CN102239253A - 谷氨酰tRNA合成酶（GtS）片段 - Google Patents

谷氨酰tRNA合成酶（GtS）片段 Download PDF

Info

Publication number
CN102239253A
CN102239253A CN2009801484409A CN200980148440A CN102239253A CN 102239253 A CN102239253 A CN 102239253A CN 2009801484409 A CN2009801484409 A CN 2009801484409A CN 200980148440 A CN200980148440 A CN 200980148440A CN 102239253 A CN102239253 A CN 102239253A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
sequence
gts
adjuvant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801484409A
Other languages
English (en)
Inventor
亚法·米兹拉西-内本兹霍尔
迈克尔·塔尔
罗恩·达冈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PROTEA VACCINE TECHNOLOGIES LT
Original Assignee
PROTEA VACCINE TECHNOLOGIES LT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PROTEA VACCINE TECHNOLOGIES LT filed Critical PROTEA VACCINE TECHNOLOGIES LT
Publication of CN102239253A publication Critical patent/CN102239253A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及肺炎链球菌(S.pneumoniae)谷氨酰tRNA合成酶(GtS)蛋白的多肽片段，包括变体和类似物，并涉及包含这种多肽片段的疫苗。尤其是，本发明涉及这种疫苗用于引发针对肺炎链球菌的保护性免疫的用途。

Description

谷氨酰tRNA合成酶(GtS)片段
发明领域
本发明涉及衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia或S.pneumoniae)细胞壁的蛋白谷氨酰tRNA合成酶(GtS)。尤其是，本发明涉及GtS的免疫原性片段和其用作引发针对肺炎链球菌的保护性免疫的基于多肽的疫苗的用途。
发明背景
肺炎链球菌属于人类呼吸道的共生菌群，但也可导致侵入性感染如脑膜炎和败血症。发展中世界的大多数儿童变成肺炎链球菌的鼻咽携带者。许多人发展可以是侵入性感染的肺炎球菌病(如菌血症、败血症或脑膜炎)、或粘膜感染的肺炎球菌病(如肺炎和中耳炎)。肺炎链球菌是非洲和发展中世界的其它地区非流行性儿童脑膜炎的主要原因。每年有大约100万至200万儿童死于肺炎球菌肺炎。特别地，当考虑到世界范围五岁以下儿童的死亡时，约20％是死于肺炎球菌肺炎。这种高的发病率和死亡率，以及肺炎链球菌的抗生素抗性菌株的持续出现加强了对开发有效预防手段如免疫接种的需求。肺炎球菌7-价多糖共轭疫苗显著减少了婴儿侵入性疾病的发生率，并显著地限制了群体中未免疫成员侵入性疾病的发生率(Kyaw等，N.Engl.J.Med.2006，354，1455-63)。然而，疫苗中未包含的菌株导致的携带和疾病仍在增加(Musher DM.，N.Engl.J.Med.2006，354，1522-4，Huang等，Pediatrics 2005，116，e408-13)。
最优的抗-肺炎球菌疫苗应当是安全、有效、广谱(覆盖大多数肺炎球菌菌株)和负担得起的(廉价、可大量获得)。现有的肺炎球菌多糖和多糖-共轭的疫苗针对肺炎球菌血清型的窄而重要的组进行保护，免疫过的受治疗者保持对疫苗未覆盖的菌株的易感性。值得注意的是，与发达国家相比，现有的肺炎球菌共轭疫苗通常具有较低的针对在发展中世界中导致疾病的肺炎球菌菌株的覆盖范围。除了覆盖范围的缺陷，共轭疫苗生产复杂并昂贵，导致数量受限制，并超出许多贫穷国家的预算。
粘膜上皮表面与它们的紧密连接构成阻止病原菌和其产物进入的第一道防线。肺炎链球菌粘附于鼻咽粘膜细胞，导致携带而没有明显的炎症反应。对于临床疾病的发生，肺炎链球菌必须从鼻咽扩散到中耳或肺中或跨粘膜上皮细胞层，基本上沉积在粘膜下层(Ring等，J.Clin.Invest.1998，102：347-60)。肺炎链球菌的粘附、扩散和侵入中牵涉的分子包括荚膜多糖、细胞壁肽聚糖和表面蛋白(Jedrzejas MJ.Microbiol.Mol.Biol.Rev.2001，65，187-207)。
已经在婴儿观察到，对肺炎链球菌细胞壁蛋白的抗体响应随年龄增加，与发病率负相关(Lifshitz等，Clin.Exp.Immunol.2002，127，344-53)。利用生化、免疫学和MALDI TOF研究，使用儿童血清的纵向系列来鉴定表现出年龄依赖性抗原性的肺炎链球菌细胞壁蛋白(Ling等，Clin ExpImmunol 2004，138，290-8)。一种这样的蛋白是谷氨酰tRNA合成酶(GtS)。
Mizrachi-Nebenzahl等，2007(J.Infect.Dis.，196，945-53)公开了肺炎链球菌衍生的重组GtS能够在小鼠诱导部分保护性免疫应答。
Chiron S.P.A.受让的国际专利申请公布号WO 02/077021公开了约2,500种肺炎链球菌4型菌株基因、包括GtS基因的序列，和计算机模拟鉴定的其相应的氨基酸序列。还提出了使用这些蛋白序列的432种的亚组用作免疫抗原，但没有提供使用蛋白作为抗原来产生疫苗的操作实施例。
SmithKline Beecham Corp.受让的国际专利申请公布号WO 97/38718公开了480、348、126和62个氨基酸的肺炎链球菌GtS多肽、编码该GtS多肽的多核苷酸和利用重组技术产生这种多肽的方法。还提供了包含GtS多肽的疫苗制剂，尽管在提交时没有实际制备这种疫苗。美国专利5,958,734要求保护GtS的348N-末端片段和126个氨基酸的C-末端片段。美国专利5,976,840要求保护开始于Val-7的480个氨基酸的GtS序列，和每100个核苷酸包含最多三个核苷酸取代、缺失或核苷酸***的变体。美国专利6,300,119要求保护与编码以上480个氨基酸的多肽的多核苷酸序列相同的GtS变异多核苷酸，除了每100个核苷酸中最多五个核苷酸可被取代、缺失或***，且其中第一个多核苷酸序列通过杂交检测肺炎链球菌。美国专利6,165,760涉及包含以上480个氨基酸的序列的GtS多肽，还包含异源氨基酸序列。
本申请发明人之一的WO 03/082183公开了用作针对肺炎链球菌的疫苗的限定组的细胞壁和细胞膜肺炎链球菌蛋白。在儿童日托中心发现，鉴定的38种肺炎链球菌蛋白，包括完整GtS具有年龄依赖性免疫原性。
对于改进的基于肺炎链球菌多肽的疫苗存在未满足的需求，所述疫苗可诱导持续长时间的免疫应答，在所有年龄组，包括儿童和老年人具有针对宽范围不同肺炎链球菌血清型的宽的特异性。还存在对基于与人类蛋白具有最小同源性的多肽序列的疫苗的需求。
发明内容
本发明提供免疫原性谷氨酰tRNA合成酶(GtS)蛋白片段和针对肺炎链球菌的疫苗。本发明的多肽为肺炎链球菌蛋白GtS的片段，该多肽选择为使与完整蛋白相比具备对人类序列减少的同源性，将产生针对免疫的受治疗者自身蛋白的抗体的风险最小化。而且，本发明的多肽在目前测序的肺炎链球菌菌株之间具有高的序列同一性，使得它们对于开发针对该细菌的广谱疫苗是理想的。令人惊讶地发现，本发明的GtS片段在引发针对肺炎链球菌的免疫应答方面比完整蛋白更有活性。
根据本发明，GtS片段可作为分离的多肽或作为融合蛋白重组产生，或通过肽合成而合成地产生，或通过连接更短的合成肽片段产生。根据本发明，可使用重组或合成产生，以在多肽片段序列中引入特异性突变和/改变，以改进具体特性如溶解度和稳定性。
比完整蛋白短的多肽片段提供每微克蛋白更多个免疫原性表位。
本发明的多肽本身或作为嵌合蛋白的部分可用在针对肺炎链球菌的疫苗中，可用作佐剂，或与外部佐剂混合或配制。
根据一个方面，本发明提供一种50-250个氨基酸的合成或重组多肽，所述多肽衍生自肺炎链球菌GtS的序列(SEQ ID NO：1)，包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)，以及其变体和类似物。
变体包括多肽序列中每十个氨基酸残基一个氨基酸残基的取代，即，具有90％或更高同一性的多肽包括在本发明范围中。根据一些实施方案，提供了与本发明多肽具有至少97％同一性的序列。
