JPS61132187A - 新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子操作技術に関し、さらに詳しくは遺伝子
操作技術を使って作成した新規コスミドベクターと、そ
れを用いる遺伝子バンクの製造方法に関するものである
。

ヒトをはじめとする哺乳動物の遺伝子の大きさは２０キ
ロ塩基対（以下キロ塩基対をＫｂｐと略す）を越えるも
のが少なくない。現在、広く使われているラムダベクタ
ーにクローン化できるＤＮＡの大きさは２０Ｋｂｐなの
で、これより大きい遺伝子全体を機能のある形でクロー
ン化することはできない。

ラムダファージのｃｏｈｅｓｉｖｅ　　ｅｎｄｓｉｔｅ
　　（以下ｃｏｓと略す）を有するベクター、すなわち
コスミドベクターを使えば３５〜４５Ｋｂｐの大きさの
ＤＮＡをクローン化できる。種々のベクターの中で、コ
スミドベクターが最も大きい長さのＤＮＡをクローン化
できるが、長いゲノムＤＮＡの調製がむづかしいことや
、インサートのないベクターだけのバックグランドが高
いこと、また効率が良くないことな′どが障害になって
、コスミドベクターの利用は進まなかった。ところが、
Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ＆Ｂｕｒｋｅはホスファター
ゼを利用してベクターに方向性を持たせる工夫をし、ベ
クターだけのバンクグランドの値を下げるとともにクロ
ーン化の効率を上げることに成功したＣＤ、Ｉｓｈ−Ｈ
ｏｒｏｗｉｃｚ＆Ｊ。

Ｆ、Ｂｕｒｋｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　！、２８８９．　　（１９
８１）〕　。

Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ＆Ｂｕｒｋｓ法によるゲノム
ＤＮＡの遺伝子バンクの製造方法は以下のようである（
たとえば、現在、広く使われているコスミドベクターの
１つであるｐＪＢ−８を例にとる）。ｐＪＢ−８は５．
４４Ｋｂｐの大きさで、制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ
［［，５ａｉｌでそれぞれ１カ所切断され、ラムダファ
ージのＣｏｓを１個有するコスミドベクターである。■
、ｐＪＢ−８をＨｉｎｄｌｌ［で切断することによって
直線状ＤＮＡとし、次にホスファターゼ処理によってＨ
ｉｎｄＩ［の切断片を不活化する。そして、ＢａｍＨＩ
で切断することによって２個のＤＮＡ断片が得られ、ｃ
ｏｓを含む大きなりＮＡ断片（５、４Ｋ　ｂ　ｐ）をア
ガロースゲル電気泳動法によって単離する。得られたｃ
ｏｓを含むＤＮＡ断片（５，４Ｋｂｐ）が、ラムダファ
ージの左腕に相当する。■、ｐＪＢ−８を５ａｌＩで切
断することによって直線状ＤＮＡとし、次にホスファタ
ーゼで処理することによって５ａｌＩの切断片を不活化
する。そして、ＢａｍＨＩで切断することによって２個
のＤＮＡ断片が得られ、ｃｏｓを含む小さなりＮＡ断片
（２，３４Ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法によっ
て単離する。得られたＣｏｓを含むＤＮＡ断片（２，３
４Ｋｂｐ）が、ラムダファージの右腕に相当する。■、
たとえば、ヒトのゲノムＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａも
しくはＭｂｏＩで部分的に切断し、３５〜４５Ｋｂｐの
大きさのＤＮＡ断片を分画する。この３５〜４５Ｋｂｐ
の大きさのＤＮＡ断片を、■と■で別々に調製した左腕
と右腕との間に、連結酵素（Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ）で
挿入させて、組み換え体ＤＮＡを調製する。■、組み換
え体ＤＮＡを１ｎｖｉｔｒｏパツケージングで形質導入
ファージ粒子に変え、次いで大腸菌に感染させることに
よりヒトのゲノムＤＮＡの遺伝子バンクが製造できる。

以上がＩｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ＆Ｂｕｒｋｅ法による
ゲノムＤＮＡの遺伝子バンクの製造方法であるが、次の
４つの問題点がある。第１に、ｐＪＢ−８はｃｏｓが１
つしかなく、左腕と右腕とを別々にｍ製しなければなら
ない。第２に、左腕と右腕について、それぞれｃｏｓを
含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離しなけ
ればならない。第３に、ｐＪＢ−８の左腕の長さは５゜
４Ｋｂｐ、右腕の長さは２．３４Ｋｂｐであり、左腕と
右腕との長さが異なるので、３５〜４５Ｋｂｐのゲノム
ＤＮＡに連結する確率も異なり、左腕と右腕の混合する
比率を検討しなければならない。第４に、この製造方法
で得られた遺伝子バンクにおいては、組み換え体ＤＮＡ
は大腸菌内でプラスミドとして複製し、大腸菌より共有
結合で閉鎖された環状のプラスミドＤＮＡ　（ｃ　ｃ　
ｃ−ＤＮＡ）として分離ｒＲ製できるが、組み換え体Ｄ
ＮＡを形質導入ファージ粒子としてゲノムＤＮＡの遺伝
子バンクを製造することはできない。

本発明者らは、これらの問題点を解決するために、同一
の方向性をもったラムダファージのｃ。

Ｓを３個有し、２種類の制限酵素で切ることによって、
それぞれｃｏｓを１個もしくは２個もった長さのほぼ等
しい右腕と左腕とが等モルできることを特徴とする新規
コスミドベクターを作成した。

そして、本発明のコスミドベクターを用いる外来ＤＮＡ
の遺伝子バンクの製造方法を完成するに至った。本発明
のコスミドベクターは、同一分子内に同一の方向性を持
った３個のｃｏｓが存在し、２種類の制限＃素で切るこ
とによって、それぞれｃｏｓを１個もしくは２個もった
長さのほぼ等しい右腕と左腕とが等モルできるので、右
腕と左腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲ
ル電気泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕
の長さがほぼ等しいので、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤ
ＮＡにＴ４−ＤＮＡリガーゼによって連結される程度も
ほぼ等しいと考えてよく、２種類の制限酵素で切断して
できた右腕と左腕の等モル混合物を、そのまま３５〜４
５ＫｂｐのゲノムＤＮＡと連結すれば、組み換え体ＤＮ
Ａの半分が形質導入ファージ粒子に変わり得ることが期
待できる。このように、本発明のベクターを用いれば、
３５〜４５ＫｂｐのＤＮＡ断片として、ゲノムＤＮＡの
遺伝子バンクをより簡単、かつより効率よく製造できる
。そして、さらに本発明のベクターは、同一分子内に同
一の方向性を持った３　ｆｉｌのＣＯ５を育するので、
組み換え体ＤＮＡをｉｎ　　ｖｉｔｒｏパフケージング
で形質導入ファージ粒子に変え、大腸菌に感染させると
、組み換え体ＤＮＡは大腸菌内で２個のｃｏｓを持った
プラスミドＤＮＡとして複製する。この段階では、プラ
スミドＤＮＡとしての外来ＤＮＡの遺伝子バンクである
が、ラムダファージが溶原化している大腸菌を宿主とし
て用いた場合には、加温もしくは紫外線照射すると言っ
たような誘発をかけることにより溶原化していたラムダ
ファージは溶菌化サイクルにはいり、大腸菌内でラムダ
ファージが増殖し、最終的に大腸菌が溶菌してラムダフ
ァージ粒子が外へ出てくる。この時に、大腸菌内で２個
のＣＯ３をもったプラスミドＤＮＡとして存在している
組み換え体ＤＮＡも、ｃｏｓを２個もっているためにラ
ムダファージの頭の部分に取り込まれて、ｉｎ　　ｖｉ
ｖｏパッケージングで形質導入ファージ粒子に変換され
る。このようにして、形質導入ファージ粒子として外来
ＤＮＡの遺伝子バンクを製造できる。

哺乳動物の培養細胞への遺伝子移入において、染色体を
用いる方法は、プラスミドＤＮＡやゲノムＤＮＡを用い
る方法と比較すると、■遺伝子移入の効率と頻度とが常
に１０倍から１００倍高く、■安定なトランスホーマン
ト−クローンが多く得られる点で優れている（１．ｅｗ
ｉｓ、Ｗ、Ｈ，。

５ｒｉｎｉｖａｓａｎ、Ｐ、Ｒ，，５ｔｏｋｏｅ。

Ｎ、、　＆　５１ｍ１ｎｏｖｉｔｃｈ、Ｌ、：Ｓ。

ｍａｔ、、ｃｅｌｌ　　Ｇｅｎｅｔ、、６，３３３゜（
１９８０））。多分このことは、染色体ではＤＮＡがク
ロマチン・タンパク質で密に包み込まれたクロマチン構
造をとり、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａ　ｓ　ｅ
）の攻撃から守られていることと関係があると思われる
。、また、密なりロマチン構造をとることによって細胞
への取り込みが容易になっているのかもしれない。しか
し、染色体のままではＤＮＡを組み換えることができず
、また、実験に必要なだけの大量の染色体を細胞から調
製することも容易ではない。いま、ラムダファージ粒子
の構成に着目すると、ラムダファージのＤＮＡは外被タ
ンパク質によって密に包み込まれており、クロマチン・
タンパク質に包み込まれている染色体ＤＮＡと状況がよ
く似ている。また、ラムダファージベクターを用いて、
ＤＮＡ組み換えでラムダファージ粒子として遺伝子バン
クを作成する方法はすでに確立している。石浦らは、Ｈ
３Ｖ−１のＴＫ遺伝子を組み込んだラムダベクターＣｈ
ａｒｏｎ４Ａの組み換え体くラムダファージ粒子）を用
イテ、Ｌｔｋ−綱１））へ（７）Ｈ３Ｖ−ＩＴＫ遺伝子
の移入を検討したところ、■遺伝子移入の効率は１０１
で、裸のＤＮＡそのままの場合に比べて１桁高いが、染
色体による場合に比べて１桁低い、■形質転換細胞のコ
ロニーはＤＮＡで得られたものに比べて大きく、そのク
ローンの多くは非選択培地でも安定にたもたれると、予
想どうりの結果を得た（Ｉｓｈｉｕｒａ、Ｍ、、ｅｔａ
ｌ。

Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、２．６０７　（１９８
２））。しかし、ラムダベクターで作成した遺伝子バン
クでの本質的な問題点は、ラムダベクターにクローン化
できるＤＮＡの大きさは最大２０Ｋｂｐなので、目的の
遺伝子がこれより大きい場合には機能のある形でその遺
伝子をクローン化することができないことである。そこ
で本発明のＣＯＳを３（固もったコスミドベクターは、
３５〜４５Ｋｂｐの外来ＤＮＡをクローン化できるとと
もに、形質導入ファージ粒子として遺伝子バンクを製造
できるという点で優れており、培養細胞への遺伝子移入
に大きな力を発揮するものと思われる。

本発明の新規コスミドベクターの１つであるｐＴｃｏｓ
　　Ａｐｒ１０ｒｉ／ｃｍ’／ｎｅｏｒを第１図に示す
。ｐＴｃ　ｏ　ｓ　　Ａｐ１″／　ｏ　ｒ　ｉ　／　ｃ
ｍ’″／ｎｅｏ？は、コスミドベクターであるｐＲＨ（
−４４）もしくはｐＬＨ（＋１２９）由来の同一方向性
のあるｃｏｓ：Ｈｌと（Ｍｉｗａ＆Ｍａｔｓｕｂａｒａ
、Ｇｅｎｅ、２０，２６７　（１９８２））、Ｔｎ９０
３由来のネオマイシン耐性遺伝子（ｎ　ｅ　ｏｖ″）（
Ｏｋａ、Ｓｕｇｉｓａｋｉ＆Ｔａｋａｎａｍｉ、Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｉｏｌ、、工１工、２１７　（１９８１））、
ｐＮＴ−３１由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（
Ｃｍ”）ＣＴｏｍｉｚａｗａ＆Ｉｔｏｈ、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７８．６０
９６　　（１９８１））、ｐＢＲ−３２７由来のアンピ
シリン耐性遺伝子（ＡｐＹ）及び複製開始点（ｏｒｉ）
（Ｓｏｂｅｒｏｎ、Ｃａｖａｒｒｕｂｉａｓ＆Ｂｏｌｉ
ｖａｒ、Ｇｅｎ＠、９．２８７（１９８０））とからな
る。大きさは４．９　Ｋ　ｂ　ｐであり、制限酵素Ｃ１
ａｌ、ＢａｍＨＩによってそれぞれ１カ所切断される。

