HU219056B - 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény - Google Patents

Abstract

A találmány vakcinakészítményre vonatkozik, amely egy antigén mellett3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A-t (MPL-t) és megfelelőhordozóanyagot tartalmaz, és amelyben az MPL részecskemérete nemhaladja meg a 120 nm-t. A találmány szerinti vakcinakészítményekimmunológiai tulajdonságai jobbak, mint a megfelelő, nagyrészecskeméretű MPL-t tartalmazó készítményeké. ŕ

Description

A találmány új vakcinakészítményekre, előállításukra szolgáló eljárásra és gyógyászati alkalmazásukra vonatkozik.

A 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A-t (vagy 3dez-O-acilezett monofoszforil-lipid A-t) korábban 3DMPL-nek vagy d3-MPL-nek nevezték annak jelölésére, hogy a glükóz-amin redukálóvégének 3-as helyzete dez-O-acilezve van. Előállítását a GB 2 220 211 A számú szabadalmi leírásban ismertetik. Kémiailag ez 4, 5 vagy 6 acilezett lánccal rendelkező 3-dezacilezett monofoszforil-lipid A elegy. Ebben a leírásban 3D-MPL (vagy d3-MPL) rövidítés helyett MPL rövidítést alkalmaznak, mivel „MPL” a Ribi Immunochem. (Montana) védjegyezett terméke, amelyet a Ribi használ saját 3-Odezacilezett monofoszforil-lipid A termékének félreérthetetlen megjelölésére.

A GB 2 220 211 A számú szabadalmi leírásban említik, hogy a korábban alkalmazott enterobakteriális lipopoliszacharidok (LPS) endotoxicitása csökkent, míg az immunogén tulajdonságok megmaradtak. Azonban a GB 2 220 211 számú szabadalmi leírásban ezeket a megfigyeléseket pusztán a bakteriális (Gram-negatív) rendszerekkel kapcsolatban említik. Nem tesznek említést az MPL részecskeméretéről. Az ismert 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A részecskéinek mérete ténylegesen 500 nm-nél nagyobb.

A WO 92/16231 számon közrebocsátott szabadalmi leírásban vakcinakészítményt ismertetnek, amely Herpes Simplex vírus gD glikoproteint vagy annak immunológiai fragmentumát tartalmazza 3-dezacilezett monofoszforil-lipid A-val összekapcsolva. Itt sem tesznek említést a 3-dezacilezett monofoszforil-lipid A részecskeméretéről.

A WO 92/06113 számon közzétett szabadalmi leírásban vakcinakészítményt ismertetnek, amely HIVgpl60-at vagy annak származékát, például gpl20-at tartalmaz 3-dezacilezett monofoszforil-lipid A-val összekapcsolva. Itt sem tesznek említést az MPL részecskeméretéről.

A találmány vakcinakészítményre vonatkozik, amely 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A-val (továbbiakban MPL-nek rövidítve) összekapcsolva egy antigént és megfelelő hordozót tartalmaz, és amelyben az MPL részecskemérete kicsi, előállításakor általában nem haladja meg a 120 nm-t.

A fenti készítmény monovalens vagy polivalens vakcinák széles körében alkalmazott.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti vakcinakészítmények különösen előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek. A fenti készítmények közelebbről erősen immunogén tulajdonságúak. Ezenkívül az adjuváns készítmény sterilitása is biztosítható, mivel a termék sterilre szűrhető. A kisméretű MPL további előnye az alumínium-hidroxiddal történő formálásból adódik, mivel az MPL az alumínium-hidroxiddal és az antigénnel kölcsönhatásba lépve egyetlen entitást képez.

A találmány kiviteli alakjában az antigén egy virális antigén, például egy hepatitisfertőzés (Hepatitis A, B, C, D vagy E) elleni antigén, vagy egy herpesz (HSV-1 vagy HSV-2) fertőzés elleni antigén. A modem hepatitisvakcinák áttekintése megtalálható a Láncét 1990. május 12-i számában az 1142 ff oldalon (Prof. A. L. W. F. Eddleston) számos kulcsreferenciával együtt [lásd még „Viral Hepatitis and Liver Disease” (szerkesztette Vyas, Β. N., Dienstag, J. L. és Hoofhagle, J. H., Grune and Stratton, Inc. (1984) és „Viral Hepatitis and Liver Disease” (Proceedings of the 1990 International Symposium, szerkesztő F. B. Honinger, S. M. Lemon és H. Margolis; kiadó: Williams and Wilkins)]. A HSV-l-re és HSV-2-re vonatkozó irodalmi hivatkozások a WO 92/16231 számon publikált szabadalmi leírásban találhatók.

A Hepatitis A vírus (HAV) által okozott fertőzés súlyos problémát jelent, de a tömeges immunizálásra alkalmas vakcinák hozzáférhetők, ilyen például a Havrix tennék (SmithKline Beecham Biologicals), amely HAV HM-175 törzsből kapott, elölt, gyengített vakcina [lásd „Inactivated Candidate Vaccines fór Hepatitis A”, F. E. Andre, A. Hepbum és E. D’Hondt, Prog. Med. Virol, 37, 72-95 (1990), valamint a SmithKline Beecham Biologicals által publikált„Havrix” termékismertetőt (1991)].

Flehmig és munkatársai (loc. cit., 56-71. oldal) tekintették át a Hepatitis A klinikai vonatkozásait, virológiáját, immunológiáját és epidemiológiáját, és tárgyalták a közönséges vírusfertőzés elleni vakcinák fejlesztésének irányait.

A leírásban HAV-antigén alatt minden olyan antigént értünk, amely képes a HAV elleni semlegesítő antitesteket stimulálni emberben. A HAV-antigén élő, gyengített vírusrészecskéket vagy inaktivált, gyengített vírusrészecskéket tartalmazhat, vagy például HAV-kapszid vagy HAV-vírusprotein lehet, amelyet célszerűen rekombináns DNS-módszerrel állíthatunk elő.

A Hepatitis B vírus (HBV) általi fertőzések súlyos problémát jelentenek, de a tömeges immunizálásra alkalmazható vakcinák már hozzáférhetők, lásd például az Engerix-B terméket (SmithKline Beecham plc), amelyet géntechnológiai módszerekkel állítanak elő.

A Hepatitis B felületi antigén (HBsAg) előállítása jól dokumentált. [Lásd például Harford és munkatársai, Develop. Bioi. Standard, 54, 125 (1983); Gregg és munkatársai, Biotechnology, 5, 479 (1987); EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108, és az ezekben hivatkozott irodalmak.]

A leírásban Hepatitis B felületi antigén vagy HBsAg alatt bármely HBsAg antigént vagy antigénfragmentumot értünk, amely a HBV felületi antigén tulajdonságaival rendelkezik. Magától értetődően a HBsAg S antigén 226 aminosavból álló szekvenciája mellett [Tiollais és munkatársai, Nautre, 317, 489 (1985) és a hivatkozott irodalmak] a találmány értelmében a HBsAg kívánt esetben tartalmazhatja a pre-S szekvencia egészét vagy egy részét, amint azt a fenti irodalmi hivatkozásokban és az EP-A-0 278 940 számú szabadalmi leírásban ismertetik. Közelebbről a HBsAg tartalmazhat egy polipeptidet, amely a HBsAg L-proteinjének, 12-52 maradékaiból, majd 133-145 maradékaiból, majd 174-400 maradékaiból álló aminosavszek2

HU 219 056 Β venciát tartalmazza az ad szerotípusú Hepatitis B vírus nyitott leolvasási keretéhez viszonyítva (ezt a polipeptidet L*-nak nevezik; lásd például az EP 0 414 374 számú szabadalmi leírást). A találmány értelmében a HBsAg tartalmazhatja a pre-Sl-pre-S2-S polipeptidet is, amelyet az EP 0 198 474 számú szabadalmi leírásban (Endotronics) ismertetnek, vagy annak analógjait, amelyeket az EP 0 304 578 számú szabadalmi leírásban (Mc Cormick és Jones) ismertetnek. A találmány értelmében a HBsAg alatt értjük a mutánsokat is, például a WO 91/14703 vagy EP 0 511 855 Al számon publikált szabadalmi leírásban ismertetett „escape mutáns”-!, különösen olyan HBsAg-t, amely 145-ös helyzetben glicin helyett arginin aminosavszubsztitúciót tartalmaz.

A HBsAg szokásos módon szemcsés formában van. Ezek a részecskék vagy szemcsék tartalmazhatnak például csak S-proteint, vagy összetett részecskék lehetnek, például (L*, S), ahol L* jelentése a fent megadott, és S a HBsAg S-proteinjét jelenti. A fenti részecske előnyösen abban a formában van, amelyben azt az élesztő expresszálja.

A Herpes simplex vírus D glikoproteinje a virális burkon lokalizálódik, és a fertőzött sejtek citoplazmájában is megtalálható [Eisenberg R. J. és munkatársai, Virol. 35, 428-435 (1980)]. Ez 393 aminosavat tartalmaz, beleértve egy szignálpeptidet is, és móltömege körülbelül 60 kD. Az összes HSV-burokglikoprotein közül ez a legjobban ismertetett (Cohen és munkatársai, J. Virology 60, 157-166). Ismert, hogy in vivő központi szerepet játszik a vírus sejtmembránokhoz való kapcsolódásában. Ezenkívül a D glikoproteinről kimutatták, hogy képes semlegesítő antitestek kiváltására in vivő (Eing és munkatársai, J. Med. Virology 127, 59-65). Azonban a latens HSV2 vírus még mindig reaktiválható, és a betegség kiújulását indukálhatja a páciens szérumában lévő magas semlegesítő antitesttiter ellenére. Ezért nyilvánvaló, hogy a semlegesítő antitestet indukáló képesség önmagában nem elegendő a betegség megfelelő kézben tartására.

A találmány szerinti vakcinakészítményekben előnyösen az érett, rekombináns, csonkolt D glikoproteint (rgD2t-t) vagy annak ekvivalensét alkalmazzuk, amelyeket emlőssejtek választanak ki. Ekvivalens proteinek közé tartozik a HSV-1-ből származó gD glikoprotein.

Egy előnyös kiviteli alakban az rgD2t egy HSV-2 D glikoprotein, amely 308 aminosavból áll, és a csonka protein C terminális végén lévő aszparaginon és glutaminon kívül tartalmazza a természetben előforduló glikoprotein 1-306 aminosavjait. A proteinnek ez a formája tartalmazza a szignálpeptidet, amelynek lehasításával az érett, 283 aminosavból álló protein keletkezik. Ilyen protein előállítása aranyhörcsög-ováriumsejtekben ismert [EP-B-139417 számú szabadalmi leírás (Genentech); Science 222, 524; és Biotechnology 527. oldal, 1984. június]. Az ilyen vakcina, ha a találmány értelmében kisméretű MPL-lel formáljuk, előnyösebb gyógyászati potenciállal rendelkezik, mint az ismert rgD2t készítmények.

Noha kísérleti célokra és kereskedelmi forgalomban hozzáférhető bizonyos vakcinákkal kiváló eredmények érhetők el, elismert tény, hogy az optimális vakcinának nemcsak semlegesítő antitesteket kell stimulálnia, hanem a lehető leghatékonyabb módon stimulálnia kell a T-sejtek által közvetített celluláris immunitást is.

A találmány szerinti vakcinakészítmények különös előnye, hogy nagyon hatékonyan indukálják a védőimmunitást, még igen alacsony antigéndózisokkal is.

