DE69131488T2

DE69131488T2 - Kombinationen der Hepatitis-C-Virus (HCV) Antigene zur Verwendung in Immuntests für Anti-HCV-Antikörper

Info

Publication number: DE69131488T2
Application number: DE69131488T
Authority: DE
Inventors: Qui-Lim Choo; Michael Houghton; George Kuo
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-04-04
Filing date: 1991-04-03
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2011-04-04
Also published as: DK0693687T4; LV10344A; AU7651091A; HU9203146D0; NO923839D0; IL170719A; LTIP1747A; FI924349A; ES2088465T3; IL97741A0; BG96943A; UA41266C2; BR9106309A; CY1881A; NO310241B1; GB2257784B; NO923839L; LT3808B; MY107499A; JPH05508219A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Immunoassays für HCV (zuvor als Non-A-, Non-B-Hepatitis- Virus bezeichnet). Insbesondere betrifft die Erfindung Kombinationen von HCV-Antigenen, die einen breiten Bereich von Immunoassays für Anti-HCV-Antikörper ermöglichen.

Stand der Technik

Die Erkrankung, die zuvor als Non-A-, Non-B-Hepatitis (NANBH) bekannt war, wurde als eine übertragbare Erkrankung oder Familie von Erkrankungen betrachtet, von der man glaubte, daß sie durch ein Virus induziert wird, und die von andere Formen virusassoziierter Lebererkrankungen, einschließlich derjenigen, die durch die bekannten Hepatitisviren hervorgerufen werden, das heißt Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Delta- Hepatitis-Virus (HDV), wie auch die Hepatitis, die durch das Cytomegalovirus (CMV) oder durch das Epstein-Barr-Virus (EBV) induziert werden, unterscheidbar sind. Die NANBH wurde zuerst in transfundierten Patienten identifiziert. Die Übertragung vom Menschen auf Schimpansen und Serienpassagen in Schimpansen führten zum Nachweis, daß die NANBH auf ein übertragbares infektiöses Agens oder übertragbare infektiöse Agentien zurückzuführen war. Epidemiologische Beweise legten nahe, daß es drei Typen von NANBH geben könnte: Ein wasserübertragbarer epidemischer Typ, ein blutübertragbarer oder parenteral übertragbarer Typ und ein sporadisch auftretender Typ (in der sozialen Gemeinschaft erworben). Jedoch wurde bis in die jüngste Vergangenheit kein übertragbares Agens, das für NANBH verantwortlich ist, identifiziert, und die klinische Diagnose und die Identifikation von NANBH wurde in erster Linie durch den Ausschluß anderer viraler Marker durchgeführt. Zu den Verfahren, die verwendet wurden, um putative NANBH-Antigene und -Antikörper nachzuweisen, gehörten Agar- Geldiffusion, Counterimmunelektrophorese, Immunfluoreszenzmikroskopie, Immunelektronenmikroskopie, Radioimmunoessay und enzymgebundener Immunsorbentassay (enzyme-linked immunosorbent assay). Jedoch erwies sich keiner dieser Assays als ausreichend empfindlich, spezifisch und reproduzierbar, um als diagnostischer Test für NANBH verwendet werden zu können.
1987 identifizierten Wissenschaftler der Chiron Corporation (der Anmelderin der vorliegenden Anmeldung) die erste Nukleinsäure, die definitiv im Zusammenhang mit der blutübertragbaren NANBH steht. Siehe z. B. EPA-Veröffentlichung Nr. 318 216; Houghton et al., Science 244: 359 (1989). Diese Publikationen beschreiben die Clonierung eines Isolats einer neuen viralen Klasse, die als Hepatitis-C-Virus benannt wurde (HCV), wobei das Prototypvirus in diesen Publikationen mit "HCV1" bezeichnet wurde. HCV ist ein Flavivirus-ähnliches Virus mit einem RNA-Genom. Die EP-A-318 216 beschreibt außerdem die Immunogenizität des C 100 Polypeptids, das von der HCV-cDNA exprimiert wird, und die Verwendung von HCV- Antigenen in diagnostischen Immunoassays.
Das U. S. Patent Nr. 5 350 671 (Houghton et al.) beschreibt die Herstellung verschiedener rekombinanter HCV-Polypeptide durch Expression von HCV-cDNA und das Durchmustern dieser Polypeptide im Hinblick auf die immunologische Reaktivität mit Seren von HCV- Patienten. Dieses begrenzte Durchmustern zeigte, daß wenigstens fünf der getesteten Polypeptide sehr immunogen waren, insbesondere diejenigen, die als 5-1-1, C100, C33c, CA279c und CA290a bezeichnet wurden. Von diesen fünf Polypeptiden ist 5-1-1 in der putativen NS4- Domäne lokalisiert; C100 überspannt die putativen NS3- und NS4-Domänen; C33c findet sich in der putativen NS3-Domäne und CA279a und CA290a befinden sich innerhalb der putativen C- Domäne. Das Durchmustern zeigte außerdem, daß keines der getesteten einzelnen Polypeptide mit allen Seren immunologisch reaktiv war. Somit sind verbesserte Tests, die mit allen oder mehreren Proben von HCV-positiven Individuen reagieren, wünschenswert. Die WO 91/15574, veröffentlicht am 17. Oktober 1991, beschreibt gereinigte Proteine und Glykoproteine des HCV, die in einem diagnostischen System zum Nachweis humaner HCV-Antiseren nützlich sind.

Offenbarung der Erfindung

Die Anmelderin hat zusätzliche serologische Studien mit HCV-Antigenen durchgeführt, die bestätigen, daß kein einzelnes HCV-Polypeptid, das bis heute identifiziert wurde, mit allen Seren immunologisch reaktiv ist. Dieses Fehlen eines einzelnen Polypeptids, das in universeller Weise mit allen Seren von Individuen mit HCV reaktiv ist, kann inter alia auf Stamm/Stammvariationen der HCV-Epitope, Variabilität in Bezug auf die humorale Antwort zwischen den Individuen und/oder Variationen der Serologie im Zusammenhang mit dem Stadium der Erkrankung zurückzuführen sein.
Diese zusätzlichen Studien haben es der Anmelderin auch ermöglicht, Kombinationen von HCV-Antigenen zu identifizieren, die im Vergleich zu einzelnen HCV-Polypeptiden einen effizienteren Nachweis von HCV-Antikörpern bereitstellen.
Demgemäß ist ein Gesichtspunkt dieser Erfindung eine Kombination von Hepatitis-C- Virus (HCV-Antigenen) in einem Polypeptid oder in mehreren Polypeptiden, die durch chemische Synthese oder rekombinante Expression hergestellt wurde/wurden, umfassend:
(a) ein erstes HCV-Antigen, das ein Epitop von der C-Domäne des HCV-Polyproteins enthält; und
(b) ein zweites IICV-Antigen, ausgewählt aus:
(i) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der S-Domäne enthält;
(ii) einen HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS3-Domäne enthält;
(iii) einen HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS4-Domäne enthält; und
(iv) einen HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS5-Domäne enthält, mit der Maßgabe, daß die Kombination nicht das Peptid p 1 mit C 100-3, das Peptid p35 mit C 100-3, das Peptid p99 mit C100-3 oder ein Peptid mit den Aminosäuren 9 bis 177 des HCV-1-Polyproteins ist.
Vorzugsweise enthält das zweite HCV-Antigen ein Epitop aus der S-Domäne, und in diesem Fall umfaßt die Kombination vorzugsweise wenigstens ein weiteres HCV-Antigen, ausgewählt aus:
(i) einem HCV-Antigen, das ein Epitop aus der NS3-Domäne enthält;
(ii) einem HCV-Antigen, das ein Epitop aus der NS4-Domäne enthält; und
(iii) einem HCV-Antigen, das ein Epitop aus der NS5-Domäne enthält.
Bevorzugter ist das zusätzliche Antigen von der NS3-Domäne.
Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einem Säugetierkörperbestandteil, der im Verdacht steht, die genannten Antikörper zu enthalten, umfassend das Inkontaktbringen des genannten Körperbestandteils mit der oben beschriebenen Kombination von HCV-Antigenen unter Bedingungen, die eine Antikörper- Antigen-Reaktion ermöglichen und Nachweis des Vorhandenseins von Immunkomplexen der genannten Antikörper und der genannten Antigene.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einem Säugetierkörperbestandteil, der im Verdacht steht, die genannten Antikörper zu enthalten, umfassend das Inkontaktbringen des genannten Körperbestandteils mit einer Kombination erfindungsgemäßer HCV-Antigene unter Bedingungen, die eine Antikörper-Antigen- Reaktion ermöglichen, und Nachweis des Vorhandenseins von Immunkomplexen der genannten Antikörper und der genannten Antigene.
Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Kit zum Durchführen eines Assays zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einem Säugetierkörperbestandteil, der im Verdacht steht, die genannten Antikörper zu enthalten, umfassend
(a) die genannte Kombination von HCV-Antigenen
(b) Standardkontrollreagentien; und
(c) Anleitungen zum Durchführen des Assays
in verpackter Kombination.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist die Nukleotidsequenz des cDNA-Sinn- (sense) und Gegensinn(antisense)- stranges des HCV-Polyproteins und die Aminosäuresequenz, die von dem Sinnstrang codiert wird.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz von Fig. 1 und zeigt die putativen Domänen des HCV-Polypeptides.

