HU208551B

HU208551B - Process for producing recombinant dns shuttle vector and chromosomal gene-bank

Info

Publication number: HU208551B
Application number: HU853643A
Authority: HU
Inventors: Ramachandra Nagaraja Rao; Richard Kale Stanzak
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1984-09-27
Filing date: 1985-09-25
Publication date: 1993-11-29
Also published as: IE852353L; AU4787785A; AU592956B2; JPS6185191A; EP0176321B1; IL76421A0; HUT38676A; DE3572510D1; CA1238591A; DK429685D0; EP0176321A1; DK429685A; JPH0815432B2; IE58265B1

Description

A jelen találmány tárgya eljárás új rekombináns DNS kozmid shuttle vektorok előállítására, melyek egy Escherichia coliban és egy Streptomycesben működő replikációs origót, a lambda bakteriofág két vagy több cos elemét tartalmazó DNS-szakaszt, és egy vagy több antibiotikum-rezisztenciát kódoló DNS-szakaszt tartalmaznak. Ugyancsak a találmány tárgya a kozmid shuttle vektorok alkalmazásával kromoszomális DNSgénbank készítése.

A kozmidok speciálisan nagyméretű idegen DNSfragmensek klónozására tervezett vektorok. Ezek a vektorok módosított plazmidok, plazmid replikációs origót, szelektálható antibiotikum-rezisztencia markert és a lamba cos régiót tartalmazzák. Viszonylag kis méretük és a lamba cos régió jelenléte miatt a kozmidok képesek egész 30-45 kilobázis (kb) méretig DNS fragmenseket befogadni és a lambda in vitro pakolási rendszer alkalmazásával pozitívan szelektálni a nagyméretű fragmensekre. Ennélfogva ezek a vektorok hatékony mechanizmust szolgáltatnak idegen DNS-nek baktériumsejtekbe juttatására.

A jelen találmány Escherichia coli és Streptomyces gazdasejtekben használható, antibiotikum rezisztenciát kódoló bifunkcionális kozmid vektorokkal foglalkozik. A bifunkcionális tulajdonság különösen előnyös, mivel a vektorok amplifikálását és manipulálását gyorsabban és kényelmesebben végezhetjük Eschericia coliban, mint Streptomycesben. így, miután a kívánt DNS rekombinációs eljárásokat elvégeztük, az Escherichia coli gazdarendszeren belül, az adott plazmidot eltávolíthatjuk és utána transzformálhatjuk egy Streptomyces gazdasejtbe. Az is lehetséges, hogy a plazmid DNS-t közvetlenül átvisszük egy Streptomyces gazdasejtbe sejt-sejt fúzióval vagy fágrészecske-sejt fúzióval. A Streptomycesben való klónozás és termék-előállítás nagyon előnyös, mivel az a szervezet lényegében nem patogén, és normális körülmények között nem termel endotoxinokat. Ezidáig a rekombináns DNS technológia fejlődése és kihasználása késésben volt, és időigényes is volt, a nagyméretű DNS-darabok befogadását lehetővé tevő hatékony klónozó rendszerek hiánya miatt. A jelen találmány szerinti vektorok képesek nagyméretű DNS-darabok befogadására, működőképesek és szelektálhatok mind Streptomyces, mind Escherichia coli gazdasejtekben, és ennélfogva a szakterületen lényeges előrehaladást jelentenek.

Shuttle vektorok előállítását számos közlemény ismerteti. Jellemző ezek közül a 0117 694 számú európai nyilvánosságrahozatali irat, mely E. coli/Streptomyces shuttle vektorokat ismertet.

A jelen találmány tárgya eljárás több lambda cos régiót tartalmazó kozmid klónozó vektorok előállítására. Az egy vektorban jelen lévő több cos régió miatt nincs szükség arra, hogy külön kozmid karokat készítsünk. Ennek következtében a jelen találmány szerinti vektorok konstrukciója miatt a kromoszomális génbankok készítése sokkal könnyebb. A jelen találmány tárgya továbbá kényelmes módszer az adott kozmid shuttle vektorok felhasználásával kromoszomális génbank készítésére. Jelenleg három módszer ismert kromoszomális génbank készítésére: baktériumsejt transzformálása plazmid DNS-sel [L. Clark and. J. Carbon. Cell. 9. 91 (1976)]; baktériumsejt transzdukciója lambda bakteriofág vektorral [Lawin et al., Cell 15, 1157 (1978)]; és baktériumsejt transzdukciója kozmid vektorokkal [Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 4242 (1978)]. Azonban a lambda vektorok felhasználását korlátozza, hogy csak maximum 20 kb méretű fragmentet képesek befogadni, s nagy plazmidok transzformációs hatékonysága pedig nagyon alacsony. így nagy DNS fragmentek klónozása esetén a kozmid vektorok használata előnyösebb, mind a plazmidok, mind a lambda bakteriofág vektoroknál. Kromoszomális génbankok készítésénél a kozmid vektorok kétszeres előnyben vannak a plazmid vagy lamba bakteriofág vektorokkal szemben. Először a kozmid vektornak az a képessége, hogy nagy DNS fragmenteket képes befogadni, megőrzi a beépített génszakasz eredeti bekapcsolódási viszonyait. Ez a megőrzés azonban függ a klónozó eljárás részleteitől és független a klónozó rendszertől. Mivel statisztikusan korlátozott számú telepben található nagy DNS darabok lefedik a teljes genomot, ennélfogva a screenelési eljárás mérete csökken.

Másodszor a DNS készítésének viszonylagos egyszerűsége nagy előnye a jelen kozmid vektoroknak.

A találmány szerinti eljárás speciális előnye az ismert kozmid vektorokkal szemben az, hogy a találmányban szereplő vektorok képesek szaporodni és amplifikálódni Escherichia coliban, majd a klónozott DNS funkcionális elemzése céljából átvihetők Streptomyces gazdasejtekbe. A vektorok viszonylag kicsik, sokoldalúak és transzformálhatok, valamint szelektálhatok, bármely olyan Streptomyces sejtben, amely érzékeny arra az antibiotikumra, mellyel szembeni rezisztenciát klónoz a kozmid, és amelyben a Streptomyces plazmid replikációs origó működőképes. Mivel a természetben előforduló antibiotikumoknak több mint hetven százalékát Streptomyces törzsek termelik, ezért kívánatos, hogy erre az iparilag fontos csoportra alkalmazható klónozó rendszereket és vektorokat fejleszszünk ki. A jelen találmány szolgáltat ilyen vektorokat, és így lehetővé teszi gének klónozását és átvitelét Streptomyces-be, ismert antibiotikumok termelésének növelése, valamint új antibiotikumok és antibiotikumszármazékok előállítása céljából.

A jelen találmány hordozókat szolgáltat DNS klónozásához Streptomyces gazdasejtekbe, valamint lehetővé teszi a transzformánsok kényelmes szelekcióját.

Mivel a transzformáció nagyon alacsony frekvenciájú esemény, az ilyen funkcionális tesztre gyakorlati szükség van annak meghatározására, hogy a sejtek milliárdjai közül mely sejt(ek) kapta (kapták) meg a plazmid DNS-t. Ez fontos, mert az önmagukban nem-szelektálható idegen DNS-szakaszokat építhetünk be a vektorokba, és transzformálás után a vektort és az adott, bennünket érdeklő DNS-szakaszt izolálhatjuk a megfelelő fenotipikus szelekcióval.

A jelen találmányban a következő szakkifejezéseket használjuk:

HU 208 551 Β

Rekombináns DNS klónozó vektor: bármely önálló replikálódásra képes molekula, ideértve, de nem korlátozódva a plazmidokra, olyan DNS molekula, melyhez egy vagy több további DNS szakaszt adtak vagy adható, kozmid:

a bakteriofág ligáit tapadása végeit (cos régió) hordozó plazmid, ennek eredményeképpen a plazmid DNS-t bepakolhatjuk vagy in vitro a fágburokba, vagy in vivő megfelelő Escherichia coli törzsek használatával, cos szakasz:

nukleotid hosszúságú tapadós vég szakasz a lambda bakteriofágból, melyet a lambda-specifikus pakoló fehérjék felismernek.

Génbank:

klónozott DNS fragmentek gyűjteménye, melyek együtt a teljes genomot reprezentálják. Restrikciós fragmens:

egy vagy több restrikciós enzim által létrehozott bármely lineáris DNS-fragmens,

Érzékeny gazdasejt:

gazdasejt, amely nem képes növekedni egy adott antibiotikum jelenlétében egy adott, az antibiotikummal szemben rezisztenciát kódoló DNS szakasz nélkül.

Transzformálás:

DNS bejuttatása egy befogadó gazdasejtbe, mely megváltoztatja genotípusát, és ennek eredményeképpen változást idéz elő a befogadó sejtben.

Transzformáns:

transzformáláson átesett befogadó gazdasejt. Escherichia coli replikon: plazmidnak vagy más vektornak Escherichia coliban való replikációját szabályozó vagy lehetővé tevő DNS szakasz.

