PT97247B - Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv - Google Patents

Description

Descrição do invento

Os requerentes realizaram estudos serológicos adicionais com antigénios do HCV, os quais confirmam que nenhum dos polipéptidos do HCV que foram identificados até à data é, quando isolado, imunologicamente reactivo com todos os soros. A falta de um polipéptido isolado que seja universalmente reactivo com todos os soros de indivíduos portadores do HCV pode ser devida, entre outros factores, à variação inter-estirpes dos epitopos do HCV, à variação inter-individuos da resposta humoral,

e/ou à variação serológica dependente do estádio da doença.

Estes estudos adicionais permitiram igualmente aos requerentes a identificação de combinações de antigénios do HCV que proporcionam uma detecção mais eficiente dos anticorpos antiHCV do que a permitida por qualquer polipéptido do HCV isolado.

Assim, um aspecto deste invento é a produção de uma combinação de antigénios do HCV, compreendendo:

(a) um primeiro antigénio de HCV proveniente do dominio

C; e (b) pelo menos um antigénio de HCV adicional, seleccionado a partir do grupo que consiste de (i) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS3;

NS4;

S? e (ii) um antigénio de HCV proveniente do dominio (iii) um antigénio de HCV proveniente do dominio (iv) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS5.

Numa das formas de realização, a combinação de antigénios do HCV encontra-se sob a forma de uma proteina de fusão, composta pelos antigénios. Numa forma de realização alternativa, a combinação de antigénios encontra-se sob a forma dos antigénios individuais ligados a uma matriz sólida comum. Ainda em outra forma de realização, a combinação de antigénios está sob a forma de uma mistura dos antigénios individuais.

Outro aspecto do invento consiste num método para detecção de anticorpos anti-HCV num componente de um organismo de

um mamífero suspeito de conter os ditos anticorpos, compreendendo o dito método o estabelecimento de contacto entre o dito componente do organismo e a combinação de antigénios do HCV, acima descrita, sob condições que permitam a reacçâo anticorpoantigénio, e a detecção da presença de imunocomplexos dos ditos anticorpos e dos ditos antigénios.

Um outro aspecto do invento consiste num método para detecção de anticorpos anti-HCV num componente de um organismo de um mamífero que se suspeita de conter os ditos anticorpos, compreendendo o dito método o estabelecimento de contacto entre o dito componente do organismo e um conjunto de antigénios do HCV, simultaneamente ou sequencialmente, compreendendo:

(a) um primeiro antigénio de HCV proveniente do domínio

C; e (b) pelo menos um antigénio de HCV seleccionado a partir do grupo que consiste em:

(i) um antigénio de HCV proveniente adicional, do domínio

NS3;

(ii) um antigénio de HCV proveniente do domínio

NS4;

(iii) um antigénio de HCV proveniente do domínio

S; e (iv) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS5, sob condições que permitam a reacçâo anticorpoantigénio, e a detecção da presença de imunocomplexos dos ditos anticorpos e dos ditos antigénios.

Outro aspecto do invento refere-se a um kit para a

realização de um ensaio para detecção de anticorpos anti-HCV num componente de um organismo de um mamifero suspeito de conter os ditos anticorpos, caracterizado pelo facto de compreender, em combinação embalada:

(a) a dita combinação dos antigénios do HCV;

(b) reagentes de controlo padronizados; e (c) instruções para a realização do ensaio.

Breve Descrição dos Desenhos >

Nos Desenhos:

A Fig. 1 representa a sequência nucleotidica da cadeias de senso e de anti-senso do cDNA para a poliproteina do HCV, e a sequência de aminoácidos codificada pela cadeia de senso.

A Fig. 2 representa esquematicamente a sequência de aminoácidos da Fig. 1, mostrando os supostos dominios da poliproteina do HCV.

Formas de realização do invento

Definições termo antigénio do HCV quer significar um polipéptido de, pelo menos, 5 aminoácidos, mais vulgarmente de pelo menos 8 a 10 aminoáciods, que define um epitopo encontrado num isolado do HCV. De preferência, o epitopo é exclusivo do HCV. Quando um antigénio é designado por um código alfanumérico, o epitopo está no dominio do HCV que é especificado pelo termo alfanumérico.

termo sintético, como usado para caracterizar um antigénio do HCV, quer significar que o antigénio do HCV foi obtido por isolamento a partir de fontes nativas ou por sintese recombinante ou química.

termo domínios designa os segmentos da poliproteina do HCV, mostrada na Fig. 2, que geralmente correspondem às supostas proteínas, estruturais e não-estruturais, do HCV. As designações dos dominios seguem geralmente a convenção empregue para designar as proteínas dos Flavivirus. As localizações dos dominios, mostradas na Fig. 2, são apenas aproximadas. As designações NS denotam dominios não-estruturais, enquanto que S indica o domínio do envelope, e C indica o domínio da nucleocápside ou do núcleo (core).

termo polipéptido de fusão quer indicar um polipéptido em que o(s) antigénio(s) do HCV faz(em) parte de uma única cadeia continua de aminoácidos, não sendo a dita cadeia de ocorrência natural. Os antigénios do HCV podem estar ligados entre si directamente, por ligações peptidicas, ou encontrar-se separados por sequências intervenientes de aminoácidos. Os polipéptidos de fusão podem conter igualmente sequências de aminoácidos exógenas em relação ao HCV.

termo matriz sólida comum quer indicar um corpo sólido ao qual os antigénios individuais do HCV, ou o polipéptido de fusão composto pelos antigénios do HCV, se encontram ligados, por ligações covalentes ou por meios não covalentes, tais como a adsorção hidrofóbica.

termo componente de um organismo de mamifero quer indicar um fluido ou tecido de um ser mamifero (e.g., um ser humano) que contenha vulgarmente anticorpos produzidos por esse mamífero. Tais componentes são bem conhecidos da técnica e incluem, sem limitação, sangue, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, secreções dos tractos respiratório, intestinal ou genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, glóbulos brancos, e mieiornas.

termo imunologicamente reactivo significa que o antigénio em questão reagirá especificamente com um anticorpo anti-HCV vulgarmente presente numa proporção significativa de soros provenientes de indivíduos infectados com o HCV.

termo imunocomplexo quer significar a combinação, ou agregado, formado quando um anticorpo se liga a um epitopo presente num antigénio.

Combinações de Antigénios do HCV

A Fig. 2 mostra os supostos dominios da poliproteina do HCV. Os dominios dos quais derivam os antigénios usados nas combinações são: C, S (ou E), NS3, NS4, e NS5. SupOe-se que o dominio C defina a proteina da nucleocápside do HCV. Este domínio estende-se desde a extremidade N da poliproteina até, aproximadamente, o aminoácido 120 da Fig. 1. Acredita-se que o dominio S defina a proteina do envelope do viriâo, e, possivelmente, a proteina da matriz (Μ), e supõe-se que se estenda desde, aproximadamente, o aminoácido 120 até o aminoácido 400 da Fig. 1. 0 dominio NS3 estende-se desde aproximadamente o aminoácido 1050 até o aminoácido 1640, e supõe-se que constitua a protease virai. O dominio NS4 estende-se desde a parte terminal do NS3 até, aproximadamente, o aminoácido 2000. A função da proteína NS4 nao é actualmente conhecida. Por fim, o domínio NS5 estende-se desde cerca do aminoácido 2000 até à extremidade da poliproteina, e supõe-se que defina a polimerase virai.

A sequência mostrada na Fig. 1 é a sequência do isolado do HCV1. E de esperar que as sequências de outras estirpes do HCV veiculado pelo sangue possam diferir da sequência da Fig. 1, particularmente nos domínios do envelope (S) e da nucleocápside (C). A utilização de antigénios do HCV possuindo tal diversidade de sequências pretende encontrar-se no âmbito do presente invento, desde que, no entanto, esta variação não degrade de forma significativa a reactividade imunológica do antigénio face a soros de indivíduos infectados com o HCV.