A találmány szerinti vakcinakészítmények kiváló védelmet nyújtanak elsődleges és kiújuló fertőzés ellen, és előnyösen stimulálják mind a specifikus Immorális (semlegesítő antitestek), mind az effektorsejtek által közvetített (DTH) immunválaszokat.

A kis részecskeméretű, 120 nm-nél kisebb 3-dezacilezett monofoszforil-lipid A előállítására a GB 2 220 211 számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárás alkalmazható, így kapjuk az ismert 3D-MPL-t (vagy a kereskedelmi forgalomban lévő, nagyobb részecskeméretű MPL-t megvásárolhatjuk a Ribi Immunochemtől), és a terméket ezután addig szonikálhatjuk, amíg a szuszpenzió kitisztul. A részecskeméretet dinamikus fényszórással határozhatjuk meg az alább ismertetett módon. Annak érdekében, hogy az MPL méretét 100 nm tartományban tartsuk, alumínium-hidroxíddal történő formálás után hozzáadhatjuk az antigént és a puffért, Tween 80-at vagy szorbitot. Ilyen körülmények között megállapítottuk, hogy az MPL nem aggregálódik foszfátpuffer jelenlétében, ami ezek nélkül a formálás során megtörténhet. Ily módon eljárva a végső készítmény még jobban definiált és jellem-? zett. Azt is megállapítottuk, hogy ilyen körülmények között az MPL még mindig kölcsönhatásba lép alumíniumhidroxiddal és az antigénnel egyetlen entitást képezve.

A találmány egyik tárgyát képezi az MPL tiszta oldata. Ez az oldat sterilizálható egy szűrőn való átvezetéssel.

A részecskék mérete előnyösen 60 és 120 nm közötti tartományba esik.

Még előnyösebben a részecskeméret 100 nm-nél kisebb.

A fent definiált MPL rendszerint 10-200 pg, előnyösen 25-50 pg mennyiségben van jelen dózisonként, míg az antigén rendszerint 2-50 pg/dózis vagy annál nagyobb mennyiségben van jelen. A találmány szerinti vakcinakészítmény tartalmazhat továbbá immunstimulánsokat, egy előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti vakcinák QS21-et (amelyet QA21-ként is említenek) tartalmaznak. Ez egy Quillaja Saponaria Molina nevű fa kérgéből származó szaponinextraktum HPLC-frakciója, és az előállítására szolgáló eljárás az US 5 057 540 számú szabadalmi leírásból ismert.

A hordozóanyag adott esetben egy „olaj a vízben” emulzió, egy lipid vivőanyag vagy alumínium-hidroxid (alumínium-hidroxid-só) lehet.

A nem toxikus „olaj a vízben” emulziók előnyösen egy nem toxikus olajat, például szkvalént és egy emulgeálószert, például Tween 80-at tartalmaznak vizes hordozóanyagban. A vizes hordozó például foszfáttal pufferolt sóoldat lehet.

A vakcinakészítmények előnyösen egy antigént vagy antigénkompozíciót tartalmaznak, amely képes

HU 219 056 Β humán vagy állati patogének elleni immunválasz kiváltására, amely antigén vagy antigénkompozíció származhat HÍV-1-ből (például gpl20 vagy gpl60; lásd WO 92/06113 számon publikált szabadalmi leírást és az abban hivatkozott irodalmakat), herpeszvírusból (például gD vagy annak származékai, vagy azonnali korai protein, például ICP27 a HSV-1-bői vagy HSV-2ből) humán citomegalovírusból (gB vagy annak származékai); vagy Varicella Zoster vírusból (gpl, II vagy III); vagy hepatitiszvírusból, például Hepatitis B vírusból vagy egyéb virális patogénből, például légzési szincitiális vírusból, humán papillomavírusból vagy influenzavírusból; vagy bakteriális patogének, például Salmonella, Neisseria, Borrelia (például OspA vagy OspB, vagy ezek származékai), vagy Chlamydia vagy Bordetella, például P69, PT és FHA elleni, vagy paraziták, például plazmódium vagy toxoplazma elleni antigén lehet. A találmány szerinti vakcinakészítmények tumorantigént is tartalmazhatnak, és rákellenes vakcinaként is alkalmazhatók.

A találmány egyik kiviteli alakjában HAV-antigén (mint például a Havrixban) van MPL-lel és alumínium-hidroxiddal összekeverve az alább ismertetett módon.

A találmány egy másik kiviteli alakjában HB vírus felületi antigén (HBsAg) (mint például az Engerix-Bben) van MPL-lel és alumínium-hidroxiddal elegyítve, az alább ismertetett módon.

A találmány egy újabb speciális kiviteli alakjában (L*, S) részecskékként HBsAg antigén van MPL-lel és alumínium-hidroxiddal összekeverve az alább ismertetett módon. Hepatitis A plusz Hepatitis B kombinációs vakcinákat is előállíthatunk a találmány értelmében.

A találmány szerinti készítmény egy további kiviteli alakja érett, csonkolt D glikoproteint (rgD2t-t) vagy egy ekvivalens proteint tartalmaz az alább ismertetett módon. A találmány szerinti készítmény egy további kiviteli alakja Borrelia burgdorferiből származó OSpA antigént vagy annak származékát tartalmazza. Például a ZS7 vagy B31 törzsekből származó antigének, különösen OSpA antigének alkalmazhatók. A találmány szerinti készítmény újabb kiviteli alakja egy influenzaantigént tartalmaz. Ezzel javított influenzavakcina nyerhető, különösen ha egy „split” vírust alkalmazunk.

A készítmény herpeszes könnyű részecskékkel, például a PCT/GB92/00824 és a PCT/GB92/00179 számú szabadalmi leírásokban ismertetett részecskékkel való felhasználásra is megfelel.

A találmány szerinti vakcinakészítmény előnyösen egyéb antigéneket is tartalmaz, ezáltal egy vagy több bakteriális, virális vagy gombás fertőzés kezelésére vagy megelőzésére alkalmazható.

így például a találmány szerinti hepatitisvakcina-készítmények előnyösen legalább egy olyan komponenst is tartalmaznak, amelyet nem hepatitisantigének közül választunk, és amely ismerten diftéria, tetanusz, pertussis, Hamophilus influenzáé b (Hib) és/vagy polio ellen nyújt védelmet.

A találmány szerinti vakcina előnyösen HBsAg-t tartalmaz a fent ismertetett módon.

A találmány szerinti kombinációs vakcinák közé tartozik közelebbről egy DTP (diftéria-tetanusz-pertussis)-Hepatitis B kombinációs vakcinakészítmény, egy Hib-Hepatitis B vakcinakészítmény, egy DTP-HibHepatitis B vakcinakészítmény és egy IPV (inaktivált poliovakcina)-DTP-Hib-Hepatitis B vakcinakészítmény.

A fenti kombinációk előnyösen egy olyan komponenst tartalmaznak, amely Hepatitis A elleni védelmet biztosít, különösen HM-175 törzsből származó elölt, gyengített törzset, amely például a Havrixban található.

Az ilyen vakcinákban alkalmazható megfelelő komponensek már kereskedelmi forgalomban kaphatók, és a részleteket a World Health Organisationtől beszerezhetjük. így például az IPV-komponens a Salk-féle inaktivált poliovakcina lehet. A pertussisvakcina tartalmazhat teljes sejtet vagy nem celluláris terméket.

A találmány szerinti hepatitis- vagy kombinációs vakcina előnyösen egy gyermekgyógyászati vakcina.

A találmány értelmében a találmány szerinti vakcinakészítmények gyógyászati célokra alkalmazhatók, különösen virális vagy bakteriális fertőzések kezelésére vagy megelőzésére, és a rák immunterápiás kezelésére. Egy előnyös vonatkozásban a találmány szerinti vakcina egy gyógyászati vakcina, amely már meglévő fertőzések kezelésére alkalmazható, például emberek Hepatitis B vagy herpeszfertőzései esetén.

A vakcina előállítása általánosságban ismert [New Trends and Developments in Vaccines, szerkesztők: Voller és munkatársai, University Park Press, Baltimore, Maryland U. S. A. (1978)]. A liposzómákba való bezárás például az US 4 235 877 számú szabadalmi leírásból (Fullerton) ismert. A proteinek makromolekulákkal való konjugálását például Likhite (US 4 372 945) és Armor és munkatársai (US 4 474 757) ismertetik.

Az egyes vakcinadózisokban lévő antigén mennyiségét úgy választjuk meg, hogy az jelentős, nem kívánatos mellékhatások nélkül váltsa ki a vakcináit egyedekben az immunprotektív választ. A fenti mennyiség az alkalmazott specifikus immunogénektől függően változik. Általában minden egyes dózis összesen 1-1000 pg, előnyösen 2-100 pg, még előnyösebben 4-40 pg immunogént tartalmaz. A kérdéses vakcina optimális mennyiségét szokásos vizsgálatokkal határozhatjuk meg, amelynek során a vakcináit egyedekben megfigyeljük az antitesttitereket és egyéb válaszokat. A kezdeti vakcinálást követően a vakcináit egyedek körülbelül 4 hét elteltével megerősítést kaphatnak.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás fertőzések megelőzésére és kezelésére alkalmas vakcina előállítására oly módon, hogy az antigént egy hordozóval és MPL-lel keveijük össze, ahol az MPL részecskemérete legfeljebb 120 nm, rendszerint 60-120 nm, előnyösen körülbelül 100 nm vagy annál kisebb.

A találmányt közelebbről a következő példákkal kívánjuk szemléltetni.

HU 219 056 Β

1. példa

60—120 nm részecskeméretű MPL előállítása

Liofilizált 3-dez-O-acilezett monofoszforil-lipid A-t (MPL-t) tartalmazó fiolákba (Ribi Immunochem, Montana) fecskendő segítségével injekció készítésére alkalmas vizet injektálunk, amellyel 1-2 mg/ml koncentrációt állítunk be. Vortex-keverő alkalmazásával végzett keveréssel előszuszpenziót kapunk. A fiolák tartalmát ezután 25 ml-es, kerek fenekű Corex-csövekbe visszük át (10 ml szuszpenzió/cső), és a szuszpenziót vízfürdős szonikátor segítségével ultrahanggal kezeljük. Amikor a szuszpenzió kitisztul, a részecskék méretét dinamikus fényszórással (Maivem Zetasizer 3) határozzuk meg. A kezelést addig folytatjuk, amíg az MPL-részecskék mérete 60-120 nm tartományon belüli lesz.

A szuszpenziókat bizonyos esetekben 4 °C-on jelentős aggregálódás nélkül 5 hónapon keresztül is tárolhatjuk. Izotóniás nátrium-klorid-oldat (0,15 mol/1) vagy 10 mmol/1 foszfátot tartalmazó izotóniás nátrium-klorid gyors aggregálódást vált ki (méret >3-5 pm).

2. példa

100 nm alatti részecskeméretű, steril, oldható MPL előállítása üzemi méretekben A Ribi Immunochemtől beszerezzük a liofilizált-3dez-O-acilezett monofoszforil-lipid A-t, és injekciókészítésre alkalmas vízben (WFI) szuszpendáljuk. A szuszpenziót folyamatosan átszivattyúztuk egy ultrahangos átfolyókamrán. Az átfolyókamra rendszerint üvegből vagy rozsdamentes acélból készül, PTFE-lezárással a GMP-előírásoknak megfelelően. Az ultrahangot egy ultrahang-generátor és egy titán hangkürt (szonotrod) alkalmazásával geijesztjük (Undatim Ultrasonics, LouvainLa-Neuve, Belgium). A hurokba egy hőkicserélőt építünk be a tennék hőbomlásának kiküszöbölése érdekében. Az MPL hőmérsékletét az átfolyókamra bemenete és kimenete között +4 °C és 30 °C között tartjuk, és a bemenet és a kimenet közötti hőmérséklet-különbség 20 °C-nál kisebb. Magától értetődően a hő elvezetődik, amikor az anyag a készüléken keresztülhalad.