Durchführungsmöglichkeiten der Erfindung

Definitionen

"HCV-Antigen" bedeutet ein Polypeptid mit wenigstens etwa S Aminosäuren, üblicherweise wenigstens etwa 8 bis 10 Aminosäuren, die ein Epitop definieren, das in einem Isolat von HCV gefunden wird. Vorzugsweise kommt dieses Epitop nur bei HCV vor. Wenn ein Antigen mit einem alphanumerischen Code bezeichnet wird, so stammt das Epitop aus der HCV- Domäne, die durch die alphanumerische Bezeichnung spezifiziert ist.
"Synthetisch", wenn es verwendet wird, um ein HCV-Antigen zu charakterisieren, bedeutet, daß das HCV-Antigen z. B. durch chemische oder rekombinante Synthese künstlich hergestellt wurde.
"Domäne" bezeichnet diejenigen Segmente des HCV-Polyproteins, das in Fig. 2 gezeigt ist, die im allgemeinen den putativen strukturellen und nichtstrukturellen Proteinen von HCV entsprechen. Die Domänenbezeichnungen folgen im allgemeinen der Konvention, die verwendet wird, um Flavivirusproteine zu bezeichnen. Die Positionen der Domänen, die in der Fig. 2 gezeigt ist, sind lediglich abgeschätzt. Die Bezeichnungen "NS" bezeichnen "nichtstrukturelle" Domänen, während "5" die Hülldomäne bezeichnet und "C" das Nukleocapsid oder die Coredomäne bezeichnet.
"Fusionspolypeptid" bedeutet ein Polypeptid, in dem das HCV-Antigen/die HCV- Antigene Teil einer einzelnen durchgängigen Kette von Aminosäuren, die in der Natur nicht vorkommen, ist/sind. Die HCV-Antigene können direkt miteinander durch Peptidbindungen verbunden sein oder sie können durch dazwischenliegende Aminosäuresequenzen getrennt sein. Die Fusionspolypeptide können außerdem Aminosäuresequenzen enthalten, die für HCV exogen sind:
"Gemeinsame feste Matrix" bedeutet einen festen Körper, an den die individuellen HCV- Antigene oder das Fusionspolypeptid, das HCV-Antigene umfaßt, kovalent oder durch nichtkovalente Mittel, wie z. B. hydrophobe Adsorption, gebunden sind.
"Säugetierkörperbestandteil" bedeutet eine Flüssigkeit oder ein Gewebe eines Säugetierindividuums (z. B. ein Mensch), die/das normalerweise Antikörper enthält, die vom Individuum gebildet werden. Solche Bestandteile sind dem Fachmann bekannt und schließen ohne Beschränkung Blut, Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Abscheidungen des Respirationstraktes, des Darmtraktes oder des Urogenitaltraktes, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutzellen und Myeloma ein.
"Immunologisch reaktiv" bedeutet, daß das fragliche Antigen in spezifischer Weise mit Anti-HCV-Antikörpern, die im allgemeinen in einem signifikanten Anteil von Seren von Individuen, die mit HCV infiziert sind, vorhanden sind, reagieren wird.
"Immunkomplex" bedeutet die Kombination oder das Aggregat, die/das gebildet wird, wenn ein Antikörper an ein Epitop auf einem Antigen bindet.