De forma geral, os antigénios do HCV compreenderão dominios inteiros ou truncados, sendo os fragmentos dos dominios analisados quanto à sua antigenicidade pelos peritos na técnica. Os antigénios do HCV individuais, usados na combinação, compreenderão, de preferência, a porção imunodominante (i.e., a porção primariamente responsável pela reactividade imunológica do polipéptido) do dominio especificado. No caso do dominio C, é preferível que o antigénio do dominio C compreenda uma parte maioritária da sequência completa do dominio. O antigénio designado por C22 (ver Exemplo 4, infra) é particularmente preferido. 0 antigénio do dominio S inclui, de preferência, o subdominio hidrofóbico localizado na extremidade N do dominio. Este subdominio hidrofóbico estende-se desde aproximadamente o aminoácido 199 até o aminoácido 328 da Fig. 1. O antigénio do HCV designado por S2 (ver Exemplo 3, infra) é particularmente preferido. A sequência a jusante do subdominio hidrofóbico pode

ser incluída no antigénio do domínio S, se desejado.

Ura antigénio do dominio NS3 presentemente preferido antigénio designado por C33c. Esse antigénio inclui os aminoácidos desde 1192 até 1457, na Fig. 1. Um antigénio NS4 preferido ê o C100, que compreende desde o aminoácido 1569 até o 1931, na Fig. 1. Um antigénio NS5 preferido compreende desde o aminoácido 2054 até o 2464, na Fig. 1.

antigénio do HCV pode encontrar-se sob a forma de um polipêptido composto inteiramente por uma sequência de aminoácidos do HCV, ou pode conter uma sequência exógena relativamente ao HCV (i.e., ele pode estar sob a forma de uma proteina de fusão contendo uma sequência exógena). No caso de um antigénio do HCV produzido por recombinação, a produção do antigénio sob a forma de uma proteina de fusão, usando a SOD, o factor alfa ou a ubiquitina (ver as patentes norte-americanas com os números de série 4.751.180, 4.870.008, e o pedido de patente com o número de série 390.599, de 7 de Agosto de 1989 - a exposição das quais é aqui incorporada - descrevendo a expressão das proteínas de fusão da SOD, do factor alfa e da ubiquitina), pode aumentar o grau de expressão e/ou aumentar a solubilidade do antigénio na água. As proteínas de fusão, tais como a proteina de fusão do factor alfa ou da ubiquitina, são processadas pelo hospedeiro de expressão no sentido da remoção da sequência heteróloga. A proteina de fusão do factor alfa constitui, no entanto, um sistema de excreção, enquanto que as proteínas de fusão da ubiquitina permanecem no citoplasma.

Adicionalmente, a combinação de antigénios pode ser produzida sob a forma de uma proteina de fusão. Por exemplo, pode ser construído um fragmento continuo de DNA codificando para o C22 e C33c, clonando-se este fragmento num vector de expressão, o qual é usado para expressar uma proteina de fusão de C22 e C33c. De forma similar, podem ser preparadas proteínas de fusão de C22 e C100; C22 e S2; C22 e um antigénio NS5; C22, C33c, e S2; C22, C100 e S2; e C22, C33c, C100 e S2. Podem ser usados fragmentos alternativos do dominio exemplificado.

Preparação dos Antigénios de HCV

Os antigénios de HCV do invento são preferencialmente produzidos por recombinação ou por pela conhecida sintese quimica em fase sólida. Contudo, podem também ser isolados a partir de HCV dissociado, ou de partículas de HCV, usando técnicas de cromatografia por afinidade, empregando anticorpos para os antigénios.

Quando produzidos por técnicas de recombinação, podem ser empregues procedimentos padrão para construir o DNA que codifica para o antigénio, clonar esse DNA nos vectores de expressão, transformar células hospedeiras tal como células de bactérias, de leveduras, de insectos, ou de mamíferos, e expressar esse DNA de modo a produzir o antigénio. Tal como foi anteriormente indicado, pode ser desejável expressar o antigénio como uma proteina de fusão para aumentar o grau de expressão, facilitar a purificação, ou melhorar a solubilidade. Exemplos de procedimentos específicos para produzir antigénios representativos do HCV encontram-se descritos nos Exemplos, infra, e no pedido de patente com o número de série 456.637.

Formulação de Antigénios para Utilização em

Imunoensaios

Os antigénios do HCV podem ser combinados por produção de uma proteína de fusão composta por dois ou mais antigénios, por imobilização dos antigénios individuais numa matriz sólida comum, ou por mistura fisica destes. As proteínas de fusão do antigénio podem também ser imobilizadas na (ligadas à) matriz sólida. São bem conhecidos da técnica métodos e meios para ligar covalentemente, ou não-covalentemente, proteínas a matrizes sólidas. A natureza da superfície sólida variará dependendo do tipo de ensaio. Para ensaios realizados em cúpulas de microtitulação, a superfície sólida será a parede da cúpula ou taça. Para ensaios usando esferas, a superfície sólida será a superfície da esfera. Em ensaios usando varetas (i.e., um corpo sólido formado por um material poroso ou fibroso, tal como tecido ou papel), a superfície será a superfície do material do qual é constituida a vareta. Nos ensaios de aglutinação, a superfície sólida pode ser a superfície de partículas de latex ou gelatina. Quando os antigénios individuais estão ligados à matriz, aqueles podem encontrar-se distribuídos de forma homogénea sobre a superfície ou estar distribuídos segundo um dado padrão, tal como bandas, de forma a que se possa discernir um padrão de ligação de antigénio.

As misturas simples de antigénios compreendem os mesmos antigénios em qualquer meio solvente ou dispersante adequado.

Tipos de Ensaios Usando Combinações de Antigénios

Os antigénios do HCV podem ser empregues, realmente, em

qualquer tipo de ensaio que utilize um antigénio conhecido para a detecção de anticorpos. Uma característica comum em todos estes ensaios é o facto de que o antigénio é posto em contacto com o componente do organismo suspeito de conter anticorpos anti-HCV, sob condições que permitem que o antigénio se ligue a qualquer de tais anticorpos presentes no componente. Tais condiçOes serão, tipicamente, a temperatura, o pH e a força iónica fisiológicos, usando-se um excesso de antigénio. A incubação do antigénio com a amostra é seguida da detecção de imunocomplexos contendo o antigénio.

heterogéneo competitivo,

A concepção dos imunoensaios encontra-se sujeita a bastantes variações, e a técnica inclui uma grande variedade de tipos de ensaio. Os protocolos poderão, por exemplo, usar suportes sólidos, ou imunoprecipitação. A maior parte dos ensaios envolve o uso de anticorpo, ou polipêptido, marcado; os marcadores podem ser, por exemplo, enzimáticos, fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivos, ou moléculas corantes. São também conhecidos ensaios que amplificam os sinais provenientes do imunocomplexo; exemplos destes últimos são os ensaios que utilizam a biotina ou a avidina, e os imunoensaios mediados, e marcados, por enzimas, tais como os ensaios ELISA.

imunoensaio pode ser, sem limitação, de carácter ou homogéneo, e de um tipo padronizado ou Num ensaio heterogéneo, o polipêptido encontra-se tipicamente ligado a uma matriz ou suporte sólido, de modo a facilitar a separação entre a amostra e o polipêptido, após a incubação. Exemplos de suportes sólidos que podem ser usados incluem a nitrocelulose (e.g., sob a forma de membrana ou de

cúpula de microtitulação), cloreto de polivinilo (e.g., em folhas ou cúpulas de microtitulação), latex de poliestireno (e.g., em esferas ou placas de microtitulação), fluoreto de polivinilidina (conhecido como Immulon®, papel diazotizado, membranas de nylon, esferas activadas, e esferas de Proteina A. Por exemplo, as placas de microtitulação InunulonO^ 1 ou Immulon^) 2, da Dynatech, ou esferas de poliestireno de 0,25 polegadas (Precision Plastic Bali) podem ser usadas no formato heterogéneo. O suporte sólido contendo os polipéptidos antigénicos é, tipicamente, lavado após a sua separação da amostra de teste, e anteriormente à detecção dos anticorpos ligados. Os ensaios dos tipos padronizado e competitivo são já conhecidos da técnica.