Az alkalmazott készüléket sematikusan az 1. ábrán mutatjuk be.

2.1. Ultrahangos kezelés

Az MPL-port (50-500 mg) WFI-ben szuszpendáljuk 1-2 mg/ml koncentrációban.

Az MPL-szuszpenziót (keverés közben) folyamatosan átszivattyúzzuk a szonikálóhurkon (lásd az 1. ábrát) 50-100 ml/perc átfolyási sebességgel, ily módon biztosítjuk a rendszer egyensúlyi hőmérsékletét, amely +4 °C és +15 °C közötti.

A szonikálókürt saját frekvenciaspektrumát a rendszer körülményei között (erő, átfolyókamra, átfolyási sebesség, hőmérséklet) a készülékre a gyártó előírásainak megfelelően állítjuk be. Az előzetesen megállapított határok 19 000 Hz és 21 000 Hz között vannak a 20 000 Hz-es transzduktorra.

A generátor biztosítja a szonikálás optimális hatékonyságának szabályozását (nagyobb energiaátadás kevesebb hővel) egy adott időintervallumban.

Az eljárás során a hőmérsékletet 30 °C alatt tartjuk, hogy elkerüljük az MPL bomlását.

Az eljárás akkor fejeződik be, amikor a részecskeméret 100 nm alá csökken, és az oldat rátekintésre tiszta. A szonikálási eljárás során mintákat veszünk a részecskeméret meghatározása céljából fotokorrelációs spektroszkópiával (dinamikus fényszórással), Maivem Zetasizer 3 alkalmazásával, ugyanúgy, mint az 1. példában. A folyadék tartózkodási idejét az ultrahangos átfolyókamrában 2,5 és 3,5 perc közötti értéknek találtuk (lásd 1. táblázatot), 20 ml kapacitású átfolyókamrát alkalmazva 50 ml/perc recirkulációs átfolyási sebesség mellett. Ilyen átfolyási sebességgel az átlagos tartózkodási idő ciklusonként 25 mp, és rendszerint 10 ciklusnál kevesebb kell ahhoz, hogy a kívánt kis részecskeméretű MPL-t előállítsuk.

2.2. Sterilizálási eljárás

A kapott szolubilizált MPL-t 0,22 pm-es hidrofil PVDF-membránon szűréssel sterilizáljuk. A mért nyomás rendszerint 1 TO⁵ Pa alatti. Négyzetcentiméterenként legalább 25 mg szolubilizált MPL könnyen feldolgozható 85% feletti visszanyeréssel.

2.3. Tárolás/stabilitás

A steril, szolubilizált MPL-t +2-8 °C közötti hőmérsékleten tároljuk. A stabilitási adatok (Maivem) nem mutatnak jelentős különbséget a részecskeméretben 6 hónapos tárolás után sem (lásd a 2. táblázatot).

3. példa

Hepatitis B vakcinakészítmény

A 100 nm-nél kisebb részecskeméretű MPL-t az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő. Az alumínium-hidroxidot (Alhydrogel) a Superfostól szerezzük be.

Az MPL-t injekció készítésére alkalmas vízben 0,2-1 mg/ml koncentrációban újraszuszpendáljuk vízfürdőn végzett szonikálással, amíg a részecskeméret eléri a 80-500 nm-t fotokorrelációs fényszórással meghatározva.

1-20 pg HBsAg-t (S-antigén, mint az Engerix Bben, foszfátpufferrel készült, 1 mg/ml koncentrációjú oldatban) szobahőmérsékleten, 1 órán keresztül, keverés közben 30-100 pg alumínium-hidroxidon (10,38 mg/ml Al³⁺-koncentrációjú oldat) adszorbeálunk. Az oldathoz ezután 30-50 pg MPL-t adunk (1 mg/ml-es oldatban). A térfogatot és az ozmolaritást 600 pl-re állítjuk be injekciókészítésre alkalmas vízzel és 5-szörös koncentrációjú foszfátpufferrel. Az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, és felhasználásig 4 °C-on tartjuk. A tárolás során végbemegy a készítmény érése. Ez 10 injekciós dózist jelent egerekben való tesztelésre.

4. példa

Hepatitis A vakcinakészítmény

A 100 nm-nél kisebb részecskeméretű MPL-t az

1. példában leírtak szerint állítjuk elő. Az alumíniumhidroxidot (Alhydrogel) a Superfostól szerezzük be.

HAV-t (360-22 EU/dózis) előadszorbeálunk 10% alumínium-hidroxid-végkoncentrációnál (0,5 mg/ml). Az oldathoz 12,5—100 pg/dózis MPL-t adunk.

HU 219 056 Β

Az oldathoz hozzáadjuk a fennmaradó aluminiumhidroxidot, és szobahőmérsékleten tartjuk 1 órán keresztül. A térfogatot foszfátpufferrel (10 mmol/1 foszfát, 150 mmol/1 nátrium-klorid) beállítjuk, majd a kész készítményt felhasználásig 4 °C-on tároljuk.

5. példa

Rekombináns Herpes Simplex D alegység glikoproteinvakcina-adjuváns hatékonyságának összehasonlítása

5.1. Megvizsgáltuk különböző A1(OH)₃ MPL-készítmények 2-es típusú Herpes simplex vírusból (HSV2) származó, csonkolt D glikoprotein (rgD2t) védőimmunitását javító képességét profilaktikus és terápiás tengerimalac-modellben. Immunogén vizsgálatokat is végeztünk főemlősökön. A fenti kísérletek célja az volt, hogy tanulmányozzuk a 3-dez-O-acilezett-monofoszforil lipid A (MPL)-részecskék méretének hatását az rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények immunogén és védőhatékonyságára rágcsálókban és főemlősökben. A kisméretű MPL három különböző A1(OH)₃/MPL készítményét vizsgáltuk:

A1(OH)₃ MPL 100 nm (amelyet fent ismertettünk), A1(OH)₃ MPL 100 nm szorbittal,

A1(OH)₃ MPL 100 nm Tweennel.

5.2. Antigén-adjuváns készítmények és immunizálási menetrendek

5.2.1. Antigénkészítmények

Az alumínium-hidroxidot [A1(OH)₃] a Superfostól szerezzük be (Alhydrogel Superfos, Dánia). Az MPL-t a Ribi Immunochem Research Inc.-től kaptuk.

5.2.1.1. rgD2t [AlfOHjfi/MPL TEA

Az MPL-t vízfürdőn szonikálással szuszpendáljuk, így 200-600 nm-es részecskeméretet kaptunk. A készítményt a WO 92/16231 számú szabadalmi leírásban ismertetett módon állítjuk elő, és felhasználásig 4 °C-on tároljuk.

Egy dózis 5 pg rgD2t-t, 0,5 mg Al(OH)₃-ot és 50 pg MPL-t tartalmazott.

5.2.1.2. rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm

A 100 nm-nél kisebb részecskeméretű MPL-t az

1. példában leírtak szerint állítjuk elő. Az rgD2t-t alumínium-hidroxidon adszorbeáljuk, és szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az oldathoz hozzáadjuk az MPL-t a kívánt koncentrációban, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül tovább inkubáljuk.

A készítményt PBS-sel egészítjük ki 10 mmol/1 PO₄, 150 mmol/1 NaCl végkoncentrációra. A végső készítményt szobahőmérsékleten 30 percen keresztül tovább inkubáltuk, és 4 °C-on tároljuk alkalmazásig.

Egy dózis 5 pg rgD2t-t, 0,5 mg Al(OH)₃-ot és 50 pg MPL-t tartalmaz.

5.2.1.3. rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm (szorbit)

Az MPL-t az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő. Az rgD2t-t alumínium-hidroxidon adszorbeáljuk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk. Ezután 50%-os szorbitoldatot adunk hozzá, amellyel 5% végkoncentrációt állítunk be. Ezután 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-oldatot adunk hozzá, amellyel beállítjuk a végtérfogatot, és az oldatot szobahőmérsékleten, keverés közben 1 órán keresztül inkubáljuk. A készítményt 4 °C-on tároljuk alkalmazásig.

Egy dózis 5 pg rgD2t-t, 0,5 mg Al(OH)₃-ot és 50 pg MPL-t tartalmaz.

5.2.1.4. rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm (Tween)

Az MPL-t az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő. Az oldathoz Tween 80-at adunk 0,01% végkoncentrációban az MPL részecskeméretének 100 nm-en tartásához. A készítményt ezután az 5.2.1.3. pontban leírtak szerint állítjuk elő.

Egy dózis 5 pg rgD2t-t, 0,5 mg Al(OH)₃-ot és 50 pg MPL-t tartalmaz.

5.3. Profilaktikus vizsgálat tengerimalacon

Ezekben a kísérletekben a tengerimalacok csoportjait a 0. napon és a 28. napon 5 pg rgD2t-vel vakcináltuk két különböző alumínium-hidroxid MPL készítmény alkalmazásával. Az immunizálást szubkután módon 0,5 ml dózisban adtuk. A második vakcinálás után egy hónappal a tengerimalacokat intravaginálisan 10⁵ telepképző egység HSV2 MS törzzsel provokáltuk. A provokálás utáni 4-39. napon az állatokat naponta megvizsgáltuk a HSV2 fertőzés elsődleges kialakulása vagy kiújulása szempontjából.

5.3.1. Terápiás vizsgálat tengerimalacon

Ezekben a kísérletekben a tengerimalacokat a 0. napon 10⁵ telepképző egység HSV2 MS törzzsel fertőztük. Az elsődleges fertőzésből való felépülés után az állatokat naponta megvizsgáltuk a herpeszfertőzés kiújulása szempontjából (13-21. nap). A tengerimalacokat a 21. napon és a 42. napon rgD2t/Al(OH)₃/MPL vakcinával vakcináltuk. A vakcinákat szubkután módon adagoltuk 0,5 ml dózisban. Az állatokat naponta megvizsgáltuk a herpeszes laeziók szempontjából a ±60. vagy ±84. napig.

5.3.2. Immunogén vizsgálat főemlősökön

A szorbitban lévő MPL-lel kombinált rgD2t/Al(OH)₃ immunogén tulajdonságát afrikai zöldmajmokon értékeltük ki. A majmok csoportjait a 0. és 28. napon vakcináltuk 5 pg MPL-t tartalmazó szorbittal kombinált 20 pg rgD2t-vel és 0,5 mg Al(OH)₃-dal. Kiértékeltük a specifikus humorális (ELISA és neutralizáló titerek) és effektorsejtek által közvetített (késleltetett típusú hiperszenzitivitásválasz: DTH) immunválaszokat. Minden egyes majomcsoport 5 állatból állt. A készítményeket intramuszkulárisan adtuk 1 ml dózisban. A készítmények előállítását a fentiek szerint végeztük. Az állatokból antitestmeghatározás céljából kéthetenként vért vettünk.

A DTH-választ a második vakcinálást követő 14 napon keresztül vizsgáltuk. A bőrteszt leírását az alábbiakban közöljük.