Streptomyces replikon:

plazmidnak vagy más vektornak Streptomycesben való replikációját szabályozó és lehetővé tevő DNS-szakasz.

Ap^R = ampicillin rezisztens fenotípus Am^R = apromicin rezisztens fenotípus Ter^R = tiostrepton rezisztencia fenotípus Nm^R = neomicin rezisztencia fenotípus.

A találmány tárgya eljárás rekombináns DNS kozmid shuttle vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy:

a) Escherichia coliban működő replikációs origót,

b) Streptomycesben működő replikációs origót,

c) a lambda bakteriofág két vagy több cos szakaszát hordozó DNS-szakaszt,

d) olyan DNS-szakaszt, melyet ha restrikciómentes érzékeny gazdasejtbe transzformálunk, legalább antibiotikumra való rezisztenciát kódol ligálással egybeépítünk.

A jelen találmány szerinti vektorok új hibrideket jelentenek egy Streptomyces vektor és egy kozmid között. Például a pKC 420 kozmid vektor képes önállóan replikálódni Streptomycesben és Escherichia coliban is, mivel mindkét organizmusból származó replikont tartalmaz.

Ezenkívül mindkét organizmus számára szelektálható markerek vannak a vektoron (Ap^R Escherichia coliban és Am^R mind Escherichia coliban, mind Streptomycesben) ezáltal kényelmesen szelektálhatok a transzformánsok. Továbbá a lambda bakteriofág cos szakasza lehetővé teszi az új vektor in vitro pakolását és Escherichia coli-ba való transzformálását. A rekombináns plazmidokat használhatjuk ezután a Streptomyces gazdasejtek transzformálására. így, mivel a lambda cos szakasz jelenléte adott a találmány szerinti Shuttle vektorban, a kozmid vektorokban rejlő klónozási előnyök alkalmazhatók Streptomyces-ekre.

A pKC 420 shuttle vektor körülbelül 10,6 kb méretű és számos, a klónozás számára különösen előnyös restrikciós hasítási helyet tartalmaz. A pKC 420 kozmidot szokványos módon izolálhatjuk az Escherichia coli K12 DMl/pKC 420 törzsből, mely a Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604 gyűjteménynél van letétbe helyezve és az állandó gyűjtemény része. A nyilvánosság számára hozzáférhető mint a kozmid forrása NRRL B—15 837 sorszám alatt. A pKC 420 kozmid részletes restrikciós és funkcionális tréképét a kísérő rajzok között az 1. ábrán közöljük. A jelenlegi célok miatt az I. ábra és az összes ezt követő ábra nem mérethelyes.

A pKC 420 kozmid, mely közvetlenül is használható kiónozó vektorként, ama a célra is alkalmazható, hogy a jelen találmány oltalmi körén belül származék-vektorokat készítsünk belőle. A pKC 420 kozmidot megemészthetjük, és egy vagy több antibiotikum-rezisztenciát kódoló DNS fragmenshez ligálhatjuk, példaként említve a -1 kb méretű, tiosztrepton rezisztenciát kódoló Bell restrikciós fragmenst a pl8702 (ATCC 39 155) plazmidból, a pUC4K (NRRL B—15 836) plazmid -1,5 kb méretű, Tn903 neomicin rezisztenciát kódoló EcoRI restrikciós fragmensét, valamint a pKC7 (ATCC 37084) plazmid Tn5 neomicin rezisztenciát kódoló -15 kb méretű HindllI-Sall restrikciós fragmensét, így a jelen találmány szerinti vektorokat állíthatunk elő.

A pIJ702 és pKC7 plazmidokat az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852 törzsgyűjteménynél letétbe helyezett és az állandó gyűjtemény részét képező törzsekből izolálhatjuk és ezek a törzsek a nyilvánosság számára az ATCC 39 155, illetve 37 084 letéti sorszámon hozzáférhetők.

Az előállítás egyszerűsége és kényelme érdekében a tiosztrepton rezisztenciát kódoló -1 kb Bell fragmenset a pKC420 kozmidba az egyetlen BamHI hasítási helyre építjük be.

A kapott rekombináns DNS-t ezután ligáljuk, így kapjuk a találmány szerinti kozmidot. A kívánt fenotípusú plazmidnak két inszerciós izomerjét kapjuk, a beépített DNS fragmens orientációjától függően. így a -1 kb méretű Bell restrikciós fragmensnek a pKC420 kozmidba való beépítésekor két különböző pKC427 és pKC427A jelű kozmidot kapunk.

HU 208 551 B

A pKC420 kozmid különböző restrikciós helyeit használhatjuk DNS szakaszok beépítésére, azzal a feltétellel, hogy a replikációs origókat, szelekciós markereket és egyéb fontos plazmid funkciókat nem rontunk el. A gyakorlott szakember megérti vagy könnyen meghatározhatja, hogy egy adott DNS szakasz 1 igálásához vagy beépítéséhez melyek az előnyös hasítási helyek.

Jóllehet, a tiosztrepton és neomicin antibiotikum rezisztenciát kódoló DNS szakaszokat illusztratív célokkal jól bemutatja a pIJ702 plazmid ~1 kb Bell fragmense, a pUC4K plazmid —1,5 kb EcoRI restrikciós frgamense, és a pKC7 plazmid —1,5 kb HindíII-Sall restrikciós fragmense, a szakterületen jártas szakember készíthet vagy helyettesíthet, külön-külön vagy kombinációban, más az említett antibiotikumokra való rezisztenciát kódoló DNS szakasz például a pLR2 plazmid —1,6 kb BamHI restrikciós fragmense. Más, neomicin rezisztenciát kódoló DNS szakasz például a pLRl plazmid -3,5 kb Psű restrikciós fragmense és a ~3,4 kb BamHI restrikciós fragmense. A pLR2 és pLRl plazmidot például a 4416994 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás alapján állítjuk elő, erre a továbbiakban referenciaképpen hivatkozunk.

További, az említett és egyéb antibiotikumokra úgymint például higromycinre, kloramfenikolra, sztreptomicinre, viomicinre, tiloxinra, eritromicinre és hasonlókra rezisztenciát kódoló DNS szakaszok is készíthetők és használhatók a jelen találmány céljaira. Ezenkívül a fent leírt antibiotikumokra való rezisztenciát kódoló DNS szakaszok különböző funkcionális variánsait állíthatjuk elő nukleotidok helyettesítésével, hozzáadásával vagy eliminálásával, a genetikai kóddal összhangban. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy ezeknek, vagy bármely más, antibiotikum rezisztenciát kódoló DNS szakasznak a pKC420 kozmid DNS-sel való ligálásakor a jelen találmány oltalmi körébe tartozó kozmid shuttle vektorokat kapunk.

A pKC420 kozmidot és ennek bármely kozmidszármazékát, valamint az antibiotikum rezisztenciát kódoló DNS szakaszokat kényelmesen módosíthatjuk az ezt követő ligálás megkönnyítése céljából. Például egy EcoRI-BamHI-EcoRI hasítási helyekkel rendelkező EcoRI linker-molekula hozzáadása a pKC427 kozmidhoz lehetővé teszi egy specifikus restrikciós hely, úgymint például egy BamHI restrikciós hely létrehozását, mely ligálásra használható, a szakterületen ismert más célok elérésére. A különböző restrikciós fragmenseket ezenkívül módosíthatjuk nukleotidok hozzáadásával, eliminálásával vagy helyettesítésével a jellemzők megváltoztatása céljából, létrehozva így számos egyedi vagy további restrikciós helyet. A szakterületen jártas szakemberek ismerik a nukleotid kémiát és a genetikai kódot, így azt is, hogy mely nukleotidok cserélhetők és milyen DNS-módosításra van szükség egy adott cél elérése érdekében.

A jelen találmány szerinti vektorok használata nem korlátozódik egy Escherichia coli vagy Streptomyces plazmidból származó specifikus replikonra. Jóllehet a találmány szerinti kozmid vektorokban levő Eschericia coliban működő replikon a pBR322 plazmidból származik, más Eschericia coli replikációs origót tartalmazó fragmenseket nyerhetünk például a pBR324 és pBR325 plazmidokból [F. Bolivár, Gene. 4, 121 (1978)], a pBR328 plazmidból [X. Soberon. Gene. 9, 287 (1980)] vagy hasonlókból, új bifunkciós kozmidok előállítása céljából. Ezenkívül más Streptomyces replikációs origót tartalmazó fragmensekkel helyettesíthetjük a Streptomyces replikációs origót. Ezek a replikációs origót tartalmazó fragmensek közé tartoznak nem korlátozó jelleggel az SCP2 és SCP2* plazmidokból származó replikációs origók [lásd Bibb and Hopwood, J. Gén. Microbiol. 126, 427 (1981)], valamint az SLP1 [lásd Bibb. M. J. Mól. Gén. Génét, 184, 230 (1981)], pEL103 (NMRRL 12 549), pFJ265 (lásd James, M. D. et al. Plasmid, II 82 (1984)] és pHJL210 (NRRLB15 824) plazmidok replikációs origói. A szakterületen jártas szakemberek számára nyilvánvaló, hogy ezeknek vagy más Escherichia coli vagy Streptomyces replikációs origót tartalmazó fragmensnek a ligálása a jelen találmány oltalmi körébe tartozó kozmid shuttle vektorokat eredményez.