根据一些实施方案，所述多肽由100-200个氨基酸组成。根据其它实施方案，所述多肽由约130-180个氨基酸组成。
根据一些实施方案，根据本发明的GtS多肽与人类GtS-2蛋白SEQ IDNO：12共有少于约24％的序列同一性。根据其它实施方案，根据本发明的GtS多肽与人类GtS-2蛋白SEQ ID NO：12共有少于约10％的序列同一性。根据一些实施方案，本发明的GtS多肽与SEQ ID NO：12的残基361-521共有少于约18％的序列同一性。根据又另一个实施方案，当比对根据本发明的GtS多肽的序列与人类GtS-2的序列(SEQ ID NO：12)时，两条序列之间不超过六个连续氨基酸残基是相同的。
根据一些实施方案，本发明提供包含以下序列的合成或重组GtS多肽片段、以及其变体和类似物：
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKF VTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTIFLLGREKSIQHIENMLKEISK(SEQ ID NO：3，即SEQ ID NO：1的残基333-486)，其中X是甲硫氨酸或代表多肽的N-末端。
根据其它实施方案，合成或重组GtS多肽片段包含以下序列、以及其变体和类似物：
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDX1FF SDFPELTEAEREVMTX2ETVPTVLEAFKAKLEAMTDDX3FVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTX4FLLGREKSIQHIENX5LKEISK(SEQ ID NO：4)，其中X是甲硫氨酸或代表多肽的N-末端，X1是Leu(L)或Fhe(F)，X2是Gly(G)或Asp(D)，X3是Lys(K)或Glu(E)，X4是Ile(I)或Val(V)，且X5是Met(M)或Ile(I)。
根据又其它实施方案，合成或重组GtS多肽片段包含选自以下组成的组的序列、以及其变体和类似物：
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKP(SEQ ID NO：5)；
KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFP(SEQ ID NO：6)；
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAK(SEQ ID NO：7)；
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKF VTENIFPQIKAVQKET(SEQ ID NO：8)；
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSG(SEQ ID NO：9)；和
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTIFLLGR(SEQ IDNO：10)，其中X是甲硫氨酸或代表多肽的N-末端。
根据又其它实施方案，本发明提供由选自SEQ ID NO：3至SEQ IDNO：10组成的组的序列组成的合成或重组GtS多肽片段。
根据一些实施方案，所述多肽片段不与载体蛋白共轭或融合。在其它实施方案中，本发明的多肽片段作为包含载体序列的重组融合蛋白产生，即该片段***到载体多肽序列中，或融合到载体蛋白序列的氨基末端、羧基末端或侧链，或融合到另一种肺炎链球菌蛋白或多肽)。
根据另一方面，本发明提供编码GtS片段多肽的分离的多核苷酸序列。
根据一些实施方案，分离的多核苷酸序列编码包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)以及其变体和类似物的50-250个氨基酸的多肽序列。根据一些优选实施方案，分离的多核苷酸序列编码由100-200个氨基酸组成的多肽序列。
根据一些具体实施方案，分离的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：11或SEQID NO：15。根据一些具体实施方案，分离的多核苷酸序列由SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：15组成。
根据另外的实施方案，分离的多核苷酸序列编码选自以下组成的组的多肽序列：SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：10、以及其变体和类似物。
根据又另一方面，本发明提供用于针对肺炎链球菌免疫受治疗者的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)以及其变体和类似物的50-250个氨基酸的合成或重组GtS多肽片段。根据一些优选实施方案，多肽由100-200个氨基酸组成。
根据一些实施方案，疫苗组合物包含选自以下组成的组的GtS多肽序列：SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：10，以及其变体和类似物。
根据其它实施方案，根据本发明的疫苗组合物还包含至少一种另外的肺炎链球菌多肽或蛋白序列。
根据一些实施方案，根据本发明的疫苗组合物还包含佐剂。根据其它实施方案，疫苗不包含佐剂。
药学上可接受的佐剂包括但不限于油包水乳剂、脂质乳剂和脂质体。根据一些实施方案，所述佐剂选自以下组成的组：
Figure BDA0000065947630000061
明矾、胞壁酰二肽、
Figure BDA0000065947630000062
几丁质微粒、壳聚糖、霍乱毒素B亚基、不稳定毒素(labile toxin)、AS21A、
Figure BDA0000065947630000063
和
Figure BDA0000065947630000064
在一些实施方案中，疫苗配制为用于肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、真皮内和经皮递送。在一些实施方案中，疫苗配制为用于肌内施用。在其它实施方案中，疫苗配制为用于口服施用。在又其它实施方案中，疫苗配制为用于鼻内施用。
根据进一步的实施方案，本发明提供一种在受治疗者中引起免疫应答并赋予针对肺炎链球菌的保护的方法，包括施用包含至少一种包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)、以及其变体和类似物的50-250个氨基酸的合成或重组GtS多肽片段的疫苗组合物。根据一些优选实施方案，所述多肽由100-200个氨基酸组成。
任何施用途径可用于递送本发明的疫苗。根据一些实施方案，其中施用所述疫苗的途径选自肌内、口服、鼻内、腹膜内、皮下、局部、真皮内和经皮递送。根据一些实施方案，所述疫苗通过肌内、鼻内或口服途径施用。
根据本发明进一步的方面，包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)、以及其变体和类似物的50-250个氨基酸的合成或重组GtS多肽片段、用于在受治疗者预防肺炎链球菌感染。根据一些优选实施方案，该多肽由100-200个氨基酸组成。
根据本发明的多肽用于制备针对肺炎链球菌免疫的疫苗组合物的用途，以及根据本发明的分离的多核苷酸用于产生包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)、以及其变体和类似物的50-250个氨基酸的GtS多肽片段的用途也在本发明的范围中。根据一些优选实施方案，该多肽由100-200个氨基酸组成。
本发明中公开的所有多肽可通过重组方法和通过化学合成产生。
本发明的另一方面提供包含至少一种GtS片段多肽和至少一种其它多肽序列的融合蛋白。
根据一个实施方案，融合蛋白包括包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)、以及其变体和类似物的100-200个氨基酸的GtS多肽片段。
本发明的进一步实施方案和适用性的完整范围将从以下提供的详细描述而变得明显。然而，应理解的是，详细描述和具体实施例虽然指出了本发明的优选实施方案，但仅以示例的方式给出，因为对于本领域技术人员，在本发明主旨和范围内的各种改变和修改将从该详细描述变得明显。
附图简述
图1显示从基因组DNA PCR扩增GtS片段(333-486)。
图2描绘由PCR扩增证实预计的462bp***片段的存在的凝胶。
图3表示由以考马斯亮蓝染色的1D-PAGE分辨出洗脱的GtS片段333-486(23kDa条带)。
图4显示由1D-PAGE利用抗-HIS-标签的抗体，对重组GtS片段333-486带HIS-标签的融合蛋白(23kDa条带)的蛋白质印迹分析。