5.4. Kiértékelés

A vizsgálatokat úgy állítottuk össze, hogy kiértékelhessük az rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítményekkel végzett vakcinálással indukált specifikus antitestválaszokat (meghatároztuk az anti-rgD2t ELISA titereket és antiHSV2 semlegesítőtitereket). A fenti gD2 készítmények védőhatékonyságát a profilaktikus és terápiás tengerimalac-modellekből becsültük meg. Immunogén vizsgálatokat is végeztünk majmokon. Kiértékeltük a specifikus humorális és DTH-válaszokat.

HU 219 056 Β

5.4.1. ELISA és semlegesítötiterek

Az anti-rgD2t antitesttitereket és anti-HSV2 semlegesítőaktivitást a WO 92/16231 számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárásokkal határoztuk meg.

5.4.2. Késleltetett típusú hiperszenzitivitás (DTH)

Az rgD2t készítményeket megvizsgáltuk majmokban T-sejt-specifikus immunválaszt indukáló képességük szempontjából is, amelyet késleltetett típusú hiperszenzitivitás (DTH) válasz indukálásaként mértünk.

Afrikai zöldmajmokat a 0. és 28. napon vakcináltunk 20 pg gD2 vakcinakészítménnyel, amelyet intramuszkulárisan adtunk. A majmokon a második vakcinálást követő 14. napon bőrtesztet végeztünk úgy, hogy a hasbőr alá 15 vagy 5 pg rgD2t-t injektáltunk sóoldatban. A bőrtesztet kontrollként sóoldattal is elvégeztük. Az injekció helyét 24 és 48 órával később megvizsgáltuk bőrpír és megkeményedés szempontjából, és meghatároztuk a helyi reakciók méretét.

5.4.3. Tengerimalac intravaginális fertőzés modell

A genitális HSV-fertőzés tengerimalac-modelljét L. Stanberry és munkatársai [J. of Infectious Diseases 146, 397-403 (1982); Intervirology 24, 226-231 (1985)] módszere szerint végeztük. Röviden a profilaktikus vizsgálatokban a tengerimalacokat intravaginálisan 10⁵ telepképző egység HSV2 MS törzzsel fertőztük az utolsó vakcinálás után 1 hónappal. A primer betegség klinikai lefolyását a genitális bőrsérülések előfordulása és súlyossága napi megfigyelésével mértük a fertőzést követő 4-14. napon keresztül. Az állatokat ezután naponta megvizsgáltuk a 13-39. napon a kiújult herpeszes sérülések jelenléte szempontjából. Terápiás vizsgálatokban a tengerimalacokat a 0. napon 10⁵ telepképző egység HSV2 MS törzzsel fertőztük. A primer fertőzésből való felépülés után az állatokat naponta kiértékeltük a 13-21. napon a kiújult herpeszes sérülések szempontjából, majd primer és kiújult pontszámaik alapján randomizáltuk (amellyel minden egyes csoportban biztosítottuk az enyhébbtől súlyosig fertőzött állatok egyenlő eloszlását), az egyes csoportokat vagy nem kezeltük, vagy vakcináltuk. A vakcinát a fertőzés utáni

20. és 41. napon adtuk. A kiújult betegség jeleit a fertőzés után±70-ig figyeltük.

A herpeszes sérüléseket mennyiségileg O-tól 32-ig terjedő sérülési pontszámskála alkalmazásával határoztuk meg.

Pontozórendszer

A sérülés típusa	Pontszám
Semmi	0
Vaginális sérülések Vérzés	0,5
Egy vagy két napon keresztül vörösség vérzés nélkül	0,5
Vörösség és vérzés egy napon át	1
Vörösség vérzés nélkül legalább 3 napon keresztül	1

A sérülés típusa	Pontszám
Külső herpeszes hólyagok < 4 kis hólyag	2
> 4 kis hólyag vagy egy nagy hólyag	4
> 4 nagy sérülés	8
Összefolyó nagy sérülések	16
Összefolyó nagy sérülések a teljes külső genitális területen	32

Klinikai értékelések

Primer fertőzés

- Sérülés súlyossága=a napi pontszámok összegével a fertőzés utáni 4-12. napon keresztül. A sérülés súlyosságát számtani közép±SD értékkel fejeztük ki, valamint a középső értékkel (jobban megfelel a nem paraméteres teszthez).

- Primer fertőzés gyakorisága=0, 0,5, 1, 2, 4, 8 vagy 16 (ritkábban 32) maximális sérülési pontszámot mutató állatok százaléka.

Primer fertőzési index=Σί (maximális pontszám i) χ χ (gyakoriság %) i=0,0,5,2,4, 8 vagy 16 esetén.

Kiújuló betegség

- Kiújulási napok száma=a fertőzés utáni 13-39. napon a kiújulás napjainak száma. Egy kiújulást egy sérülés nélküli előz meg és követ, és jellemzője, hogy legalább 2 napon keresztül bőrpír látható, vagy egy napon keresztül hólyagfok). A kiújulási napok számát a számtani középérték ±SD és a középső érték megadásával fejezzük ki.

- Kiújulás súlyossága=fertőzés utáni 13-39. napon a napi pontszámok összege. Az eredményeket a számtani középérték±SD és a középső érték megadásával fejezzük ki.

5.5. Eredmények

A különböző rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények védőhatékonyságát profilaktikus és terápiás kísérletekben tengerimalacokon hasonlítottuk össze. Immunogén vizsgálatokat is végeztünk főemlősökön. A fenti kísérletek célja az volt, hogy összehasonlítsuk a különböző részecskeméretű MPL-lel kombinált rgD2t/Al(OH)₃ készítmények védőhatékonyságát és immunogenicitását.

5.5.1. Profilaktikus vizsgálatok

Két kísérletet végeztünk a különböző rgD2t/Al(OH)₃/ MPL vakcinák hatékonyságának kiértékelésére az elsődleges és kiújult HSV2 betegség elleni védelem szempontjából, ha azokat intravaginális virális fertőzést megelőzően adagoltuk tengerimalacoknak.

1. kísérlet

MPL 100 nm (szorbit) összehasonlítása MPL

TEA-val

200-250 g-os nőstény Hartley-tengerimalacokból álló csoportokat a 0. és 28. napon immunizáltunk kisméretű MPL-részecskékkel (100 nm; MPL szorbitban) vagy nagyobb MPL-részecskékkel (MPL TEA-ban) kombinált 5 pg rgD2t/Al(OH)₃-dal. A kontrollállatokat

HU 219 056 Β ugyanezen protokoll szerint csak adjuvánssal injektáltuk, vagy nem kezeltük. Az állatoktól a második vakcinálást követő 14. és 28. napon vért vettünk antitestmeghatározáshoz ELISA- és semlegesítővizsgálattal. Az állatokat a második vakcinálás utáni 29. napon 10^{2 * * 5} telepképző egység HSV2 MS törzzsel fertőztük intravaginálisan. A fertőzés után a tengerimalacokon naponta kiértékeltük az akut fertőzés klinikai tüneteit (fertőzés utáni 4-12. napon), valamint a kiújuló herpeszes betegség tüneteit (fertőzés utáni 13-39. napon).

a) Humorális immunitás indukálása

Amint a 3. táblázatból látható, magasabb ELISAés semlegesítőtitereket kaptunk, ha kisméretű MPL-részecskéket alkalmaztunk az rgD2t/Al(OH)₃ készítményben.

b) Vakcinálás hatása elsődleges HSV2 fertőzésre (3. táblázat)

A kontrollcsoporttal összehasonlítva - amely fertőzötté vált és akut primer fertőzés alakult ki - mindkét vakcináit csoportban szignifikánsan csökkent a sérülések súlyossága (p<0,00 005). Szignifikánsan kisebb bőrsérülés-gyakoriság volt megfigyelhető az rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm-rel vakcináit csoportban (p<0,06).

c) Vakcinálás hatása a HSV2 betegség kiújulására

Az eredményeket a 4. táblázatban közöljük. A kontrollcsoporttal összehasonlítva mindkét vakcina képes volt befolyásolni a kiújuló herpeszes betegség kifejlődését, amelyet a kiújult esetek számának csökkenésével mértünk [p<0,02 az rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm esetén].

d) Következtetések

Mindkét készítmény szignifikáns védelmet tudott nyújtani elsődleges fertőzés ellen, és csökkentette a kiújult betegséget. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kisméretű MPL-részecskéket tartalmazó rgD2t/Al(OH)₃ készítmények nagyon erős profilaktikus hatékonysággal rendelkeznek.

2. kísérlet

Al(OH)₃IMPL 100 nm hatékonysága

200-250 g-os Hartley-tengerimalacokat a 0. és 28. napon immunizáltunk 5 pg gD2-vel, amelyet A1(OH)₃ MPL 100 nm-rel formáltunk. Az immunizálásokat szubkután adtuk 0,5 ml dózisban. Az A1(OH)₃/MPL készítményben 50 pg MPL dózist alkalmaztunk. A kontrollállatokat ugyanezen protokoll szerint injektáltuk csak adjuvánssal, vagy nem kezeltük. A második vakcinálás utáni 14. és 28. napon az állatoktól vért vettünk az antitestmeghatározáshoz ELISA-val és neutralizációs vizsgálattal. A tengerimalacokat az utolsó immunizálás után 29 nappal 10⁵ telepképző egység HSV2 MS törzzsel fertőztük intravaginálisan.

a) Humorális immunitás indukálása

A 3. táblázatból látható, hogy a vakcináit csoportban jó ELISA- és neutralizálótitereket kaptunk. A kontrollcsoportban nem fejlődött ki kimutatható mennyiségű antitestválasz.

b) Vakcinálás hatása a primer HSV2 fertőzésre (3. táblázat)

A kontrollcsoporttal összehasonlítva - amely fertőződött és kialakult az akut primer fertőzés - a vakcináit csoportban szignifikánsan csökkent a sérülés súlyossága (p<0,000 05) és gyakorisága (p<0,02). Egyetlen vakcináit tengerimalacon sem mutatkozott külső bőrsérülés.

c) Vakcinálás hatása a kiújuló HSV2 betegségre (4. táblázat)

A kontroliokkal összehasonlítva az rgD2t/Al(OH)₃/MPL vakcina meg tudta akadályozni a kiújult herpeszes betegség kifejlődését, amelyet a kiújult esetek súlyosságának szignifikáns csökkenésével (p<0,00 005) és a kiújult esetek gyakoriságának szignifikáns csökkenésével (p<0,01) mértünk.

d) Következtetések

Az rgD2t/Al(OH)₃ kisméretű MPL-részecskékkel kombinálva nagyon hatékonynak mutatkozott az elsődleges és a kiújuló HSV2 fertőzések elleni védelemben tengerimalacokban.

A fenti kísérletekből arra következtethetünk, hogy a kisméretű MPL/A1(OH)₃ készítmények, amelyeket két eltérő módszerrel állítottunk elő, legalább olyan hatékony profilaktikus választ indukálnak, mint a nagyméretű MPL/A1(OH)₃ készítmények. Ezenkívül a kisméretű MPL előnye, hogy alkalmazás előtt könnyen sterilizálható.

5.5.2. Terápiás kísérletek

Ezen kísérletek célja az volt, hogy kimutatottan HSV2 fertőzésben szenvedő tengerimalacokon összehasonlítsuk a különböző rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények terápiás hatékonyságát a kiújuló herpeszes betegség lefolyására.

