HU217025B - Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben - Google Patents
Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben Download PDFInfo
- Publication number
- HU217025B HU217025B HU9203146A HUP9203146A HU217025B HU 217025 B HU217025 B HU 217025B HU 9203146 A HU9203146 A HU 9203146A HU P9203146 A HUP9203146 A HU P9203146A HU 217025 B HU217025 B HU 217025B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hcv
- antigen
- domain
- epitope derived
- cvh
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 162
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 158
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 139
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- ASCHNMXUWBEZDM-UHFFFAOYSA-N chloroperoxyl Inorganic materials [O]OCl ASCHNMXUWBEZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 13
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 9
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 9
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 9
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 8
- 101710144117 Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 8
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 7
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- -1 pH 9.0) Chemical compound 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920002620 polyvinyl fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Thermistors And Varistors (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya szilárd mátrix felületén immőbilizált hepatitis Cvírűs- (HCV) antigénkészítmény, amely egy vagy több kémiaiszintézissel vagy rekőmbináns kifejezés útján nyert peptidettartalmaz, HCV elleni antitestek imműnőassay-vel történőmeghatárőzására, amely az alábbi antigéneket tartalmazza: a) egy elsőHCV-antigént, mely a HCV-pőliprőtein C dőménjéből származó epitóppalrendelkezik, és b) legalább egy tővábbi HCV-antigént, melyet az alábbicsőpőrtból választanak ki: i) egy, a HCV-pőliprőtein NS3 dőménjébőlszármazó epitóppal rendelkező HCV-antigén; ii) egy, a HCV-pőliprőteinNS4 dőménjéből származó epitóppal rendelkező HCV- antigén; iii) egy, aHCV-pőliprőtein S dőménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén; iv) egy, a HCV-pőliprőtein NS5 dőménjéből származó epitóppalrendelkező HCV- antigén. ŕ
Description
A jelen találmány hatáskörébe a HCV (korábban nem A, nem B [Non-A, Non-B] néven ismert) meghatározására alkalmas immunoassay-k tartoznak. Részletesebben olyan HCV-antigénkészítmények, melyek az antiHCV-antitestek meghatározására alkalmas immunoassay-k széles skáláját teszik lehetővé.
A régebben nem A, nem B (Non-A, Non-B; NANBH) hepatitis néven ismert betegségről, melyet vírus által okozott betegségnek hittek, kiderült, hogy örökölhető betegség vagy betegségcsoport, és így megkülönböztethető volt a vírusokhoz kapcsolódó májbetegségek más formáitól, beleértve az ismert hepatitisvírusok által okozott betegségektől, azaz a hepatitis A vírustól (HAV), a hepatitis B vírustól (HBV) és a delta-hepatitisvírustól (HDV) éppúgy, mint a citomegalovírus (CMV), vagy az Epstein-Barr-vírus (EBV) által indukált hepatitistől. A NANBH-t először transzíüzióval kezelt egyéneknél azonosították. Az emberről csimpánzra való átvitel és a csimpánzok közötti sorozatos átvitel azt tette nyilvánvalóvá, hogy a NANBH az átvihető fertőző anyag, illetve anyagok hatására jelentkezik. Epidemiológiailag egyértelmű, hogy a NANBH-nak három típusa fordul elő: a víz által átvitt járványos típus; a vér által átvitt, vagy a parenterálisan átvitt típus; és a szórványosan előforduló (társadalmi igények) típus. Ugyanakkor eddig nem sikerült a NANBH-ért felelős átvihető anyagot azonosítani, és a NANBH klinikai diagnosztizálása és azonosítása elsődlegesen más vírusmarkerek fertőzésének kizárásával történt. Az igazinak vélt NANBH-antigének és antitestek detektálására alkalmas eljárások közé tartozik az agargél-diffiizió, a számlálásos immunoelektroforézis (counterimmunoelectrophoresis), az immunofluoreszcencia-mikroszkópia, az immun-elektronmikroszkópia, a radioimmunoassay, és az ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Ugyanakkor ezek közül a mérések közül egy sem bizonyult eléggé érzékenynek, specifikusnak és reprodukálhatónak a NANBH diagnosztikai tesztje céljára.
1987-ben a Chiron Corporation kutatói (a jelen találmány tulajdonosa) azonosították az első nukleinsavat, mely definiálhatóan a vér által átvitt NANB-hez kapcsolódik. Lásd EPO Pub. No. 318.216; Houghton és társai, Science 244: 359 (1989). Az említett publikációk egy izolátumnak az új vírusosztályból, a hepatitis C-ból (HCV) való klónozását ismertetik, az itt bemutatott izolátumprototípust „HCVl”-nek nevezték el. A HCV egy RNS-genommal rendelkező, Flavi-szerű vírus.
A 456.637 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Houghton és társai), melyet itt referenciaként említünk, számos rekombináns HCV-polipeptidnek a HCV cDNS expressziója által történő előállítását, és az említett polipeptidek immunológiai reaktivitásának HCV-vel fertőzött betegek szérumával való ellenőrzését ismerteti. Ez a limitált ellenőrzés azt mutatta, hogy a vizsgált polipeptidek közül legalább öt erősen immunogén volt; ezeket mint 5-1-1, Cl00, C33c, CA279a és CA290a polipeptideket azonosították. Ebből az öt polipeptidből az 5-1-1 az igazinak vélt NS4 doménen helyezkedik el; a Cl00 az igazinak vélt NS3 és NS4 dómén között ível át; a C33c az igazinak vélt NS3 doménben helyezkedik el, míg a CA279a és a CA290a az igazinak vélt C doménban helyezkedik el. Az ellenőrzés eredménye azt mutatta, hogy az összes szérummal nemcsak az egyedülálló polipeptid volt immunológiailag reaktív. így tökéletesített tesztek szükségesek, melyek minden, vagy több, a HCV-pozitív egyénekből származó mintával reagálnak.
A feltalálók további szerológiai vizsgálatokat végeztek a HCV-antigénen, melyek megerősítették, hogy az összes szérummal nemcsak az egyedülálló polipeptid volt immunológiailag reaktív. Ennek az univerzálisan minden HCV-fertőzött szérummal reaktív egyedülálló polipeptidnek a hiánya inter alia a HCV-epitópok törzsről törzsre történő megváltozásának, az egyénről egyénre történő humorális válasz megváltozásának és/vagy a betegség szerológiai állapota megváltozásának tulajdonítható.
Ezek a további tanulmányok az egyedülálló HCVpolipeptidnél jóval hatékonyabban detektálható HCV-antitestek detektálására alkalmas HCV-antigénkészítmények azonosítását tették lehetővé a feltalálók számára.
Ennek megfelelően a találmány tárgya szilárd mátrix felületén immobilizált hepatitis C vírus (HCV) antigénkészítmény egy vagy több kémiai szintézissel vagy rekombináns kifejezés útján nyert pepiidben, HCV-nek immunassay-vel történő meghatározására. A készítmény az alábbi antigéneket tartalmazza:
a) egy első HVC antigént, mely a HVC poliprotein C doméjéből származó epitóppal rendelkezik, és
b) legalább egy további HCV-antigént, melyet az alábbi csoportból választhatunk ki:
i) egy, a HCV-poliprotein NS3 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
ii) egy, a HCV-poliprotein NS4 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
iii) egy, a HCV-poliprotein S doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
iv) egy, a HCV polipropotein NS5 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén.
Olyan körülmények között dolgozunk, melyek lehetővé teszik az antitest-antigén reakciót és a detektálást az említett antitesteknek, illetve az említett antigének immunkomplexe jelenlétében.
A találmány kivitelezése során a találmány egy HCV-antigénkészítményt nyújt, mely az antigénekből álló fúziós fehérje formájában van jelen. Egy másik kivitelezés során az antigének készítménye egyéni antigének formájában van jelen, melyek általánosan egy szilárd mátrixhoz kapcsolódnak. Egy további kivitelezés során az antigének készítménye egyéni antigének elegye formájában van jelen.
A továbbiakban a találmány eljárást nyújt HCV-antitesteknek az említett antitesteket feltehetően tartalmazó emlőstestrészekben való detektálására, ahol az említett testrészeket a fent említett HCV-antigénkészítménnyel hozzuk kapcsolatba, olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik az antitest-antigén reakciót és a detektálást az említett antitestek, illetve az említett antigének immunkomplexe jelenlétében.
A továbbiakban a találmány in vitro eljárást nyújt a
HCV-antitesteknek az említett antitesteket feltehetően
HU 217 025 Β tartalmazó emlóstestkomponensekben való detektálására, ahol az említett testkomponenseket a fenti készítménnyel hozzuk kapcsolatba egyidejűleg, illetve sorozatban, ahol olyan körülmények között dolguzunk, melyek lehetővé teszik az antitest-antigén reakciót és a detektálást az említett antitestek, illetve az említett antigének immunkomplexe jelenlétében.
A továbbiakban a találmány a HCV-antitesteknek az említett antitesteket feltehetően tartalmazó emlőstestrészekben való detektálására alkalmas mérés kivitelezésére nyújt egy kitet, ahol az említett antitestek kiszerelt készítménye az alábbiakat tartalmazza:
a) a HVC antigének említett készítményét,
b) standard kontrollreagenseket, és
c) utasításokat a mérés kivitelezéséhez.
Az 1. ábra a C-DNS-nek a HCV-poliproteinre nézve érzékeny és nem érzékeny (sense, anti-sense) szálának nukleotidszekvenciáját mutatja be, és az érzékeny szál által kódolt aminosavszekvenciát.
A 2. ábra az 1. ábra aminosavszekvenciájának vázlata, mely a HCV-polipeptid igazinak vélt doménjeit mutatja be.
Definíciók
A „HCV-antigén” a legalább öt aminosavból álló polipeptidekre vonatkozik, általánosabban a legalább 8-10 aminosavból álló polipeptidekre, melyek egy, a HCV izolátumon található epitópot definiálnak. Előnyös esetben az epitóp egyenértékű a HCV-vel. Amennyiben az antigént alfanumerikus kóddal jelöljük, a C dómén epitópját is alfanumerikusán adjuk meg.
A „szintetikus” kifejezés egy HCV-antigén jellemzése esetében arra vonatkozik, hogy a HCV-antigén vagy mesterségesen, például kémiai úton, vagy rekombináns szintézissel lett előállítva.
A „domének” azokra a 2. ábrán látható HCV-poliprotein-szegmensekre vonatkoznak, melyek általánosan a HCV igazinak vélt strukturális és nemstrukturális fehérjéinek felelnek meg. A dómén jelölései általában a flavivirális fehérjéknél megnevezett konvencióknak felelnek meg. A doméneknek a 2. ábrán látható elhelyezkedése csak megközelítés. Az „NS” jelzés „nemstrukturális” doménekre vonatkozik, míg az „S” a burokdoméneket jelöli, és a „C” a nukleokapszid vagy a magdoméneket jelöli.