Num ensaio homogéneo, a amostra de teste é incubada com a combinação de antigénios em solução. Por exemplo, o ensaio pode decorrer sob condições que provocarão a precipitação de quaisquer complexos anticorpo-antigénio formados. São igualmente conhecidos da técnica os tipos padronizado e competitivo para estes ensaios.

Num ensaio padronizado, a quantidade de anticorpos de HCV que formam o complexo anticorpo-antigénio é directamente monitorizada. Tal pode ser conseguido determinando qual a quantidade de anticorpos anti-xenogénicos (e.g., anti-humanos) marcados, que reconhecem um epitopo presente nos anticorpos antiHCV, que se ligará em consequência da formação de complexos. Num ensaio competitivo, a quantidade de anticorpos anti-HCV presentes numa amostra é deduzida através da monitorização do efeito competitivo, relativamente à ligação, de uma quantidade conhecida de anticorpo marcado (ou de outro ligando competitivo) presente no complexo.

Os complexos formados, compreendendo o anticorpo antiHCV (ou, no caso dos ensaios competitivos, a dada quantidade de anticorpo competitivo), são detectados através de qualquer de uma variedade de técnicas conhecidas, dependendo do tipo de ensaio. Por exemplo, podem detectar-se anticorpos anti-HCV não marcados, presentes no complexo, usando um conjugado formado por uma Ig antixenogeneica complexada com um marcador (e.g., um marcador enzimático).

Num ensaio de imunoprecipitaçâo ou de aglutinação, a reacção entre os antigénios do HCV e o anticorpo forma uma rede, que precipita a partir da solução ou suspensão, e forma uma camada, ou pelicula, de precipitado, visível. Se não estiver presente nenhum anticorpo anti-HCV num espécime de teste, não se forma qualquer precipitado visivel.

Os antigénios do HCV serão tipicamente embalados na forma de um kit para uso nestes imunoensaios. 0 kit conterá normalmente em depósitos separados a combinação de antigénios (ou já ligados a uma matriz sólida, ou separados, com reagentes para os ligar à matriz), formulações de controlo de anticorpo (positivo e/ou negativo), anticorpos marcados quando o tipo de ensaio os requer, e reagentes geradores de sinal (e.g., substrato enzimático) se o marcador não gera o sinal directamente. Serão geralmente incluídas instruções para a realização do ensaio (e.g., escritas, gravadas, em cassete video, em CD-ROM, etc.).

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar o invento e não pretendem, de forma alguma, limitá-lo.

Exemplo 1: Síntese do Antigénio C33c do HCV antigénio C33c do HCV contém uma sequência proveniente do dominio NS3. Especificamente, o antigénio inclui as aminoáeidos 1192-1457 da Figura 1. Este antigénio foi produzido em bactérias sob a forma de uma proteina de fusão com a superóxido dismutase (SOD) humana, como se segue. 0 vector pSODcfl (Steiner et al. (1986), J. Virol. 58:9) foi digerido por completo pela EcoRI e BAMHI, e o fragmento de digestão EcoRI,BamHI resultante foi ligado ao linker seguinte para formar o pcflEF:

GATC CTG GAA TTC TGA TAA

GAC CTT AAG ACT ATT TTA A

Foi introduzido no pcflEF um clone de cDNA codificando para os aminoáeidos 1192-1457, e possuindo extremidades digeridas pela EcoRI, de modo a formar-se o pcflEF/C33c. Esta construção de expressão foi transformada recorrendo a células de E. coli D1210.

Os transformantes foram usados para expressar uma proteina de fusão, composta de SOD na extremidade N e do antigénio C33c do HCV, no interior da cadeia, na extremidade C. A expressão foi possibilitada inoculando 1500 ml de caldo Luria contendo ampicilina (100 μg/ml) com 15 ml de uma cultura de 12 horas dos transformantes. As células foram cultivadas até uma

D.O. de 0,3, foi adicionado IPTG para produzir uma concentração final de 2 mM, e a cultura continuou até que as células atingissem uma densidade de 1 D.O., altura em que foram recolhidas por centrifugação a 3.000 x g, a 4°C, durante 20 minutos. As céulas empilhadas podem ser armazenadas a -80° durante diversos meses.

De forma a purificar o polipéptido SOD-C33c, as células bacterianas em que o polipéptido foi expresso foram sujeitas a choque osmótico e ruptura mecânica, sendo a fracção insolúvel, contendo o SOD-C33c, isolada e submetida a extracção diferencial com uma solução alcalina de NaCl, e o polipéptido de fusão presente no extracto purificado, por cromatografia em colunas de sefarose S e sefarose Q.

extracto em bruto, resultante do choque osmótico e ruptura mecânica, foi preparado pelo procedimento seguinte. Suspendeu-se lg das células empilhadas em 10 ml de uma solução contendo Tris-HCl 0,02 M, pH 7,5, EDTA 10 mM, sucrose a 20%, e fez-se a incubação durante 10 minutos, em gelo. Obteve-se, então, um pellet de células por centrifugação a 4.000 x g, durante 15 min., a 4°C. Após a remoção do sobrenadante, os pellets de células foram ressuspensos em 10 ml de Tampão Al (Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5, EDTA 1 mM, beta-mercaptoetanol [BME] 14 mM), e incubados em gelo durante 10 minutos. As células foram de novo centrifugadas para formar um pellet, a 4.000 x g durante 15 minutos, a 4°C. Após remoção do sobrenadante limpido (fracção periplásmica I), os pellets de células foram ressuspensos em Tampão Al, incubados em gelo durante 10 minutos, e de novo centrifugados a 4.000 x g, durante 15 minutos, a 4°C. O sobrenadante limpido (fracção periplásmica II) foi removido, e o pellet de células ressuspenso em 5 ml de Tampão A2 (Tris-HCl 0,02 M, pH 7,5, BME 14mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM) . Para obter a ruptura das células, a suspensão (5 ml) e 7,5 ml de esferas de vidro Dyno-mill isentas de chumbo, lavadas com ácido (0,10-0,15 mm de diâmetro; obtidas através da Glen-Mills, Inc.) foram colocadas

num tubo Falcon e vortexadas a velocidade máxima durante dois minutos, seguindo-se um arrefecimento em gelo de pelo menos 2 minutos; o procedimento de vortexação-arrefecimento foi repetido por mais quatro vezes. Após a vortexação, a suspensão de finas partículas foi filtrada através de um funil de vidro usando sucção baixa; as esferas de vidro foram lavadas por duas vezes com Tampão A2, e o filtrado e as lavagens foram combinados.

A fracção insolúvel do extracto em bruto foi recolhida por centrifugação a 20.000 x g, durante 15 minutos, a 4°C, lavada por duas vezes com 10 ml de Tampão A2, e ressuspensa em 5 ml de água MILLI-Q.

Foi isolada, a partir do material insolúvel, uma fracção contendo SOD-C33c, adicionando à suspensão NaOH (2 M) e NaCl (2 Μ), para obter uma concentração final de 20 mM de cada, vortexando a mistura durante 1 minuto, centrifugando-a a 20.000 x g durante 20 minutos a 4°C, e retendo o sobrenadante.