A jelen találmány szerinti rekombináns DNS kozmid shuttle vektorok használata nem korlátozódik egyetlen Streptomyces fajra vagy törzsre. Ellenkezőleg, a vektorok széles körben alkalmazhatók és számos Streptomyces faj gazdasejtjeiben transzformálhatók, főleg az antibiotikum-termelő, például aminoglikozid makrolid, β-laktám, poliéter és glikopeptid termelő, restrikció-mentes, gazdaságilag fontos fajok törzseibe. Az ilyen restrikciómentes törzseket könnyen szelektálhatjuk és izolálhatjuk a Streptomyces fajokból, a szakterületen jól ismert, szokványos módszerekkel [Lomovsksya et al., Microbiological Reviews, 44, 266 (1980)]. A restrikció-mentes törzsek sejtjeiben nincsenek restrikciós enzimek, ennélfogva nem hasítják el vagy bontják le a transzformálással bejuttatott plazmid DNS-t. A jelen területen való alkalmazás szempontjából azokat a gazdasejteket, melyek az itt alkalmazott rekombináns kozmidok egyik restrikciós hasítási helyébe sem vágnak bele, szintén restrikciós-mentesnek tekintjük.

A Streptomyces taxonba tartozó restrikció-mentes törzsek közül azokat a gazdasejteket részesítjük előnyben, melyek aminoglikozid antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a jelen vektorok különösen jól használhatók, oda transzformálhatók. Ezek például a következő restrikciómentes törzsek sejtjei:

Streptomyces kanamyceticus (kanamicinek), S. chestomyceticus (aminosidine), 5. griseeflavus (MA 1267 antibiotikum), S. microsporius (SF-767 antibiotikum), 5. ribosidificus (SF733 antibiotikum), 5. flavopersicus (spectinomycin), 5. spectabilis (actinospectacin), 5. rlmosus forma paromomycinus (paromomycinek, catenulin), S. fradiae var. italicus (aminosidine), 5. bluensis var. bluensis (bluensomycin), S. catanulae (catonulin), S. olivoreticula var. cellulophilus (destomycin A), S. lavendulae (neumicin), S. albograsedus (neomicinek), S. albus var. metamycinus (metamycin),

HU 208 551 Β

S. hygroscopicus var. Sagamiensis (spectinomycin), 5. bikiniensis (streptomicin), 5. grissus S. erythrochromogenes var. narutoensis (streptomicin), S. poolensis (streptomicin), 5. galbun (streptomicin), S. rameus (streptomicin), S. olivaceus (streptomicin), 5. mashuensis (Streptomicin), S. hygroscopicus var. Limoneus (validamycinek), S. rimofaciens (destomycinek), S. hygroscopicus forma glebosus (glabomycin), S. fradiae (hybrimicinek, neomycinek) S. eurocidicus (antibiotikum AL16316-C), S. aquacanus (N-methyl hygromicin B), S. crystallinus (hygromycin A), S. noboritoensis (hygromycin), S. hygrocopicus (hygromycinek), S. atrofaciens (hygromycin), 5. kasugaspinus (kasugamycinek), 5. netropsis (LL-AM31 antibiotikum), S. lividus (lividomycinek), 5. hofuensis (seldomycin Komplex), and S. canus (ribozil paromamin).

A Streptomyces taxonba tartozó restrikciómentes törzsek közül azokat a gazdasejteket részesítjük előnyben, melyek makrolid antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a jelen vektorok különösen hasznosak, odatranszformálhatók.

Ezek például a következő restrikció-mentes törzsek sejtjei:

Streptomyces cselestis (M198 antibiotikum), S. platensis S. platonsis (platenomycin), S. rochei var. volubilis (T2636 antibiotikum), S. venezuelae (methymycinek), S. narbonensis (josamycin, narbomycin), S. fungicidicus (NA-181 antibiotikum), 5. grissofaciens (PA133A antibiotikum), 5. roseocitreus (albocycline),

S. bruneogriseus (albocycline), 5. roseochromo genes (albocycline), 5. cinerochromogenes (cineromycin B), S. albus (albomycetin), S.felleus (argomycin, picromycin), S. rochei (lankacidin, borrelidin), S. violecegniger (lankacidin), S. griseus (borrelidin), S. maizeus (ingramycin), 5. albus var. coilmyceticus (coleimycin), S. mycerofaciens (acetyl-leukomycin, espinomycin), 5. hygroscopicus (turimycin, relomycin, meridomycin, tylosin, carbomycin), S. griseospiralis (relomycin), S. levenduláé (aldgamycin), S. rimosus (neutramycin), S. deltae (deltamycinek), S. fungicidicus var. espinomyceticus (espinomycinek), S. furdicidicus (mydecamycin), S. ambofaciens (foromacidin D), S. eurocidicus (methymycin), S. flavochromogenes (amaromycin, ehincomycinek), S. fimbriatus (amaromycin), S. fasciculus (amaromycin), S. erythreus (erythromycinek), S. antibioticus (oleandomycin), S. olivochromogenes (oleandomycin), 5. epinichromogenes var. suragsoensis (kujimycinek), S. kitasatoensis (leucomycin), S. narbonensis var. josamyceticus (leucomycin A3, josamycin), S. albogriscolus (mikonomycin), 5. bikiniensis (chalcomycin), S. cirratus (cirramycin), 5. dijakartensis (niddamycin), S. eurythermus (angolamycin), S. fradiae (tylosin, lactenocin, macrocin), S. goshikiensis (bendamycin), S. grisepflavus (acumycin), S. halstedii (carbomycin), S. tendae (carbomycin), 5. macrosporeus (carbomycin), S. thermotolerans (carbomycin), és S. albireticuli (carbomycin).

A Streptomyces taxonba tartozó restrikció-mentes törzsek közül azokat a gazdasejteket részesítjük előnyben, amelyek β-laktám antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a jelen vektorok különösen jól használhatók és oda transzformálhatok. Ezek például a következő restrikció-mentes törzsek sejtjei:

Streptomyces liomanii (A 16 884, MM4550,

MM13902), S. glavuligerus (A168868, klavulánsav), S. lactamdurans (caphamycin C), S. griseus (cephamycin A, B), S. hygroscopicus (descetoxycephalosporin C), S. wadayamensis (WS-3442-D), S. chartrausis (SF 1623), S. heteromorphus és S. panayansis (C2081X), S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei és S. viridochromogenes (cephamycine A, B); S. cattleya (thienomycin), és S. olivaceus, S.flavovirens, S. flavus, S. fulvoviridas, S. argenteolus és S. sicyaensis (MM 4550 és MM 13902).

A Streptomyces taxonba tartozó restrikció-mentes törzsek közül azokat a gazdasejteket részesítjük előnyben, melyek poliéter antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a jelen vektorok különösen jól használhatók és oda transzformálhatok. Ezek például a következő restrikció-mentes törzsek sejtjei:

Streptomyces albus (A204, A28695A és B. salinomocin), S. hygroscopicus (A218, americid, DE3936), A120A, A28695A és B. etheromycin, dianamycin), S. grissuss (grisorixin), S. conolobatus (ionomycin), 5. eurocidicus var. asterocidicus (laidlomycin), S. lasaliensis (lasalocid), S. ribosidificus (Ionomycin), S. cacaoi var. asoensis (lysocellin), S. cinnamonensis (monensin), S. sureofaciens (narasin), S. callinarius (RP 30504), S. lengwoodensis (lysocellin), S. flaveolus (CP38936), 5. mutabilis (S—11743a), és S. violaceoniger (nigericin).

A Streptomyces taxonba tartozó restrikció-mentes törzsek közül azokat a gazdasejteket részesítjük előnyben, melyek glikopeptid antibiotikumokat termelnek, és amelyekben a jelen vektorok különösen jól használhatók és oda transzformálhatok. Ezek például a következő restrikció-mentes törzsek sejtjei:

Streptomyces orientalis és S. haranomachiensis (vancomycin); S. candidus (A-35512, avoparcin), S. eburosporeus (LL-AM 374), és S. toyocaensis (A47934).

A Streptomyces taxonba tartozó restrikció-mentes törzsek közül azokat a gazdasejteket részesítjük előnyben, amelyekben a jelen vektorok különösen jól használhatók és oda transzformálhatok. Ezek például a következő restrikció-mentes törzsek sejtjei:

Streptomyces coslicolor, S. granuloruber, S. resosporus, S. lividans, S. tenebrarius, S. acrimycins, S. glaucescens, S. parvilin, S. pristinaespiralis, S. violeceoruber, S. vinaceus, S. Virginiáé, S. expinosus, és S. azureus.

