JPS61132187A - 新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法 - Google Patents
新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法Info
- Publication number
- JPS61132187A JPS61132187A JP59253784A JP25378484A JPS61132187A JP S61132187 A JPS61132187 A JP S61132187A JP 59253784 A JP59253784 A JP 59253784A JP 25378484 A JP25378484 A JP 25378484A JP S61132187 A JPS61132187 A JP S61132187A
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- JP
- Japan
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- dna
- solution
- cos
- cosmid vector
- precipitate
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子操作技術に関し、さらに詳しくは遺伝子
操作技術を使って作成した新規コスミドベクターと、そ
れを用いる遺伝子バンクの製造方法に関するものである
。
操作技術を使って作成した新規コスミドベクターと、そ
れを用いる遺伝子バンクの製造方法に関するものである
。
ヒトをはじめとする哺乳動物の遺伝子の大きさは20キ
ロ塩基対(以下キロ塩基対をKbpと略す)を越えるも
のが少なくない。現在、広く使われているラムダベクタ
ーにクローン化できるDNAの大きさは20Kbpなの
で、これより大きい遺伝子全体を機能のある形でクロー
ン化することはできない。
ロ塩基対(以下キロ塩基対をKbpと略す)を越えるも
のが少なくない。現在、広く使われているラムダベクタ
ーにクローン化できるDNAの大きさは20Kbpなの
で、これより大きい遺伝子全体を機能のある形でクロー
ン化することはできない。
ラムダファージのcohesive endsite
(以下cosと略す)を有するベクター、すなわち
コスミドベクターを使えば35〜45Kbpの大きさの
DNAをクローン化できる。種々のベクターの中で、コ
スミドベクターが最も大きい長さのDNAをクローン化
できるが、長いゲノムDNAの調製がむづかしいことや
、インサートのないベクターだけのバックグランドが高
いこと、また効率が良くないことな′どが障害になって
、コスミドベクターの利用は進まなかった。ところが、
Ish−Horowicz&Burkeはホスファター
ゼを利用してベクターに方向性を持たせる工夫をし、ベ
クターだけのバンクグランドの値を下げるとともにクロ
ーン化の効率を上げることに成功したCD、Ish−H
orowicz&J。
(以下cosと略す)を有するベクター、すなわち
コスミドベクターを使えば35〜45Kbpの大きさの
DNAをクローン化できる。種々のベクターの中で、コ
スミドベクターが最も大きい長さのDNAをクローン化
できるが、長いゲノムDNAの調製がむづかしいことや
、インサートのないベクターだけのバックグランドが高
いこと、また効率が良くないことな′どが障害になって
、コスミドベクターの利用は進まなかった。ところが、
Ish−Horowicz&Burkeはホスファター
ゼを利用してベクターに方向性を持たせる工夫をし、ベ
クターだけのバンクグランドの値を下げるとともにクロ
ーン化の効率を上げることに成功したCD、Ish−H
orowicz&J。
F、Burke、Nucleic
Acids Res、、 !、2889. (19
81)〕 。
81)〕 。
Ish−Horowicz&Burks法によるゲノム
DNAの遺伝子バンクの製造方法は以下のようである(
たとえば、現在、広く使われているコスミドベクターの
1つであるpJB−8を例にとる)。pJB−8は5.
44Kbpの大きさで、制限酵素BamHI、Hind
[[,5ailでそれぞれ1カ所切断され、ラムダファ
ージのCosを1個有するコスミドベクターである。■
、pJB−8をHindll[で切断することによって
直線状DNAとし、次にホスファターゼ処理によってH
indI[の切断片を不活化する。そして、BamHI
で切断することによって2個のDNA断片が得られ、c
osを含む大きなりNA断片(5、4K b p)をア
ガロースゲル電気泳動法によって単離する。得られたc
osを含むDNA断片(5,4Kbp)が、ラムダファ
ージの左腕に相当する。■、pJB−8を5alIで切
断することによって直線状DNAとし、次にホスファタ
ーゼで処理することによって5alIの切断片を不活化
する。そして、BamHIで切断することによって2個
のDNA断片が得られ、cosを含む小さなりNA断片
(2,34Kbp)をアガロースゲル電気泳動法によっ
て単離する。得られたCosを含むDNA断片(2,3
4Kbp)が、ラムダファージの右腕に相当する。■、
たとえば、ヒトのゲノムDNAを制限酵素5au3Aも
しくはMboIで部分的に切断し、35〜45Kbpの
大きさのDNA断片を分画する。この35〜45Kbp
の大きさのDNA断片を、■と■で別々に調製した左腕
と右腕との間に、連結酵素(T4−DNAリガーゼ)で
挿入させて、組み換え体DNAを調製する。■、組み換
え体DNAを1nvitroパツケージングで形質導入
ファージ粒子に変え、次いで大腸菌に感染させることに
よりヒトのゲノムDNAの遺伝子バンクが製造できる。
DNAの遺伝子バンクの製造方法は以下のようである(
たとえば、現在、広く使われているコスミドベクターの
1つであるpJB−8を例にとる)。pJB−8は5.
44Kbpの大きさで、制限酵素BamHI、Hind
[[,5ailでそれぞれ1カ所切断され、ラムダファ
ージのCosを1個有するコスミドベクターである。■
、pJB−8をHindll[で切断することによって
直線状DNAとし、次にホスファターゼ処理によってH
indI[の切断片を不活化する。そして、BamHI
で切断することによって2個のDNA断片が得られ、c
osを含む大きなりNA断片(5、4K b p)をア
ガロースゲル電気泳動法によって単離する。得られたc
osを含むDNA断片(5,4Kbp)が、ラムダファ
ージの左腕に相当する。■、pJB−8を5alIで切
断することによって直線状DNAとし、次にホスファタ
ーゼで処理することによって5alIの切断片を不活化
する。そして、BamHIで切断することによって2個
のDNA断片が得られ、cosを含む小さなりNA断片
(2,34Kbp)をアガロースゲル電気泳動法によっ
て単離する。得られたCosを含むDNA断片(2,3
4Kbp)が、ラムダファージの右腕に相当する。■、
たとえば、ヒトのゲノムDNAを制限酵素5au3Aも
しくはMboIで部分的に切断し、35〜45Kbpの
大きさのDNA断片を分画する。この35〜45Kbp
の大きさのDNA断片を、■と■で別々に調製した左腕
と右腕との間に、連結酵素(T4−DNAリガーゼ)で
挿入させて、組み換え体DNAを調製する。■、組み換
え体DNAを1nvitroパツケージングで形質導入
ファージ粒子に変え、次いで大腸菌に感染させることに
よりヒトのゲノムDNAの遺伝子バンクが製造できる。
以上がIsh−Horowicz&Burke法による
ゲノムDNAの遺伝子バンクの製造方法であるが、次の
4つの問題点がある。第1に、pJB−8はcosが1
つしかなく、左腕と右腕とを別々にm製しなければなら
ない。第2に、左腕と右腕について、それぞれcosを
含むDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離しなけ
ればならない。第3に、pJB−8の左腕の長さは5゜
4Kbp、右腕の長さは2.34Kbpであり、左腕と
右腕との長さが異なるので、35〜45Kbpのゲノム
DNAに連結する確率も異なり、左腕と右腕の混合する
比率を検討しなければならない。第4に、この製造方法
で得られた遺伝子バンクにおいては、組み換え体DNA
は大腸菌内でプラスミドとして複製し、大腸菌より共有
結合で閉鎖された環状のプラスミドDNA (c c
c−DNA)として分離rR製できるが、組み換え体D
NAを形質導入ファージ粒子としてゲノムDNAの遺伝
子バンクを製造することはできない。
ゲノムDNAの遺伝子バンクの製造方法であるが、次の
4つの問題点がある。第1に、pJB−8はcosが1
つしかなく、左腕と右腕とを別々にm製しなければなら
ない。第2に、左腕と右腕について、それぞれcosを
含むDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離しなけ
ればならない。第3に、pJB−8の左腕の長さは5゜
4Kbp、右腕の長さは2.34Kbpであり、左腕と
右腕との長さが異なるので、35〜45Kbpのゲノム
DNAに連結する確率も異なり、左腕と右腕の混合する
比率を検討しなければならない。第4に、この製造方法
で得られた遺伝子バンクにおいては、組み換え体DNA
は大腸菌内でプラスミドとして複製し、大腸菌より共有
結合で閉鎖された環状のプラスミドDNA (c c
c−DNA)として分離rR製できるが、組み換え体D
NAを形質導入ファージ粒子としてゲノムDNAの遺伝
子バンクを製造することはできない。
本発明者らは、これらの問題点を解決するために、同一
の方向性をもったラムダファージのc。
の方向性をもったラムダファージのc。
Sを3個有し、2種類の制限酵素で切ることによって、
それぞれcosを1個もしくは2個もった長さのほぼ等
しい右腕と左腕とが等モルできることを特徴とする新規
コスミドベクターを作成した。
それぞれcosを1個もしくは2個もった長さのほぼ等
しい右腕と左腕とが等モルできることを特徴とする新規
コスミドベクターを作成した。
そして、本発明のコスミドベクターを用いる外来DNA
の遺伝子バンクの製造方法を完成するに至った。本発明
のコスミドベクターは、同一分子内に同一の方向性を持
った3個のcosが存在し、2種類の制限#素で切るこ
とによって、それぞれcosを1個もしくは2個もった
長さのほぼ等しい右腕と左腕とが等モルできるので、右
腕と左腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲ
ル電気泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕
の長さがほぼ等しいので、35〜45KbpのゲノムD
NAにT4−DNAリガーゼによって連結される程度も
ほぼ等しいと考えてよく、2種類の制限酵素で切断して
できた右腕と左腕の等モル混合物を、そのまま35〜4
5KbpのゲノムDNAと連結すれば、組み換え体DN
Aの半分が形質導入ファージ粒子に変わり得ることが期
待できる。このように、本発明のベクターを用いれば、
35〜45KbpのDNA断片として、ゲノムDNAの
遺伝子バンクをより簡単、かつより効率よく製造できる
。そして、さらに本発明のベクターは、同一分子内に同
一の方向性を持った3 filのCO5を育するので、
組み換え体DNAをin vitroパフケージング
で形質導入ファージ粒子に変え、大腸菌に感染させると
、組み換え体DNAは大腸菌内で2個のcosを持った
プラスミドDNAとして複製する。この段階では、プラ
スミドDNAとしての外来DNAの遺伝子バンクである
が、ラムダファージが溶原化している大腸菌を宿主とし
て用いた場合には、加温もしくは紫外線照射すると言っ
たような誘発をかけることにより溶原化していたラムダ
ファージは溶菌化サイクルにはいり、大腸菌内でラムダ
ファージが増殖し、最終的に大腸菌が溶菌してラムダフ
ァージ粒子が外へ出てくる。この時に、大腸菌内で2個
のCO3をもったプラスミドDNAとして存在している
組み換え体DNAも、cosを2個もっているためにラ
ムダファージの頭の部分に取り込まれて、in vi
voパッケージングで形質導入ファージ粒子に変換され
る。このようにして、形質導入ファージ粒子として外来
DNAの遺伝子バンクを製造できる。
の遺伝子バンクの製造方法を完成するに至った。本発明
のコスミドベクターは、同一分子内に同一の方向性を持
った3個のcosが存在し、2種類の制限#素で切るこ
とによって、それぞれcosを1個もしくは2個もった
長さのほぼ等しい右腕と左腕とが等モルできるので、右
腕と左腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲ
ル電気泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕
の長さがほぼ等しいので、35〜45KbpのゲノムD
NAにT4−DNAリガーゼによって連結される程度も
ほぼ等しいと考えてよく、2種類の制限酵素で切断して
できた右腕と左腕の等モル混合物を、そのまま35〜4
5KbpのゲノムDNAと連結すれば、組み換え体DN
Aの半分が形質導入ファージ粒子に変わり得ることが期
待できる。このように、本発明のベクターを用いれば、
35〜45KbpのDNA断片として、ゲノムDNAの
遺伝子バンクをより簡単、かつより効率よく製造できる
。そして、さらに本発明のベクターは、同一分子内に同
一の方向性を持った3 filのCO5を育するので、
組み換え体DNAをin vitroパフケージング
で形質導入ファージ粒子に変え、大腸菌に感染させると
、組み換え体DNAは大腸菌内で2個のcosを持った
プラスミドDNAとして複製する。この段階では、プラ
スミドDNAとしての外来DNAの遺伝子バンクである
が、ラムダファージが溶原化している大腸菌を宿主とし
て用いた場合には、加温もしくは紫外線照射すると言っ
たような誘発をかけることにより溶原化していたラムダ
ファージは溶菌化サイクルにはいり、大腸菌内でラムダ
ファージが増殖し、最終的に大腸菌が溶菌してラムダフ
ァージ粒子が外へ出てくる。この時に、大腸菌内で2個
のCO3をもったプラスミドDNAとして存在している
組み換え体DNAも、cosを2個もっているためにラ
ムダファージの頭の部分に取り込まれて、in vi
voパッケージングで形質導入ファージ粒子に変換され
る。このようにして、形質導入ファージ粒子として外来
DNAの遺伝子バンクを製造できる。
哺乳動物の培養細胞への遺伝子移入において、染色体を
用いる方法は、プラスミドDNAやゲノムDNAを用い
る方法と比較すると、■遺伝子移入の効率と頻度とが常
に10倍から100倍高く、■安定なトランスホーマン
ト−クローンが多く得られる点で優れている(1.ew
is、W、H,。
用いる方法は、プラスミドDNAやゲノムDNAを用い
る方法と比較すると、■遺伝子移入の効率と頻度とが常
に10倍から100倍高く、■安定なトランスホーマン
ト−クローンが多く得られる点で優れている(1.ew
is、W、H,。
5rinivasan、P、R,,5tokoe。
N、、 & 51m1novitch、L、:S。
mat、、cell Genet、、6,333゜(
1980))。多分このことは、染色体ではDNAがク
ロマチン・タンパク質で密に包み込まれたクロマチン構
造をとり、デオキシリボヌクレアーゼ(DNa s e
)の攻撃から守られていることと関係があると思われる
。、また、密なりロマチン構造をとることによって細胞
への取り込みが容易になっているのかもしれない。しか
し、染色体のままではDNAを組み換えることができず
、また、実験に必要なだけの大量の染色体を細胞から調
製することも容易ではない。いま、ラムダファージ粒子
の構成に着目すると、ラムダファージのDNAは外被タ
ンパク質によって密に包み込まれており、クロマチン・
タンパク質に包み込まれている染色体DNAと状況がよ
く似ている。また、ラムダファージベクターを用いて、
DNA組み換えでラムダファージ粒子として遺伝子バン
クを作成する方法はすでに確立している。石浦らは、H
3V−1のTK遺伝子を組み込んだラムダベクターCh
aron4Aの組み換え体くラムダファージ粒子)を用
イテ、Ltk−綱1))へ(7)H3V−ITK遺伝子
の移入を検討したところ、■遺伝子移入の効率は101
で、裸のDNAそのままの場合に比べて1桁高いが、染
色体による場合に比べて1桁低い、■形質転換細胞のコ
ロニーはDNAで得られたものに比べて大きく、そのク
ローンの多くは非選択培地でも安定にたもたれると、予
想どうりの結果を得た(Ishiura、M、、eta
l。
1980))。多分このことは、染色体ではDNAがク
ロマチン・タンパク質で密に包み込まれたクロマチン構
造をとり、デオキシリボヌクレアーゼ(DNa s e
)の攻撃から守られていることと関係があると思われる
。、また、密なりロマチン構造をとることによって細胞
への取り込みが容易になっているのかもしれない。しか
し、染色体のままではDNAを組み換えることができず
、また、実験に必要なだけの大量の染色体を細胞から調
製することも容易ではない。いま、ラムダファージ粒子
の構成に着目すると、ラムダファージのDNAは外被タ
ンパク質によって密に包み込まれており、クロマチン・
タンパク質に包み込まれている染色体DNAと状況がよ
く似ている。また、ラムダファージベクターを用いて、
DNA組み換えでラムダファージ粒子として遺伝子バン
クを作成する方法はすでに確立している。石浦らは、H
3V−1のTK遺伝子を組み込んだラムダベクターCh
aron4Aの組み換え体くラムダファージ粒子)を用
イテ、Ltk−綱1))へ(7)H3V−ITK遺伝子
の移入を検討したところ、■遺伝子移入の効率は101
で、裸のDNAそのままの場合に比べて1桁高いが、染
色体による場合に比べて1桁低い、■形質転換細胞のコ
ロニーはDNAで得られたものに比べて大きく、そのク
ローンの多くは非選択培地でも安定にたもたれると、予
想どうりの結果を得た(Ishiura、M、、eta
l。
Mol、Ce1l、Biol、、2.607 (198
2))。しかし、ラムダベクターで作成した遺伝子バン
クでの本質的な問題点は、ラムダベクターにクローン化
できるDNAの大きさは最大20Kbpなので、目的の
遺伝子がこれより大きい場合には機能のある形でその遺
伝子をクローン化することができないことである。そこ