Tengerimalacokat intravaginálisan fertőztünk a 0. napon 10⁵ telepképző egység HSV2 MS törzzsel. Az állatokon naponta megvizsgáltuk az akut fertőzés klinikai tüneteit (4-12. nap), valamint a kiújuló herpeszes betegség tüneteit (13-20. nap). Az állatokat elsődleges és kiújuló pontszámaik alapján randomizáltan különböző kísérleti csoportokba osztottuk, amellyel biztosítottuk az enyhétől súlyosig terjedő fertőzés egyenlő eloszlását az egyes csoportokban. Azokat a tengerimalacokat, amelyekben nem találtuk a fertőzés klinikai jeleit, a kísérletből kizártuk. A vakcinákat szubkután módon adagoltuk a fertőzés utáni 21. és 42. napon.

Az rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények terápiás hatékonyságát három különböző kísérletben értékeltük ki.

1. kísérlet

Nagyméretű MPL-részecskékkel (MPL TEA-ban) kombinált rgD2t/Al(OH)₃ hatékonysága A kiújuló betegséget mutató tengerimalacokat randomizáltuk úgy, hogy vagy 20 pg rgD2t/Al(OH)₃-ot kaptak nagyméretű MPL-részecskékkel (MPL TEA) kombinálva, vagy csak adjuvánst. A vakcinákat a fertőzés utáni 21. és 42. napon adtuk az állatoknak. A kiújuló betegség lefolyását a 84. napig figyeltük meg.

Amint a 3. táblázat mutatja, az rgD2t/Al(OH)₃/MPL TEA készítmények nem voltak hatásosak a kiújuló betegség kimenetelének mérséklésében.

HU 219 056 Β

2. kísérlet rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm hatékonysága

Tengerimalacok egyik csoportját 20 pg rgD2t/Al(OH)₃-dal vakcináltuk kisméretű MPL-részecskékkel (MPL 100 nm) kombinálva, a másik csoportot nem kezeltük.

A vakcinálásokat a fertőzés utáni 20. és 41. napon adtuk. A kiújuló betegséget a 69. napig figyeltük meg.

Amint azt az 5. táblázat mutatja, az 1. kísérlet adataival ellentétben, ahol nagyméretű MPL-t alkalmaztunk, az rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm-rel végzett vakcinálás esetén a vakcina befolyásolta a megállapított HSV2 betegség kiújulását, és a kontrollcsoporttal összehasonlítva szignifikánsan csökkentette a kiújulás súlyosságát (-39%, p<0,05) és a kiújulás napjainak számát (-28%, p<0,l).

3. kísérlet

Kisméretű MPL-részecskék és Al(0H)₃ kombinációk hatékonyságának összehasonlítása Ebben a kísérletben egy harmadik stratégiát alkalmaztunk a kisméretű MPL előállítására: Tween, például Tween 80 hozzáadását.

A kísérleti csoportok a következők:

1. csoport (n=15): 20 pg rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm

Tweennel;

2. csoport (n=15): 20 pg rgD2t/Al(OH)₃/MPL 100 nm szorbittal;

3. csoport (n= 16): kontroll.

A kontrollt vagy nem kezeltük, vagy csak Al(OH)₃/MPL-lel vakcináltuk. A vakcinákat a fertőzés utáni 21. és 42. napon adtuk. A kiújuló betegség lefolyását a fertőzés utáni 60. napig figyeltük meg.

Az eredményeket az 5. táblázat mutatja. Egy tiszta, szignifikáns terápiás hatást figyeltünk meg a két rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítménnyel vakcináit állatokban. Mindkét készítmény szignifikánsan csökkentette a kiújulás súlyosságát, a kiújulási nap számát, és a kiújult esetek számát.

Következtetések

Igen hatékony terápiás hatást figyeltünk meg megállapított kiújult HSV2 genitális betegség ellen a kisméretű MPL-részecskéket (körülbelül 100 nm) tartalmazó rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítményekkel. Ezzel szemben ezt a terápiás hatást nem figyeltük meg, ha nagyméretű MPL-részecskéket (MPL TEA-ban) adtunk az rgD2t/Al(OH)₃ vakcinához.

Következésképpen a tengerimalacokkal kapott eredmények világosan bizonyítják a kisméretű MPL-részecskékkel készített rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények profilaktikus hatékonyságát. Ezek a készítmények javított terápiás hatékonysággal rendelkeznek a nagyméretű MPL-részecskékkel kombinált rgD2t/Al(OH)₃dal összehasonlítva.

5.5.3. Kisméretű MPL-részecskékkel kombinált rgD2t/Al(OH)₃ immunogén tulajdonságának vizsgálata főemlősökön

A kisméretű MPL-részecskékkel (MPL 100 nm szorbittal) kombinált rgD2t/Al(OH)₃ immunogén hatását főemlősökön (afrikai zöldmajmok) értékeltük ki.

A 100 nm-es MPL-ből 50, 20 vagy 5 pg dózisokat 20 pg rgD2t-vel és 0,5 mg Al(OH)₃-dal kombináltunk. Két vakcinálást végeztünk a 0. és az 1. hónapban. A specifikus humorális (ELISA- és semlegesítőtiterek) és effektorsejtek által médiáit (DTH) immunválaszokat mértük.

a) Kísérleti eljárás

Három, egyenként 5 afrikai zöldmajomból álló csoportot vakcináltunk a 0. és 28. napon 20 pg gD2t/Al(OH)₃ készítménnyel, amely 50, 20 vagy 5 pg MPL-t tartalmazott. Az immunizálásokat intramuszkulárisan végeztük 1 ml dózisban. Az állatoktól minden két hétben vért vettünk az antitestmeghatározáshoz ELISA-val (anti-gD2 titerek) és neutralizációs vizsgálattal. A három vakcinakészítmény in vivő T-sejt által közvetített immunitást indukáló képességét is összehasonlítottuk, amelyet egy specifikus késleltetett típusú hiperszenzitivitás (DTH) válasz indukálásával mértünk. A második vakcinálás után 14 nappal minden egyes csoportból három majmon bőrpróbát végeztünk 15 vagy 5 pg gD2t-vel, amelyet sóoldatban alkalmaztunk a hason. A bőrpróbát kontrollként csak sóoldattal is elvégeztük. A bőrpírt és az intradermális oltás helyének megkeményedését 24 és 48 órával később megvizsgáltuk.

b) Eredmények

A szerológiai és DTH-válaszokat a 6. táblázat tartalmazza. Az 50 vagy 20 pg MPL-t tartalmazó gD2t/Al(OH)₃ készítménnyel vakcináit majomcsoportokban szignifikánsan több semlegesítő antitest termelődött, mint az 5 pg MPL dózissal kezelt csoportban (p<0,003, illetve p<0,008). Nem volt szignifikáns különbség az ELISA- vagy semlegesítőtiterekben az 50 vagy 20 pg MPL-lel kezelt csoportokban. Korrelációt figyeltünk meg az MPL-dózis és az effektorsejtek által közvetített immunválaszra kifejtett hatás között. Erős DTH-választ detektáltunk az 50 vagy 20 pg MPL-t tartalmazó készítménnyel vakcináit majmok többségében (3/4). Ezzel szemben az 5 pg MPL-t tartalmazó vakcinával kezelt csoportból csak egyetlen majomban fejlődött ki a bőrpróbára válasz.

c) Következtetések

A fenti adatok bizonyítják, hogy a kisméretű MPLrészecskékkel kombinált A1(OH)₃ adjuváns hatása főemlősökben is jelentkezik, és nemcsak a kisállatfajtákra korlátozódik. Majmokban korrelációt észleltünk az MPL-dózis és az rgD2t/Al(OH)₃ MPL-készítmény immunogén jellege között. 20 és 50 pg-mal kaptuk a legjobb szerológiai és DTH-válaszokat.

6. példa

Klinikai vizsgálatok Lyme- és Hepatitis B vakcinákkal, és kisméretű MPL-lel

6.1. Influenzavírusból származó NS1(1 —81) és B. burgdorferi ZS7-ből származó OspA fúziós proteinjét tartalmazó Lyme-kór-vakcina

Készítmények előállítása

6.6.1. NSl-OspA/alumínium-hidroxid

Az NSl-OspA-t a WO 93/04175 számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint állítottuk elő, alu9

HU 219 056 Β mínium-hidroxidon adszorbeáltuk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáltuk. A végtérfogatot foszfátpufferrel (10 mmol/1 PO₄, 150 mmol/1 NaCl) állítottuk be. A készítményt 4 °C-on tartottuk felhasználásig.

Egy dózis 10 pg NSl-OspA/500 pg alumíniumhidroxidot tartalmaz.

6.1.2. NSl-OspA/alumínium-hidroxid/MPL

NSl-OspA-t alumínium-hidroxidon adszorbeáltuk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáltuk. Az MPL-t a fentiek szerint állítottuk elő, a készítményhez adtuk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül újra inkubáltuk. A készítményt ezután foszfátpufferrel (10 mmol/1 PO₄, 150 mmol/1 NaCl) állítottuk be végtérfogatra. A készítményt felhasználásig 4 °C-on tároltuk.

Egy dózis 10 pg OspA/500 pg A1(OH)₃/50 pg MPL-t tartalmaz.

6.1.3. Immunizálás rendje

Humán önkénteseket injektáltunk intramuszkulárisan ml készítménnyel háromszor, a 0., 31. és 62. napon. Az I., II. és III. immunizálás után 30 nappal vettük a szérummintákat.

A mintákat ELISA-val analizáltuk teljes IgG antiOspA és LA-2-szerű antitestválaszra inhibiciós tesztben (az LA-2 Mab bizonyítottan egy védő antitest egerekben fertőzés ellen).

6.2. HBsAg/MPL készítmények vizsgálata emberben

6.2.1. Készítmények előállítása

HBsAg 20 μg/alumínium-hidroxid 500 pg

A HBsAg-t az alumínium-hidroxid teljes mennyiségén adszorbeáltuk, és a végtérfogatot foszfáttal pufferolt sóoldattal (10 mmol/1 PO₄, 150 mmol/1 NaCl) állítottuk be 1 ml/dózisra. A készítményeket 4 °C-on tároltuk felhasználásig.

6.2.2. HBsAg 20 pg/alumínium-hidroxid 100 pg

A HBsAg-t a fentiek szerint formáltuk, de csak 100 pg Al(OH)₃-on abszorbeáltuk. A végtérfogat dózisonként 1 ml.

6.2.3. HBsAg 20 pg/aluminium-hidroxid 100 ^g/MPL pg

A HBsAg-t 100 pg alumínium-hidroxidon adszorbeáltuk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáltuk. Ezután hozzáadtuk az MPL-t a kívánt koncentrációban, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáltuk. A készítményt ezután végtérfogatra (1 ml/dózis) állítottuk megfelelő pufferrel (lásd fent), és felhasználásig 4 °C-on tároltuk.

6.2.4. Immunizálás rendje

Humán önkénteseket (20/csoport) intramuszkulárisan injektáltunk 1 ml fenti készítmény valamelyikével. A 0., L, 3. és 6. hónapban vettük a szérumot. A szérumot semlegesítő antitestre analizáltuk kereskedelmi forgalomból beszerezhető Abbot-teszttel.

6.3 Eredmények

A 8. táblázat mutatja, hogy az alumínium-hidroxiddal és az NSl-OspA-val kombinációban alkalmazott MPL 100 nm-es részecskék formájában hatékonyan indukál inhibitor természetű magasabb antitesttitereket, mint az antigén alumínium-hidroxidon, és a szerokonverzió kinetikája gyorsabb.

Ez bizonyítja, hogy egy oldható antigén esetén, mint például az NSl-OspA emberben, az MPL kis részecske formában alkalmazva megtartja adjuváns tulajdonságait, amelyeket állatokban egyéb oldható antigénekkel már kimutattunk.