A „fúziós polipeptid” olyan polipeptidre vonatkozik, melyben a HCV-antigén(ek) a természetben elő nem forduló, egyedülálló, folyamatos aminosavlánc része(i). A HCV-antigének peptidkötéseken keresztül közvetlenül kapcsolódhatnak egymáshoz, vagy közbenső szekvenciák által szeparáltak lehetnek. A fúziós polipeptidek a HCV-vel exogén aminosavszekvenciákat is tartalmazhatnak.
Az „általános szilárd mátrix” szilárd test, melyhez az egyéni HCV-antigének, vagy a HCV-antigéneket tartalmazó fúziós polipeptidek kovalensen, vagy - például hidrofób adszorpcióval - nemkovalensen kapcsolódhatnak.
Az „emlőstestkomponensek” (mammalian body component) emlős eredetű (például humán) testfolyadékra vagy -szövetre vonatkozik, mely általában az egyén által termelt antitesteket tartalmazza. Ezek a testkomponensek a szakmában általánosan ismertek, ilyenek például korlátozások nélkül a vér, a plazma, a szérum, a gerincfolyadék, a nyirokfolyadék, a légzőrendszer szekréciós termékei, a bél- vagy a húgy- és ivarszervi traktus, a könnyek, a nyálka, a tej, a fehérvértestek és a mielómák.
Az „immunológiailag reaktív” kifejezés azt jelenti, hogy a szóban forgó antigén a HCV-vel fertőzött egyén szérumában általában szignifikáns mennyiségben jelen levő anti-HCV-antitesttel specifikusan reagál.
Az „immunkomplex” kifejezés azokra az elegyekre, illetve aggregátumokra vonatkozik, melyek az antitestnek az antigén epitópjával való kapcsolódásakor keletkeznek.
A 2. ábra a HCV-polipeptid igazinak vélt doménjeit mutatja be. A készítményben alkalmazott antigének doménjei az alábbiak: C, S (vagy E), NS3, NS4 és NS5. A C dómén feltehetőleg a HCV-fehérje nukleokapszidját definiálja. Ez az 1. ábrán a polipeptid N-terminusától megközelítőleg 120 aminosav távolságig terjeszkedik. Az S dómén feltehetőleg a virion burokfehérjét és a mátrix- (M) fehérjét határozza meg, és az 1. ábrán megközelítőleg a 120. aminosavtól a 400. aminosavig tart. Az NS3 dómén megközelítőleg az 1050. aminosavtól az 1640. aminosavig tart, és feltehetőleg a virális proteázt alkotja. Az NS4 dómén az NS3 terminusától a 2000. aminosavig tart. Az NS4 fehéije funkciója eddig ismeretlen. Végül az NS5 dómén megközelítőleg a 2000. aminosavtól a poliprotein végéig tart, és feltehetőleg a virális polimerázt határozza meg.
Az 1. ábrán látható szekvencia a HCV1 izolátum szekvenciája. A vér által átvitt HCV-től eltérő törzsek szekvenciája várhatóan eltér az 1. ábrán látható szekvenciától, főleg a burok (S) és a nukleokapszid (C) doméneknél. Az ilyen eltérő szekvenciával rendelkező HCV-antigének alkalmazása szintén a jelen találmány tárgykörébe tartozik, de a változás nem gyengíti szignifikánsan az antigén immunológiai reaktivitását a HCVvel fertőzött egyén szérumával szemben.
A teljes vagy megcsonkított doméneket tartalmazó HCV-antigének, a doménfragmentumok antigenicitása a szakmai gyakorlattal rendelkezők számára könnyen ellenőrizhető. A készítményben alkalmazott HCV-antigének előnyös esetben a meghatározott dómén immundomináns részét is tartalmazzák (azaz azt a részt, mely a polipeptid immunológiai reaktivitásáért elsődlegesen felelős). A C dómén esetén előnyös esetben a C doménantigén a dómén teljes szekvenciájának nagy részét tartalmazza. A C22-ként jelölt antigén (lásd 4. példa, lent) különösképpen előnyös. Az S domén-antigénje előnyös esetben tartalmazza a dómén N-terminális végén levő hidrofób szubdomént. Ez a hidrofób szubdomén megközelítőleg a 199. aminosav és a 328. aminosav között helyezkedik el az 1. ábrán. Az S2-vel jelölt HCV-antigén (lásd 3. példa, lent) különösképpen előnyös. A hidrofób szubdomén azonos irányú szekvenciája igény esetén szintén az S domén-antigénjébe tartozik.
Egy előnyben részesített NS3 domén-antigén a C33c jelzéssel ellátott antigén. Ez az antigén az 1. ábrán az
HU 217 025 Β
1192-1457. aminosavakat tartalmazza. Egy előnyben részesített NS4 antigén a C100 jelzéssel ellátott antigén, ami az 1. ábrán a 1569-1931. aminosavakat tartalmazza. Egy előnyben részesített NS5 antigén, ami az 1. ábrán a 2054-2464. aminosavakat tartalmazza.
A HCV-antigén polipeptid formájában fordulhat elő, mely teljes mértékben a HCV-aminosav-szekvenciából áll, vagy a HCV-vel exogén szekvenciát tartalmazhat (azaz exogén szekvenciát tartalmazó fúziós fehéije formájában fordulhat elő). Rekombinánsan előállított HCVantigén esetén az antigén fúziós fehéijeként történő előállítása, mint például SÓD, α-faktor, vagy ubiquitin (lásd a 4.751.180, a 4.870.008 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, melyek ismertetik a SÓD, az α-faktor és az ubiquitin fúziós fehérjék expresszióját) fokozhatja az antigén expressziójának mértékét és/vagy fokozhatja az antigén vízoldhatóságát. A fúziós fehérjék, például az α-faktor vagy az ubiquitin fúziója a gazda expressziója által történik, melynek során az eltávolítja a heterológ szekvenciát. Az α-faktor egy szekréciós rendszer, míg az ubiquitin a citoplazmában marad.
Az antigénkészítmények előállítása továbbá fúziós fehéijeként is történhet. így például a C22-t és a C33c-t kódoló folyamatos DNS-fragmentum megszerkesztése egy expressziós vektorba klónozással történhet, és a C22 és C33c fúziós fehérje expresszálására alkalmazható. Hasonló módon hozhatjuk létre a Cl00-ból származó C22 fúziós fehérjét; az S2-ből származó C22-t; a C22 és egy NS5 antigént; a C22-t, a C33c-t és az S2-t; a C22-t, a ClOO-at és az S2-t; a C22-t, a C33c-t, a ClOO-at és az S2-t. A bemutatott domének alternatív fragmentumait is alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti HCV-antigének előállítása előnyös esetben rekombináns úton, vagy jól ismert szilárd fázisú kémiai eljárással történhet. Ugyanakkor az antigének a disszociált HCV-ből vagy HCV-részecskékből affinitáskromatográfiával izolált antitestekkel szemben termeltek is lehetnek.
Amennyiben az előállítás rekombináns technikával történik, a standard eljárások során az antigént kódoló cDNS megszerkesztése, a DNS expressziós vektorba klónozása, a gazdasejt - például a baktérium - transzformálása és az ilyen, az antigént termelő DNS expresszálása alkalmazható. Amint fent említettük, kívánatos lehet az antigén fúziós fehérjeként történő expresszálása, így az expresszió fokozható, a tisztítás megkönnyíthető és az oldhatóság fokozható. A HCV-antigének előállítására alkalmas eljárásokat az alábbi példákban és a 456.637 sorozatszámú szabadalmi sorozatban ismertetjük.
A HCV-antigéneket két vagy több antigénből álló fúziós fehéije formájában történő elegyítéssel, általános szilárd mátrixon egyéni immobilizálással vagy fizikai keveréssel elegyíthetjük. Az antigén fúziós fehérjéit szintén a szilárd mátrixon (hozzákötéssel) immobilizálhatjuk. A fehérjéknek a szilárd mátrixhoz kovalensen, illetve nem kovalensen való hozzákapcsolása céljából alkalmazható eljárások és módszerek a szakmában jól ismert eljárások. A szilárd felület természete a mérés formátuma szerint változik. A mikrotiterlyukakban végzett mérés során a szilárd felület a lyuk fala vagy teteje lehet. A gyöngyöket alkalmazó mérés során a szilárd felület a gyöngyök felszíne lesz. A „dipstick”-et alkalmazó mérések során (azaz amikor a szilárd testet pórusos vagy szálas anyagból, például szövetből vagy papírból állítjuk elő) a felszín annak az anyagnak a felülete lesz, melyből a „dipstick”-et készítettük. Az agglutinációs mérések során a szilárd felület a latex- vagy a zselatinrészecskék felszíne lesz. Amennyiben a mátrixhoz egyéni antigéneket kötünk, azok a felületen homogénen szétoszolhatnak, illetve valamilyen minta szerint, így például sávokban, ami megkönnyíti az antigénkötések észrevételét.
Az egyszerű antigénelegyek az antigént megfelelő oldószerben vagy diszpergálóközegben tartalmazzák.
A HCV-antigéneket gyakorlatilag olyan mérésekben alkalmazhatjuk, melyek egy ismert antigént alkalmaznak az antitestek detektálására. Ezeknek a méréseknek általános jellemzője az, hogy az antigént a HCVantitesteket feltehetően tartalmazó emlőstestkomponensekkel hozzuk kapcsolatba, olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik, hogy az antigén valamely ilyen, a testkomponensben jelen levő antitesthez kapcsolódjon. Ezek a körülmények a fiziológiai hőmérséklet, a pH és az antigénfelesleget alkalmazó ionerősség. Az antigénnek a mintával történő inkubálását az antigént tartalmazó immunkomplex detektálása követi.
Az immunoassay-k tervezése során számos változtatás léphet fel, és a szakmában számos változat ismert, így például szilárd támasztékot alkalmazó, illetve immunocsapadék-képzéses eljárást alkalmazhatunk. A legtöbb mérés jelzett antitestet vagy polipeptidet alkalmaz; a jelzés enzimes, fluoreszcens, kemilumineszcens, radioaktív vagy festékmolekula lehet. Olyan mérések is ismeretesek, melyek biotint, avidint alkalmaznak, vagy enzimmel jelzett és közvetített immunoassay-k, mint például az ELISA.