で本発明のCOSを3(固もったコスミドベクターは、
35〜45Kbpの外来DNAをクローン化できるとと
もに、形質導入ファージ粒子として遺伝子バンクを製造
できるという点で優れており、培養細胞への遺伝子移入
に大きな力を発揮するものと思われる。
2))。しかし、ラムダベクターで作成した遺伝子バン
クでの本質的な問題点は、ラムダベクターにクローン化
できるDNAの大きさは最大20Kbpなので、目的の
遺伝子がこれより大きい場合には機能のある形でその遺
伝子をクローン化することができないことである。そこ
で本発明のCOSを3(固もったコスミドベクターは、
35〜45Kbpの外来DNAをクローン化できるとと
もに、形質導入ファージ粒子として遺伝子バンクを製造
できるという点で優れており、培養細胞への遺伝子移入
に大きな力を発揮するものと思われる。
本発明の新規コスミドベクターの1つであるpTcos
Apr10ri/cm’/neorを第1図に示す
。pTc o s Ap1″/ o r i / c
m’″/neo?は、コスミドベクターであるpRH(
−44)もしくはpLH(+129)由来の同一方向性
のあるcos:Hlと(Miwa&Matsubara
、Gene、20,267 (1982))、Tn90
3由来のネオマイシン耐性遺伝子(n e ov″)(
Oka、Sugisaki&Takanami、J、M
o1.Biol、、工1工、217 (1981))、
pNT−31由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子(
Cm”)CTomizawa&Itoh、Proc、N
atl、Acad、Sci、U、S、A、、78.60
96 (1981))、pBR−327由来のアンピ
シリン耐性遺伝子(ApY)及び複製開始点(ori)
(Soberon、Cavarrubias&Boli
var、Gen@、9.287(1980))とからな
る。大きさは4.9 K b pであり、制限酵素C1
al、BamHIによってそれぞれ1カ所切断される。
Apr10ri/cm’/neorを第1図に示す
。pTc o s Ap1″/ o r i / c
m’″/neo?は、コスミドベクターであるpRH(
−44)もしくはpLH(+129)由来の同一方向性
のあるcos:Hlと(Miwa&Matsubara
、Gene、20,267 (1982))、Tn90
3由来のネオマイシン耐性遺伝子(n e ov″)(
Oka、Sugisaki&Takanami、J、M
o1.Biol、、工1工、217 (1981))、
pNT−31由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子(
Cm”)CTomizawa&Itoh、Proc、N
atl、Acad、Sci、U、S、A、、78.60
96 (1981))、pBR−327由来のアンピ
シリン耐性遺伝子(ApY)及び複製開始点(ori)
(Soberon、Cavarrubias&Boli
var、Gen@、9.287(1980))とからな
る。大きさは4.9 K b pであり、制限酵素C1
al、BamHIによってそれぞれ1カ所切断される。
本ベクターを用いるゲノムDNA (外来DNA)の遺
伝子バンクの製造方法を示せば以下のようになる(第2
図参照)。
伝子バンクの製造方法を示せば以下のようになる(第2
図参照)。
■、pDcos ApY10ri/cmr/ne6Y
をC1a!で切断することによって直線状DNAとし、
次にホスファターゼ処理によってC1aIの切断片を不
活化する。そしてBamHIで切断することによって、
それぞれcosを1個及び2個もった長さがほぼ等しい
右腕と左腕とを調製する。■外来DNAを5au3Aも
しくはMbolなどで限定消化し、35〜45Kbpの
大きさのDNA断片を調製する。■35〜45Kbpの
ゲノムDNA断片を■で調製した左腕と右腕との間に7
4−DNAリガーゼで挿入させて、組み換え体DNAを
調製する。■組み換え体DNAをin vi troパ
ッケージングで形質導入ファージ粒子に変え;ラムダフ
ァージが溶原化している大腸菌に感染させる。■この形
質導入体DNAは、ベクター由来のAP’ 、cm?と
oriを含むので、アンピシリンもしくはクロラムフェ
ニコールで選択することによって、2個のcosをもっ
た組み換え体DNAをプラスミドとして持つ大腸菌のみ
を選択的に生かすことができる。0次に、トランスホー
マント(大腸菌)に、加温もしくは紫外線照射すると言
ったような誘発をかけて溶原化していたラムダファージ
を溶菌化サイクルに移行させることに依って、2個のc
osをもった組み換え体DNAをin vivoパッ
ケージングで形質導入ファージ粒子に変換できる。この
形質導入ファージ粒子内には、1個のcos及びApr
、ori、外来DNAからなる組み換え体DNAが包み
込まれている。このようにしてゲノムDNA(外来DN
A)の遺伝子バンクを形質導入ファージ粒子として製造
することができる。
をC1a!で切断することによって直線状DNAとし、
次にホスファターゼ処理によってC1aIの切断片を不
活化する。そしてBamHIで切断することによって、
それぞれcosを1個及び2個もった長さがほぼ等しい
右腕と左腕とを調製する。■外来DNAを5au3Aも
しくはMbolなどで限定消化し、35〜45Kbpの
大きさのDNA断片を調製する。■35〜45Kbpの
ゲノムDNA断片を■で調製した左腕と右腕との間に7
4−DNAリガーゼで挿入させて、組み換え体DNAを
調製する。■組み換え体DNAをin vi troパ
ッケージングで形質導入ファージ粒子に変え;ラムダフ
ァージが溶原化している大腸菌に感染させる。■この形
質導入体DNAは、ベクター由来のAP’ 、cm?と
oriを含むので、アンピシリンもしくはクロラムフェ
ニコールで選択することによって、2個のcosをもっ
た組み換え体DNAをプラスミドとして持つ大腸菌のみ
を選択的に生かすことができる。0次に、トランスホー
マント(大腸菌)に、加温もしくは紫外線照射すると言
ったような誘発をかけて溶原化していたラムダファージ
を溶菌化サイクルに移行させることに依って、2個のc
osをもった組み換え体DNAをin vivoパッ
ケージングで形質導入ファージ粒子に変換できる。この
形質導入ファージ粒子内には、1個のcos及びApr
、ori、外来DNAからなる組み換え体DNAが包み
込まれている。このようにしてゲノムDNA(外来DN
A)の遺伝子バンクを形質導入ファージ粒子として製造
することができる。
また、本発明者らは哺乳動物細胞に対する選択マーカー
を持っていて、哺乳動物細胞への遺伝子移入を目的とす
るコスミドベクター、pTc o sAp? 10ri
/TK/cmr/neo?″ (第3図)を作成した。
を持っていて、哺乳動物細胞への遺伝子移入を目的とす
るコスミドベクター、pTc o sAp? 10ri
/TK/cmr/neo?″ (第3図)を作成した。
pTc o s Apr 10 r i /TK/cm
’/neoFは、pRH(−44)もしくはpLH(+
129)由来の同一方向性のあるcos3個と、Tn9
03由来のneol’、pNT−31由来のcmr 、
pBR−327由来のAprとori、及びpTK−4
由来のTK遺伝子(Ishiura、M、、etal、
、Mol。
’/neoFは、pRH(−44)もしくはpLH(+
129)由来の同一方向性のあるcos3個と、Tn9
03由来のneol’、pNT−31由来のcmr 、
pBR−327由来のAprとori、及びpTK−4
由来のTK遺伝子(Ishiura、M、、etal、
、Mol。
Cel 1.Biol、、2,607 (1982)〕
とからなる。このココスミドベクタは、前記したpTc
osAp’10ri/cm’″/neorと同様に、ゲ
ノム遺伝子バンクを製造できる。すなわち、同一の方向
性を持った3個のcosがあり、CIaIとBamHI
で切断することにより、それぞれcosを1個及び2個
もった右腕と左腕とが等モル出来、Bam H[サイ
トに35〜45Kbpの大きさのゲノムDNAを挿入さ
せた組み換え体DNAを作成できる。そして、この組み
換え体DNAは、in vitroパッケージングに
よって形質導入ファージ粒子に変換し、大腸菌(ラムダ
ファージが溶原化している)に移すことができ、組み換
え体DNAを含む大腸菌は、アンピシリンもしくはクロ
ラムフェニコールで選択することによって得ることがで
きる。次に、トラスホーマント(大腸菌)に誘発をかけ
て、2個のcosを持った組み換え体DNAをin
vivOパッケージングで形質導入ファージ粒子に変換
して、遺伝子バンクを製造できる。さらに、この形質導
入ファージ粒子は、TK遺伝子を持つので、哺乳動物の
培養細胞へ遺伝子移入した際に、チミジンキナーゼ(T
K)活性をマーカーとすることによって、ベクター由来
の組み換え体DNAの移入の判定が培養細胞のレベルで
可能であるという利点がある。
とからなる。このココスミドベクタは、前記したpTc
osAp’10ri/cm’″/neorと同様に、ゲ
ノム遺伝子バンクを製造できる。すなわち、同一の方向
性を持った3個のcosがあり、CIaIとBamHI
で切断することにより、それぞれcosを1個及び2個
もった右腕と左腕とが等モル出来、Bam H[サイ
トに35〜45Kbpの大きさのゲノムDNAを挿入さ
せた組み換え体DNAを作成できる。そして、この組み
換え体DNAは、in vitroパッケージングに
よって形質導入ファージ粒子に変換し、大腸菌(ラムダ
ファージが溶原化している)に移すことができ、組み換
え体DNAを含む大腸菌は、アンピシリンもしくはクロ
ラムフェニコールで選択することによって得ることがで
きる。次に、トラスホーマント(大腸菌)に誘発をかけ
て、2個のcosを持った組み換え体DNAをin
vivOパッケージングで形質導入ファージ粒子に変換
して、遺伝子バンクを製造できる。さらに、この形質導
入ファージ粒子は、TK遺伝子を持つので、哺乳動物の
培養細胞へ遺伝子移入した際に、チミジンキナーゼ(T
K)活性をマーカーとすることによって、ベクター由来
の組み換え体DNAの移入の判定が培養細胞のレベルで
可能であるという利点がある。
本発明は、かかる新規コスミドベクター及びそれを用い
る遺伝子バンクの製造方法に関するものであるが、本発
明に用いられるcosとしては、ラムダファージまたは
ラムドイドファージ由来のものが挙げられる。特に、ラ
ムダファージ由来のcosが好ましいものとして挙げら
れる。また、本発明のコスミドベクターで形質導入ファ
ージ粒子として遺伝子バンクを製造するためには、同一
分子内に同一の方向性を持ったcosが3個ベクター中
に存在すれば充分であるが、3個以上c。
る遺伝子バンクの製造方法に関するものであるが、本発
明に用いられるcosとしては、ラムダファージまたは
ラムドイドファージ由来のものが挙げられる。特に、ラ
ムダファージ由来のcosが好ましいものとして挙げら
れる。また、本発明のコスミドベクターで形質導入ファ
ージ粒子として遺伝子バンクを製造するためには、同一
分子内に同一の方向性を持ったcosが3個ベクター中
に存在すれば充分であるが、3個以上c。
Sがベクター中にあってもかまわない。
本発明のベクターは、2種類の制限酵素で切ることによ
って、それぞれcosを1個づつ持った右腕と左腕がで
きるのであるが、この2種類の制限酵素の組み合わせと
しては、PvunとBamHl、PvuffとBglf
f、C1arとBamHl、C1alとBgllIなど
を挙げることができる。勿論この他にも組合わせは考え
ることができるので、これらに限定されるものではない
。
って、それぞれcosを1個づつ持った右腕と左腕がで
きるのであるが、この2種類の制限酵素の組み合わせと
しては、PvunとBamHl、PvuffとBglf
f、C1arとBamHl、C1alとBgllIなど
を挙げることができる。勿論この他にも組合わせは考え
ることができるので、これらに限定されるものではない
。
本発明のベクター中には、ベクター由来のDNA断片が
挿入されたことを、判定するためには一般的に薬剤耐性
による選択が行われる。従って、本発明のベクター中に
も薬剤耐性を発現するDNA断片が組み込まれているこ
とが好ましい。薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、
テトラサイタリン耐性、ネオマイシン(カナマイシン)
耐性、もしくはクロラムフェニコール耐性など通常の抗
生物質耐性が挙げられる。pTcosApY/。
挿入されたことを、判定するためには一般的に薬剤耐性
による選択が行われる。従って、本発明のベクター中に
も薬剤耐性を発現するDNA断片が組み込まれているこ
とが好ましい。薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、
テトラサイタリン耐性、ネオマイシン(カナマイシン)
耐性、もしくはクロラムフェニコール耐性など通常の抗
生物質耐性が挙げられる。pTcosApY/。
r i / CmY+/ n e O?及び、pTco
sAp)10 r i/TK/cmY/ne oY’は
アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子を有している。
sAp)10 r i/TK/cmY/ne oY’は
アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子を有している。
本発明のベクターを用いてゲノムDNA (外来DNA
)の遺伝子バンクを製造し、哺乳動物の培養細胞へ遺伝
子(遺伝子バンク)移入する際には、ベクター由来のD
NA断片が挿入されたことを判定するために特定の生理
機能を発現するDNA断片が本発明のベクター中に組み
込まれているのが好ましい。特定の生理機能を発現せし
める遺伝子としては、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子
〔Wigler、M、etal、、Ce1l、1土。
)の遺伝子バンクを製造し、哺乳動物の培養細胞へ遺伝
子(遺伝子バンク)移入する際には、ベクター由来のD
NA断片が挿入されたことを判定するために特定の生理
機能を発現するDNA断片が本発明のベクター中に組み
込まれているのが好ましい。特定の生理機能を発現せし
める遺伝子としては、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子
〔Wigler、M、etal、、Ce1l、1土。
725(1978))、アデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ(APRT)遺伝子(Wigler、M、
、etal、、Pro、Natl、Acad、Sci、
U、S、A、、76.1373(1979))、ヒボキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(
HGPRT)遺伝子(Graf、 L、 H,Jr、、
etal、 、 Somat、Ce1l、Qenet
、、5.1031(1979))、キサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT又はg
pt)遺伝子(Berg、p、、eta 1.、M。
スフェラーゼ(APRT)遺伝子(Wigler、M、
、etal、、Pro、Natl、Acad、Sci、
U、S、A、、76.1373(1979))、ヒボキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(
HGPRT)遺伝子(Graf、 L、 H,Jr、、
etal、 、 Somat、Ce1l、Qenet
、、5.1031(1979))、キサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT又はg
pt)遺伝子(Berg、p、、eta 1.、M。
1、Cel 1.Biol、、1,449 (1981
)〕などが挙げられる。本発明の新規コスミドベクター
pTc osApYlo r i/TK/cm?/ne
o”はTK遺伝子を有している。
)〕などが挙げられる。本発明の新規コスミドベクター
pTc osApYlo r i/TK/cm?/ne
o”はTK遺伝子を有している。
さらに、本発明のベクター中には、COI EI由来
の複製機能を有する遺伝子画分を有することが好ましい
。
の複製機能を有する遺伝子画分を有することが好ましい
。
本発明において用いられる外来DNAの例としては、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物もしくは各
種ファージ等に由来するDNAが挙げられる。
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物もしくは各
種ファージ等に由来するDNAが挙げられる。
また、本発明において用いられる制限酵素(DNA断片
の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有する
酵素)や制限酵素により切断されて生じるDNA接着末
端と、これと相補的な関係のある他のDNA断片接着末
端を結合させる為に用いる酵素(リガーゼ)、あるいは
互いに相補的出ないDNA末端同志を結合させるために
DNA末端同志を互いに相補的な接着末端にする酵素、
あるいはこれらを結合させるリガーゼについてはすでに
良く知られ、数多くの酵素が市販され、それらを用いる
手法等についても広く開示されている(Molecul
ar Cloning、C。
の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有する
酵素)や制限酵素により切断されて生じるDNA接着末
端と、これと相補的な関係のある他のDNA断片接着末
端を結合させる為に用いる酵素(リガーゼ)、あるいは
互いに相補的出ないDNA末端同志を結合させるために
DNA末端同志を互いに相補的な接着末端にする酵素、
あるいはこれらを結合させるリガーゼについてはすでに
良く知られ、数多くの酵素が市販され、それらを用いる
手法等についても広く開示されている(Molecul
ar Cloning、C。
Id Spring Harbor Labor
atory、Maniatfs、T、、etal、。
atory、Maniatfs、T、、etal、。