A 7. táblázat mutatja, hogy az adjuváns hatás, amely elveszik, ha a Hepatitis B készítményekben jelen lévő alumínium-hidroxid-készítmény mennyiségét csökkentjük, visszanyerhető, ha MPL-t adunk hozzá a találmány szerinti formában. Az MPL a szerokonverzió sebességét is javítja.

7. példa

Hepatitis B+Hepatitis A kombinált vakcinakészítmény

A HBsAg-t az alumínium-hidroxid teljes mennyiségének 90%-án adszorbeáltuk (0,5 mg/ml), és szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltuk. A pH-t 6,2-re állítottuk be, és a készítményt szobahőmérsékleten 14 napon keresztül tárolva érni hagytuk.

A HM-175 törzs inaktivált származéka formájában (mint a Havrixban) lévő Hepatitis A antigént 360-22 EU/dózisban az alumínium-hidroxid végső mennyiségének 10%-án preadszorbeáltuk (0,5 mg/ml). A fennmaradó alumínium-hidroxidot ezután az oldathoz adtuk, és keverés közben szobahőmérsékleten tartottuk 1 órán keresztül.

Ezután az alumínium-hidroxidon adszorbeált HAV-t hozzáadtuk a HBsAg készítményhez.

A HAV/HBsAg oldathoz 12,5-100 pg/ml dózis koncentrációban hozzáadtuk a 100 nm-nél kisebb részecskeméretű MPL-t, és a térfogatot végtérfogatra állítottuk, majd a készítményt felhasználásig 4 °C-on tároltuk.

8. példa

További antigéneket tartalmazó kombinációs vakcinák előállítása

A kombinációs vakcinákat úgy állíthatjuk elő, hogy a 2. vagy a 3., vagy a 4. példa szerinti készítményhez hozzáadunk egy vagy több kívánt antigént.

9. példa

Humorális immunitás fokozódása és sejt által közvetített immunitás indukálása alumínium-hidroxiddal és MPL-lel formált HBsAg-vel immunizált egerekben

9.1. Al(OH)₃+MPL hatása az anti-HBs-antitestek indukálására

Balb/c egereket szubkután módon vagy intradermálisan immunizáltunk alumínium-hidroxidon adszorbeált rekombináns HBsAg-vel és MPL-lel mint adjuvánssal. Az egereket kétszer immunizáltuk a HBsAg/Al/MPL készítményekkel, és az első és második dózis után mértük az antitestválaszokat. Az össz-Ig-t ELISA- vagy AUSAB-készlettel (Abbott Láb, III.) mértük, és különleges figyelmet szenteltünk az IgG2a izotípusú antitestek indukálásának, mivel ezt az izotípust főleg a γ-interferon szekréciója indukálja. A fenti izotípus indukálása ezért közvetve a sejt által közvetített immunitás aktiválását, mégpedig a Thl aktiválását tükrözi.

HU 219 056 Β

Vizsgáltuk a HBsAg/MPL arányát, valamint az MPL-részecskék méretét.

9.1.1.1. kísérlet

MPL (> 500 nm) dózis hatása az alumínium-hidroxidon adszorbeált recHBsAg immunogenicitására 10 nőstény Balb/c egérből álló csoportokat injektáltunk szubkután módon 50 pg Al₃ ⁺-on [Al(OH)₃-ként] adszorbeált 2,5 pg recHBsAg-vel és növekvő mennyiségű (3,1-50 pg) >500 nm részecskeméretű MPL-lel. Az egereket kétszer injektáltuk 100 pl térfogatban, 2 hetes intervallumban. Az egerekből az első injekció után 2 héttel, és a megerősítés után 1 héttel vért vettünk. Az összes anti-HBs IgG-t és a specifikus IgG2a-t ELISAval mértük recHBsAg mint kötőantigén alkalmazásával. A titereket a maximális érték 50%-ának megfelelő hígítás (középponthígítás) reciprokával fejeztük ki. Az eredmények azt mutatják, hogy mind a specifikus IgG, mind az IgG2a mennyisége növekedik az MPL növekvő dózisaival, különösen 12,5-50 pg dózisok esetén. A hatás látható mind a primer, mind a szekunder válaszokon, és különösen nyilvánvaló IgG2a esetén (20szoros növekedés), amely közvetve jelzi az MPL-lel történő immunizálás által indukált γ-interferon szekrécióját.

9.1.2. II kísérlet

MPL-t (>500 nm) tartalmazó vagy MPL nélküli adszorbeált recHBsAg klinikai összehasonlítása Három klinikai készítményt állítottunk elő alumínium-hidroxidon adszorbeált recHBsAg-ből: a DSAH 16 nem tartalmazott MPL-t és kontrollként szolgált, a DSAR501-et és 502-t hasonló módon állítottuk elő [20 pg recHBsAg 0,5 mg Al³⁺-on A1(OH)₃ formájában adszorbeálva], de ezek 50 pg MPL-t (>500 nm) is tartalmaztak.

A három készítményt szubkután módon injektáltuk 10 egérből álló csoportoknak 2,5 pg HBsAg-t, 100 pg Al³⁺-t és 6,26 pg MPL-t tartalmazó 200 pl térfogatban, két alkalommal, 2 hetes intervallummal. Az egerekből a 14. napon és a megerősítés után egy héttel vért vettünk. Az anti-HBs-antitesteket AUSAB-készlettel vagy házilag készített ELISA-val mértük IgG-re vagy IgG2a-ra. Az eredményeket a 2. táblázatban közöljük. Az eredmények azt jelzik, hogy az első injektálás után két héttel az MPL-t tartalmazó két készítmény nagyon szignifikáns anti-HBs-választ indukált (12,4 és 41,9 mIU/ml), míg az MPL-t nem tartalmazó készítmény csak jelentéktelen választ indukált (0,75 mIU/ml). A válaszadók száma magasabb volt az MPL alkalmazása esetén (9/10 és 9/10, szemben az MPL nélküli 1/10-zel). Az MPL hatását a megerősítés után is kimutattuk, mivel a DSAR501-gyel és DSAR502-vel kapott titerek körülbelül 6-szor nagyobbak voltak, mint az MPL nélküli titerek.

A fentiekből arra következtetünk, hogy - legalábbis egerekben - az 500 nm-nél nagyobb MPL képes javítani mind az anti-HBs-válasz kinetikáját, mind az antiHBs-válasz szintjét.

Ezeket az eredményeket megerősítettük, amikor specifikus IgG-t és IgG2a-t mértünk a DSAH16-tal (MPL nélkül) és a DSAR502-vel (MPL-lel) végzett immunizálás után: az anti-HBs IgG titer 5-ször (primer válasz), illetve 3-szor (szekunder válasz) magasabb, ha az MPL jelen van.

Az IgG2a válasz esetén az MPL hatása még szembetűnőbb, legalábbis a második dózis után, ami az IgG2a elsődleges indukálását jelzi. Ez közvetve tükrözi a sejt által közvetített immunitás aktiválását (gamma-interferonszekréciót) az MPL-t tartalmazó készítmények által.

9.1.3. III. kísérlet

MPL (<100 nm) dózis hatása alumínium-hidroxidon adszorbeált rekombináns HBsAg immunogenicitására darab 7 hetes nőstény Balb/c egérből álló csoportokat injektáltunk szubkután módon 50 pg Al³⁺-on [Al(OH)₃-ként] adszorbeált 1 pg recHBsAg-vel és növekvő mennyiségű (3,1-25 pg) < 100 nm részecskeméretű MPL-el. Az egereket kétszer injektáltuk 200 pl térfogattal, 2 hetes intervallumban. Az egerekből az első injekció után 2 héttel, és a megerősítés után 1 héttel vért vettünk. Az anti-HBs-választ ELISA-val értékeltük ki (össz-Ig, -IgG, -IgG2a) az összegyűjtött szérumban. A titereket középponthígításokként adtuk meg (a legmagasabb értékek 50%-át adó hígítások reciproka). Az eredmények azt mutatják, hogy már 3,1 pg MPL is erős növekedést indukál az antitestválaszban mind a primer, mind a szekunder válaszok esetén. A válaszok 6,25 pg-nál érik el a tetőpontot, és ezután csökkennek, és hasonlóvá válnak az MPL nélkül kapott értékekhez, ha az MPL-t magas dózisban (25 pg) alkalmazzuk. Az antitestválaszok mintája hasonló IgG-re, IgG2a-ra és az összes Ig-re. Ez ellentétben van a nagyobb méretű (>500 nm) MPL-lel kapott eredményekkel, és azt mutatja, hogy a kisméretű (<100 nm) MPL-részecskék (legalábbis a humorális immunitást illetően) hatékonyabbak, mint a nagyobb méretű (>500 nm) részecskék, mivel kevesebb MPL szükséges a maximális hatás kiváltásához. A kisméretű MPL magasabb aktivitását számos kísérletben megerősítettük.

Amint azt a nagyméretű MPL (>500 nm) esetén is kimutattuk, az MPL adjuváns hatása nagyobb IgG2ara, mint az összes IgG-re vagy Ig-re. A szekunder válasz maximális hatásánál (6,25 pg MPL) 25-szörös emelkedés van IgG2a-ra, míg az IgG-re vagy a totál-Igre a növekedés 7,6-szeres, illetve 4,3-szeres.

9.2. Sejt által közvetített immunitás indukálása

Al(OH)₃-on adszorbeált recHBsAg-vel - MPL hatása

Ha a humorális immunitás elegendő a Hepatitis B elleni védelemhez, a sejt által közvetített immunitás (CTL, Thl) indukálása különösen fontos lehet a betegség kezelése szempontjából.

Terápiás vakcinák céljára azonban új készítmények szükségesek, mivel az A1(OH)₃ a humorális immunitást képes ugyan javítani, de a sejt által közvetített immunitást nem.

Megvizsgáltuk az MPL hatását az IL-2 és g (azaz gamma) - interferon szekretálására képes Thl-sejtek indukálására Al(OH)₃-on adszorbeált recHBsAg-vei immunizált Balb/c egerekben.

HU 219 056 Β

9.2.1.1. kísérlet

MPL (>500 nm) hatása Thl-sejtek indukciójára

Al(OH)_}-on adszorbeált HBsAg-vel immunizált

Balb/c egerekben darab 5 hetes nőstény Balb/c egérből álló csoportot immunizáltunk oly módon, hogy 10 pg HBsAg-t, 15 pg Al³⁺-t [Al(OH)₃-ként] és 15 pg MPL-t tartalmazó 30 pl elegyet injektáltunk mindegyik talpba. A kontrollegereket hasonló módon injektáltuk azonos mennyiségű recHBsAg-vel, vagy FCA-val keverve (pozitív kontroll), vagy Al(OH)₃-on adszorbeálva MPL nélkül (negatív kontroll).

Az immunizálás után 6 nappal az egereket leöltük, és eltávolítottuk a popliterális nyirokcsomókat. A nyirokcsomósejteket (LNC 2105/ml) különböző időkön keresztül (24-74 óra) tenyésztettük 1% negatív egérszérummal kiegészített RPMI tápközegben, amely 5 pg/ml recHBsAg-t tartalmazott. A tenyésztés befejeztével meghatároztuk a közegbe szekretált IL-2, INF-g és IL-4 mennyiségét. Az IL-2 mennyiségét az IL-2-dependens CTL sejtvonal (VDA2 sejtek) proliferációját stimuláló képessége alapján határoztuk meg (amelyet ³H-timidin-beépülés alapján értékeltünk ki), és a titert stimulációs indexként fejeztük ki (Sí=stimulált sejtekbe beépült ³H-timidin mennyisége/nem stimulált sejtekbe beépült ³H-timidin mennyisége). Az IL-4 és INF-g mennyiségét kereskedelmi forgalomban lévő ELISAkészlettel mértük (Holland Biotechnology az IFN-g esetén és Endogén az IL-4 esetén). A titereket pg IFN-g/ml-ben fejeztük ki.