图5表示以用兔抗rGtS333-486片段活体外中和的肺炎链球菌攻击的小鼠的存活。
图6从第一G-200制备性柱循环收集的三个连续试管获得的无标签GtS 333-486片段(sGtS)的SDS-PAGE考马斯染色。
具体实施方式
本发明提供衍生自肺炎链球菌GtS蛋白的序列的多肽、和包含这些多肽的疫苗。根据本发明的多肽包括对应于SEQ ID NO：1的完整肺炎链球菌GtS蛋白的残基333-361的29个氨基酸残基KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)。
本发明的多肽具有与人类序列同源性减少的优势。如果微生物抗原与人类蛋白具有显著序列同源性，那么在疫苗中使用这种抗原将带来引发针对特定人类蛋白的抗体的风险，导致自身免疫性的风险，这是不可接受的结果。因此，从抗原去除微生物抗原与人类蛋白之间同源的任何这种序列是非常重要的，以使得其具有用作疫苗抗原的用途。
产生对应于肺炎链球菌GtS蛋白的氨基酸残基333-486的154个氨基酸的多肽片段，对其进行表征，发现其在兔中产生针对肺炎链球菌感染的中和抗体方面有效。令人惊讶地，发现154个氨基酸的GtS片段比相应的完整蛋白在中和侵染性细菌方面更有效。
为了方便，在这里描述了说明书、实施例和权利要求书中采用的某些术语。
术语“抗原呈递”是指与动物的I类或II类主要组织相容性复合物分子(MHC-I或MHC-II)或与人类的HLA-I和HLA-II缔合的抗原在细胞表面上的表达。
术语“免疫原性”或“免疫原性的”涉及物质刺激或引发免疫应答的能力。免疫原性例如通过确定产生对该物质特异性的抗体的能力来测量。抗体的存在由本领域已知方法检测，例如利用ELISA测定。
本文所用的“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列、和其片段，并指天然产生或合成的分子。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”可互换使用，是指从其衍生GtS多肽片段的多肽可操作地连接于该多肽以外的多肽。
多肽的重组产生
本发明的多肽片段可通过在表达载体中作为自身或作为嵌合蛋白表达而制备。产生包含一种或多种GtS多肽片段的嵌合或重组蛋白的方法是本领域技术人员已知的。编码一种或多种GtS多肽片段的核酸序列可***表达载体以制备用于在宿主细胞中繁殖和表达的多核苷酸构建体。
本文所用的术语“表达载体”和“重组表达载体”是指一种DNA分子，例如质粒或病毒，其包含对于在特定宿主细胞中表达重组多肽所必需的期望和适当的核酸序列。本文所用的“可操作地连接”是指至少两个序列的功能连接。可操作地连接包括启动子与第二序列例如本发明核酸之间的连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。
多肽转录所必需的调节区可由表达载体提供。基因表达所需的调节区的确切性质在不同载体和宿主细胞之间可能变化。通常需要启动子，其能够结合RNA聚合酶并促进可操作地连接的核酸序列的转录。调节区可包括转录和翻译起始中牵涉的5′非编码序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等等。编码序列3′的非编码区可包含转录终止调节序列，如终止子和多腺苷酸化位点。还可提供翻译起始密码子(ATG)。
为了将核酸序列克隆到载体的克隆位点，在核酸合成过程中加入提供适当的相容性限制位点的接头或衔接子。例如，通过使用以包含期望的限制性酶位点的引物进行的PCR扩增DNA，可将期望的限制性酶位点引入DNA片段。
PCR的替代方法是使用合成基因。该方法允许产生包含将在期望的物种(例如大肠杆菌(E.coli))中表达的优化的核苷酸序列的人工基因。基因的再设计提供了在许多情形改进基因表达的手段。因为遗传密码的冗余性，重写开放阅读框是可能的。从而可能改变开放阅读框中达约三分之一的核苷酸，仍产生相同的蛋白。对于300个氨基酸的典型蛋白序列，存在编码相同蛋白的超过10150种密码子组合。利用优化方法，如用更常用的密码子代替使用较少的密码子，可导致惊人的结果。还可包括进一步优化如去除RNA二级结构。进行这些和其它同时优化的计算机程序是可获得的。充分优化的基因可惊人地改进蛋白表达。由于对原始DNA序列进行了大量核苷酸改变，产生新设计的基因的唯一实用方式是使用基因合成。
包含与调节区可操作地连接的GtS多肽片段序列的表达构建体可直接引入适当的宿主细胞以表达和产生多肽本身或作为重组融合蛋白。可使用的表达载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒或修饰的病毒。通常，这种表达载体包含用于在适当的宿主细胞繁殖载体的功能性复制起点、用于***期望的基因序列的一个或多个限制性内切酶位点、和一个或多个选择标记。
然后，应将包含表达载体和GtS多肽片段的重组多核苷酸构建体转移到细菌宿主细胞中，在那里其可复制并表达。这可通过本领域已知的方法进行。表达载体与相容的原核或真核宿主细胞一起使用，所述细胞可衍生自细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和人类。
由宿主细胞表达后，可由多种蛋白纯化方法将GtS多肽片段与不期望的组分分离。一种这样的方法使用重组蛋白上的多组氨酸标签。多组氨酸标签由通常在N-末端或C-末端加到重组蛋白的至少六个组氨酸(His)残基组成。多组氨酸标签通常用于在大肠杆菌或其它原核表达***中表达的带有多组氨酸标签的重组蛋白的亲和性纯化。离心收集细菌细胞，可通过物理手段或以去污剂或酶如溶菌酶裂解所得的细胞小团。在这一阶段，粗裂解物包含重组蛋白与衍生自细菌的多种其它蛋白，将其与亲和性介质如NTA-琼脂糖、HisPur树脂或Talon树脂一起培养。这些亲和性介质包含结合的金属离子镍离子或钴离子，多组氨酸标签以微摩尔的亲和性与其结合。然后用磷酸盐缓冲液洗涤树脂，去除不与钴离子或镍离子特异性相互作用的蛋白。洗涤效力可通过加入20mM咪唑来改进，然后通常用150-300mM咪唑洗脱蛋白。随后可利用限制性酶、内切蛋白酶或外切蛋白酶去除多组氨酸标签。用于纯化带有多组氨酸标签的蛋白的试剂盒可购自例如Qiagen。
另一种方法是通过产生包涵体，其是当在原核生物中表达重组多肽时可能产生的蛋白的无活性聚集体。虽然cDNA可能适当地编码可翻译的mRNA，但产生的蛋白可能不正确地折叠，或序列的疏水性可能导致重组多肽变得不可溶。包涵体容易由本领域已知方法纯化。纯化包涵体的各种方案是本领域已知的。在一些实施方案中，通过离心从细菌裂解物回收包涵体，并以去污剂和螯合剂洗涤以从聚集的重组蛋白去除尽可能多的细菌蛋白。为了获得可溶性蛋白，将洗涤后的包涵体溶解在变性剂中，然后由稀释或透析逐步去除变性试剂而将释放的蛋白重折叠(如描述在例如Molecular cloning：a laboratory manual(分子克隆：实验手册)，第3版，Sambrook，J.和Russell，D.W.，2001；CSHL Press)。
分析性纯化通常利用三种特性来分离蛋白。首先，可将蛋白运行通过pH分级凝胶或离子交换柱，根据等电点来纯化。其次，可根据其尺寸或分子量经由尺寸排阻色谱或经由SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析来分离蛋白。通常利用2D-PAGE纯化蛋白，然后由肽质量指纹图谱分析以确定蛋白身份。第三，蛋白可根据极性/疏水性经由高压液相色谱或反相色谱分离。纯化的蛋白由其分子量或本领域已知的其它方法追踪。
为了评价多步骤纯化的方法，必须将具体蛋白的量与总蛋白的量比较。后者可通过Bradford总蛋白测定或在280nm的吸光度来确定，然而纯化方法中使用的某些试剂可能干扰定量。例如，咪唑(通常用于纯化带多组氨酸-标签的重组蛋白)是一种氨基酸类似物，在低浓度将干扰用于总蛋白定量的双金鸡纳酸(BCA)测定。低等级咪唑中的杂质也将在280nm吸光，导致从UV吸光度获得的蛋白浓度读数不准确。
将考虑的另一方法是表面等离子体共振(SPR)。SPR可检测无标记分子对芯片表面的结合。如果期望的蛋白是抗体，结合可直接解释为蛋白的活性。人们可以将蛋白的活性浓度表示为总蛋白的百分比。SPR可以是用于快速确定蛋白活性和总产率的强有力方法。
疫苗制剂
本发明的疫苗组合物包含至少一种GtS多肽片段，且任选地包含佐剂。制剂可包含多种添加剂，如佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂或防腐剂。疫苗可配制为以许多方式之一施用。
在一些实施方案中，疫苗配制为胃肠外施用，例如肌内施用。根据又另一实施方案，施用是口服。根据一些实施方案，施用是口服且疫苗例如以片剂的形式呈现或包装在明胶胶囊或微胶囊中。
根据又另一实施方案，施用是真皮内。特别设计为真皮内沉积疫苗的针头是本领域已知的，如例如在6,843,781和7,250,036及其它中公开的。根据其它实施方案，施用以无针头注射器进行。