(1982))ので、それらを利用すればよい。
本発明のベクターを用い、ゲノムDNA (外来DNA
)の遺伝子バンクを作成することによって、有用物質を
発現せしめる特定の遺伝子を効率よく見い出すことが可
能である。この特定の遺伝子とは、細菌、糸状菌、酵母
などの微生物、高等動植物あるいは各種ファージ等に由
来するDNAがあり、具体的な有用物質としては、例え
ば各種ホルモン、酵素、さらには抗生物質やアミノ酸な
どの合成系酵素等が挙げられる。
)の遺伝子バンクを作成することによって、有用物質を
発現せしめる特定の遺伝子を効率よく見い出すことが可
能である。この特定の遺伝子とは、細菌、糸状菌、酵母
などの微生物、高等動植物あるいは各種ファージ等に由
来するDNAがあり、具体的な有用物質としては、例え
ば各種ホルモン、酵素、さらには抗生物質やアミノ酸な
どの合成系酵素等が挙げられる。
以下、実施例を示して本発明をいっそう詳細に説明する
。
。
実施例1. ”[’cosA / o r i /
c m’″/ n eゲ1」λ作刀d辷ぴm<第4図
、第4B図及び第4.C図) (a)pH3cosの作成及び調製 (i)作成 コスミドベクターであるpRH(−44)10μgを、
反応混液100μ/ (150mM’ Nacl、6
mM Tr i 5−HCI (pH7,9)。
c m’″/ n eゲ1」λ作刀d辷ぴm<第4図
、第4B図及び第4.C図) (a)pH3cosの作成及び調製 (i)作成 コスミドベクターであるpRH(−44)10μgを、
反応混液100μ/ (150mM’ Nacl、6
mM Tr i 5−HCI (pH7,9)。
6mM MgCl2.100μg/mnBsA)で、
69ユニツトの制限酵素BamH1,(NewEngl
and Biolabs社製)と2時間反応させて完
全に消化した。反応終了後、等量の水飽和フェノールで
抽出を行い、水層をセカンダリブタノールで濃縮後、0
.1倍容量の3M酢酸ナトリウムと2倍容量のエタノー
ルを加えて、DNAを沈澱として得、95%エタノール
で洗ったのち、水流ポンプで乾燥を行い、沈澱を10m
MTr i 5−HC1(p H8,0) 、0.1
mMEDTAからなる水溶液(以下10t10.IEと
略す)7μN(〜1μg/μl)に溶解させた。
69ユニツトの制限酵素BamH1,(NewEngl
and Biolabs社製)と2時間反応させて完
全に消化した。反応終了後、等量の水飽和フェノールで
抽出を行い、水層をセカンダリブタノールで濃縮後、0
.1倍容量の3M酢酸ナトリウムと2倍容量のエタノー
ルを加えて、DNAを沈澱として得、95%エタノール
で洗ったのち、水流ポンプで乾燥を行い、沈澱を10m
MTr i 5−HC1(p H8,0) 、0.1
mMEDTAからなる水溶液(以下10t10.IEと
略す)7μN(〜1μg/μl)に溶解させた。
次に、このBam’HIで消化したDNA溶液1μl(
〜1μg)を反応混液25pl (50mMTr i
5−HCI (pH7,2) 、10mM Mg5
04.0.1mMDTT、50μg/m1BSA、80
μM dATP、80μM dCTP、80μM
dGTP、80μM dTTP)で、2ニーZ y
トのKlenow酵素(Boehringer Ma
nnheim社製)と22℃′で30分間反応させて、
互いに相補鎖が存在する2本gDNA断片(cohes
ive end)を両端がそろった2本鎖DNA断
片(blunt end)に変えた。反応終了後、反
応液を65℃で10分間熱処理してKIenow酵素を
失活させた。
〜1μg)を反応混液25pl (50mMTr i
5−HCI (pH7,2) 、10mM Mg5
04.0.1mMDTT、50μg/m1BSA、80
μM dATP、80μM dCTP、80μM
dGTP、80μM dTTP)で、2ニーZ y
トのKlenow酵素(Boehringer Ma
nnheim社製)と22℃′で30分間反応させて、
互いに相補鎖が存在する2本gDNA断片(cohes
ive end)を両端がそろった2本鎖DNA断
片(blunt end)に変えた。反応終了後、反
応液を65℃で10分間熱処理してKIenow酵素を
失活させた。
次に、このDNA溶液10μj2.(0,4μg)と、
3alIリンカ−(d (pc−c−’r−c−c−
A−C−C’))2μgとを、反応混液20μ!〔50
mM Tris−HCI (pH7,4)10mM
MgCl2,10mM DTT、1mMスペルミ
ジン、1mM ATP、100μg/mNBSA)で
、6ユニツトの74−DNAリガーゼと22℃で6時間
反応させて連結した。その後フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得た。
3alIリンカ−(d (pc−c−’r−c−c−
A−C−C’))2μgとを、反応混液20μ!〔50
mM Tris−HCI (pH7,4)10mM
MgCl2,10mM DTT、1mMスペルミ
ジン、1mM ATP、100μg/mNBSA)で
、6ユニツトの74−DNAリガーゼと22℃で6時間
反応させて連結した。その後フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得た。
このDNA沈澱を、反応混液6001)1(150mM
NaCl、6mM Tris=HC1(PH7,
9) 、6mM MgCl2.6mM DTT、1
00/7g/mj! BSA)で1000ユニツトの
制限酵素Sa I I (Takara社製)と37
°Cで4時間反応させて消化したのち′、O,S%調製
用アガロースゲルにかけて、lOmAで12時間電気泳
動した。分解されたDNA断片は臭化エチジウム染色と
長波長紫外線照明によって見えてくる。cosおよびO
ri、ApからなるDNA断片(3,89Kbp)を含
有するゲルを切り出したのち、5倍容量の抽出液(0,
5M NH40Ac、1mM EDTA (pH7
,5):水飽和フェノール=i : 1)の存在下で、
ゲルをすりつぶしてDNAを溶出させた。そして、溶出
液をセカンダリ−ブタノールで濃縮後、0.1倍容量の
3M酢酸ナトリウムと2倍容量のエタノールを加えてD
NAを沈澱として得た。このDNA沈澱を反応混液20
μl (50mM Tris−HCI (pH7,
4) 、10mM MgCl2.10mM DTT
、1mMスペルミジン、1mM ATP、1)00u
/mI BSA)で、6ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて、cos及びor
t、Ap”からなるDNA断片(3,89Kbp)を閉
環化させた。その後、フェノール抽出を行ない、DNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tr
i 5−MCl (pH7,5)溶液20μEに熔解
させた。
NaCl、6mM Tris=HC1(PH7,
9) 、6mM MgCl2.6mM DTT、1
00/7g/mj! BSA)で1000ユニツトの
制限酵素Sa I I (Takara社製)と37
°Cで4時間反応させて消化したのち′、O,S%調製
用アガロースゲルにかけて、lOmAで12時間電気泳
動した。分解されたDNA断片は臭化エチジウム染色と
長波長紫外線照明によって見えてくる。cosおよびO
ri、ApからなるDNA断片(3,89Kbp)を含
有するゲルを切り出したのち、5倍容量の抽出液(0,
5M NH40Ac、1mM EDTA (pH7
,5):水飽和フェノール=i : 1)の存在下で、
ゲルをすりつぶしてDNAを溶出させた。そして、溶出
液をセカンダリ−ブタノールで濃縮後、0.1倍容量の
3M酢酸ナトリウムと2倍容量のエタノールを加えてD
NAを沈澱として得た。このDNA沈澱を反応混液20
μl (50mM Tris−HCI (pH7,
4) 、10mM MgCl2.10mM DTT
、1mMスペルミジン、1mM ATP、1)00u
/mI BSA)で、6ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて、cos及びor
t、Ap”からなるDNA断片(3,89Kbp)を閉
環化させた。その後、フェノール抽出を行ない、DNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tr
i 5−MCl (pH7,5)溶液20μEに熔解
させた。
(ii) −ンスホーメーションこのDNA溶液
10μβを大腸菌HB 101のcompetent
cell 100μj! (対数増殖期の大腸菌H
BIOIを0〜4℃で0. I MCaC12溶液で1
5分間処理後、もとの培養液の1/10容量の0.1
M Ca C12/ 14% gIycerol溶液
に再懸濁し、−70℃に保存)とよく混合し、0℃で1
0分間、続いて37℃で5分間保温して、DNAを大腸
菌内に取りこませたのち、これにL−ブロス(1% B
actot−ryptone、0.5%酵母エキス、0
.5%Nac1,0.1%グルコース) 2mJを加
えて、37℃で1時間振盪培養した。この菌体懸濁液を
20℃g / m IIのアンピシリンを含むし一プレ
ート(L−ブロースに寒天を1%添加したプレート)上
にまき、37℃で24〜48時間培養し、アンピシリン
耐性のクローンを得た。
10μβを大腸菌HB 101のcompetent
cell 100μj! (対数増殖期の大腸菌H
BIOIを0〜4℃で0. I MCaC12溶液で1
5分間処理後、もとの培養液の1/10容量の0.1
M Ca C12/ 14% gIycerol溶液
に再懸濁し、−70℃に保存)とよく混合し、0℃で1
0分間、続いて37℃で5分間保温して、DNAを大腸
菌内に取りこませたのち、これにL−ブロス(1% B
actot−ryptone、0.5%酵母エキス、0
.5%Nac1,0.1%グルコース) 2mJを加
えて、37℃で1時間振盪培養した。この菌体懸濁液を
20℃g / m IIのアンピシリンを含むし一プレ
ート(L−ブロースに寒天を1%添加したプレート)上
にまき、37℃で24〜48時間培養し、アンピシリン
耐性のクローンを得た。
(iii )小 立 、 び小 DNA5ApY″であ
るクローンをL−ブロス2m7!中(Ap 20 ii
g/mz含有)で37℃、1晩振盪して、増殖させた
。培養液1.5 m lをエツペンドルフチューブにと
り、机上遠心分離機にかけて集菌後、この菌体を抽出液
〔8%ショ糖、0.5%Triton X−100,
50mMEDTA (pH8,0) 、10mM T
r 1s−HCI (pH8,0))0.35m1に
再懸濁させた。次に、リゾチーム溶液25 /J 1
(10mg/ml、10mMTr i 5−HCl
(pH8,0) )を加え混合したのち、チューブを沸
騰水中に40秒問おいた。そして、直ちにチューブを4
℃にて遠心分離機(21゜000rpm、15分間)に
かけて上澄液を得、これにRNaSeA溶液(20mg
/mA、10t10、IE)0.5μlを加えて37℃
で1時間保温してRNAを分解させた。その後、フェノ
ール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱を10t10.IE 20μlに溶解させて、
プラスミドDNA1液を得た。
るクローンをL−ブロス2m7!中(Ap 20 ii
g/mz含有)で37℃、1晩振盪して、増殖させた
。培養液1.5 m lをエツペンドルフチューブにと
り、机上遠心分離機にかけて集菌後、この菌体を抽出液
〔8%ショ糖、0.5%Triton X−100,
50mMEDTA (pH8,0) 、10mM T
r 1s−HCI (pH8,0))0.35m1に
再懸濁させた。次に、リゾチーム溶液25 /J 1
(10mg/ml、10mMTr i 5−HCl
(pH8,0) )を加え混合したのち、チューブを沸
騰水中に40秒問おいた。そして、直ちにチューブを4
℃にて遠心分離機(21゜000rpm、15分間)に
かけて上澄液を得、これにRNaSeA溶液(20mg
/mA、10t10、IE)0.5μlを加えて37℃
で1時間保温してRNAを分解させた。その後、フェノ
ール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱を10t10.IE 20μlに溶解させて、
プラスミドDNA1液を得た。
(iv)プラスミドDNAの
そして、このプラスミドDNA溶液1μlまたは2tt
lを制限酵素Hindl[、Sa 1). pvU■、
PstIなどで消化したのち、0.4〜1.5%アガロ
ースゲル電気泳動C40mMTr i s。
lを制限酵素Hindl[、Sa 1). pvU■、
PstIなどで消化したのち、0.4〜1.5%アガロ
ースゲル電気泳動C40mMTr i s。
20mM酢酸ナトリウム、2mMEDTA (pH8,
15); l OmA、12〜24時間〕にかけた。
15); l OmA、12〜24時間〕にかけた。
分解されたDNA断片は臭化エチジウム染色と長波長紫
外線照明によって検出できる。このようにして、プラス
ミドDNAの制限地図を作成することによって、各クロ
ーンが持っているプラスミドDNAを特性化した。そし
て、pRH(−44)の13MmHI サイトとSa
t Iサイトの間のDNA断片(0,31Kbp)を
欠き、その場所にSal I リンカ−が挿入され
たプラスミド:pH3Cos (第4A図)を持つ大
腸菌を得た。
外線照明によって検出できる。このようにして、プラス
ミドDNAの制限地図を作成することによって、各クロ
ーンが持っているプラスミドDNAを特性化した。そし
て、pRH(−44)の13MmHI サイトとSa
t Iサイトの間のDNA断片(0,31Kbp)を
欠き、その場所にSal I リンカ−が挿入され
たプラスミド:pH3Cos (第4A図)を持つ大
腸菌を得た。
(V) 培養、 びプラスミドDNAの゛この大腸
菌を、TYG−P培地(1%Bact−otrypto
ne、0.1%酵母エキス、0.2%グルコース、0.
1% NH4Cl、093% NacI、0.01%N
a2SO4,0,08% MgCl2 ・6H20,1
,52% Na2 HPO4・12 H20,0,3%
KH2PO4)1)中(A920μg / m l含有
)で、37℃で振盪培養し、600 nmでの吸光度(
As o o )が1.0になった時点で、クロラムフ
ェニコールを100μg/mlの濃度になるように添加
し、さらに15時間37℃で振盪培養した。培養終了後
、遠心分離機(6,000rpm、10分間)にかけて
集菌を行ない、次に菌体を25%ショ糖、50mM
Tr i 5−HCl (pH8,0)からなる等張援
衝液18m1に再懸濁した。これに、リゾチーム溶液(
5mg/ml 0.25M Tris−HCI (
pH8,0))3.6mlを加え、おだやかに混合し、
0℃で5分間おいたのち、0.25MEDTA (pH
8,0>溶液7. ’l m lを加え、おだやかに混
合し、0℃で5分間おいた。その後、10%SO3溶液
2.7 m lと5MNaC1溶液8.1 m lとを
加えおだやかに混合し、0℃で一晩おいたのち、遠心分
離機(20,OOOrpm、45分間)にかけて粗溶菌
液(cleared 1ysate) 〜39 m
lを得た。この粗溶菌液に、RNa s eA温溶液
20 m g / m 1.10t10.IE)20μ
iを加えて37℃にで1時間保温してRNAを分解させ
たのち、フェノール抽出で除蛋白を行い、さらにセファ
ロース2Bのゲル口過にかけた。プラスミドDNAを含
むボイドフラクションから、DNAをエタノール沈澱と
して得、次にDNAを塩化セシウム−臭化エチジウム溶
液(IM Tris−HCI (pH8,0)0.
375mm!、0.25MEDTA (p H8,0)
0.30mJ、H2O6,45mf、CsC1)7,5
g、、EtBr溶液(4mg/mjり 0.375mj
り テ平衡密度勾配遠心(60,00Orpm、12時
間ンにかけた。そうすると、共有結合で閉鎖された環状
のプラスミドDNA (c c c−DNA)は、遠沈
管中で長波長紫外線照射下において、線状のプラスミド
DNA及び染色体のけい光帯の下にバンド状に見えてく
る。このccc−DNAのバンドを分画し、C5cl水
溶液で飽和したイソプロパツールで抽出を行って、臭化
エチジウムを取り除いた後、10t10.IE 16
に対して透析を行った。そして、透析内液から、c c
c−DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t
10.1E 2mlに熔解させてpH5cosのプラ
スミドDNA溶液を調製した。
菌を、TYG−P培地(1%Bact−otrypto
ne、0.1%酵母エキス、0.2%グルコース、0.
1% NH4Cl、093% NacI、0.01%N
a2SO4,0,08% MgCl2 ・6H20,1
,52% Na2 HPO4・12 H20,0,3%
KH2PO4)1)中(A920μg / m l含有
)で、37℃で振盪培養し、600 nmでの吸光度(
As o o )が1.0になった時点で、クロラムフ
ェニコールを100μg/mlの濃度になるように添加
し、さらに15時間37℃で振盪培養した。培養終了後
、遠心分離機(6,000rpm、10分間)にかけて
集菌を行ない、次に菌体を25%ショ糖、50mM
Tr i 5−HCl (pH8,0)からなる等張援
衝液18m1に再懸濁した。これに、リゾチーム溶液(
5mg/ml 0.25M Tris−HCI (
pH8,0))3.6mlを加え、おだやかに混合し、
0℃で5分間おいたのち、0.25MEDTA (pH
8,0>溶液7. ’l m lを加え、おだやかに混
合し、0℃で5分間おいた。その後、10%SO3溶液
2.7 m lと5MNaC1溶液8.1 m lとを
加えおだやかに混合し、0℃で一晩おいたのち、遠心分
離機(20,OOOrpm、45分間)にかけて粗溶菌
液(cleared 1ysate) 〜39 m
lを得た。この粗溶菌液に、RNa s eA温溶液
20 m g / m 1.10t10.IE)20μ
iを加えて37℃にで1時間保温してRNAを分解させ
たのち、フェノール抽出で除蛋白を行い、さらにセファ
ロース2Bのゲル口過にかけた。プラスミドDNAを含
むボイドフラクションから、DNAをエタノール沈澱と
して得、次にDNAを塩化セシウム−臭化エチジウム溶
液(IM Tris−HCI (pH8,0)0.