Az eredmények azt jelzik, hogy az Al(OH)₃-on adszorbeált HBsAg-vel immunizált egerekből származó LNC nem választott ki szignifikáns mennyiségű IL-2-t, IL-4-et vagy ING-g-t. Ezzel szemben az Al(OH)₃-on + MPL-en adszorbeált HBsAg-vel immunizált egerekből származó LNC nagyobb mennyiségben szekretált IL-2-t (I. S.=38 a 48. órában) és szignifikáns mennyiségű INF-g-t szekretált. Ez a szekréció hasonló (INF-g esetén) vagy magasabb (IL-2 esetén), mint a HBsAg+ +FCA-val immunizált egereknél megfigyelt, és az in vitro szekréció hamarabb következik be.

Nem detektáltunk IL-4-et Al(OH)₃-on adszorbeált HBsAg-vel történő immunizálás után még MPL jelenlétében sem.

A szekréciós profil azt jelzi, hogy a specifikus Thl-sejtek (IL-2, INF-g) indukálódtak az adszorbeált HBsAg-vel MPL jelenlétében végzett immunizálás hatására, de MPL távollétében nem. Azonban Th2-t (IL-4-et) nem tudtunk kimutatni ilyen immunizálási körülmények között.

9.2.2. II. kísérlet

MPL (<100 nm) dózisának hatása Thl-sejtek indukálására Al(OH)_}-on adszorbeált recHBsAg-vel immunizált Balb/c egerekben

Csoportonként 5 Balb/c egeret immunizáltunk az egyes állatok két talpába injektált 30 pl eleggyel, amely 15 pg Al³⁺-on [Al(OH)₃-ként] adszorbeált 10 pg recHBsAg-t és növekvő mennyiségekben (0-15 pg) MPL-t (100 nm) tartalmazott.

Az injektálás után 6 nappal az egereket leöltük, és a popliterális nyirokcsomósejteket (LNC) 2106 sejt/ml koncentrációban tenyésztettük 1% negatív egérszérummal kiegészített RPMI-ben különböző időkön keresztül (24 óra - 96/25) 5 pg recHBsAg jelenlétében.

Az IL-2 szekrécióját a VDA-2 sejtek proliferációjának stimulálásával mértük, és az IL-2 koncentrációját stimulációs indexszel (Sí) fejeztük ki; az INF-g szekrécióját kereskedelmi forgalomban lévő készlet alkalmazásával mértük, és pg/ml-ben fejeztük ki.

Azt találtuk, hogy az IL-2 szekréciója drámaian megnövekedett az MPL alacsony dózisainak hatására (7,5 pg), és maximális hatást kaptunk 15 pg MPL esetén.

Az IL-2 szekréciója általában jelentősebb a 24 órás időpontban, mint a 48 vagy 72 órás időpontban.

Az INF-g szekréciója hiányzott, ha az immunizálást MPL távollétében, Al(OH)₃-on adszorbeált HBsAg-vel végeztük. Az MPL kis dózisa (7,5 pg) az INF-g szekrécióját indukálja, és itt is maximális hatást kapunk 15 pg MPL-vel. Az IL-2 esetén megfigyeltekkel ellentétben az INF-g szekréciója a tenyészetben késleltetett, és az idő előrehaladtával 96 óráig fokozódik.

A fenti adatok együttesen azt jelzik, hogy az MPL (<100 nm) erőteljesen indukálja a Thl-sejteket, ha Al(OH)₃-on adszorbeált HBsAg-vel kombináljuk. Az Al(OH)₃-on adszorbeált HBsAg-t és MPL-t tartalmazó készítmények hatását megvizsgáltuk mind a humorális, mind a sejt által közvetített immunitásra Balb/c egerekben. Az eredmények azt jelzik, hogy az MPL világosan javítja az anti-HBs-válasz kinetikáját, mivel több anti-HBs-antitestet találtunk mind a primer, mind a szekunder immunizálás után. Az anti-HBs minősége is módosul, és egy preferált IgG2a indukció figyelhető meg, amely közvetve tükrözi az INF-g szekréciót, és így a sejt által közvetített immunitás indukálását.

A Thl-sejtek HBsAg-t, Al(OH)₃-ot és MPL-t tartalmazó készítmények általi indukálásának közvetlen kiértékelése világosan jelzi, hogy az MPL erőteljesen indukálja a mind IL-2-t, mind INF-g-t szekretáló Thlsejteket. Az ilyenfajta készítmény ezért fontos a gyógyászati vakcinák kifejlesztése szempontjából.

Legjobb eredményeket 100 nm részecskeméretnél kisebb MPL alkalmazásával kaptunk.

A fenti kísérletek eredményeit a 9-14. táblázatok tartalmazzák.

13. Az eredmények összefoglalása

A kísérleti adatok azt sugallják, hogy a kisméretű MPL jobb immunstimuláns főemlősökben, beleértve az embert is, mint a nagyméretű MPL. Figyelembe véve azt is, hogy a kisméretű MPL lehetővé teszi ipari méretű steril mennyiségek előállítását, így megfelelő immunstimulánst jelent humán- vagy állatgyógyászati vakcinák előállítására.

HU 219 056 Β

1. táblázat

MPL részecskemérete és szűrés utáni hozamok különböző szonikálási paraméterek alkalmazásával

A kísértet száma	Koncentráció (mg/ml)	Teljes tartózkodási idő az átfolyókamrában (perc)	Részecskeméret szűrés előtt (nm)	Hozam szűrés után (%)
16.	1	2,5	92	104
17.	1	3	79	78,5
18.	1	3,5	95	86,4
19.	2	2,8	77	N. A.
20.	1	2,8	98	N. A.

2. táblázat

Steril MPL-oldat részecskeméretének stabilitása 1 mg/ml koncentrációban, fotonkorrelációs spektroszkópiával (Maivem) meghatározva

A kísérlet száma	Részecskeméret szűrés után (nm)	Részecskeméret stabilitási vizsgálat után 4 °C-on (nm)
8 nap	1 hónap	3 hónap	6 hónap
9	94	81	74	88	82

3. táblázat rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények profilaktikus hatékonysága tengerimalacban primer HSV2 betegség elleni vakcinálásra adott humorális válasz és hatás

Csoport	Készítmény	Antitcsttiterek (GMT)	Primer fertőzés
28 nap III immunizálás után	Sérülés súlyossága*	Sérülés gyakorisága (%) pontszám** szerint	Pl index***
ELISA	NEUTRA	Számtani közép±SD	Középső érték	0	0,5	1	2	4	8	16
	1. kísérlet
ln=12	rgD2t 5 pg/Al(OH)3/MPL (szorbit)	10439	673	2,2±3,1	0,5	50	17	0	33	0	0	0	75
2n=12	rgD2t 5 pg/Al(OH)3/MPL TEA	5 454	378	4,6±6,3	1,5	42	8	8	25	17	0	0	130
3n=ll	Kontrollok	<100	<50	55,3±51,8	55	18	0	0	0	27	0	55	988
	2. kísérlet
ln=10	rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm	21039	696	0,5 ±0,7	0	60	30	10	0	0	0	0	25
2n=10	Kontrollok	<100	<50	28,5±29,1	31,5	30	0	0	0	10	40	20	680

* A sérülés pontszámainak összege a fertőzés utáni 4-12. napon.

** Sérülés pontozása: nincs sérülés (0), vaginális sérülés (0,5 vagy 1), külső bőrhólyagok (2,4, 8 vagy 16). *** Primer fertőzési indcx=Ii (maximális pontszám i) χ (gyakoriság %); i=0, 0,5, 1, 2,4, 8 vagy 16 értékkel.

HU 219 056 Β

4. táblázat rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények profilaktikus hatékonysága tengerimalacban Vakcinálás hatása kiújuló HSV2 betegségre

Csoport	Készítmény	Kiújuló begség
Kiújulás súlyossága*	Kiújulás napjainak száma**	Kiújult esetek száma gyakoriság (%)
Számtani közép±SD	Középső érték	Számtani közepi SD	Középső érték	0	1	2	3	4	5
	1. kísérlet
ln=12	rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm szorbit)	5,4±6,2	3,5	4±5	2,5	33	42	8	8	8	0
2n=ll	rgD2t 5 pg/Al(OH)3/MPL TEA	6,5±5,9	6,5	4,3 ±3,9	3	27	27	9	27	9	0
3n=ll	Kontrollok	8±5,4	9	5,1±3,1	6	18	0	18	64	0	0
	2. kísérlet
ln=10	rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm	1,6±3,9	0	0,5±l,l	0	80	20	0	0	0	0
2n=10	Kontrollok	6,1 ±6	6,75	4,3 ±4,3	4,5	40	0	20	20	0	20

* A sérülés pontszámainak összege a fertőzés utáni 13-39. napon.

** Kiújulás napjainak száma a fertőzés utáni 13-39 napos periódusban.

Egy kiújulást egy sérülés nélküli nap előz meg és követ, és jellemzője, hogy legalább két napon keresztül bőrpír jelentkezik, vagy egy napon át hólyagok).

5. táblázat rgD2t/Al(OH)₃/MPL készítmények terápiás hatékonysága

Csoport	Készítmény	Terápiás hatékonyság
Súlyosság*	Kiújulási napok száma**	Kiújulási esetek száma***
Számtani közép±SD	Középső érték (% kontrollal szemben)	Számtani középiSD	Középső érték (% kontrollal szemben)	Számtani középtSD	Középső érték (% kontrollal szemben)
	l. kísérlet
ln=18	rgD2t 20 pg/Al(OH)3/MPL TEA	ND	ND	ND	11	ND	7
2n=18	Kontrollok	ND	ND	ND		ND	5
	2. kísérlet
ln=14	rgD2t 20 gg/Al(OH)3/MPL 100 nm	11,2±8,7 (-39%)p<0,05	10,25 (-41%)p<0,l	8,4±6 (—28%)p<0,l	8,5 (-23%) p<0,31	3,3 ±2	4
2n=13	Kontrollok	18,3±10,3	17,5	11,7±6,8	11	4,4±2,1	4
	3. kísérlet
ln=15	rgD2t 20 pg/Al(OH)3/MPL 100 nm (Tween)	10,3±10,l	6(-54%) p<0,07	6,3±5,8	4(-43%) p<0,l	2,7±2p<0,l	3(-25%) P<0,l

HU 219 056 Β

5. táblázat (folytatás)

Csoport	Készítmény	Terápiás hatékonyság
Súlyosság*	Kiújulási napok száma**	Kiújulási esetek száma***
Számtani közép ±SD	Középső érték (% kontrollal szemben)	Számtani közép±SD	Középső érték (% kontrollal szemben)	Számtani közép±SD	Középső érték (% kontrollal szemben)
2n=15	rgD2t 20 pg/Al(OH)3/MPL 100 nm (szorbit)	8,3 ±6,7	5,6 (-50%) p<0,03	5,5 ±4,4	4 (-43%) p<o,i	2,7±1,5	3(-25%) p<0,l
3n=16	Kontrollok	12,5±8,1	13	8,5±4,5	7	3,6±1,6	4

* A sérülés pontszámainak összege a fertőzés utáni 21-60. napon.