根据本发明的一个实施方案，疫苗是鼻内施用。疫苗制剂可以任何方便的方式施加到鼻的淋巴组织。然而，优选的是以液流或液态滴剂向鼻部道的壁施加。鼻内组合物可配制为例如液态形式的鼻滴剂、喷雾，或配制为适于吸入的粉末、膏剂、或乳剂。
这些样式的制剂对于本领域技术人员是一般知识。
脂质体提供用于抗原递送和呈递的另一递送***。脂质体是双层的囊泡，由围绕可包封抗原或其它产物的通常含水的中心的磷脂和其它固醇构成。脂质体结构是高度可变的，具有从纳米大小到微米大小变化的许多类型，从约25nm到约500μm。已经发现脂质体有效地递送治疗剂到皮肤和粘膜表面。可进一步修饰脂质体用于靶向递送，通过例如，掺入特异性抗体到表面膜中，或被改变以包封细菌、病毒或寄生虫。完整脂质体结构的平均存活时间或寿命可随着并入某些聚合物例如聚乙二醇而延长，允许体内持久释放。脂质体可以是单层或多层的。
疫苗组合物可通过以下配制：在脂质体中包封抗原或抗原/佐剂复合物形成脂质体-包封的抗原，混合脂质体-包封的抗原与包括连续相疏水物质的载体。如果在第一步骤没有使用抗原/佐剂复合物，可将适合的佐剂加入到脂质体-包封的抗原，加入到脂质体-包封的抗原与载体的混合物，或在载体与脂质体-包封的抗原混合之前加入到载体。方法的顺序可以取决于所用佐剂的类型。通常，当使用佐剂如明矾时，首先混合佐剂与抗原以形成抗原/佐剂复合物，然后用脂质体包封抗原/佐剂复合物。然后将所获得的脂质体-包封的抗原与载体混合。术语“脂质体-包封的抗原”根据上下文，可以是指包封仅抗原，或是指包封抗原/佐剂复合物。这促进佐剂与抗原之间的亲密接触，并可能至少部分地解释当明矾用作佐剂时的免疫应答。当使用另一种时，可首先在脂质体中包封抗原，然后将所获得的脂质体-包封的抗原混合到疏水物质中的佐剂中。
在配制大致不含水的疫苗组合物时，用脂质体包封抗原或抗原/佐剂复合物，并与疏水物质混合。在配制疏水物质包水乳剂中的疫苗时，用含水介质中的脂质体包封抗原或抗原/佐剂复合物，然后混合含水介质与疏水物质。在乳剂的情形，为了保持疏水物质在连续相，可将包含脂质体的含水介质以小份加入，伴随与疏水物质混合。
在所有配制方法中，视情况与疏水物质或与含水介质混合之前可冻干脂质体-包封的抗原。在一些情形，抗原/佐剂复合物可被脂质体包封，随后冻干。在其它情形，抗原可被脂质体包封，随后加入佐剂，然后冻干形成带有外部佐剂的冻干脂质体-包封的抗原。在又另一种情形，抗原可被脂质体包封，随后冻干，然后加入佐剂。冻干可促进佐剂与抗原之间更好的相互作用，形成更有效力的疫苗。
将脂质体-包封的抗原配制到疏水物质中还可能包括使用乳化剂来促进脂质体在疏水物质中更均匀地分布。典型乳化剂是本领域公知的，包括二缩甘露醇油酸酯(ArlacelTM A)、卵磷脂、TweenTM 80、SpansTM 20、80、83和85。乳化剂以有效促进脂质体均匀分布的量使用。通常，疏水物质与乳化剂的体积比(v/v)在约5∶1至约15∶1的范围。
微粒和纳米颗粒采用小的生物可降解球，其用作疫苗递送的储库。聚合物微球具备的超过其它储库-作用佐剂的大的益处是，其非常安全，已被美国食品药品管理局批准作为适合的缝线(sutures)用于人类药物和用作生物可降解药物递送***(Langer R.Science.1990；249(4976)：1527-33)。共聚物水解的速率是非常充分表征的，这继而允许制造经长的时间段缓慢释放抗原的微粒(O’Hagen，等，Vaccine.1993；11(9)：965-9)。
肠胃外施用微粒引起持续长时间的免疫，尤其是如果其并入了延长释放特征。释放速率可由聚合物的混合物和其相对分子量来调整，各聚合物将经不同的时间段水解。不希望受理论限制，不同大小的颗粒(1μm至200μm)的制剂也可能有助于持续长时间的免疫应答，因为大的颗粒必须破碎成小的颗粒才能被巨噬细胞摄取。以这种方式，通过整合不同颗粒大小，可开发单次注射的疫苗，从而延长抗原呈递并大大地有益于家畜的生产者。
在一些应用中，佐剂或赋形剂可包括在疫苗制剂中。例如，MontanideTM(不完全弗氏佐剂)和明矾是用于人类的优选佐剂。佐剂的选择将部分地由疫苗施用方式确定。一种优选施用方式是肌内施用。另一种优选施用方式是鼻内施用。鼻内佐剂的非限制性例子包括壳聚糖粉末、PLA和PLG微球、QS-21、AS02A、磷酸钙纳米颗粒(CAP)；mCTA/LTB(具有热不稳定肠毒素的五聚B亚基的突变霍乱毒素E112K)和去毒的大肠杆菌衍生不稳定毒素。
理论上，使用的佐剂还可以是已知用于基于肽-或蛋白的疫苗的任何佐剂。例如：凝胶形式的无机佐剂(氢氧化铝/磷酸铝，Warren等，1986；磷酸钙，Relyvelt，1986)；细菌佐剂如单磷酰脂质A(Ribi，1984；Baker等，1988)和胞壁酰肽(Ellouz等，1974；Allison和Byars，1991；Waters等，1986)；颗粒佐剂如所谓的ISCOMS(“免疫刺激性复合体”，Mowat和Donachie，1991；Takahashi等，1990；Thapar等，1991)、脂质体(Mbawuike等，1990；Abraham，1992；Phillips和Emili，1992；Gregoriadis，1990)和生物可降解微球(Marx等，1993)；基于油性乳剂和乳化剂的佐剂如IFA(“不完全弗氏佐剂”(Stuart-Harris，1969；Warren等，1986)、SAF(Allison和Byars，1991)、皂苷(如QS-21；Newman等，1992)、角鲨烯/角鲨烷(Allison和Byars，1991)；合成佐剂如非离子嵌段共聚物(Hunter等，1991)、胞壁酰肽类似物(Azuma，1992)、合成脂质A(Warren等，1986；Azuma，1992)、合成多核苷酸(Harrington等，1978)和聚阳离子佐剂(WO97/30721)。
用于本发明免疫原的佐剂包括铝盐或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。本文使用的尤其优选的佐剂是氢氧化铝凝胶如AlhydrogelTM。磷酸钙纳米颗粒(CAP)是由Biosante，Inc(Lincolnshire，Ill.)开发的佐剂。感兴趣的免疫原可包被在颗粒外部，或包封在其内部[He等，(2000年11月)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6)：899-903]。
用于本发明免疫原的另一种佐剂是乳剂。涵盖的乳剂可以是水包油乳剂或油包水乳剂。除了免疫原性嵌合蛋白颗粒以外，这种乳剂包括如公知的角鲨烯、角鲨烷、花生油或类似物的油相、和分散剂。非离子分散剂是优选的，这种材料包括脱水山梨醇和二缩甘露醇的单-和二-G12-C24-脂肪酸酯，如脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。
这种乳剂例如是包括角鲨烯、甘油和表面活性剂如二缩甘露醇单油酸酯(ArlacelTM A)的油包水乳剂，任选地具有角鲨烷，在水相中用嵌合蛋白颗粒乳化。油相的替代组分包括α-生育酚、混合链的二-和三-甘油酯、和脱水山梨醇酯。这种乳剂的公知例子包括MontanideTM ISA-720和MontanideTM ISA 703(Seppic，Castres，France)。其它水包油乳剂佐剂包括WO 95/17210和EP 0399843中公开的那些。
本文还涵盖使用小分子佐剂。本文可用的一种类型的小分子佐剂是美国专利号4,539,205、美国专利号4,643,992、美国专利号5,011,828和美国专利号5,093,318中描述的7-取代的-8-氧代-或8-磺基-鸟苷衍生物。7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾)在减少抗原-(免疫原-)特异性响应方面尤其有效。
有用的佐剂包括单磷酰脂质A
Figure BDA0000065947630000151
3-脱酰基单磷酰脂质A
Figure BDA0000065947630000152
是由Corixa Corp.of Seattle(以前称为Ribi Immunochem，Hamilton，Mont)制造的公知佐剂。该佐剂在2％角鲨烯/TweenTM 80乳剂中包含从细菌提取的三种组分：单磷酰脂质(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)。这种佐剂可通过GB 2122204B中教导的方法制备。
其它化合物与称为氨烷基葡糖酰胺磷酸酯(AGP)的
Figure BDA0000065947630000161