Para purificar o SOD-C33c em sefarose S, a fracção do sobrenadante foi ajustada até uma concentração final de ureia a 6 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, BME 14 mM, EDTA 1 mM. Esta fracção foi então aplicada a uma coluna de S-Sepharose Fast Flow (1,5 x 10 cm) que havia sido equilibrada com Tampão B (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, BME 14 mM, EDTA 1 mM) . Após a aplicação, a coluna foi lavada com dois volumes, equivalentes ao volume da coluna, de Tampão B. As fracções de eluição e de lavagem foram recolhidas. A taxa de fluxo da aplicação e da lavagem foi de 1 ml/min; e as fracções recolhidas foram de 1 ml. De modo a identificar as fracções contendo SOD-C33c, foram analisadas aliquotas das fracções por electroforese em geles de poliacrilamida a 10% contendo SDS, seguindo-se a coloração com azul de Coomassie. As fraeções são igualmente analisáveis pela técnica de Western Blot, usando um anticorpo dirigido contra a SOD. As fraeções contendo

SOD-C33c foram recolhidas.

Procedeu-se a uma purificação mais completa do SOD-C33c numa coluna de sefarose Q (1,5 x 5 cm) que havia sido equilibrada com Tampão B. As fraeções recolhidas contendo SOD-C33c, obtidas por cromatografia em sefarose S, foram aplicadas sobre a coluna. A coluna foi então lavada com Tampão B, e eluida com 60 ml de um gradiente de 0.0 a 0,4 M de NaCl em Tampão Β. A taxa de fluxo para a aplicação, lavagem, e eluição foi de 1 ml/min; as fraeções recolhidas foram de 1 ml. Todas as fraeções provenientes da coluna de sefarose Q foram analisadas tal como decrito para a coluna de sefarose S. 0 pico de SOD-C33c correspondeu à fracção eluida da coluna, à concentração de NaCl de cerca de 0,2 M.

O SOD-C33c, obtido a partir da coluna de sefarose Q, possuia um grau de pureza superior a cerca de 90%, tal como determinado por análise em geles de poliacrilamida-SDS e por imuno-transferência (immuno-blot), usando um anticorpo monoclonal dirigido contra a SOD humana.

Exemplo 2; Síntese do Antigénio C100 do HCV 0 antigénio C100 do HCV contém sequências provenientes dos dominios NS3 e NS4. Especificamente, ele inclui os aminoácidos 1569-1931 da Figura 1. Este antigénio foi produzido em leveduras. Foi preparado um fragmento de cDNA com 1270 pb, codificando para os aminoácidos acima referidos e possuindo extremidades digeridas pela EcoRI.

A construção de um vector de expressão de levedura, no qual este fragmento foi directamente fundido com o promotor ADH2/GAP da S. cerevisiae, foi conseguida através de um protocolo que incluiu a amplificação da sequência do C100 usando um método de PCR, seguida da ligação da sequência amplificada a um vector de clonagem. Após a clonagem, a sequência de C100 foi retirada, e, juntamente com uma sequência contendo o promotor ADH2/GAP, ligada a um grande fragmento de um vector de levedura de modo a obter-se um vector de expressão de levedura.

A amplificação por PCR do C100 foi conseguida usando como molde o vector pS3-56ci00m/ 9^ue havia sido linearizado por digestão pela Sall. 0 plasmídeo pS3-56, que é um derivado do pBR322, contém uma cassette de expressão que é composta do promotor hibrido de levedura ADH2/GAPDH, a montante do gene da superóxido dismutase humana, e de um terminador da transcrição do factor alfa, a jusante.

Os primers oligonucleotidicos usados para a amplificação foram concebidos para facilitar a clonagem no vector de expressão, e para introduzir um codâo de terminação da tradução. Especificamente, foram gerados novos locais de restrição da HindIII (em -5') e da Sall (em -3') com os oligonucleótidos de PCR. 0 oligonucleótido contendo o local de restrição da Sall codifica igualmente para os codões de terminação, TAA e TGA. 0 oligonucleótido contendo o local de restrição da HindIII contém igualmente uma sequência leader não traduzida derivada do gene pgap63, situado imediatamente a montante do codâo AUG. 0 gene pEco63GAPDH foi descrito por Holland e Holland (1980) e por Kniskern et al. (1986). As

sequências primer de PCR, usadas para a expressão directa do

ClOOm, foram:

5'

GAG

ACT

TGC

TTC

TCA AGC TAT CCC

TTC AAA ACA AAA TGG CTC AGA CAA AGC AGA GT 3'

5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3'.

A amplificação por PCR, utilizando os primers e o molde, foi efectuada com um kit de PCR da Cetus-Perkin-Elmer, e de acordo com as instruções do fabricante. As condições da técnica de PCR foram as de 29 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 37°C durante 2 minutos, 72°C durante 3 minutos, e a incubação final a 72°C durante 10 minutos. O DNA pode ser armazenado a 4°C ou a -20°C durante 12 horas.

Após a amplificação, os produtos de PCR foram digeridos pela HindIII e pela Sall. 0 produto principal de 1,1 kb foi purificado por electroforese em gel, e o produto purificado eluido foi ligado a um grande fragmento de restrição, pela HindIII, do pBR322. Com o objectivo de se isolarem recombinantes correctos, foram transformadas células competentes HB101 com os vectores recombinantes, e, após clonagem, os recombinantes desejados foram identificados com base no tamanho previsto dos fragmentos de restrição de HindIII-SalI que foram removidos dos clones. Um dos clones que continha um fragmento de restrição de HindIII-SalI com a dimensão correcta foi designado por pBR322/C100^-d. A confirmação de que este clone continha o C100 amplificado foi feita por análise sequencial directa do fragmento de restrição de HindIII-SalI.

vector de expressão contendo C100 foi construido por ligação do fragmento de restrição de HindIII-SalI do pBR322/C100~ d a um fragmento de restrição de BamHI-SalI, com 13,1 kb, do pBS24.1, e a um fragmento de restrição de BamHI-HindíII, com 1369 pb, contendo o promotor ADH2/GAP (este último fragmento está descrito na EPO 164.556). 0 vector pBS24.1 está descrito na patente norte-americana com o número de série 382.805, de 19 de Julho de 1989. 0 fragmento contendo o promotor ADH2/GAP foi obtido por digestão do vector pPGAP/AG/HindIII pela HindíII e pela BamHI, seguindo-se a purificação em gel do fragmento com 1369 pb.

Foram transformadas células competentes HB101 com os vectores recombinantes; e foram identificados os recombinantes correctos pela geração de um fragmento com 2464 pb e de outro fragmento com 13,1 kb, criados por digestão, por BamHI e Sall, dos vectores clonados. Um dos vectores recombinantes clonados considerado correcto foi designado por pC100^-d#3.

Para a expressão de C100, células competentes de Saccharomyces cerevisiae, da estirpe AB122 (MATa leu2 ura3-53 prb

1-1122 pep4-3 prcl-407[cir-0]) foram transformadas com o vector de expressão pC100~d#3. As células transformadas foram semeadas em placas com meio de URA-sorbitol, e os transformantes individuais foram semeados por estria em placas Leu .

Os clones individuais foram cultivados em meio Leu^-, ura com 2% de glucose, a 30°C, durante 24-36 horas. Um litro de meio com extracto de levedura e peptonado (YEP) contendo 2% de glucose foi inoculado com 10 ml da cultura de 12 horas, e a cultura resultante foi cultivada a 30°C, a uma taxa de agitação de 400 rpm e a uma taxa de arejamento de 1 litro de ar por 1 litro de meio por minuto (i.e., 1 vvm), durante 48 horas. 0 pH do meio não foi controlado. A cultura foi cultivada num fermentador

BioFlo II, fabricado pela New Brunswick Science Corp.. Após a fermentação, as células foram isoladas e analisadas quanto à expressão do C100.

