 se restringió a las células bipolares y estrelladas. A los 4 días la mayor parte de las células que expresaban GAP-43 se marcaban también con los marcadores de oligodendrocitos O4 y GalC, aunque GFAP y GAP-43 se coexpresaban en varias células. Una semana después del plaqueo, sin embargo, esencialmente todos los astrocitos que expresaban GFAP ya no expresaban GAP-43 mientras que la mayoría de las células que expresaban O4 y GalC seguían expresando GAP-43. A los 7-10 días, estos oligodendrocitos comenzaron a expresar MBP y a perder la expresión de GAP-43. Las células germinales que respondían a EGF pueden representar un sistema de modelo útil para el estudio del papel de GAP-43 en el desarrollo de neurogliocitos y neuronas.
(El ejemplo 5 no está dentro del ámbito de la presente memoria según se reivindica a continuación).

Claims (5)

1. Un método para preparar células diferenciadas a partir de células madre neurales de mamífero consistente en las siguientes etapas:
(a)
hacer proliferar al menos una célula madre neural de mamífero aislada del tejido de un donante, con la condición de que el tejido no derive de un embrión humano, en suspensión en un medio de cultivo libre de suero que contiene factor de crecimiento epidérmico como mitógeno que hace proliferar a dichas, al menos una, célula madre de las cuales al menos una célula madre neural responde al EGF y es capaz de producir progenie capaz de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, y
(b)
diferenciar las células precursoras neurales y eliminar el mitógeno y cultivar dichas células precursoras neurales en un medio de cultivo inductor de la diferenciación libre de EGF para producir células diferenciadas, cuyo medio contiene un substrato sobre el que se pueden adherir las células precursoras neurales, siendo preparado dicho medio con un factor de crecimiento exógeno seleccionado entre el grupo consistente en CNTF, bFGF, BDNF y ácido retinoico.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato se selecciona del grupo que consiste en poli-L-ornitina, colágeno, fibronectina, laminina, y matrigel.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células diferenciadas son neuronas.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células diferenciadas son oligodendrocitos maduros.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células diferenciadas son astrocitos.
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