Az immunoassay kivitelezése, korlátozások nélkül, homogén vagy heterogén formában történhet, standard vagy kompetitív módon. A heterogén formánál a polipeptidet szilárd mátrixhoz vagy támasztékhoz kapcsoljuk, ami megkönnyíti az inkubálás után a mintának a polipeptidtől történő elválasztását. A szilárd támasztékok nitro-cellulóz (azaz membrán- vagy mikrotiterlyukforma), poli(vinil-klorid) (azaz ívek vagy mikrotiterlyukak), polisztirén-latex (azaz gyöngyök vagy mikrotiterlemezek), poli(vinil-fluorid) („Immulon” néven ismert), diazotált papír, nejlonmembránok, aktivált gyöngyök és Protein A gyöngyök lehetnek. így például a heterogén formáknál Dynatech Immulon™ 1 vagy Immulon™ 2 mikrotiterlemezeket, vagy 0,25 inch átmérőjű polisztirolgyöngyöket (Precision Plastic Ball) alkalmazhatunk. Az antigenikus polipeptideket tartalmazó szilárd támaszték mosása általában a vizsgálandó minta eltávolítása és a kötött antitestek eltávolítása után történik. A szakmában mind a standard, mind a kompetitív forma általánosan ismert.
Homogén forma esetén a vizsgálandó mintát az antigénkészítmény oldatával inkubáljuk. Például olyan körülményeket alkalmazhatunk, melyek mellett a képződő
HU 217 025 Β antigén-antitest komplex kicsapódik. Ezeknél a méréseknél a szakmában mind a standard, mind a kompetitív forma általánosan ismert.
A standard forma esetén az antigén-antitest komplexet képző HCV-antitestek mennyiségét közvetlenül ellenőrizzük. Ezt az anti-HCV-antitestek epitópját felismerő, jelzett antixenogenikus (például antihumán) antitestek meghatározásával végezhetjük, melyek felismerik az anti-HCV-antitesteknek a komplexképződés következtében kapcsolódott epitópját. A kompetitív forma esetén a mintában levő HCV-antitestek mennyiségére a komplexben levő, ismert mennyiségű, jelzett antitest (vagy egyéb kompetitív ligandum) kötésének kompetitív hatásából következtetünk.
Az anti-HCV-antitestet (vagy kompetitív mérés esetén a kompetitív antitestet) tartalmazó komplexek képződését a formától függően számos jól ismert eljárással detektálhatjuk. így például a komplexben lévő, nem jelzett HCV-antitesteket antixenogenikus Ig-konjugátum alkalmazásával detektálhatjuk, mely egy jelzéssel (azaz egy enzimjelzéssel) képzett komplex.
Immunocsapadék-képzéses vagy agglutinációs mérés esetén a HCV-antigének és -antitestek közötti reakció során háló keletkezik, ami az elegyből vagy a szuszpenzióból kicsapódik, és így látható csapadékréteg vagy -film képződik. Amennyiben anti-HCV-antitest nincs jelen a vizsgálandó mintában, nem képződik látható csapadék.
Az említett immunoassay-k céljára a HCV-antigének kiszerelése kitekben történik. A kit általában különálló edényekben tartalmazza az antigének készítményét (vagy mindegyiket szilárd mátrixhoz kötve, vagy szeparálva azokkal a reagensekkel, melyek azoknak a mátrixhoz kötődését segítik), a kontroll antitestkészítmény (pozitív és/vagy negatív), amennyiben a méréshez azonos és jelképző reagensek szükségesek, és a jelzés közvetlen jelt nem hoz létre, jelzett antitesteket (azaz enzimszubsztrátot). A mérés kivitelezéséhez szükséges utasítások (azaz leírások, magnetofonszalag, VCR, CDROM stb.) szintén a kithez tartoznak.
Az alábbi példák a találmányt szemléltetik minden korlátozás nélkül. A pl, p35 és p99 peptideket az EP 90125342 számú leírás, a CA 290a peptidet a WO 90/11089 számú irat ismerteti.
1. példa: A C33c HCV-antigén szintézise
A C33c HCV-antigén az NS3 dómén szekvenciáját tartalmazza. Ez speciálisan az 1. ábrán látható 1192-1457. aminosavakat tartalmazza. Az antigént baktériumban állítottuk elő, fúziós fehéije formájában, humán szuperoxid-diszmutáz (SÓD) alkalmazásával, az alábbiak szerint. A pSODcfl vektort [Steiner és társai (1986), J. Virol. 58:9] EcoRI és BamHI alkalmazásával tártuk fel, és a keletkezett EcoRI, BamHI fragmentumot az alábbi linkerhez ligáltuk, melynek eredményeképpen pcflEF keletkezett:
GATC CTG GAA TTC TGA TAA
GAC CTT AAG ACT ATT TTA A
A 1192-1457. aminosavakat kódoló és EcoRI végeket tartalmazó cDNS-klónt pcflEF-be illesztettük, így pcflEF/C33c-t kaptunk. Az expressziós szerkezetet D1210 E. coli sejtekbe transzformáltuk.
A transzformátumokat egy fúziós fehéije expreszszálására használtuk, ami keretben (in frame) az N-terminusán SOD-ot, és a C-terminusán C33c antigént tartalmazott. Az expresszálás ampicillint (100 pg/ml) tartalmazó, 1500 ml mennyiségű Luria táptalajon (Luria broth) történt, a transzformáns 15 ml mennyiségű, egyéjszakás tenyészetével. A sejtek 0,3 O. D.-ig növekedtek, 2 mM végső koncentráció eléréséig IPTG-t adtunk hozzá, és a tenyésztést addig folytattuk, míg a sejtek az 1 O. D.-t elérték, ezután 3000 xg mellett, 4 °C-on, 20 perces centrifugálással összegyűjtöttük a sejteket. A kiszerelt sejteket -80 °C-on több hónapig tároltuk.
A SOD-C33c polipeptid megtisztítása céljából a baktériumsejteket, melyekben a polipeptidet expreszszáltuk, ozmotikus hatásnak vagy mechanikai feltárásnak vetettük alá, a SOD-C33c-t tartalmazó oldhatatlan frakciót izoláltuk, alkalikus foszfatázzal differenciálóextrakciónak vetettük alá, és az extraktumban levő fúziós fehéijét S-Sepharose és Q-Sepharose oszlopokon kromatográfiásan tisztítottuk.
Az ozmotikus hatásnak vagy mechanikai feltárásnak eredményeképpen kapott nyersextraktumot az alábbi eljárással dolgoztuk fel. A kiszerelt sejtek egy grammját 10 ml mennyiségű, 0,02 M Tris-HCl-t, pH 7,5, 10 mM EDTA-t és 20% szukrózt tartalmazó oldatban felszuszpendáltuk, és 10 percig jégen inkubáltuk. Ezután a sejteket 4000xg mellett, 4 °C-on, 15 perces centrifugálással pelletizáltuk. A felülúszó eltávolítása után a sejtpelletet 10 ml Al pufferben (0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mM β-merkapto-etanol [BME]) felszuszpendáltuk, és 10 percig jégen inkubáltuk. A sejteket 4000xg mellett, 4 °C-on, 15 perces centrifugálással ismét pelletizáltuk. A tiszta felülúszó (I. periplazmikus frakció) eltávolítása után a sejtpelletet Al pufferben felszuszpendáltuk, 10 percig jégen inkubáltuk, majd 4000xg mellett, 4 °C-on, 15 perces centrifugálással ismét pelletizáltuk. A tiszta felülúszó (II. periplazmikus frakció) eltávolítása után a sejtpelletet A2 pufferben (0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mM BME, 1 mM PMSF) felszuszpendáltuk. A sejtek feltárása céljából a szuszpenziót (5 ml) 7,5 ml Dyno-mill ólommentes savval mosott üveggyöngyökre (átmérő 0,10-0,15 mm) (beszerezve a Glen-Mills, Inc. cégtől) vittük Falcon-csőben, és két percig a legnagyobb sebességgel kevertük, majd legalább két percig jégen hűtöttük; a keveréses-hűtéses eljárást további négyszer megismételtük. A keverés után kapott szuszpenziót kis erősséggel üvegtölcséren szűrtük át; az üveggyöngyöket A2 pufferrel kétszer átmostuk, majd a szűrletet és a mosófolyadékot elegyítettük.
A nyersextraktum oldhatatlan frakcióját 4000xg mellett, 4 °C-on, 15 perces centrifugálással összegyűjtöttük, 10 ml mennyiségű A2 pufferrel kétszer mostuk, és 5 ml mennyiségű MILLI-Q vízzel felszuszpendáltuk.
A SOD-C33c-t tartalmazó frakciót NaOH-nak (2 M) és NaCl-nek (2 M) a szuszpenzióhoz történő hozzáadásával, úgy, hogy mindegyiknek 20 mM volt a végső koncentrációja, elválasztottuk az oldhatatlan
HU 217 025 Β anyagtól, az elegyet 1 percig kevertük, 20 000xg mellett, 4 °C-on, 20 percig centrifugáltuk, és a felülúszót visszatartottuk.
A SOD-C33c S-Sepharose oszlopon történő megtisztítása céljából a felülúszó frakciót 6 M urea, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 14 mM BME és 1 mM EDTA végső koncentrációra állítottuk be. Ezt a frakciót vittük fel a S-Sepharose Fást Flow (1,5 χ 10 cm) oszlopra, melyet B pufferrel (0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 14 mM BME és 1 mM EDTA) ekvilibráltunk. A minta felvitele után az oszlopot két oszloptérfogatnyi B pufferrel mostuk. Az átfolyó és a mosófrakciókat összegyűjtöttük. A felvitel és a mosás során 1 ml/perc folyadékrátát alkalmaztunk; az összegyűjtött frakciók térfogata 1 ml volt. A SODC33c-t tartalmazó frakciók azonosítása céljából aliquot frakciókat analizáltunk gélelektroforézissel, SDS-t tartalmazó 10%-os poliakrilamid gélen, majd Coomassie kékkel festettük azt. A frakciók Western biot eljárással is analizálhatók, közvetlenül a SÓD ellen termelt antitestek alkalmazásával. A SOD-C33c-t tartalmazó frakciókat pooloztuk.
A SOD-C33c további tisztítása Q-Sepharose oszlopon (1,5x5 cm) történt, melyet B pufferrel ekvilibráltunk. A poolozott, SOD-C33c-t tartalmazó frakciókat, melyeket az S-Sepharose oszlopon végzett kromatográfia eredményeként kaptunk, felvittük az oszlopra. Az oszlopot ezután B pufferrel mostuk, és 60 ml mennyiségű 0,0-0,4 M NaCl B pufferben levő oldatával eluáltuk. A felvitel, a mosás és az elúció során 1 ml/perc folyadékrátát alkalmaztunk; az összegyűjtött frakciók térfogata 1 ml volt. Minden, a Q-Sepharose oszlopon kapott frakciót az S-Sepharose oszlopnál ismertetett eljárás szerint analizáltunk. Az oszlopon eluált SOD-C33c csúcsot 0,2 M NaCl-nél kaptuk.