本ベクターを用いるゲノムＤＮＡ　（外来ＤＮＡ）の遺
伝子バンクの製造方法を示せば以下のようになる（第２
図参照）。

■、ｐＤｃｏｓ　　ＡｐＹ１０ｒｉ／ｃｍｒ／ｎｅ６Ｙ
をＣ１ａ！で切断することによって直線状ＤＮＡとし、
次にホスファターゼ処理によってＣ１ａＩの切断片を不
活化する。そしてＢａｍＨＩで切断することによって、
それぞれｃｏｓを１個及び２個もった長さがほぼ等しい
右腕と左腕とを調製する。■外来ＤＮＡを５ａｕ３Ａも
しくはＭｂｏｌなどで限定消化し、３５〜４５Ｋｂｐの
大きさのＤＮＡ断片を調製する。■３５〜４５Ｋｂｐの
ゲノムＤＮＡ断片を■で調製した左腕と右腕との間に７
４−ＤＮＡリガーゼで挿入させて、組み換え体ＤＮＡを
調製する。■組み換え体ＤＮＡをｉｎ　ｖｉ　ｔｒｏパ
ッケージングで形質導入ファージ粒子に変え；ラムダフ
ァージが溶原化している大腸菌に感染させる。■この形
質導入体ＤＮＡは、ベクター由来のＡＰ’　、ｃｍ？と
ｏｒｉを含むので、アンピシリンもしくはクロラムフェ
ニコールで選択することによって、２個のｃｏｓをもっ
た組み換え体ＤＮＡをプラスミドとして持つ大腸菌のみ
を選択的に生かすことができる。０次に、トランスホー
マント（大腸菌）に、加温もしくは紫外線照射すると言
ったような誘発をかけて溶原化していたラムダファージ
を溶菌化サイクルに移行させることに依って、２個のｃ
ｏｓをもった組み換え体ＤＮＡをｉｎ　　ｖｉｖｏパッ
ケージングで形質導入ファージ粒子に変換できる。この
形質導入ファージ粒子内には、１個のｃｏｓ及びＡｐｒ
、ｏｒｉ、外来ＤＮＡからなる組み換え体ＤＮＡが包み
込まれている。このようにしてゲノムＤＮＡ（外来ＤＮ
Ａ）の遺伝子バンクを形質導入ファージ粒子として製造
することができる。

また、本発明者らは哺乳動物細胞に対する選択マーカー
を持っていて、哺乳動物細胞への遺伝子移入を目的とす
るコスミドベクター、ｐＴｃ　ｏ　ｓＡｐ？　１０ｒｉ
／ＴＫ／ｃｍｒ／ｎｅｏ？″　（第３図）を作成した。

ｐＴｃ　ｏ　ｓ　Ａｐｒ　１０　ｒ　ｉ　／ＴＫ／ｃｍ
’／ｎｅｏＦは、ｐＲＨ（−４４）もしくはｐＬＨ（＋
１２９）由来の同一方向性のあるｃｏｓ３個と、Ｔｎ９
０３由来のｎｅｏｌ’、ｐＮＴ−３１由来のｃｍｒ　、
ｐＢＲ−３２７由来のＡｐｒとｏｒｉ、及びｐＴＫ−４
由来のＴＫ遺伝子（Ｉｓｈｉｕｒａ、Ｍ、、ｅｔａｌ、
、Ｍｏｌ。

Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、、２，６０７　（１９８２）〕
とからなる。このココスミドベクタは、前記したｐＴｃ
ｏｓＡｐ’１０ｒｉ／ｃｍ’″／ｎｅｏｒと同様に、ゲ
ノム遺伝子バンクを製造できる。すなわち、同一の方向
性を持った３個のｃｏｓがあり、ＣＩａＩとＢａｍＨＩ
で切断することにより、それぞれｃｏｓを１個及び２個
もった右腕と左腕とが等モル出来、Ｂａｍ　　Ｈ［サイ
トに３５〜４５Ｋｂｐの大きさのゲノムＤＮＡを挿入さ
せた組み換え体ＤＮＡを作成できる。そして、この組み
換え体ＤＮＡは、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏパッケージングに
よって形質導入ファージ粒子に変換し、大腸菌（ラムダ
ファージが溶原化している）に移すことができ、組み換
え体ＤＮＡを含む大腸菌は、アンピシリンもしくはクロ
ラムフェニコールで選択することによって得ることがで
きる。次に、トラスホーマント（大腸菌）に誘発をかけ
て、２個のｃｏｓを持った組み換え体ＤＮＡをｉｎ　　
ｖｉｖＯパッケージングで形質導入ファージ粒子に変換
して、遺伝子バンクを製造できる。さらに、この形質導
入ファージ粒子は、ＴＫ遺伝子を持つので、哺乳動物の
培養細胞へ遺伝子移入した際に、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）活性をマーカーとすることによって、ベクター由来
の組み換え体ＤＮＡの移入の判定が培養細胞のレベルで
可能であるという利点がある。

本発明は、かかる新規コスミドベクター及びそれを用い
る遺伝子バンクの製造方法に関するものであるが、本発
明に用いられるｃｏｓとしては、ラムダファージまたは
ラムドイドファージ由来のものが挙げられる。特に、ラ
ムダファージ由来のｃｏｓが好ましいものとして挙げら
れる。また、本発明のコスミドベクターで形質導入ファ
ージ粒子として遺伝子バンクを製造するためには、同一
分子内に同一の方向性を持ったｃｏｓが３個ベクター中
に存在すれば充分であるが、３個以上ｃ。

Ｓがベクター中にあってもかまわない。

本発明のベクターは、２種類の制限酵素で切ることによ
って、それぞれｃｏｓを１個づつ持った右腕と左腕がで
きるのであるが、この２種類の制限酵素の組み合わせと
しては、ＰｖｕｎとＢａｍＨｌ、ＰｖｕｆｆとＢｇｌｆ
ｆ、Ｃ１ａｒとＢａｍＨｌ、Ｃ１ａｌとＢｇｌｌＩなど
を挙げることができる。勿論この他にも組合わせは考え
ることができるので、これらに限定されるものではない
。

本発明のベクター中には、ベクター由来のＤＮＡ断片が
挿入されたことを、判定するためには一般的に薬剤耐性
による選択が行われる。従って、本発明のベクター中に
も薬剤耐性を発現するＤＮＡ断片が組み込まれているこ
とが好ましい。薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、
テトラサイタリン耐性、ネオマイシン（カナマイシン）
耐性、もしくはクロラムフェニコール耐性など通常の抗
生物質耐性が挙げられる。ｐＴｃｏｓＡｐＹ／。

ｒ　ｉ　／　ＣｍＹ＋／　ｎ　ｅ　Ｏ？及び、ｐＴｃｏ
ｓＡｐ）１０　ｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍＹ／ｎｅ　ｏＹ’は
アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺
伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子を有している。

本発明のベクターを用いてゲノムＤＮＡ　（外来ＤＮＡ
）の遺伝子バンクを製造し、哺乳動物の培養細胞へ遺伝
子（遺伝子バンク）移入する際には、ベクター由来のＤ
ＮＡ断片が挿入されたことを判定するために特定の生理
機能を発現するＤＮＡ断片が本発明のベクター中に組み
込まれているのが好ましい。特定の生理機能を発現せし
める遺伝子としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子
〔Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、ｅｔａｌ、、Ｃｅ１ｌ、１土。

７２５（１９７８））、アデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、
、ｅｔａｌ、、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、７６．１３７３（１９７９））、ヒボキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
ＨＧＰＲＴ）遺伝子（Ｇｒａｆ、　Ｌ、　Ｈ，Ｊｒ、、
　ｅｔａｌ、　、　Ｓｏｍａｔ、Ｃｅ１ｌ、Ｑｅｎｅｔ
、、５．１０３１（１９７９））、キサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ又はｇ
ｐｔ）遺伝子（Ｂｅｒｇ、ｐ、、ｅｔａ　１．、Ｍ。

１、Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、、１，４４９　（１９８１
）〕などが挙げられる。本発明の新規コスミドベクター
ｐＴｃ　ｏｓＡｐＹｌｏ　ｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍ？／ｎｅ
ｏ”はＴＫ遺伝子を有している。

さらに、本発明のベクター中には、ＣＯＩ　　ＥＩ由来
の複製機能を有する遺伝子画分を有することが好ましい
。

本発明において用いられる外来ＤＮＡの例としては、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物もしくは各
種ファージ等に由来するＤＮＡが挙げられる。

また、本発明において用いられる制限酵素（ＤＮＡ断片
の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有する
酵素）や制限酵素により切断されて生じるＤＮＡ接着末
端と、これと相補的な関係のある他のＤＮＡ断片接着末
端を結合させる為に用いる酵素（リガーゼ）、あるいは
互いに相補的出ないＤＮＡ末端同志を結合させるために
ＤＮＡ末端同志を互いに相補的な接着末端にする酵素、
あるいはこれらを結合させるリガーゼについてはすでに
良く知られ、数多くの酵素が市販され、それらを用いる
手法等についても広く開示されている（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃ。

Ｉｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｍａｎｉａｔｆｓ、Ｔ、、ｅｔａｌ、。

（１９８２））ので、それらを利用すればよい。

本発明のベクターを用い、ゲノムＤＮＡ　（外来ＤＮＡ
）の遺伝子バンクを作成することによって、有用物質を
発現せしめる特定の遺伝子を効率よく見い出すことが可
能である。この特定の遺伝子とは、細菌、糸状菌、酵母
などの微生物、高等動植物あるいは各種ファージ等に由
来するＤＮＡがあり、具体的な有用物質としては、例え
ば各種ホルモン、酵素、さらには抗生物質やアミノ酸な
どの合成系酵素等が挙げられる。

以下、実施例を示して本発明をいっそう詳細に説明する
。

実施例１．　　”［’ｃｏｓＡ　　／　ｏ　ｒ　ｉ　／
　ｃ　ｍ’″／　ｎ　ｅゲ１」λ作刀ｄ辷ぴｍ＜第４図
、第４Ｂ図及び第４．Ｃ図） （ａ）ｐＨ３ｃｏｓの作成及び調製 （ｉ）作成 コスミドベクターであるｐＲＨ（−４４）１０μｇを、
反応混液１００μ／　（１５０ｍＭ’　　Ｎａｃｌ、６
ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，９）。

６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１００μｇ／ｍｎＢｓＡ）で、
６９ユニツトの制限酵素ＢａｍＨ１，（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と２時間反応させて完
全に消化した。反応終了後、等量の水飽和フェノールで
抽出を行い、水層をセカンダリブタノールで濃縮後、０
．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノー
ルを加えて、ＤＮＡを沈澱として得、９５％エタノール
で洗ったのち、水流ポンプで乾燥を行い、沈澱を１０ｍ
ＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１（ｐ　Ｈ８，０）　、０．１　
ｍＭＥＤＴＡからなる水溶液（以下１０ｔ１０．ＩＥと
略す）７μＮ（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。

次に、このＢａｍ’ＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μｌ（
〜１μｇ）を反応混液２５ｐｌ　（５０ｍＭＴｒ　ｉ　
５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，２）　、１０ｍＭ　　Ｍｇ５
０４．０．１ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍ１ＢＳＡ、８０
μＭ　　ｄＡＴＰ、８０μＭ　　ｄＣＴＰ、８０μＭ　
　ｄＧＴＰ、８０μＭ　　ｄＴＴＰ）で、２ニーＺ　ｙ
トのＫｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社製）と２２℃′で３０分間反応させて、
互いに相補鎖が存在する２本ｇＤＮＡ断片（ｃｏｈｅｓ
　ｉｖｅ　　ｅｎｄ）を両端がそろった２本鎖ＤＮＡ断
片（ｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄ）に変えた。反応終了後、反
応液を６５℃で１０分間熱処理してＫＩｅｎｏｗ酵素を
失活させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｊ２．（０，４μｇ）と、
３ａｌＩリンカ−（ｄ　　（ｐｃ−ｃ−’ｒ−ｃ−ｃ−
Ａ−Ｃ−Ｃ’））２μｇとを、反応混液２０μ！〔５０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，４）１０ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭスペルミ
ジン、１ｍＭ　　ＡＴＰ、１００μｇ／ｍＮＢＳＡ）で
、６ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間
反応させて連結した。その後フェノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得た。