佐剂结构相关，如可从Corixa Corp以名称RC-529TM佐剂获得的{2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧四-癸酰基]-2-[(R)-3-四-癸酰基氧四癸酰基-氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵盐}。RC-529佐剂可以作为RC-529SE销售的角鲨烯乳剂、以作为RC-529AF的含水制剂从Corixa Corp获得。(参见，美国专利号6,355,257和美国专利号6,303,347；美国专利号6,113,918；和美国公布号03-0092643)。
进一步涵盖的佐剂包括包含CpG核苷酸基序一次或多次(加上侧翼序列)的合成的寡核苷酸佐剂，可从Coley Pharmaceutical Group获得。称为QS21、可从Aquila Biopharmaceuticals，Inc.获得的佐剂是来源于南美皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮、具有佐剂活性的免疫活性皂苷级分(如QuilTM A)，其生产方法公开于美国专利号5,057,540。还公开了QuilTM A的衍生物例如QS21(QuilTM A的HPLC纯化级分衍生物，也称为QA21)、和其它级分如QA17。南美皂皮树皂苷的半合成和合成衍生物也是可用的，如美国专利号5,977,081和美国专利号6,080,725中描述的那些。标为MF59、可从Chiron Corp.获得的佐剂描述在美国专利号5,709,879和美国专利号6,086,901。
还涵盖胞壁酰二肽佐剂，包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[CGP 11637，称为正-MDP]、和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二软脂酰-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧)乙胺[(CGP)1983A，称为MTP-PE]。所谓的胞壁酰二肽类似物描述在美国专利号4,767,842。
其它佐剂混合物包括3D-MPL与QS21的组合(EP 0 671 948 B1)、包含3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO 95/17210、PCT/EP98/05714)、用其它载体配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)、在含胆固醇的脂质体中配制的QS21(WO 96/33739)、或免疫刺激性寡核苷酸(WO 96/02555)。在水包油乳剂中包含QS21和MPL的佐剂SBAS2(现在称为ASO2)也是可用的。替代佐剂包括WO 99/52549在描述的佐剂和聚氧乙烯醚的非颗粒悬液(英国专利申请号9807805.8)。
还任选将包含toll-样受体-4(TLR-4)的一种或多种激动剂的佐剂如佐剂或结构相关的化合物如
Figure BDA0000065947630000172
佐剂或脂质A模拟物单独使用或与TLR-9激动剂如包含CpG基序的非甲基化寡脱氧核苷酸一起使用。
另一种类型的佐剂混合物包括还包含氨烷基葡糖酰胺磷酸酯的稳定油包水乳剂，如美国专利号6,113,918中描述的。氨烷基葡糖酰胺磷酸酯中，称为RC-529的分子{(2-[(R)-3-四癸酰基氧四癸酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧-四癸酰基]-2-[(R)-3--四癸酰基氧四-癸酰基氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵盐)}是最优选的。优选的油包水乳剂描述在WO 99/56776。
佐剂以佐剂量使用，佐剂量可随着佐剂、宿主动物和免疫原而变化。典型的量可从每次免疫约1μg至约1mg变化。本领域技术人员知晓可容易地确定适当的浓度或量。
包含基于水包油乳剂的佐剂的疫苗组合物也包括在本发明的范围中。油包水乳剂可包括可代谢的油和皂苷，如例如美国专利号7,323,182所述。
根据多个实施方案，根据本发明的疫苗组合物可包含一种或多种佐剂，其特征在于以大致上不含无机盐离子的溶液或乳剂存在，其中所述溶液或乳剂包含一种或多种能够使得疫苗等渗或低张力的水溶性或水可乳化性物质。水溶性或水可乳化性物质可以例如选自以下组成的组：麦芽糖；果糖；半乳糖；蔗糖；糖醇；脂质；和其组合。
根据一些具体实施方案，本发明的GtS多肽片段包括蛋白体佐剂。蛋白体佐剂包括脑膜炎球菌(meningococci)外膜蛋白的纯化制品和来自其它细菌的相似制品。这些蛋白是高度疏水的，反映其作为跨膜蛋白和孔蛋白的作用。由于这些蛋白的疏水性蛋白-蛋白相互作用，当适当地分离时，它们形成由直径约60-100nm的完整或片段化的膜囊泡组成的多分子结构。这种脂质体-样物理状态允许蛋白体佐剂作为蛋白载体起作用，还作为佐剂起作用。
现有技术中已经描述了蛋白体佐剂的使用，由Lowell GH在“NewGeneration Vaccines(新一代疫苗)”，第二版，Marcel Dekker Inc，New York，Basel，Hong Kong(1997)第193-206页综述。蛋白体佐剂囊泡描述为大小与某些病毒相当，是疏水的，对人类使用安全。这一综述描述了包含不同抗原和蛋白体佐剂囊泡之间非-共价复合物的组合物的制备，该复合物在利用彻底透析技术选择性地去除增溶性去污剂时形成。
包含不同GtS片段的疫苗组合物可通过混合或连接多种根据本发明的不同GtS多肽片段而产生，并具有或不具有佐剂。此外，根据本发明的GtS片段可包括在包含任何其它肺炎链球菌蛋白或蛋白片段包括突变的蛋白如去毒的肺炎球菌溶血素的疫苗组合物中，或可连接于任何这种肺炎链球菌蛋白或蛋白片段或与任何这种肺炎链球菌蛋白或蛋白片段一起产生。
根据本发明的疫苗组合物可包含，例如，流感多肽或肽表位，其与至少一种根据本发明的GtS多肽片段共轭或偶联。
抗原含量由其激发的生物作用来最佳地界定。当然，应存在足量的抗原以激发产生可测量量的保护性抗体。抗原生物活性的一种方便检验涉及经受检验的抗原性材料消耗其保护性抗体的已知阳性抗血清的能力。结果报告为用已知抗血清预处理的毒性生物体处理的小鼠LD50(致命剂量，50％)的负对数，所述已知抗血清本身已用被评价的抗原性材料的不同稀释液预处理。因此，高的值反映高含量的抗原性材料，其已经固定了已知抗血清中的抗体，从而减少或消除抗血清对毒性生物体的作用，使得小剂量致命。优选地，与以未处理的抗血清处理的毒性生物体活动的结果相比，最终制剂中存在的抗原性材料的水平足以使LD50的负对数增加至少1，优选地1.4。当然，对抗血清对照和适合的疫苗材料获得的绝对值取决于所选择的毒性生物体和抗血清标准品。
以下方法也可用于实现理想的疫苗配制：从预期激发期望的免疫应答的指定抗原开始，在第一步，发现与抗原匹配的佐剂，如专题文献尤其是在WO 97/30721中所述的。下一步，通过以等渗或略微低张力的浓度向抗原和佐剂的混合物加入各种如本发明定义的使得等渗的物质，优选地糖和/或糖醇来优化疫苗，否则组合物将是相同的，并调整溶液到从pH 4.0到10.0的范围的生理pH，尤其是7.4。然后，确定在第一个步骤中与常规的、盐水缓冲溶液相比改进抗原/佐剂组合物溶解度的物质或其浓度。候选物质对溶解度特征的改进是该物质能够带来疫苗免疫原性增加的第一个指示。
因为细胞免疫应答增加的可能先决条件之一是抗原对APC(抗原呈递细胞)的结合增加，所以在下一步骤可进行观察这种物质是否会导致这种类型的增加的研究。采用的方案可以类似于在定义佐剂时描述的方案，如将APC与荧光标记的肽或蛋白、佐剂和使得等渗的物质一起培养。该物质带来的APC对肽的摄取或结合增加可利用通流式细胞计量术与已经与在常规盐水缓冲溶液中存在的仅肽和仅佐剂或肽/佐剂组合物混合的细胞比较来确定。
任选地，制剂的效力还可由细胞免疫应答证实，通过检测免疫后动物中的“延迟型超敏性”(DTH)反应。
最后，在动物实验中测量制剂的免疫调节活性。
合成的肽
本发明的GtS多肽片段可利用本领域已知用于合成肽和多肽的方法化学合成。这些方法通常依赖于肽合成的已知原理；最方便地，方案可按照固相肽合成的已知原理进行。
本文所用的“肽”是指由肽键连接的氨基酸序列。多肽通常是约30和更多个氨基酸的肽。
多肽类似物和模拟物也包括在本发明范围中，以及涵盖本发明多肽的盐和酯。根据本发明的多肽类似物可任选地包含至少一个非天然氨基酸和/或在C末端或N末端的至少一个封闭基团。本发明肽的盐是生理上可接受的有机盐和无机盐。可由计算机辅助设计适当的“类似物”。
术语“模拟物”是指根据本发明的多肽以使得其包含至少一种非肽键的方式被修饰，所述非肽键如例如脲键、氨基甲酸酯键、磺胺键、肼键、或任何其它共价键。可由计算机辅助设计适当的“模拟物”。