375mm!、0.25MEDTA (p H8,0)
0.30mJ、H2O6,45mf、CsC1)7,5
g、、EtBr溶液(4mg/mjり 0.375mj
り テ平衡密度勾配遠心(60,00Orpm、12時
間ンにかけた。そうすると、共有結合で閉鎖された環状
のプラスミドDNA (c c c−DNA)は、遠沈
管中で長波長紫外線照射下において、線状のプラスミド
DNA及び染色体のけい光帯の下にバンド状に見えてく
る。このccc−DNAのバンドを分画し、C5cl水
溶液で飽和したイソプロパツールで抽出を行って、臭化
エチジウムを取り除いた後、10t10.IE 16
に対して透析を行った。そして、透析内液から、c c
c−DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t
10.1E 2mlに熔解させてpH5cosのプラ
スミドDNA溶液を調製した。
(b) HB cosの び−pH3cos
10Mgを反応混液400μlで、185ユニツト
5allと37℃で2時間反応させて消化した。そして
、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を1ot10.IE’7μl(〜1μg
/μl)に溶解させた。
10Mgを反応混液400μlで、185ユニツト
5allと37℃で2時間反応させて消化した。そして
、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を1ot10.IE’7μl(〜1μg
/μl)に溶解させた。
次に、このSal’(で消化したDNA溶液1μl(〜
1μg)を、反応混液25μ!で、2ユニツトの1(l
enov酵素と22℃で30分間反応させて、cohe
sive endをbluntendに変えた。そし
て反応液を65°Cで10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。
1μg)を、反応混液25μ!で、2ユニツトの1(l
enov酵素と22℃で30分間反応させて、cohe
sive endをbluntendに変えた。そし
て反応液を65°Cで10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。
このDNA溶液10ul (0,4μg)と、BamH
Iリンカ−(d (pC−G−G−A−’T−C−C−
G))2μgとを、反応混液20μlで6ユニットのT
4−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結し
た。
Iリンカ−(d (pC−G−G−A−’T−C−C−
G))2μgとを、反応混液20μlで6ユニットのT
4−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結し
た。
そして、この反応液10μlを反応混液50μlで15
ユニ・ノドのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後、フェノール抽出を
行い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1
M T r i s −HC1(pH7゜5)溶液
20μEに溶解させた。
ユニ・ノドのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後、フェノール抽出を
行い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1
M T r i s −HC1(pH7゜5)溶液
20μEに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、ApYクローンを
得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を調べて、pH8cosの5ailサイトにB
amHIリンカ−を挿入させたプラスミド(この場合、
BamHIサイトの両側に5allサイトが再構成され
る):pHB cos (第、4A図)を持つ大腸
菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、ApYクローンを
得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を調べて、pH8cosの5ailサイトにB
amHIリンカ−を挿入させたプラスミド(この場合、
BamHIサイトの両側に5allサイトが再構成され
る):pHB cos (第、4A図)を持つ大腸
菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体より、c c c−DNAを分離精製して、pH
BcosのプラスミドDNAを調製した。
、菌体より、c c c−DNAを分離精製して、pH
BcosのプラスミドDNAを調製した。
(C) CHcosの び−
コスミドベクターであるpLH(+129)10μgを
反応混液100μ6 C30mM NaC1,100
mM Tr i 5−HCl (pH7,5)、5
mM MgCl2,1)00u/m1BSA)で、6
9ユニツトの制限酵素EcoRI (Takara社
製)と37℃で2時間反応させて消化した。そして、フ
ェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を10t10.IE 7μl (〜1μg/
μm)に溶解させた。
反応混液100μ6 C30mM NaC1,100
mM Tr i 5−HCl (pH7,5)、5
mM MgCl2,1)00u/m1BSA)で、6
9ユニツトの制限酵素EcoRI (Takara社
製)と37℃で2時間反応させて消化した。そして、フ
ェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を10t10.IE 7μl (〜1μg/
μm)に溶解させた。
次に、このEcoRIで消化したDNA溶液1μl(〜
1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのKle
nov酵素と22℃で30分間反応させて、cohes
ive endをblunt endに変えた。そ
して反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。
1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのKle
nov酵素と22℃で30分間反応させて、cohes
ive endをblunt endに変えた。そ
して反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。
次に、このDNA溶液10μl(0,4μg)と、C1
a Iリンカ−(d (pC−A−T−C−G−A−
T−G))2μgとを、反応混液20μlで6ユニツト
の74−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連
結した。
a Iリンカ−(d (pC−A−T−C−G−A−
T−G))2μgとを、反応混液20μlで6ユニツト
の74−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連
結した。
そして、この反応液10μlを、反応混液50μlで1
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr i 5−HCI (pH7,5’)溶液2
0μlに溶解させた。
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr i 5−HCI (pH7,5’)溶液2
0μlに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μβで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Aprクローンを
得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を關べて、pLH(+129)のEC0RI
サイトにC1aIリンカ−を挿入させたプラスミド(
この場合、C1aIサイトの両側にEc oRI サ
イトが再構成される。):pCHcos (第4A図)
を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Aprクローンを
得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を關べて、pLH(+129)のEC0RI
サイトにC1aIリンカ−を挿入させたプラスミド(
この場合、C1aIサイトの両側にEc oRI サ
イトが再構成される。):pCHcos (第4A図)
を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pCH
cosのプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pCH
cosのプラスミドDNAを調製した。
pH8os20.lJgを反応混液200μn (60
mM NaC1,7mM Tris−HCI (
pH7,4) 、7mM MgCl2.5mM D
TT、1)00u/ml BSA)で、1)4ユニツト
の制限酵素Hindl[I (New Englan
d Biolabs社製)及び192ユニツトのPv
ulr (Takara社製)と37℃で2時間反応さ
せて消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、cos及びAp?、oriを含むDNA
断片(2,5Kbp)を分離精製して、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t10.1E 8.5
μ!(〜lμg/μm)に溶解させた。
mM NaC1,7mM Tris−HCI (
pH7,4) 、7mM MgCl2.5mM D
TT、1)00u/ml BSA)で、1)4ユニツト
の制限酵素Hindl[I (New Englan
d Biolabs社製)及び192ユニツトのPv
ulr (Takara社製)と37℃で2時間反応さ
せて消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、cos及びAp?、oriを含むDNA
断片(2,5Kbp)を分離精製して、DNAをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を10t10.1E 8.5
μ!(〜lμg/μm)に溶解させた。
一方、pHBcos 20μgを反応混液200pH
で、1)4ニー1− ットの)(indlI[及び19
2ユニツトのPvuIIと37℃で2時間反応させて消
化したのち、0.8%聞製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、cosを含むDNA断片(1,6Kbp)を分
離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を
I Otlo、 l E6.Oμβ (〜1μg/μi
)に熔解させた。
で、1)4ニー1− ットの)(indlI[及び19
2ユニツトのPvuIIと37℃で2時間反応させて消
化したのち、0.8%聞製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、cosを含むDNA断片(1,6Kbp)を分
離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を
I Otlo、 l E6.Oμβ (〜1μg/μi
)に熔解させた。
そして、pCHcosのcos及びAp 5Oriを含
むHindI[/PvuI[断片のDNA溶液1μl(
〜1μg)と、pHBcosのcosを含むHindI
[/Pvull断片のDNA溶液1μm(〜lμg)と
を、反応混液20μlで6ユニツトの74−DNAリガ
ーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その
後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.1M Tris−MCI (p
H7,5)溶液20μlに溶解させた。
むHindI[/PvuI[断片のDNA溶液1μl(
〜1μg)と、pHBcosのcosを含むHindI
[/Pvull断片のDNA溶液1μm(〜lμg)と
を、反応混液20μlで6ユニツトの74−DNAリガ
ーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その
後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.1M Tris−MCI (p
H7,5)溶液20μlに溶解させた。
次に、このDNA溶液10pHで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Apvクローンを
得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を調べて、2個のcos及びAp’、oriを
有するプラスミド:pDcos (第4A図)を持つ
大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Apvクローンを
得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を調べて、2個のcos及びAp’、oriを
有するプラスミド:pDcos (第4A図)を持つ
大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1β中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpI)c
osのプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpI)c
osのプラスミドDNAを調製した。
(e) HC−79cm’″の び−コスミドベ
゛クターであるpHC−79CHohn&Co l 1
ins、Gene、土工、291 (1980))
10℃gを、反応混液100μi〔50mM NaC
1,6mM Tris−HCI(pH7,9) 、6
mM MgCl2.LOOpg/mll BSA)
で、15ユニツトの制限酵素C1al(Boehrin
ger Mannheim社製)と37℃で2時間反
応させて消化した。
゛クターであるpHC−79CHohn&Co l 1
ins、Gene、土工、291 (1980))
10℃gを、反応混液100μi〔50mM NaC
1,6mM Tris−HCI(pH7,9) 、6
mM MgCl2.LOOpg/mll BSA)
で、15ユニツトの制限酵素C1al(Boehrin
ger Mannheim社製)と37℃で2時間反
応させて消化した。
そして、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を1ot10.IE7μl (〜
lμg/μE)に溶解させた。
ル沈澱として得、沈澱を1ot10.IE7μl (〜
lμg/μE)に溶解させた。
一方、pNT−31)0℃gを反応混液200ttl
(100m!vj NaC1,10mM Tris−
HCI (pH8,4)、6mM MgCl2゜6
mM DTT、100μg/mIl BSA)で、4
0ユニツトの制限酵素TaqI (New Eng
land Biolabs社製)と65℃で2時間反
応させて消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、c m’を含むDNA断片(0,7
9Kbp)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を10t10.IE3.0μ2 (〜1μ
g/μgに溶解させた。
(100m!vj NaC1,10mM Tris−
HCI (pH8,4)、6mM MgCl2゜6
mM DTT、100μg/mIl BSA)で、4
0ユニツトの制限酵素TaqI (New Eng
land Biolabs社製)と65℃で2時間反
応させて消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、c m’を含むDNA断片(0,7
9Kbp)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を10t10.IE3.0μ2 (〜1μ
g/μgに溶解させた。
そして、pHC−79をC1aIで消化したDNA熔液
(I!IIC〜1pg)とpNT−31のCmYを含む
Taq−I断片のDNA溶液lμIl(〜1μg)とを
、反応混液20μlで6ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その後
、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱とし
て得、沈澱をOlIM Tris−HCI (pH
7,5)溶液20μlに溶解させた。
(I!IIC〜1pg)とpNT−31のCmYを含む
Taq−I断片のDNA溶液lμIl(〜1μg)とを
、反応混液20μlで6ユニツトのT4−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その後
、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱とし
て得、沈澱をOlIM Tris−HCI (pH
7,5)溶液20μlに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μ2で大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Cm かつApy
″クローンを得た。次いで、これらの゛クローンのもつ
プラスミドDNAの特性を調べて、pHC−79のC1
a Iサイトにcm”を挿入させたプラスミド:pHC
−T9/cmY (第4B図)を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Cm かつApy
″クローンを得た。次いで、これらの゛クローンのもつ
プラスミドDNAの特性を調べて、pHC−79のC1
a Iサイトにcm”を挿入させたプラスミド:pHC
−T9/cmY (第4B図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1)中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpHC−
79/crn”のプラスミドDNAt−1ll製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpHC−
79/crn”のプラスミドDNAt−1ll製した。
pHC−79/CmY″ 10μg反応混液10Qui
tで、35ユニツトのHindI[[と37℃で2時間
反応させて消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白
後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t1
0.1B 7μl(〜1μg/μl)に溶解させた。
tで、35ユニツトのHindI[[と37℃で2時間
反応させて消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白
後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t1
0.1B 7μl(〜1μg/μl)に溶解させた。
次に、このHindllで消化したDNA溶液1μl(
〜1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのKl
enow酵素と22℃で30分間反応させて、c、oh
esive endをblunt endに変えた
。そして反応液を65℃で10分間熱処理してKlen
ow酵素を失活させた。
〜1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのKl
enow酵素と22℃で30分間反応させて、c、oh
esive endをblunt endに変えた
。そして反応液を65℃で10分間熱処理してKlen
ow酵素を失活させた。
次に、このDNA溶液10μl(〜0.4μg)を、反
応混液50μlで15ユニツトの74−DNAリガーゼ
と12℃で17.5時間反応させて閉環化した。その後
フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1MTri 5−HCl (pH7゜
5)溶液20μlに熔解させた。
応混液50μlで15ユニツトの74−DNAリガーゼ
と12℃で17.5時間反応させて閉環化した。その後
フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1MTri 5−HCl (pH7゜
5)溶液20μlに熔解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Aprかつcm”
l”クローンを得た。そして、これらのクローンのもつ
プラスミドDNAの特性を調べて、pHC−79/cm
Yの)(indu[サイトを欠いたプラスミド:pHC
−79/Cm’″△(Htndlu)(第4B図)を持
つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Aprかつcm”
l”クローンを得た。そして、これらのクローンのもつ
プラスミドDNAの特性を調べて、pHC−79/cm
Yの)(indu[サイトを欠いたプラスミド:pHC
−79/Cm’″△(Htndlu)(第4B図)を持
つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pHC
−79/Cm″r′△(Hindl[[)のプラスミド
DNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pHC
−79/Cm″r′△(Hindl[[)のプラスミド
DNAを調製した。
(g)pUC−8/cmrの作成及び調製pHC−79
/cmY″へ(Hindl[)20μgを、反応混液2
00μ/ (50mM (NH4)2SO4,20mM
Tris−HCI (pH7゜5)、 10m
M MgCl2. 100μg/m!!BSA)で、
22ユニツトの制限酵素psむI (New Eng
land Biolabs社製)と37℃で2時間反
応させて完全に消化した。そして、さらに反応混液50
01)1で、80ユニツトのBamHIと37℃で2時
間反応させて完全に消化したのち、0.8%調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、Cm”を含むDNA断片
(1,9Kbp)を分離精製して、DNAをエタノール
沈澱として得、沈澱を10t10.IE 4.0μi
(〜lμl/μj2)に熔解させた。
/cmY″へ(Hindl[)20μgを、反応混液2
00μ/ (50mM (NH4)2SO4,20mM
Tris−HCI (pH7゜5)、 10m
M MgCl2. 100μg/m!!BSA)で、
22ユニツトの制限酵素psむI (New Eng
land Biolabs社製)と37℃で2時間反
応させて完全に消化した。そして、さらに反応混液50
01)1で、80ユニツトのBamHIと37℃で2時
間反応させて完全に消化したのち、0.8%調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、Cm”を含むDNA断片
(1,9Kbp)を分離精製して、DNAをエタノール
沈澱として得、沈澱を10t10.IE 4.0μi
(〜lμl/μj2)に熔解させた。
一方、pUC−8CJeffrey Vieira&
Joachim Messing、Gene、エエ、
259 (1982))20pgを、反応混液200μ
!で、60ユニツトのPStlと37℃で2時間反応さ
せて完全に消化した。そして、さらに反応混液500μ
!で215ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応
させて完全に消化したのち、0.8%調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて、Apr、oriを含むDNA断
片(2,7Kbp)を分離精製して、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱をtotlo、IE14.0μ!
(〜1μg/μl)に溶解させた。
Joachim Messing、Gene、エエ、
259 (1982))20pgを、反応混液200μ
!で、60ユニツトのPStlと37℃で2時間反応さ
せて完全に消化した。そして、さらに反応混液500μ
!で215ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応
させて完全に消化したのち、0.8%調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて、Apr、oriを含むDNA断
片(2,7Kbp)を分離精製して、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱をtotlo、IE14.0μ!
(〜1μg/μl)に溶解させた。
そして、pHC−79/cmr△(Hind■)のcm
’l”を含むPstl/BamHI断片のDNA溶液1
μl(〜1μg)と、pUC−8のApr、oriを含
むPstl/BamHI断片のDNA溶液1μm(〜l
μg)とを、反応混液20μlで6ユニツトのT4−D
NAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて連結し
た。その後、フェノール抽出をおこない、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−H
CI(p H7,5)溶液20μlに熔解させた。
’l”を含むPstl/BamHI断片のDNA溶液1
μl(〜1μg)と、pUC−8のApr、oriを含
むPstl/BamHI断片のDNA溶液1μm(〜l
μg)とを、反応混液20μlで6ユニツトのT4−D
NAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて連結し
た。その後、フェノール抽出をおこない、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−H
CI(p H7,5)溶液20μlに熔解させた。
次に、このDNA溶液10pHで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Cm?かつAp’
r″クローンを得た。次いで、これらのクローン、のも
つプラスミドDNAの特性を調べて、Ap’、ori及
びcm?’を有するプラスミド:pUC−8/cm’
(第4B図)を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Cm?かつAp’
r″クローンを得た。次いで、これらのクローン、のも
つプラスミドDNAの特性を調べて、Ap’、ori及
びcm?’を有するプラスミド:pUC−8/cm’
(第4B図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1)中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pUC
−8/cmjのプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pUC
−8/cmjのプラスミドDNAを調製した。
pUC−8/cmr 20μgを反応混液200μlで
、60ユニツトのEC0RIと37℃で30分間反応さ
せて限定消化した。次で、フェノール抽出で除蛋白後、
DNAをエタノール沈澱として得た。このDNA沈澱を
、反応混液200μlで35ユニツトのPSttと37
℃で2時間反応させて完全に消化した。そして、フェノ
ール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱をLotlo、IE 10μl (〜ll1g
/μE)に溶解させた。次に、このDNA溶液1,5μ
β(〜1.5μg)を、反応混液30μ!〔33mM
Tris−acetate (pH7,9)、66
mM酢酸カリ、10mM MgCl2.0.5mMD
TT、 100μg/m1BsAS 0.1mMdA
TP、O,1mM dCTP、0.1mM d
GTP、0.1mM dTTP)で、5ユニツトのT
4−DNAポリメラーゼ(P −L社製)と、37℃で
15分間反応させて、coheslve endをb
lunt endに変えたのち0.8%調製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、Apr。
、60ユニツトのEC0RIと37℃で30分間反応さ
せて限定消化した。次で、フェノール抽出で除蛋白後、
DNAをエタノール沈澱として得た。このDNA沈澱を
、反応混液200μlで35ユニツトのPSttと37
℃で2時間反応させて完全に消化した。そして、フェノ
ール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱をLotlo、IE 10μl (〜ll1g
/μE)に溶解させた。次に、このDNA溶液1,5μ
β(〜1.5μg)を、反応混液30μ!〔33mM
Tris−acetate (pH7,9)、66
mM酢酸カリ、10mM MgCl2.0.5mMD
TT、 100μg/m1BsAS 0.1mMdA
TP、O,1mM dCTP、0.1mM d
GTP、0.1mM dTTP)で、5ユニツトのT
4−DNAポリメラーゼ(P −L社製)と、37℃で
15分間反応させて、coheslve endをb
lunt endに変えたのち0.8%調製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、Apr。
ori及びCm”を含むDNA断片(3,85Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。
そして、このDNA沈澱を反応混液50μiで15ユニ
ツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反
応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M T
r i 5−HCl (pH7,5)溶液20μlに
溶解させた。
ツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反
応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M T
r i 5−HCl (pH7,5)溶液20μlに