このＤＮＡ沈澱を、反応混液６００１）１（１５０ｍＭ
　　ＮａＣｌ、６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ＝ＨＣ１（ＰＨ７，
９）　、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　　ＤＴＴ、１
００／７ｇ／ｍｊ！　　ＢＳＡ）で１０００ユニツトの
制限酵素Ｓａ　Ｉ　Ｉ　　（Ｔａｋａｒａ社製）と３７
°Ｃで４時間反応させて消化したのち′、Ｏ，Ｓ％調製
用アガロースゲルにかけて、ｌＯｍＡで１２時間電気泳
動した。分解されたＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色と
長波長紫外線照明によって見えてくる。ｃｏｓおよびＯ
ｒｉ、ＡｐからなるＤＮＡ断片（３，８９Ｋｂｐ）を含
有するゲルを切り出したのち、５倍容量の抽出液（０，
５Ｍ　　ＮＨ４０Ａｃ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７
，５）：水飽和フェノール＝ｉ　：　１）の存在下で、
ゲルをすりつぶしてＤＮＡを溶出させた。そして、溶出
液をセカンダリ−ブタノールで濃縮後、０．１倍容量の
３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノールを加えてＤ
ＮＡを沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を反応混液２０
μｌ　（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，
４）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　　ＤＴＴ
、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ　　ＡＴＰ、１）００ｕ
／ｍＩ　ＢＳＡ）で、６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガー
ゼと１２℃で１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒ
ｔ、Ａｐ”からなるＤＮＡ断片（３，８９Ｋｂｐ）を閉
環化させた。その後、フェノール抽出を行ない、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒ　
ｉ　５−ＭＣｌ　　（ｐＨ７，５）溶液２０μＥに熔解
させた。

（ｉｉ）　　　　−ンスホーメーションこのＤＮＡ溶液
１０μβを大腸菌ＨＢ　１０１のｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　
　ｃｅｌｌ　　１００μｊ！　（対数増殖期の大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩを０〜４℃で０．　Ｉ　ＭＣａＣ１２溶液で１
５分間処理後、もとの培養液の１／１０容量の０．１　
Ｍ　　Ｃａ　Ｃ１２／　１４％　ｇＩｙｃｅｒｏｌ溶液
に再懸濁し、−７０℃に保存）とよく混合し、０℃で１
０分間、続いて３７℃で５分間保温して、ＤＮＡを大腸
菌内に取りこませたのち、これにＬ−ブロス（１％　Ｂ
ａｃｔｏｔ−ｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％酵母エキス、０
．５％Ｎａｃ１，０．１％グルコース）　　２ｍＪを加
えて、３７℃で１時間振盪培養した。この菌体懸濁液を
２０℃ｇ　／　ｍ　ＩＩのアンピシリンを含むし一プレ
ート（Ｌ−ブロースに寒天を１％添加したプレート）上
にまき、３７℃で２４〜４８時間培養し、アンピシリン
耐性のクローンを得た。

（ｉｉｉ　）小　立　、　び小　ＤＮＡ５ＡｐＹ″であ
るクローンをＬ−ブロス２ｍ７！中（Ａｐ　２０　ｉｉ
　ｇ／ｍｚ含有）で３７℃、１晩振盪して、増殖させた
。培養液１．５　ｍ　ｌをエツペンドルフチューブにと
り、机上遠心分離機にかけて集菌後、この菌体を抽出液
〔８％ショ糖、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００，
５０ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　　Ｔ
ｒ　１ｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０））０．３５ｍ１に
再懸濁させた。次に、リゾチーム溶液２５　／Ｊ　１　
（１０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　
（ｐＨ８，０）　）を加え混合したのち、チューブを沸
騰水中に４０秒問おいた。そして、直ちにチューブを４
℃にて遠心分離機（２１゜０００ｒｐｍ、１５分間）に
かけて上澄液を得、これにＲＮａＳｅＡ溶液（２０ｍｇ
／ｍＡ、１０ｔ１０、ＩＥ）０．５μｌを加えて３７℃
で１時間保温してＲＮＡを分解させた。その後、フェノ
ール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得
、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ　　２０μｌに溶解させて、
プラスミドＤＮＡ１液を得た。

（ｉｖ）プラスミドＤＮＡの そして、このプラスミドＤＮＡ溶液１μｌまたは２ｔｔ
ｌを制限酵素Ｈｉｎｄｌ［、Ｓａ　１）．　ｐｖＵ■、
ＰｓｔＩなどで消化したのち、０．４〜１．５％アガロ
ースゲル電気泳動Ｃ４０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ。

２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，
１５）；　ｌ　ＯｍＡ、１２〜２４時間〕にかけた。

分解されたＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色と長波長紫
外線照明によって検出できる。このようにして、プラス
ミドＤＮＡの制限地図を作成することによって、各クロ
ーンが持っているプラスミドＤＮＡを特性化した。そし
て、ｐＲＨ（−４４）の１３ＭｍＨＩ　　サイトとＳａ
ｔ　　Ｉサイトの間のＤＮＡ断片（０，３１Ｋｂｐ）を
欠き、その場所にＳａｌ　　Ｉ　　リンカ−が挿入され
たプラスミド：ｐＨ３Ｃｏｓ　　（第４Ａ図）を持つ大
腸菌を得た。

（Ｖ）　　　培養、　びプラスミドＤＮＡの゛この大腸
菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地（１％Ｂａｃｔ−ｏｔｒｙｐｔｏ
ｎｅ、０．１％酵母エキス、０．２％グルコース、０．
１％　ＮＨ４Ｃｌ、０９３％　ＮａｃＩ、０．０１％Ｎ
ａ２ＳＯ４，０，０８％　ＭｇＣｌ２　・６Ｈ２０，１
，５２％　Ｎａ２　ＨＰＯ４・１２　Ｈ２０，０，３％
ＫＨ２ＰＯ４）１）中（Ａ９２０μｇ　／　ｍ　ｌ含有
）で、３７℃で振盪培養し、６００　ｎｍでの吸光度（
Ａｓ　ｏ　ｏ　）が１．０になった時点で、クロラムフ
ェニコールを１００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加
し、さらに１５時間３７℃で振盪培養した。培養終了後
、遠心分離機（６，０００ｒｐｍ、１０分間）にかけて
集菌を行ない、次に菌体を２５％ショ糖、５０ｍＭ　　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）からなる等張援
衝液１８ｍ１に再懸濁した。これに、リゾチーム溶液（
５ｍｇ／ｍｌ　０．２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（
ｐＨ８，０））３．６ｍｌを加え、おだやかに混合し、
０℃で５分間おいたのち、０．２５ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ
８，０＞溶液７．　’ｌ　ｍ　ｌを加え、おだやかに混
合し、０℃で５分間おいた。その後、１０％ＳＯ３溶液
２．７　ｍ　ｌと５ＭＮａＣ１溶液８．１　ｍ　ｌとを
加えおだやかに混合し、０℃で一晩おいたのち、遠心分
離機（２０，ＯＯＯｒｐｍ、４５分間）にかけて粗溶菌
液（ｃｌｅａｒｅｄ　　１ｙｓａｔｅ）　〜３９　ｍ　
ｌを得た。この粗溶菌液に、ＲＮａ　ｓ　ｅＡ温溶液　
２０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１．１０ｔ１０．ＩＥ）２０μ
ｉを加えて３７℃にで１時間保温してＲＮＡを分解させ
たのち、フェノール抽出で除蛋白を行い、さらにセファ
ロース２Ｂのゲル口過にかけた。プラスミドＤＮＡを含
むボイドフラクションから、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、次にＤＮＡを塩化セシウム−臭化エチジウム溶
液（ＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）０．
３７５ｍｍ！、０．２５ＭＥＤＴＡ　（ｐ　Ｈ８，０）
０．３０ｍＪ、Ｈ２Ｏ６，４５ｍｆ、ＣｓＣ１）７，５
ｇ、、ＥｔＢｒ溶液（４ｍｇ／ｍｊり　０．３７５ｍｊ
り　テ平衡密度勾配遠心（６０，００Ｏｒｐｍ、１２時
間ンにかけた。そうすると、共有結合で閉鎖された環状
のプラスミドＤＮＡ　（ｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡ）は、遠沈
管中で長波長紫外線照射下において、線状のプラスミド
ＤＮＡ及び染色体のけい光帯の下にバンド状に見えてく
る。このｃｃｃ−ＤＮＡのバンドを分画し、Ｃ５ｃｌ水
溶液で飽和したイソプロパツールで抽出を行って、臭化
エチジウムを取り除いた後、１０ｔ１０．ＩＥ　　１６
に対して透析を行った。そして、透析内液から、ｃ　ｃ
　ｃ−ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ
１０．１Ｅ　　２ｍｌに熔解させてｐＨ５ｃｏｓのプラ
スミドＤＮＡ溶液を調製した。

（ｂ）　　　ＨＢ　　ｃｏｓの　　　び−ｐＨ３ｃｏｓ
　　１０Ｍｇを反応混液４００μｌで、１８５ユニツト
５ａｌｌと３７℃で２時間反応させて消化した。そして
、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を１ｏｔ１０．ＩＥ’７μｌ（〜１μｇ
／μｌ）に溶解させた。

次に、このＳａｌ’（で消化したＤＮＡ溶液１μｌ（〜
１μｇ）を、反応混液２５μ！で、２ユニツトの１（ｌ
ｅｎｏｖ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅ
ｓｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔｅｎｄに変えた。そし
て反応液を６５°Ｃで１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ
酵素を失活させた。

このＤＮＡ溶液１０ｕｌ　（０，４μｇ）と、ＢａｍＨ
Ｉリンカ−（ｄ　（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−’Ｔ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ））２μｇとを、反応混液２０μｌで６ユニットのＴ
４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結し
た。

そして、この反応液１０μｌを反応混液５０μｌで１５
ユニ・ノドのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後、フェノール抽出を
行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１
　Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ１（ｐＨ７゜５）溶液
２０μＥに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、ＡｐＹクローンを
得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドＤＮ
Ａの特性を調べて、ｐＨ８ｃｏｓの５ａｉｌサイトにＢ
ａｍＨＩリンカ−を挿入させたプラスミド（この場合、
ＢａｍＨＩサイトの両側に５ａｌｌサイトが再構成され
る）：ｐＨＢ　　ｃｏｓ　　（第、４Ａ図）を持つ大腸
菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体より、ｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＨ
ＢｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

（Ｃ）　　ＣＨｃｏｓの　　　び− コスミドベクターであるｐＬＨ（＋１２９）１０μｇを
反応混液１００μ６　Ｃ３０ｍＭ　　ＮａＣ１，１００
ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）、５
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，１）００ｕ／ｍ１ＢＳＡ）で、６
９ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（Ｔａｋａｒａ社
製）と３７℃で２時間反応させて消化した。そして、フ
ェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ　７μｌ　（〜１μｇ／
μｍ）に溶解させた。

次に、このＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μｌ（〜
１μｇ）を、反応混液２５μｌで、２ユニツトのＫｌｅ
ｎｏｖ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えた。そ
して反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ
酵素を失活させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌ（０，４μｇ）と、Ｃ１
ａ　Ｉリンカ−（ｄ　　（ｐＣ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−
Ｔ−Ｇ））２μｇとを、反応混液２０μｌで６ユニツト
の７４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連
結した。

そして、この反応液１０μｌを、反応混液５０μｌで１
５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５’）溶液２
０μｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μβで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｒクローンを
得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドＤＮ
Ａの特性を關べて、ｐＬＨ（＋１２９）のＥＣ０ＲＩ　
　サイトにＣ１ａＩリンカ−を挿入させたプラスミド（
この場合、Ｃ１ａＩサイトの両側にＥｃ　ｏＲＩ　　サ
イトが再構成される。）：ｐＣＨｃｏｓ　（第４Ａ図）
を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＣＨ
ｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＨ８ｏｓ２０．ｌＪｇを反応混液２００μｎ　（６０
ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（
ｐＨ７，４）　、７ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ、１）００ｕ／ｍｌ　ＢＳＡ）で、１）４ユニツト
の制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及び１９２ユニツトのＰｖ
ｕｌｒ　（Ｔａｋａｒａ社製）と３７℃で２時間反応さ
せて消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｃｏｓ及びＡｐ？、ｏｒｉを含むＤＮＡ
断片（２，５Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．１Ｅ　　８．５
μ！（〜ｌμｇ／μｍ）に溶解させた。

一方、ｐＨＢｃｏｓ　　２０μｇを反応混液２００ｐＨ
で、１）４ニー１−　ットの）（ｉｎｄｌＩ［及び１９
２ユニツトのＰｖｕＩＩと３７℃で２時間反応させて消
化したのち、０．８％聞製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、ｃｏｓを含むＤＮＡ断片（１，６Ｋｂｐ）を分
離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を
Ｉ　Ｏｔｌｏ、　ｌ　Ｅ６．Ｏμβ　（〜１μｇ／μｉ
）に熔解させた。