A análise da expressão do polipéptido C100 pelas células transformadas foi efectuada em lisados de células totais e em extractos em bruto, preparados a partir de colónias isoladas de leveduras obtidas a partir das placas Leu . Os lisados e extractos em bruto de células foram analisados por electroforese em geles de poliacrilamida-SDS, e por técnicas de Western Blot. As técnicas de Western Blot usaram como sondas anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra o polipéptido SOD-CIOO expresso pelas leveduras. A dimensão esperada do polipéptido C100 é de 364 aminoácidos. Por análise em gel, o polipéptido expresso tem um MW_r de 39,9K.

Ambos os métodos analíticos demonstraram que o polipéptido C100 expresso se encontrava presente nos lisados de células totais, mas que se encontrava ausente dos extractos em bruto. Estes resultados sugerem que o polipéptido C100 expresso pode ser insolúvel.

Exemplo 3: Expressão do Antigénio S2 do HCV

O antigénio S2 do HCV contém uma sequência proveniente da extremidade N, hidrofóbica, do dominio S. Ele inclui os aminoácidos 199-328 da Fig. 1.

protocolo para a construção do vector de expressão

codificando para o polipêptido S2 e para a sua expressão em leveduras foi análogo ao usado para a expressão do polipêptido C100, descrito no Exemplo 2.

molde para a reacção de PCR foi o vector pBR322/Pil4a, que havia sido linearizado por digestão pela HindIII. 0 Pil4a é um clone de cDNA que codifica para os aminoácidos 199-328.

Os oligonucleótidos usados como primers para a amplificação por PCR da sequência codificando para o S2 foram os seguintes.

Para a região 5' da sequência do S2:

5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3';

e para a região 3' da sequência do S2:

5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC ATC ATC ATA TCC CAT GCC AT 3'.

primer para a região 5' introduz um local de restrição para a HindIII e um codão de iniciação ATG no produto amplificado. 0 primer para a região 3' introduz codões de terminação da tradução e um local de restrição para a Sall no produto amplificado.

As condições para a PCR foram de 29 ciclos de 94°C durante um minuto, 37°C durante 2 minutos, 72°C durante 3 minutos, e a incubação final deu-se a 72°C durante 10 minutos.

produto principal da reacção de PCR foi um fragmento de 413 pb, que foi purificado em gel. O fragmento purificado foi ligado ao grande fragmento obtido a partir do pBR322 digerido por

HindIII e Sall, obtendo-se o plasmídeo pBR322/S2d.

A ligação do fragmento S2, obtido por restrição por HindIII-SalI com o fragmento de restrição por BamHI-HindiII, com 1,36 kb, contendo o promotor ADH2/GAP, e com o grande fragmento de restrição, por BamHI-SalI, do vector de levedura pBS24.1, produziu vectores recombinantes, que foram clonados. Os vectores recombinantes correctos foram identificados pela presença de um fragmento de 1,77 kb, após digestão por BamHI e Sall. Um vector de expressão, construído a partir da sequência amplificada, e contendo a sequência que codifica para S2, directamente fundida no promotor ADH2/GAP, é identificado como pS2d#9.

Exemplo 4: Sintese do Antigénio C do HCV antigénio C22 do HCV pertence ao dominio C. 0 mesmo compreende os aminoácidos 1-222 da Figura 1.

protocolo para a construção do vector de expressão, codificando para o polipêptido C e para a sua expressão em leveduras, foi análogo ao usado para a expressão do polipêptido C100, descrito supra, excepto nos aspectos seguintes.

molde para a reacção de PCR foi o pBR322/Ag30a, que havia sido linearizado pela HindIII. Ag30 é um clone de cDNA que codifica para os aminoácidos 1-222. Os oligonucleótidos usados como primers para a amplificação, por PCR, da sequência codificando para o polipêptido C foram os seguintes.

Para a região 5' da sequência C:

5' GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA GCA CGA ATC CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3' , e

para a região 3' da sequência C:

5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3'.

primer para a região 5' introduz um local de restrição para a Hindlll no produto amplificado, e o primer para a região 3' introduz codões de terminação da tradução e um local de restrição para a Sall. A reacçâo de PCR decorreu em 29 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 37°C durante 2 minutos, 72°C durante 3 minutos, e a incubação final deu-se a 72°C durante 10 minutos.

principal produto resultante da amplificação por PCR é um polinucleótido com 381 pb. A ligação deste fragmento ao grande fragmento de restrição, por SalI-HindIII, do pBR322, produziu o plasmídeo pBR322/C2.

A ligação do fragmento de restrição, por HindIII-SalI, codificando para o polipéptido C e com 381 pb, que foi retirado do pBR322/C2, ao fragmento de restrição, por BamHI/HindIII, com 1,36 kb e contendo o promotor ADH2/GAP, e ao grande fragmento de restrição, por BamHl/SalI, do vector de levedura pBS24.1, produziu vectores recombinantes, que foram clonados. 0 vectores recombinantes correctos foram identificados pela presença de um fragmento com 1,74 kb, após digestão por BamHI e Sall. Um vector de expressão, construído a partir da sequência amplificada, e contendo a sequência que codifica para C directamente fundida ao promotor ADH2/GAp, é identificado como pC22.

A análise da expressão do polipéptido C, pelas células transformadas, foi efectuada em lisados de células totais e extractos em bruto, preparados a partir de colónias de leveduras simples obtidas destas placas Leu^-. Os lisados de células e

'''χίί extractos em bruto foram analisados por electroforese em geles d_e poliacrilamida SDS. Espera-se que o polipéptido C possua 122 aminoâcidos, e, por análise em gel, o polipéptido expresso possui um MW_r de, aproximadamente, 13,6 Kd.

Exemplo 5: Sintese do polipéptido NS5

Este polipéptido contém uma sequência proveniente da extremidade N do dominio NS5. Especificamente, ele inclui os aminoâcidos 2054-2464 da Fig. 1. 0 protocolo para a construção do vector de expressão codificando para o polipéptido NS5, e para a sua expressão, foi análogo ao usado para a expressão do C33c (ver Exemplo 1).

Exemplo 6: Radioimunoensaio (RIA) para anticorpos anti-HCV

Os antigénios do HCV dos Exemplos 1-5 foram testados num ensaio RIA quanto à sua capacidade de detecção de anticorpos anti-HCV no soro de indivíduos clinicamente diagnosticados como portadores do HCV (Não-A, Nâo-B) e no soro retirado do sangue de dadores remunerados.

RIA foi baseado na técnica de Tsu e Herzenberg (1980), em SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman & Co.) págs. 373-391, De maneira geral, placas de imunotitulaçâo (Immulon 2, tiras Removawell) são revestidas com antigénio HCV purificado. As placas revestidas são incubadas com as amostras de soro ou com os controlos apropriados. Durante a incubação, o anticorpo, se presente, liga-se imunologicamente ao antigénio em fase sólida. Após a remoção do material não ligado e a lavagem das placas de microtitulaç:ao, são detectados os complexos de anticorpo humano-antigénio NANBV, por incubação com 125 imunoglobulina de ovelha, anti-humana, marcada com I. 0 anticorpo marcado não ligado é removido por aspiração, e as placas são lavadas. E determinada a radioactividade nas cúpulas individuais; a quantidade de anticorpo anti-HCV humano ligado é proporcional à radioactividade na cúpula.