** Összes napok száma, amikor az állatokban a sérülések kiújultak a fertőzést követő 21-60 napos periódusban.

*** Kiújulási esetek száma a fertőzést követő 21-60 napos periódusban. Egy esetet egy sérülés nélküli nap előz meg és követ, és jellemzője, hogy legalább két napon keresztül jelentkezik bőrpír (pontszám=0,5) vagy egy napon keresztül látható külső hólyag (pontszám >2). Immunterápiás kezelés; szubkután injekciók a fertőzés utáni 21. és 42. napon. Statisztikai analízis; Wilcoxon ránk sum teszt adjuváns kontrollal szemben (nem szignifikáns p>0,l; NS).

6. táblázat gD2t/alumínium-hidroxid/MPL 100 nm (szorbit) immunogenicitása főemlősökben Szerológiai és DTH-eredmények

Vakcina	Majom száma	Antitestválasz*	DTH-válasz** (beszűrődés)
ELISA-titer	NEUTRA-titer	gD2	gD2
PBS	5 Pg	15 pg
	KQ 100	18 630	800	-	+	+ +
	KQ101	5 554	1600	-	-	-
20 pg gD2t Alumínium-hidroxid 50 pg MPL	KQ 102	14 870	800	-	+ +	+ + +
KQ 103	5 486	1600	-	+ +	+ + +
KQ 104	16 270	1600	ND	ND	ND
	GMT	10 655	1213
	KQ 105	16 170	800	-	+	+ +
	KQ 106	4 389	800	-	-	-
20 pg gD2 alumínium-hidroxid 20 pg MPL	KQ 107	20 440	1600	-	+ +	+ + +
KQ 108	5 613	800	-	+	+
KQ 109	6 765	1600	ND	ND	ND
	GMT	8 876	1056
	KQ 110	2 486	200	-	-	-
	KQ111	9 918	800	-	+ +	+ + +
20 pg gD2t alumínium-hidroxid 5 pg MPL	KQ 112	2 526	400	-	-	-
KQU3	7137	400	-	-	-
KQ114	8 396	400	ND	ND	ND
	GMT	5 181	400

* II. immunizálás után 14 nappal mérve/GMT=geometriaiátlag-titer.

ELISA-titer=középponttiter.

NEUTRA-titer=citopatogén hatás ellen 100%-os védelmet adó legnagyobb szérumhígítás reciproka.

** Bőrtcszt a II. immunizálás utáni 14. napon.

Beszűrődés (24 órás leolvasás): + = 1 mm, + + = l-5mm, + + + = >5 mm.

HU 219 056 Β

7. táblázat

Időzítés	N	Szerokonverzió	%	GMT	Min. titcr	Max. titer
Alumínium-hidroxid (500 pg) HBsAg pre	20	0	0	0	0	0
Pl (1. hónap)	20	10	50	6	1	58
PII (3. hónap)	20	19	95	80	7	565
Alumínium-hidroxid (100 pg) HBsAg pre	20	0	0	0	0	0
Pl (1. hónap)	19	7	36,8	4	1	56
PII (3. hónap)	19	18	94,7	24	2	320
Alumínium-hidroxid (100 pg) MPL pre	20	0	0	0	0	0
Pl (1. hónap)	20	12	60	10	1	66
PII (3. hónap)	20	20	100	73	6	605

8. táblázat

OspA klinikai mintáinak immunogenicitása emberben Anti-OspA az LA-2 inhibiciós vizsgálatban (ng ekvivalens LA-2/ml) (GMT)

Vakcina	Pre 0. nap	Post I 30 28. nap	Post 11 30 56. nap	Post III 30 84. nap
NSl-OspA alumínium-hidroxidon	118	233	409	768
SC (%)	2,6	77,2	86,5	100
NSl-OspA alumínium-hidroxidon	134	269	865	2424
SC (%)	2,6	88,6	97,2	100

N=80 10 pg/dózis Folyamatban

9. táblázat

MPL (>500 nm) növekvő dózisainak hatása alumínium-hidroxidon adszorbeált recHBsAg immunogenicitására

MPL mennyisége (pg/dózis)	Anti-HBs-válasz
Összes IgG	IgG2a
14. nap	21. nap	14. nap	21. nap
0*	69	743	3,2	11
3,13	122	541	3,8	20
6,25	296	882	6,4	24
12,5	371	1359	10	48
25	456	1493	18	138
50	403	1776	33	242

* HBsAg Al-on

HU 219 056 Β

10. táblázat

MPL-lel és a nélkül készült 3 klinikai készítmény összehasonlítása AUSAB-válasz

Készítmény	HBsAg dózisa Al(OH)3-on(gg)	MPL dózisa (gg)	GMT anti-HBs (mIU/ml)
DSAH16	2,5	0	0,75	15,1
DSAR501	2,5	6,25	12,4	96,7
DSAR502	2,5	6,25	41,9	89,2

11. táblázat

MPL-lel (>500 nm) és a nélkül készült 2 klinikai készítmény összehasonlítása Anti-HBs IgG és IgG2a válaszok

Készítmény	HBsAg dózisa Al(OH)3-on (pg)	MPL dózisa (gg)	Antí-HBs-válasz
IgG	IgG2a
15. nap	21. nap	15. nap	21. nap
DSAH16	2,5	0	20	178	<5	5
DSAR502	2,5	6,25	113	641	<5	28

12. táblázat

MPL (<100 nm) dózisának hatása Al(OH)₃-on adszorbeált recHBsAg immunogenicitására

Al(OH)3-on adszorbeált HBsAg dózisa (gg)	MPL (<100nm) dózisa (pg)	Anti-HBs-válasz
Összes IG	IgG	IgG2a
15. nap	21. nap	15. nap	21.nap	15. nap	21. nap
1	0	30	637	67	516	15	99
1	3,12	312	2302	335	3532	167	1752
1	6,25	538	2719	856	3932	261	2521
1	12,5	396	2104	485	3625	125	1393
1	25,0	38	446	141	638	28	233

13. táblázat

MPL (>500 nm) hatása HBsAg-specifikus Thl-sejtek indukálására Balb/c egerekben

HBsAg dózisa (gg/egér)	Készít- mény	In vitro szekréció
IL-2 (Sí)	INF-γ (gg/ml)	IL-4 (gg/ml)
24 óra	48 óra	72 óra	24 óra	48 óra	72 óra	24 óra	48 óta	72 óra
20	FCA	1,3	2,0	8,0	<125	<125	385	NT	NT	NT
-	FCA	0,7	1,8	0,7	<125	<125	<125	NT	NT	NT
20	A1(OH)3	1,0	1,4	1,2	<125	<125	<125	<40	<40	<40
20	A1(OH)3+MPL (30 pg)	2	38	10	<125	280	280	<40	<40	<40

A leírásban ismertetett módon végrehajtott immunizálás után a nyirokcsomósejteket 5 gg rccHBsAg/ml jelenlétében tenyésztettük a megadott időn keresztül, és az IL-2, INF-γ és IL-4 szekrécióját VDA2 T-sejt vonal, illetve két, kereskedelmi forgalomban lévő ELISA-készlet alkalmazásával határoztuk meg.

HU 219 056 Β

14. táblázat

MPL (< 100 nm) különböző dózisainak hatása HBsAg-specifikus Thl-sejtek indukciójára

HBsAg dózisa (gg/egér)	MPL dózisa	In vitro szekréció
IL-2 (Sí)	INF-γ (pg/ml)
24 óra	48 óra	72 óra	24 óra	48 óra	72 óra	96 óra
20	0	2,6	28	21,8	<67	<67	<67	<67
20	7,5	207	173	58	<67	207	522	698
20	15	270	71	36	275	878	1249	1582
20	30	41	59	36	<67	<67	<67	207

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (31)

1. Vakcinakészítmény, amely egy antigént tartalmaz 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A-val (MPL) és egy megfelelő hordozóanyaggal együtt, amelyben az MPL részecskemérete nem haladja meg a 120 nm-t.

2. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az MPL részecskemérete 60-120 nm.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az MPL részecskemérete 100 nm-nél kisebb.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben a hordozóanyag alumíniumhidroxid.

5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben a hordozóanyag egy „olaj a vízben” típusú emulzió vagy egyéb lipidbázisú hordozóanyag.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az antigén egy virális antigén.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az antigén egy Hepatitis A elleni antigén.

8. A 7. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a Hepatitis A antigén egy inaktivált teljes sejtkészítmény, amely a HM-175 törzsből származik.

9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben az antigén egy Hepatitis B elleni antigén.

10. A 9. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben az antigén Hepatitis B felületi antigént (HBsAg-t) vagy annak egy variánsát tartalmazza.

11. A 10. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a HBsAg a HBsAg S antigénjét (226 aminosav) tartalmazza.

12. A 11. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a HBsAg a pre-S szekvenciát is tartalmazza.

13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a HBsAg egy (L*, S) képletű összetett részecske, ahol L* a Hepatitis B vírus módosított L-proteinjét jelenti, amely az L-protein 12-52., majd

133-145., majd 175-400. aminosavmaradékából álló aminosavszekvenciát tartalmazza, és S a HBsAg S-proteinjét jelenti.

14. A 9-13. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amely egy Hepatitis A antigént is tartalmaz.

15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amely egy vagy több hepatitisantigént és legalább egy nem hepatitis antigén komponenst tartalmaz, amely diftéria, tetanusz, pertussis, Haemophilus influenzáé b (Hib) és/vagy polio elleni védelmet biztosít.

16. A 15. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely egy DTP (diftéria-tetanusz-pertussis)-HBsAg kombináció, egy Hib-HBsAg kombináció, egy DTP-Hib-HBsAg kombináció vagy egy IPV (inaktivált poliovakcina)-DTP-Hib-HBsAg kombináció.

17. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely egy Hepatitis A antigént is tartalmaz.

18. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amely egy HSV D glikoproteint vagy annak egy immunológiai fragmentumát tartalmazza.

19. A 18. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a D glikoprotein egy csonka protein.

20. A 19. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a csonka protein a HVSgD2, és a C-terminális kötőrégió hiányzik.

21. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amely HIVgpl60-at vagy annak származékát tartalmazza.

22. A 21. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amelyben a gpl60 származéka a gpl20.

23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amelyben a 3-O-dezacilezett-monofoszforil-lipid A mennyisége dózisonként 10 pg és 100 pg közötti.

24. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, amely Tween 80-at vagy szorbitot is tartalmaz.

25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény gyógyászati alkalmazásra.

26. 3-O-dezacilezett-monofoszforil-lipid A, amelynek részecskemérete 120 nm-nél kisebb.

HU 219 056 Β

27. A 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A tiszta, steril oldata.

28. Eljárás 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A tiszta, steril oldatának előállítására, azzal jellemezve, hogy 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A-t vízben 5 szuszpendálunk, és a kapott szuszpenziót ultrahanggal kezeljük.

29. Eljárás az 1-25. igénypontok bármelyike szerinti vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a

27. igénypont szerinti terméket egy antigénnel keverjük.

30. 3-O-dezacilezett monofoszforil-lipid A, amelynek részecskemérete legfeljebb 120 nm, és egy antigén együttes alkalmazása gyógyszerek előállítására fertőző betegségek megelőzésére és kezelésére.

31. 120 nm-nél kisebb részecskeméretű 3-Odezacilezett monofoszforil-lipid A gyógyászati alkalmazásra.