A fent leírt jellegzetes Streptomyces gazdasejtek mellett a jelen vektorok jól használhatók és transzformálhatok más taxonokba tartozó restrikció-mentes törzsek sejtjeibe, például:

Bacillus, Staphylococcus és rokon Actinomyceták, ideértve Streptosporangium, Actinoplanes, Nocardia, és Micromonospora törzsekbe. A jelen találmány szerinti vektorok tehát széles körben használhatók, különböző mikroorganizmusok sejtjeibe transzformálhatok.

HU 208 551 B

Jóllehet, a jelen találmánynak minden igényelt területe hasznos, mégis a jelen rekombináns DNS klónozó vektorok és transzformánsok közül néhányat előnyben részesítünk. Ennek megfelelően előnyös vektorok a pKC420, pKC427, pKC428, pKC448, pKC462A és pKC467 kozmidok, előnyös transzformánsok a Streptomyces ambofaciens/pKC42(\ S. ambofaciens/ pKC427, 5. ambofaciens/pKC42&, S. ambofaciens/ pKC448, S. ambofaciens/,pKC462A, 5. ambofaciens/ pKC467, E. coli K12 SF8/pKC420, E. coli K12 SF8/pKC427, E. coli K12 SF8/pKC428, E. coli K12 SF8/pKC448, E. coli SF8/pKC462A és E. coli K12 SF8/pKC467.

Ebből az előnyben részesített csoportból a pKC420, pKC462A és pKC467 kozmidok, valamint a S. ambofaciens/pKC420, S. ambofaciens/pYlC462A, S. ambofaciens/pKC461, E. coli K12 SF8/pKC420, E. coli K12 SF8/pKC462A és az E. coli K12 SF8/pKC467 transzformánsok a legelőnyösebbek.

A jelen találmány szerinti rekombináns DNS klónozó vektorok és transzformánsok széles körben használhatók és segítenek kielégíteni a Streptomyces-ekben és rokon mikroorganizmusokban használható klónozó vektorok iránti igényt. Továbbá jelen vektoroknak az a tulajdonsága, hogy a transzformálatlan gazdasejtekre toxikus antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát hordoznak, a transzformánsok szelektálásához nyújt módot. Ez nagyon fontos, mert a gyakorlatban szükség van arra, hogy meghatározzuk és szelektáljuk a vektor DNS-t hordozó sejteket. További DNS szakaszokat, amelyekről hiányzik a kimutatásukra használható funkció, szintén beépíthetünk a jelen vektorokba, majd a nem-szelektálható DNS-szakaszt tartalmazó transzformánsokat megfelelő antibiotikumos szelekcióval izolálhatjuk. Az ilyen nem-szelektálható DNS-szakaszokat bárhova beépíthetjük, kivéve a plazmid funkciójához, fennmaradásához, illetve replikációjához szükséges régiókat. Az ilyen szakaszok lehetnek - nem korlátozó jelleggel - antibiotikum-módosító enzimeket, antibiotikum rezisztenciát, antibiotikum bioszintézist kódoló gének, valamint mindenféle típusú szabályozó gének.

A jelen találmány tárgya továbbá új eljárás a fentiekben meghatározott rekombináns DNS kozmid shuttle vektorok alkalmazására kromoszomális génbank létrehozásánál, azzal jellemezve, hogy

1. a kromoszomális DNS-szakaszt a korábban meghatározott kozmid shuttle vektorba ligálunk,

2. az említett ligáit kozmidot lambda bakteriofág részecskékbe csomagoljuk,

3. az említett csomagolt kozmidot E. coli-ba transzformáljuk, és

4. a rekombináns kozmidot Streptomyces gazdasejtekbe transzformáljuk.

Részletesebben a 2. ábra szerint a pKC420 DNS-t EvmII restrikciós enzimmel emésztjük, így tompavégű lineáris fragmenst kapunk. Ezeket a tompa végeket ezután defoszforilezzük bakteriális alkalikus foszfatázzal (BAP), hogy az ezt követő reakciókban megakadályozzuk összeligálásukat.

Extrakció és kicsapás után a DNS-t SaraHI restrikciós enzimmel emésztve két, nem egyforma hosszúságú DNS fragmenst kapunk, mindegyik fragmens tartalmaz egy cos helyet, melyet egy reakcióképes BamHI vég és egy nem reakcióképes PvuII vég fog közre. A DNS-t extraháljuk, kicsapjuk, majd TE pufferben oldjuk, a beépítendő DNS-fragmens ezt követő ligálásához. Jóllehet, a találmány szerinti módszer előnyös megvalósítási formájában a pKC420 kozmidot használja, az nyilvánvaló, hogy a következő kozmidok bármelyike használható kromoszomális génbank készítésére: _PKC427, pKC428, pKC448, pKC462, pKC462A vagy pKC467.

Az idegen DNS-t például a Streptomyces falleus (NRRL 2251), DNS-t részlegesen emésztjük restrikciós enzimmel, például Mbol-gyel vagy 5au3A-val, így az S.felleus DNS fragmensektől különböző méretűeket kapunk (átlagos méret 40 kb). Ezeket a fragmenseket ezután BAP-pal kezeljük, hogy megakadályozzuk az Mbol-gyel kezelt végek egymáshoz kapcsolódását. így az egyetlen lehetséges ligálódás a beépített DNS Mbol vége és a kozmid kompatíbilis BamHI vége között játszódik le. A kapott hibrid DNS molekulák szolgálnak a lambda bakteriofág részecskékbe való in vitro pakolás szubsztrátjaként. A lambda pakolás méret-szelektáló mechanizmusának következtében csak azok a kozmid-inszert DNS molekulák pakolódnak be, amelyekben a cos szakaszok 37-52 kb távolságra vannak egymástól. Mivel a lambda pakoláshoz két cos régióra van szükség, az egyik iniciálja, a másik befejezi a pakolást, valamint a méret-szelektálás következtében a transzduktánsokban pozitívan szelektálódnak a nagy beépített DNS szakaszok. Miután a kívánt rekombináns DNS eljárást végrehajtottuk az E. coli gazdarendszerben, az adott rekombináns plazmid DNS-t izoláljuk, majd megfelelő Streptomyces gazdaszervezetbe transzformáljuk.

A jelen találmány szerinti módszer a kozmid klónozásnak megnöveli mind a hatásfokát, mind a hatékonyságát, az új kozmid vektorok speciális konstrukciója következtében. Például a két vagy több cos hely jelenléte a pKC420 kozmidban szükségtelenné teszi azt, hogy külön izoláljunk két kozmid kart. Másodszor, a többszörös cos helyen belüli tompavégű hasítóhelyek, úgymint a PvuII és Hpal helyek megléte megakadályozza a preparált kozmid karok közötti kozmid konkatamerizációt. Végül a jelen vektorok bifunkcionális volta miatt a klónozott DNS-t funkcionális elemzés céljára bevihetjük egy Streptomyces gazdasejtbe. Ez az átvivő-képesség különösen hasznos az ismert kozmid vektorokkal szemben, mert a Streptoinyces kozmid vektorok még nincsenek kifejlesztve.

Az Escherichia coli K12 DHl/pKC420 törzset, (NRRL B-15 837), melyből a pKC420 kozmid vektor kinyerhető, valamint az Escherichia coli K12 SF8/pKC462A törzset (NRRL B-15973), melyből a pKC462A kozmid vektor kinyerhető, különböző módon tenyészthetjük, különböző táptalajok közül bármelyiket választva. A táptalajban előnyösen használható szénforrások közé tartozik például a glükóz és glicerin, a nitrogénforrás lehet például ammónium-só, amino6

HU 208 551 Β sav-keverék és peptonok. A szervetlen tápsókra is szükség van, és ide tartoznak a magnézium, nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, klorid, szulfát és hasonló ionokat tartalmazó sók. Ahogy az szükséges más mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez, a lényeges nyomelemeket is hozzáadjuk. Ezeket a nyomelemeket általában a tápközeg más komponenseinek szennyezéseként adjuk a táptalajhoz.

AzE. coliK 12 DHl/pKC420 törzset és azE. coll K12 SF8/pKC462A törzset aerob tenyésztési körülmények között viszonylag széles (6,5-7,4) pH-tartományban, 3042 °C hőmérséklet-tartományban tenyésztjük. A pKC420 és pKC462A kozmid vektorok nagy mennyiségben való előállítása céljából azonban kívánatos, hogy a tenyésztés kezdetekor a táptalaj pH-ja körülbelül 7,4 legyen, és a tenyészet hőmérsékletét 37 °C-on tartsuk. A fenti körülmények között tenyésztve az E. coll sejteket, így olyan tenyészetekhez jutunk, melyekből a pKC420 és pKC462Akozmidokat az irodalomból ismert módszerekkel állítjuk elő.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a pKC420 kozmid restrikciós és funkciós térképet látjuk.

A 2. ábrán sematikusan ábrázoljuk kromoszomális DNS génbank készítését Streptomyces DNS-ből a pKC420 kozmid vektorral.