そして、ｐＣＨｃｏｓのｃｏｓ及びＡｐ　５Ｏｒｉを含
むＨｉｎｄＩ［／ＰｖｕＩ［断片のＤＮＡ溶液１μｌ（
〜１μｇ）と、ｐＨＢｃｏｓのｃｏｓを含むＨｉｎｄＩ
［／Ｐｖｕｌｌ断片のＤＮＡ溶液１μｍ（〜ｌμｇ）と
を、反応混液２０μｌで６ユニツトの７４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　　（ｐ
Ｈ７，５）溶液２０μｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０ｐＨで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｖクローンを
得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮ
Ａの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びＡｐ’、ｏｒｉを
有するプラスミド：ｐＤｃｏｓ　　（第４Ａ図）を持つ
大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１β中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＩ）ｃ
ｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

（ｅ）　　ＨＣ−７９ｃｍ’″の　　　び−コスミドベ
゛クターであるｐＨＣ−７９ＣＨｏｈｎ＆Ｃｏ　ｌ　１
　ｉｎｓ、Ｇｅｎｅ、土工、２９１　　（１９８０））
１０℃ｇを、反応混液１００μｉ〔５０ｍＭ　　ＮａＣ
１，６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）　、６
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．ＬＯＯｐｇ／ｍｌｌ　　ＢＳＡ）
で、１５ユニツトの制限酵素Ｃ１ａｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）と３７℃で２時間反
応させて消化した。

そして、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１ｏｔ１０．ＩＥ７μｌ　（〜
ｌμｇ／μＥ）に溶解させた。

一方、ｐＮＴ−３１）０℃ｇを反応混液２００ｔｔｌ　
（１００ｍ！ｖｊ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　　（ｐＨ８，４）、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２゜６
ｍＭ　　ＤＴＴ、１００μｇ／ｍＩｌ　ＢＳＡ）で、４
０ユニツトの制限酵素ＴａｑＩ　　（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と６５℃で２時間反
応させて消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、ｃ　ｍ’を含むＤＮＡ断片（０，７
９Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ３．０μ２　（〜１μ
ｇ／μｇに溶解させた。

そして、ｐＨＣ−７９をＣ１ａＩで消化したＤＮＡ熔液
（Ｉ！ＩＩＣ〜１ｐｇ）とｐＮＴ−３１のＣｍＹを含む
Ｔａｑ−Ｉ断片のＤＮＡ溶液ｌμＩｌ（〜１μｇ）とを
、反応混液２０μｌで６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガー
ゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後
、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、沈澱をＯｌＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ
７，５）溶液２０μｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μ２で大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ｃｍ　かつＡｐｙ
″クローンを得た。次いで、これらの゛クローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨＣ−７９のＣ１
ａ　Ｉサイトにｃｍ”を挿入させたプラスミド：ｐＨＣ
−Ｔ９／ｃｍＹ　（第４Ｂ図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＨＣ−
７９／ｃｒｎ”のプラスミドＤＮＡｔ−１ｌｌ製した。

ｐＨＣ−７９／ＣｍＹ″　１０μｇ反応混液１０Ｑｕｉ
ｔで、３５ユニツトのＨｉｎｄＩ［［と３７℃で２時間
反応させて消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白
後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１
０．１Ｂ　　７μｌ（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。

次に、このＨｉｎｄｌｌで消化したＤＮＡ溶液１μｌ（
〜１μｇ）を、反応混液２５μｌで、２ユニツトのＫｌ
ｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃ、ｏｈ
ｅｓｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えた
。そして反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎ
ｏｗ酵素を失活させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌ（〜０．４μｇ）を、反
応混液５０μｌで１５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ
と１２℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その後
フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７゜
５）溶液２０μｌに熔解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｒかつｃｍ”
ｌ”クローンを得た。そして、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨＣ−７９／ｃｍ
Ｙの）（ｉｎｄｕ［サイトを欠いたプラスミド：ｐＨＣ
−７９／Ｃｍ’″△（Ｈｔｎｄｌｕ）（第４Ｂ図）を持
つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＨＣ
−７９／Ｃｍ″ｒ′△（Ｈｉｎｄｌ［［）のプラスミド
ＤＮＡを調製した。

（ｇ）ｐＵＣ−８／ｃｍｒの作成及び調製ｐＨＣ−７９
／ｃｍＹ″へ（Ｈｉｎｄｌ［）２０μｇを、反応混液２
００μ／　（５０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４，２０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７゜５）、　　１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２．　１００μｇ／ｍ！！ＢＳＡ）で、
２２ユニツトの制限酵素ｐｓむＩ　（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反
応させて完全に消化した。そして、さらに反応混液５０
０１）１で、８０ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時
間反応させて完全に消化したのち、０．８％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、Ｃｍ”を含むＤＮＡ断片
（１，９Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ　　４．０μｉ
　（〜ｌμｌ／μｊ２）に熔解させた。

一方、ｐＵＣ−８ＣＪｅｆｆｒｅｙ　　Ｖｉｅｉｒａ＆
Ｊｏａｃｈｉｍ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ、エエ、
２５９　（１９８２））２０ｐｇを、反応混液２００μ
！で、６０ユニツトのＰＳｔｌと３７℃で２時間反応さ
せて完全に消化した。そして、さらに反応混液５００μ
！で２１５ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応
させて完全に消化したのち、０．８％調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて、Ａｐｒ、ｏｒｉを含むＤＮＡ断
片（２，７Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱をｔｏｔｌｏ、ＩＥ１４．０μ！
　（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。

そして、ｐＨＣ−７９／ｃｍｒ△（Ｈｉｎｄ■）のｃｍ
’ｌ”を含むＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１
μｌ（〜１μｇ）と、ｐＵＣ−８のＡｐｒ、ｏｒｉを含
むＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μｍ（〜ｌ
μｇ）とを、反応混液２０μｌで６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結し
た。その後、フェノール抽出をおこない、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐ　Ｈ７，５）溶液２０μｌに熔解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０ｐＨで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ｃｍ？かつＡｐ’
ｒ″クローンを得た。次いで、これらのクローン、のも
つプラスミドＤＮＡの特性を調べて、Ａｐ’、ｏｒｉ及
びｃｍ？’を有するプラスミド：ｐＵＣ−８／ｃｍ’　
　（第４Ｂ図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＵＣ
−８／ｃｍｊのプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＵＣ−８／ｃｍｒ　２０μｇを反応混液２００μｌで
、６０ユニツトのＥＣ０ＲＩと３７℃で３０分間反応さ
せて限定消化した。次で、フェノール抽出で除蛋白後、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を
、反応混液２００μｌで３５ユニツトのＰＳｔｔと３７
℃で２時間反応させて完全に消化した。そして、フェノ
ール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得
、沈澱をＬｏｔｌｏ、ＩＥ　　１０μｌ　（〜ｌｌ１ｇ
／μＥ）に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１，５μ
β（〜１．５μｇ）を、反応混液３０μ！〔３３ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ　　（ｐＨ７，９）、６６
ｍＭ酢酸カリ、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．０．５ｍＭＤ
ＴＴ、　　１００μｇ／ｍ１ＢｓＡＳ　０．１ｍＭｄＡ
ＴＰ、Ｏ，１ｍＭ　　　ｄＣＴＰ、０．１ｍＭ　　　ｄ
ＧＴＰ、０．１ｍＭ　　ｄＴＴＰ）で、５ユニツトのＴ
４−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ　−Ｌ社製）と、３７℃で
１５分間反応させて、ｃｏｈｅｓｌｖｅ　　ｅｎｄをｂ
ｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えたのち０．８％調製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、Ａｐｒ。

ｏｒｉ及びＣｍ”を含むＤＮＡ断片（３，８５Ｋｂｐ）
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。

そして、このＤＮＡ沈澱を反応混液５０μｉで１５ユニ
ツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反
応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）溶液２０μｌに
溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μβで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｒかつｃｍｍ
ヒフローン得た。そして、これらのクローンのもつプラ
スミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＵＣ−８／ｃｍ／？の
ＥＣ０ＲＩサイトとＰｓｔＩサイトの間のＤＮＡ断片（
０，７５Ｋｂｐ）を欠いたプラスミド：ｐＵＣ−８／ｃ
ｍＹΔ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）（第４Ｂ図）を持つ大
腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１７！中で増殖さ　　　
　゛せたのち、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製
して、（ｐＵＣ−８／ｃｍｌ”Δ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ
Ｉ）のプラスミドＤＮＡを調製した。

Ｅ）　Ｕ　Ｃ−８／　ｃ　ｍＴ″△ＣＥｃｏＲＩ／Ｐｓ
　ｔ　Ｉ）１０μｇを反応混液１００μ！で、１５０ユ
ニツトのＢａｍＨＩと３７℃、で２時間反応させて消化
した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、ＯＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０゜ＩＥ　　７
μｌ　（〜ｌμｇ／μＮ）に熔解させた。

次に、このＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μｌ（〜
１μｇ）を、反応混液２５μｌで、２ユニツトのＫｌｅ
ｎｏｖ酵素と２２℃で３００分間反応せて、ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えた。そ
して反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ
＃素を失活させた。

そして、この反応液１０μβを、反応混液５０μｌで１
５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
　　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）ｆ４液２０
μｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
’ｔ４−ｒンスホーメーションしたのち、Ａｐ　かつｃ
ｍ　　クローンを得た。そして、これらのクローンのも
つプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＵＣ−８／ｃｍ
？Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）のＢａｍＨＩサイトを欠
いたプラスミド：ｐＵＣ−８／ｃｍ′ｒへ（ＥｃｏＲＩ
／Ｐｓ　ｔ　Ｉ）へ（ＢａｍＨＩ）（第４Ｂ図）を持つ
大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）中で増殖させたのち
、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＵ　Ｃ−
８／　ｃ　ｍｒΔ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１）Δ（Ｂａｍ
ＨＩ）のプラスミドＤＮＡを調製した。　　　・ ｐＵＣ−８／ｃｍｌ”へ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ）
へ（ＢａｍＨＩ）１０＃ｇを反応混液１００．ｃｌ（２
０ｍＭ　　ＫＣＩ、６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８，０）、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　　ＤＴＴ、
１００μｇ／ｍ６　　ＢＳＡ）で、１２５ユニツトの制
限酵素Ｓｍａｆ　　（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で完全に消化した（ｂｌｕ
ｎｔ　　ｅｎｄ＞、そして、フェノール抽出で除蛋白後
、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０
．ＩＥ　　７μｍ　（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液０．４μｌ（〜０．４μｇ）と、
Ｈｉｎｄｌｌｒリンカ−Ｃｄ　　（＋）Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ））２μｇとを、反応混液２０μｌで
６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反
応させて連結した。

そして、この反応液１０μｌを、反応混液５０μｌで１
５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５’）溶液２０μ
ｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０ｔｔｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ
）をトラスホーメーションしたのち、Ａ　Ｉ）Ｙ’かつ
ｃｍｒクローンを得た。そして、これらのクローンのも
つプラスｌ”ＤＮＡの特性を調べて、ｐＵＣ−８／ｃｍ
？△（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ　　１）Δ（ＢａｍＨＩ）の
Ｓｍａ　ＩサイトにＨｉｎｄ■リンカ−を挿入させたプ
ラスミド：ｐＵＣ−１３／　ｃ　ｍＹ’Δ（Ｅｃｏ　　
ＲＩ／Ｐｓｔ　　Ｉ）Δ（ＢａｍＨＩ）／Ｈｉｎｄｌｌ
ｒ　（第４Ａ［ｆｆｌ及び第４Ｂｌｆｆｌ）を持つ大腸
菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＵＣ
−８／ｃｍｒΔ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ■）Δ（ＢａｍＨ
Ｉ）／Ｈｉ　ｎｄｎＩのプラスミドＤＮＡを調製した。

（ｋ）ｐＤｃ　ｏ　ｓ　　ｃｍｒ　　　び“　１ＰＤｃ
ｏｓ　　ＩＱμｇを反応混液１００μ！で、６０ユニツ
トのＨｉｎｄＩ［［と３７℃で２時間反応させて消化し
た。そして、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．ｌＥ　　７μ
ｌ（〜１μｇ／μｍ）に溶解させた。

一方、ｐＵＣ−１３／ｃｍＹ″Δ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ
　　［）Δ（ＢａｍＨｒ）／Ｈｉｎｄｌ［［２（ｌμｇ
を反応混液２００μｌで、２５０ユニツトのＨｉ　ｎｄ
Ｉ［［と３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち
、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｃ
ｍＹ’を含むＤＮＡ断片（１，１５Ｋｂｐ）を分離精製
して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０　
ｔｌｏ、ＩＥ　　４．０ｔｔｌ　（〜１μｇ／μｌ）に
溶解させた。