溶解させた。
次に、このDNA溶液10μβで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Aprかつcmm
ヒフローン得た。そして、これらのクローンのもつプラ
スミドDNAの特性を調べて、pUC−8/cm/?の
EC0RIサイトとPstIサイトの間のDNA断片(
0,75Kbp)を欠いたプラスミド:pUC−8/c
mYΔ(EcoRI/PstI)(第4B図)を持つ大
腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Aprかつcmm
ヒフローン得た。そして、これらのクローンのもつプラ
スミドDNAの特性を調べて、pUC−8/cm/?の
EC0RIサイトとPstIサイトの間のDNA断片(
0,75Kbp)を欠いたプラスミド:pUC−8/c
mYΔ(EcoRI/PstI)(第4B図)を持つ大
腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地17!中で増殖さ
゛せたのち、菌体よりc c c−DNAを分離精製
して、(pUC−8/cml”Δ(EcoRI/Pst
I)のプラスミドDNAを調製した。
゛せたのち、菌体よりc c c−DNAを分離精製
して、(pUC−8/cml”Δ(EcoRI/Pst
I)のプラスミドDNAを調製した。
E) U C−8/ c mT″△CEcoRI/Ps
t I)10μgを反応混液100μ!で、150ユ
ニツトのBamHIと37℃、で2時間反応させて消化
した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、ONAをエ
タノール沈澱として得、沈澱を10t10゜IE 7
μl (〜lμg/μN)に熔解させた。
t I)10μgを反応混液100μ!で、150ユ
ニツトのBamHIと37℃、で2時間反応させて消化
した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、ONAをエ
タノール沈澱として得、沈澱を10t10゜IE 7
μl (〜lμg/μN)に熔解させた。
次に、このBamHIで消化したDNA溶液1μl(〜
1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのKle
nov酵素と22℃で300分間反応せて、cohes
ive endをblunt endに変えた。そ
して反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
#素を失活させた。
1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのKle
nov酵素と22℃で300分間反応せて、cohes
ive endをblunt endに変えた。そ
して反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
#素を失活させた。
そして、この反応液10μβを、反応混液50μlで1
5ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr 1s−HCI (pH7,5)f4液20
μlに溶解させた。
5ユニツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr 1s−HCI (pH7,5)f4液20
μlに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
’t4−rンスホーメーションしたのち、Ap かつc
m クローンを得た。そして、これらのクローンのも
つプラスミドDNAの特性を調べて、pUC−8/cm
?Δ(EcoRI/PstI)のBamHIサイトを欠
いたプラスミド:pUC−8/cm′rへ(EcoRI
/Ps t I)へ(BamHI)(第4B図)を持つ
大腸菌を得た。
’t4−rンスホーメーションしたのち、Ap かつc
m クローンを得た。そして、これらのクローンのも
つプラスミドDNAの特性を調べて、pUC−8/cm
?Δ(EcoRI/PstI)のBamHIサイトを欠
いたプラスミド:pUC−8/cm′rへ(EcoRI
/Ps t I)へ(BamHI)(第4B図)を持つ
大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1)中で増殖させたのち
、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pU C−
8/ c mrΔ(EcoRI/Pst1)Δ(Bam
HI)のプラスミドDNAを調製した。 ・ pUC−8/cml”へ(EcoRI/Ps t I)
へ(BamHI)10#gを反応混液100.cl(2
0mM KCI、6mM Tris−HCl(pH
8,0)、6mM MgCl2.6mM DTT、
100μg/m6 BSA)で、125ユニツトの制
限酵素Smaf (New England B
iolabs社製)と37℃で完全に消化した(blu
nt end>、そして、フェノール抽出で除蛋白後
、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t10
.IE 7μm (〜1μg/μl)に溶解させた。
、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pU C−
8/ c mrΔ(EcoRI/Pst1)Δ(Bam
HI)のプラスミドDNAを調製した。 ・ pUC−8/cml”へ(EcoRI/Ps t I)
へ(BamHI)10#gを反応混液100.cl(2
0mM KCI、6mM Tris−HCl(pH
8,0)、6mM MgCl2.6mM DTT、
100μg/m6 BSA)で、125ユニツトの制
限酵素Smaf (New England B
iolabs社製)と37℃で完全に消化した(blu
nt end>、そして、フェノール抽出で除蛋白後
、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t10
.IE 7μm (〜1μg/μl)に溶解させた。
次に、このDNA溶液0.4μl(〜0.4μg)と、
Hindllrリンカ−Cd (+)C−A−A−G
−C−T−T−G))2μgとを、反応混液20μlで
6ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃で6時間反
応させて連結した。
Hindllrリンカ−Cd (+)C−A−A−G
−C−T−T−G))2μgとを、反応混液20μlで
6ユニツトのT4−DNAリガーゼと22℃で6時間反
応させて連結した。
そして、この反応液10μlを、反応混液50μlで1
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tris−HCI (pH7,5’)溶液20μ
lに溶解させた。
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tris−HCI (pH7,5’)溶液20μ
lに溶解させた。
次に、このDNA溶液10ttlで大腸菌(HBlol
)をトラスホーメーションしたのち、A I)Y’かつ
cmrクローンを得た。そして、これらのクローンのも
つプラスl”DNAの特性を調べて、pUC−8/cm
?△(EcoRI/Pst 1)Δ(BamHI)の
Sma IサイトにHind■リンカ−を挿入させたプ
ラスミド:pUC−13/ c mY’Δ(Eco
RI/Pst I)Δ(BamHI)/Hindll
r (第4A[ffl及び第4Blffl)を持つ大腸
菌を得た。
)をトラスホーメーションしたのち、A I)Y’かつ
cmrクローンを得た。そして、これらのクローンのも
つプラスl”DNAの特性を調べて、pUC−8/cm
?△(EcoRI/Pst 1)Δ(BamHI)の
Sma IサイトにHind■リンカ−を挿入させたプ
ラスミド:pUC−13/ c mY’Δ(Eco
RI/Pst I)Δ(BamHI)/Hindll
r (第4A[ffl及び第4Blffl)を持つ大腸
菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pUC
−8/cmrΔ(EcoRI/Pst■)Δ(BamH
I)/Hi ndnIのプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pUC
−8/cmrΔ(EcoRI/Pst■)Δ(BamH
I)/Hi ndnIのプラスミドDNAを調製した。
(k)pDc o s cmr び“ 1PDc
os IQμgを反応混液100μ!で、60ユニツ
トのHindI[[と37℃で2時間反応させて消化し
た。そして、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を10t10.lE 7μ
l(〜1μg/μm)に溶解させた。
os IQμgを反応混液100μ!で、60ユニツ
トのHindI[[と37℃で2時間反応させて消化し
た。そして、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を10t10.lE 7μ
l(〜1μg/μm)に溶解させた。
一方、pUC−13/cmY″Δ(EcoRI/Pst
[)Δ(BamHr)/Hindl[[2(lμg
を反応混液200μlで、250ユニツトのHi nd
I[[と37℃で2時間反応させて完全に消化したのち
、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、c
mY’を含むDNA断片(1,15Kbp)を分離精製
して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10
tlo、IE 4.0ttl (〜1μg/μl)に
溶解させた。
[)Δ(BamHr)/Hindl[[2(lμg
を反応混液200μlで、250ユニツトのHi nd
I[[と37℃で2時間反応させて完全に消化したのち
、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、c
mY’を含むDNA断片(1,15Kbp)を分離精製
して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10
tlo、IE 4.0ttl (〜1μg/μl)に
溶解させた。
そして、pDcosをHindlllで消化したDNA
溶液lμl(〜1.pg)と、pUC−8/Cm Δ(
EcoRI/Ps t I)Δ(BamHI)/Hin
dII[のcm’を含む)(indnI断片のDNA溶
液lμl(〜lμg)とを、反応混液20μlで6ユニ
ツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反
応させて連結した。その後、フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M T
r i 5−HCl (pH7,5)溶液20μlに
溶解させた。
溶液lμl(〜1.pg)と、pUC−8/Cm Δ(
EcoRI/Ps t I)Δ(BamHI)/Hin
dII[のcm’を含む)(indnI断片のDNA溶
液lμl(〜lμg)とを、反応混液20μlで6ユニ
ツトのT4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反
応させて連結した。その後、フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M T
r i 5−HCl (pH7,5)溶液20μlに
溶解させた。
次に、このDNA溶液10μ2で大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、AprかつcmY
’クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドDNAの特性を関ぺで、2個のcos及び、A
pr、art、cm、’を有するプラスミド:pDco
s/cmy′ (第4A図)を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、AprかつcmY
’クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドDNAの特性を関ぺで、2個のcos及び、A
pr、art、cm、’を有するプラスミド:pDco
s/cmy′ (第4A図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1)中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pDc
os/crHY′のプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pDc
os/crHY′のプラスミドDNAを調製した。
(1) HCcosの び−
pRH(−44)10μkを反応混液100μlで、2
3ユニツトのPvullと37℃で2時間反応させて完
全に消化したのち、さらに反応混液250μfで、70
ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応させて完全
に消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳
動にかけて、c。
3ユニツトのPvullと37℃で2時間反応させて完
全に消化したのち、さらに反応混液250μfで、70
ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応させて完全
に消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳
動にかけて、c。
S及びAp?、oriを含むDNA断片(2,48Kb
p)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱トシテ得
、沈澱を10t10.IE 4.0tt1 (〜1μ
g/μm)に溶解させた。
p)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱トシテ得
、沈澱を10t10.IE 4.0tt1 (〜1μ
g/μm)に溶解させた。
次に、このD N、A溶液1μm(〜1μg)を、反応
混液25μlで、2ユニツトのKlenov酵素と22
℃で30分間反応させて、cohesive end
をblunt endに変えた。
混液25μlで、2ユニツトのKlenov酵素と22
℃で30分間反応させて、cohesive end
をblunt endに変えた。
そして反応液を65℃で10分間熱処理してKleno
w酵素を失活させた。
w酵素を失活させた。
このDNA熔液LOp1(0,4μg)と、c1alリ
ンカ−(d (pC−A−T−C−G−A−T−G))
2μgとを、反応混液20μlで6ユニツトの74−D
NAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結した。
ンカ−(d (pC−A−T−C−G−A−T−G))
2μgとを、反応混液20μlで6ユニツトの74−D
NAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結した。
そして、この反応液10μβを、反応混液50μlで1
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tris−HCI (pH7,5)溶液20μβ
に溶解させた。
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tris−HCI (pH7,5)溶液20μβ
に溶解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、ApY クローン
を得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドD
NAの特性を調べてpRH(−44)のpvulサイト
とBamHIサイトの間のDNA断片(1,72Kbp
)を欠き、その場所にC1aIリンカ−が挿入されたプ
ラスミド:pHCcos (第4C図)を持つ大腸菌
を得た。
をトランスホーメーションしたのち、ApY クローン
を得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドD
NAの特性を調べてpRH(−44)のpvulサイト
とBamHIサイトの間のDNA断片(1,72Kbp
)を欠き、その場所にC1aIリンカ−が挿入されたプ
ラスミド:pHCcos (第4C図)を持つ大腸菌
を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pHC
COSのプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pHC
COSのプラスミドDNAを調製した。
(m)pB IIICcosの びpHccos
lOμgを反応混液100μlで、100ユニツトのH
indnIと37℃で2時間反応させて消化した。そし
て、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を10t10.1E 7μ!(〜1
μg/μl)に熔解させた。
lOμgを反応混液100μlで、100ユニツトのH
indnIと37℃で2時間反応させて消化した。そし
て、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱を10t10.1E 7μ!(〜1
μg/μl)に熔解させた。
次にこの)(indll[で消化したDNA溶液1μl
(〜1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのK
lenow酵素と22℃で30分間反応させて、coh
esive endをbluntendに変えた。そ
して反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。
(〜1μg)を、反応混液25μlで、2ユニツトのK
lenow酵素と22℃で30分間反応させて、coh
esive endをbluntendに変えた。そ
して反応液を65℃で10分間熱処理してKlenow
酵素を失活させた。
このDNA溶液10μl(0,4μg)と、8g1■リ
ンカ−(d (p C−A−G−A−T−C−T−G
)32℃gとを、反応混液20μlで6ユニツトのT4
−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結した
。
ンカ−(d (p C−A−G−A−T−C−T−G
)32℃gとを、反応混液20μlで6ユニツトのT4
−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結した
。
そして、この反応液10μEを、反応混液50μβで1
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr i 5−HCI (pH7,5)溶液20
μlに溶解させた。次に、このDNA溶液10IIJで
大腸菌(HBIOI)をトランスホーメーションしたの
ち、Aprクローンを得た。そして、これらのクローン
のもつプラスミドDNAの特性を調べて、pHccos
のHindI[[サイトにBglI[リンカ−を挿入さ
せたプラスミド:pBglIICcos (第4C図)
を持つ大腸菌を得た。
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr i 5−HCI (pH7,5)溶液20
μlに溶解させた。次に、このDNA溶液10IIJで
大腸菌(HBIOI)をトランスホーメーションしたの
ち、Aprクローンを得た。そして、これらのクローン
のもつプラスミドDNAの特性を調べて、pHccos
のHindI[[サイトにBglI[リンカ−を挿入さ
せたプラスミド:pBglIICcos (第4C図)
を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1)で増殖させたのち、
菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pBgl
IICcosのプラスミドDNAを調製した。
菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pBgl
IICcosのプラスミドDNAを調製した。
■
pBR−3271’Oμgを反応混液100μ(1(6
0mM NaC1,6mM Tris−HCl
(pH8,0) 、10mM MgCl2.6mM
DTT、100μg/mj! BSA)で、55ユ
ニツトの制限酵素Ava lと37℃で2時間反応させ
て消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱を10t10.1B
7μl (〜1μg/μl)に熔解させた。
0mM NaC1,6mM Tris−HCl
(pH8,0) 、10mM MgCl2.6mM
DTT、100μg/mj! BSA)で、55ユ
ニツトの制限酵素Ava lと37℃で2時間反応させ
て消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱を10t10.1B
7μl (〜1μg/μl)に熔解させた。
次に、このAvalで消化したDN−A溶液1μm(〜
1μg)を、反応混液25μ!で、2ユニツトのKle
now酵素と22℃で30分間反応させて、cohes
ive endをbluntendに変えた。そして
反応液を65℃で10分間熱処理してKleno’w酵
素を失活させた。
1μg)を、反応混液25μ!で、2ユニツトのKle
now酵素と22℃で30分間反応させて、cohes
ive endをbluntendに変えた。そして
反応液を65℃で10分間熱処理してKleno’w酵
素を失活させた。
このDNA溶液101!(0,4μg)と、BamHI
リンカ−(d <pC−G−G−A−T−C−C−G
))2μgとを、反応混液20μlで6ユニツトの74
−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結した
。その後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール
沈澱として得た。
リンカ−(d <pC−G−G−A−T−C−C−G
))2μgとを、反応混液20μlで6ユニツトの74
−DNAリガーゼと22℃で6時間反応させて連結した
。その後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール
沈澱として得た。
このDNA沈澱を、反応混液600μlで1000ユニ
ツトのBamHIと37℃で4時間反応させて消化した
のち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて
、Ap(、oriを含むDNA断片(2,22Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。
ツトのBamHIと37℃で4時間反応させて消化した
のち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて
、Ap(、oriを含むDNA断片(2,22Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。
このDNA沈澱を反応混液20μlで、6ユニツトの7
4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて
閉環化したのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−H
CI (pH7,5)溶液20μlに溶解させた。
4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて
閉環化したのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Tris−H
CI (pH7,5)溶液20μlに溶解させた。
そして、このDNA溶液10μlで大腸菌(HB 1
01)をトランスホーメーションしたのち、Aprクロ
ーンを得た。次で、これらのクローンのもつプラスミド
DNAの特性を調べて、pBR−327のBamHIサ
イトとAvaIサイトの間のDNA断片(1,05Kb
p)を欠き、その場所にBamHIリンカ−を挿入させ
たプラスミド:pBR−3278amHI (第4C
図)を持つ大腸菌を得た。
01)をトランスホーメーションしたのち、Aprクロ
ーンを得た。次で、これらのクローンのもつプラスミド
DNAの特性を調べて、pBR−327のBamHIサ
イトとAvaIサイトの間のDNA断片(1,05Kb
p)を欠き、その場所にBamHIリンカ−を挿入させ
たプラスミド:pBR−3278amHI (第4C
図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpBR−
3278amHI のプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpBR−
3278amHI のプラスミドDNAを調製した。
pBglI[ccos20μgを反応混液200μ!で
、65ユニツトのPstlと37℃で2時間反応させて
完全に消化したのち、さらに反応混液500μj2で7
7ユニツトのC1alと37℃で2時間反応させて完全
に消化したの・ち、0.8%調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、cosを含むDNA断片(0,94Kb
p)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱を10t10.IE 5.0μβ (〜lμg
/μIt)に溶解させた。
、65ユニツトのPstlと37℃で2時間反応させて
完全に消化したのち、さらに反応混液500μj2で7
7ユニツトのC1alと37℃で2時間反応させて完全
に消化したの・ち、0.8%調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、cosを含むDNA断片(0,94Kb
p)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱を10t10.IE 5.0μβ (〜lμg
/μIt)に溶解させた。
一方、pBR−327BamHI 20.lJgを反
応混液200μlで、70ユニツトのPstlと37℃
で2時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応混
液500μβで85ユニツトのC1aIと37℃で2時
間反応させて完全に消化したのち、0.8%調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、oriを含むDNA断片
(1,45Kbp)を分離精製して、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を10t10.IE 9.0μ
l(〜1μg/μl)に溶解させた。
応混液200μlで、70ユニツトのPstlと37℃
で2時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応混
液500μβで85ユニツトのC1aIと37℃で2時
間反応させて完全に消化したのち、0.8%調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、oriを含むDNA断片
(1,45Kbp)を分離精製して、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を10t10.IE 9.0μ
l(〜1μg/μl)に溶解させた。
そして、pBglIIccosのcosを含むPstI
/C1aI断片のDNA溶液1all(〜4μg)と、
pBR−327BamHI のoriを含むPstI
/C1aI断片のDNA溶液1μm(〜1μg)とを、
反応混液20μlで6ユニツトの74−DNAリガーゼ
と12℃で17.5時間反応させて連結した。その後、
フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1M Tr 1s−HCI (pH
7,5)溶液20μβに溶解させた。
/C1aI断片のDNA溶液1all(〜4μg)と、
pBR−327BamHI のoriを含むPstI
/C1aI断片のDNA溶液1μm(〜1μg)とを、
反応混液20μlで6ユニツトの74−DNAリガーゼ
と12℃で17.5時間反応させて連結した。その後、
フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱として
得、沈澱を0.1M Tr 1s−HCI (pH
7,5)溶液20μβに溶解させた。
次に、このDNAf4液10μlで大腸菌(HBlol
)をトランスホーメーションしたのち、Ap?クローン
を得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を調べて、cos及び、Apr、oriを有す
るプラスミド:pBR−327/BglI[Ccos
(第4A図及び第4C図)を持つ大腸菌を得た。
)をトランスホーメーションしたのち、Ap?クローン
を得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミドDN
Aの特性を調べて、cos及び、Apr、oriを有す
るプラスミド:pBR−327/BglI[Ccos
(第4A図及び第4C図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpBR−
327/Bg I UCc o sのプラスミドDNA
を調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpBR−
327/Bg I UCc o sのプラスミドDNA
を調製した。
p p c o s / c m? 201) gを反
応混液200μlで、37ユニツトのC1alと37℃
で2時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応混
液500.crJで、1)0ニー’−ソトのBamHI
と37℃で2時間反応させて完全に消化したのち、0.
8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、2個のc
os及びCff1’を含むDNA断片(1,5Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈
澱を10t10.IE 4.0μl (〜1μg/μ
m)に溶解させた。
応混液200μlで、37ユニツトのC1alと37℃
で2時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応混
液500.crJで、1)0ニー’−ソトのBamHI
と37℃で2時間反応させて完全に消化したのち、0.