A Q-Sepharose oszlopon kapott SOD-C33c tisztasága 90% felett volt, amit a poliakrilamid gélek és a humán SÓD ellen termelt monoklonális antitesteket alkalmazó immunobiot eljárások is alátámasztottak.
2. példa: A HCV Cl00 antigén szintézise
A HCV C100 antigén az NS3 és az NS4 doménekből származó szekvenciákat tartalmazza. Az 1. ábrán a 1569-1931. aminosavakat tartalmazza. Ezt az antigént élesztőben termeltük. A fenti aminosavakat kódoló 1270 bp-ból álló, EcoRI terminussal rendelkező cDNSffagmentumot előállítottuk.
Az élesztő expressziós vektor megszerkesztése, melynek során ezt a fragmentumot közvetlenül a S.
cerevisiae ADH2/GAP promoterbe fuzionáltuk, egy olyan eljárás során történt, ami a C100 szekvencia PCReljárással történő amplifikációjából áll. A klónozás után a C100 szekvenciát kivágtuk, és egy, az ADH2/GAP promotert tartalmazó szekvenciával ligáltuk az élesztő15 vektor nagyobb fragmentumához.
A C100 PCR-amplifikációja során vektorként Ps3-56cl00m vektort alkalmaztunk, melyet Sall-es feltárással linearizáltunk. A pS3-56 egy pBR322— származék, ami a humán szuperoxid-diszmutáz-gén
ADH2/GAPDH hibrid élesztőpromoter ellentétesen haladó ágát tartalmazó expressziós kazettát, valamint egy azonos irányban haladó a-faktor transzkripciós terminátort tartalmaz.
Az amplifikáció céljából alkalmazott oligonukleotid primereket az expressziós vektorba való klónozás megkönnyítésére és egy transzlációs terminátorkodon beviteléhez terveztük. Az új 5’-HindlII és 3’-Sáli helyek előállítása a PCR-oligonukleotidokkal történt. A Sáli helyeket tartalmazó oligonukleotidok tehát a kettős terminátorkodont kódolják, ami a következő: TAA és TGA. A HindlII helyeket tartalmazó oligonukleotidok tehát egy, a pgap63 génből származó, le nem fordított szekvenciát tartalmaznak, ami az AUG kodonnal közvetlenül ellentétes irányban helyezkedik el.
A pEco63GAPDH gént Holland és Holland (1980), valmint Kniskem és társai (1986) ismertetik. A C100 közvetlen expressziója céljából az alábbi PCR-primereket alkalmaztuk:
’5 GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGC CTC ACT TTC TAT CCC AGA CAA AGC AGA GT 3’ és ’5 GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3’.
A PCR-amplifikáció céljából alkalmazott primerek és templátok a Cetus-Perkin-Elmer PCR-kitből származtak, az eljárást a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre. A PCR-t 29 ciklusban, 94 °C-on egy perc alatt, 37 °C-on két perc alatt, és 72 °C-on tíz perc alatt hajtottuk végre; a végső inkubálás 72 °C-on tíz percig tartott. A DNS-t -4 °C-on vagy -20 °C-on egy éjszakán keresztül tároltuk.
Az amplifikáció után a PCR-terméket HindlII és Sáli alkalmzásával tártuk fel. Az 1,1 kb méretű főterméket gélelektroforézissel tisztítottuk meg, és az eluált tisztított terméket egy, a pBR322-ből származó nagy Sall-HindlII fragmentummal ligáltuk. A megfelelő rekombinánsok izolálása céljából kompetens HB101 sej50 teket transzformáltunk a rekombináns vektorokkal, és a klónozás után a klónból kivágott Sall-HindlII fragmentumok előre várt mérete alapján azonosítottuk a kívánt rekombinánsokat. A kiónok egyikét, mely a megfelelő mérettel rendelkező Sall-HindlII fragmentumot tartalmazta, pBR322/C100d-nek neveztük el. Azt, hogy ez a klón az amplifikált ClOO-at tartalmazta, a Sall-Híndül fragmentum közvetlen szekvenciaanalízisével erősítettük meg.
A ClOO-at tartalmazó expressziós vektort a pBR322/C 100 d-ből származó Sall-HindlII fragmentumot egy 13,1 kb méretű, a pBS24.1 BamHI-Sall ffagentumhoz, és egy, az ADH2/GAP promotert tartalmazó 1369 bm BamHI-HindlII fragmentumhoz ligáltuk.
HU 217 025 Β (Az utóbbi fragmentumot az EPO 164.566 ismerteti.) A pBS24.1 vektort az U. S. S. N. 382.805 számú leírás ismerteti (1989. július 19.) Az ADH2/GAP promotert a vektor pPGAP/AG/HindlII HindllI és BamHI alkalmazásával történő feltárásával és a 1369 bp méretű fragmentum gélen történő tisztításával kaptuk.
A kompetens HB101 sejteket transzformáltuk a rekombináns vektorokkal; a megfelelő rekombinánst egy 2464 bp méretű fragmentum és egy 13,1 bp méretű fragmentum létrehozásával azonosítottuk, melyeket a klónozott vektor BamHI és Sáli alkalmazásával történő feltárásával kaptunk. A megfelelő klónozott rekombináns vektorok egyikét pClOO d#3-nak neveztük el.
A Cl00 expresszálása céljából a Saccharomyces cerevisiae AB122 (MATa leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl-407[cir-0]) kompetens sejtjeit a pC100 #3 expressziós vektorral transzformáltuk. A transzformált sejteket URA-szorbitolra vittük, és az egyes transzformánsokat csíkok formájában Leu lemezekre vittük fel.
Az egyes ki ónokat Leu , ura közegben tenyésztettük, 2% glükóz jelenlétében, 30 °C-on, 24-36 óráig. 2% glükózt tartalmazó, egy liter mennyiségű Yeast Extráét Peptone Médiumot (élesztőextraktumos pepton tápközeg) 10 ml egyéjszakás tenyészettel inokuláltunk, és a kapott tenyészetet 30 °C-on, 400 rpm keverési ráta és 1 1 levegő/1 1 közeg/perc (azaz lvvm) levegőráta mellett 48 órán keresztül hagytuk növekedni. A fermentor pH-ját nem ellenőriztük. A tenyészetet a New Brunswick Science Corp. által gyártott BioFlo II fermentorban tenyésztettük. A fermentáció után a sejteket izoláltuk, és Cl00 expressziójukat meghatároztuk.
Az expresszált Cl00 polipeptid analízisét a transzformáit sejtekkel végeztük, teljes sejtlizátumon, és a nyersextraktumokat különálló élesztőtelepekről nyertük, melyeket a Leu lemezekről kaptunk. A sejtbzátumot és a nyersextraktumot SDS poliakrilamid gélen gélelektroforézissel és Western biot eljárással vizsgáltuk meg. A Western biot eljárást élesztőben expresszált SODC100 polipeptiddel szemben termelt nyúl-poliklonálisantitestekkel hajtottuk végre. A C100 polipeptid előre várt mérete 364 aminosav volt. Az expresszált polipeptidek a gélelektroforézis alapján MWr 39,9 K értékkel rendelkeztek.
Minden bemutatott analitikai eljárás azt bizonyítja, hogy az expresszált Cl00 polipeptid a teljes sejtlizá15 tumban jelen volt, míg a nyersextraktumból hiányzott. Az eredmények szerint az expresszált Cl00 polipeptid feltehetőleg oldhatatlan.
3. példa: A HCVS2 antigén expressziója
A HCV S2 antigén az S dómén hidrofób N-terminusa szekvenciáját tartalmazza. Ez az 1. ábrán a 199-328. aminosav.
Az S2 polipeptidet kódoló expressziós vektor létrehozásának eljárása és élesztőben való expressziója hasonló volt a C100 polipeptid expressziójának 2. példában ismertetett eljárásával.
A PCR-reakció templátja a pBR322/Pil4a vektor volt, amit HindlII-al végzett feltárással linearizáltunk. A Pil4a a 199-328. aminosavakat kódoló cDNSklón.
Az S2-t kódoló szekvencia PCR-amplifíkációja során primerként alkalmazott oligonukleotidok szekvenciája az alábbi volt.
Az S2 szekvencia 5’-régiójára:
5’ GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT
ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3’ az S2 szekvencia 3’-régiójára:
’5 GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC
ATC ATC ATA TCC CAT GCC AT 3’.
Az 5’-terület primerje egy HindllI helyet és egy ATG startkodont visz be az amplifikált termékbe. A 3’terület primerje egy transzlációs stopkodont és egy Sáli helyet visz be az amplifikált termékbe.
A PCR-t 29 ciklusban, 94 °C-on egy perc alatt, 37 °C-on két perc alatt, és 72 °C-on tíz perc alatt hajtottuk végre; a végső inkubálás 72 °C-on tíz percig tartott.
A PCR-reakció fő terméke egy 413 bp-ból álló fragmentum volt, melyet gélen tisztítottunk meg. A tisztított fragmentumot egy, a HindllI és a Sáli fragmentummal feltárt, a pBR322-ből származó nagyobb fragmentumhoz ligáltuk, így kaptuk a pBR322/S2d plazmidot.
A 413 bp méretű HindlII-Sall S2 fragmentumnak az ADH2/GAP promotert tartalmazó 1,36 bp méretű BamHI-HindlII fragmentummal és a pBS24,l élesztővektor nagyméretű BamHI-Sáli fragmentumával történő ligálása eredményeképpen rekombináns vektorokat 45 kaptunk, melyeket klónoztunk. A megfelelő rekombináns vektorokat a BamHI-el és a Sall-el történő feltárás után egy 1,7 kb fragmentum jelenlétével azonosítottuk.
Egy, az amplifikált szekvenciából létrehozott expressziós vektort, és egy, közvetlenül az ADH2/GAP promoterbe fuzionált S2-t kódoló szekvenciát azonosítottunk mint pS2d#9.
4. példa: A HCVC antigén szintézise
A HCV C22 antigén a C doménről származik. Ez az
1. ábrán az 1 -122. aminosav.
A C polipeptidet kódoló expressziós vektor létrehozásának eljárása és élesztőben való expressziója az alábbi eltéréseken kívül hasonló volt a C100 polipeptid expresszíójának a 2. példában ismertetett eljárá60 sával.