Kombinationen von HCV-Antigenen

Die Fig. 2 zeigt die putativen Domänen des HCV-Polyproteins. Die Domänen, von denen die in den Kombinationen verwendeten Antigene abgeleitet sind, sind: C, S (oder E), NS3, NS4 und NS5. Es wird angenommen, daß die C-Domäne das Nukleocapsidprotein von HCV definiert. Sie erstreckt sich vom N-Terminus des Polyproteins bis zu etwa Aminosäure 120 der Fig. 1. Man nimmt an, daß die S-Domäne das Virionhüllprotein und möglicherweise das Ma trix(M)protein definiert, und es wird angenommen, daß sie sich von etwa Aminosäure 120 bis zur Aminosäure 400 der Fig. 1 erstreckt. Die NS3-Domäne erstreckt sich von etwa Aminosäure 1050 bis zur Aminosäure 1640, und es wird angenommen, daß sie die virale Protease bildet. Die NS4-Domäne erstreckt sich vom Ende des NS3 bis zu etwa Aminosäure 2000. Bislang ist die Funktion des NS4-Proteins nicht bekannt. Schließlich erstreckt sich die NS5-Domäne etwa von Aminosäure 2000 bis zum Ende des Polypeptides, und es wird angenommen, daß sie die virale Polymerase definiert.
Die Sequenz, die in Fig. 1 gezeigt ist, ist die Sequenz des HCV1-Isolates. Es wird angenommen, daß die Sequenzen anderer Stämme des durch Blut übertragbaren HCV von der Sequenz der Fig. 1 abweichen können, insbesondere in den Hüll(S)- und Nukleocapsid(C)- Domänen. Die Verwendung von HCV-Antigenen, die derartige differierende Sequenzen haben, soll vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung mit umfaßt werden, jedoch mit der Maßgabe, daß die Variation nicht in signifikanter Weise die immunologische Reaktivität des Antigens für Seren von Menschen, die mit HCV infiziert sind, herabsetzt.
Im allgemeinen werden die HCV-Antigene ganze oder trunkierte Domänen umfassen, wobei die Domänenfragmente im Hinblick auf die Antigenizität durch Fachleute durchgemustert werden. Die individuellen HCV-Antigene, die in der Kombination verwendet werden, werden vorzugsweise den immundominanten Teil (d. h. den Teil, der hauptsächlich für die immunologische Reaktivität des Polypeptides verantwortlich ist) der genannten Domäne umfassen. Im Falle der C-Domäne ist es bevorzugt, daß das C-Domänen-Antigen den Hauptteil der ganzen Sequenz der Domäne umfaßt. Das Antigen, das als C22 bezeichnet wird (siehe Beispiel 4, unten), ist besonders bevorzugt. Das S-Domänen-Antigen schließt vorzugsweise die hydrophobe Subdomäne arn N-terminalen Ende der Domäne ein. Diese hydrophobe Subdomäne erstreckt sich etwa von Aminosäure 199 bis Aminosäure 328 von Fig. 1. Das HCV-Antigen, das mit 52 bezeichnet ist (siehe Beispiel 3, unten), ist besonders bevorzugt. Die Sequenz stromabwärts der hydrophoben Subdomäne kann, falls gewünscht, in das S-Domänen-Antigen eingeschlossen sein.
Ein bevorzugtes NS3-Domänen-Antigen ist das Antigen, das als C33c bezeichnet wird. Dieses Antigen schließt die Aminosäuren 1192 bis 1457 von Fig. 1 ein. Ein bevorzugtes NS4- Antigen ist C 100, das die Aminosäuren 1569 bis 1931 von Fig. 1 umfaßt. Ein bevorzugtes NS5-Antigen umfaßt die Aminosäuren 2054 bis 2464 von Fig. 1.
Das HCV-Antigen kann in Form eines Polypeptides vorliegen, das vollständig aus HCV- Aminosäuresequenzen zusammengesetzt ist, oder es kann Sequenzen enthalten, die für HCV exogen sind (das heißt, es kann in Form eines Fusionsproteins vorliegen, das exogene Sequenzen mit einschließt). Im Falle rekombinant hergestellten HCV-Antigens kann die Bildung des Antigens als Fusionsprotein, z. B. mit SOD, Alpha-Faktor oder Ubiquitin (US-PS Nr. 4 751 180, US- PS Nr. 4 870 ß08 und U. S. Patentanmeldung Serien Nr. 390 599, eingereicht am 7. August 1989, im gemeinsamen Besitz, die die Expression von SOD-, Alpha-Faktor- und Ubiquitin- Fusionsproteinen beschreiben), das Expressionsniveau erhöhen und/oder die Wasserlöslichkeit des Antigens erhöhen können. Fusionsproteine, wie z. B. Alpha-Faktor und Ubiquitinfusion, werden durch den Expressionswirt prozessiert, um die heterologen Sequenzen zu entfernen. Der Alpha-Faktor ist ein Sekretionssystem, wohingegen jedoch die Ubiquitinfusionen im Cytoplasma verbleiben.
Weiterhin kann die Kombination von Antigenen als ein Fusionsprotein gebildet werden. Z. B. kann ein kontinuierliches DNA Fragment, das für C22 und C33c codiert, konstruiert werden, in einen Expressionsvektor cloniert werden und verwendet werden, um ein Fusionsprotein aus C22 und C33c zu exprimieren. Auf eine ähnliche Weise können Fusionsproteine von C22 und C100; C22 und 52; C22 und einem NS5-Antigen; C22, C33c und 52; C22, C100 und 52 und C22, C33c, C100 und 52 hergestellt werden. Alternative Fragmente der beispielhaft genannten Domäne können auch verwendet werden.

Herstellung von HCV-Antigenen

Die erfindungsgemäßen HCV-Antigene werden rekombinant oder durch bekannte Festphasen-chemische Synthese hergestellt.
Werden sie durch rekombinante Techniken hergestellt, so werden Standardverfahren zur Konstruktion von DNA, die für das Antigen codiert, Clonierung der DNA in Expressionsvektoren, Transformation von Wirtszellen, wie z. B. Bakterien, Hefe, Insekten- oder Säugetierzellen, und die Expression einer derartigen DNA zur Bildung des Antigens verwendet werden. Wie zuvor angegeben, kann es wünschenswert sein, das Antigen als Fusionsprotein zu exprimieren, um die Expression zu erhöhen, die Reinigung zu erleichtern oder die Löslichkeit zu erhöhen. Beispiele spezifischer Verfahren zur Bildung charakteristischer HCV-Antigene werden in den Beispielen, unten, und in dem U. S. Patent Nr. 5 350 671 beschrieben.

Formulierung von Antigenen zur Verwendung in einem Immunoassay

Die HCV-Antigene können dadurch kombiniert werden, daß sie in Form eines Fusionsproteins, das aus zwei oder mehr der Antigene zusammengesetzt ist, dadurch hergestellt werden, daß sie individuell auf einer gemeinsamen festen Matrix immobilisiert werden oder daß sie physikalisch gemischt werden. Fusionsproteine des Antigens können auch auf einer festen Matrix immobilisiert werden (an die feste Matrix gebunden werden). Verfahren und Mittel zur kovalenten oder nichtkovalenten Bindung von Proteinen an feste Matrizen sind dem Fachmann bekannt. Die Natur des festen Trägers wird in Abhängigkeit des Assayformats variiert. Für Assays, die in Mikrotitervertiefungen ausgeführt werden, wird die feste Oberfläche, die Wand der Vertiefung oder des Schälchens sein. Bei Assays unter Verwendung von Kügelchen wird die feste Oberfläche die Oberfläche des Kügelchens sein. Bei Assays unter Verwendung eines Eintauchstäbchens (das heißt, ein fester Körper, der aus einem porösen oder fasrigen Material hergestellt wurde, wie z. B. Stoff/Gewebe oder Papier) wird die Oberfläche die Oberfläche des Materials sein, aus dem das Eintauchstäbchen hergestellt wurde. Bei Agglutinierungsassays kann die feste Oberfläche die Oberfläche von Latex- oder Gelatmeteilchen sein. Werden individuelle Antigene an die Matrix gebunden, können sie homogen auf der Oberfläche verteilt sein oder auf der Oberfläche in Form eines Musters verteilt sein, wie z. B. als Bänder, so daß ein Muster an Antigenbindung unterschieden werden kann.
Einfache Gemische der Antigene enthalten die Antigene in irgendeinem geeigneten Lösungsmittel oder Dispersionsmedium.