そして、ｐＤｃｏｓをＨｉｎｄｌｌｌで消化したＤＮＡ
溶液ｌμｌ（〜１．ｐｇ）と、ｐＵＣ−８／Ｃｍ　Δ（
ＥｃｏＲＩ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ）Δ（ＢａｍＨＩ）／Ｈｉｎ
ｄＩＩ［のｃｍ’を含む）（ｉｎｄｎＩ断片のＤＮＡ溶
液ｌμｌ（〜ｌμｇ）とを、反応混液２０μｌで６ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反
応させて連結した。その後、フェノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔ
ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）溶液２０μｌに
溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μ２で大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、ＡｐｒかつｃｍＹ
’クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を関ぺで、２個のｃｏｓ及び、Ａ
ｐｒ、ａｒｔ、ｃｍ、’を有するプラスミド：ｐＤｃｏ
ｓ／ｃｍｙ′　（第４Ａ図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃ
ｏｓ／ｃｒＨＹ′のプラスミドＤＮＡを調製した。

（１）　　ＨＣｃｏｓの　　　び− ｐＲＨ（−４４）１０μｋを反応混液１００μｌで、２
３ユニツトのＰｖｕｌｌと３７℃で２時間反応させて完
全に消化したのち、さらに反応混液２５０μｆで、７０
ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて完全
に消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳
動にかけて、ｃ。

Ｓ及びＡｐ？、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片（２，４８Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱トシテ得
、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ　　４．０ｔｔ１　（〜１μ
ｇ／μｍ）に溶解させた。

次に、このＤ　Ｎ、Ａ溶液１μｍ（〜１μｇ）を、反応
混液２５μｌで、２ユニツトのＫｌｅｎｏｖ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ　　ｅｎｄ
をｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えた。

そして反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏ
ｗ酵素を失活させた。

このＤＮＡ熔液ＬＯｐ１（０，４μｇ）と、ｃ１ａｌリ
ンカ−（ｄ　（ｐＣ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ））
２μｇとを、反応混液２０μｌで６ユニツトの７４−Ｄ
ＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結した。

そして、この反応液１０μβを、反応混液５０μｌで１
５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）溶液２０μβ
に溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、ＡｐＹ　クローン
を得た。そして、これらのクローンのもつプラスミドＤ
ＮＡの特性を調べてｐＲＨ（−４４）のｐｖｕｌサイト
とＢａｍＨＩサイトの間のＤＮＡ断片（１，７２Ｋｂｐ
）を欠き、その場所にＣ１ａＩリンカ−が挿入されたプ
ラスミド：ｐＨＣｃｏｓ　　（第４Ｃ図）を持つ大腸菌
を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＨＣ
ＣＯＳのプラスミドＤＮＡを調製した。

（ｍ）ｐＢ　　ＩＩＩＣｃｏｓの　　　びｐＨｃｃｏｓ
ｌＯμｇを反応混液１００μｌで、１００ユニツトのＨ
ｉｎｄｎＩと３７℃で２時間反応させて消化した。そし
て、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を１０ｔ１０．１Ｅ　　７μ！（〜１
μｇ／μｌ）に熔解させた。

次にこの）（ｉｎｄｌｌ［で消化したＤＮＡ溶液１μｌ
（〜１μｇ）を、反応混液２５μｌで、２ユニツトのＫ
ｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈ
ｅｓｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔｅｎｄに変えた。そ
して反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ
酵素を失活させた。

このＤＮＡ溶液１０μｌ（０，４μｇ）と、８ｇ１■リ
ンカ−（ｄ　　（ｐ　Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
）３２℃ｇとを、反応混液２０μｌで６ユニツトのＴ４
−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結した
。

そして、この反応液１０μＥを、反応混液５０μβで１
５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）溶液２０
μｌに溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１０ＩＩＪで
大腸菌（ＨＢＩＯＩ）をトランスホーメーションしたの
ち、Ａｐｒクローンを得た。そして、これらのクローン
のもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨｃｃｏｓ
のＨｉｎｄＩ［［サイトにＢｇｌＩ［リンカ−を挿入さ
せたプラスミド：ｐＢｇｌＩＩＣｃｏｓ　（第４Ｃ図）
を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）で増殖させたのち、
菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＢｇｌ
ＩＩＣｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

■ ｐＢＲ−３２７１’Ｏμｇを反応混液１００μ（１（６
０ｍＭ　　ＮａＣ１，６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　
（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　
　ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｊ！　　ＢＳＡ）で、５５ユ
ニツトの制限酵素Ａｖａ　ｌと３７℃で２時間反応させ
て消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．１Ｂ
　　７μｌ　（〜１μｇ／μｌ）に熔解させた。

次に、このＡｖａｌで消化したＤＮ−Ａ溶液１μｍ（〜
１μｇ）を、反応混液２５μ！で、２ユニツトのＫｌｅ
ｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔｅｎｄに変えた。そして
反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏ’ｗ酵
素を失活させた。

このＤＮＡ溶液１０１！（０，４μｇ）と、ＢａｍＨＩ
リンカ−（ｄ　　＜ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
））２μｇとを、反応混液２０μｌで６ユニツトの７４
−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結した
。その後、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得た。

このＤＮＡ沈澱を、反応混液６００μｌで１０００ユニ
ツトのＢａｍＨＩと３７℃で４時間反応させて消化した
のち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて
、Ａｐ（、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片（２，２２Ｋｂｐ）
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。

このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μｌで、６ユニツトの７
４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて
閉環化したのち、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　　（ｐＨ７，５）溶液２０μｌに溶解させた。

そして、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢ　　１
０１）をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｒクロ
ーンを得た。次で、これらのクローンのもつプラスミド
ＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２７のＢａｍＨＩサ
イトとＡｖａＩサイトの間のＤＮＡ断片（１，０５Ｋｂ
ｐ）を欠き、その場所にＢａｍＨＩリンカ−を挿入させ
たプラスミド：ｐＢＲ−３２７８ａｍＨＩ　　（第４Ｃ
図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＢＲ−
３２７８ａｍＨＩ　　のプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＢｇｌＩ［ｃｃｏｓ２０μｇを反応混液２００μ！で
、６５ユニツトのＰｓｔｌと３７℃で２時間反応させて
完全に消化したのち、さらに反応混液５００μｊ２で７
７ユニツトのＣ１ａｌと３７℃で２時間反応させて完全
に消化したの・ち、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｃｏｓを含むＤＮＡ断片（０，９４Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得
、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ　　５．０μβ　（〜ｌμｇ
／μＩｔ）に溶解させた。

一方、ｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ　　２０．ｌＪｇを反
応混液２００μｌで、７０ユニツトのＰｓｔｌと３７℃
で２時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応混
液５００μβで８５ユニツトのＣ１ａＩと３７℃で２時
間反応させて完全に消化したのち、０．８％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片
（１，４５Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ　　９．０μ
ｌ（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。

そして、ｐＢｇｌＩＩｃｃｏｓのｃｏｓを含むＰｓｔＩ
／Ｃ１ａＩ断片のＤＮＡ溶液１ａｌｌ（〜４μｇ）と、
ｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ　　のｏｒｉを含むＰｓｔＩ
／Ｃ１ａＩ断片のＤＮＡ溶液１μｍ（〜１μｇ）とを、
反応混液２０μｌで６ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ
と１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、
フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ
７，５）溶液２０μβに溶解させた。

次に、このＤＮＡｆ４液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ
）をトランスホーメーションしたのち、Ａｐ？クローン
を得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミドＤＮ
Ａの特性を調べて、ｃｏｓ及び、Ａｐｒ、ｏｒｉを有す
るプラスミド：ｐＢＲ−３２７／ＢｇｌＩ［Ｃｃｏｓ　
（第４Ａ図及び第４Ｃ図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＢＲ−
３２７／Ｂｇ　Ｉ　ＵＣｃ　ｏ　ｓのプラスミドＤＮＡ
を調製した。

ｐ　ｐ　ｃ　ｏ　ｓ　／　ｃ　ｍ？　２０１）　ｇを反
応混液２００μｌで、３７ユニツトのＣ１ａｌと３７℃
で２時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応混
液５００．ｃｒＪで、１）０ニー’−ソトのＢａｍＨＩ
と３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、０．
８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のｃ
ｏｓ及びＣｆｆ１’を含むＤＮＡ断片（１，５Ｋｂｐ）
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を１０ｔ１０．ＩＥ　　４．０μｌ　（〜１μｇ／μ
ｍ）に溶解させた。

一方、ｐＢＲ−３２７／ＢｇｌＩＩＣｃｏｓ２０μｇを
反応混液２００μβで、８０ユニツトのＣ１ａｌと３７
℃で２時間反応させて完全に消化したのち、さらに反応
混液５００μ！で、２４０ユニットのＢａｍＨＩと３７
°Ｃで２時間反応させて完全に消化したのち、０．８％
調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｃｏｓ及びＡ
ｐ’、ｏｒｉを合むＤＮＡＩ＃ｉ片（２゜０Ｋｂｐ）を
分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ１０、］、Ｅ　　１２μｌ　（〜１μｇ／μｌ
）に溶解させた。

そして、ｐＤｃｏｓ／ｃｍｒの２個のｃｏｓ及びｃｍγ
を含むＣ１ａｌ／ＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μｌ（
〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２７／ＢｇｌｌｌＣｃｏｓの
ｃｏｓおよびＡｐＹ、ｏｒｉを含むＣ１ａｌ／ＢａｍＨ
Ｉ断片のＤＮＡ溶液１μ！（〜１μｇ）とを、反応混液
２０μ２で６ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃
で１７．５時間反応させて連結した。その後、フェノー
ル抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を０．ＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）溶
液２０μｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、ＡｐＹ、ｃｍＹク
ローンを得た。次いでこれらのクローンのもつプラスミ
ドＤＮＡの特性を調べて、３個のｃｏｓ及びＡｐＹ　、
　　ｏ　ｒ　ｉ、　　Ｃｍｙ″を有するプラスミド：　
ｐ　Ｔ　ｃ　ｏ　ｓ　　Ａ　ｐ？　／　ｏ　ｒ　ｉ　／
　ｃｍＶ　　（第４Ａ図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ＩＩｌ中で増殖させたの
ち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＴｃｏｓ
Ａｐｒ　１０ｒ　ｉ／ｃｍｒプラスミドＤＮＡを調製し
た。

（ｑ）　　　　５ＶＯＩＯｎｅｏ　　の　　およびｐＡ
ｏ　　４３　（Ｏｋａ、Ｓｕｇｉｓａｋｉ＆Ｔａｋａｎ
ａｍｉ、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、１４７゜２１４　（１
９８１））２０μｇを反応混液２００ｐｌ　Ｃ６０ｍＭ
　　ＮａＣ１，６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　　（ｐ
Ｈ８，０）、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　　ＤＴ
Ｔ、１）００ｕ／ｍｉ！　　ＢＳＡ）で、１５０ユニツ
トの制限酵素ＡＶａｌｌ　（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ
　　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反応させて
消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、ｎｅσとを含むＤＮＡ断片（１，２４Ｋｂｌ
））を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得
、沈澱を１０ｔ１０、ＩＥ５μＮ（〜ｌ１）ｇ／μｌ）
に溶解させた。

このＤＮＡ溶液２μｌ（〜２μｇ）を、反応混液５０μ
ｌで、４ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分
間反応させて、ｃｏ、ｈｅｓｉｖａｅｎｄをｂｌｕｎｔ
　　ｅｎｄに変えた。そして、フェノール抽出で除蛋白
後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱をｘｏｔｌ
ｏ、ｌＥ　　１．５ｐｌ（〜１μｇ／μｌ）に溶解させ
た。

一方、ｐｓＶＯｌｏ（ｙＣＶＸ（Ｂｒａｉｎ　　５ｅｅ
ｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、。

土工、２４２７　　（１９８３））由来のポリリンカー
を持ったｐｓＶＯｌ　（Ｔｊａｎ、Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ。

Ｓ、Ａ、、エエ、６４９１　　（１９８０））の類縁プ
ラスミド）　１０μｇを、反応混液１００μｌで１２９
ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化
したのち、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．１Ｅ７μｍ（〜ＩＭ
ｇ／μｌ）に溶解させた。

このＤＮＡ溶液２μｌ（〜２μｇ）を、反応混液５０μ
！で、４ユニツトの）（ｌｅｎｑｗ酵素と２２℃で３０
分間反応させて、ｃｏｈｅｓ　１ｖｅｅｎｄ−’５−ｂ
ｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えた。そして、フェノール抽出
で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を
１０ｔ１０．１Ｅ　　１．５μ！（〜１μｇ／μｌ）に
溶解させた。