8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、2個のc
os及びCff1’を含むDNA断片(1,5Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈
澱を10t10.IE 4.0μl (〜1μg/μ
m)に溶解させた。
一方、pBR−327/BglIICcos20μgを
反応混液200μβで、80ユニツトのC1alと37
℃で2時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応
混液500μ!で、240ユニットのBamHIと37
°Cで2時間反応させて完全に消化したのち、0.8%
調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、cos及びA
p’、oriを合むDNAI#i片(2゜0Kbp)を
分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱
を10t10、]、E 12μl (〜1μg/μl
)に溶解させた。
反応混液200μβで、80ユニツトのC1alと37
℃で2時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応
混液500μ!で、240ユニットのBamHIと37
°Cで2時間反応させて完全に消化したのち、0.8%
調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、cos及びA
p’、oriを合むDNAI#i片(2゜0Kbp)を
分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱
を10t10、]、E 12μl (〜1μg/μl
)に溶解させた。
そして、pDcos/cmrの2個のcos及びcmγ
を含むC1al/BamHI断片のDNA溶液1μl(
〜1μg)と、pBR−327/BglllCcosの
cosおよびApY、oriを含むC1al/BamH
I断片のDNA溶液1μ!(〜1μg)とを、反応混液
20μ2で6ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃
で17.5時間反応させて連結した。その後、フェノー
ル抽出を行い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱
を0.IM Tris−HCI (pH7,5)溶
液20μlに溶解させた。
を含むC1al/BamHI断片のDNA溶液1μl(
〜1μg)と、pBR−327/BglllCcosの
cosおよびApY、oriを含むC1al/BamH
I断片のDNA溶液1μ!(〜1μg)とを、反応混液
20μ2で6ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃
で17.5時間反応させて連結した。その後、フェノー
ル抽出を行い、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱
を0.IM Tris−HCI (pH7,5)溶
液20μlに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、ApY、cmYク
ローンを得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミ
ドDNAの特性を調べて、3個のcos及びApY 、
o r i、 Cmy″を有するプラスミド:
p T c o s A p? / o r i /
cmV (第4A図)を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、ApY、cmYク
ローンを得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミ
ドDNAの特性を調べて、3個のcos及びApY 、
o r i、 Cmy″を有するプラスミド:
p T c o s A p? / o r i /
cmV (第4A図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地IIl中で増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpTcos
Apr 10r i/cmrプラスミドDNAを調製し
た。
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製してpTcos
Apr 10r i/cmrプラスミドDNAを調製し
た。
(q) 5VOIOneo の およびpA
o 43 (Oka、Sugisaki&Takan
ami、J、Mol、Biol、147゜214 (1
981))20μgを反応混液200pl C60mM
NaC1,6mM Tris −HCl (p
H8,0)、10mM MgCl2.6mM DT
T、1)00u/mi! BSA)で、150ユニツ
トの制限酵素AVall (New England
Biolabs社製)と37℃で2時間反応させて
消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、neσとを含むDNA断片(1,24Kbl
))を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱を10t10、IE5μN(〜l1)g/μl)
に溶解させた。
o 43 (Oka、Sugisaki&Takan
ami、J、Mol、Biol、147゜214 (1
981))20μgを反応混液200pl C60mM
NaC1,6mM Tris −HCl (p
H8,0)、10mM MgCl2.6mM DT
T、1)00u/mi! BSA)で、150ユニツ
トの制限酵素AVall (New England
Biolabs社製)と37℃で2時間反応させて
消化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、neσとを含むDNA断片(1,24Kbl
))を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得
、沈澱を10t10、IE5μN(〜l1)g/μl)
に溶解させた。
このDNA溶液2μl(〜2μg)を、反応混液50μ
lで、4ユニツトのKlenow酵素と22℃で30分
間反応させて、co、hesivaendをblunt
endに変えた。そして、フェノール抽出で除蛋白
後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱をxotl
o、lE 1.5pl(〜1μg/μl)に溶解させ
た。
lで、4ユニツトのKlenow酵素と22℃で30分
間反応させて、co、hesivaendをblunt
endに変えた。そして、フェノール抽出で除蛋白
後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱をxotl
o、lE 1.5pl(〜1μg/μl)に溶解させ
た。
一方、psVOlo(yCVX(Brain 5ee
d、Nucleic Ac1ds Res、。
d、Nucleic Ac1ds Res、。
土工、2427 (1983))由来のポリリンカー
を持ったpsVOl (Tjan、R,et al、
Proc、Natl、Acad、Sci、U。
を持ったpsVOl (Tjan、R,et al、
Proc、Natl、Acad、Sci、U。
S、A、、エエ、6491 (1980))の類縁プ
ラスミド) 10μgを、反応混液100μlで129
ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応させて消化
したのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール
沈澱として得、沈澱を10t10.1E7μm(〜IM
g/μl)に溶解させた。
ラスミド) 10μgを、反応混液100μlで129
ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応させて消化
したのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール
沈澱として得、沈澱を10t10.1E7μm(〜IM
g/μl)に溶解させた。
このDNA溶液2μl(〜2μg)を、反応混液50μ
!で、4ユニツトの)(lenqw酵素と22℃で30
分間反応させて、cohes 1veend−’5−b
lunt endに変えた。そして、フェノール抽出
で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を
10t10.1E 1.5μ!(〜1μg/μl)に
溶解させた。
!で、4ユニツトの)(lenqw酵素と22℃で30
分間反応させて、cohes 1veend−’5−b
lunt endに変えた。そして、フェノール抽出
で除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を
10t10.1E 1.5μ!(〜1μg/μl)に
溶解させた。
次に、pAO43のn e O?を含むDNA断片をに
1enow酵素で処理したDNA溶液1μl(〜1μg
)と、psVo 10をBamHIで消化し、l(le
now酵素で処理したDNA溶液1μl(〜1μg)と
を、反応液20μlで6ユニツトの74−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その後
、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱とし
て得、その沈澱を0.1M Tr i 5−HCI
(pH7,5)溶液20μlに熔解させた。
1enow酵素で処理したDNA溶液1μl(〜1μg
)と、psVo 10をBamHIで消化し、l(le
now酵素で処理したDNA溶液1μl(〜1μg)と
を、反応液20μlで6ユニツトの74−DNAリガー
ゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その後
、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱とし
て得、その沈澱を0.1M Tr i 5−HCI
(pH7,5)溶液20μlに熔解させた。
そして、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBIOI
)をトランスホーメーションしたのち、AprかつKm
r(n e or )クローンを得た。
)をトランスホーメーションしたのち、AprかつKm
r(n e or )クローンを得た。
次いでこれらのクローンのもつプラスミドDNAの特性
を調べてpsVo 10のt3amHIサイトにn e
orを挿入させたプラスミド:pSVO10/neo
r (第4A図)を持つ大腸菌を得た。
を調べてpsVo 10のt3amHIサイトにn e
orを挿入させたプラスミド:pSVO10/neo
r (第4A図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1)中で、増殖させたの
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pSVO
IO/neorのプラスミドDNAを調製した。
ち、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pSVO
IO/neorのプラスミドDNAを調製した。
pTcos Apr 10ri/cmr IQμgを
反応混液100μ!で、27ユニツトのEc。
反応混液100μ!で、27ユニツトのEc。
RIと37℃で30分間反応させて限定消化した。そし
て、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈
澱として得1.沈澱を10t10゜IE 7μl (
〜1μg/μm)に溶解させた。
て、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノール沈
澱として得1.沈澱を10t10゜IE 7μl (
〜1μg/μm)に溶解させた。
一方、E)SVO10/neor 20℃gを反応混液
200μlで、325ユニツトのEc oR1と37℃
で2時間反応させて完全に消化したのち、0.8%調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、n e oyを含
むDNA断片(1,3Kbp)を分離精製して、DNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を10t10゜IE
5゜0μIl(〜1μg/μl)に溶解させた。
200μlで、325ユニツトのEc oR1と37℃
で2時間反応させて完全に消化したのち、0.8%調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、n e oyを含
むDNA断片(1,3Kbp)を分離精製して、DNA
をエタノール沈澱として得、沈澱を10t10゜IE
5゜0μIl(〜1μg/μl)に溶解させた。
そして、pTcosApl’ 10ri/cmrをEc
o R1で限定消化したDNA溶液1pl(〜Lcr
g)と、pSVOIO/neo)′のn e Orを含
むEC0RI断片のDNA溶液lμl (〜1μg)と
を、反応混液20μlで6ユニソトのT4−DNAリガ
ーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その
後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.IMTris−HCI (pH7
,5)溶液20plに溶解させた。
o R1で限定消化したDNA溶液1pl(〜Lcr
g)と、pSVOIO/neo)′のn e Orを含
むEC0RI断片のDNA溶液lμl (〜1μg)と
を、反応混液20μlで6ユニソトのT4−DNAリガ
ーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。その
後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈澱と
して得、沈澱を0.IMTris−HCI (pH7
,5)溶液20plに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Apr、cmrか
つKmY” (neoY’)クローンを得た。次いで
これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を関ぺ
て、pTc o 5ApY 10 ri/cmT’のE
CORI サイトにn e o7’が挿入されたプラ
スミド: pTc o sAp” 10 r i/ c
mγ/neor(第1図、第4A図)を持つ大腸菌を
得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微工研菌第P7888(FERMP−7888)
Jとして寄託されている。
をトランスホーメーションしたのち、Apr、cmrか
つKmY” (neoY’)クローンを得た。次いで
これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を関ぺ
て、pTc o 5ApY 10 ri/cmT’のE
CORI サイトにn e o7’が挿入されたプラ
スミド: pTc o sAp” 10 r i/ c
mγ/neor(第1図、第4A図)を持つ大腸菌を
得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微工研菌第P7888(FERMP−7888)
Jとして寄託されている。
この大腸菌を、TYG−P培地1)中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpTco
sApr10ri/cm’/neoTのプラスミドDN
Aを調製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製してpTco
sApr10ri/cm’/neoTのプラスミドDN
Aを調製した。
実施例2.9工上土土人ア二Z上り上/TKl且pTK
−4(Ishiura、M、、etal。
−4(Ishiura、M、、etal。
Mo1.Ce1l Biol、2,607 (19
82))10℃gを反応混液100μ2で、3.0ユニ
ツトのPvuIrと37℃で30分間反応させて限定消
化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、6.43 K b pの長さのDNA断片を分
離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を
10t10.1E 3μl(〜1μg/μl)に溶解
させた。
82))10℃gを反応混液100μ2で、3.0ユニ
ツトのPvuIrと37℃で30分間反応させて限定消
化したのち、0.8%調製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、6.43 K b pの長さのDNA断片を分
離精製して、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を
10t10.1E 3μl(〜1μg/μl)に溶解
させた。
次に、このDNA溶液0.4μl (〜0.4μg)と
、13amHIリンカー(d ([)C−G−G−A
−T−C−C−G))2μgとを、反応混液20μlで
6ユニツトの74−DNAリガーゼと22℃で6時間反
応させて連結した。
、13amHIリンカー(d ([)C−G−G−A
−T−C−C−G))2μgとを、反応混液20μlで
6ユニツトの74−DNAリガーゼと22℃で6時間反
応させて連結した。
そして、この反応液10μlを、反応混液50μiで1
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈′澱を0.1
M Tr i 5−HC1(pH7,5)溶液20μ
Eに溶解させた。
5ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、DNAをエタノール沈澱として得、沈′澱を0.1
M Tr i 5−HC1(pH7,5)溶液20μ
Eに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μlで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Apr かつTc
″クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドDNAの特性を調べて、pTK−4のoriI
!:TKとの間のPvuIIサイトに13amHTリン
カーを挿入させたプラスミド:pTK−4/BamHI
(第5図)を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Apr かつTc
″クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドDNAの特性を調べて、pTK−4のoriI
!:TKとの間のPvuIIサイトに13amHTリン
カーを挿入させたプラスミド:pTK−4/BamHI
(第5図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pTK−4
/BamHIのプラスミドDNAを調製した。
、菌体よりccc−DNAを分離精製して、pTK−4
/BamHIのプラスミドDNAを調製した。
pTK−4/BamHI 10μgを反応混液100
μ#で9ユニツトのBamHIと37°Cで30分間反
応させて限定消化したのち、フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得た。
μ#で9ユニツトのBamHIと37°Cで30分間反
応させて限定消化したのち、フェノール抽出を行い、D
NAをエタノール沈澱として得た。
このエタノール沈澱を反応混液100μEで15ユニツ
トのPvu■と37℃で2時間反応させて完全に消化し
たのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱をLotlo、1.E 3μl(〜
1μg/μIl)に溶解させた。
トのPvu■と37℃で2時間反応させて完全に消化し
たのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱をLotlo、1.E 3μl(〜
1μg/μIl)に溶解させた。
次に、このBamHIで限定消化し、さらにPvuff
で消化したDNA溶液Lpl (〜lμg)を、反応混
液25μlで2ユニツトのKlen。
で消化したDNA溶液Lpl (〜lμg)を、反応混
液25μlで2ユニツトのKlen。
W酵素と22℃で30分間反応させて、cohesiv
e endをblunt endに変えたのち、0
.8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、art
及びApr、TKを含むDNA断片(4,67Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。
e endをblunt endに変えたのち、0
.8%調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、art
及びApr、TKを含むDNA断片(4,67Kbp)
を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た。
このDNA沈澱を反応混液20μlで6ユニツトの74
−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉
環化したのち(この場合、BamHIサイトが再構成さ
れる)、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱をOlLM Tr 1s−HCI
(pH7,5)溶液20μlに溶解させた。
−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて閉
環化したのち(この場合、BamHIサイトが再構成さ
れる)、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱をOlLM Tr 1s−HCI
(pH7,5)溶液20μlに溶解させた。
そして、このDNA溶液10ttlで、大腸菌(HB
101)をトランスホーメーションしたのち、71、p
V″かつTc クローンを得た。次いでこれらのクロ
ーンのもつプラスミドDNAの特性を調べて、pTK−
4/BamHIのPvullサイトとBamHIサイト
(TCY上)の間のDNA断片(1,76Kbp)を欠
いたプラスミド:pTK−4/BamHI/BamHI
(第5図)を持つ大腸菌を得た。
101)をトランスホーメーションしたのち、71、p
V″かつTc クローンを得た。次いでこれらのクロ
ーンのもつプラスミドDNAの特性を調べて、pTK−
4/BamHIのPvullサイトとBamHIサイト
(TCY上)の間のDNA断片(1,76Kbp)を欠
いたプラスミド:pTK−4/BamHI/BamHI
(第5図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1β中で増殖させたのち
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pTK
−4/BamHI/BamHIのプラスミドDNAを調
製した。
、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pTK
−4/BamHI/BamHIのプラスミドDNAを調
製した。
pTcosApr 10r i/am?”/neor1
0μgを反応混液100μlで60ユニツトのBamH
Iと37℃で2時間反応さセて消化した。
0μgを反応混液100μlで60ユニツトのBamH
Iと37℃で2時間反応さセて消化した。
そして、フェノール抽出で除蛋白後、DNAをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を10t10.IE7μm (〜
1μg/μm)に溶解させた。 一方、pTK−4/B
amHI/BamHI 20.ljgを反応混液20
0μlで240ユニツトのBamHIと37℃で2時間
反応させて完全に消化したのち、0.8%鋼製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、TKを含むDNA断片(2
,0Kbp)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10 tlo、I E6.OμE(〜
工μg/μl)に溶解させた。
ル沈澱として得、沈澱を10t10.IE7μm (〜
1μg/μm)に溶解させた。 一方、pTK−4/B
amHI/BamHI 20.ljgを反応混液20
0μlで240ユニツトのBamHIと37℃で2時間
反応させて完全に消化したのち、0.8%鋼製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、TKを含むDNA断片(2
,0Kbp)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱
として得、沈澱を10 tlo、I E6.OμE(〜
工μg/μl)に溶解させた。
そして、pTc o 5Apl’ 10 r i/cm
Y/n e orをBamHIで消化したDNA溶液1
μIl (〜1μg)と、p TK −4/B a m
HI /BamHrのTKを含むBamHr断片のDN
A溶液1μl(〜lμg)とを、反応混液20μlで6
ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて連結した。その後、フェノール抽出を行い
、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr 1s−HC:l (pH7,5) f4液2
0μlに溶解させた。
Y/n e orをBamHIで消化したDNA溶液1
μIl (〜1μg)と、p TK −4/B a m
HI /BamHrのTKを含むBamHr断片のDN
A溶液1μl(〜lμg)とを、反応混液20μlで6
ユニツトの74−DNAリガーゼと12℃で17.5時
間反応させて連結した。その後、フェノール抽出を行い
、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を0.1M
Tr 1s−HC:l (pH7,5) f4液2
0μlに溶解させた。
次に、このDNA溶液10μβで大腸菌(HBlol)
をトランスホーメーションしたのち、Ap’:cmrか
つKmヒ(neor)クローンを得た。次いでこれらの
クローンのもつプラスミドDNAの特性を調べて、pT
cosApど/ o r i/cmr/neorのBa
mHIサイトにTKが挿入されたプラスミド:pTco
sApY’ 10ri/TK/cmr/neor (
2BamHI)(第5図)を持つ大腸菌を得た。
をトランスホーメーションしたのち、Ap’:cmrか
つKmヒ(neor)クローンを得た。次いでこれらの
クローンのもつプラスミドDNAの特性を調べて、pT
cosApど/ o r i/cmr/neorのBa
mHIサイトにTKが挿入されたプラスミド:pTco
sApY’ 10ri/TK/cmr/neor (
2BamHI)(第5図)を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、TYG−P培地1i!中で増殖させたの
ち、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pT
c o 5Apr10 r i/TK/cm”/neo
Y(2BamHI)のプラスミドDNAを調製した。
ち、菌体よりc c c−DNAを分離精製して、pT
c o 5Apr10 r i/TK/cm”/neo
Y(2BamHI)のプラスミドDNAを調製した。
pTcosApYlor i/TK/cm’/neo’
(2BamHI)10IIgを反応混液100plで
、14ユニツトのBamHIと37℃で30分間反応さ
せて限定消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後
、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t10
.1E7μN (〜1μg/μN)に溶解させた。
(2BamHI)10IIgを反応混液100plで
、14ユニツトのBamHIと37℃で30分間反応さ
せて限定消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後
、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱を10t10
.1E7μN (〜1μg/μN)に溶解させた。
次に、このB a m HIで限定消化したDNA溶液
1μ!(〜1μg)を、反応混液25μ!で、2ユニツ
トの1(lenov酵素と22℃で30分間反応させて
、cohesive endをbtunt end
に変えたのち、0.8%m製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、3個のcos及びApr 、ori、TK、
cm’?、neo”を含むDNA断片(6,93Kbp
)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た
。
1μ!(〜1μg)を、反応混液25μ!で、2ユニツ
トの1(lenov酵素と22℃で30分間反応させて
、cohesive endをbtunt end
に変えたのち、0.8%m製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、3個のcos及びApr 、ori、TK、
cm’?、neo”を含むDNA断片(6,93Kbp
)を分離精製して、DNAをエタノール沈澱として得た
。
このDNA沈澱を反応混液20μlで、6ユニツトの7
4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて
閉環化したのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Trts−M
CI (pH7,5)溶液20μlに溶解させた。
4−DNAリガーゼと12℃で17.5時間反応させて
閉環化したのち、フェノール抽出を行い、DNAをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を0.1M Trts−M
CI (pH7,5)溶液20μlに溶解させた。
そして、このD N A f4液10μβで大腸菌(H
BIOI)をトランスホーメーションしたのち、ApY
、cmrかつKmr (neor)クローンを得た。次
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を
調べて、pTcosApr/。
BIOI)をトランスホーメーションしたのち、ApY
、cmrかつKmr (neor)クローンを得た。次
で、これらのクローンのもつプラスミドDNAの特性を
調べて、pTcosApr/。
r i/TK/cmr /ne o)’ (2Bam
HI)のCm? とTKとの間にあるBamH1サイト
を欠いたプラスミド:pTcosAp”10r i/T
K/cmY/ne or (第3.5図)を持つ大腸
菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に[微工研菌第7887(FERMP−7887
)Jとして寄託されている。
HI)のCm? とTKとの間にあるBamH1サイト
を欠いたプラスミド:pTcosAp”10r i/T
K/cmY/ne or (第3.5図)を持つ大腸
菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に[微工研菌第7887(FERMP−7887
)Jとして寄託されている。
この大腸菌を、TYG−P培地ll中で増殖させたのち
、菌体よりccc−DNAを分離精製してpTcosA
pY10ri/TK/cmy″/ne o”のプラスミ
ドDNAを調製した。
、菌体よりccc−DNAを分離精製してpTcosA
pY10ri/TK/cmy″/ne o”のプラスミ
ドDNAを調製した。
pBR−322の塩基配列を持つ、ヘルペスシンプレツ
クウィルス1型(H3V−1)のチミジンキナーゼ(T
K)遺伝子の組み換え体を移入したマウスL細胞(Lt
k−(H3V−ITK ))は、10%仔牛血清を添
加したイーグルMEMで培養し、confluent
monolayers(100mm−プレート9枚、
〜107CeIIs/プレート)とし、PBS (1
37mMNaC1,3’mM KCI、 8mM
Na2 HPO4,1mM KH2PO4)で
2度洗ったのち、可溶化剤〔100μg/ml Pr
oteinaseK、j、5%SDS、 150mM
NaC1゜10mM EDTA、 10m
M Tris−HCl (pH7,5))をプレ
ート当り1. Om N加え、65℃で15〜30分間
保温して可溶化した。この可溶化物は50mj!容量の
遠沈管に移し、さらに37℃で一晩保温し、途中、Pr
otinaseKをさらに100μg/mβ添加した。
クウィルス1型(H3V−1)のチミジンキナーゼ(T
K)遺伝子の組み換え体を移入したマウスL細胞(Lt
k−(H3V−ITK ))は、10%仔牛血清を添
加したイーグルMEMで培養し、confluent
monolayers(100mm−プレート9枚、
〜107CeIIs/プレート)とし、PBS (1
37mMNaC1,3’mM KCI、 8mM
Na2 HPO4,1mM KH2PO4)で
2度洗ったのち、可溶化剤〔100μg/ml Pr
oteinaseK、j、5%SDS、 150mM
NaC1゜10mM EDTA、 10m
M Tris−HCl (pH7,5))をプレ
ート当り1. Om N加え、65℃で15〜30分間
保温して可溶化した。この可溶化物は50mj!容量の
遠沈管に移し、さらに37℃で一晩保温し、途中、Pr
otinaseKをさらに100μg/mβ添加した。
反応後、等量のトリス緩衝液で飽和したフェノールでお
だやかに2度抽出し、水層を50mM Tris−H
CI (pH8,0) 、10mM EDTA、1
0mMNaclからなる透析緩衝液31に対して4回透
析を行った。透析内液は、50μg / m 1のDN
ase−free RNaseAを加えて37℃で3
時間保温してRNAを分解した。反応後、等量のフェノ
ール:クロロホルム混液で2度おだやかに抽出し゛、水
層を10mM Tris−MCI (pH8,0)
、1mM EDTAからなる水溶液(TE)3jl!