本发明肽的盐和酯涵盖在本发明的范围中。本发明多肽的盐是生理上可接受的有机盐和无机盐。本发明多肽的功能衍生物覆盖可由本领域已知手段从作为残基上的侧链或N-或C-末端基团出现的官能团制备的衍生物，并包括在本发明中，只要其保持是药学上可接受的，即，不破坏多肽的活性并不对包含其的组合物赋予毒性特征。例如，这些衍生物可包括羧基的脂肪族酯、通过羧基与氨或与伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(如，烷酰基或碳环芳酰基)反应形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分反应形成的O-酰基衍生物。
术语“氨基酸”是指一种化合物，其具有氨基和羧酸基团，优选地以碳骨架上1，2-、1，3-、或1，4-取代的型式。α-氨基酸是最优选的，包括见于蛋白的20种天然氨基酸(除了甘氨酸以外是L-氨基酸)、相应的D-氨基酸、相应的N-甲基氨基酸、侧链修饰的氨基酸、未见于蛋白的生物合成可利用的氨基酸(如，4-羟基-脯氨酸、5-羟基-赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、β-氰丙氨酸(cyanolanine))、和合成衍生的α-氨基酸，如氨基-异丁酸、正亮氨酸、正缬氨酸、高半胱氨酸和高丝氨酸。β-丙氨酸和γ-氨基丁酸分别是1，3和1，4-氨基酸的例子，还有许多其它氨基酸是本领域已知的。抑胃酶氨酸-样等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOH代替)、羟基乙烯等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOHCH2代替)、还原酰胺等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CH2NH键代替)和硫酰胺等排体(包含两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CSNH键代替)也是本发明可用的残基。
本发明中使用的氨基酸是可购买获得的氨基酸或通过常规合成方法可获得的氨基酸。某些残基可能需要特殊方法来掺入多肽，对肽序列的连续的、多种多样的或收敛的合成方法可用于本发明。天然编码的氨基酸和其衍生物按照IUPAC惯例由三字母代码表示。当没有指明时，使用L异构体。
如本领域技术人员所知的氨基酸的保守性取代在本发明的范围中，只要取代的多肽中保留了抗原性。保守性氨基酸取代包括用另一个具有相同类型，如脂肪族、芳香族、带正电荷、带负电荷的官能团或侧链的氨基酸代替一个氨基酸。这些取代可能增强口服生物利用度、向中枢神经***的渗入、靶向特异性细胞群等等。本领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码的序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的对肽、多肽或蛋白序列的单个取代、缺失、或添加是“保守性修饰的变体”，其中所述改变导致以化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守性取代表格是本领域公知的。
以下六组各包括对彼此是保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
提出以下实施例以更充分地阐述本发明的一些实施方案。然而，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可容易地设计本文公开的原理的许多变化和改变而不偏离本发明的范围。
实施例
实施例1.GtS片段
来自血清型4TIGR4菌株(登录号NP_346492)的肺炎链球菌GtS的氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示：
1MSKDIRVRYA PSPTGLLHIG NARTALFNYL YARHHGGTFL IRIEDTDRKR HVEDGERSQL
61ENLRWLGMDW DESPESHENY RQSERLDLYQ KYIDQLLAEG KAYKSYVTEE ELAAERERQE
121VAGETPRYIN EYLGMSEEEK AAYIAEREAA GIIPTVRLAV NESGIYKWHD MVKGDIEFEG
181GNIGGDWVIQ KKDGYPTYNF AVVIDDHDMQ ISHVIRGDDH IANTPKQLMV YEALGWEAPE
241FGHMTLIINS ETGKKLSKRD TNTLQFIEDY RKKGYLPEAV FNFIALLGWN PGGEDEIFSR
301EEFIKLFDEN RLSKSPAAFD QKKLDWMSND YIKNADLETI FEMAKPFLEE AGRLTDKAEK
361LVELYKPQMK SVDEIIPLTD LFFSDFPELT EAEREVMTGE TVPTVLEAFK AKLEAMTDDE
421FVTENIFPQI KAVQKETGIK GKNLFMPIRI AVSGEMHGPE LPDTIFLLGR EKSIQHIENM
481LKEISK
产生缺少N-末端氨基酸1-332个氨基酸的以上蛋白的片段。该片段称为GtS(333-486)，包含对应于SEQ ID NO：1的残基333-486的154个氨基酸，由SEQ ID NO：3表示：
MKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTD
LFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQI
KAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTIFLLGREKSIQHIENM
LKEISK。
该片段的核苷酸序列由SEQ ID NO：11表示：
AAG AAT GCA GAC CTT GAA ACC ATC TTT GAA ATG GCA AAA
CCA TTC TTA GAG GAA GCA GGC CGT TTG ACT GAC AAG GCT
GAA AAA TTA GTT GAG CTC TAT AAA CCA CAA ATG AAA TCA
GTA GAT GAG ATT ATC CCA TTG ACA GAT CTT TTC TTC TCA GAT
TTC CCA GAA TTG ACA GAA GCA GAG CGC GAA GTC ATG ACG
GGT GAA ACA GTT CCA ACA GTT CTT GAA GCA TTC AAA GCA
AAA CTT GAA GCG ATG ACA GAT GAT AAA TTT GTG ACA GAA
AAT ATC TTC CCA CAA ATT AAA GCA GTT CAA AAA GAA ACA
GGT ATT AAA GGG AAA AAT CTT TTC ATG CCT ATT CGT ATC GCA
GTT TCA GGC GAA ATG CAT GGG CCA GAA TTA CCA GAT ACA
ATT TTC TTG CTT GGA CGT GAA AAA TCA ATT CAG CAT ATC GAA
AAC ATG CTA AAA GAA ATC TCT AAA TAA。
实施例2.与人类的同源性
比较SEQ ID NO：3的GtS(333-486)片段氨基酸序列与人类基因组序列的同源性检验利用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行。
在肺炎链球菌GtS片段与人类蛋白谷氨酰-tRNA合成酶2(人类GtS-2，基因ID：124454EARS2，SEQ ID NO：12)之间发现了最高同源性。完整肺炎链球菌GtS蛋白序列(SEQ ID NO：1)与人类GtS-2蛋白(SEQ ID NO：12)之间的序列同一性是29％。肺炎链球菌GtS片段333-486与人类完整GtS-2(比较SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：12)之间的序列同一性是7.66％，而GtS片段333-486(SEQ ID NO：2)与人类GtS-2序列的相应氨基酸残基(SEQID NO：12的残基361-521)之间的序列同一性是18％。肺炎链球菌GtS的N-末端片段(SEQ ID NO：1的残基5-332)与人类GtS-2蛋白(SEQ IDNO：12)的相应氨基酸具有37％的序列同一性。
很明显，与完整肺炎链球菌GtS蛋白相比，SEQ ID NO：2的GtS多肽片段与人类蛋白具有显著较低的序列同一性。
实施例3.与不同肺炎链球菌菌株的同源性
使用NCBI-Blast工具检查SEQ ID NO：3的GtS(333-486)片段与其它肺炎链球菌菌株之间的同源性。如表1所示，检查的所有肺炎链球菌菌株与SEQ ID NO：3具有至少98％的同一性，与SEQ ID NO：2具有100％的同一性(在相关区域)。
表1.