A 3. ábrán a pKC427 kozmid restrikciós és funkciós térképet látjuk.

A 4. ábrán a pKC428 kozmid restrikciós és funkciós térképet látjuk.

Az 5. ábrán a pKC448 kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

A 6. ábrán a pKC462 kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

A 7. ábrán a pKC467 kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

A 8. ábrán a pKC462A kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

A 9. ábrán a pOJ108 kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

A 10. ábrán a pOJ 108 kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

All. ábrán a coslll kozmid restrikciós és funkciós térképét látjuk.

A következő, nem korlátozó jellegű példák a találmányt illusztrálják és részletezik. A találmány konstrukciójának mind a magyarázatát, mind az aktuális eljárást közöljük, ahol szükséges.

1. példa

Az E. coli K12 DHIIpKC420 törzs tenyésztése és a pKC420 kozmid izolálása

A) Tenyésztés

Az E. coli K12 DHI/pKC420 (NRRLB-15 837) törzs 5 ml-es tenyészetét szelektív körülmények között ΊΎ táptalajban (1% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid, pH = 7,4), szokványos mikrobiológiai eljárással tenyésztjük. A sejteket asztali centrifugán lecentrifugáljuk, az üledéket 1 ml 0,3 M szacharózt 25 mM EDTA (etiléndiamin-tetraecetsav) és 25 mM Trisz-HCl (pH8) összetételű oldatban (I. oldat) szuszpendáljuk. Miután átvittük egy Eppendorf-csőbe a sejteket körülbelül egy percig centrifugáljuk, és az üledéket újra szuszpendáljuk 0,5 ml I oldatban. Körülbelül 50 pl frissen készített lizozim oldatot (20 mg/ml, vízben) adunk hozzá és az oldatot 10 percig 37 °C-on inkubáljuk.

Miután 250 μΐ frissen készített lízis-keveréket (2% nátrium-dodecil-szulfát és 0,3 normál nátrium-hidroxid) adtunk hozzá, a sejteket azonnal és teljesen öszszevortexeljük. A sejteket ezután 10 percig 50 °C-on inkubáljuk, lehűtjük, majd 100 μΐ fenol-Sevag-ot (fenol-kloroform-izoamil alkohol, 25-24-1) adunk hozzá. Miután a DNS-t két percig egy Eppendorf-centrifugában centrifugáltuk, a felülúszót leöntjük és egy másik csőbe visszük, majd 70 μΐ pufferoldatlan 3 M nátriumacetátot és izopropanolt adunk hozzá a DNS kicsapása céljából. Ezt az oldatot öt percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd két percig centrifugáljuk. A felülúszót óvatosan és teljesen dekantáljuk az összes felesleges folyadék eltávolítása céljából.

A DNS csapadékot újra oldjuk 500 μΐ TE oldatban (10 mM Trisz-HCl pH 8 és 1 mM EDTA) és 10 μΐ 100 mM Spermine HCl-t adunk hozzá. Ezt a keveréket vortexeljük, majd öt percen szobahőmérsékleten tartjuk, mielőtt öt percig centrifugálnánk egy Eppendorfcentrifugában. A felülúszót megint teljesen dekantáljuk és elöntjük, majd a kicsapott DNS-t 1 ml 75%-os etanol, 0,3 M nátrium-acetát és 10 mM magnézium-acetát elegyével vortexeljük. Ezt az oldatot öt percig szobahőmérsékleten tartjuk és a DNS-t a fentiek szerint összegyűjtjük. A csapadékot újra oldjuk 10 μΐ TE-ben, klónozó vektorként való felhasználás céljára.

2. példa

A pKC427 kozmid shuttle vektor készítése

A) A pKC420 kozmid BatnHI emésztése

Körülbelül 5 pg pKC420 kozmidot emésztünk lxőawHI pufferben (150 mM nátrium-klorid, 6 mM Trisz-HCl pH = 7,9, 6 mM magnézium-klorid és 1 mM ditiotreitol) 50 μΐ össztérfogatban 20 egység (New England Biolab) öamHI restrikciós endonukleázzal.* Az elegyet körülbelül 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót 10 perces 70 °C-os inkubálással állítjuk le. Mivel a pKC420 kozmidban egyetlen BamHI hely található, az emésztést könnyen követhetjük agaróz gélelektroforézissel. Egyetlen, körülbelül 10 kb méretű sáv megjelenése a teljes emésztést mutatja. A DNS-t fenollal és Sevag-gal (kloroform-izoamil alkohol 24:1) extraháljuk, etanollal kicsapjuk, szárítjuk, majd TEben újra szuszpendáljuk az ezt követő ligálás céljából.

’ A restrikciós enzimeket és használati utasítást a következő forrásokból nyerhetünk:

New England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Road, Beverly, Messachusetts 01915

Bethesda Research Laboratories, Inc., P. O. Box 577, Gaithersburg, Maryland 20760

Boehringer-Mannheim Biochemicals, P. O. Box 50816, Indianapolis, lndiana 46250.

HU 208 551 Β

Β) A pIJ702 plazmid Bell emésztése

Körülbelül 5 pg pIJ702 DNS-t (ATCC 39 155) emésztünk lxőc/I pufferben (75 mM kálium-klorid, 6 mM Trisz-HCl pH = 7,4, 10 mM magnézium-klorid és 1 mM ditriotreitol) 50 pl össztérfogatban 10 egység (New England Biolab) Bell restrikciós endonukleázzal. A reakcióelegyet körülbelül egy óráig 50 °C-on tartjuk, majd a reakciót fenolos és Sevag-os extrakcióval leállítjuk, etanollal kicsapjuk, megszárítjuk, majd 5 μΐ TEben oldjuk.

A DNS-t 0,5%-os agaróz-gélen elektroforetizáljuk, amíg a körülbelül 1 kb méretű Bell elválik a többi fragmenstől. A kívánt fragmens előtt egy vágásba Whatman DEAE cellulóz papírt helyezünk és a DNS-t elektroforézissel a DEAE papírra futtatjuk. A papírt 1 ml TE-vel mossuk, majd a DNS-t 400 μΐ megfelelő koncentrációjú és térfogatú nátrium-kloriddal 1 mólosra állított TE-vel eluáljuk. A leoldott DNS-t etanollal kicsapjuk és végül 5 μΐ TEben oldjuk.

C) E. coll KI2 SF8lpKC427 ligálása és készítése

Körülbelül 1-1 pg-ot a őűmHI-gyel emésztett pKC420 DNS-ből és a ~1 kb méretű tiostrepton rezisztenciát hordozó fragmensből összeligáhink 20 pl lxligáz pufferben (50 mM Trisz-HCl pH = 7,8, 10 mM magnézium-klorid, 20 mM ditiotreitol és 1 mM ATP) 400 egység T4 DNS-ligázzal* 16 órán át 16 °C-on. A reakciót 10 perces, 70 °C-os inkubálással állítjuk le. Jégbehűtés után a kapott ligáit DNS-t használjuk E. coli K12 SF8 (NRRLB-15 835) transzformálására Manistis et al. módszere szerint [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)]. A keresett transzformánsokat konvencionális módon a BamHI hely elválasztása és egy SaE megjelenés alapján azonosítjuk.

A kompetens sejteket dimetil-szulfoxid helyett 20% glicerinben tároljuk -70 ’C-on. A kapott E. coli K12 SF8/pKC427 transzformánsokat szokványos módon tenyésztjük a pKC427 kozmid előállítása és izolálása céljából. A pKC427 restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között a 3. ábrán mutatjuk be.

3. példa

A pKC428 kozmid shuttle vektor készítése

A) A pKC427 kozmid emésztése EcoRI-gyei

Körülbelül 5 pg pKC427 kozmid DNS-t emésztünk lxEcoRI pufferban (50 mM nátrium-klorid, 100 mM Trisz-HCl pH = 7,5, 5 mM magnézium-klorid és 1 mM ditiotreitol) 50 pl össztérfogatban 20 egység (New England Biolab) EcoRI restrikciós endonukleázzal.

Az elegyet körülbelül 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót 10 perces, 70 °C-os inkubálással állítjuk le. Mivel a pKC427 kozmid egyetlen EcoRI helyet tartalmaz, az EcoRI-gyes emésztéssel egyetlen lineáris fragmenst kapunk.

' T4 DNS-ligázt ugyanazokból a forrásokból szerezhetjük be, mint a restrikciós enzimeket.

B) A pUC4K plazmid emésztése EcoRI-gyel és az 1,5 kb méretű EcoRI, neomicin-rezisztencia gént hordozó szakasz izolálása A kívánt emésztést lényegében a 3A pontban leírt módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy pKC427 kozmid DNS helyett a pUC4K (NRRL D-1383A) plazmidot használjuk. Az 1,5 kb méretű EcoRI fragmens izolálását lényegében a 2B pont szerint végezzük.