HU 217 025 Β
A PCR-reakció templátja a pBR322/Ag30a vektor volt, amit HindlII-mal végzett feltárással linearizáltunk. Az Ag30a az 1-122. aminosavakat kódoló cDNS-klón.
A C szekvencia 5’-régiójára:
5’ GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA ATC CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC : és
A C szekvencia 3’-régiójára:
’5 GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3’.
Az 5’-terület primerje egy HindlII helyet visz be az amplifikált termékbe, míg a 3’-terület primerje egy 15 transzlációs stopkodont és egy Sáli helyet visz be az amplifikált termékbe. A PCR-t 29 ciklusban, 94 °C-on egy perc alatt, 37 °C-on két perc alatt, és 72 °C-on tízperc alatt hajtottuk végre; a végső inkubálás 72 °C-on tíz percig tartott. 20
A PCR-reakció fő terméke egy 381 bp-ból álló fragmentum volt. Ennek a fragmentumnak a pBR322 nagy Sall-HindlII fragmentummal történő ligálása a pBR322/C2 plazmidot eredményezte.
A 381 bp méretű HindlII-Sall C-nek, mely a 25 pBR322/C2-ből kivágott fragmentumot kódolja, az ADH2/GAP promotert tartalmazó, 1,36 bp méretű BamHI-HindlII fragmentummal és a pBS24.1 élesztővektor nagyméretű BamHI-Sall fragmentumával történő ligálása eredményeképpen rekombináns vektorokat 30 kaptunk, melyeket klónoztunk. A megfelelő rekombináns vektorokat a BamHI-gyel és a Sall-gyel való feltárás után egy 1,74 kb fragmentum jelenlétével azonosítottuk. Egy, az amplifikált szekvenciából létrehozott expressziós vektort és egy, közvetlenül az ADH2/GAP 35 promoterbe fuzionált C-t kódoló szekvenciát azonosítottunk mint pC22.
Az expresszált C polipeptid analízisét a transzformált sejtekkel végeztük, teljes sejtlizátumon, és a nyersextraktumokat különálló élesztőtelepekről nyertük, melye- 40 két a Leu lemezekről kaptunk. A sejtlizátumot és a nyersextraktumot SDS poliakrilamid gélen gélelektroforézissel vizsgáltuk meg. A C polipeptid előre várt mérete 122 aminosav volt. Az expresszált polipeptidek a gélelektroforézis alapján MWr 13,6 Kd értékkel rendelkeztek. 45
5. példa: Az NS5 polipeptid szintézise
Ez a polipeptid az NS5 dómén N-terminusának szekvenciáját tartalmazza. Az NS5 polipeptidet kódoló expressziós vektor létrehozásának eljárása és expresz- 50 sziója az alábbi eltéréseken kívül hasonló volt a C33c polipeptid expressziójának az 1. példában ismertetett eljárásával.
6. példa: Radioimmunoassay (RIA) a HCV-antitestekre 55
Az 1 -5. példában említett HCV-antigéneket RIA-eljárással vizsgáltuk, így detektáltuk a klinikailag HCVbetegnek diagnosztizált (nem A, nem B [Non-A, NonB]) egyének szérumában és fizetett vérdonorok szérumában a HCV ellen termelt antitesteket. 60
A C-t kódoló szekvencia PCR-amplifíkációja során primerként alkalmazott oligonukleotidok szekvenciája az alábbi volt.
GCA CGA
AAA TTG CGC
A RIA Tsu és Herzenberg (1980) eljárásán alapul; Selected Methods in Cellular Immunology (W. H. Freeman & Co.), pp. 373-391. Az eljárás lényege az alábbi. Mikrotiterlemezeket tisztított HCV-antigénnel vonunk be (coating). A bevont lemezeket a szérummintával vagy megfelelő kontrollal inkubáljuk. Az inkubálás alatt az antitestek, amennyiben jelen vannak a rendszerben, immunológiailag hozzákötődnek a szilárd fázisú antigénhez. A nem kötött anyag eltávolítása és a mikrotiterlemezek mosása után a humán antitest-NANBV antigénkomplexeket 125I-jelzett birkaanti-humán immunoglobulinnal történő inkubálással detektáljuk. A nem kötött jelzett antitesteket leszívással távolítjuk el, és a lemezeket mossuk. Az egyes lyukakban meghatározzuk a radioaktivitást; a kötött humán anti-HCV-antitestek mennyisége arányos a lyukakban mért radioaktivitás-értékekkel.
Részletesen az eljárást az alábbi módon hajtjuk végre. 100 μΐ mennyiségű, 0,125 M Na-borát-pufferben, pH 8,3 és 0,075 M NaCl-ben (BBS) 0,1-0,5 pg HCV-antigént tartalmazó aliquot mennyiségeket viszünk az egyes lyukakba a mikrotiterlemezekre (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips). A lemezt egy éjszakán keresztül 4 °C-on nedves kamrában inkubáljuk, az antigénoldatot eltávolítjuk, és a lyukakat 3szor 0,02% Triton Χ-100-at tartalmazó BBS-sel mossuk. A nemspecifikus kötések megakadályozása céljából a lyukakat szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) vonjuk be, 100 μΐ 5 mg/ml koncentrációjú BSA BBSben készített elegyének a bevitelével, majd a lemezeket egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk; az inkubálás után a BSA-oldatot eltávolítjuk. A bevont lyukakban levő antigének a szérummal reagálnak a 100 μΐ mennyiségű, 1:100 hígítású, 10 mg/ml BSA-t tartalmazó, 0,01 M Na-foszfát-pufferben, pH 7,2, 0,15 M NaCl-ben készült szérummintákkal a szérumot tartalmazó lyukak 1 órás, 37 °C-on történő inkubálása alatt. Az inkubálás után a szérummintákat leszívással eltávolítjuk, és a lyukakat BBST-vel ötször mossuk. Az antigénhez kötött antitestek mennyiségét 125I-jelzett F’(ab)2 birka-anti-humán IgG-nek a bevont lyukakhoz kötődése által határozzuk meg. Az egyes lyukakhoz hozzáadjuk a jelzett anyag 100 μΐ-es aliquot mennyiségeit (fajlagos aktivitás 5-20 pCi/pg), a lemezeket 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk, és az anyagfelesleget leszívással távolítjuk el, majd a lemezt BBST-vel ötször mossuk. Az egyes lyukakban
HU 217 025 Β kötött radioaktivitás mértékét τ-sugárzást detektáló számlálóval határozzuk meg.
Az 1. táblázat a HCV-fertőzöttnek diagnosztizált egyének szérumának vizsgálati eredményeit mutatja be.
1. táblázat
| Beteg | Antigén | ||||
| S2 | C22 | C100 | C33c | NS5 | |
| CVH IVDA | P | P | P(+ ++) | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P(+) | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P(+) | P | P |
| CVH NOS | P | P | P | P | P |
| AVH NOS HS | N | N | N | N | N |
| AVH NOS HS | P | N | N | N | N |
| AVH NOS HS | P | N | N | N | N |
| AVH NOS HS | P/N | N | N | N | N |
| AVH PTVH | N | N | N | P/N | N |
| AVH NOS HS | N | N | N | N | N |
| AVH NOS | N | N | N | N | P |
| AVH PTVH | N | N | N | N | N |
| AVH IVDA | N | P | N | P | P |
| AVH PTVH | P | P/N | N | N | P |
| AVH NOS | N | P | N | N | N |
| AVH IVDA | N | P | N | P | P |
| AVH NOS HS | P/N | N | N | N | N |
| AVH PTVH | N | N | N | N | N |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| AVH NOS HS | N | N | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | N | N | N |
| AVH PTVH | P | N | P(+) | P(+ + +) | N |
| CVH PTVH | N | P | P | P | P |
| CVH NOS HS | P | P | P | P | N |
| CVH NOS | N | P | P/N | P | P |
| CVH IVDA | N | N | N | P | N |
| AVH IVDA | P | P | P | P | P |
| AVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| AVH IVDA | P/N | P | N | P | P |
| AVN IVDA | N | P | P | P | N |
| CVH PTVH | P | P/N | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| AVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| AVH PTVH? | N | P | P | P | P |
| AVH IVDA | N | P | N | P | N |
| AVH NOS | N | N | N | N | N |
HU 217 025 Β
1. táblázat (folytatás)
| Beteg | Antigén | ||||
| S2 | C22 | C100 | C33c | NS5 | |
| AVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH NOS | N | P | N | N | P |
| CVH NOS | P | P | N | N | N |
| CVH NOS HS | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | N | P | P |
| AVH nurse | P | P | N | N | N |
| AVH IVDA | P | P | P | P | N |
| AVH IVDA | N | P | P(+) | P(+ + +) | N |
| AVH nurse | P/N | P | N | N | N |
| AVH PTVH | P/N | P | P | N | P |
| AVH NOS | N | P/N | N | N | P |
| AVH NOS | N | P | N | P | N |
| AVH PTVH | P | P/N | N | N | N |
| AVH PTVH | N | P | N | P | P |
| AVH PTVH | P | P | P | P | P |
| AVH PTVH | N | P | N | N | P |
| CVH PTVH | P/N | P | P(+) | P(+ + +) | N |
| AVH PTVH | N | P/N | P(+) | P(+ + +) | P |
| AVH PTVH | P | (?) | P | N | P |
| CVH PTVH | N | P | N | P | P |
| CVH PTVH | N | P | P | P | P |
| CVH PTVH | N | N | N | N | N |
| AVH NOS | N | N | N | N | N |
| AVH nurse | P | P | N | N | N |
| CVH PTVH | N | P | N | N | P |
| AVH IVDA | N | P | N | P/N | N |
| CVH PTVH | P | P | P(+) | P(+ + +) | P |
| AVH NOS | P | P | N | N | N |
| AVH NOS | P/N | P | N | N | P |
| AVH PTVH | P/N | P | P | P | P |
| AVH NOS | N | P | P | P | P/N |
| AVH IVDA | N | P | N | N | P |
| AVH NOS | N | P/N | N | N | N |
| AVH NOS | P | P | N | N | P |
| AVH PTVH | N | P | P | P | P |
| crypto | P | P | P | P | P |
| CVH NOS | N | P | P | P | P |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| AVH PTVH | N | P | P(+) | P(++) | N |
| AVH PTVH | N | P/N | P(+) | P(++) | P |
| AVH PTVH | N | P/N | P(+) | P(++) | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
HU 217 025 Β
1. táblázat (folytatás)
| Beteg | Antigén | ||||
| S2 | C22 | C100 | C33c | NS5 | |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| AVH NOS | N | P | N | N | N |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P/N |
| AVH IVDA | P | P | P | P | N |
| AVH NOS | P | P | N | N | N |
| AVH NOS | P | P | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | N | N | P/N |
| AVH PTVH | N | P | N | P | P |
| AVH NOS | N | N | N | N | N |
| AVH NOS | N | P | N | N | N |
| AVH NOS | P | N | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| AVH NOS | N | P/N | N | N | N |
| AVH IVDA | N | P | P | P | P |
| crypto | N | P | N | N | P/N |
| crypto | P | P | P/N | P | P |
| AVH IVDA | N | N | P | P | N |
| AVH IVDA | N | P | P | P | N |
| AVH NOS | N | N | N | N | N |
| AVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | N | N | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | P(+) | P(+ + +) | P |