次に、ｐＡＯ４３のｎ　ｅ　Ｏ？を含むＤＮＡ断片をに
１ｅｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μｌ（〜１μｇ
）と、ｐｓＶｏ　１０をＢａｍＨＩで消化し、ｌ（ｌｅ
ｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μｌ（〜１μｇ）と
を、反応液２０μｌで６ユニツトの７４−ＤＮＡリガー
ゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後
、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、その沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　
　（ｐＨ７，５）溶液２０μｌに熔解させた。

そして、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢＩＯＩ
）をトランスホーメーションしたのち、ＡｐｒかつＫｍ
ｒ（ｎ　ｅ　ｏｒ　）クローンを得た。

次いでこれらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性
を調べてｐｓＶｏ　１０のｔ３ａｍＨＩサイトにｎ　ｅ
　ｏｒを挿入させたプラスミド：ｐＳＶＯ１０／ｎｅｏ
ｒ　（第４Ａ図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）中で、増殖させたの
ち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＳＶＯ
ＩＯ／ｎｅｏｒのプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＴｃｏｓ　　Ａｐｒ　１０ｒｉ／ｃｍｒ　ＩＱμｇを
反応混液１００μ！で、２７ユニツトのＥｃ。

ＲＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。そし
て、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得１．沈澱を１０ｔ１０゜ＩＥ　　７μｌ　（
〜１μｇ／μｍ）に溶解させた。

一方、Ｅ）ＳＶＯ１０／ｎｅｏｒ　２０℃ｇを反応混液
２００μｌで、３２５ユニツトのＥｃ　ｏＲ１と３７℃
で２時間反応させて完全に消化したのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｎ　ｅ　ｏｙを含
むＤＮＡ断片（１，３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０゜ＩＥ　
　５゜０μＩｌ（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。

そして、ｐＴｃｏｓＡｐｌ’　１０ｒｉ／ｃｍｒをＥｃ
ｏ　　Ｒ１で限定消化したＤＮＡ溶液１ｐｌ（〜Ｌｃｒ
ｇ）と、ｐＳＶＯＩＯ／ｎｅｏ）′のｎ　ｅ　Ｏｒを含
むＥＣ０ＲＩ断片のＤＮＡ溶液ｌμｌ　（〜１μｇ）と
を、反応混液２０μｌで６ユニソトのＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７
，５）溶液２０ｐｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｒ、ｃｍｒか
つＫｍＹ”　　（ｎｅｏＹ’）クローンを得た。次いで
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を関ぺ
て、ｐＴｃ　ｏ　５ＡｐＹ　１０　ｒｉ／ｃｍＴ’のＥ
ＣＯＲＩ　　サイトにｎ　ｅ　ｏ７’が挿入されたプラ
スミド：　ｐＴｃ　ｏ　ｓＡｐ”　１０　ｒ　ｉ／　ｃ
　ｍγ／ｎｅｏｒ（第１図、第４Ａ図）を持つ大腸菌を
得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微工研菌第Ｐ７８８８（ＦＥＲＭＰ−７８８８）
Ｊとして寄託されている。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１）中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＴｃｏ
ｓＡｐｒ１０ｒｉ／ｃｍ’／ｎｅｏＴのプラスミドＤＮ
Ａを調製した。

実施例２．９工上土土人ア二Ｚ上り上／ＴＫｌ且ｐＴＫ
−４（Ｉｓｈｉｕｒａ、Ｍ、、ｅｔａｌ。

Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ、２，６０７　　（１９
８２））１０℃ｇを反応混液１００μ２で、３．０ユニ
ツトのＰｖｕＩｒと３７℃で３０分間反応させて限定消
化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、６．４３　Ｋ　ｂ　ｐの長さのＤＮＡ断片を分
離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を
１０ｔ１０．１Ｅ　　３μｌ（〜１μｇ／μｌ）に溶解
させた。

次に、このＤＮＡ溶液０．４μｌ　（〜０．４μｇ）と
、１３ａｍＨＩリンカー（ｄ　　（［）Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ））２μｇとを、反応混液２０μｌで
６ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反
応させて連結した。

そして、この反応液１０μｌを、反応混液５０μｉで１
５ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５
時間反応させて閉環化した。その後フェノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈′澱を０．１
Ｍ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ１（ｐＨ７，５）溶液２０μ
Ｅに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μｌで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐｒ　かつＴｃ
″クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ−４のｏｒｉＩ
！：ＴＫとの間のＰｖｕＩＩサイトに１３ａｍＨＴリン
カーを挿入させたプラスミド：ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ
　　（第５図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴＫ−４
／ＢａｍＨＩのプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ　　１０μｇを反応混液１００
μ＃で９ユニツトのＢａｍＨＩと３７°Ｃで３０分間反
応させて限定消化したのち、フェノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得た。

このエタノール沈澱を反応混液１００μＥで１５ユニツ
トのＰｖｕ■と３７℃で２時間反応させて完全に消化し
たのち、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱をＬｏｔｌｏ、１．Ｅ　　３μｌ（〜
１μｇ／μＩｌ）に溶解させた。

次に、このＢａｍＨＩで限定消化し、さらにＰｖｕｆｆ
で消化したＤＮＡ溶液Ｌｐｌ　（〜ｌμｇ）を、反応混
液２５μｌで２ユニツトのＫｌｅｎ。

Ｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖ
ｅ　　ｅｎｄをｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄに変えたのち、０
．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ａｒｔ
及びＡｐｒ、ＴＫを含むＤＮＡ断片（４，６７Ｋｂｐ）
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。

このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μｌで６ユニツトの７４
−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉
環化したのち（この場合、ＢａｍＨＩサイトが再構成さ
れる）、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱をＯｌＬＭ　　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＩ　
　（ｐＨ７，５）溶液２０μｌに溶解させた。

そして、このＤＮＡ溶液１０ｔｔｌで、大腸菌（ＨＢ　
１０１）をトランスホーメーションしたのち、７１、ｐ
Ｖ″かつＴｃ　　クローンを得た。次いでこれらのクロ
ーンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ−
４／ＢａｍＨＩのＰｖｕｌｌサイトとＢａｍＨＩサイト
（ＴＣＹ上）の間のＤＮＡ断片（１，７６Ｋｂｐ）を欠
いたプラスミド：ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ
　　（第５図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１β中で増殖させたのち
、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴＫ
−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩのプラスミドＤＮＡを調
製した。

ｐＴｃｏｓＡｐｒ　１０ｒ　ｉ／ａｍ？”／ｎｅｏｒ１
０μｇを反応混液１００μｌで６０ユニツトのＢａｍＨ
Ｉと３７℃で２時間反応さセて消化した。

そして、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０．ＩＥ７μｍ　（〜
１μｇ／μｍ）に溶解させた。　一方、ｐＴＫ−４／Ｂ
ａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ　　２０．ｌｊｇを反応混液２０
０μｌで２４０ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間
反応させて完全に消化したのち、０．８％鋼製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、ＴＫを含むＤＮＡ断片（２
，０Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を１０　ｔｌｏ、Ｉ　Ｅ６．ＯμＥ（〜
工μｇ／μｌ）に溶解させた。

そして、ｐＴｃ　ｏ　５Ａｐｌ’　１０　ｒ　ｉ／ｃｍ
Ｙ／ｎ　ｅ　ｏｒをＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１
μＩｌ　（〜１μｇ）と、ｐ　ＴＫ　−４／Ｂ　ａ　ｍ
ＨＩ　／ＢａｍＨｒのＴＫを含むＢａｍＨｒ断片のＤＮ
Ａ溶液１μｌ（〜ｌμｇ）とを、反応混液２０μｌで６
ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて連結した。その後、フェノール抽出を行い
、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　
　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣ：ｌ　　（ｐＨ７，５）　ｆ４液２
０μｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液１０μβで大腸菌（ＨＢｌｏｌ）
をトランスホーメーションしたのち、Ａｐ’：ｃｍｒか
つＫｍヒ（ｎｅｏｒ）クローンを得た。次いでこれらの
クローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴ
ｃｏｓＡｐど／　ｏ　ｒ　ｉ／ｃｍｒ／ｎｅｏｒのＢａ
ｍＨＩサイトにＴＫが挿入されたプラスミド：ｐＴｃｏ
ｓＡｐＹ’　１０ｒｉ／ＴＫ／ｃｍｒ／ｎｅｏｒ　　（
２ＢａｍＨＩ）（第５図）を持つ大腸菌を得た。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１ｉ！中で増殖させたの
ち、菌体よりｃ　ｃ　ｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴ
ｃ　ｏ　５Ａｐｒ１０　ｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍ”／ｎｅｏ
Ｙ（２ＢａｍＨＩ）のプラスミドＤＮＡを調製した。

ｐＴｃｏｓＡｐＹｌｏｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍ’／ｎｅｏ’
　（２ＢａｍＨＩ）１０ＩＩｇを反応混液１００ｐｌで
、１４ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応さ
せて限定消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後
、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ１０
．１Ｅ７μＮ　（〜１μｇ／μＮ）に溶解させた。

次に、このＢ　ａ　ｍ　ＨＩで限定消化したＤＮＡ溶液
１μ！（〜１μｇ）を、反応混液２５μ！で、２ユニツ
トの１（ｌｅｎｏｖ酵素と２２℃で３０分間反応させて
、ｃｏｈｅｓｉｖｅ　　ｅｎｄをｂｔｕｎｔ　　ｅｎｄ
に変えたのち、０．８％ｍ製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、３個のｃｏｓ及びＡｐｒ　、ｏｒｉ、ＴＫ、
ｃｍ’？、ｎｅｏ”を含むＤＮＡ断片（６，９３Ｋｂｐ
）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た
。

このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μｌで、６ユニツトの７
４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて
閉環化したのち、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ　　Ｔｒｔｓ−Ｍ
ＣＩ　　（ｐＨ７，５）溶液２０μｌに溶解させた。

そして、このＤ　Ｎ　Ａ　ｆ４液１０μβで大腸菌（Ｈ
ＢＩＯＩ）をトランスホーメーションしたのち、ＡｐＹ
、ｃｍｒかつＫｍｒ　（ｎｅｏｒ）クローンを得た。次
で、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を
調べて、ｐＴｃｏｓＡｐｒ／。

ｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍｒ　／ｎｅ　ｏ）’　　（２Ｂａｍ
ＨＩ）のＣｍ？　とＴＫとの間にあるＢａｍＨ１サイト
を欠いたプラスミド：ｐＴｃｏｓＡｐ”１０ｒ　ｉ／Ｔ
Ｋ／ｃｍＹ／ｎｅ　ｏｒ　　（第３．５図）を持つ大腸
菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に［微工研菌第７８８７（ＦＥＲＭＰ−７８８７
）Ｊとして寄託されている。

この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地ｌｌ中で増殖させたのち
、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＴｃｏｓＡ
ｐＹ１０ｒｉ／ＴＫ／ｃｍｙ″／ｎｅ　ｏ”のプラスミ
ドＤＮＡを調製した。

ｐＢＲ−３２２の塩基配列を持つ、ヘルペスシンプレツ
クウィルス１型（Ｈ３Ｖ−１）のチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子の組み換え体を移入したマウスＬ細胞（Ｌｔ
ｋ−（Ｈ３Ｖ−ＩＴＫ　　））は、１０％仔牛血清を添
加したイーグルＭＥＭで培養し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　
　ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ（１００ｍｍ−プレート９枚、
〜１０７ＣｅＩＩｓ／プレート）とし、ＰＢＳ　　（１
３７ｍＭＮａＣ１，３’ｍＭ　　　ＫＣＩ、　　８ｍＭ
　　　Ｎａ２　ＨＰＯ４，１ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４）で
２度洗ったのち、可溶化剤〔１００μｇ／ｍｌ　　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅＫ、ｊ、５％ＳＤＳ、　　１５０ｍＭ
　　　ＮａＣ１゜１０ｍＭ　　　ＥＤＴＡ、　　１０ｍ
Ｍ　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５））をプレ
ート当り１．　Ｏｍ　Ｎ加え、６５℃で１５〜３０分間
保温して可溶化した。この可溶化物は５０ｍｊ！容量の
遠沈管に移し、さらに３７℃で一晩保温し、途中、Ｐｒ
ｏｔｉｎａｓｅＫをさらに１００μｇ／ｍβ添加した。