Figure BDA0000065947630000241
在菌株之间发现的序列突变(每两个菌株最多两个差异)是：L/F 382、G/D 400、K/E 421、I/V 466和M/I 481(按照SEQ ID NO：1编号)。
实施例4.GtS片段的克隆和纯化
GtS片段的克隆和纯化如Mizrachi-Nebenzahl等，2007，J Infect Dis.196：945-53所述地进行。
利用分别包含Xoh1和EcoRI识别序列的以下引物由PCR从肺炎链球菌菌株R6基因组DNA扩增GtS片段：
正向5′GGAATTCAAGAATGCAGACCTTGAAACC 3′(SEQ ID NO：13)
反向5′CCGCTCGAGTTATTTAGAGATTTCTTTTAGCAT 3′(SEQ ID NO：14)
图1表示从基因组DNA PCR扩增GtS(333-486)。
将扩增的和Xoh1-E.coRI(Takara Bio Inc，Shiga，Japan)消化的DNA-片段克隆到pET32a表达载体(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)中，并转化到DH5a UltraMAX超感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。培养氨苄西林-抗性转化子，由PCR分析质粒DNA。由PCR扩增证实预计的462bp大小的***片段的存在，如图2所示。
利用Qiagen High Speed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen GMBH，Hilden，Germany)从DH5αUltraMAX细胞纯化修饰的(去掉硫氧还蛋白(TRX))pET32a-GtS片段载体，转化到大肠杆菌宿主表达菌株BL21(DE3)pLysS(Stratagene，La Jolla，CA)中。测序证实***片段的同一性。培养细菌过夜，通过向BL21(DE3)pLysS+6PGD细胞加入1mM IPTG 5小时来诱导重组蛋白表达。离心收集细胞，在裂解缓冲液中裂解。利用Ni-NTA柱(QiagenGMBH，Hilden，Germany)纯化带HIS-标签的重组蛋白；在室温结合1小时，然后用洗涤缓冲液(8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-Cl、pH 6.3)洗涤柱，利用洗脱缓冲液(8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-Cl、pH 5.9)从柱回收重组蛋白。蛋白的分离由考马斯亮蓝染色和利用抗-HIS抗体(BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)的蛋白质印迹分析证实。由1D-PAGE分辨洗脱的蛋白，揭示考马斯亮蓝染色后的单个条带(23kDa条带)，如图3所示。图4表示利用重组蛋白的抗-HAT抗体的蛋白质印迹分析1D-PAGE，证实23k Da条带为带HIS-标签的-rGtS(333-486)融合蛋白。替代方法是通过利用NdeI限制性酶克隆该基因到省略His-标签序列的pET30+载体中，以产生第一个甲硫氨酸(metionine)。将包括添加末端ATG(编码Met残基)和TAA终止密码子的GtS片段(333-486)的对大肠杆菌的密码子利用优化的DNA序列亚克隆到pET 30+以产生实际上不带标签的GTS片段，由SEQ ID NO：15表示：
ATGAAAAACGCTGATCTGGAAACTATTTTTGAAATGGCAAAACCGTT
TCTGGAAGAAGCAGGTCGTCTGACTGACAAAGCAGAGAAACTGGTT
GAGCTGTACAAACCGCAGATGAAATCTGTTGACGAGATCATTCCGCT
GACTGACCTGTTCTTTTCTGATTTCCCGGAACTGACTGAAGCAGAAC
GTGAAGTAATGACTGGTGAAACTGTTCCGACTGTTCTGGAAGCGTTC
AAAGCTAAACTGGAGGCTATGACCGACGATAAATTCGTCACCGAAAA
CATCTTTCCGCAGATCAAAGCGGTTCAGAAAGAAACCGGTATCAAAG
GCAAAAACCTGTTCATGCCGATTCGTATTGCAGTATCTGGTGAAATGC
ATGGTCCGGAACTGCCGGATACTATCTTTCTGCTGGGTCGTGAGAAAT
CTATCCAGCACATTGAGAACATGCTGAAAGAGATCTCCAAATAA。
产生的多肽片段利用三个步骤纯化：以AmSO4、Q-琼脂糖进行ppt，和在G-200制备性色谱柱上两个循环。由SDS-PAGE检查结果，图5表示从第一循环的G-200制备性柱(重复相似结果的15个柱运行中)收集的三个连续试管获得的不带标签的GtS 333-486片段(sGtS)。
体内模型：
用衍生自血清型4TIGR4菌株序列的合成或重组GtS(333-486)免疫后，用血清型3菌株WU2攻击动物。进行另外的实验以检验这种片段和其它片段针对血清学和遗传学上不同于血清型4菌株TIGR4或血清型3菌株WU2的其它肺炎链球菌菌株的保护能力。
实施例5.用兔抗GtS(333-486)抗血清活体外免疫
用兔抗GtS(333-486)和兔抗GtS稀释血清(1∶5和1∶10)活体外中和200CFU肺炎链球菌菌株3(WU2)1小时，用于攻击7周大的BALB/c雌性小鼠(n＝10)。用从同一只兔获得的免疫前稀释血清(1∶5和1∶10)中和后的200CFU肺炎链球菌菌株3(WU2)攻击阴性对照小鼠(n＝10)。用兔抗非-凝集素血清中和后的200CFU肺炎链球菌菌株3(WU2)攻击阳性对照小鼠(n＝10)。监测存活持续七天。
图5所示的结果证明用1∶5和1∶10抗GtS(333-486)稀释血清处理的小鼠分别存活100％和40％，而1∶5和1∶10的完整抗GtS稀释血清分别证明仅78％和10％存活。
因此证明，兔抗GtS(333-486)血清显著地(p＜0.05)保护小鼠免受肺炎链球菌WU2的腹膜内致命攻击。
实施例6.小鼠模型中rGtS片段对***感染的免疫潜力
对于***性肺炎链球菌致命攻击，对用与佐剂一起配制的rGtS片段和作为对照的仅佐剂免疫的小鼠腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v)接种致命剂量的肺炎链球菌血清型3菌株WU2。确定接种物的量为导致对照小鼠在96-120小时内100％死亡的最低量。每天监测存活。
实施例7.小鼠模型中rGtS片段对上呼吸道致命感染的免疫潜力
对于呼吸道肺炎链球菌致命攻击，将用与佐剂一起的rGtS片段和作为对照的仅佐剂免疫的小鼠用异氟烷麻醉，鼻内接种致命剂量的肺炎链球菌血清型3菌株WU2(25μl PBS中)。确定接种物的量为导致对照小鼠在96-120小时内100％死亡的最低量。每天监测存活。
此外，检验了GtS(333-486)免疫减少肺炎链球菌在鼻咽中的细菌载量并阻止向肺抽吸的能力。
实施例8.GtS片段特异性的抗血清和GtS片段抑制鼻咽和肺定植的能力
为了确定GtS片段是否能够抑制肺炎链球菌定植，在用抗GtS片段抗体活体外处理之前和之后将小鼠鼻内接种肺炎链球菌血清型3。可选地，将浓度从5-40μg变化的GtS片段与肺炎链球菌血清型3菌株WU2细菌混合，将混合物与5×105至5×107个肺炎链球菌一起鼻内接种。接种3、6、24和48小时后，处死小鼠，将切下的鼻咽和肺匀浆，铺板到血液琼脂平板以计数集落数。
实施例9.中耳炎模型
灰鼠(chinchilla)和大鼠中的中耳炎模型(根据Chiavolini等，2008，Clinical Microbiology Reviews，21：666-685；Giebink，G.S.1999，Microb.Drug Resist.，5：57-72；Hermansson等，1988，Am.J.Otolaryngol.9：97-101；和Ryan等，2006，Brain Res.1091：3-8开发)，用于检验根据本发明的GtS片段的有效性。研究了GtS(333-486)保护这些动物在鼻内攻击后不发展中耳炎的能力。
尽管已经具体地描述了本发明，但本领域技术人员将明白，可进行许多改变和修改。因此，本发明不应解释为限制于具体地描述的实施方案，本发明的范围和概念通过参考后附的权利要求书而更容易理解。
Figure IDA0000065947700000011
Figure IDA0000065947700000021
Figure IDA0000065947700000031
Figure IDA0000065947700000041
Figure IDA0000065947700000051
Figure IDA0000065947700000061
Figure IDA0000065947700000071
Figure IDA0000065947700000081
Figure IDA0000065947700000091
Figure IDA0000065947700000101
Figure IDA0000065947700000111
Figure IDA0000065947700000121
Figure IDA0000065947700000131
Figure IDA0000065947700000141
Figure IDA0000065947700000151
Figure IDA0000065947700000161
Figure IDA0000065947700000171
Figure IDA0000065947700000181

Claims (25)

1.一种50-250个氨基酸的合成或重组多肽，所述多肽衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia或S.pneumoniae)谷氨酰tRNA合成酶(GtS)的序列SEQ ID NO：1，包含序列KNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKL(SEQ ID NO：2)，以及其变体和类似物。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由100-200个氨基酸组成。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由130-180个氨基酸组成。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：12共有少于24％的序列同一性。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：12共有少于10％的序列同一性。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含以下序列、以及其变体和类似物：
XKNADLETIFEMAKPFLEELVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTIFLLGREKSIQHIENMLKEISK(SEQ IDNO：3)，其中X是甲硫氨酸或代表多肽的N-末端。
7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含以下序列、以及其变体和类似物：
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDX1FFSDFPELTEAEREVMTX2ETVPTVLEAFKAKLEAMTDDX3FVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTX4FLLGREKSIQHIENX5LKEISK(SEQ ID NO：4)，其中X是甲硫氨酸或代表多肽的N-末端，X1是Leu(L)或Fhe(F)，X2是Gly(G)或Asp(D)，X3是Lys(K)或Glu(E)，X4是Ile(I)或Val(V)，且X5是Met(M)或Ile(I)。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ IDNO：5-SEQ ID NO：10组成的组的序列、以及其变体和类似物：
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKP(SEQ ID NO：5)；
MKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFP(SEQ ID NO：6)；
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAK(SEQ ID NO：7)；
MKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQIKAVQKET(SEQ ID NO：8)；
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSG(SEQ ID NO：9)；和
XKNADLETIFEMAKPFLEEAGRLTDKAEKLVELYKPQMKSVDEIIPLTDLFFSDFPELTEAEREVMTGETVPTVLEAFKAKLEAMTDDKFVTENIFPQIKAVQKETGIKGKNLFMPIRIAVSGEMHGPELPDTIFLLGR(SEQ IDNO：10)，其中X是甲硫氨酸或代表多肽的N-末端。
9.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由选自SEQ IDNO：3-SEQ ID NO：10组成的组的序列组成。
10.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与载体蛋白共轭或融合。
11.一种分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码根据权利要求1-9任一项所述的多肽。
12.根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码选自由SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：10组成的组的多肽序列。
13.根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQID NO：11或SEQ ID NO：15。
14.根据权利要求11所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸由SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：15组成。
15.一种用于针对肺炎链球菌免疫受治疗者的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种根据权利要求1所述的多肽。
16.根据权利要求15所述的疫苗，所述疫苗包含至少两种根据权利要求1所述的多肽。
17.根据权利要求15所述的疫苗组合物，还包含佐剂。
18.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自以下组成的组：油包水乳剂、脂质乳剂和脂质体。
19.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自以下组成的组：明矾、胞壁酰二肽、
Figure FDA0000065947620000032
几丁质微粒、壳聚糖、霍乱毒素B亚基、不稳定毒素、AS21A、和
Figure FDA0000065947620000034