C) Az E. coli KI2 SE8/pKC428 ligálása és készítése

A ligálást és az azt követő transzformációt lényegében a 2C pont szerint végezzük. A kívánt transzformánsokat úgy azonosítjuk, hogy először Am^R fenotípusra szelektálunk, majd ezeket az Am^R telepeket replikázva szelektálunk neomicin-rezisztens telepeket. Ezeket a telepeket tovább szelektáljuk ÖamHI és Sáli restrikciós helyek megléte alapján. A pKC428 kozmid restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között, a 4. ábrán mutatjuk be.

4. példa

Λ pKC448 kozmid shuttle vektor készítése

A) A pKC428 kozmid emésztése BamHI-gyel, majd ligálása

A pKC448 kozmidot úgy állítjuk elő, hogy a pKC428 kozmidból kihasítjuk a BamHI fragmenst. A kívánt ÖamHI emésztést lényegében a 2A példa szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC420 kozmid DNS helyett a pKC428 kozmid DNS-t használjuk. A kapott fragmenseket kinyerjük, ligálással bezárjuk, lényegében a 2B és 2C példák szerint. Az emésztés eredményeképpen eltávolítjuk a neomicin rezisztenciát hordozó gént és egyetlen, két EcoRI hasítási hellyel kísért BamHI hasítási helyet kapunk. A pKC448 kozmid restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között az 5. ábrán közöljük.

5. példa

Λ pKC462 kozmid készítése

A) A pKC448 kozmid emésztése HindHI és Sáli restrikciós endonukleázokkal

Körülbelül 10 pg pKC448 kozmid DNS-t emésztünk 100 pl pufferben (150 mM nátrium-klorid 6 mM ditiotreitol) a Hindlll és őall restrikciós enzimekből egyaránt 20-20 egységgel 2 órán át 37 ’C-on. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 20 pl TE-ben szuszpendáljuk.

B) A pKC7 plazmid DNS emésztése és a neomicinrezisztenciát kódoló gén izolálása

A kívánt emésztést és a —1,5 kb méretű Hindlll-Sall fragmens izolálását lényegében az 5A példa szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC448 kozmid helyett a pKC7 (ATCC 37 084) plazmidot használjuk.

C) Az E. coli DHJIpKC462 ligálása, készítése

A ligálást majd az ezt követő transzformálást lényegében a 2C példa szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 SF8 törzs helyett az E. coli DH1 (NRRL-B-15 021) törzset használjuk. Ráadásul a pKC427 DNS helyett a pKC462 DNS-t használjuk. A kívánt transzformánsokat szokványos módon először az Am^R fenotípusra való szelektálás1

HU 208 551 Β sál, majd az Am^R telepek közül a neomicin rezisztensek szelektálásával izoláljuk. A pKC462 kozmid restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között, a

6. ábrán adjuk meg.

6. példa

Az E. coli K12 SF8lpKC448 törzs készítése A kívánt konstrukciót lényegében a 2C példa szerint készítjük, szelektáljuk és nyerjük ki, azzal a különbséggel, hogy a pKC427 kozmid DNS helyett a pKC448 kozmid DNS-t használjuk. Az azonosított transzformánsokat használjuk ezek után a pKC448 kozmid termelésére és izolálására az 1. példa szerint.

7. példa

A Streptomyces ambofacienslpK420 és az S. ambofaciens/pKC448 készítése

Az 1. és 6. példákból származó DNS mintákból körülbelül 1-1 gg-ot és 200 μΐ Streptomyces ambofaciens törzsből készült protoplasztot (a törzset a Morthern Régiónál Research Laboratories-nál, Peoria, Illinois, helyezték letétbe és lett az államok gyűjtemény része, ahol az NRRL 2420 szám alatt érhető el) keverünk össze 500 μΐ 55%-os polietilén-glikollal (Sigma) P táptalajban [Hopwood and Wright, Molecular and General Genetics, 162, 307 (1978)], vortexeljük, majd 25 és 250 μΐ-es alikvot részeket rétegzünk R2YE’ lemezekre R2YE fedő-agarban. A lemezeket 18 órán át 30 °C-on inkubáljuk, majd 3 ml, 50 gg/ml végkoncentráció eléréséhez elegendő mennyiségű apramicint** tartalmazó 3 ml R2YE fedőagarral rétegezzük felül. A lemezeket ezután további 3 napig inkubáljuk 30 ’C-on. A kapott

S. ambofaciens/pKC420 és S. ambofaciens/pKC448 apramicin-rezisztens telepeket ismert módszerekkel izoláljuk, tenyésztjük, majd szokványos módon azonosítjuk restrikciós enzimes emésztéssel és agaróz gélelektro-forézissel a bennük lévő kozmidokat (Maniatis et al., 1982).

8. példa

Kromoszomális génbank készítése

A) A pKC420 vektor-DNS készítése

Körülbelül 50 gg pKC420 kozmid DNS-t emésztünk 500 gl lxPvwII pufferban (60 mM nátrium-klorid, 6 mM Trisz-HCl pH - 7,5,6 mM magnézium-klorid és 1 mM ditiotreitol) 100 egység Pvull restrikciós enzimmel 3 órán át 37 °C-on. Körülbelül 50 gl lOxBAP puffért (600 mM Trisz-HCl pH = 8 és 500 mM nátriumklorid) és 2,5 egység BAP enzimet (International BioAz R2YE táptalaj összetétele a következő, 1 literre számítva: Szacharóz 103 g, 2,5%-os kálium-szulfátból 10 ml magnézium-klorid 10,1 g, glükóz 10 g, kazein-hidrolizátum 0,1 g, agar 22 g, nyomelem-keverék 2 ml, 0,5%-os KH2PO4 10 ml, 1 mólos kalcium-klorid 20 ml, prolin 3 g, 0,25 mólos TES pH - 7,2 100 ml, 10%-os élesztőkivonat 50 ml.

” Az apramicin antibiotikum vagy a Sigmától (St. Louis, Missouri) vagy az Eli Lilly and Companytől (Indianapolis, Indiana) szerezhető be.

technologies, Inc. P. O. Box. 1565, New Naven CT 06506) adunk az elegyhez ezután, és 1 órán át 70 ’Con tartjuk. A DNS-t fenollal extraháljuk, majd Sevaggal, végül etanollal kicsapjuk. A DNS-t ezután 500 gl lxBawHI pufferben 90 egység SűmíHI restrikciós enzimmel emésztjük 3 órán át 37 ’C-on. A DNS-t ezután ismét fenollal, Sevag-gal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd végül 50 gl TEben oldjuk.

B) A beépítendő DNS elkészítése

A Streptomyces felleus (NRRL 2251) törzset 100gg/ml spiramicinneT kiegészített 250 ml Tryptic Soy táplevesben növesztjük 16 órán át 30 ’C-on. A sejteket centrifugálással (10 perc 8000/perc fordulatszám) összegyűjtjük, 10 ml lízis-keverékben (300 mM szacharóz, 25 mM Trisz-HCl pH = 8 és 25 mM EDTA) szuszpendáljuk, majd 1 mg/ml-re állítjuk a szuszpenzióban a lizozim koncentrációt és 37 ’C-on inkubáljuk 10 percig. Majd proteináz K-t adunk hozzá 200 gg/ml-es és SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát) 2%-os végkoncentrációban. A terméket 10 percig 70 ’C-on inkubáljuk, majd jégbehűtjük. Az elegyben 1 mólos nátrium-acetát koncentrációt állítunk be, majd 30 percig jégen hagyjuk. Miután az oldatot óvatosan extraháltuk TE-vel telített fenollal a rétegeket szétválasztjuk és vizes fázist óvatosan extraháljuk Sevag-gal. A fázisokat megint szétválasztjuk és a vizes fázisban lévő nukleinsavakat etanollal kicsapjuk. A csapadékot 70%-os etanollal mossuk, majd 5 ml TEben oldjuk. A DNS oldathoz 50 gg/ml végkoncentrációban RNáz A-t adunk. Az oldatot ezután 30 percig 37 ’C-on inkubáljuk, kétszer extraháljuk fenollal, kétszer Sevag-gal, majd etanollal kicsapjuk. A DNS-t 1 ml TE-ben oldjuk (545 gg/ml), majd 0,3%-os agaróz gélen meghatározzuk a méretét lambda fág mint standard mellett, úgy azt kapjuk, hogy átlagos mérete 70 kb.

Ezután 50 gg Streptomyces felleus kromoszomális DNS-t inkubálunk 30 egység ΛίάοΙ-gyel 500 gl lx Mbol pufferben (100 mM nátrium-klorid, 10 mM Trisz-HCl pH = 7,4, 10 mM magnézium-klorid és 1 mM DTT) 37 ’C-on 15 percig. Ez a körülmény szolgáltatja, empirikus alapon, a kromoszomális DNS kívánt részleges fragmentációját. A DNS-t fenollal, Sevag-gal extraháljuk, majd 50 gl TEben oldjuk.