Assayformate unter Verwendung von Antigenkombinationen

Die HCV-Antigene können in praktisch jeglichem Assayformat verwendet werden, das ein bekanntes Antigen verwendet, um Antikörper nachzuweisen. Ein gemeinsames Merkmal aller dieser Assays ist, daß das Antigen mit dem Körperbestandteil, der im Verdacht steht, HCV- Antikörper zu enthalten, unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die es ermöglichen, das Antigen an irgendeinen solchen in dem Bestandteil vorhandenen Antikörper zu binden. Derartige Bedingungen werden typischerweise physiologische Temperatur, pH und Ionenstärke unter Verwendung eines Antigenüberschusses sein. Der Inkubation des Antigens mit der Probe folgt der Nachweis von Immunkomplexen, die das Antigen enthalten.
Das Design des Immunoassays ist Gegenstand eines großen Ausmaßes an Variation, und dem Fachmann sind viele Formate bekannt. Protokolle können z. B. feste Träger oder eine Immunpräzipitation verwenden. Die meisten Assays beinhalten die Verwendung markierten Antikörpers oder Polypeptids; die Markierungen können z. B. enzymatische, fluoreszierende, chemilumineszente, radioaktive oder Farbstoffmoleküle sein. Assays, die die Signale von dem Immunkomplex amplifizieren, sind ebenfalls bekannt; Beispiele dafür sind Assays, die Biotin und Avidin nutzen, und enzymmarkierte und vermittelte Immungssays, wie z. B. ELISA-Assays.
Der Immungssay kann, ohne darauf beschränkt zu sein, in einem heterogenen oder einem homogenen Format und vom Standard- oder kompetitiven Typ sein. Bei einem heterogenen Format wird das Polypeptid typischerweise an eine feste Matrix oder einen festen Träger gebunden, um die Trennung der Probe vom Polypeptid nach der Inkubation zu erleichtern. Beispiele fester Träger, die verwendet werden können, sind Nitrocellulose (z. B. in Form einer Membran oder einer Mikrotitervertiefung), Polyvinylchlorid (z. B. in Blättern/Bögen oder Mikrotitervertiefungen), Polystyrollatex (z. B. in Kügelchen oder Mikrotiterplatten), Polyvinylidenfluorid (als ImmulonTM bekannt), diazotiertes Papier, Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen und Protein-A- Kügelchen. Zum Beispiel können Dynatech ImmulonTM 1- oder ImmulonTM 2-Mikrotiterplatten oder 6,4 mm (0,25 inch) Polystyrolkügelchen (Precision Plastic Ball) im heterogenen Format verwendet werden. Der feste Träger, der die antigenen Polypeptide enthält, wird typischerweise nach dessen Abtrennung von der Testprobe und vor dem Nachweis gebundener Antikörper gewaschen. Sowohl die Standard- als auch die kompetitiven Formate sind dem Fachmann bekannt.
In einem homogenen Format wird die Testprobe mit der Kombination von Antigenen in Lösung inkubiert. Das kann zum Beispiel unter Bedingungen erfolgen, unter denen jegliche gebildete Antigen-Antikörperkomplexe präzipitieren werden. Sowohl Standard- als auch kompetitive Formate für diese Assays sind dem Fachmann bekannt.
In einem Standardformat wird die Menge von HCV-Antikörpern, die den Antikörper- Antigenkomplex bilden, direkt beobachtet. Dies kann dadurch erreicht werden, daß nachgewiesen wird, ob markierte anti-xenogene (d. h. anti-humane) Antikörper, die dann ein Epitop auf Anti-HCV-Antikörpern erkennen, aufgrund einer Komplexbildung binden werden. In einem kompetitiven Format wird die Menge an HCV-Antikörpern in der Probe durch Überwachung der kompetitiven Wirkung auf die Bindung einer bekannten Menge markierten Antikörpers (oder eines anderen konkurrierenden Liganden) im Komplex abgeleitet.
Komplexe, die gebildet werden, und die Anti-HCV-Antikörper (oder im Falle kompetitiver Assays die Menge konkurrierenden Antikörpers) enthalten, werden mittels irgendeiner Anzahl bekannter Techniken in Abhängigkeit des Formats nachgewiesen. Zum Beispiel können nichtmarkierte HCV-Antikörper im Komplex unter Verwendung eines Konjugates von antixenogenen Ig, komplexiert mit einer Markierung (z. B. einer Enzymmarkierung) nachgewiesen werden.
Bei einem Immunpräzipitations- oder Agglutinationsassayformat bildet die Reaktion zwischen den HCV-Antigenen und dem Antikörper ein Netzwerk, das aus der Lösung oder der Suspension präzipitiert, und eine sichtbare Schicht oder einen sichtbaren Film des Präzipitates bildet. Ist kein Anti-HCV-Antikörper in der Testprobe vorhanden, wird kein sichbares Präzipitat gebildet.
Das HCV-Antigen wird tpyischerweise in Form eines Kits zur Verwendung bei diesen Immungssays verpackt. Der Kit wird normalerweise in getrennten Behältern, die Kombination an Antigenen (entweder bereits an eine feste Matrix gebunden oder getrennt mit Reagentien für deren Bindung an die Matrix), Kontrollantikörperformulierungen (positiv und/oder negativ), markierten Antikörper, wenn das Assayformat derartige benötigt, und signalerzeugende Reagentien (z. B. Enzymsubstrat), wenn die Markierung nicht direkt ein sichtbares Signal erzeugt, enthalten. Anleitungen (z. B. geschrieben, magnetisch, VCR, CD-ROM etc.) zum Durchführen des Assays werden üblicherweise im Kit enthalten sein.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung darzustellen und dienen nicht dazu, die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Beispiel 1: Synthese des HCV-Antigens C33c

Das HCV-Antigen C33c enthält eine Sequenz aus der NS3-Domäne. In spezifischer Weise enthält es die Aminosäuren 1192 bis 1457 von Fig. 1. Dieses Antigen wurde in Bakterien als Fusionsprotein mit der humanen Superoxiddismutase (SOD) wie folgt hergestellt. Der Vektor pSODcfl (Steiner et al. (1986), J. Virol. 58: 9) wurde vollständig mit EcoRI und BamHI gespalten, und das entstandene EcoRI, BamHI-Fragment wurde mit dem folgenden Linker ligiert, um pcf1EF zu bilden:
GATC CTG GAA TTC TGA TAA
GAC CTT AAG ACT ATT TTA A
Ein cDNA-Clon, der für die Aminosäuren 1192-1457 codiert und EcoRI-Enden hat, wurde in pcflEF insertiert, um pcflEF/C33c zu bilden. Dieses Expressionskonstrukt wurde in D 1210 E. coli-Zellen transformiert.
Die Transformanten wurden verwendet, um ein Fusionsprotein zu exprimieren, das SOD am Endterminus und im Leserahmen C33c-HCV-Antigen am C-Terminus umfaßt. Die Expression wurde durch Inokulation von 1500 ml Luriamedium, enthaltend Ampicillin (100 Mikrogramm/ml) mit 15 ml einer Übernachtkultur der Transformanten bewerkstelligt. Die Zellen wurden bis zu einer O. D. von 0,3 wachsen gelassen, IPTG wurde zugefügt, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erhalten, und das Wachstum wurde fortgesetzt, bis die Zellen eine Dichte von 1 O. D. erreichten; zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 · g bei 4ºC während 20 Minuten geerntet. Die verdichteten Zellen können bei -80ºC während mehrerer Monate gelagert werden.
Um das SOD-C33c-Polypeptid zu reinigen, wurden die bakteriellen Zellen, in denen das Polypeptid exprimiert wurde, einem osmotischen Schock und einer mechanischen Zerstörung unterzogen; die unlösliche Fraktion, die SOD-C33c enthielt, wurde isoliert und einer differentiellen Extraktion mit einer alkalischen NaCl-Lösung unterzogen, und das Fusionspolypeptid im Extrakt wurde durch Chromatrographie auf S-SepharoseTM und Q-SepharoseTM-Säulen gereinigt.
Der Rohextrakt, der vom osmotischen Schock unter mechanischen Disruptionen entstand, wurde auf die folgende Weise hergestellt. Ein Gramm der verdichteten Zellen wurde in 10 ml einer Lösung, enthaltend 0,02 M Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 20% Saccharose, suspendiert und während 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 4000 · g während 15 Minuten bei 4ºC sedimentiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurden die Zeilsedimente in 10 ml Puffer A1 (0,01 M Tris HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mM Beta-Mercaptoethanol [BME]) suspendiert und auf Eis während 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden erneut bei 4000 · g während 15 Minuten bei 4ºC sedimentiert. Nach Entfernung des klaren Überstands (periplasmatische Fraktion I) wurden die Zellsedimente in Puffer A1 resuspendiert, auf Eis während 10 Minuten inkubiert und erneut bei 4000 · g während 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der klare Überstand (periplasmatische Fraktion II) wurde entfernt, und die Zellpellets wurden in 5 ml Puffer A2 (0,02 M Tris HCl, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) resuspendiert. Um die Zellen zu zerstören, wurden die Suspension (5 ml) und 7,5 ml Dyno-millTM bleifreie säuregewaschene Glaskügelchen (mit einem Durchmesser von 0,10-0,15 mm) (von Glen-Mills, Inc. erhalten) in ein FalconTM-Röhrchen gegeben und mit maximaler Geschwindigkeit während 2 Minuten gevortext, gefolgt von Abkühlen während wenigstens 2 Minuten auf Eis; das Vortex-Abkühlungsverfahren wurde weitere vier Mal durchgeführt. Nach dem Vortexen wurde die Aufschlämmung durch einen gesinterten Glastrichter unter Verwendung schwachen Saugens filtriert; die Glaskügelchen wurden zwei Mal mit Puffer A2 gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösungen wurden kombiniert.
Die unlösliche Fraktion des Rohextrakts wurde durch Zentrifugation bei 20.000 · g während 15 Minuten bei 4ºC gesammelt, zwei Mal mit 10 ml Puffer A2 gewaschen und in 5 ml MILLI-QTM-Wasser resuspendiert.
Eine Fraktion, enthaltend SOD-C33c, wurde aus dem unlöslichen Material durch Zugabe zur Suspension von NaOH (2 M) und NaCl (2 M) bis zu einer Endkonzentration von jeweils 20 mM, Vortexen des Gemisches während 1 Minute, Zentrifugation des Gemisches bei 20.000 · g während 20 Minuten bei 4ºC und Zurückbehalten des Überstandes isoliert.
Um SOD-C33c auf S-SepharoseTM zu reinigen, wurde die Überstandsfraktion auf eine Endkonzentration von 6 M Harnstoff, 0,05 M Tris HCl, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA eingestellt. Diese Fraktion wurde dann auf eine S-SepharoseTM-Säule, Fast Flow (1,5 · 10 cm), die mit Puffer B (0,05 M Tris HCl, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA) äquilibriert worden war, aufgetragen. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit zwei Säulenvolumina Puffer B gewaschen. Die Durchfluß- und Waschfraktionen wurden gesammelt. Die Flußrate des Auftragens und des Waschens betrug 1 ml/min. und die gesammelten Fraktionen betrugen jeweils 1 ml. Um Fraktionen zu identifizieren, die SOD-C33c enthielten, wurden Aliquots der Fraktionen durch Elektrophorese auf 10% Polyacrylamid-Gelen, die SDS enthielten, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie blau, analysiert. Die Fraktionen können auch durch Westernblots unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen SOD gerichtet ist, analysiert werden. Fraktionen, die SOD-C33c enthielten, wurden gesammelt.
Eine weitere Reinigung von SOD-C33c erfolgte auf einer Q-SepharoseTM-Säule (1,5 · 5 cm), die mit Puffer B äquilibriert wurde. Die gesammelten Fraktionen, die von der S-Sepharose- Chromatographie erhaltenes SOD-C33c enthielten, wurden auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde dann mit Puffer B gewaschen und mit 60 ml eines 0,0-0,4 M großen NaCl-Gradienten in Puffer B eluiert. Die Flußrate für die Auftragung, das Waschen und die Elution betrug 1 ml/min; die gesammelten Fraktionen betrugen 1 ml. Alle Fraktionen von der Q-SepharoseTM-Säule wurden, wie für die S-SepharoseTM-Säule beschrieben, analysiert. Der Peak von SOD-C33c eluierte von der Säule bei etwa 0,2 M NaCl.
Das SOD-C33c, das von der Q-SepharoseTM-Säule erhalten wurde, war mehr als 90% rein, wie durch Anaylse auf den Polyacrylamid-SDS-Gelen und durch Immunoblot unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen humanes SOD gerichtet ist, beurteilt wurde.

Beispiel 2: Synthese von HCV-Antigen C100

HCV-Antigen C100 enthält Sequenzen von den NS3- und NS4-Domänen. Insbesondere beinhaltet es die Aminosäuren 1569-1931· von Fig. 1. Dieses Antigen wurde in Hefe gebildet. Ein cDNA-Fragment von 1270 bp, das für die oben genannten Aminosäuren codiert und das EcoRI-Enden besitzt, wurde hergestellt.
Die Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors, in dem dieses Fragment direkt an den S. cerevisiae ADH2/GAP-Promotor fusioniert war, erfolgte durch ein Protokoll, das die Ampli fikation der C100-Sequenz unter Verwendung eines PCR-Verfahrens, gefolgt von einer Ligation der amplifizierten Sequenz in einen Clonierungsvektor, mit einschloß. Nach der Clonierung wurde die C100-Sequenz herausgeschnitten und mit einer Sequenz, die den ADH2/GAP-Promotor enthielt, zu einem großen Fragment eines Hefevektors ligiert, um einen Hefeexpressionsvektor zu erhalten.
Die PCR-Amplifikation von C100 wurde unter Verwendung des Vektors pS3-56c100 m, der durch Spaltung mit Sall linearisiert worden war, als Matrix durchgeführt. pS3-56, bei dem es sich um ein pBR322-Derivat handelt, enthält eine Expressionskassette, die den ADH2/GAPDH- Hybrid-Hefepromotor stromaufwärts des humanen Superoxiddismutasegenes und einen stromabwärts liegenden Alphafaktor-Transkriptionsterminator umfaßt.
Die Oligonukleotidprimer, die für die Amplifikation verwendet wurden, wurden so entwickelt, daß sie die Clonierung in den Expressionsvektor erleichtern, und daß ein Translationsterminationscodon eingeführt wird. Insbesondere wurden neue 5'-HindIII- und 3'-SaII- Spaltstellen mit den PCR-Oligonukleotiden erzeugt. Das Oligonukleotid, das die SalJ-Spaltstelle enthält, codiert auch für die doppelten Terminationscodons, TAA und TGA. Das Oligonukleotid, das die HindIII-Spaltstelle enthält, enthält ebenfalls eine nichttranslatierte Leadersequenz, die von dem pgap63-Gen abgeleitet ist und die unmittelbar stromaufwärts des AUG-Codons liegt.
Das pEco63GAPDH-Gen wird von Holland und Holland (1980) und von Kniskern et al. (1986) beschrieben. Die PCR-Primersequenzen, die für die direkte Expression von C 100 m verwendet wurden, waren:
5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG CTC
ACT TTC TAT CCC AGA CAA AGC AGA GT 3'
und
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA
ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3'
Die Amplifikation durch PCR unter Verwendung der Primer und der Matrize erfolgte mit einem Cetus-Perkin-Elmer-PCR-Kit und wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren 29 Zyklen bei 94ºC während einer Minute, 37ºC während 2 Minuten, 72ºC während 3 Minuten und die Endinkubation erfolgte bei 72ºC während 10 Minuten. Die DNA kann bei 4ºC oder -20ºC über Nacht gelagert werden.
Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit HindIII und SaU gespalten. Das Hauptprodukt von 1, 1 kb wurde durch Elektrophorese auf einem Gel gereinigt, und das eluierte gereinigte Produkt wurde mit einem großen SalI-HindIII-Fragment von pBR322 ligiert. Um korrekte Rekombinanten zu isolieren, wurden kompetente HB 101-Zellen mit den Rekombinantenvektoren transformiert, und nach der Clonierung wurden die gewünschten Rekombinanten auf der Basis der vorhergesehenen Größe der HindIII-SalI-Fragmente, die aus den Clonen herausgeschnitten wurden, identiliziert. Einer der Clone, der ein HindIII-SalI-Fragment der korrekten Größe enthielt, wurde mit pBR322/C100-d bezeichnet. Die Bestätigung, daß dieser Clon amplifiziertes C 100 enthielt, erfolgte durch direkte Sequenzanalyse des HindIII-SalI-Fragmentes.
Der Expressionsvektor, der C100 enthielt, wurde durch Ligation des HindIII-SalI- Fragmentes von pBR322/C100-d mit einem 13,1 kb BamHI-SalI-Fragment von pBS24.1 und einem 1369 bm BamHI-HindIll-Fragment, das den ADH2/GAP-Promotor enthielt, konstruiert (das letztgenannte Fragment wird in der EPA 164 556 beschrieben). Das ADH2/GAP- Promotorfragment wurde durch Spaltung des Vektors pPGAP/AG/HindIII mit HindIII und BamHI, gefolgt von einer Reinigung des 1369 bp-Fragmentes auf einem Gel, erhalten. Kompetente HB 101-Zellen wurden mit den Rekombinantenvektoren transformiert, und korrekte Rekombinanten wurden durch die Bildung eines 2464 bp-Fragments und eines 13,1 kb- Fragments, die durch BamHI- und SaII-Spaltung der clonierten Vektoren erzeugt wurden, identifiziert. Einer der clonierten korrekten Rekombinantenvektoren wurde mit pC 100 d#3 bezeichnet.
Um C100 zu exprimieren, wurden kompetente Zellen des Saccaromyces cerevisiae- Stammes AB 122 (MATa leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl-407[cir-0]) mit dem Expressionsvektor pC 100-d#3 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf URA-Sorbit ausplattiert, und individuelle Transformanten wurden dann auf Leu = Platten ausgestrichen.
Individuelle Clone wurden in Leu&supmin;-, ura&supmin;-Medium mit 2% Glucose bei 30ºC während 24- 36 Stunden kultiviert. Ein Liter Hefeextrakt-Peptonmedium (YEP), enthaltend 2% Glucose, wurde mit 10 ml der Übernachtkultur inokuliert, und die entstandene Kultur wurde bei 30ºC, bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 UpM und einer Luftzufuhrrate von 1 l Luft pro 1 l Medium pro Minute (d. h. 1 wm) während 48 Stunden, wachsen gelassen. Der pH des Mediums wurde nicht kontrolliert. Die Kultur wurde in einem BioFlo II-Fermenter, hergestellt von New Brunswick Science Corp., wachsen gelassen. Nach der Fermentation wurden die Zellen isoliert und in Bezug auf die C 100-Expression analysiert.
Die Analyse im Hinblick auf von den transformierten Zellen exprimiertes C100- Polypeptid wurde mit Gesamtzell-Lysaten und Rohextrakten, die von einzelnen Hefekolonien isoliert wurden, die von den Leu&supmin;-Platten erhalten wurden, durchgeführt. Die Zell-Lysate und die Rohextrakte wurden durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gelen und durch Westernblots analysiert. Die Westernblots wurden mit Kaninchen-polyclonalen Antikörpern als Sonde, die gegen das SOD/C100-Polypeptid, das in Hefe exprimiert wurde, gerichtet waren, durchgemustert. Die erwartete Größe des C100-Polypeptids ist 364 Aminosäuren. In der Gelanaylse hat das exprimierte Polypeptid ein MGr von 39,9 kD.
Beide analytische Verfahren zeigten, daß das exprimierte C 100-Polypeptid in Gesamtzell- Lysaten vorhanden war, jedoch in Rohextrakten nicht anwesend war. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das exprimierte C 100-Polypeptid unlöslich sein könnte.

Beispiel 3: Expression des HCV-Antigens S2

Das HCV-Antigen 52 enthält eine Sequenz vom hydrophoben N-Terminus der S- Domäne. Es schließt die Aminosäuren 199-328 von Fig. 1 ein.
Das Protokoll für die Konstruktion des Expressionsvektors, der für das S2-Polypeptid codiert und für seine Expression in Hefe, war analog zu dem, das zur Expression des C100- Polypeptides verwendet wurde, und das in Beispiel 2 beschrieben wurde.
Die Matrize für die PCR-Reaktion war der Vektor pBR322/Pi14a, der durch Spaltung mit HindIII linearisiert worden war. Pi14a ist ein cDNA-Clon, der für die Aminosäuren 199-328 codiert.
Die Oligonukleotide, die als Primer für die Amplifikation der für 52 codierenden Sequenz mittels PCR verwendet wurden, waren die folgenden.
Für die 5'-Region der S2-Sequenz:
5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT
ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3;
und
für die 3'-Region der 52-Sequenz:
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC
ATC ATC ATA TCC CAT GCC AT 3'.
Der Primer für die 5'-Region führt eine HindIII-Spaltstelle und ein ATG-Startcodon in das amplifizierte Produkt ein. Der Primer für die 3'-Region führt Translationsstopcodons und eine SalI-Spaltstelle in das amplitizierte Produkt ein.
Die PCR-Bedingungen waren 29 Zyklen mit 94ºC während einer Minute, 37ºC während 2 Minuten, 72ºC während 3 Minuten und die letzte Inkubation war 72ºC während 10 Minuten. Das Hauptprodukt der PCR Reaktion war ein 413 bp-Fragment, das gelgereinigt wurde. Das gereinigte Fragment wurde mit dem großen Fragment ligiert, das aus pBR322 durch Spaltung mit HindIII und SaII erhalten wurde. Dadurch wurde das Plasmid pBR322/S2d erhalten.
Die Ligation des 413 bp-HindIII-SalI-S2-Fragments mit dem 1,36 kb-BamHI-HindIII- Fragment, das den ADH2/GAP-Promotor enthält, und mit dem großen BamHI-SalI-Fragment des Hefevektors pBS24.1 ergab rekombinante Vektoren, die cloniert wurden. Korrekte Rekombinantenvektoren wurden durch das Vorhandensein eines 1,77 kb-Fragments nach Spaltung mit BamHI und SalI identifiziert. Ein Expressionsvektor, der aus der amplifizierten Sequenz konstruiert wurde und die Sequenz enthielt, die für 52 codiert und die direkt an den ADH2/GAP- Promotor fusioniert ist, wird als pS2d#9 identifiziert.

Beispiel 4 Synthese von HCV-C-Antigen

HCV-Antigen C22 ist aus der C-Domäne. Es enthält die Aminosäuren 1-122 von Fig. 1.
Das Protokoll für die Konstruktion des Expressionsvektors, der das C-Polypeptid codiert und für seine Expression in Hefe, war analog zu demjenigen, das für die Expression des C100- Polypeptids, oben beschrieben, verwendet wurde, mit folgender Ausnahme.
Die Matrize für die PCR-Reaktion war pBR322/Ag30a, das mit Hindill linearisiert worden war. Ag30 ist ein cDNA-Clon, der für die Aminosäuren 1-122 codiert. Die Oligonukleotide, die als Primer für die Amplifikation der C-codierenderi Sequenz durch PCR verwendet wurden, waren die folgenden:
Für die 5'-Region der C-Sequenz:
5' GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA GCA CGA
ATC CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3',
und
für die 3'-Region der C-Sequenz:
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC
GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3'.
Der Primer für die 5'-Region führt eine HindIII-Spaltstelle in das amplifizierte Produkt ein, und der Primer für die 3'-Region führt Translationsstopcodons und eine SalI-Spaltstelle ein.
Die PCR wurde mit 29 Zyklen mit 94ºC während einer Minute, 37ºC während 2 Minuten, 72ºC während 3 Minuten durchgeführt, und die letzte Inkubation war bei 72ºC während 10 Minuten.
Das Hauptprodukt der PCR-Ampliflkation ist ein 381 bp-Polynukleotid. Die Ligation dieses Fragments mit dem SalI-HindIII-groß-SalI-HindIII-Fragment von pBR322 ergab das Plasmid pBR322/C2.
Die Ligation des 381 bp HindIII-SalI-C codierenden Fragments, das aus pBR322/C2 herausgeschnitten wurde, mit dem 1,36 kb BamHI-HindIll-Fragment, das den ADH2/GAP- Promotor enthielt, und mit dem großen BamHI-Sali-Fragment des Hefevektors pBS24.1, ergab rekominante Vektoren, die cloniert wurden. Korrekte rekominante Vektoren wurden durch das Vorhandensein eines 1,74 kb-Fragments nach Spaltung mit BamHT und SaII identifiziert. Ein Expressionsvektor, der aus der amplifizierten Sequenz konstruiert wurde, und der die Sequenz, die für C codiert direkt an den ADH2/GAP-Promotor fusioniert, enthielt, wird als pC22 identifiziert.
Die Analyse im Hinblick auf exprimiertes C-Polypeptid durch die transformierten Zellen wurde mit Gesamtzell-Lysaten und Rohextrakten durchgeführt, die von einzelnen Hefekolonien isoliert wurden, die von den Leu&supmin;-Platten erhalten wurden. Die Zell-Lysate und Rohextrakte wurden durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamid-Gelen analysiert. Es wird erwartet, daß das C-Polypeptid 122 Aminosäuren hat, und durch Gelanalyse hat das exprimierte Polypeptid ein MGr von etwa 13,6 kD.

Beispiel 5: Synthese des NS5-Polypeptids

Dieses Polypeptid enthält eine Sequenz vom N-Terminus der NS5-Domäne. Insbesondere schließt es die Aminosäuren 2054 bis 2464 von Fig. 1 ein. Das Protokoll für die Konstruktion des Expressionsvektors, der für das NS5-Polypeptid codiert und für seine Expression, war analog zu demjenigen, das für die Expression von C33c verwendet wurde (siehe Beispiel 1).

Beispiel 6: Radioimmungssay (RIA) für Antikörper gegen 110V

Die HCV-Antigene der Beispiele 1-5 wurden in einem RIA-Format im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Antikörper gegen HCV im Serum von Individuen, die klinisch als HCV-erkrankt (Non-A, Non-B) diagnostiziert wurden, und im Serum von Blut, das von bezahlten Blutspendern erhalten wurde, nachzuweisen, getestet.
Der RIA basierte auf dem Verfahren von Tsu und Herzenberg (1980) in SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W. H. Freeman & Co), S. 373-391. Im allgemeinen werden Microtiterplatten (Immulon 2, Removawellstrips) mit gereinigtem HCV-Antigen beschichtet. Die beschichteten Platten werden mit den Serumproben oder geeigneten Kontrollen inkubiert. Während der Inkubation wird Antikörper, falls vorhanden, immunologisch an das Festphasen-Antigen gebunden. Nach Entfernung des nichtgebundenen Materials und Waschen der Microtiterplatten werden humane Antikörper-NANBV-Antigenkomplexe durch Inkubation mit ¹²&sup5;Imarklerten Schafantimenschlichen-Immunglobulin nachgewiesen. Nichtgebundener markierter Antikörper wird durch Absaugen entfernt, und die Platten werden gewaschen. Die Radioaktivität in individuellen Vertiefungen wird bestimmt; die Menge an gebundenen humanen Anti-HCV-Antikörper ist proportional zur Radioaktivität in der Vertiefung.
Im einzelnen wurden einhundert Mikroliter Aliquots, enthaltend 0,1 bis 0,5 Mikrogramm HCV-Antigen in 0,125 M Na-Boratpuffer, pH 8,3, 0,075 M NaCl (BBS) zu jeder Vertiefung einer Mihrotiterplatte (Dynatech Immulon 2 Removawellstrips) zugegeben. Die Platte wurde bei 4ºC über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert; danach wurde die Antigenlösung entfernt, und die Vertiefungen wurden 3 Mal mit BBS, enthaltend 0,02% Triton X-100TM (BBST) gewaschen. Um nichtspezifische Bindung zu verhindern, wurden die Vertiefungen mit Rinderserumalbumin (BSA) durch Zugabe von 100 Mikroliter einer 5 mg/ml-Lösung BSA in BBS, gefolgt durch eine Inkubation bei Raumtemperatur während einer Stunde, beschichtet; nach dieser Inkubation wurde die BSA-Lösung entfernt. Die Antigene in den beschichteten Vertiefungen wurden mit Serum durch Zugabe von 100 Mikroliter Serumproben, die 1 : 100 in 0,01 M Na- Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,15 M NaCl (PBS), enthaltend 10 mg/ml BSA, verdünnt worden waren, und durch Inkubation der serumenthaltenden Vertiefungen während 1 h bei 37ºC umgesetzt. Nach der Inkubation wurden die Serumproben durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden Smal mit BBST gewaschen. Antikörper, die an das Antigen gebunden sind, wurden durch die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem F'(ab)2 Schaf-antihumanem IgG an die beschichteten Vertiefungen bestimmt. Aliquots von 100 Mikroliter markierter Sonde (spezifische Aktivität 5- 20 Mikrocuries/Mikrogramm) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden bei 37ºC während 1 Stunde inkubiert, gefolgt von der Entfernung überschüssiger Sonde durch Absaugen und 5 Waschschritten mit BBST. Die Menge an in jeder Vertiefung gebundener Radioaktivität wurde durch Zählen in einer Zähleinrichtung, die Gammastrahlung nachweist, bestimmt.
Die Tabelle 1 unten zeigt die Ergebnisse der Tests mit dem Serum von Patienten, die als HCV infiziert diagnostiziert wurden. Tabelle 1 Tabelle Tabelle Tabelle Tabelle
AVH = akute virale Hepatitis
CVH = chronische virale Hepatitis
PTVH = posttransfusionsvirale Hepatitis
IVDA = intravenös Drogenabhängige
crypto = cryptogene Hepatitis
NOS = nichtoffensichtliche Quelle
P = positiv
N = negativ
Bei diesen Ergebnissen reagierte kein einzelnes Antigen mit allen Seren. C22 und C33c waren am reaktivsten, und 52 reagierte mit einigen Seren von einigen putativen akuten HCV- Fällen, mit denen kein anderes Antigen reagierte. Basierend auf diesen Ergebnissen ist die Kombination zweier Antigene, die den größten Nachweisbereich bereitstellen würden, C22 und C33c. Würde man es wünschen, ein Maximum an akuten Infektionen nachzuweisen, würde 52 in die Kombination eingeschlossen werden.
Tabelle 2 unten zeigt die Ergebnisse des Testens der bezahlten Blutspender. Tabelle 2 Antigene Antigene Antigene Antigene Antigene Antigene Antigene
Die Ergebnisse bei dem bezahlten Spender bestätigen im allgemeinen die Ergebnisse von den Seren infizierter Patienten.

Beispiel 7: ELISA-Bestimmungen von HCV-Antikörpern unter Verwendung von HCV-Antigenkombinationen

Platten, die mit einer Kombination von C22- und C33c-Antigenen beschichtet sind, werden wie folgt hergestellt. Eine Lösung, enthaltend Beschichtungspuffer (50 mM Na-Borat, pH 9,0), 21 ml/Platte BSA (25 Mikrogramm/ml), C22 und C33c (jeweils 2,50 Mikrogramm/ml) wird unmittelbar vor der Zugabe zu den Removeawell-Immulon I-Platten (Dynatech Corp.) her gestellt. Nach dem Mischen während 5 Minuten werden 0,2 ml/Vertiefung der Lösung zu den Platten zugegeben, dann werden sie bedeckt und während 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, wonach die Lösung durch Absaugen entfernt wird. Die Vertiefungen werden einmal mit 400 Mikroliter Waschpuffer (100 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 140 mM Natriumchlorid, 0,1% (Gew./Vol.) Casein, 1% (Gew./Vol.) Triton X-100TM, 0,01% (Gew./Vol.) Thimerosal) gewaschen. Nach der Entfernung der Waschlösung werden 200 Mikroliter/Vertiefung Postcoat-Lösung (100 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid, 0,1% (Gew./Vol.) Casein, 3% Saccharose und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) zugegeben, die Platten werden locker bedeckt, um ein Verdampfen zu verhindern, und werden bei Raumtemperatur während 30 Minuten stehengelassen. Die Vertiefungen werden dann abgesaugt, um die Lösung zu entfernen, und über Nacht zur Trockenheit ohne Geräterhitzung lyophilisiert. Die präparierten Platten können bei 2-8ºC in dicht verschlossenen Aluminiumbeuteln mit Trocknungsmittel (3 g Sorb-itTM-Packungen) gelagert werden.
Um die ELISA-Bestimmung durchzuführen, werden 20 Mikroliter Serumprobe oder Kontrollprobe zu einer Vertiefung gegeben, die 200 Mikroliter Probenverdünnungsmittel (100 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 0,1% (Gew./Vol.) Casein, 0,01% (Gew./Vol.) Thimerosal, 1% (Gew./Vol.) Triton X-100TM, 100 Mikrogramm/ml Hefeextrakt) enthält. Die Platten werden dicht verschlossen, und sie werden bei 37ºC während 2 Stunden inkubiert, wonach die Lösung durch Absaugen entfernt wird, und die Vertiefungen drei Mal mit 400 Mikroliter Waschpuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,05% Tween 20TM) gewaschen werden. Die gewaschenen Vertiefungen werden mit 200 Mikroliter Maus-antihumanem-IgG-Meerrettichperoxidase(HRP)-Konjugat, das in einer Lösung von Orthokonjugat-Verdünnungsmittel (10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid, 50% (Vol./Vol.) fötales Rinderserum, 1% (Vol./Vol.) hitzebehandeltes Pferdeserum, 1 ml K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 0,05% (Gew./Vol.) Tween 20, 0,02% (Gew./Vol.) Thimerosal) enthalten ist, behandelt. Die Behandlung erfolgt während 1 Stunde bei 37ºC. Die Lösung wird durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen werden drei Mal mit 400 ml Waschpuffer gewaschen, der auch durch Absaugen entfernt wird. Um die Menge gebundenen Enzymkonjugates zu bestimmen, werden 200 Mikroliter Substratlösung (10 mg o-Phenylendiamindihydrochlorid je 5 ml Entwicklungslösung) zugegeben. Die Entwicklungslösung enthält 50 mM Natriumcitrat, das mit Phosphorsäure auf einen pH von 5,1 eingestellt ist, und 0,6 Mikroliter/ml 30% H&sub2;O&sub2;. Die Platten, die die Substratlösung enthalten, werden in der Dunkelheit während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 50 Mikroliter/ml 4 N Schwefelsäure angehalten, und die ODs werden bestimmt.
Auf eine ähnliche Weise können ELISAs unter Verwendung von Fusionsproteinen von C22 und C33c, und C22, C33c, und 52 und Kombinationen von C22 und C100, C22 und 52, C22 und einem NS5-Antigen, C22, C33c und 52, und C22, C100 und 52 durchgeführt werden.
Modifikationen der oben beschriebenen Durchführungsweisen der Erfindung, die für die Fachleute auf dem Gebiet der Molekularbiologie, der Immunologie und verwandter Gebiete offensichtlich sind, sollen im Schutzbereich der folgenden Ansprüche mit enthalten sein.

Claims

1. Kombination von Hepatitis-C-Virus(HCV)-Antigenen in einem Polypeptid oder in mehreren Polypeptiden, das/die durch chemische Synthese oder rekombinante Expression hergestellt wurde/wurden, umfassend.

(a) ein erstes HCV-Antigen, das ein Epitop von der C-Domäne des HCV-Polyproteins enthält; und

(b) ein zweites HCV-Antigen, ausgewählt aus

(i) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der S-Domäne enthält;

(ii) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS3-Domäne enthält;

(iii) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS4-Domäne enthält und

(iv) ein HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS5-Domäne enthält;

mit der Maßgabe, daß die Kombination nicht das Peptid p1 mit C100-3, das Peptid p35 mit C100-3, das Peptid p99 mit C100-3 oder einem Peptid mit den Aminosäuren 9 bis 177 des HCV-1-Polyproteins ist.

2. Kombination nach Anspruch 1, wobei das zweite HCV- Antigen ein Epitop von der 5-Domäne enthält und wobei die Kombination weiterhin wenigstens ein weiteres HCV-Antigen, ausgewählt aus:

(i) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS3-Domäne enthält;

(ii) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS4-Domäne enthält; und

(iii) einem HCV-Antigen, das ein Epitop von der NS5-Domäne enthält; enthält.

3. Kombination nach Anspruch 2, wobei das zusätzliche Antigen von der NS3-Domäne ist.

4. Kombination nach Anspruch 3, wobei das erste HCV- Antigen C22 ist und das zusätzliche HCV-Antigen C33c ist.

5. Kombination nach Anspruch 2, wobei das zusätzliche Antigen von der NS4-Domäne ist.

6. Kombination nach Anspruch 5, wobei das erste HCV- Antigen C22 ist und das zusätzliche HCV-Antigen C100 ist.

7. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Antigen von der S-Domäne das Antigen 52 ist.

8. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kombination in Form eines Fusionspolypeptids ist.

9. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Kombination in Form des genannten ersten HCV-Antigens und der genannten zusätzlichen Antigene, die an eine gemeinsame feste Matrix gebunden sind, ist.

10. Kombination nach Anspruch 9, wobei die feste Matrix die Oberfläche einer Mikrotiterplattenvertiefung, einer Kugel oder eines Eintauchstäbchens ist.

11. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kombination auf der Oberfläche einer festen Matrix, die zum Nachweis von HCV durch Immunoassay geeignet ist, immobilisiert ist.

12. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einem Säugetierkörperbestandteil, der im Verdacht steht, diese Antikörper zu enthalten, umfassend das Inkontaktbringen des Körperbestandteils mit einer Kombination von Antigenen nach einem der Ansprüche 1 bis 11 unter Bedingungen, die die Antikörper-Antigen-Reaktion ermöglichen, und Nachweis des Vorhandenseins von Immunkomplexen der genannten Antikörper und der genannten Antigene.

13. Kit zum Durchführen eines Assays zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis-C-Antigen (HCV) in einem Säugetierkörperbestandteil, der im Verdacht steht, diese Antikörper zu enthalten, umfassend:

(a) die Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 11;

(b) Standardkontrollreagentien; und

(c) Anleitungen zum Durchführen des Assays; in verpackter Kombination.