に対して9回透析して、精製DNA溶液50mj2を得
た。DNA溶液の260nmと280nmでの吸光度(
OD)は、10倍希釈でそれぞれ0.667. 0.3
63 (OD2 s 。
だやかに2度抽出し、水層を50mM Tris−H
CI (pH8,0) 、10mM EDTA、1
0mMNaclからなる透析緩衝液31に対して4回透
析を行った。透析内液は、50μg / m 1のDN
ase−free RNaseAを加えて37℃で3
時間保温してRNAを分解した。反応後、等量のフェノ
ール:クロロホルム混液で2度おだやかに抽出し゛、水
層を10mM Tris−MCI (pH8,0)
、1mM EDTAからなる水溶液(TE)3jl!
に対して9回透析して、精製DNA溶液50mj2を得
た。DNA溶液の260nmと280nmでの吸光度(
OD)は、10倍希釈でそれぞれ0.667. 0.3
63 (OD2 s 。
10D260=O8544)であり、DNAの濃度は0
.667X0.050 (μg/l0D)xl 0=0
、334μg/μlであった。
.667X0.050 (μg/l0D)xl 0=0
、334μg/μlであった。
(b) 〜45Kb の゛ツムDNAの゛精製
したゲノムDNA溶液5.98rrl(2mg)を、反
応混液29.96mj! (50mM NaC1゜1
0mM Tr i 5−HCl (p H7,5)
、 10mM MgCl2.100μg/mj!B
SA)で15.6ユニ7トのSau 3A (New
England Blolabs社製)と37℃
で1時間反応させて限定消化したのち、0.5 M E
D T A(pH8,0)溶液を1.3 m−J加え
、等量ノドリス援所液飽和フェノールで2度おだやかに
抽出した。
したゲノムDNA溶液5.98rrl(2mg)を、反
応混液29.96mj! (50mM NaC1゜1
0mM Tr i 5−HCl (p H7,5)
、 10mM MgCl2.100μg/mj!B
SA)で15.6ユニ7トのSau 3A (New
England Blolabs社製)と37℃
で1時間反応させて限定消化したのち、0.5 M E
D T A(pH8,0)溶液を1.3 m−J加え
、等量ノドリス援所液飽和フェノールで2度おだやかに
抽出した。
そして水層をセカンダリ−ブタノールでlQmj!まで
濃縮したのち、3.0 M酢酸ナトリウム1.1mgと
エタノール20mgを加え、エタノール沈澱としてゲノ
ムDNAを得、70%エタノールで洗ったのち水流ポン
プにて乾燥を行い、エタノール沈澱をT E 2 m
lに溶解させた。
濃縮したのち、3.0 M酢酸ナトリウム1.1mgと
エタノール20mgを加え、エタノール沈澱としてゲノ
ムDNAを得、70%エタノールで洗ったのち水流ポン
プにて乾燥を行い、エタノール沈澱をT E 2 m
lに溶解させた。
次に、このDNA溶液300μ2を5〜25%シヨ糖密
度勾配遠心(20mM Tris−HCl (pH
7,6) 、5mM EDTA、 ベックマン5W2
8 ;20.00Orpm、9時間、20℃〕にかけて
30滴ごとに分画した。各分画20μlを0.4%アガ
ロースゲル電気泳動にかけ長さを測定し、35〜45K
bpの大きさのDNA分画を集めたのち、TE3j!に
対して3回透析を行った。そして透析内液をフェノール
抽出後、水層をセカンダリ−ブタノールで濃縮し、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱をTElmjlに溶
解させて、35〜45KbpのゲノムDNA溶液を得た
。DNA溶液の0D26o及びOD2goは50倍希釈
でそれぞれ0.216.0.1)2 (OD2a o
10D2 e o =0.519)であり、DNAの濃
度は0.216X0.050 (μg/l0D)x5
0=0.54μg/μlであった。
度勾配遠心(20mM Tris−HCl (pH
7,6) 、5mM EDTA、 ベックマン5W2
8 ;20.00Orpm、9時間、20℃〕にかけて
30滴ごとに分画した。各分画20μlを0.4%アガ
ロースゲル電気泳動にかけ長さを測定し、35〜45K
bpの大きさのDNA分画を集めたのち、TE3j!に
対して3回透析を行った。そして透析内液をフェノール
抽出後、水層をセカンダリ−ブタノールで濃縮し、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱をTElmjlに溶
解させて、35〜45KbpのゲノムDNA溶液を得た
。DNA溶液の0D26o及びOD2goは50倍希釈
でそれぞれ0.216.0.1)2 (OD2a o
10D2 e o =0.519)であり、DNAの濃
度は0.216X0.050 (μg/l0D)x5
0=0.54μg/μlであった。
(C) コスミドベクターDNAの一製pTcosA
pr 10ri/cmV”/neoW40μgを反応混
液400μlで80ユニツトのC1a Iと37℃で2
時間反応させて消化した。
pr 10ri/cmV”/neoW40μgを反応混
液400μlで80ユニツトのC1a Iと37℃で2
時間反応させて消化した。
その後、フェノール抽出を行い、DNAをエタノール沈
澱として得、沈澱をLotlo、IE100μ2に溶解
させた。
澱として得、沈澱をLotlo、IE100μ2に溶解
させた。
このCIaIで消化したDNA溶液95 p、1を、反
応混液500pj! (50mM Tris−HCl
(pH9,0)、1mM MgCl2,0.1m
MZnCl2.1mM スペルジミン〕で、6ユニツ
トのホスファターゼ(Calf 1ntestina
l alkaline phosphatase、
Boehringer、Mannheim社製)と、3
7℃で15分間、56℃で15分間反応後、さらに6ユ
ニツトのホスファターゼを加え、37℃で15分間、続
いて56℃で15分間反応させて、C1alの切断片を
不活化した。
応混液500pj! (50mM Tris−HCl
(pH9,0)、1mM MgCl2,0.1m
MZnCl2.1mM スペルジミン〕で、6ユニツ
トのホスファターゼ(Calf 1ntestina
l alkaline phosphatase、
Boehringer、Mannheim社製)と、3
7℃で15分間、56℃で15分間反応後、さらに6ユ
ニツトのホスファターゼを加え、37℃で15分間、続
いて56℃で15分間反応させて、C1alの切断片を
不活化した。
その後、H20400ttl、STE (100mMT
ris−HCI (pH8,0) 、LM NaC
1゜10mM EDTA) IQQμj!S to
%5DS50μEを加え、68℃で15分間保温してホ
スファターゼを失活させた。そして、フェノール抽出で
除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱をL
otlo、IE 30μlに溶解した。
ris−HCI (pH8,0) 、LM NaC
1゜10mM EDTA) IQQμj!S to
%5DS50μEを加え、68℃で15分間保温してホ
スファターゼを失活させた。そして、フェノール抽出で
除蛋白後、DNAをエタノール沈澱として得、沈澱をL
otlo、IE 30μlに溶解した。
次に、このC1alで消化し、ホスファターゼで不活化
したDNA溶液30μlを、反応混液500μm2で、
176ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応させ
て消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱をLotlo、IE
30μ2に溶解させて、コスミドベクターDNA溶
液を得た(0゜69μg/μl)。
したDNA溶液30μlを、反応混液500μm2で、
176ユニツトのBamHIと37℃で2時間反応させ
て消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、DN
Aをエタノール沈澱として得、沈澱をLotlo、IE
30μ2に溶解させて、コスミドベクターDNA溶
液を得た(0゜69μg/μl)。
(b)で調製した35〜45Kbpのゲノム溶液2.6
1μm (1,4μg)と、(c)で開裂したコスミド
ベクターDNA0.86μl (0,59μg)とを、
反応混液10μlで5.9ユニツトの74−DNAリガ
ーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。反応
終了後、反応液は4℃で保存した。
1μm (1,4μg)と、(c)で開裂したコスミド
ベクターDNA0.86μl (0,59μg)とを、
反応混液10μlで5.9ユニツトの74−DNAリガ
ーゼと12℃で17.5時間反応させて連結した。反応
終了後、反応液は4℃で保存した。
大腸菌BHB2690をNZY培地(1%NZamin
e、0.5%酵母エキス、0.5% NaC1,0,2
% MgCl2 ・6H20,pH7,5)100mj
!で一晩培養した液のODs o oを測定後、あらか
じめ32℃に保温しておいたNZY培地500mf (
2Nフラスコ中)に最初の0Dsooが0.025にな
るように菌を接種し、32℃で振盪培養を開始した。そ
して、0D6ooが0゜3になった時点で(培養開始か
ら2時間40分後)、45℃で15分間おきプロファー
ジの誘導を行った。その後、培養温度を38〜39℃に
変え、さらに3時間激しく振盪培養した(培養液の少量
にクロロホルムを一滴滴下することによって誘導の検査
をした)。
e、0.5%酵母エキス、0.5% NaC1,0,2
% MgCl2 ・6H20,pH7,5)100mj
!で一晩培養した液のODs o oを測定後、あらか
じめ32℃に保温しておいたNZY培地500mf (
2Nフラスコ中)に最初の0Dsooが0.025にな
るように菌を接種し、32℃で振盪培養を開始した。そ
して、0D6ooが0゜3になった時点で(培養開始か
ら2時間40分後)、45℃で15分間おきプロファー
ジの誘導を行った。その後、培養温度を38〜39℃に
変え、さらに3時間激しく振盪培養した(培養液の少量
にクロロホルムを一滴滴下することによって誘導の検査
をした)。
培養終了後、6,000rpmで10分間遠心分離機に
かけて集菌を行い、菌体を20mM Tr 1s−
HCI (pH8,0)、 1mM EDTA。
かけて集菌を行い、菌体を20mM Tr 1s−
HCI (pH8,0)、 1mM EDTA。
5mMβ−メルカプトエタノールからなる緩衝液3、6
m lに懸濁させた。そして、4℃以下で超音波処理
(最大出力で5秒間×20回)を行ったのち、20.0
0Orpmで10分間遠心分離機にかけて(4℃)、上
澄液〜3mJを得た。
m lに懸濁させた。そして、4℃以下で超音波処理
(最大出力で5秒間×20回)を行ったのち、20.0
0Orpmで10分間遠心分離機にかけて(4℃)、上
澄液〜3mJを得た。
次に、上澄み液3mlに等量の上記緩衝液とパッケージ
ング緩衝液(6mM Tris−HCI(pH8,0
) 、50mMスペルミジン、50mMプトレシン、2
0mM MgCl2.30mMATP、30mMβ−
メルカプトエタノール〕0゜5mfを加えたのち、15
plづつ1.5 m Itのエツペンドルフチェーブに
分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−70℃で保存し
た。
ング緩衝液(6mM Tris−HCI(pH8,0
) 、50mMスペルミジン、50mMプトレシン、2
0mM MgCl2.30mMATP、30mMβ−
メルカプトエタノール〕0゜5mfを加えたのち、15
plづつ1.5 m Itのエツペンドルフチェーブに
分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−70℃で保存し
た。
大腸菌2688を、NZY培地109mm!で一晩培養
した液の006 o oを測定したのち、あらかじめ3
2℃に保温しておいたNZY培地500mA(21フラ
スコ中)に最初のODe o oが0゜025になるよ
うに菌を接種し、32℃で振盪培養を開始した。そして
、0D6ooが0.3になった時点で(培養開始から2
時間40分後)、45℃で15分間おきプロファージの
誘導を行った。
した液の006 o oを測定したのち、あらかじめ3
2℃に保温しておいたNZY培地500mA(21フラ
スコ中)に最初のODe o oが0゜025になるよ
うに菌を接種し、32℃で振盪培養を開始した。そして
、0D6ooが0.3になった時点で(培養開始から2
時間40分後)、45℃で15分間おきプロファージの
誘導を行った。
その後、培養温度を38〜39℃に変え、さらに3時間
激しく振盪培養した(培養液の少量にクロロホルムを一
滴、滴下することによって誘導の検査をした。) 培養終了後、6.00Orpmで10分間遠心分離機に
かけて集菌を行い、菌体をショ糖溶液〔10%ショ糖、
50mM Tr i 5−HCI (pH8,0)
13mj!に懸濁させたのち、Q、 5 m lづつエ
ツペンドルフチューブ6本にとり、この各々のチューブ
にリゾチーム溶液(2mg/nu、0゜25M Tr
is−HCI (pH8,0))25μlを加え(4
℃)、おだやかに混合し、すばやく液体窒素中にて凍結
させた。
激しく振盪培養した(培養液の少量にクロロホルムを一
滴、滴下することによって誘導の検査をした。) 培養終了後、6.00Orpmで10分間遠心分離機に
かけて集菌を行い、菌体をショ糖溶液〔10%ショ糖、
50mM Tr i 5−HCI (pH8,0)
13mj!に懸濁させたのち、Q、 5 m lづつエ
ツペンドルフチューブ6本にとり、この各々のチューブ
にリゾチーム溶液(2mg/nu、0゜25M Tr
is−HCI (pH8,0))25μlを加え(4
℃)、おだやかに混合し、すばやく液体窒素中にて凍結
させた。
次に、チューブを氷上において抽出物を融解させたのち
、各チューブにパンケージング緩衝液25μlを加えて
混合した。そして、各抽出物を一緒にして、21.00
Orpmで1時間(4℃)遠心分離機にかけて上澄液を
得、これの10plづつをl、 5 m lのエッペン
ドルフチューブに分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、
−70℃で保存した。
、各チューブにパンケージング緩衝液25μlを加えて
混合した。そして、各抽出物を一緒にして、21.00
Orpmで1時間(4℃)遠心分離機にかけて上澄液を
得、これの10plづつをl、 5 m lのエッペン
ドルフチューブに分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、
−70℃で保存した。
(f) in vitroパッケージング−70
℃に保存しておいたBHB2690とBHB2688の
菌体抽出液を氷上におき、まず先に融解するBHB26
88の抽出液をBHBZ690の抽出液に加えておだや
かに混合した。はぼ全部融解したところで、(d)で調
製した組み換え体DNA溶液2.5μ6(0,5μg)
を加えてよ(混合したのち、室温で1時間反応させて1
nvitroパツケージングを行った。
℃に保存しておいたBHB2690とBHB2688の
菌体抽出液を氷上におき、まず先に融解するBHB26
88の抽出液をBHBZ690の抽出液に加えておだや
かに混合した。はぼ全部融解したところで、(d)で調
製した組み換え体DNA溶液2.5μ6(0,5μg)
を加えてよ(混合したのち、室温で1時間反応させて1
nvitroパツケージングを行った。
反応終了後、3M溶液(0,58%NaC1,0゜2%
MgSO4・7H,20,50mM Tr i 5−
HCI (pH7,5)0.01%ゲラチン〕 1m
lとクロロホルム−滴を加えて混合した。そして、エッ
ペンドルフチューブを机上遠心機に30秒間かけて、上
澄液を形質導入ファージ粒子溶液として得た。
MgSO4・7H,20,50mM Tr i 5−
HCI (pH7,5)0.01%ゲラチン〕 1m
lとクロロホルム−滴を加えて混合した。そして、エッ
ペンドルフチューブを机上遠心機に30秒間かけて、上
澄液を形質導入ファージ粒子溶液として得た。
(g) MJ!tj びプレー−ン゛大腸菌HB
IOIのL−ブロス(マルトース0゜4%添加)で−晩
培養した液200μlを机上遠心機にかけて集菌を行い
、その菌体を10mMMgC12溶液100μlに再懸
濁した。次に、この菌体懸濁液100μlに3M溶液で
10倍希釈した形質導入ファージ粒子溶液100μlを
加え、37℃で15分間保温して形質導入を行ったのち
、さらにL−ブロス1.l m lを加え37℃で45
分間振盪培養した。そして、この菌体懸濁液を100μ
iずつアンピシリン20μg / m l含有する10
0mmのし一プレートに塗布し、プレートを37℃で一
晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてL−ブ
ロス(アンピシリン20 μg / m Il含有
)で増殖させた。また、プレート当たりのコロニー数は
20〜100個であった。
IOIのL−ブロス(マルトース0゜4%添加)で−晩
培養した液200μlを机上遠心機にかけて集菌を行い
、その菌体を10mMMgC12溶液100μlに再懸
濁した。次に、この菌体懸濁液100μlに3M溶液で
10倍希釈した形質導入ファージ粒子溶液100μlを
加え、37℃で15分間保温して形質導入を行ったのち
、さらにL−ブロス1.l m lを加え37℃で45
分間振盪培養した。そして、この菌体懸濁液を100μ
iずつアンピシリン20μg / m l含有する10
0mmのし一プレートに塗布し、プレートを37℃で一
晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてL−ブ
ロス(アンピシリン20 μg / m Il含有
)で増殖させた。また、プレート当たりのコロニー数は
20〜100個であった。
(g)で得られたアンピシリン耐性コロニー(トランス
ホーマント)20個を、L−ブロス(アンピシリン20
μg / m l含有)2mlで一晩培養したのち、各
培養液1.5 m lのエツペンドルフチューブにとり
、机上遠心機かけて集菌した。これらの菌体を溶液IC
50mMグルコース、25mMTris−HCI (
pH8,0) 、10mMEDTA、4mg/mj!リ
ゾチーム)100uJに再懸濁したのち、室温で5分間
おいた。次に、溶液II (0,2N NaOH,1
%5DS)200μlを加えておだやかに混合し、氷上
に5分間おいたのち、溶液I[(5M酢酸カリ (pH
4,8))150μβを加えておだやかに混合し、氷上
に5分間おいた。そして、エツベンドルフチューブを机
上遠心機にかけて上澄液を得、これに2倍容量のエタノ
ールを加えて、プラスミドDNAをエタノール沈澱とし
て得た。
ホーマント)20個を、L−ブロス(アンピシリン20
μg / m l含有)2mlで一晩培養したのち、各
培養液1.5 m lのエツペンドルフチューブにとり
、机上遠心機かけて集菌した。これらの菌体を溶液IC
50mMグルコース、25mMTris−HCI (
pH8,0) 、10mMEDTA、4mg/mj!リ
ゾチーム)100uJに再懸濁したのち、室温で5分間
おいた。次に、溶液II (0,2N NaOH,1
%5DS)200μlを加えておだやかに混合し、氷上
に5分間おいたのち、溶液I[(5M酢酸カリ (pH
4,8))150μβを加えておだやかに混合し、氷上
に5分間おいた。そして、エツベンドルフチューブを机
上遠心機にかけて上澄液を得、これに2倍容量のエタノ
ールを加えて、プラスミドDNAをエタノール沈澱とし
て得た。
各トランスホーマントのもつプラス゛ミドDNAを少量
の10t10.1Eに溶解させたのち、サイズマーカー
DNA (ラムダDNA:48Kbp。
の10t10.1Eに溶解させたのち、サイズマーカー
DNA (ラムダDNA:48Kbp。
ラムダDNAをHi ndn[で消化したもの:22゜
3Kbp; 9.5Kbp)と−緒に、0.4%アガ
ロースゲル電気泳動にかけたところ、アンピシリン耐性
コロニー20個のうち、すべてが22.3 K bp〜
48Kbpの大きさのところにプラスミドDNAの存在
が認められた。
3Kbp; 9.5Kbp)と−緒に、0.4%アガ
ロースゲル電気泳動にかけたところ、アンピシリン耐性
コロニー20個のうち、すべてが22.3 K bp〜
48Kbpの大きさのところにプラスミドDNAの存在
が認められた。
この段階では、組み換え体DNAはプラスミドとして存
在して、おり、外来DNAの遺伝子バンクはプラスミド
DNAとして製造されている。
在して、おり、外来DNAの遺伝子バンクはプラスミド
DNAとして製造されている。
(i) fl びin vivoバ・・ −ジ
ン久 大腸菌HBIOIにラムダファージが溶原化し七 ている菌株LN900 (HBIOI (λCI 。
ン久 大腸菌HBIOIにラムダファージが溶原化し七 ている菌株LN900 (HBIOI (λCI 。
TcY″)=30℃ではラムダファージは溶原化してい
るが、37℃ではラムダファージは溶菌化サイクルに移
行する。またテトラサイタリン耐性である。〕を〕L−
ブロスマルトース0.4%添加)にて30℃で一晩培養
した。その培養液200μiを机上遠心機にかけて集菌
を行い、その菌体を10mM MgCl2溶液100
IINに再懸濁した0次に、この菌体懸濁液100μl
に、(f)で調製した形質導入ファージ粒子溶液(3M
溶液で10倍希釈)100μlを加え、30℃で15分
間保温して形質導入を行ったのち、さらにL−ブロス1
.1 m Itを加え30℃で45分間振盪培養した。
るが、37℃ではラムダファージは溶菌化サイクルに移
行する。またテトラサイタリン耐性である。〕を〕L−
ブロスマルトース0.4%添加)にて30℃で一晩培養
した。その培養液200μiを机上遠心機にかけて集菌
を行い、その菌体を10mM MgCl2溶液100
IINに再懸濁した0次に、この菌体懸濁液100μl
に、(f)で調製した形質導入ファージ粒子溶液(3M
溶液で10倍希釈)100μlを加え、30℃で15分
間保温して形質導入を行ったのち、さらにL−ブロス1
.1 m Itを加え30℃で45分間振盪培養した。
その後、最終濃度が20℃g / m lになるように
アンピシリン及びクロラムフェニコールを添加し、全液
量2mJ (L−ブロス:マルトース0、4%添加)で
30℃において一晩培養した。
アンピシリン及びクロラムフェニコールを添加し、全液
量2mJ (L−ブロス:マルトース0、4%添加)で
30℃において一晩培養した。
次に、この培養液25μlを、あらかじめ30℃に保温
しておいたし一ブロス(マルトース0.4%、アンピシ
リン20μg / m 1 、クロラムフェニコール2
0μg / m l添加)5mlに接種し、30℃で振
盪培養を開始した。そして、OD6 。
しておいたし一ブロス(マルトース0.4%、アンピシ
リン20μg / m 1 、クロラムフェニコール2
0μg / m l添加)5mlに接種し、30℃で振
盪培養を開始した。そして、OD6 。
Oが0.3になった時点で(培養開始から3時間後)4
0℃で10分間おいてインダクション(誘発)を行った
のち、培養温度を37℃に変えて30分間振盪培養した
。そして、この培養液100μlに、あらかじめ37℃
に保温しておいたし一ブロス(マルトース0.4%添加
)9.9m/を加え、さらに37℃で2時間振盪培養し
たのち、クロロホルムを数滴加えて混合した。次に、こ
の液を遠心分離機(4,500rpm、10分間)にか
けて、上澄液を形質導入ファージ粒子溶液として得た。
0℃で10分間おいてインダクション(誘発)を行った
のち、培養温度を37℃に変えて30分間振盪培養した
。そして、この培養液100μlに、あらかじめ37℃
に保温しておいたし一ブロス(マルトース0.4%添加
)9.9m/を加え、さらに37℃で2時間振盪培養し
たのち、クロロホルムを数滴加えて混合した。次に、こ
の液を遠心分離機(4,500rpm、10分間)にか
けて、上澄液を形質導入ファージ粒子溶液として得た。
また、この形質導入ファージ粒子溶液50μlに、30
℃で一晩培養しておいた大腸菌LN900の培養液1m
lを加え、30℃で5分間保温して形質導入を行ったの
ち、この菌体懸濁液を50μlづつL−プレート(アン
ピシリン20μg/m1含有)に塗布し、プレートを3
0℃において一晩おいたところ、プレート当たり100
0〜3000個のコロニーが認められた。
℃で一晩培養しておいた大腸菌LN900の培養液1m
lを加え、30℃で5分間保温して形質導入を行ったの
ち、この菌体懸濁液を50μlづつL−プレート(アン
ピシリン20μg/m1含有)に塗布し、プレートを3
0℃において一晩おいたところ、プレート当たり100
0〜3000個のコロニーが認められた。
この段階において、組み換え体DNAは形質導入ファー
ジ粒子として存在しており、外来DNAの遺伝子バンク
は形質導入ファージ粒子として製造されている。
ジ粒子として存在しており、外来DNAの遺伝子バンク
は形質導入ファージ粒子として製造されている。
第1図は、新規コスミドベクターpTcosApY 1
0ri/cmr/neoどを示し、第2図は、第1図の
新規コスミドベクターを用いるゲノムDNAの遺伝子バ
ンクの製造方法を示し、 第3図は、新規コスミドベクターp T c o s
ApY 10 r i/TK/cmY/ne oY
を示し、第4A図、第4B図及び第4C図は、p’l’
c 0sApr10ri/cmY/neorの作成方法
を示し、 第5図は、pTcosAprlor i/TK/cm”
/neorの作成方法を示す。 手続補正書 (方式) 昭和60年 4月2チ日 昭和59年 特許側 第253784号2、発明の名称 新規コスミドベグタ、−及びそれを用いる遺伝子バンク
の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都中央区日本橋本町2丁目7番地8昭和60
年3月6日 (発送日60年3月26日) 方丈 4λ 6、補正の対象 発明の詳細な説明の項。 7、補正の内容 別紙の通り。 (1)明細書第4ページ下から3行目ないし1行目[〔
D、l5h−Res、Jとあるを「〔デー・イシューホ
ロウイッツ アンド リュー・エフ・バーク:ヌクレイ
ツク アシッズリサーチ(D、Ish・・・Res、)
Jと訂正する。 (2)明細書第5ページ上から2行目rlsh・・・B
urkeJとあるを[イシューホロウイッツ アンド
バーク(Ish・・・Burke)Jと訂正する。 (3) 明細書第10ページ上から8行目ないし1)
行目r (Lewis ・・・Gene t、Jとある
を「〔レーウィス、タフリュー・エイチ、スリニバサン
ピー・アール:ストケ エフ アンド シミノピッチ、
エル:ソマト セル ジェネテイックス(LeWIS
・・・Genet、)」と訂正する。 (4)明細書第1)ページ下から3行目及び4行目「〔
l5hiura=Bio1.Jとあるを「〔イシウラ
エム等:モレキュラー セル ビオロジ−(Ishiu
ra・・・3io1.)Jと訂正する。 (5)明細書第12ページ下から1行目ないし明細書第
13ページ上から1行目r (Oka−Biol。 」とあるを[〔才力、スギサキ アンド タカナミ。 ジャーナル オプ モレキュラー ビオロジ−(Oka
・・・Btol、)Jと訂正する。 (6)明細書第13ページ上から4行目及び5行目「T
omlzawa=U、S、A、Jとあるを「〔トミザワ
アンド イトウ、プロシーディング オプ ナショナ
ル アカデミ−オブ サイエンシズユー・ニス・ニー(
Tomizawa ・・−U、S。 A、)」と訂正する。 (7) 同ページ中上から8行目及び9行目「〔5o
beron・・・Gene、Jとあるを[〔ソベロン、
カバラピアス アンド ポリバーシーン(Sobero
n=−Gene、)Jと訂正する。 (8)明細書第19ページ上から2行目および3行目「
(Wigler・−・Ce1lJとあるを「〔ウィグラ
ー、エム等セル(Wigler・・・Ce1l)jと訂
正する。 (9)同ページ中上から5行目ないし7行目r(Wig
ler・・・U、S、A、」とあるを「〔ウイグラ−、
エム等ブロシーデインダス オブ ナショナルアカデミ
−オブ サイエンシズ ニー・ニス・ニー (Wigl
er−U、S、A、Jと訂正する。 αω 同ページ中上から10行目及び1)行行目(Gr
af−・−Genet、Jとあるを[〔グラーフ、エル
・エイチ・ジュニア等ソマト セル ジェネティクス(
Graf・・・Genet。)」と訂正する。 (1))同ページ中下から7行目r (Berg・−・
Biol、Jとあるを「〔ベルブ、ビー等モレキュラー
アンド セル ビオロジー(Berg・・・Bi。 1、)」と訂正する。 (12)明細書第20ページ下から4行目r(Mole
cular−−−et al、、Jとあるを「〔モレ
キュラー クローニング、ゴールド スプリングハーバ
−ラボラトリ−、アニアティス、ティ等(Molecu
lar・・−et′ al、、)Jと訂正する。 (13)明細書第60ページ下から10行目及び9行目
「(Oka・・・Biol、Jとあるを「〔才力、スギ
サキ アンド タカナミ、ジャーナル オプ モレキュ
ラー ビオロジー(Oka・・・Biol)」と訂正す
る。 (14)明細書第61ページ下から7行目ないし5行目
「Tjan・・・U、S、A、Jとあるを[〔チャン、
アール等:プロシーディング オブ ナショナルアカデ
ミ−オブ サイエンシズ ニー・ニス・ニー (Tja
n ・・・U、S、A、)Jと訂正する。 (15)明細書第65ページ下から6行目及び5行目「
〔l5hiura ・・・Biol、Jとあるを「〔イ
シウラ、エム等モレキュラニ アンド セル ビオロジ
−(Ishiua ・・・Biol、)Jと訂正する。
0ri/cmr/neoどを示し、第2図は、第1図の
新規コスミドベクターを用いるゲノムDNAの遺伝子バ
ンクの製造方法を示し、 第3図は、新規コスミドベクターp T c o s
ApY 10 r i/TK/cmY/ne oY
を示し、第4A図、第4B図及び第4C図は、p’l’
c 0sApr10ri/cmY/neorの作成方法
を示し、 第5図は、pTcosAprlor i/TK/cm”
/neorの作成方法を示す。 手続補正書 (方式) 昭和60年 4月2チ日 昭和59年 特許側 第253784号2、発明の名称 新規コスミドベグタ、−及びそれを用いる遺伝子バンク
の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都中央区日本橋本町2丁目7番地8昭和60
年3月6日 (発送日60年3月26日) 方丈 4λ 6、補正の対象 発明の詳細な説明の項。 7、補正の内容 別紙の通り。 (1)明細書第4ページ下から3行目ないし1行目[〔
D、l5h−Res、Jとあるを「〔デー・イシューホ
ロウイッツ アンド リュー・エフ・バーク:ヌクレイ
ツク アシッズリサーチ(D、Ish・・・Res、)
Jと訂正する。 (2)明細書第5ページ上から2行目rlsh・・・B
urkeJとあるを[イシューホロウイッツ アンド
バーク(Ish・・・Burke)Jと訂正する。 (3) 明細書第10ページ上から8行目ないし1)
行目r (Lewis ・・・Gene t、Jとある
を「〔レーウィス、タフリュー・エイチ、スリニバサン
ピー・アール:ストケ エフ アンド シミノピッチ、
エル:ソマト セル ジェネテイックス(LeWIS
・・・Genet、)」と訂正する。 (4)明細書第1)ページ下から3行目及び4行目「〔
l5hiura=Bio1.Jとあるを「〔イシウラ
エム等:モレキュラー セル ビオロジ−(Ishiu
ra・・・3io1.)Jと訂正する。 (5)明細書第12ページ下から1行目ないし明細書第
13ページ上から1行目r (Oka−Biol。 」とあるを[〔才力、スギサキ アンド タカナミ。 ジャーナル オプ モレキュラー ビオロジ−(Oka
・・・Btol、)Jと訂正する。 (6)明細書第13ページ上から4行目及び5行目「T
omlzawa=U、S、A、Jとあるを「〔トミザワ
アンド イトウ、プロシーディング オプ ナショナ
ル アカデミ−オブ サイエンシズユー・ニス・ニー(
Tomizawa ・・−U、S。 A、)」と訂正する。 (7) 同ページ中上から8行目及び9行目「〔5o
beron・・・Gene、Jとあるを[〔ソベロン、
カバラピアス アンド ポリバーシーン(Sobero
n=−Gene、)Jと訂正する。 (8)明細書第19ページ上から2行目および3行目「
(Wigler・−・Ce1lJとあるを「〔ウィグラ
ー、エム等セル(Wigler・・・Ce1l)jと訂
正する。 (9)同ページ中上から5行目ないし7行目r(Wig
ler・・・U、S、A、」とあるを「〔ウイグラ−、
エム等ブロシーデインダス オブ ナショナルアカデミ
−オブ サイエンシズ ニー・ニス・ニー (Wigl
er−U、S、A、Jと訂正する。 αω 同ページ中上から10行目及び1)行行目(Gr
af−・−Genet、Jとあるを[〔グラーフ、エル
・エイチ・ジュニア等ソマト セル ジェネティクス(
Graf・・・Genet。)」と訂正する。 (1))同ページ中下から7行目r (Berg・−・
Biol、Jとあるを「〔ベルブ、ビー等モレキュラー
アンド セル ビオロジー(Berg・・・Bi。 1、)」と訂正する。 (12)明細書第20ページ下から4行目r(Mole
cular−−−et al、、Jとあるを「〔モレ
キュラー クローニング、ゴールド スプリングハーバ
−ラボラトリ−、アニアティス、ティ等(Molecu
lar・・−et′ al、、)Jと訂正する。 (13)明細書第60ページ下から10行目及び9行目
「(Oka・・・Biol、Jとあるを「〔才力、スギ
サキ アンド タカナミ、ジャーナル オプ モレキュ
ラー ビオロジー(Oka・・・Biol)」と訂正す
る。 (14)明細書第61ページ下から7行目ないし5行目
「Tjan・・・U、S、A、Jとあるを[〔チャン、
アール等:プロシーディング オブ ナショナルアカデ
ミ−オブ サイエンシズ ニー・ニス・ニー (Tja
n ・・・U、S、A、)Jと訂正する。 (15)明細書第65ページ下から6行目及び5行目「
〔l5hiura ・・・Biol、Jとあるを「〔イ
シウラ、エム等モレキュラニ アンド セル ビオロジ
−(Ishiua ・・・Biol、)Jと訂正する。
Claims (8)
- (1)同一の方向性をもったラムダファージまたはラム
ドイドファージのcosを少なくとも3個有することを
特徴とするコスミドベクター。 - (2)同一の方向性をもったラムダファージまたはラム
ドイドファージのcosを少なくとも3個有し、2種類
の制限酵素で切ることによって、それぞれcosを少な
くとも1個もしくは2個持った右腕と左腕とが等モルで
きる特許請求の範囲第1項記載のコスミドベクター。 - (3)コスミドベクター由来の遺伝子画分の挿入を判定
するための薬剤耐性、もしくは特定の生理機能を発現せ
しめる遺伝子配列を含有する特許請求の範囲第1項記載
のコスミドベクター。 - (4)薬剤耐性としてアンピシリン耐性、テトラサイク
リン耐性、ネオマイシン耐性もしくはクロラムフェニコ
ール耐性を発現せしめる遺伝子配列を有する特許請求の
範囲第3項記載のコスミドベクター。 - (5)特定の生理機能として、チミジンキナーゼ(TK
)活性、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(
APRT)活性、ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(HGPRT)活性、キサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPR
T又はgpt)活性、もしくはジヒドロ葉酸リダクター
ゼ(dhfr)活性を発現せしめる遺伝子配列を有する
特許請求の範囲第3項記載のコスミドベクター。 - (6)ColEI由来の複製機能を有する遺伝子画分を
含有する特許請求の範囲第1項記載のコスミドベクター
。 - (7)特許請求の範囲第1項記載のコスミドベクターを
2種類の制限酵素で、切ることによって得られる、それ
ぞれcosを少なくとも1個もしくは2個持った右腕と
左腕との間に、35〜45Kbpの長さの種々の外来D
NA断片を挿入し、invitroパッケージングで形
質導入ファージ粒子に変え、次いでラムダファージが溶
原化している大腸菌にクローン化したのち誘発をかけて
、組み換え体DNAをin vivoパッケージングで
形質導入ファージ粒子に変えることによって、外来DN
Aの遺伝子バンクを製造することを特徴とする遺伝子ハ
ンクの製造方法。 - (8)外来DNAが、細菌、糸状菌、酵母などの微生物
、高等動植物もしくは各種ファージ等に由来するDNA
である特許請求の範囲第7項記載の製造方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59253784A JPS61132187A (ja) | 1984-11-30 | 1984-11-30 | 新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法 |
EP85308769A EP0183571A3 (en) | 1984-11-30 | 1985-12-02 | Cosmid vectors |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59253784A JPS61132187A (ja) | 1984-11-30 | 1984-11-30 | 新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9511794A Division JPH0898690A (ja) | 1994-05-09 | 1994-05-09 | 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61132187A true JPS61132187A (ja) | 1986-06-19 |
Family
ID=17256099
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59253784A Pending JPS61132187A (ja) | 1984-11-30 | 1984-11-30 | 新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0183571A3 (ja) |
JP (1) | JPS61132187A (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5378618A (en) * | 1988-04-15 | 1995-01-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Vitro headful packaging system for cloning DNA fragments as large as 95kb |
DE68928062T2 (de) * | 1988-04-15 | 1997-10-09 | Du Pont Merck Pharma | P1-bakteriophagen-klonierungssystem für bis zu 95 kb grossen dna-fragmenten |
US5589385A (en) * | 1990-07-26 | 1996-12-31 | American Cyanamid Company | Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein |
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