Körülbelül 25 gg, ΛΤύοΙ-gyel részlegesen emésztett Streptomyces felleus DNS-t BAP-pal kezelünk (1,25 egység az első órában 70 ’C-on, majd újabb 1,25 egység újra egy órán át 70 ’C-on) 100 gl lxBAP pufferben. A DNS-t fenollal Sevag-gal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 50 gl TE-ben kicsapjuk. Ennek a DNS-nek a méretét 0,3%-os agaróz-gélen határozzuk meg, így arra 30-40 kb-t kapunk.

C) A vektor-DNS ligálása a beépítendő DNS-sel

A pKC420 karokból körülbelül 125 ng-ot (a 8A példa szerint készül) keverünk 500 ng Streptomyces felleus Mbol-gyel parciálisán emésztett DNS-sel (a 8B példa szerint készül), majd 400 egység (New England

A spiramicin antibiotikumot a Sigmától (St. Louis, Missouri) lehet beszerezni.

HU 208 551 Β

Biolabs) T4 DNS ligázzal ligáljuk 1 mM ATP koncentrációjú, 20 μΐ lxligáz pufferben. A ligálást 16 órán át 16 °C-on végezzük, majd 10 perc 70 °C-os inkubálással állítjuk le.

D) In vitro pakolás

A ligálást úgy végezzük, hogy körülbelül 10 μΐ ligáló keveréket (-62,5 ng hibrid vektor DNS) adunk a Biotec pakoló kit-hez* és 30 ’C-on tartjuk 1 órán át. Ehhez a keverékhez körülbelül 500 μΐ 0,1 M nátriumklorid, 0,01 M Trisz-HCl pH = 8, és 0,01 M magnézium-szulfát összetételű oldatot adunk. Végül 25 μΐ kloroformot adunk hozzá, hogy az esetleges élő baktériumokat megöljük.

Az E. coli KI 2 SF8 transzdukciója

Körülbelül 200 μΐ pakolt cozmidot (25 ng vektor DNS) 500 μΐ, 0,2% maltózzal és 10 mM magnéziumszulfáttal kiegészített Trypton élesztőkivonaton növesztett E. coli K12 SF8 törzshöz adszorbeálunk. Az adszorpciót 10 percig végezzük 37 ’C-on 10 mM Trisz pH = 8,0 és 10 mM magnézium-szulfát összetételű oldatban. A sejteket 5 ml Trypton élesztőkivonatban növesztjük 3 órán át szobahőmérsékleten, majd 30 ’C-on, 200 Bg/ml koncentrációjú apramicinnel kiegészített lemezeken szelektáljuk a transzdukánsokat. A transzdukált sejtek 0,1 ml-ének szélesztéséből körülbelül 400 telepet kapunk, ami azt jelenti, hogy a transzdukciós hatásfok körülbelül l,2xl0⁶ transzdukáns per mikrogramm.

F) Transzformálás Streptomyces ambofaciens-be

A kívánt transzformálást lényegében a 7. példa szerint hajtjuk végre. Ebben a kísérletben körülbelül 3,4xl0⁴ transzformánst kapunk 1 μg E. coli-bó\ izolált pKC420-ra számítva.

9. példa

A pKC 467 kozmid készítése

A) A pKC462 kozmid emésztése Xbal-gyel

Körülbelül 25 μg pKC462 kozmidot emésztünk

200 egység Xbal restrikciós enzimmel 100 μΐ lxXüal pufferben (50 mM nátrium-klorid, 100 mM TriszHCl pH = 7,5, 5 mM magnézium-klorid és 1 mM ditiotreitol). Az elegyet 37 ’C-on inkubáljuk körülbelül egy órán át, majd reakciót 10 perces 70 °C-os inkubálással állítjuk le. Az emésztett DNS-t 0,5%-os agaróz gélen (International Biotech, Inc.) elektroforetizáljuk, majd a nagy fragmentet izoláljuk DEAE papíron. Az izolált DNS-t 400 μΐ, 1 M nátrium-klorid koncentrációjú TE-vel eluáljuk, majd etanollal kicsapjuk. A DNS-t az ezután következő ligálás céljából 20 μΐ TEben oldjuk.

B) Ligálás és az E. coli K12 SF8lpKC467 készítése

Körülbelül 3 μΐ (-1,5 Bg) izolált DNS-t önmagában ligálunk, majd ezzel E. coli K12 SF8 törzset transzformálunk, lényegében a 2C példa szerint. A kívánt transzformánsokat úgy azonosítjuk, hogy először Am^Rfenotípusra szelektálunk, majd az Am^R telepek közül replikázással keressük a neomicin rezisztens telepeket.

Promaga Biotec. 2800 S. Rish Hatchery Road, Medison, WI 53 711

A kapott E. coli K12 SF8/pKC467 transzformánsokat ezután szokványosán tenyésztjük és izoláljuk a pKC467 kozmidot.

Ennek az Xbal deléciónak a következtében egy alacsony kópia-számú Streptomyces vektort kapunk. Az alacsony kópia-számú vektorok annyiban előnyösek, hogy a befogadó törzsek sejtjei valószínűleg nem sérülnek a fiziológiailag aktív géntermékek nagyfokú kifejeződésétől. A pKC467 kozmid restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között, a 7. ábrán mutatjuk be.

10. példa

A Streptomyces ambofaciens!pKC462 és S. ambofacienslpKC467 készítése

Az 5. példából származó, körülbelül 1 Bg DNS-t és 200 μΐ Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) protoplasztot összekeverünk, lényegében a 7. példa szerint. A kívánt transzformánsokat úgy azonosítjuk, hogy először az Am^R fenotípusra szelektálunk, majd az Am^Rtelepeket replikázva keressük a neomicin rezisztens telepeket. A kapott S. ambofaciens/pKCA62 apramicin rezisztens és neomicin rezisztens telepeket ismert módszerekkel izoláljuk, tenyésztjük, majd szokványos módon azonosítjuk kozmidjaik restrikciós enzimes és agaróz gélelektroforézises elemzésével (Maniatis et. al., 1982).

A Streptomyces ambofacienslpKC46!-el a fentiek szerint állíthatjuk elő úgy, hogy a 9. példa pKC467 DNS-e helyett a pKC462 DNS-t használjuk.

11. példa

Az E. coli K12 SE8/pKC462A törzs tenyésztése és a pKC462A kozmid izolálása

Az E. coli K12 SF8/pKC462A törzs (NRRL B15 973) tenyésztését, majd a pKC462A kozmid izolálását lényegében az 1. példa szerint végezzük. Az eljárással előállított -0,4 mg pKC462A kozmid DNS-t 1 ml TE pufferben oldjuk, majd -20 ’C-on tároljuk. A pKC462A restrikciós és funkciós térképet a kísérő rajzok között a 8. ábrán közöljük. A pKC462A kozmidot könnyű megkülönböztetni a pKC462 kozmidtól a méret alapján, mivel a pKC462A kozmid körülbelül 0,9 kb-vel több DNS-t tartalmaz, mint a pKC462 kozmid.

72, példa

A pKC467A kozmid és az E. coli K12

SF8!pKC467A készítése

Ezt az alacsony kópia-számú Streptomyces vektort lényegében a 9A példa szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pKC462A DNS-t használjuk a pKC462 DNS helyett.

Az E. coli K12 SF8 törzset lényegében a 2C példa szerint transzformáljuk a pKC467A kozmid DNS-sel. A kívánt transzformánsok azonosításánál először az Am^R fenotípusra szelektálunk, majd az Am^R telepek közül replikázással keressük a neomicin rezisztens telepeket. A kapott E. coli K12 SF8/pKC467 transzformánsokat szokványos módon tenyésztjük a pKC467A kozmid előállítása és izolálása céljából.

HU 208 551 Β

13. példa

A Streptomyces ambofaciens/pKC462A és a S. ambofacienslpKC467A törzsek előállítása

All. példából származó, körülbelül 1 pg DNS-t és

200 μΐ Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) protoplasztot keverünk össze lényegében a 7. példa szerint. A kívánt transzformánsok azonosításánál először az Am^R fenotípusra szelektálunk, majd az Am^R telepek közül replikázással szelektáljuk a neomicin rezisztens telepeket.

A Streptomyces ambofacienslpK.C4(TJA törzseket a fentiek szerint állíthatjuk elő úgy, hogy a 12. példából származó pKC467A DNS-t használunk a pKC462A DNS helyett.

14. példa

A cos 111 kozmid készítése

A) A pOJ107 közbenső plazmid készítése

Körülbelül 25 μg pKC462A kozmid DNS-t emésztünk 0,5 ml lxpufferben (150 mM nátrium-klorid, 6 mM Trisz-HCl pH = 7,9, 6 mM magnézium-klorid és 1 mM ditiotreitol) 20 egység Pstl restrikciós enzimmel 3 órán át 38 °C-on. A DNS-t etanollal kicsapjuk és centrifugálással gyűjtjük össze. Miután a DNS csapadékot 100 μΐ TE-ben oldottuk, a Rs/I-gyel emésztett DNS-t 0,7%-os agaróz minigélen elektroforetizáljuk és elektroelúcióval izoláljuk, IBI elektroelúciós készülék alkalmazásával. A ~2 kb méretű Pstl fragmenst úgy izoláljuk, hogy a gélt 30 percig 150 V feszültséggel futtatjuk, majd etanollal kicsapjuk és 50 μΐ TE-ben oldjuk. Ebből a DNS-ből körülbelül 1 μΐ-t 20 egység BamHl restrikciós enzimmel emésztünk 37 °C-on 1 órán át. A BamHI-Pstl-gyel emésztett DNS-t 0,7%os agaróz gélen elektroforetizáljuk, majd a kívánt, —1,3 kb méretű BamHl-Pstl fragmenst, amely az apramicin rezisztencia gént tartalmazza, izoláljuk és tisztítjuk a 2B példa szerint.

A pUC19 plazmidot (forgalmazó Pharmacia, Inc., 800 Centennial Or., Piscataway, M. J. 08 854) a fentiekhez hasonlóan kezeljük BawzHI és Pstl restrikciós enzimekkel és a BamHI-Pstl-gyel hasított plazmidot a pKC462A coamid -1,3 kb BamHl-Pstl fragmenséhez ligáljuk, majd a 2C példa szerint az E. coli K12 SF8 törzsbe transzformáljuk.

A kívánt, E. coli K12 SF8/pOJ107 transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízisével, valamint az apramicin-rezisztencia fenotípus alapján azonosítjuk.

B) A pOJ108 közbenső plazmid készítése

Körülbelül 10 μg pOJ107 plazmid DNS-t emésztünk 20 μΐ lxEcoRI pufferben 20 egység EcoRI restrikciós enzimmel. Etanolos kicsapás után ezeket a fragmenseket 100 μΐ Ndel pufferben szuszpendáljuk 3 egység Ndel restrikciós enzimmel. A plazmid DNS keveréket etanollal kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, majd 20 μΐ TE-ben oldjuk. Az ezzel a kettős emésztéssel kapott fragmensekben van az a kívánt EcoBl-Ndel fragmens is, amely az E. coli replikont és mind az ampicillin, mind az apramycin rezisztencia gént tartalmazza.

Részleges Ndel restrikciós emésztést végzünk pHJL210 plazmid (NRRL B—15 824) DNS-én úgy, hogy az az EcoRI-gyel emésztett pHJL210 DNS-t 37 °C-on 8 percig inkubáljuk 3 egység Ndel restrikciós enzimmel. Kicsapás után ezeket a fragmenseket teljesen elhasítjuk 20 egység EcoRI restrikciós enzimmel 37 °C-on inkubálva 2 órán át. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 10 μΐ TE-ben oldjuk. Ezzel a kettős emésztéssel kapjuk a kívánt EcoBA-Ndel fragmenset, amely az SCP2* replikációs origót, valamint a neomicin és tiostrepton rezisztencia géneket tartalmazza. Ezt a két plazmid-emésztményt ligáljuk, és az E. coii K12 SF8 törzset transzformáljuk vele. A kapott E. coli K12 SF8/pOJ108 transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízisével, valamint az apromicin-rezisztencia fenotípus alapján azonosítjuk. A pOJ108 plazmid restrikciós és funkciós térképét a 9. ábrán közöljük a kísérő rajzok között.

C) A pOJIll közbenső plazmid készítése

A pOJ!08 plazmid DNS-ből 10 pg-ot emésztünk 100 μΐ IxPstl pufferben 50 egység Pstl restrikciós enzimmel 2 órán át 37 °C-on. A pOJ108 plazmid ilyen Pstl emésztésekor három, köztük egy ~1 kb-os deléció keletkezik, ezáltal eltávolítunk egy BamHl helyet és inaktiváljuk a neomicin-rezisztenciát kódoló gént. Az emésztéskor keletkezett szegmenseket ligáljuk, és a rekombináns-variánsokkal E. coli K12 SF8-ra transzformálunk, és a neomicínre érzékeny transzformánsokból izoláljuk és azonosítjuk a pOJIll plazmidot. A pOJ 111 plazmid restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között a 10. ábrán mutatjuk be.

D) A Sca-HindllI-mal emésztett plazmid DNS előállítása

Körülbelül 5 g pOJIll plazmid DNS-t oldunk 100 μΐ lxtömény reakció-pufferben (150 mM nátriumklorid 6 mM Trisz-HCl pH = 7,5, 6 mM magnéziumklorid és 6 mM ditiotreitol), 3 μΐ (~50 egység) Seal restrikciós enzimet adunk hozzá és a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A DNS-t fenollal és Sevag-gal extrabáljuk, etanollal kicsapjuk és 20 μΐ TEben oldjuk. A DNS-t Hindlll pufferben oldjuk, majd 50 egység Hindlll restrikciós enzimmel hasítjuk 37 ’Con 2 órán át. Fenolos és Sevagos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk és 20 μΐ TE-ben oldjuk.

pg pKC462A plazmid DNS-t emésztünk Hindlll és Seal restrikciós enzimekkel a fentiek szerint (a mennyiséget 70 egységre növeljük). Ezzel a kettős emésztéssel kapjuk a többszörös cos helyet, valamint az ampicillin rezisztenciát kódoló gén egy részét tartalmazó kívánt Hindlll-Scal fragmenst. Az emésztés lejátszódása után 3 pl (-45 egység) Xhal restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez, majd további 2 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. Ezzel az Xhal emésztéssel azt érjük el, hogy az eredeti plazmid felbukkanásának valószínűségét csökkentjük.

E) A fragmensek ligálása a coslll kozmid előállítása céljából, és az E. coli KI2 SE8 transzformálása

A 14D példában előállított pOJIll plazmid ScalHindlll restrikciós fragmentből öt mikrolitert és öt mikroliter, a pKC462A kozmid 14D példában előál11

HU 208 551 Β lított Scal-Hindlll fragmenst összekeverünk, majd ligálunk. Ezzel a ligáló eleggyel transzformáljuk az E. co/zK12SF8 törzset. A kívánt E. coli K12 SF8/cos 111 transzformánsokat apramicin rezisztens fenotípusuk és kozmid DNS-ük restrikciós enzimes emésztése alapján azonosítjuk. A kozmid DNS-t az 1. példában leírt módszerrel izoláljuk a transzformánsokból A cos 111 restrikciós és funkciós térképét kísérő rajzok között all. ábrán közöljük.

15. példa

A Streptomyces lividaus TK23/cosll 1 törzs előállítása

A 14. példában előállított DNS-ből körülbelül 1 pgot és 200 pl Streptomyces lividaus TK23 (NRRL 15 826) protoplaszt szuszpenziót a 7. példában leírtak szerint összekeverünk. A kívánt S. lividaus TK 23/coslll transzformánsokat először az apramicin rezisztencia fenotípusra való szelektálással, majd az apramicin rezisztens telepek közül replikázással tiostrepton rezisztencia alapján választjuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás rekombináns DNS kozmid shuttle vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy ligálással egybeépítünk

a) egy E. coli-ban működő replikációs origót,

b) egy Streptomyces-ben működő replikációs origót,

c) egy, a lambda bakteriofág két vagy több cos szakaszát tartalmazó DNS szakaszt és

d) E. coli és/vagy Streptomyces gazdasejtben antibiotikum-rezisztenciát kifejező egy vagy több DNSszakaszt. (Elsőbbsége: 1984. 09. 27.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pKC427, pKC428, pKC462, pKC467, pKC467A vagy coslll rekombináns DNS kozmid shuttle vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő a)—d) DNS szakaszokat ligálással egybeépítjük. (Elsőbbsége: 1985.06.07.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pKC427, pKC428, pKC448, pKC462 vagy pKC467 rekombináns DNS kozmid shuttle vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő a)-d) DNS szakaszokat ligálással egybeépítjük. (Elsőbbsége: 1984. 09. 27.)
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás pKC467A vagy coslll cosmid shuttle vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő a)—d) DNS szakaszokat ligálással egybeépítjük. (Elsőbbsége: 1985.06. 17.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli replikációs origóként a pBR322 replikációs origót tartalmazó fragmensét építjük egybe a b)-d) DNS szakaszokkal. (Elsőbbsége: 1984. 09. 27.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Streptomices replikációs origóként az SCP2 vagy SCP2* replikációs origóját tartalmazó fragmensét építjük egybe az a), c) és d) DNS szakaszokkal. (Elsőbbsége: 1984.09. 27.)
7. Eljárás kromoszomális génbank készítésére, azzal jellemezve, hogy

i) egy genom kromoszomális DNS-szakaszait az 1. igénypont szerinti kozmid shuttle vektorba ligáljuk;

ii) a fenti ligáit kozmid shuttle vektort bakteriofág részecskékbe pakoljuk;

iii) a fenti pakolt vektorral E. coli törzset transzformálunk;

iv) az E. coli törzset tenyésztjük, majd a vektort kinyerjük;

v) és a rekombináns vektort Streptomyces gazdasejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1984. 09. 27.)