| CVH PTVH | P | P | P(+) | P(+ ++) | P |
| CVH NOS | P/N | N | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| AVH IVDA | N | P | P | P | P |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| AVH NOS | P | P | N | N | P/N |
| AVH NOS | N | P/N | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | N | N | P |
| CVH NOS | N | P/N | N | N | N |
| AVH NOS | N | P | N | N | N |
| AVH NOS | N | P | N | N | N |
| CVH PTVH | N | P | N | N | N |
| AVH IVDA | N | P | N | P | P |
| AVH NOS | P | N | N | N | N |
HU 217 025 Β
1. táblázat (folytatás)
| Beteg | Antigén | ||||
| S2 | C22 | C100 | C33c | NS5 | |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P/N | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | N | P | P | P | P |
| AVH NOS | N | P | N | N | N |
| CVH IVDA | N | P | N | N | P |
| CVH IVDA | N | P | N | N | P |
| AVH PTVH | P | P | N | P | P |
| AVH PTVH | P | P | N | P | P |
| CVH NOS | N | P/N | N | N | P/N |
| CVH NOS | N | P | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| AVH IVDA | N | P | N | N | P |
| AVH IVDA | N | P | P(++) | P(+) | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| AVH PTVH | N | P | P | P | P |
| CVH PTVH? | N | P | P | P | P |
| CVH PTVH? | P/N | P | P | P | P |
| CVH NOS HS | P | P | N | N | N |
| CVH IVDA | P | P | P | P | N |
| CVH PTVH | N | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P/N |
| CVH NOS | P | P | P | P | P |
| CVH IVDA | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | N |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| CVH NOS | N | N | N | N | P/N |
| CVH NOS | N | P/N | N | N | P/N |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| CVH NOS | N | P | N | N | N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH NOS | P | P | N | N | P/N |
| CVH NOS | N | N | N | N | N |
| CVH NOS HS | P | P | P | P | P |
| CVH NOS HS | P | P | P | P | P |
| CVH PTVH | N | N | N | N | N |
| AVH PTVH | N | P | P | P | P |
| AVH NOS | - | - |
HU 217 025 Β
1. táblázat (folytatás)
| Beteg | Antigén | ||||
| S2 | C22 | C100 | C33c | NS5 | |
| CVH PTVH | N | P | P/N | P(+ + +) | N |
| crypto | P | P | P | P | P |
| crypto | P | P | P | P | P |
| crypto | N | P | N | N | N |
| crypto | N | P | P | P | P |
| CVH PTVH | P | P | P | P | P |
| crypto | N | N | N | N | N |
| crypto | N | P | N | N | P/N |
| crypto | N | P | N | N | P |
| crypto | P | P | P | P | P |
| crypto | N | P | N | P | N |
| crypto | - | - | |||
| crypto | - | - | |||
| CVH NOS | - | - | |||
| AVH IVDA | N | P | N | P(+) | P |
| AVH IVDA | N | P/N | N | P(++) | N |
AVH=akut virális hepatitis
CVH=krónikus virális hepatitis PTVH=poszttranszfűziós virális hepatitis IVDA=intravenásdrog-használó crypto=kriptogcnikus hepatitis NOS=ncm egyértelmű forrás P=pozitív
N =negatív
Az eredmények szerint egyik egyedülálló antigén sem reagált az összes szérummal. A legreaktívabb a C22 és a C33c volt, míg az S2 az egyes valódinak vélt, akut HCV-esetek szérumaival reagált, melyekkel más antigén nem lépett reakcióba. Az eredmények alapján a két antigén elegye, mely a leginkább megfelelő detektálási sorozatot biztosította, a C22 és a C33c volt. Amennyiben az akut fertőzés maximumát kívánjuk detektálni, a készítménynek az S2-t is célszerű tartalmaznia.
A 2. táblázat a fizetett vérdonorok szérumának vizsgálati eredményeit mutatja be.
2. táblázat
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 1 | N | N | N | N | N |
| 2 | N | N | N | N | N |
| 3 | P | P | P | P | P |
| 4 | N | N | N | N | N |
| 5 | N | N | N | N | N |
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 6 | N | N | N | N | N |
| 7 | N | N | N | N | N |
| 8 | N | N | N | N | N |
| 9 | N | N | N | N | N |
| 10 | N | N | N | N | N |
| 11 | N | N | N | N | N |
| 12 | N | N | N | N | N |
| 13 | N | N | N | N | N |
| 14 | N | N | N | N | N |
| 15 | N | N | N | N | N |
| 16 | N | N | N | N | N |
| 17 | N | N | N | N | N |
| 18 | P | P | P | P | P |
| 19 | P | P | N | P | P |
| 20 | P | P | N | P | P |
| 21 | N | N | N | N | N |
HU 217 025 Β
2. táblázat (folytatás)
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 22 | N | P | P | N | P |
| 23 | P | P | P | P | P |
| 24 | N | N | N | N | N |
| 25 | N | N | N | N | N |
| 26 | N | N | N | N | N |
| 27 | N | N | N | N | N |
| 28 | N | N | N | N | N |
| 29 | N | N | N | N | N |
| 30 | N | N | N | N | N |
| 31 | P | P | P | N | P |
| 32 | N | N | N | N | N |
| 33 | N | N | N | N | N |
| 34 | N | N | N | N | P |
| 35 | N | N | P | N | P |
| 36 | N | N | N | N | N |
| 37 | N | N | N | N | N |
| 38 | N | N | N | N | N |
| 39 | N | N | N | N | N |
| 40 | N | N | N | N | N |
| 41 | N | N | N | N | P |
| 42 | N | N | N | N | N |
| 43 | N | N | N | N | N |
| 44 | N | N | N | N | N |
| 45 | N | N | N | N | N |
| 46 | N | N | N | N | N |
| 47 | P | P | N | N | P |
| 48 | N | N | N | N | N |
| 49 | N | N | N | N | N |
| 50 | N | N | N | N | N |
| 51 | N | P | P | N | P |
| 52 | N | N | N | N | N |
| 53 | N | P | P | N | P |
| 54 | P | P | P | P | N |
| 55 | N | N | N | N | N |
| 56 | N | N | N | N | N |
| 57 | N | N | N | N | N |
| 58 | N | N | N | N | N |
| 59 | N | N | N | N | N |
| 60 | N | N | N | N | N |
| 61 | N | N | N | N | N |
| 62 | N | N | N | N | N |
| 63 | N | N | N | N | N |
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 64 | N | N | N | N | N |
| 65 | N | N | N | N | N |
| 66 | N | N | N | N | N |
| 67 | N | N | N | N | N |
| 68 | N | N | N | N | N |
| 69 | N | N | N | N | N |
| 70 | P | P | P | P | P |
| 71 | N | N | N | N | N |
| 72 | N | N | N | N | N |
| 73 | P | P | P | P | N |
| 74 | N | N | N | N | N |
| 75 | N | N | N | N | N |
| 76 | N | N | N | N | P |
| 77 | N | N | N | N | N |
| 78 | N | N | N | N | N |
| 79 | N | N | N | N | N |
| 80 | N | N | N | N | N |
| 81 | N | N | N | N | N |
| 82 | N | N | N | N | N |
| 83 | P | P | N | N | N |
| 84 | N | N | P | N | N |
| 85 | N | N | N | N | N |
| 86 | P | P | P | P | N |
| 87 | N | N | N | N | N |
| 88 | N | N | N | N | N |
| 89 | P | P | P | P | P |
| 90 | P | P | P | P | N |
| 91 | N | N | N | N | P |
| 92 | P | P | P | N | N |
| 93 | N | N | N | N | N |
| 94 | N | N | N | N | N |
| 95 | N | N | N | N | N |
| 96 | N | N | N | N | N |
| 97 | N | N | N | N | N |
| 98 | N | P | P | P | P |
| 99 | P | P | P | P | P |
| 100 | N | N | N | N | N |
| 101 | P | P | P | P | P |
| 102 | N | N | N | N | N |
| 103 | N | N | N | N | N |
| 104 | N | N | N | N | |
| 105 | P | P | P | P | N |
| 106 | N | N | N | N | N |
HU 217 025 Β
2. táblázat (folytatás)
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 107 | N | N | N | N | N |
| 108 | N | N | N | N | N |
| 109 | P | P | P | P | P |
| 110 | P | P | P | N | P |
| lll | P | P | P | N | P |
| 112 | N | N | N | N | N |
| 113 | P | P | P | P | P |
| 114 | N | N | N | N | N |
| 115 | N | N | N | N | N |
| 116 | P | P | P | P | P |
| 117 | N | N | N | N | N |
| 118 | N | N | N | N | N |
| 119 | N | N | N | N | N |
| 120 | P | P | P | P | P |
| 121 | N | N | N | N | N |
| 122 | N | P | P | N | P |
| 123 | N | N | N | N | N |
| 124 | N | N | N | N | N |
| 125 | N | N | N | N | N |
| 126 | P | N | N | N | N |
| 127 | N | N | N | N | N |
| 128 | N | N | N | N | N |
| 129 | N | N | N | N | N |
| 130 | P | P | P | P | N |
| 131 | N | N | N | N | P |
| 132 | N | N | N | N | N |
| 133 | N | N | N | N | N |
| 134 | N | N | N | N | N |
| 135 | N | N | N | N | N |
| 136 | N | N | N | N | N |
| 137 | N | N | N | N | N |
| 138 | N | N | N | N | N |
| 139 | N | N | N | N | N |
| 140 | P | N | N | N | N |
| 141 | P | N | P | P | P |
| 142 | N | N | N | N | N |
| 143 | N | N | N | N | N |
| 144 | N | N | N | N | N |
| 145 | N | N | N | N | N |
| 146 | N | N | N | N | N |
| 147 | N | N | N | N | N |
| 148 | N | N | N | N | N |
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 149 | N | N | N | N | N |
| 150 | N | N | N | N | N |
| 151 | N | N | N | N | N |
| 152 | N | N | N | N | N |
| 153 | N | N | N | N | N |
| 154 | P | P | P | P | P |
| 155 | N | N | N | N | N |
| 156 | N | N | N | N | N |
| 157 | N | N | N | N | N |
| 158 | N | N | N | N | N |
| 159 | N | N | N | N | N |
| 160 | N | N | N | N | N |
| 161 | P | P | P | P | P |
| 162 | N | N | N | N | N |
| 163 | N | N | N | N | N |
| 164 | P | P | P | N | P |
| 165 | N | N | N | N | N |
| 166 | P | P | P | N | P |
| 167 | N | N | N | N | N |
| 168 | N | N | N | N | N |
| 169 | N | N | N | N | -1 N |
| 170 | N | N | N | N | N |
| 171 | N | N | N | N | N |
| 172 | N | N | N | N | N |
| 173 | N | N | N | N | N |
| 174 | N | N | N | N | N |
| 175 | N | N | N | N | N |
| 176 | N | N | N | N | N |
| 177 | N | N | N | N | P |
| 178 | N | N | N | N | N |
| 179 | N | N | N | N | N |
| 180 | N | N | N | N | N |
| 181 | N | N | N | N | N |
| 182 | N | N | N | N | N |
| 183 | P | P | P | P | P |
| 184 | N | N | N | N | N |
| 185 | N | N | N | N | N |
| 186 | N | N | N | N | N |
| 187 | N | N | N | N | N |
| 188 | N | P | P | N | N |
| 189 | N | N | N | N | N |
| 190 | N | N | N | N | N |
| 191 | N | N | N | N | N |
HU 217 025 Β
2. táblázat (folytatás)
| Donor | Antigén | ||||
| C100 | C33c | C22 | S2 | NS5 | |
| 192 | N | N | N | N | N |
| 193 | N | N | N | N | N |
| 194 | N | N | N | N | N |
| 195 | N | N | N | N | N |
| 196 | N | N | N | N | N |
| 197 | N | N | N | N | P |
| 198 | P | P | P | N | N |
| 199 | N | N | N | N | P |
| 200 | P | P | P | P | N |
A fizetett vérdonorok esetén kapott eredmények megerősítik a fertőzött egyének szérumánál kapott eredményeket.