Especificamente, aliquotas de 100 μΐ contendo 0,1 a 0,5 gg do antigénio HCV em tampão de borato sódico 0,125 M, pH 8,3,

NaCl 0,075 M (BBS) foram adicionadas a cada cúpula de uma placa de microtitulação (immulon 2 Removawell Strips, da Dynatech). A placa foi incubada a 4°C, durante a noite, numa câmara húmida, após o que a solução de antigénio foi removida e as cúpulas foram lavadas por três vezes com BBS contendo 0,02% de Triton X-100 (BBST). Para evitar a ligação nâo-especifica, as cúpulas foram revestidas com albumina sérica bovina (BSA), por adição de 100 μΐ de uma solução de 5mg/ml de BSA em BBS, seguindo-se a incubação à temperatura ambiente durante 1 hora; após esta incubação, a solução de BSA foi removida. Promoveu-se a reacção entre os antigénios presentes nas cúpulas revestidas, e o soro, através da adição de 100 μΐ de amostras de soro, diluidas a 1:100 em tampão fosfato sódico 0,01 M, pH 7,2, 0,15 M NaCl (PBS) contendo 10 mg/ml de BSA, e da incubação das cúpulas contendo soro durante 1 hora, a 37°C. Após a incubação, as amostras de soro foram removidas por aspiração, e as cúpulas foram lavadas por 5 vezes com BBST. A quantidade de anticorpo ligado ao antigénio foi determinada pela ligação de IgG F'(ab)2 de ovelha, anti-humana, 125 marcada com I, às cúpulas revestidas. Foram adicionadas a cada

cúpula aliquotas de 100 μΐ da sonda marcada (actividade especifica 5-20 μθχ/μ9), e as placas foram incubadas a 37°C durante 1 hora, seguindo-se a remoção do excesso de sonda por aspiração, e 5 lavagens com BBST. A quantidade de radioactividade ligada presente em cada cúpula foi determinada por contagem num contador que detecta a radiação gama.

A Tabela 1, abaixo, apresenta os resultados dos testes

efectuados	com o soro	proveniente de indivíduos	diagnosticados
como sendo	portadores	do HCV.
		Tabela 1
INDIVÍDUO			ANTIGENIO
		S2	C22	C100	C33c	NS5
CVH	IVDA	P	P	P ( + + +)	P	P
CVH	IVDA	P	P	P( + )	P	P
CVH	IVDA	P	P	P(+)	P	P
CVH	NOS.	P	P	P	P	P
AVH	NOS HS	N	N	N	N	N
AVH	NOS HS	P	N	N	N	N
AVH	NOS HS	P	N	N	N	N
AVH	NOS HS	P/N	N	N	N	N
AVH	PTVH	N	N	N	P/N	N
AVH	NOS HS	N	N	N	N	N
AVH	NOS	N	N	N	N	P
AVH	PTVH	N	N	' N	N	N
AVH	IVDA	N	P	N	P	P
AVH	PTVH	P	P/N	N	N	P
AVH	NOS	N	P	N	N	N
AVH	IVDA	• N	P	N	P	P
AVH	NOS HS	P/N	N	N	N	N
AVH	PTVH	N	N	N	N	N
CVH	IVDA	P	P	P	P	P
CVH	IVDA	P	P	P	P	P
AVH	NOS HS	N	N	N	N	N
CVH	PTVH	P	P	N	N	N
AVH	PTVH	P	N	P( + )	P(+++) N
CVH	PTVH	N	P	P	P	P
CVH	NOS HS	P	P	P	P	N
CVH	NOS	N	P	P/N	P	P

INDIVÍDUO

ANTIGÉNIO

	S2	C22	C100	C33c	NS5
CVH IVDA	N	N	N	P	N
AVH IVDA	P	P	P	P	P
AVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
AVH IVDA	P/N	F	N	P	P
AVH IVDA	N	P	P	P	N
CVH PTVH	P	P/N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH IVDA	P	P	P	P	P
AVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
AVH PTVH?	N	P	P	P	P
AVH IVDA	N	P	N	P	N
AVH NOS	N	N	N	N	N
AVH NOS	N	N	N	N	N
CVH NOS	N	P	N	N	P
CVH NOS	P	P	N	N	N
CVH NOS HS	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	N	P	P
AVH (enfermeiro)	P	P	N	N	N
AVH IVDA	P	P	P	P	N
AVH IVDA	N	P	P(4·)	P(+++)	N
&VH (enfermeiro)	P/N	P	N	N	N
AVH PTVH	P/N	P	P	N	P
AVH NOS	N	P/N	N	N	P
AVH NOS	N	P	N	P	N
AVH PTVH	P	P/N	N	N	N
AVH PTVH	N '	P	N	P	P
AVH PTVH	P	P	P	P	P
AVH PTVH	N	P	N	N	P
CVH PTVH	P/N	P	P( + )	P(+++)	N
AVH PTVH	N	P/N	P( + )	P(+++)	P

INDIVÍDUO

ANTIGÉNIO

	S2	C22	C100	C33c	NS5
AVH PTVH	P	< ? )	P	N	P
CVH PTVH	N	P	N	P	P
CVH PTVH	N	P	P	P	P
CVH PTVH	N	N	N	N	N
AVH NOS	N	N	N	N	N
AVH enfermeiro	P	P	N	N	N
CVH PTVH	N	P	N	N	P
AVH IVDA	N	P	N	P/N	N
CVH PTVH	P	P	P( + )	P(+++)	P
AVH NOS	P	P	N	N	N
AVH NOS	P/N	P	N	N	P
AVH PTVH	P/N	P	P	P	P
AVH NOS	N	P	P	P	P/N
AVH IVDA	N	P	N	N	P
AVH NOS	N	P/N	N	N	N
AVH NOS	P	P	N	N	P
AVH PTVH	N	P	P	P	P
crypto	P	P	P	P	P
CVH NOS	N	P	P	P	P
CVH NOS	N	N	N	N	N
AVH PTVH	N	P	P( + )	P(++)	N
AVH PTVH	N	P/N	P( + )	P(++)	P
AVH PTVH	N	P/N	P( + )	P(++)	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
AVH NOS	N	P	N	N	N
CVH IVDA	P	P	P	P	P/N
AVH IVDA	P	P	P	P	N
AVH NOS	P	P	N	N	N
AVH NOS	P	P	N	N	N
CVH PTVH	P	P	N	N	P/N

INDIVÍDUO

ANTIGÉNIO

	S2	' £22	C100	C33c	NS5
AVH PTVH	N	P	N	P	P
AVH NOS	N	N	N	N	N
AVH NOS	N	P	N	N	N
AVH NOS	P	N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
AVH NOS	N	P/N	N	N	N
AVH IVDA	N	P	P.	P	P
crypto	N	P	N	N	P/N
crypto	P	P	P/N	P	P
AVH IVDA	N	N	P	P	N
AVH IVDA	N	P	P	P	N
AVH NOS	N	N	N	N	N
AVH NOS	N	N	N	N	N
CVH IVDA	P	F	P	P	P
CVH PTVH	N	N ·	N	N	N
CVH PTVH	P	P	P( + )	P(+++)	P
CVH PTVH	P	P	P( + )	P(+++)	P
CVH NOS	P/N	N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH PTVH	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
AVH IVDA	N	P	P	P	P
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH PTVH	P	P	P	P	P
AVH NOS	P	P	N	N	P/N
AVH NOS	N	Ρ / N	N	N	N
CVH PTVH	P	P	N	N	P
CVH NOS	N	P N	N	N	N
AVH NOS	N	r	N	N	N
AVH NOS	N	P	N	N	N
CVH PTVH	N	P	N	N	N