反応後、等量のトリス緩衝液で飽和したフェノールでお
だやかに２度抽出し、水層を５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　　（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１
０ｍＭＮａｃｌからなる透析緩衝液３１に対して４回透
析を行った。透析内液は、５０μｇ　／　ｍ　１のＤＮ
ａｓｅ−ｆｒｅｅ　　ＲＮａｓｅＡを加えて３７℃で３
時間保温してＲＮＡを分解した。反応後、等量のフェノ
ール：クロロホルム混液で２度おだやかに抽出し゛、水
層を１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　　（ｐＨ８，０）
、１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる水溶液（ＴＥ）３ｊｌ！
に対して９回透析して、精製ＤＮＡ溶液５０ｍｊ２を得
た。ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍと２８０ｎｍでの吸光度（
ＯＤ）は、１０倍希釈でそれぞれ０．６６７．　０．３
６３　　（ＯＤ２　ｓ　。

１０Ｄ２６０＝Ｏ８５４４）であり、ＤＮＡの濃度は０
．６６７Ｘ０．０５０　（μｇ／ｌ０Ｄ）ｘｌ　０＝０
、３３４μｇ／μｌであった。

（ｂ）　　　　〜４５Ｋｂ　　の゛ツムＤＮＡの゛精製
したゲノムＤＮＡ溶液５．９８ｒｒｌ（２ｍｇ）を、反
応混液２９．９６ｍｊ！　（５０ｍＭ　　ＮａＣ１゜１
０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐ　Ｈ７，５）
　、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００μｇ／ｍｊ！Ｂ
ＳＡ）で１５．６ユニ７トのＳａｕ　　３Ａ　（Ｎｅｗ
　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｌｏｌａｂｓ社製）と３７℃
で１時間反応させて限定消化したのち、０．５　Ｍ　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ（ｐＨ８，０）溶液を１．３　ｍ−Ｊ加え
、等量ノドリス援所液飽和フェノールで２度おだやかに
抽出した。

そして水層をセカンダリ−ブタノールでｌＱｍｊ！まで
濃縮したのち、３．０　Ｍ酢酸ナトリウム１．１ｍｇと
エタノール２０ｍｇを加え、エタノール沈澱としてゲノ
ムＤＮＡを得、７０％エタノールで洗ったのち水流ポン
プにて乾燥を行い、エタノール沈澱をＴ　Ｅ　２　ｍ　
ｌに溶解させた。

次に、このＤＮＡ溶液３００μ２を５〜２５％シヨ糖密
度勾配遠心（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　（ｐＨ
７，６）　、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　ベックマン５Ｗ２
８　；２０．００Ｏｒｐｍ、９時間、２０℃〕にかけて
３０滴ごとに分画した。各分画２０μｌを０．４％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ長さを測定し、３５〜４５Ｋ
ｂｐの大きさのＤＮＡ分画を集めたのち、ＴＥ３ｊ！に
対して３回透析を行った。そして透析内液をフェノール
抽出後、水層をセカンダリ−ブタノールで濃縮し、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱をＴＥｌｍｊｌに溶
解させて、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ溶液を得た
。ＤＮＡ溶液の０Ｄ２６ｏ及びＯＤ２ｇｏは５０倍希釈
でそれぞれ０．２１６．０．１）２　（ＯＤ２ａ　ｏ　
１０Ｄ２　ｅ　ｏ　＝０．５１９）であり、ＤＮＡの濃
度は０．２１６Ｘ０．０５０　　（μｇ／ｌ０Ｄ）ｘ５
０＝０．５４μｇ／μｌであった。

（Ｃ）　　コスミドベクターＤＮＡの一製ｐＴｃｏｓＡ
ｐｒ　１０ｒｉ／ｃｍＶ”／ｎｅｏＷ４０μｇを反応混
液４００μｌで８０ユニツトのＣ１ａ　Ｉと３７℃で２
時間反応させて消化した。

その後、フェノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱をＬｏｔｌｏ、ＩＥ１００μ２に溶解
させた。

このＣＩａＩで消化したＤＮＡ溶液９５　ｐ、１を、反
応混液５００ｐｊ！　（５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
　　（ｐＨ９，０）、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，０．１ｍ
ＭＺｎＣｌ２．１ｍＭ　　スペルジミン〕で、６ユニツ
トのホスファターゼ（Ｃａｌｆ　　１ｎｔｅｓｔｉｎａ
ｌ　　ａｌｋａｌｉｎｅ　　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）と、３
７℃で１５分間、５６℃で１５分間反応後、さらに６ユ
ニツトのホスファターゼを加え、３７℃で１５分間、続
いて５６℃で１５分間反応させて、Ｃ１ａｌの切断片を
不活化した。

その後、Ｈ２０４００ｔｔｌ、ＳＴＥ　（１００ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）　、ＬＭ　　ＮａＣ
１゜１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）　　ＩＱＱμｊ！Ｓ　ｔｏ
％５ＤＳ５０μＥを加え、６８℃で１５分間保温してホ
スファターゼを失活させた。そして、フェノール抽出で
除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱をＬ
ｏｔｌｏ、ＩＥ　　３０μｌに溶解した。

次に、このＣ１ａｌで消化し、ホスファターゼで不活化
したＤＮＡ溶液３０μｌを、反応混液５００μｍ２で、
１７６ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させ
て消化した。そして、フェノール抽出で除蛋白後、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱をＬｏｔｌｏ、ＩＥ
　　３０μ２に溶解させて、コスミドベクターＤＮＡ溶
液を得た（０゜６９μｇ／μｌ）。

（ｂ）で調製した３５〜４５Ｋｂｐのゲノム溶液２．６
１μｍ　（１，４μｇ）と、（ｃ）で開裂したコスミド
ベクターＤＮＡ０．８６μｌ　（０，５９μｇ）とを、
反応混液１０μｌで５．９ユニツトの７４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。反応
終了後、反応液は４℃で保存した。

大腸菌ＢＨＢ２６９０をＮＺＹ培地（１％ＮＺａｍｉｎ
ｅ、０．５％酵母エキス、０．５％　ＮａＣ１，０，２
％　ＭｇＣｌ２　・６Ｈ２０，ｐＨ７，５）１００ｍｊ
！で一晩培養した液のＯＤｓ　ｏ　ｏを測定後、あらか
じめ３２℃に保温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｆ　（
２Ｎフラスコ中）に最初の０Ｄｓｏｏが０．０２５にな
るように菌を接種し、３２℃で振盪培養を開始した。そ
して、０Ｄ６ｏｏが０゜３になった時点で（培養開始か
ら２時間４０分後）、４５℃で１５分間おきプロファー
ジの誘導を行った。その後、培養温度を３８〜３９℃に
変え、さらに３時間激しく振盪培養した（培養液の少量
にクロロホルムを一滴滴下することによって誘導の検査
をした）。

培養終了後、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機に
かけて集菌を行い、菌体を２０ｍＭ　　Ｔｒ　　１ｓ−
ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

５ｍＭβ−メルカプトエタノールからなる緩衝液３、６
　ｍ　ｌに懸濁させた。そして、４℃以下で超音波処理
（最大出力で５秒間×２０回）を行ったのち、２０．０
０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけて（４℃）、上
澄液〜３ｍＪを得た。

次に、上澄み液３ｍｌに等量の上記緩衝液とパッケージ
ング緩衝液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）　、５０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭプトレシン、２
０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．３０ｍＭＡＴＰ、３０ｍＭβ−
メルカプトエタノール〕０゜５ｍｆを加えたのち、１５
ｐｌづつ１．５　ｍ　Ｉｔのエツペンドルフチェーブに
分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−７０℃で保存し
た。

大腸菌２６８８を、ＮＺＹ培地１０９ｍｍ！で一晩培養
した液の００６　ｏ　ｏを測定したのち、あらかじめ３
２℃に保温しておいたＮＺＹ培地５００ｍＡ（２１フラ
スコ中）に最初のＯＤｅ　ｏ　ｏが０゜０２５になるよ
うに菌を接種し、３２℃で振盪培養を開始した。そして
、０Ｄ６ｏｏが０．３になった時点で（培養開始から２
時間４０分後）、４５℃で１５分間おきプロファージの
誘導を行った。

その後、培養温度を３８〜３９℃に変え、さらに３時間
激しく振盪培養した（培養液の少量にクロロホルムを一
滴、滴下することによって誘導の検査をした。） 培養終了後、６．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離機に
かけて集菌を行い、菌体をショ糖溶液〔１０％ショ糖、
５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）
１３ｍｊ！に懸濁させたのち、Ｑ、　５　ｍ　ｌづつエ
ツペンドルフチューブ６本にとり、この各々のチューブ
にリゾチーム溶液（２ｍｇ／ｎｕ、０゜２５Ｍ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０））２５μｌを加え（４
℃）、おだやかに混合し、すばやく液体窒素中にて凍結
させた。

次に、チューブを氷上において抽出物を融解させたのち
、各チューブにパンケージング緩衝液２５μｌを加えて
混合した。そして、各抽出物を一緒にして、２１．００
Ｏｒｐｍで１時間（４℃）遠心分離機にかけて上澄液を
得、これの１０ｐｌづつをｌ、　５　ｍ　ｌのエッペン
ドルフチューブに分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、
−７０℃で保存した。

（ｆ）　　　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏパッケージング−７０
℃に保存しておいたＢＨＢ２６９０とＢＨＢ２６８８の
菌体抽出液を氷上におき、まず先に融解するＢＨＢ２６
８８の抽出液をＢＨＢＺ６９０の抽出液に加えておだや
かに混合した。はぼ全部融解したところで、（ｄ）で調
製した組み換え体ＤＮＡ溶液２．５μ６（０，５μｇ）
を加えてよ（混合したのち、室温で１時間反応させて１
ｎｖｉｔｒｏパツケージングを行った。

反応終了後、３Ｍ溶液（０，５８％ＮａＣ１，０゜２％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ，２０，５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−
ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）０．０１％ゲラチン〕　１ｍ
ｌとクロロホルム−滴を加えて混合した。そして、エッ
ペンドルフチューブを机上遠心機に３０秒間かけて、上
澄液を形質導入ファージ粒子溶液として得た。

（ｇ）　　ＭＪ！ｔｊ　　　びプレー−ン゛大腸菌ＨＢ
ＩＯＩのＬ−ブロス（マルトース０゜４％添加）で−晩
培養した液２００μｌを机上遠心機にかけて集菌を行い
、その菌体を１０ｍＭＭｇＣ１２溶液１００μｌに再懸
濁した。次に、この菌体懸濁液１００μｌに３Ｍ溶液で
１０倍希釈した形質導入ファージ粒子溶液１００μｌを
加え、３７℃で１５分間保温して形質導入を行ったのち
、さらにＬ−ブロス１．ｌ　ｍ　ｌを加え３７℃で４５
分間振盪培養した。そして、この菌体懸濁液を１００μ
ｉずつアンピシリン２０μｇ　／　ｍ　ｌ含有する１０
０ｍｍのし一プレートに塗布し、プレートを３７℃で一
晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてＬ−ブ
ロス（アンピシリン２０　　　μｇ　／　ｍ　Ｉｌ含有
）で増殖させた。また、プレート当たりのコロニー数は
２０〜１００個であった。

（ｇ）で得られたアンピシリン耐性コロニー（トランス
ホーマント）２０個を、Ｌ−ブロス（アンピシリン２０
μｇ　／　ｍ　ｌ含有）２ｍｌで一晩培養したのち、各
培養液１．５　ｍ　ｌのエツペンドルフチューブにとり
、机上遠心機かけて集菌した。これらの菌体を溶液ＩＣ
５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　（
ｐＨ８，０）　、１０ｍＭＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｊ！リ
ゾチーム）１００ｕＪに再懸濁したのち、室温で５分間
おいた。次に、溶液ＩＩ　（０，２Ｎ　　ＮａＯＨ，１
％５ＤＳ）２００μｌを加えておだやかに混合し、氷上
に５分間おいたのち、溶液Ｉ［（５Ｍ酢酸カリ　（ｐＨ
４，８））１５０μβを加えておだやかに混合し、氷上
に５分間おいた。そして、エツベンドルフチューブを机
上遠心機にかけて上澄液を得、これに２倍容量のエタノ
ールを加えて、プラスミドＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得た。

各トランスホーマントのもつプラス゛ミドＤＮＡを少量
の１０ｔ１０．１Ｅに溶解させたのち、サイズマーカー
ＤＮＡ　（ラムダＤＮＡ：４８Ｋｂｐ。

ラムダＤＮＡをＨｉ　ｎｄｎ［で消化したもの：２２゜
３Ｋｂｐ；　　９．５Ｋｂｐ）と−緒に、０．４％アガ
ロースゲル電気泳動にかけたところ、アンピシリン耐性
コロニー２０個のうち、すべてが２２．３　Ｋ　ｂｐ〜
４８Ｋｂｐの大きさのところにプラスミドＤＮＡの存在
が認められた。

この段階では、組み換え体ＤＮＡはプラスミドとして存
在して、おり、外来ＤＮＡの遺伝子バンクはプラスミド
ＤＮＡとして製造されている。

（ｉ）　　ｆｌ　　　びｉｎ　　ｖｉｖｏバ・・　−ジ
ン久 大腸菌ＨＢＩＯＩにラムダファージが溶原化し七 ている菌株ＬＮ９００　（ＨＢＩＯＩ　（λＣＩ　　。

ＴｃＹ″）＝３０℃ではラムダファージは溶原化してい
るが、３７℃ではラムダファージは溶菌化サイクルに移
行する。またテトラサイタリン耐性である。〕を〕Ｌ−
ブロスマルトース０．４％添加）にて３０℃で一晩培養
した。その培養液２００μｉを机上遠心機にかけて集菌
を行い、その菌体を１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２溶液１００
ＩＩＮに再懸濁した０次に、この菌体懸濁液１００μｌ
に、（ｆ）で調製した形質導入ファージ粒子溶液（３Ｍ
溶液で１０倍希釈）１００μｌを加え、３０℃で１５分
間保温して形質導入を行ったのち、さらにＬ−ブロス１
．１　ｍ　Ｉｔを加え３０℃で４５分間振盪培養した。

その後、最終濃度が２０℃ｇ　／　ｍ　ｌになるように
アンピシリン及びクロラムフェニコールを添加し、全液
量２ｍＪ　（Ｌ−ブロス：マルトース０、４％添加）で
３０℃において一晩培養した。

次に、この培養液２５μｌを、あらかじめ３０℃に保温
しておいたし一ブロス（マルトース０．４％、アンピシ
リン２０μｇ　／　ｍ　１　、クロラムフェニコール２
０μｇ　／　ｍ　ｌ添加）５ｍｌに接種し、３０℃で振
盪培養を開始した。そして、ＯＤ６　。

Ｏが０．３になった時点で（培養開始から３時間後）４
０℃で１０分間おいてインダクション（誘発）を行った
のち、培養温度を３７℃に変えて３０分間振盪培養した
。そして、この培養液１００μｌに、あらかじめ３７℃
に保温しておいたし一ブロス（マルトース０．４％添加
）９．９ｍ／を加え、さらに３７℃で２時間振盪培養し
たのち、クロロホルムを数滴加えて混合した。次に、こ
の液を遠心分離機（４，５００ｒｐｍ、１０分間）にか
けて、上澄液を形質導入ファージ粒子溶液として得た。

また、この形質導入ファージ粒子溶液５０μｌに、３０
℃で一晩培養しておいた大腸菌ＬＮ９００の培養液１ｍ
ｌを加え、３０℃で５分間保温して形質導入を行ったの
ち、この菌体懸濁液を５０μｌづつＬ−プレート（アン
ピシリン２０μｇ／ｍ１含有）に塗布し、プレートを３
０℃において一晩おいたところ、プレート当たり１００
０〜３０００個のコロニーが認められた。

この段階において、組み換え体ＤＮＡは形質導入ファー
ジ粒子として存在しており、外来ＤＮＡの遺伝子バンク
は形質導入ファージ粒子として製造されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、新規コスミドベクターｐＴｃｏｓＡｐＹ　１
０ｒｉ／ｃｍｒ／ｎｅｏどを示し、第２図は、第１図の
新規コスミドベクターを用いるゲノムＤＮＡの遺伝子バ
ンクの製造方法を示し、 第３図は、新規コスミドベクターｐ　Ｔ　ｃ　ｏ　ｓ　
ＡｐＹ　１０　ｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍＹ／ｎｅ　ｏＹ　　
を示し、第４Ａ図、第４Ｂ図及び第４Ｃ図は、ｐ’ｌ’
ｃ　０ｓＡｐｒ１０ｒｉ／ｃｍＹ／ｎｅｏｒの作成方法
を示し、 第５図は、ｐＴｃｏｓＡｐｒｌｏｒ　ｉ／ＴＫ／ｃｍ”
／ｎｅｏｒの作成方法を示す。 手続補正書 （方式） 昭和６０年　４月２チ日 昭和５９年　特許側　第２５３７８４号２、発明の名称 新規コスミドベグタ、−及びそれを用いる遺伝子バンク
の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所　東京都中央区日本橋本町２丁目７番地８昭和６０
年３月６日 （発送日６０年３月２６日） 方丈　４λ ６、補正の対象 発明の詳細な説明の項。 ７、補正の内容 別紙の通り。 （１）明細書第４ページ下から３行目ないし１行目［〔
Ｄ、ｌ５ｈ−Ｒｅｓ、Ｊとあるを「〔デー・イシューホ
ロウイッツ　アンド　リュー・エフ・バーク：ヌクレイ
ツク　アシッズリサーチ（Ｄ、Ｉｓｈ・・・Ｒｅｓ、）
Ｊと訂正する。 （２）明細書第５ページ上から２行目ｒｌｓｈ・・・Ｂ
ｕｒｋｅＪとあるを［イシューホロウイッツ　アンド　
バーク（Ｉｓｈ・・・Ｂｕｒｋｅ）Ｊと訂正する。 （３）　　明細書第１０ページ上から８行目ないし１）
行目ｒ　（Ｌｅｗｉｓ　・・・Ｇｅｎｅ　ｔ、Ｊとある
を「〔レーウィス、タフリュー・エイチ、スリニバサン
ピー・アール：ストケ　エフ　アンド　シミノピッチ、
　エル：ソマト　セル　ジェネテイックス（ＬｅＷＩＳ
・・・Ｇｅｎｅｔ、）」と訂正する。 （４）明細書第１）ページ下から３行目及び４行目「〔
ｌ５ｈｉｕｒａ＝Ｂｉｏ１．Ｊとあるを「〔イシウラ　
エム等：モレキュラー　セル　ビオロジ−（Ｉｓｈｉｕ
ｒａ・・・３ｉｏ１．）Ｊと訂正する。 （５）明細書第１２ページ下から１行目ないし明細書第
１３ページ上から１行目ｒ　（Ｏｋａ−Ｂｉｏｌ。 」とあるを［〔才力、スギサキ　アンド　タカナミ。 ジャーナル　オプ　モレキュラー　ビオロジ−（Ｏｋａ
・・・Ｂｔｏｌ、）Ｊと訂正する。 （６）明細書第１３ページ上から４行目及び５行目「Ｔ
ｏｍｌｚａｗａ＝Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｊとあるを「〔トミザワ
　アンド　イトウ、プロシーディング　オプ　ナショナ
ル　アカデミ−オブ　サイエンシズユー・ニス・ニー（
Ｔｏｍｉｚａｗａ　・・−Ｕ、Ｓ。 Ａ、）」と訂正する。 （７）　　同ページ中上から８行目及び９行目「〔５ｏ
ｂｅｒｏｎ・・・Ｇｅｎｅ、Ｊとあるを［〔ソベロン、
カバラピアス　アンド　ポリバーシーン（Ｓｏｂｅｒｏ
ｎ＝−Ｇｅｎｅ、）Ｊと訂正する。 （８）明細書第１９ページ上から２行目および３行目「
（Ｗｉｇｌｅｒ・−・Ｃｅ１ｌＪとあるを「〔ウィグラ
ー、エム等セル（Ｗｉｇｌｅｒ・・・Ｃｅ１ｌ）ｊと訂
正する。 （９）同ページ中上から５行目ないし７行目ｒ（Ｗｉｇ
ｌｅｒ・・・Ｕ、Ｓ、Ａ、」とあるを「〔ウイグラ−、
エム等ブロシーデインダス　オブ　ナショナルアカデミ
−オブ　サイエンシズ　ニー・ニス・ニー　（Ｗｉｇｌ
ｅｒ−Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｊと訂正する。 αω　同ページ中上から１０行目及び１）行行目（Ｇｒ
ａｆ−・−Ｇｅｎｅｔ、Ｊとあるを［〔グラーフ、エル
・エイチ・ジュニア等ソマト　セル　ジェネティクス（
Ｇｒａｆ・・・Ｇｅｎｅｔ。）」と訂正する。 （１））同ページ中下から７行目ｒ　（Ｂｅｒｇ・−・
Ｂｉｏｌ、Ｊとあるを「〔ベルブ、ビー等モレキュラー
アンド　セル　ビオロジー（Ｂｅｒｇ・・・Ｂｉ。 １、）」と訂正する。 （１２）明細書第２０ページ下から４行目ｒ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ−−−ｅｔ　　ａｌ、、Ｊとあるを「〔モレ
キュラー　クローニング、ゴールド　スプリングハーバ
−ラボラトリ−、アニアティス、ティ等（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ・・−ｅｔ′　ａｌ、、）Ｊと訂正する。 （１３）明細書第６０ページ下から１０行目及び９行目
「（Ｏｋａ・・・Ｂｉｏｌ、Ｊとあるを「〔才力、スギ
サキ　アンド　タカナミ、ジャーナル　オプ　モレキュ
ラー　ビオロジー（Ｏｋａ・・・Ｂｉｏｌ）」と訂正す
る。 （１４）明細書第６１ページ下から７行目ないし５行目
「Ｔｊａｎ・・・Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｊとあるを［〔チャン、
アール等：プロシーディング　オブ　ナショナルアカデ
ミ−オブ　サイエンシズ　ニー・ニス・ニー　（Ｔｊａ
ｎ　・・・Ｕ、Ｓ、Ａ、）Ｊと訂正する。 （１５）明細書第６５ページ下から６行目及び５行目「
〔ｌ５ｈｉｕｒａ　・・・Ｂｉｏｌ、Ｊとあるを「〔イ
シウラ、エム等モレキュラニ　アンド　セル　ビオロジ
−（Ｉｓｈｉｕａ　・・・Ｂｉｏｌ、）Ｊと訂正する。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）同一の方向性をもったラムダファージまたはラム
   ドイドファージのｃｏｓを少なくとも３個有することを
   特徴とするコスミドベクター。
2. （２）同一の方向性をもったラムダファージまたはラム
   ドイドファージのｃｏｓを少なくとも３個有し、２種類
   の制限酵素で切ることによって、それぞれｃｏｓを少な
   くとも１個もしくは２個持った右腕と左腕とが等モルで
   きる特許請求の範囲第１項記載のコスミドベクター。
3. （３）コスミドベクター由来の遺伝子画分の挿入を判定
   するための薬剤耐性、もしくは特定の生理機能を発現せ
   しめる遺伝子配列を含有する特許請求の範囲第１項記載
   のコスミドベクター。
4. （４）薬剤耐性としてアンピシリン耐性、テトラサイク
   リン耐性、ネオマイシン耐性もしくはクロラムフェニコ
   ール耐性を発現せしめる遺伝子配列を有する特許請求の
   範囲第３項記載のコスミドベクター。
5. （５）特定の生理機能として、チミジンキナーゼ（ＴＫ
   ）活性、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
   ＡＰＲＴ）活性、ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
   ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）活性、キサンチン
   グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲ
   Ｔ又はｇｐｔ）活性、もしくはジヒドロ葉酸リダクター
   ゼ（ｄｈｆｒ）活性を発現せしめる遺伝子配列を有する
   特許請求の範囲第３項記載のコスミドベクター。
6. （６）ＣｏｌＥＩ由来の複製機能を有する遺伝子画分を
   含有する特許請求の範囲第１項記載のコスミドベクター
   。
7. （７）特許請求の範囲第１項記載のコスミドベクターを
   ２種類の制限酵素で、切ることによって得られる、それ
   ぞれｃｏｓを少なくとも１個もしくは２個持った右腕と
   左腕との間に、３５〜４５Ｋｂｐの長さの種々の外来Ｄ
   ＮＡ断片を挿入し、ｉｎｖｉｔｒｏパッケージングで形
   質導入ファージ粒子に変え、次いでラムダファージが溶
   原化している大腸菌にクローン化したのち誘発をかけて
   、組み換え体ＤＮＡをｉｎ　ｖｉｖｏパッケージングで
   形質導入ファージ粒子に変えることによって、外来ＤＮ
   Ａの遺伝子バンクを製造することを特徴とする遺伝子ハ
   ンクの製造方法。
8. （８）外来ＤＮＡが、細菌、糸状菌、酵母などの微生物
   、高等動植物もしくは各種ファージ等に由来するＤＮＡ
   である特許請求の範囲第７項記載の製造方法。