7. példa: A HCV-antitestek HCV-antigénkészítmény alkalmazásával történő ELISA-meghatározása
A C22 és a C33c antigének készítményével bevont lemezeket az alábbiak szerint készítettük el. Közvetlenül a Removeawell Immulon I lemezekre (Dynatech. Corp.) történő felvitel előtt bevonópufferből (coating puffer; 50 mM borát, pH 9,0) 21 ml/lemez, BSA-ból (25 pg/ml) C22-ből és C33c-ből (mindegyik 2,50 pg/ml mennyiségben) oldatot készítettünk. Ötperces keverés után az oldatból 0,2 ml/lyuk mennyiségeket vittünk fel a lemezekre, befedtük, két órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk, majd az oldatfelesleget leszívással eltávolítottuk. A lyukakat egyszer 400 μΐ mosópufferrel mostuk [100 mM nátriumfoszfát, pH 7,4, 140 mM NaCl, 0,1% (W/V) kazein, 1% (W/V) Triton X-100, 0,01% (W/V) Thimerosal). A mosóoldat eltávolítása után 200 μΐ/lyuk mennyiségű „utóbevonó oldatot” (postcoat solution) (10 mM Na-foszfát, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% (W/V) kazein, 3% szukróz és 2 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF)] vittünk a lyukakba, a párolgás megakadályozása céljából lazán befedtük a lemezeket, majd szobahőmérsékleten 30 percig állni hagytuk. Ezután a lyukakból leszívtuk a folyadékot, és önmelegedés (self heating) nélkül egy éjszaka alatt szárazra liofileztük. Az így kapott lemezeket 2-8 °C-on, zárt alumíniumtasakban, szárítókapszulával (3 g Sorbit™ kapszulák) tárolhatjuk.
Az ELISA eredményeinek megerősítése céljából a szérumminta, illetve a kontrollminta 20 μΐ mennyiségeit adtuk a 200 μΐ minta hígítót [100 mM nátrium-foszfát, pH 7,4, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% (W/V) kazein, 1% (W/V) Triton X-100,0,01% (W/V) Thimerosal és 100 pg/ml élesztőextraktum] tartalmazó lyukakba. A lemezeket lefedtük, és 37 °C-on két órán keresztül inkubáltuk, majd az oldatot leszívással eltávolítottuk, és a lemezeket háromszor 400 μΐ mosópufferrel mostuk [0,05% Tween 20-at tartalmazó, foszfátpufferes fiziológiás sóoldat (PBS)]. A mosás után a lyukakat 200 μΐ egér-anti-humán IgG-torma-peroxidáz- (HRPO) konjugátummal kezeltük, mely Ortho konjugátum hígítóoldatban volt [10 mM nátrium-foszfát, pH 1(2, 150 mM NaCl, 50% (V/V) fetális szarvasmarhaszérum, 1% (V/V) hőkezelt lószérum, 1 mM K3Fe (CN)6, 0,05% (W/V) Tween 20 és 0,02% (W/V) Thimerosal]. A kezelés 37 °C-on, egy órán keresztül tartott, majd az oldatot leszívással eltávolítottuk, és a lemezeket háromszor 400 μΐ mosópufferrel mostuk, melyet szintén leszívással távolítottunk el. A kötött enzimkonjugátum meghatározása céljából 200 μΐ szubsztrátoldatot (10 mg o-fenilén-diamin-dihidroklorid 5 ml „developer” oldatban) adtunk hozzá. A „developer” oldat 50 mM Na-citrátot tartalmazott, pH 5,1 foszforsavval és 0,6 μΐ/ml 30%-os H2O2-t. A szubsztrátoldatot tartalmazó lemezeket sötétben 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, a reakciót 50 μΐ/ml 4 N kénsav hozzáadásával állítottuk le, majd meghatároztuk az OD-értékeket.
Hasonló módon végezhetjük el a C22 és C33c, és C22, C33c, és S2, és a C22, és C100, C22, és S2, C22, és egy NS5 antigén, C22, C33c, és S2, és C22, Cl00, és S2 fúziós fehéijék ELISA-vizsgálatát.
A fenti eljárások kivitelezésében a molekuláris biológiai, az immunológiai és az egyéb kapcsolódó tudományok alapján történő módosításoknak az alább következő igénypontok területén belül kell esniük.
Claims (17)
1. Szilárd mátrix felületén immobilizált hepatitis C vírus- (HCV) antigénkészítmény, amely egy vagy több kémiai szintézissel vagy rekombináns kifejezés útján nyert pepiidet tartalmaz, HCV elleni antitestek immunoassay-vel történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy az alábbi antigéneket tartalmazza:
a) egy első HCV-antigént, mely a HCV-poliprotein C doménjéből származó epitóppal rendelkezik, és
b) legalább egy további HCV-antigént, melyet az alábbi csoportból választunk ki:
i) egy, a HCV-poliprotein NS3 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
ii) egy, a HCV-poliprotein NS4 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
iii) egy, a HCV-poliprotein S doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
iv) egy, a HCV-poliprotein NS5 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az antigének kombinációja a pl peptid és a C 100-3; a p35 peptid és a C 100-3; vagy a p99 peptid és a C 100-3 kombinációjától vagy a CA 290a fúziós peptidtől eltérő.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy harmadik HCV-antigént tartalmaz, melyet az alábbi csoportból választunk ki :
i) egy, a HCV poliprotein NS3 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
ii) egy, a HCV-poliprotein NS4 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
iii) egy, a HCV-poliprotein S doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén;
HU 217 025 Β iv) egy, a HCV-poliprotein NS5 doménjéből származó epitóppal rendelkező HCV-antigén, azzal a feltétellel, hogy a második és harmadik antigén a HCV-poliprotein különböző doménjeiből származó epitóppal rendelkezik.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a második antigén a HCV NS3 doménjéből származó epitóppal rendelkezik.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a második antigén a HCV NS4 doménjéből származó epitóppal rendelkezik.
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a második antigén a HCV S doménjéből származó epitóppal rendelkezik.
7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a második antigén a HCV NS5 doménjéből származó epitóppal rendelkezik.
8. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az első HCV-antigén a C22, és a második HCV-antigén a C33c.
9. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az első HCV-antigén a C22, a második HCV-antigén a C33c, és a harmadik HCV-antigén az S2.
10. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az első HCV-antigén a C22, és a második HCV-antigén a C100.
11. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az első HCV-antigén a C22, a második HCV-antigén a Cl00, és a harmadik HCV-antigén az S2.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény egy fúziós polipeptidet tartalmaz.
13. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az első HCV-antigén és a további antigének külön kötődnek a közös szilárd mátrixhoz.
14. A 13. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a szilárd mátrix egy mikrotiterlemez felszíne, gyöngy vagy pálca.
15. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az az első HCV-antigén és a további antigének keverékét tartalmazza.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az egy kit része.