ANTIGÉNIO

INDIVÍDUO

	S2	C2 2	C100	C33c	NS5
AVH IVDA	N	P	N	P	P
AVH NOS	P	N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH IVDA	P/N	P	P	P	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH IVDA	N	P	P	P	P
AVH NOS	N	P	N	N	N
CVH IVDA	N	P	N	N	P
CVH IVDA	N	P	N	N	P
AVH PTVH	P	P	N	P	P
AVH PTVH	P	P	N	P	P
CVH NOS	N	P/N	N	N	P/N
CVH NOS	N	P	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH PTVH	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
AVH IVDA	N	P	N	N	P
AVH IVDA	N	P	P(++)	P( + )	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
AVH PTVH	N	P	P	P	P
CVH PTVH?	N	P	P	P	P
CVH PTVH?	P/N	P	P	P	P
CVH NOS HS	• P	P	N	N	N
CVH IVDA	P	P	P	P	N
CVH PTVH	N	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P/N
CVH NOS	P	P	P	P	P
CVH IVDA	P	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	N
CVH PTVH	P	P	P	P	P

indivíduo

ANTIGÉNIO

	S2	C22	C100	C33c	NS5
CVH NOS	N	N	N	N	P/N
CVH NOS	N	P/N	N	N	P/N
CVH PTVH	P	P	P	P	P
CVH NOS	N	P	N	N	N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH NOS	P	P	N	N	P/N
CVH NOS	N	N	N	N	N
CVH NOS HS	P	P	P	P	P
CVH NOS HS	P	P	P	P	P
CVH PTVH	N	N	N	N	N
AVH PTVH	N	P	P	P	P
AVH NOS			-	-
CVH PTVH	N	P	P/N	P(+++)	N
crypto	P	P	P	P	P
crypto	P	P	P	P	P
crypto	N	P	N	N	N
crypto	N	P	P	P	P
CVH PTVH	P	P	P	P	P
crypto	N	N	N	N	N
crypto	N	P	N	N	P/N
crypto	N	P	N	N	P
crypto	P	P	P	P	P
crypto	N	P	N	P	N
crypto			-
crypto			-	-
CVH NOS			-	-
AVH-IVDA	N	P	N	P(+)	P

INDIVÍDUO_____ANTIGÉNIO

	S2 C2 2	C100	C33c
AVH-IVDA	N P/N	N	P(++
AVH = hepatite	virai aguda
ÇVH = hepatite	virai crónica

PTVH = hepatite virai pós-transfusional

IVDA = toxicodependente de drogas intravenosas

Crypto = hepatite criptogénica

NOS = fonte não evidente

P = positivo

N = negativo

Segundo estes resultados, nenhum antigénio isolado reagiu com todos os soros. Os antigénios C22 e C33c foram os mais reactivos, e o S2 reagiu com alguns soros de alguns casos putativos de infecção aguda por HCV com os quais nenhum outro antigénio reagiu. Com base nestes resultados, a combinação de dois antigénios, que proporcionaria a maior gama de detecção é a de C22 e C33c. Se fosse desejada a detecção de um máximo de infecções agudas, o S2 seria incluido na combinação.

A Tabela 2, abaixo, apresenta os resultados dos testes efectuados em dadores de sangue remunerados.

Tabela 2 Antigénios

Dador

C100

N

N

P

N

N

N

N

N

Ç33c

N

N

P

N

N

N

N

N czz

N

N

P

N

N

N

N

N

S2

N

N

P

N

N

N

N

N

NS5

N

N

P

N

N

N

N

N

Dador

21 22 ’ 27

C100	ANTIGÉNIOS
C33c	C22
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
P	P	P
P	P	N
P	P	N
N	N	N
N	P	P
P	P	P
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
P	P	P
N	N	N
N	N	N
N·	N	N
N	N	P
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N
N	N	N

S2

N

N

N

N

N

N

N

N

N

P

P

P

N

N

P

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NS5

N

N

N . N N N N N N P P P N P P N N Ν' N N N N P N N P P N N N N N P N

Τ’

ί*·*

ANTIGÉNIOS

Dador	C100	C33c	C22	S2	NS5
43	N	N	N	N	N
44	N	N	N	N	N
45	N	N	N	N	N
46	N	N	N	N	N
47	P	P	N	N	P
48	N	N	N	N	N
49	N	N	N	N	N
50	N	N	N	N	N
51	N	P	P	N	P
52	N	N	N	N	N
53	N	P	P	N	P
54	P	P	P	P	N
55	N	N	N	N	N
56	N	N	N	N	N
57	N	N	N	N	N
58	N	N	N	N	N
'59	N	N	N	N	N
60	N	N	N	N	•N
' 61	N	N	N	N	N
62	N	N	N	N	N
63	N	N	N	N	N
64	N	N	N	N	N
65	N	N	N	N	N
66	N	N	N	N	N
67	N	N	N	N	N
68	N·	N	N	N	N
69	N	N	N	N	N
70	P	P	P	P	P
71	N	N	N	N	N
72	N	N	N	N	N
73	P	P	P	P	N
74	N	N	N	N	N
75	N	N	N	N	N
76	N	N	N	N	P

ANTIGÉNIOS

C100

N

N

N

N

N

N

P

N

N

P

N

N

P

P

N

P

N

N

N

N

N

N

P

N

P

NN

P

N

N

N

P

P

C33c

N

N

N

N

N

N

P

N

N

P

N

N

P

P

N

P

N

N

N

N

N

P

P

N

P

N

N

N

P

N

N

N

P

P

C22

N

N

N

N

N

N

N

P

N

P

N

N

P

P

N

P

N

N

N

N

N

P

P

N

P

N

N

N

P

N

N

N

P

P

S2

N

N

N

N

N

N

N

N

N

P

N

N

P

P

N

N

N

N

N

N

N

P

P

N

P

N

N

N

P

N

N

N

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NS5

N

N

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N

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N

N

N

N

N

N

P

P

N

P

N

N

N

N

N

N

N

P

P

Dador

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120 121 122

123

124

125 1-26

127

128 129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

C100	Antigénios C33c C22	S2.	NS5
P	P	P	N	P
N	N	N	N	N
P	P	P	* P	P
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
P	P	P	P	P
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
P	P	P	P	P
N	N	N	N	N
N	P	P	N	P
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
P	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
P	P	P	P	N
N	N	N	N	P
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N-	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
P	N	N	N	N
P	N	P	P	P
N	N	N	N	N
N	N	N	N	N
N	N	- N	N	N

Antigénios

Dador

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160 161 162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

C100

N

N

N

N

N

N

N

N

N

P

N

N

N

N

N

N

P

N

N

P

N

P

N

N

N

NN

N

N

N

N

N

N

N

C 3 3 c N N N N N N N N N P N N N N N N P N N P N P N N N N N N N N N N N N

C22

N

N

N

N

N

N

N

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N

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N

P

N

N

P

N

P

N

N

N

N

N

N

N

N

N

Dador

C100 antigénios

179

180 181 182

183

184

185

186 187 | 188 * 189

190

191

192

193

194

195

196 ' 197

198

199

200

N

N

N

N

P

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

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C33c

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C22

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S2

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NS5

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N

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N

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N

N

N

N

N

N

P

N

P

N

P

N

P

Os resultados obtidos com os dadores remunerados confirmam de forma geral os resultados obtidos a partir dos soros de individuos infectados.

Exemplo 7: Determinações por ELISA de Anticorpos antiHCV Usando uma Combinação de Antigénios de HCV Placas revestidas com uma combinação dos antigénios C22 e C33c são preparadas como se segue. Uma solução contendo um

tampão de revestimento ( borato sódico 50 mM, pH 9,0), 21 ml/placa, BSA (25 (ig/ml), C22 e C33c (2,5 μg/ml cada), é preparada imediatamente antes da adição às placas Removeawell

Immulon I (Dynatech Corp.). Após mistura durante 5 minutos, adicionam-se às placas 0,2 ml da solução por cúpula, cobrindo-se e incubando-se as placas durante 2 horas a 37°C, após o que a solução é removida por aspiração. As cúpulas são lavadas uma vez com 400 μΐ de tampão de lavagem (fosfato sódico 100 mM, pH 7,4, cloreto de sódio 140 mM, 0,1% (p/v) de caseina, 1% (p/v) de

Triton x-100, 0,01% (p/v) de Thimerosal). Após remoção da solução de lavagem, adiciona-se 200 μΐ de solução Postcoat por cúpula (fosfato sódico 10 mM, pH 7,2, cloreto de sódio 150 mM, 0,1% (p/v) de caseina, 3% de sucrose e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), 2 mM), cobrindo-se as placas de forma não estanque para prevenir a evaporação, e permitindo que as mesmas permaneçam à temperatura ambiente durante 30 minutos. As cúpulas são, então, aspiradas para remover a solução, e liofilizadas até secagem, durante a noite, sem aquecimento do suporte. As placas preparadas podem ser armazenadas a 2-8°C em bolsas seladas de aluminio TM contendo um exsicante (pacotes de 3 g de Sorb-it ).

Para a realização da determinação por ELISA, adicionamse 20 μΐ de amostra de soro ou de amostra de controlo a uma cúpula contendo 200 μΐ de diluente da amostra (fosfato sódico 100 mM, pH 7,4, cloreto de sódio 500 mM, EDTA 1 mM, 0,1% (p/v) de caseina, 0,01% (p/v) de Thimerosal, 1% (p/v) de Triton X-100, 100 μ9/ιη1 de extracto de levedura). As placas são seladas, e são incubadas a 37°C durante duas horas, após o que a solução é removida por aspiração, e as cúpulas são lavadas por três vezes com 400 μΐ de tampão de lavagem (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo 0,05% de Tween 20). As cúpulas lavadas são tratadas com 200 μΐ de conjugado de IgG de rato anti-humanaperoxidase de rábano (HRP), contido numa solução de diluente de conjugado Ortho (fosfato sódico 10 mM, pH 7,2, cloreto de sódio 150 mM, 50% (v/v) de soro fetal bovino, 1% (v/v) de soro equideo tratado pelo calor, K3Fe(CN)g 1 mM, 0,05% (p/v) de Tween 20, 0,02% (p/v) de Thimerosal). O tratamento é feito durante 1 hora a 37°C, a solução é removida por aspiração, e as cúpulas são lavadas por três vezes com 400 ml de tampão de lavagem, o qual é igualmente removido por aspiração. Para determinar a quantidade de conjugado enzimático ligado, são adicionados 200 μΐ da solução de substrato (10 mg de dihidrocloreto de O-fenilenodiamina por 5 ml de solução de desenvolvente). A solução de desenvolvente contém citrato de sódio 50 mM, ajustado até pH 5,1 com ácido fosfórico, e 0,6 μΐ/ml de H2O2 a 30%. As placas contendo a solução de substrato são incubadas no escuro durante 30 minutos, à temperatura ambiente, sendo as reacções interrompidas pela adição de 50 μΐ/ml de ácido sulfúrico 4N, e determinando-se as

D. Os.

De forma similar, podem ser realizadas técnicas de ELISA usando proteínas de fusão de C22 e C33c, e C22, C33c e S2 e combinações de C22 e C100, C22 e S2, C22 e um antigénio de NS5, C22, C33c e S2, e C22, C100 e S2.

Modificações dos modos de realização do invento, descritos acima, que são óbvias para os especialistas nos campos de biologia molecular, de imunologia, e em campos relacionados pretende-se que estejam dentro do alcance das seguintes reivindicações.

Claims (16)

1. Um processo de fabrico de uma composição útil num imunoensaio para detecção da hepatite C, caraeterizado pelo facto de compreender a combinação de:

(a) um primeiro antigénio de ACV proveniente do dominio

C; e (b) pelo menos um antigénio de HCV adicional, seleccionado a partir do grupo que consiste de (I) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS3;

(II) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS4;

(III) um antigénio de HCV proveniente do dominio

S; e (IV) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS5.

2. Um processo de preparação de uma combinação de antigénios sintéticos do virus da hepatite C (HCV), caracterizada pelo facto de compreender:

(a) um primeiro antigénio de HCV consistindo essencialmente no dominio C; e (b) um segundo antigénio de HCV proveniente do dominio

NS3.

3. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o primeiro antigénio de HCV ser o C22, e o segundo antigénio de HCV ser o C33c.

4. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de incluir (c) um terceiro antigénio de HCV proveniente do dominio

S.

5. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de incluir (c) o antigénio de HCV S2.

6. Um processo de fabrico de uma composição útil num imunoensaio para a detecção da hepatite C, caracterizado pelo facto de compreender a combinação de:

(a) um primeiro antigénio de HCV consistindo essencialmente no dominio C; e (b) um segundo antigénio de HCV proveniente do dominio

NS4.

7. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o primeiro antigénio do HCV ser o C22, e de o segundo antigénio de HCV ser o C100.

8. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de incluir (c) um terceiro antigénio de HCV proveniente do dominio

S.

9. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de incluir (c) o antigénio de HCV S2.

10. Um processo, conforme reivindicado nas reivindicações 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo facto da combinação estar na forma de um polipéptido de fusão.

11. Um processo, conforme reivindicado nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo facto da combinação possuir o dito primeiro antigénio de HCV e os ditos antigénios adicionais, ligados de forma individual a uma matriz sólida comum.

12. Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto da matriz sólida ser a superfície de uma cúpula de placa de microtitulação, de uma esfera, ou de uma vareta.

13. Um processo, conforme reivindicado nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo facto da combinação estar na forma de uma mistura do dito primeiro antigénio de HCV e do(s) dito(s) antigénio(s) de HCV adicional(ais).

14. Um método para a detecção de anticorpos contra o virus da hepatite C (HCV) num componente de um organismo de um mamifero suspeito de conter os ditos anticorpos, sendo este método caracterizado pelo facto de compreender o estabelecimento de contacto entre o dito componente do organismo com a combinação de antigénios sintéticos de HCV das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou 13, sob condições que permitam a reacção anticorpo-antigénio, e a detecção da presença de imunocomplexos dos ditos anticorpos e dos ditos antigénios.

15. Um método para a detecção de anticorpos contra o virus da hepatite C (HCV) num componente de um organismo de um mamifero suspeito de conter os ditos anticorpos, sendo este método caracterizado pelo facto de compreender o estabelecimento de ¢,, .· β» contacto entre o dito componente do organismo com um conjunto de antigénios sintéticos de HCV, compreendendo:

(a) um primeiro antigénio de HCV proveniente do dominio

C; e (b) pelo menos um antigénio de HCV adicional, seieccionado a partir do grupo que consiste de (I) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS3;

NS4;

S; e (II) um antigénio de HCV proveniente do dominio (III) um antigénio de HCV proveniente do dominio (IV) um antigénio de HCV proveniente do dominio

NS5, sob condições que permitam a reacção anticorpo-antigénio, e a detecção da presença de imunocomplexos dos ditos anticorpos e dos ditos antigénios.

16. Um kit destinado à realização de um ensaio para a detecção de anticorpos contra o antigénio da hepatite C (HCV) num componente de um organismo de um mamifero suspeito de conter os ditos anticorpos, caracterizado pelo facto de compreender, em combinação embalada:

(a) a combinação dos antigénios sintéticos de HCV da reivindicação 1;

(b) reagentes de controlo padronizados; e (c) instruções para a realização do ensaio.