20.一种在受治疗者中引起免疫应答并赋予针对肺炎链球菌的保护的方法，包括向受治疗者施用根据权利要求15-19任一项所述的疫苗组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中施用所述疫苗的途径选自肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、真皮内和经皮递送。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述疫苗组合物肌内施用。
23.根据权利要求1-10任一项所述的多肽，用于针对肺炎链球菌免疫。
24.根据权利要求1-10任一项所述的多肽用于制备用于针对肺炎链球菌免疫的疫苗组合物的用途。
25.根据权利要求11-14任一项所述的分离的多核苷酸用于产生多肽的用途。
CN2009801484409A 2008-12-03 2009-12-03 谷氨酰tRNA合成酶（GtS）片段 Pending CN102239253A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11938308P 2008-12-03 2008-12-03
US61/119,383 2008-12-03
PCT/IL2009/001142 WO2010064243A1 (en) 2008-12-03 2009-12-03 GLUTAMYL tRNA SYNTHETASE (GtS) FRAGMENTS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102239253A true CN102239253A (zh) 2011-11-09

Family

ID=42041695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801484409A Pending CN102239253A (zh) 2008-12-03 2009-12-03 谷氨酰tRNA合成酶（GtS）片段

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20110236470A1 (zh)
EP (1) EP2356225A1 (zh)
JP (1) JP2012510289A (zh)
KR (1) KR20110091560A (zh)
CN (1) CN102239253A (zh)
AU (1) AU2009323682A1 (zh)
BR (1) BRPI0922132A2 (zh)
CA (1) CA2745205A1 (zh)
WO (1) WO2010064243A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103096909A (zh) * 2010-05-04 2013-05-08 Atyr医药公司 与谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120076813A1 (en) * 2008-12-03 2012-03-29 Ben Gurion University Of The Negev Research And De Velopment Authority USES OF GLUTAMYL tRNA SYNTHETASE (GtS) FRAGMENTS
NZ597858A (en) 2009-06-29 2014-01-31 Genocea Biosciences Inc Vaccines and compositions against streptococcus pneumoniae
MX344120B (es) 2011-01-20 2016-12-06 Genocea Biosciences Inc Vacunas y composiciones contra streptococcus pneumoniae.
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
KR20220082558A (ko) * 2020-12-10 2022-06-17 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 면역 증진 활성이 있는 신규 crs 단편 펩타이드 및 이의 용도

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4767842A (en) 1973-05-07 1988-08-30 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4539205A (en) 1982-11-09 1985-09-03 Scripps Clinic And Research Foundation Modulation of animal cellular responses with compositions containing 8-substituted guanine derivatives
US4643992A (en) 1982-11-09 1987-02-17 Scripps Clinic And Research Foundation Modulation of animal cellular responses with compositions containing 8-substituted guanine derivatives
US5093318A (en) 1983-11-01 1992-03-03 Scripps Clinic And Research Foundation Immunostimulating guanosine derivatives and their pharmaceutical compositions
US5011828A (en) 1985-11-15 1991-04-30 Michael Goodman Immunostimulating guanine derivatives, compositions and methods
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5709879A (en) 1990-06-29 1998-01-20 Chiron Corporation Vaccine compositions containing liposomes
DK0761231T3 (da) 1992-06-25 2000-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
KR100310510B1 (ko) 1993-03-23 2002-07-04 장 스테판느 3-0-탈아세틸화모노포스포릴지질a를함유하는백신조성물
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
CO4600681A1 (es) 1996-02-24 1998-05-08 Boehringer Ingelheim Pharma Composicion farmaceutica para la modulacion inmunitaria
GB9607992D0 (en) 1996-04-18 1996-06-19 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5976840A (en) 1997-04-18 1999-11-02 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotides encoding gluS polypeptides of streptococcal pneumoniae
US5958734A (en) 1997-04-18 1999-09-28 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotides encoding gluS polypeptides of streptococcus pneumoniae
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US7063967B2 (en) 1997-05-08 2006-06-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6355257B1 (en) 1997-05-08 2002-03-12 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6080725A (en) 1997-05-20 2000-06-27 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulating and vaccine compositions employing saponin analog adjuvants and uses thereof
NZ500779A (en) 1997-05-20 2001-06-29 Galenica Pharmaceuticals Inc Triterpene saponin analogs having adjuvant and immunostimulatory activity
ES2298316T3 (es) 1997-09-05 2008-05-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas.
ATE215385T1 (de) 1997-12-16 2002-04-15 Chiron Corp Verwendung von mikropartikeln mit submikron öl/wasser emulsionen
CN1296416A (zh) 1998-04-09 2001-05-23 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 佐剂组合物
CN101219217A (zh) 1998-05-07 2008-07-16 科里克萨有限公司 佐剂组合物及其使用方法
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
EP2275126A3 (en) 2002-04-02 2011-04-27 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Protein-based streptococcus pneumoniae vaccines

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103096909A (zh) * 2010-05-04 2013-05-08 Atyr医药公司 与谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
US9062301B2 (en) 2010-05-04 2015-06-23 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-tRNA synthetases
US9574187B2 (en) 2010-05-04 2017-02-21 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-tRNA synthetases
US10160814B2 (en) 2010-05-04 2018-12-25 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-tRNA synthetases

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0922132A2 (pt) 2018-10-23
WO2010064243A1 (en) 2010-06-10
AU2009323682A1 (en) 2010-06-10
KR20110091560A (ko) 2011-08-11
US20110236470A1 (en) 2011-09-29
EP2356225A1 (en) 2011-08-17
JP2012510289A (ja) 2012-05-10
CA2745205A1 (en) 2010-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101580660B1 (ko) 다중체 다중-에피토프 인플루엔자 백신
CN102239253A (zh) 谷氨酰tRNA合成酶（GtS）片段
JP5322718B2 (ja) 腸管出血性大腸菌ワクチン
US8529911B2 (en) Small Streptococcus pyogenes antigens and their use
JP5349070B2 (ja) Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド
WO2009042165A2 (en) Mutant botulinum neurotoxin serotype a polypeptide and uses thereof
AU2015246654B2 (en) Group A streptococcus vaccine
US20120100172A1 (en) Immunogenic streptococcus pneumoniae peptides and peptide-multimers
AU704882B2 (en) Vaccine for nontypable haemophilus influenzae strain
EP2424882A2 (en) Peptides protective against e. faecalis, methods and uses relating thereto
CN104508120A (zh) 编码肝素结合血凝素(hbha)融合蛋白质的重组分枝杆菌和其用途
JP2023503057A (ja) ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン
JP2023503058A (ja) ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン
WO2002040515A2 (en) Exoenzyme toxin of aeromonas salmonicida, and uses thereof
WO2022256427A1 (en) Minicells from highly genome reduced escherichia coli: cytoplasmic and surface expression of recombinant proteins and incorporation in the minicells
CN109942718A (zh) 一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白
Class et al. Patent application title: SYNTHETIC PEPTIDE CONSTRUCTS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF PERIODONTIS ASSOCIATED WITH PORPHYROMONAS GINGIVALIS Inventors: Eric Charles Reynolds (Deepdene, AU) Neil Martin O'Brien-Simpson (Brunswick, AU) Nada Slakeski (Kew East, AU) Assignees: THE UNIVERSITY OF MELBOURNE

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20111109