17. In vitro módszer HCV-antitesteknek emlőstestkomponensekben történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy a testkomponenst az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti antigénkészítménnyel hozzuk érintkezésbe, és a létrejött antitest-antigén reakció során keletkezett immunkomplex jelenlétét kimutatjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50435290A | 1990-04-04 | 1990-04-04 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9203146D0 HU9203146D0 (en) | 1992-12-28 |
| HUT62706A HUT62706A (en) | 1993-05-28 |
| HU217025B true HU217025B (hu) | 1999-11-29 |
Family
ID=24005897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203146A HU217025B (hu) | 1990-04-04 | 1991-03-29 | Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0450931B1 (hu) |
| JP (1) | JP2733138B2 (hu) |
| KR (1) | KR100206150B1 (hu) |
| AT (2) | ATE182684T1 (hu) |
| BG (1) | BG61291B1 (hu) |
| BR (1) | BR9106309A (hu) |
| CY (1) | CY1881A (hu) |
| DE (2) | DE69120138T2 (hu) |
| DK (2) | DK0693687T4 (hu) |
| ES (2) | ES2088465T3 (hu) |
| FI (1) | FI106317B (hu) |
| GB (1) | GB2257784B (hu) |
| GR (2) | GR3020964T3 (hu) |
| HU (1) | HU217025B (hu) |
| IE (1) | IE911105A1 (hu) |
| IL (2) | IL170719A (hu) |
| LT (1) | LT3808B (hu) |
| LV (2) | LV10344A (hu) |
| MY (1) | MY107499A (hu) |
| NO (1) | NO310241B1 (hu) |
| PL (1) | PL172133B1 (hu) |
| RO (1) | RO109916B1 (hu) |
| RU (1) | RU2130969C1 (hu) |
| UA (1) | UA41266C2 (hu) |
| WO (1) | WO1991015771A1 (hu) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7166287B1 (en) | 1989-12-18 | 2007-01-23 | Glaxo Wellcome Inc. | Viral agent |
| SE9004010D0 (sv) | 1989-12-18 | 1990-12-17 | Wellcome Found | Viralt medel |
| KR940000755B1 (ko) * | 1990-02-16 | 1994-01-29 | 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 | Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드 |
| US6194140B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
| DK0527815T3 (da) * | 1990-04-06 | 2000-11-06 | Genelabs Tech Inc | Hepatitis C-virus-epitop |
| CA2049679C (en) * | 1990-08-24 | 2005-06-21 | Sushil G. Devare | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens |
| US6274148B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-08-14 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus asialoglycoproteins |
| SK285623B6 (sk) * | 1990-11-08 | 2007-05-03 | Chiron Corporation | Spôsob produkcie asialoglykoproteínu hepatitis C vírusu |
| US5910404A (en) | 1990-12-14 | 1999-06-08 | Innogenetics N.V. | Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus |
| DK0489968T3 (da) * | 1990-12-14 | 1997-03-24 | Innogenetics Nv | Syntetiske antigener til påvisning af antistoffer imod hepatitis C virus |
| US6007982A (en) * | 1990-12-14 | 1999-12-28 | Innogenetics N.V. | Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus |
| DE4041304A1 (de) * | 1990-12-21 | 1992-06-25 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren |
| US5574132A (en) * | 1991-04-05 | 1996-11-12 | Biochem Immunosystems Inc. | Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV) |
| CA2099883A1 (en) * | 1991-11-07 | 1993-05-08 | John A. Kink | Epitope mapping of the c33c region of hcv |
| DE610436T1 (de) * | 1991-11-21 | 1995-08-03 | Common Services Agency | Detektion des Hepatis-C Virus. |
| EP0625204B1 (en) * | 1992-02-04 | 2002-06-19 | Chiron Corporation | Hepatitis therapeutics |
| GB9203803D0 (en) * | 1992-02-21 | 1992-04-08 | Wellcome Found | A recombinant polypeptide |
| UA39944C2 (uk) * | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
| US6153378A (en) * | 1992-10-16 | 2000-11-28 | Bionova Corporation | Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus |
| JP2778886B2 (ja) * | 1992-10-16 | 1998-07-23 | エバーニュー バイオテック インコーポレイティド | Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
| EP0593291A3 (en) * | 1992-10-16 | 1995-03-15 | Evernew Biotech Inc | Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit. |
| WO1994013164A1 (en) | 1992-12-10 | 1994-06-23 | Nike International Ltd. | Bonding of rubber to plastic in footwear |
| PT698216E (pt) * | 1993-05-10 | 2005-03-31 | Chiron Corp | Metodos de tipificacao do virus da hepatite c e reagentes para utilizar nestes |
| DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
| JPH0862219A (ja) * | 1994-08-19 | 1996-03-08 | Dainabotsuto Kk | 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 |
| JP3665371B2 (ja) * | 1994-08-31 | 2005-06-29 | 株式会社先端生命科学研究所 | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
| CA2172305A1 (en) * | 1995-03-30 | 1996-10-01 | Muneo Aoyama | Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides |
| AU5924396A (en) * | 1995-05-22 | 1996-12-11 | Bionova Corporation | Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccinati on against, hepatitis c virus (hcv) |
| FR2734639B1 (fr) * | 1995-05-26 | 1997-10-03 | Parteurop | Methode de pronostic de l'evolution d'une infection par le virus de l'hepatite c, et necessaire pour sa mise en oeuvre |
| FR2737209B1 (fr) | 1995-07-25 | 1997-09-19 | Bio Merieux | Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c |
| US6127116A (en) | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
| JP3715027B2 (ja) | 1996-05-07 | 2005-11-09 | シスメックス株式会社 | Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬 |
| US7049428B1 (en) | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
| US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
| US6391540B1 (en) * | 1997-09-22 | 2002-05-21 | Chiron Corporation | Method for detecting antibodies in a sample |
| AU6098900A (en) * | 1999-07-15 | 2001-02-05 | Bayer Corporation | The use of specific antibody titers to predict hepatic failure in people infected with hepatitis c virus |
| AU1236801A (en) | 1999-10-27 | 2001-05-08 | Chiron Corporation | Activation of hcv-specific t cells |
| US6986892B1 (en) | 1999-11-24 | 2006-01-17 | Chiron Corporation | Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides |
| KR100788812B1 (ko) * | 1999-11-24 | 2007-12-27 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 | 신규한 ｈｃｖ 비구조 폴리펩티드 |
| MXPA02012424A (es) | 2000-06-15 | 2003-04-25 | Chiron Corp | Ensayo de combinacion de antigenos/anticuerpos para el virus de hepatitis c. |
| US7491808B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-02-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HCV non-structural protein mutants and uses thereof |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| WO2002014362A2 (en) | 2000-08-17 | 2002-02-21 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
| FR2839722A1 (fr) | 2002-05-17 | 2003-11-21 | Bio Merieux | Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c |
| MXPA05002641A (es) | 2002-09-09 | 2005-05-05 | Chiron Corp | Ensayo del virus de la hepatitis c. |
| US8101425B1 (en) * | 2004-06-09 | 2012-01-24 | Pathogen Removal And Diagnostic Technologies Inc. | Particles embedded in a porous substrate for removing target analyte from a sample |
| JP2005274584A (ja) * | 2005-05-25 | 2005-10-06 | Sysmex Corp | Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法 |
| CA2618429A1 (en) | 2005-05-25 | 2007-03-22 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
| JP4005093B2 (ja) * | 2005-05-25 | 2007-11-07 | シスメックス株式会社 | Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬および抗ｈｃｖ抗体検出方法 |
| ES2387321T3 (es) | 2006-03-09 | 2012-09-20 | Transgene Sa | Proteína de fusión no estructural del virus de la hepatitis C |
| EP1978365B1 (en) | 2007-03-16 | 2010-08-25 | Sysmex Corporation | Reagent kit and method for measuring HCV antibody |
| WO2009022236A2 (en) | 2007-08-16 | 2009-02-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| WO2009130588A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| CN107110868B (zh) | 2014-10-29 | 2020-08-21 | 雅培制药有限公司 | 采用ns3捕获肽的受试者抗hcv抗体检测测定 |
| JP2018124277A (ja) * | 2017-02-02 | 2018-08-09 | 三洋化成工業株式会社 | 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US456637A (en) | 1891-07-28 | Fence | ||
| US390599A (en) | 1888-10-02 | Tool for weaver s use | ||
| SE7804231L (sv) | 1978-04-14 | 1979-10-15 | Haessle Ab | Magsyrasekretionsmedel |
| US4870008A (en) * | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| CA1341482C (en) † | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
| US4751180A (en) * | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
| NZ227011A (en) * | 1987-11-18 | 1992-03-26 | Chiron Corp | Non-a, non-b-hepatitis (hepatitis c) antigens, proteins, nucleotide sequences, vaccines and kits |
| HUT54896A (en) † | 1989-03-17 | 1991-04-29 | Chiron Corp | Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv |
| SE9004010D0 (sv) * | 1989-12-18 | 1990-12-17 | Wellcome Found | Viralt medel |
| AU638304B2 (en) † | 1989-12-22 | 1993-06-24 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay |
-
1991
- 1991-03-29 HU HU9203146A patent/HU217025B/hu unknown
- 1991-03-29 PL PL91296329A patent/PL172133B1/pl unknown
- 1991-03-29 RU SU5053084A patent/RU2130969C1/ru active
- 1991-03-29 WO PCT/US1991/002225 patent/WO1991015771A1/en active IP Right Grant
- 1991-03-29 JP JP3507636A patent/JP2733138B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-29 BR BR919106309A patent/BR9106309A/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-03-29 RO RO92-01275A patent/RO109916B1/ro unknown
- 1991-03-29 KR KR1019920702437A patent/KR100206150B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-03-29 UA UA93004190A patent/UA41266C2/uk unknown
- 1991-04-01 IL IL170719A patent/IL170719A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-04-01 IL IL97741A patent/IL97741A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-04-02 MY MYPI91000551A patent/MY107499A/en unknown
- 1991-04-03 EP EP91302910A patent/EP0450931B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 ES ES91302910T patent/ES2088465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 DE DE69120138T patent/DE69120138T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 AT AT95114016T patent/ATE182684T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-03 DK DK95114016T patent/DK0693687T4/da active
- 1991-04-03 AT AT91302910T patent/ATE139343T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-03 DE DE69131488T patent/DE69131488T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 DK DK91302910.4T patent/DK0450931T3/da active
- 1991-04-03 ES ES95114016T patent/ES2134388T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 EP EP95114016A patent/EP0693687B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 IE IE110591A patent/IE911105A1/en unknown
-
1992
- 1992-09-28 FI FI924349A patent/FI106317B/fi active
- 1992-09-28 GB GB9220480A patent/GB2257784B/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-01 NO NO19923839A patent/NO310241B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-10-02 BG BG96943A patent/BG61291B1/bg unknown
-
1993
- 1993-05-31 LV LV930038D patent/LV10344A/en unknown
- 1993-05-31 LV LVP-93-438.1A patent/LV10344B/en unknown
- 1993-12-30 LT LTIP1747A patent/LT3808B/lt not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-05 CY CY188196A patent/CY1881A/xx unknown
- 1996-09-05 GR GR960402319T patent/GR3020964T3/el unknown
-
1999
- 1999-09-29 GR GR990402455T patent/GR3031361T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217025B (hu) | Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben | |
| US6312889B1 (en) | Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
| US5683864A (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
| US7056658B2 (en) | Multiple epitope fusion protein | |
| US7728121B2 (en) | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 | |
| US6596476B1 (en) | Hepatitis C assay | |
| AU685059B2 (en) | Immunoassays for anti-HCV antibodies using antigens with conformational epitopes | |
| JPH04253998A (ja) | Ｃ型肝炎アッセイ | |
| JPH06153960A (ja) | Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット | |
| EP0642666B1 (en) | Hepatitis c assay | |
| JPH06247997A (ja) | Ｈｃｖ ペプチド抗原及びｈｃｖ の測定方法 | |
| US5935778A (en) | Method for serological typing using type-specific antigens | |
| AU639560C (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
| JPH06510289A (ja) | Ｎｓ５領域由来の組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ | |
| JP3327549B2 (ja) | Ｃ１００領域に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ | |
| JPH07504562A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスペプチド | |
| PT97247B (pt) | Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv | |
| JPH06153959A (ja) | Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |