HU193538B - Process for separating pure 1, 2, 3, 4 and 5 factores of teichomycine a2 - Google Patents
Process for separating pure 1, 2, 3, 4 and 5 factores of teichomycine a2 Download PDFInfo
- Publication number
- HU193538B HU193538B HU832029A HU202983A HU193538B HU 193538 B HU193538 B HU 193538B HU 832029 A HU832029 A HU 832029A HU 202983 A HU202983 A HU 202983A HU 193538 B HU193538 B HU 193538B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- nujol
- acetonitrile
- teichomycin
- solution
- factor
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/045—Actinoplanes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgya: eljárás a teichomycin A2 egyes antibiotikus komponensei, nevezetesen az 1,2,3,4 és 5 faktor lényegében tiszta alakban való előállítására.
A teichomycin A2 egyike azoknak a különböző antibiotikus anyagoknak, amelyeket oly módon állíthatunk elő, hogy az Actinoplanes Teichomyceticus ATCC 31121 törzset asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajban tenyésztjük (1. a 839.259 sz. belga szabadalmi leírást). Az említett szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint egy teichomycin A|, A2 és A3 antibiotikumot tartalmazó keveréket nyerünk ki az elkülönített fermentléből oly módon, hogy azt egy megfelelő, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk és az extraháló oldószerből a keveréket ismert módon kicsapjuk. Az így kapott antibiotikum keverékből a teichomycin A2-t Sephadex-szel végzett oszlopkromatográfia segítségével különítjük el. A teichomycin A2-t, miután szulfonált polisztirol gyantán való átvezetéssel tovább tisztítottuk, számos különböző fizikokémiai paraméterrel jellemezhetjük, ideértve a különböző papír- és vékonyrétegkromatográfiás rendszerekben kapott R/ értékeket, amelyek arra mutattak, hogy ez a vegyület valódi egységes termékként viselkedik.
Most váratlanul azt találtuk, hogy a teichomycin A2 ténylegesen több, egyidejűleg keletkező, egymáshoz nagymértékben hasonló antibiotikus anyag keveréke, amelynek főbb komponenseit teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktornak neveztük el. Ugyancsak megállapítottuk, hogy ezek a tiszta egyes faktorok biológiailag megkülönböztethetők a teichomycin A2 komplextől, ugyanis érzékeny mikroorganizmusokkal szemben magasabb antibiotikus aktivitással rendelkeznek.
A találmány szerinti antibiotikus anyagokat teichomycinből kiindulva állítjuk elő (amelynek előállítását a fent említett belga szabadalmi leírás mutatja be), oly módon, hogy az antibiotikum komplexet nagyhatékonyságú kromatográfiás módszerekkel felbontjuk az egyes faktorokra és kinyerjük a főbb faktorokat.
A jelen találmányi leírásban alkalmazott „teichomycin A2“, „teichomycin A2 komplex vagy „antibiotikum komplex kifejezés az említett, egyidejűleg keletkező .5 antibiotikus faktort tartalmazó keverékre vonatkozik, amelyet pl. a hivatkozott 839.259 sz. belga szabadalmi leírás kitanítása szerint áldhatunk elő és amelyet abban a leírásban teichomycin A2-nek neveztünk.
A komplexnek a főbb tiszta egyedi faktorokra való szétválasztása inverz fázisú megosztási vagy ioncserélő kromatográfiával érhető el. Az előbbi esetben előnyösen inaktívált szilikagélt használunk oszlop-töltetként és gradiens eluciót alkalmazunk, kifejlesztőként acetonitril/vízes ammóniumformiát ele2 gyet véve, míg az utóbbi esetben célszerűen gyenge gél-típusú anioncserélőt alkalmazunk stacionárius fázisként és vizes puffereket vagy vizes pufferek és nem-vizes oldószerek elegyeit eluáló rendszerekként. Közelebbről: optimális elválasztási eredményeket érünk el oly módon, hogy a híg vizes ammóniumformiát-acetonitril elegyben oldott teichomycin A2 oldatát szilanizált szilikagél oszlopon engedjük át és az oszlopot gradiens elucióval, ugyanezzel az oldószer-rendszerrel fejlesztjük ki. Jó eredményeket érhetünk el akkor is, ha stacionárius fázisként agaróz-dietilaminoetil-származékot alkalmazunk és a szétválasztást puffer oldatokkal vagy puffer oldatok és vízmentes vízzel elegyedő oldószerek segítségével végezzük, progresszív elucióval.
A szétválasztási eljárást HPLC-vel követjük.
A hasonló HPLC profillal rendelkező frakciókat egyesítjük, kívánt esetben preparatív HPLC-vel tovább tisztítjuk és sómentesítjük. Ezekből az oldatokból az egyes faktorokat oly módon nyerjük ki, hogy a szerves oldószereket ledesztilláljuk, a vizet kis térfogat eléréséig elűzzük és a kapott termék kicsapására olyan szerves oldószert adunk, feleslegben, a rendszerhez, amelyben a vegyületek nem oldhatók.
A találmány szerinti eljárás jobb szemléltetésére a következő konkrét példát mutatjuk be. Ez a példa azonban nem tekinthető olyannak, mint amely a találmányt az itt tárgyalt konkrét körülményekre korlátozza.
1. példa
A teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor szétválasztása gramm teichomycin A2 komplexet — amelyet a 839.259 sz. belga szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint állítunk elő — 1 liter (9:1) 0,2%-os ammóniumformiát:acetonitril elegyben oldunk és a pH-t IN NaOH-dal 7,5-re állítjuk be. Ezt az oldatot egy 500 gramm szilanizált szilikagél 60-at (Merck) tartalmazó oszlopon vezetjük át.
Az oszlopot ezután 10 liter össztérfogatú 0,2%-os ammóniumformiát oldattal eluáljuk, acetonitril 10—20% közötti lineáris grádiensének alkalmazásával.
Kb. 20 ml térfogatú frakciókat szedünk és ezeket HPLC segítségével vizsgáljuk.
A következő I. táblázatban a teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor retenciós idejét (U) tüntetjük fel, amelyeket egy jellegzetes HPLC elválasztás során mértünk (a műveleti körülményeket a táblázat folytatásaként tüntetjük fel):
I. táblázat
Teichomycin Retenciós idő /perc/ A2 faktor
21,2
22,6
-2193538'
I. táblázat (folytatás) Teichomycin Retenciós idő /perc/
A2 faktor
23,3
25,8
26,4 3,5-dihidroxitoluol /belső standard/ 8,84
Oszlop: 5 μ Zorba^ODS (Du Pont)
Mozgó fázis: lineáris grádiens 0%B-tői
50%B-ig_ A-ban 40 perc alatt
A) (9:1) 25 mM NaH2PO4:acetonitril 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva
B) (3:7) 25 mM NaH2PO4:acetonitril 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra beállítva
Áramlási sebesség: 2 ml/perc
Detektor: UV fotométer 254 nm-en.
A hasonló HPLC profilú frakciókat egyesítjük és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A visszamaradt vizes oldatokat 10 gramm szilanizált szilikagél 60-at (Merck) tartalmazó oszlopon vezetjük át. Az oszlopot desztillált vízzel mossuk az ammóniumformiát eltávolítására, majd 50%-os vizes acetonitrillel eluáljuk.
Az eluátumot kis térfogatra töményítjük be, butanol hozzáadásával, a víz ledesztillálásának megkönnyítésére, majd 1:1 acetonitril: etiléter eleggyel kicsapást végzünk. Ezzel az eljárással 410 mg tiszta teichomycin A2 1 faktort és 770, mg 2 faktort kapunk.
A teichomycin A2 3 faktort, a teichomycin A2 2 faktorral alkotott 1:1 keverék alakjában HPLC-vel tisztítjuk tovább félpreparatív oszlopon, a következő műveleti körülmények között.
Oszlop: Whatman Partisi/® ODS M 9 10/50
Mozgó fázis: 0,2%-os vizes ammóniumformiát 76:24 acetonitril elegy
Áramlási sebesség: 4,5 ml/perc Detektor: UV fotométer 254 nm-en Terhelés: 20 mg
A tisztítást ebben az esetben is követjük, oly módon, hogy mindegyik frakciót HPLC-vel vizsgáljuk meg.
A tiszta teichomycin A2 2 faktort és a tiszta teichomycin A2 3 faktort tartalmazó frakciókat egyesítjük, sómentesítjük és az előbbiekben leírt módon kicsapjuk. (Kitermelés: 510 mg teichomycin A2 2 faktor és 520 mg teichomycin A2 3 faktor).
Az első oszlopról kapott, a 4 és 5 frakciót 1:1 arányban tartalmazó frakciókat (kb. 500 mg) egyesítjük azzal a (kb. 490 mg súlyú (keverékkel, amely a 4 és 5 faktor keveréke és amelyet ugyanígy állítunk elő egy második párhuzamos elkülönítés során. A frakciókat félpreparatív HPLC-vel választjuk szét ugyanolyan műveleti körülmények alkalmazásával, amelyeket az előbbiekben a teichomycin A2 3 faktor tisztításával kapcsolatban említettünk.' 350 mg teichomycin A2 4 faktort és 300 mg teichomycin A2 5 faktort kapunk.
A teichomycin A2 egyes tiszta frakcióinak fizikokémiai jellemzői
A teichomycin A2 1 faktor fehér amorf por, amely melegítés hatására kb. 220°C-on sötétedni kezd és 225°C-on teljesen elbomlik. A faktor jellemzői a következők:
a) Korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, valamint dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban;
gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;
rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma, amelyet az 1. ábrán mutatunk be, a következő helyeken tartalmaz abszorpciós maximumokat: — O,1N sósavban:
lambdaműx 278 nm (El^ = 49,5) — pH 7,4 foszfát pufferben: lambdamcx 278 nm (Ef^ = 50,0) — 0,lN nátriumhidroxidban: lambdaműX 297 nm (EÍ& — 72,1);
c) IR abszorpciós spektruma, amelyet a 2. ábrán mutatunk be, a következő helyeken tartalmaz abszorpciós maximumokat: 3700—3100, 2960—2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség = 8,á %), amely a következő közelítő %-os összetételt mutatja (átlag): szén 56,70; hidrogén 4,90; nitrogén 6,65; klór 3,80; oxigén (a különbségből) 27,95%;
e) retenciós idő (tn) 21,2 perc, ha a mintát inverz fázisú HPLC-vel elemezzük 5 μ-os Zorbax®ODS oszlopot alkalmazva és az eluálást 40 perc alatt a B oldat 0-50%-os lineáris grádiense mellett, A oldattál végezve (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4/acetonitril elegy, 0,1 N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PO4/ /acetonitril 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség mellett (belső standard: 3,5-dihidroxi-toluol, tK 8,84 perc);
f) a következő jel-csoportok a 270 MHz-es Ή NMR spektrumban (a teljes spektrumot a 3. ábrán mutatjuk be), amelyet DMSO-d6-ban veszünk fel, néhány csepp D2O hozzáadása mellett) koncentráció: 25 mg/0,5 ml) (TMS mint belső standard: delta 0,00 ppm): 0,8—1,5 (m),
-3193538 .5
1.7- 2,3 (m), 2,7-4,0 (m), 4,0-4,7 (m),
4.8- 5,8 (m), 6,2-8,1 (m);
g) sóképzésre képes sav-funkció;
h) sóképzésre alkalmas bázis-funkció;
i) molekulasúly kb. 1875, fömegspektrum-elemzéssel, ionforrásként gyors atonj-bombázást alkalmazva (FAB). (AFABtömegspektrometria tárgyalására vonatkozóan 1. pl.: M. Barber et al., Natúré 293, No. 5830, p. 270—275, 1981).
A teichomycin A2 2 faktor fehér amorf por, amely 210°C-ra felmelegítve sötétedni kezd és 250°C-on teljesen elbomlik; jellemzői a következők :
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy 2 alatt; dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben; rosszul oldható kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma, amelyet a
4. ábrán mutatunk be, a következő abszorpciós maximumokat tartalmazza:
— O,1N sósavban:
lambda,278 nm (E’**m = 48)
- pH 7,4 foszfát-pufferben: larnbdamax 278 nm (Eftm = 49,0) — 0,lN nátriumhidroxidban: larnbdamax 297 nm (E]& = 70,0)
c) ÍR abszorpciós spektruma nujolban — amelyet az 5. ábrán mutatunk be — a következő megfigyelhető abszorpciós maximumokat tartalmazza: 3700—3100, 2960— 2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában (súlycsökkenés — 9,8%) szárítottuk, amely a következő közelítő százalékos összetételt (átlag) mutatja: szén 56,15%; hidrogén 5,15%; nitrogén 6,30%; klór 3,90%; oxigén (a különbség alapján) 28,50%;
e) retenciós idő (U) 22,6 pépe, inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ Zorbax® ODS oszlop alkalmazásával, mimellett az eluálást a B oldat 0—50% lineáris grádiense mellett az A oldatban, 40 perc alatt végezzük (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4 : acetonitril, 0,1N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 25 mM NaH2PO4: acetonitril 3:7 elegy, 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség mellett (belső standard: 3,5 - dihidroxi - toluol, ír
8,84 perc);
1) a következő jel-csoportok 270 Hz-n, Ή NMR spektrumban (a teljes spektrumot a 6. ábrán mutatjuk be), amelyet DMSO-d6-ban vettünk fel, néhány csepp D2O hozzáadásával) koncentráció 25 mg/0,5 ml) (TMS mint belső standard, delta = — 0,00 ppm): 0,7—1,5 (m), 1,8—2,2-(m), 2,7-4,5 (m), 4,6—5,7 (m), 6,2-8,1 (m);
g) sóképzésre alkalmas sav-funkció;
h) sóképzésre alkalmas bázis-funkció;
i) molekulásúly kb. 1877, FAB tömegspektrometriával meghatározva.
A teichomycin A2 3 faktor fehér amorf por, amely melegítés hatására 205°C-on bomlani kezd és teljesen elbomlik 250°C-on, amely a következő jellemzőket mutatja:
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben; rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma, amelyet a
7. ábrán mutatunk be, a következő abszorpciós maximumokat tartalmazza:
— 0,lN sósavban:
lambdamax 278 nm EiTm = 49,2) — pH 7,4 foszfát pufferben: lambdamax 278 nm (F.Vfm — 50,8) — 0,1 N nátriumhidroxidban: lambdamOx 297 nm (El^ = 72,7);
c) IR abszorpciós spektruma nujolban, amelyet a 8. ábrán mutatunk be, a következő megfigyelhető abszorpciós maximumokat tartalmazza: 3700—3100, 2960— 2850 (nujol), 1645,1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol);
d) elem-analízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on szárítottuk, közömbös atmoszférában (súlyveszteség = 12,0%), amely a következő közelítő %-os összetételt (átlagban) mutatja: szén 56,26; hidrogén 5,20; nitrogén 6,69%; klór 3,95%; oxigén (a különbség alapján): 27,90%;
e) retenciós idő ti 23,3 perc, inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ-os Zorbax” ODS oszlop alkalmazásával és az eluálást 0—50% lineáris B oldat grádiens mellett — A oldatban — végezve (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril, 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2P04:acetonitril 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség mellett (belső standard: 3,5-dihidroxitoluol, tR 8,84 perc);
f) a következő jel-csoportok 270 MHz-en, lH NMR-spektrumban (a teljes . spektrumot a 9. ábrán mutatjuk be), amelyet DMSO-d6-ban vettünk fel, néhány csepp D2O hozzáadásával (koncentráció: 25 mg/ /0,5 ml) (TMS mint belső standard, delta = 0,00 ppm): 0,7—1,5 (m), 1,8— 2,0 (m), 2,7-4,5 (m), 4,6-5,7 (m), 6,2-8,0 (m);
g) sóképzésre képes sav-funkció;
h) sóképzésre képes bázis-funkció;
-4193538
i) molekulasúly kb. 1877, FAB tömegspektrometriával meghatározva.
A teichomycin A2 4 faktor fehér amorf por, amely melegítés hatására kb. 210°C-on sötétedni kezd és 250°C-on teljesen elbomlik, amely a következő jellemzőkkel rendelkezik:
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2-n, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben; rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma, amelyet a
10. ábrán mutatunk be, a következő abszorpciós maximumokat tartalmazza:
— 0,lN sósavban:
lambdaműX 278 nm (EÍ?m = 52,5)
- pH 7,4 foszfát-pufferben: lambdaműx 278 nm (E]&> = 52,5) — O,1N nátriumhidroxidban:
lambdam,„ 297 nm (ΕΓ^, = 75,5);
c) IR abszorpciós spektruma, amelyet a 11. ábrán mutatunk be, a következő abszorpciós maximumokat tartalmazza (nujolban): 3700—3100, 2960—2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025,970, 890, 840, 813, 720 (nujol);
d) elem-analízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség — 9,8%), amely a következő közelítő %-os összetételt (átlag) mutatja: szén 56,50; hidrogén 5,10; nitrogén 6,50; klór 3,80%; oxigén (a különbségből) 28,10%;
e) retenciós idő (ír) 25,8 perc inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ Zorbax ODS oszlop alkalmazásával, és az eluálást 0— 50% lineáris B oldat grádiens mellett — az A oldatban — végezve, 40 perc alatt (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4: acetonitril, 0,lN NaOH-dai pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PO4:acetonitri.l, 0,lN NaOH-dal pH-6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség mellett) belső standard: 3,5-dihidroxi-toluol, ír
8,84 perc);
f) sóképzésre képes sav-funkció;
g) sóképzésre képes bázis-funkció;
h) molekulásúlykb. 1891, FAB tömegspektrometriával meghatározva.
A teichomycin A2 5 faktor fehér amorf por, amely 210°C-ra melegítve sötétedni kezd és teljesen elmbomlik 250°C-on, és a következő jellemzőkkel rendelkezik:
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;
rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma, amelyet a
12. ábrán mutatunk be, a következő abszorpciós maximumokat tartalmazza:
— 0,íN sósavban:
lambdam0I 278 nm (E^em = 49,6) — pH 7,4 foszfát pufferben: lambdamox 278 nm (ETSk — 51,8) — 0,IN nátriumhidroxidban:
lambdamax 297 nm (E^, — 78,8)
c) IR abszorpciós spektruma nujolban, amelyet a 13. ábrán mutatunk be, a következő megfigyelhető abszorpciós maximumokat tartalmazza: 3700—3100, 2960— 2840 (nujolban), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375, (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízis, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség = 10,1%), amely a következő közelítő %-os összetételt (átlag) mutatja: szén 56,60; hidrogén 5,05%; nitrogén 6,63%; klór 3,85%; oxigén (a különbség alapján) 27,87%;
e) retenciós idő (t*) 26,4 perc, inverz fáx zisú HPLC-vel elemezve, 5 μ-os Zorbax ODS oszlopot alkalmazva, az eluálást 0— 50% B oldat lineáris grádiense mellett — A oldatban — végezve, 40 perc alatt (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril,
0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PO4:acetonitril, 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség esetén (belső standard: 3,5-dihidroxi-toluol, t«.
8,84 perc);
f) sóképzésre képes sav-funkció;
g) sóképzésre képes bázis-funkció;
h) molekulasúly kb. 1891, FAB tömegspektrometriával meghatározva.
A teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor egyaránt tartalmaz egy sóképzésre képes sav-funkciót.
A teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor alkálifém-, alkáliföldfém- és gyógyászati szempontból elfogadható ammónium-sóinak előállítása a találmány további tárgyát képezi.
Jellegzetes alkálifém- és alkáliföldfém-só pl. a nátrium-, kálium-, lítium-, kalciumés magnéziumsó. Az ammóniumsók ammónium- és primer, szekunder vagy tercier-(1—4 szénatomos)-alkilammónium- és hidroxi-(1—4 szénatomos)-alkilammónium sókat jelentenek.
Az alkáli- és alkáliföldfémsókat a fémsók előállítására általában alkalmazott szokásos eljárások szerint állítjuk elő. Például: a teichomycin A2 1,2,3,4 vagy 5 faktort, szabad sav alakban, megfelelő oldószerben, pl. propilénglikolban oldjuk és a kapott oldat5
-5193538 hoz fokozatosan hozzáadjuk a megfelelő, kiválasztott ásványi bázist, közel sztöchiometrikus mennyiségben.
A keletkező alkáli- vagy alkáliföldíémsót ezután nem-oldószerrel való. kicsapással és szűréssel nyerjük ki.
Egy másik megoldás szerint ezeket a sókat lényegében vízmentes alakban állíthatjuk elő, liofilizálással. Ebben az esetben a kívánt sókat tartalmazó vizes oldatokat- amelyeket úgy állítunk elő, hogy a szabad savas alakot megfelelően megválasztott alkáli- vagy alkáliföldfém-karbonáttal vagy -hidroxiddal sóvá alakítjuk, mimellett a bázist olyan mennyiségben adagoljuk, hogy pH 7—8 értéket érjünk el az oldhatatlan anyagok eltávolítására szűrjük és liofilizáljuk.
A szerves ammóníumsókat úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelően megválasztott amint hozzáadjuk a teichomycin A2 1,2,3,4 vagy 5 faktor megfelelő oldószerrel, pl. propilénglikollal elkészített oldatához — amely a faktort a szabad sav alakban tartalmazza —, majd az oldószert és az amin-felesleget ledesztilláljuk. Egy másik megoldás szerint a két reagenst minimális mennyiségű vízben reagáltatjuk, majd a kapott sót nem-oldószer hozzáadásával kicsapjuk.
Mint az előbbiekben említettük, a teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor egy bázisos funkciót is tartalmaz, amely sóvá alakítható. A gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sók előállítása — amelyekhez ismert módon juthatunk, oly módon, hogy a tiszta egyedi faktorokat erős savval, előnyösen ásványi savval reagáltatjuk — ugyancsak a találmány tárgyát képezi.
2. példa
A teichomycin A2 2 faktor nátriumsójának előállítása
A teichomycin A2 2 faktor oldatát (150 mg, 15 ml térfogatú vizes oldat) pH 8,0-ra állítjuk be, O,1N NaOH cseppenkénti hozzáadásával. A kapott oldatot szűrjük, az oldatot átvisszük egy fagyasztva-szárító rendszer kamrájába és megfagyasztjuk. A fagyasztás befejeződése után a kamrát 1,33322· 10 Pa eléréséig evakuáljuk és a jeget szublimáljuk, oly módon, hogy a fütőlemezt 0°C-ra melegítjük. Az eljárást addig folytatjuk, amig a termék csaknem száraz (kb. 1 % nedvesség). Az így kapott teichomycin Á2 2 faktor 3:1 metilcelloszoIv:H2O elegyben (25 ml) O,1N HCl-val végzett titrálása arra mutat, hogy két titrálható funkció van jelen, amelyet pK 7,03 és 4,78 jellemez.
Az előbbi eljárást követve, de teichomycin A2 1,3,4 vagy 5 faktorból kiindulva a megfelelő nátriumsókat állítjuk elő. A végtermékként kapott sók nátriumtartalmának meghatározása azt igazolja, hogy mononátriumsó keletkezik.
A teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor in vitro antibakteriális aktivitását — amelyek főként Gram-pozítív baktériumokkal szemben mutatkoznak aktívnak — klinikai Staphylococcus és Streptococcus izolátumokkal szemben határozzuk meg, mikrotitrálásos rendszerben, kétszeres hígítás alkalmazásával. A Staphylococcusok esetében Penassay húslevest (Difco), a Streptococcusok esetében pedig Todd-Hewitt húslevest (Diíco) használunk. Az egy éjjelen át tenyésztett húsleves-kulturákat oly mértékben hígítjuk, hogy a végső inokulum kb. 103 telepképző egységet — milliliterenként — tartalmazzon. A minimális gátló koncentrációkat (MIC) úgy határozzuk meg, mint azt a legalacsonyabb koncentrációt, amely 18—24h-s inkubálás után, 37°C-on nem tesz lehetővé látható növekedést. A kapott eredményeket a II. táblázatban mutatjuk be.
II. Táblázat
| A teichomycin A2 1, 2, 3, | 4 és 5 faktor | |
| Mikroorganizmus | Vizsgált törzsek száma | 1 faktor |
| Staph. aureus | 5 | 0,8-1,6 |
| Staph. epidermidis | 4 | 0,2-1,6 |
| Streptoc. pyogenes | 7 | 0,05-0,1 |
| Streptoc. pneumoniae | 6 | 0,1-0,2 |
| Streptoc. faecalis | 5 | 0,2-0,4 |
| Streptoc. mitis | 1 | 0,025 |
| Streptoc. salivarius | 1 | 0,2 |
| Streptoc. sanguis | 1 | 0,1 |
| Streptoc. bovis | 1 | 0,4 |
| Streptoc. agalactiae | 1 | 0,1 |
vitro antibakteriális aktivitása
M.I.C / pg/ml/, teichomycin A2
| 2 faktor | 3 faktor | 4 faktor | 5 faktor |
| 0,8-1,6 | 0,4-0,8 | 0,2-0,8 | 0,2-0,8 |
| 0,1-1,6 | 0,2-0,8 | 0,2-0,8 | 0,2-0,8 |
| 0,025-0,1 | 0,025-0,05 | 0,006-0,05 | 0,006-0,05 |
| 0,05-0,1 | 0,05-0,1 | 0,05-0,1 | 0,05-0,1 |
| 0,1-0,4 | 0,1-0,2 | 0,1-0,4 | 0,1-0,4 |
| 0,025 | 0,0125 | 0,025 | 0,025 |
| 0,2 | 0,1 | 0,05 | 0,05 |
| 0,1 | 0,1 | 0,05 | 0,05 |
| 0,4 | 0,2 | 0,4 | 0,4 |
| 0,1 | 0,05 | 0,1 | 0,1 |
Az 1,2,3,4 és 5 faktor mikrobiológiai potenciáljának a komplexhez való viszonyát agar-diffuziós módszerrel határozzuk meg,
S. aureus ATCC 6538 mint teszt-mikroorganizmus és teichomycin A2 komplex mint standard alkalmazásával.
Közelebbről: a teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor, valamint a standardként alkalmazott teichomycin A2 komplex megfelelő mennyiségét dimetilformamidban oldjuk, 2000 μg/ml koncentráció elérésére. Ezeket az oldatokat tovább hígítjuk 1% szarvasmarha-szérumot
-6193538 tartalmazó 0,067M, pH 7,4 foszfát-puffer segítségével’, a következő koncentrációk előállítására: 2,5; 5, 10, és 20 pg/ml.
Ezután szűrőpapír-korongokat merítünk a minta-oldatokba és a korongokat szabályos elrendezésben agar-lemezek felületére helyezzük, amelyeket a teszt-mikroorganizmus szuszpenziójával oltottunk be. A lemezeket 18 órán át 37°C-on inkubáljuk, majd lemérjük a gátlási zónák átmérőjét. A kapott adatokat számítógépbe tápláljuk be az egyes faktoroknak a komplexhez viszonyított potenciálja meghatározására.
A kapott eredményeket az alábbiakban tüntetjük fel:
teichomycin A2 teichomycin A2 2 teichomycin A2 3 teichomycin A2 4 teichomycin A2 5 faktor 841 E/mg faktor 1086 E/mg faktor 1131 E/mg faktor 1066 E/mg faktor 954 E^mg teichomycin A2 komplex lOOQE/mg A teichomycin A2 2,3,4 és 5 faktort S. pneumoniae és S. pyogenes által egérben okozott kísérleti fertőzések esetében is kipróbáltuk. A kísérleteket teichomycin A2 komplex mint összehasonlító anyag alkalmazásával végeztük. Az eredményeket a III. táblázatban mutatjuk be.
In
Vegyület teichomycin A2 faktor teichomycin A2 faktor teichomycin A2 faktor teichomycin A2 faktor teichomycin A2 komplex
III. táblázat
| vivő antibakteriális aktivitás ED50 /mg/kg/nap/, s.c. S. pneumoniae L 44 S. pyogenes L 49 | ||
| 0,28 | /0,22-0,34/ | 0,15 /0,13-0,18/ |
| 0,27 | /0,23-0,31/ | 0,13 /0,11-0,16/ |
| 0,12 | /0,98-0,14/ | 0,098 /0,073-0,11/ |
| 0,13 | /0,10-0,15/ | 0,10 /0,098-0,13/ |
| 0,35 | /0,28-0,44/ | 0,18 l-l |
A közelítő akut toxicitást egérben (i.p.) a teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor esetében a IV. táblázatban mutatjuk be.
IV. táblázat
Akut toxicitás egérben /i.p./ Vegyület Közelítő LDSO /mg/kg/ teichomycin A2 teichomycin A2 teichomycin A2 teichomycin A2 teichomycin A2 faktor faktor faktor faktor faktor
1500-2000 —
1000-1500
500-1000
Az előbbiek alapján megállapítható, hogy a találmány szerinti vegyületek, a teichomycin A21,2,3,4 és 5 faktor hatékonyan alkalmazható mikróbaellenes készítmények hatóanyagaként, amelyeket az ember- és állatgyógyászatban az aktív komponensekre érzékeny patogén baktériumok által okozott fertőző betegségek megelőzésére és kezelésére használhatunk. Ilyen kezelés során ezeket a vegyületeket mint olyanokat vagy egyedi faktorokként alkalmazhatjuk, vagy figyelembe véve áktívításuk hasonlóságát az 5 fakto: közül kettőt vagy' többet tartalmazó keverékek alakjában is használhatjuk ezeket.
A találmány szerinti vegyületek bevihetők orálisan, helyileg vagy parenterálisan, mimellett kitüntetett a parenterális bevitel. A beviteli módtól függően ezek a vegyületek kü40 lönböző adagolási formákban készíthetők ki. Az orális bevitelre szánt készítmények kapszula, tabletta, folyékony oldat vagy szuszpenzió alakúak lehetnek. Mint ez szakember számára ismeretes, a kapszulák és tabletták az aktív komponensen kívül szokásos hordozó45 anyagokat, pl. hígítókat (amilyen pl. a laktóz, kalciumfoszfát, szorbit stb.), kenőanyagokat (pl. magnéziumsztearátot, talkumot, polietilénglikolt), kötőanyagokat (pl. polivinilpir50 rolidont, zselatint, szorbitot, tragakantát, ákácmézgát), ízanyagokat és elfogadható szétesést elősegítő és nedvesítő szereket tartalmazhatnak. A cseppfolyós készítmények, általában vizes vagy olajos oldatok vagy szuszpenziók alakjában szokásos adalékanyagokat, pl. szuszpendálószereket tartalmazhatnak. Helyi alkalmazás céljából a találmány szerinti vegyületek megfelelő alakban készíthetők ki abból a célból is, hogy abszorbeálódjanak a bőrön, az orr és a torok nyálkahártyáján vagy a légcső szövetein keresztül és előnyösen folyékony permetek, inhalálószerek, pasztillák vagy a torok ecsetelésére alkalmas szerek alakjában használhatók. A szem vagy a fül kezelésére a készítmények folyékony vagy félfolyékony alakúak lehet-7193538 nek. A helyi alkalmazásra szánt készítményeket hidrofob vagy hidrofil hordozókkal kenőcs, krém, rázókeverék, festék vagy por alakjában készíthetjük ki.
Az injekciós készítmények szuszpenzió, oldat vagy emulzió alakjában — olajos vagy vizes hordozóanyagokban — fordulhatnak elő és tartalmazhatnak kikészítőszereket, amilyenek a szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergálószerek. Egy másik megoldás szerint az aktív komponens por alakban áll rendelkezésre és az alkalmazás időpontjában megfelelő hordozóanyaggal, pl. steril vízzel oldattá alakítható.
A beviendő aktív komponens mennyisége különböző tényezőktől függ, amilyen a kezelendő egyén testsúlya és állapota, a beviteli mód és a bevitel gyakorisága és a szóbanforgó kórokozó milyensége.
A teíchomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor általában hatásos napi kb. 0,1—20 mg aktív komponens/kg testsúly dózisban, amelyet kívánt esetben napi 2 adagra oszthatunk el. Különösen előnyben részesítjük azokat a készítményeket, amelyek kb. 50 — kb. 250 mg/ /egység koncentrációjú adagolási egység alakjában készíthetők ki.
A gyógyszerkészítmények előállítására a következő jellemző példákat mutatjuk be.
Parenterális oldatot állítunk elő oly módon, hogy 100 mg teíchomycin A2 2 faktor, nátriumsót 2 ml steril injekciós vízben oldunk.
Parenterális oldatot állítunk elő oly módon, hogy
250 mg teíchomycin A2 3 faktor nátriumsót 3 ml steril, pro inj. vízben oldunk.
Helyi kezelésre szolgáló kenőcsöt állítunk elő
200 mg teíchomycin A2 2 faktor,
600 mg polietilénglikol 4000 U.S.P. és 1,2 g polietilénglikol 400 U.S.P.
felhasználásával.
Gyógyszerként megnyilvánuló aktivitásuk mellett a találmány szerinti vegyületek felhasználhatók állatok növekedésének elősegítésére.
E célból egy vagy több, találmány szerinti vegyületet viszünk be orálisan, megfelelő takarmánnyal. Az alkalmazott pontos koncentráció megegyezik azzal, amelyet — normális mennyiségű takarmány elfogyasztását feltételezve — az aktív anyag növekedést elősegítő, hatásos mennyisége bevitelének szükségessége alapján számíthatunk.
A találmány szerinti aktív vegyületeknek az állati takarmányhoz való hozzáadását előnyösen oly módon hajthatjuk végre, hogy megfelelő takarmány-premixet állítunk elő, amely az aktív vegyületeket hatásos mennyiségben tartalmazza és a premixet hozzáadjuk a teljes takarmányhoz.
Egy másik megoldás szerint az aktív komponenst tartalmazó közti koncentrátum vagy takarmányadalék keverhető össze a takarmánnyal.
Az ilyen takarmány-premixek és teljes takarmányok előállítására és bevitelére irányuló eljárások kézikönyvekben találhatók leírva (amilyenek pl. a következők: „Applied Animál Nutrition” (Alkalmazott állat-takarmányozás), W. H. Freedman and Co., San Francisco, USA, 1969 vagy „Livestock Feeds and Feedings*1 (Szarvasmarha-takarmányok és -takarmányozás), O and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977)) és ezeket hivatkozás formájában foglaljuk be a leírásba.
Claims (6)
1) Eljárás antibiotikus vegyületek, nevezetesen a teíchomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor — amelyek a következő fizikokémiai jellemzők alapján azonosíthatók:
teíchomycin A2 1 faktor: fehér amorf por, amely melegítés hatására sötétedni kezd kb. 220°C-on, és teljesen elbomlik 225°C-on, ezenkívül
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2-n, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;
rosszul oldható metanolban és etanolban, csaknem olhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
— 0,lN sósavban:
larnbdamax 278 nm (E#m = 49,5) — pH 7,4 foszfát-pufferben: lambdamax 278 nm (Eí£„ = 50,0) — 0,lN nátriumhídroxidban: larnbdaműX 297 nm (Ei*c* = 72,1);
c) IR abszorpciós spektruma nujolban a kővetkező abszorpciós maximumokat mutatja: 3700—3100, 2960—2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízise, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (sulyveszteség = 8,5%), a.következő közelítő százalékos összetételt (átlag) mutatja: szén 56,70%; hidrogén 4,90%; nitrogén 6,65%; klór 3,80%; oxigén (a különbség alapján) 27,95;
e) retenciós ideje (ír) 21,2 perc inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ-os Zorbax® ODS oszlop alkalmazásával, az eluálást 40 perc alatt a B oldat 0—50%-nak megfelelő lineáris grádiense mellett — az A oldatban — végezve) A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril, O,1N NaOH-dal pH 6,0-ra puíferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PO4:acetonitril 0,lN NaOH-dal pH
-8193538
6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség mellett (belső standard: 3,5dihidroxitoluol, ír 8,84 perc);
f) a 270 MHz-es Ή NMR spektrum, amelyet DMSO-d6-ban veszünk fel, néhány csepp D2O hozzáadásával (koncentráció 25 mg/0,5 ml) (TMS mint belső standard, delta = 0,00 ppm) a következő jel-csoportokat mutatja: 0,8—1,5 (m); 1,7—2,3 (m); 2,7-4,0 (m);4,0—4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m);
g) egy sóképzésre alkalmas savas funkcióval rendelkezik;
h) egy sóképzésre alkalmas bázisos funkcióval rendelkezik;
i) molekulásúlya kb. 1875, FAB tömegspektrometriával meghatározva;
teichomycin A2 2 faktor: fehér amorf por, amely melegítés hatására 210°C-on sötétedni kezd, és 250°C-on teljesen elbomlik, ezenkívül
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;
rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban, széntetrakloridban;
b) UV spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
— 0,lN sósavban:
lambdaműx 278 nm (EíTm = 48) — pH 7,4 foszfát-pufferben: larnbdamax 278 nm (E?^, = 49,0) — 0,lN nátriumhidroxidban: larnbdamax 297 nm (EÍ* = 70,0);
c) IR abszorpciós spektruma nujolban a következő megfigyelhető abszorpciós maximumokat mutatja: 3700—3100, 2960— 286a (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízise, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség = 9,8%), a következő közelítő százalékos összetételt mutatja (átlag): szén 56,15%; hidrogén 5,15%; nitrogén 6,30%; klór 3,90%; oxigén (a különbség alapján) 28,50%;
e) retenciós ideje (ír) 22,6 perc inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ-os Zorbax ODS oszlop alkalmazásával, az eluálást a B oldat 0—50%-nak megfelelő lineáris gradiense mellett — az A oldatban — végezve, 40 perc alatt (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril, 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PÓ4:acetonitril O,1N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával (belső standard: 3,5-dihidroxi-toluol, ír 8,84 perc);
f) 270 MHz-en ’H NMR spektrumban — amelyet DMSO-d6-ban vettünk fel, néhány csepp D2O hozzáadásával (koncentráció: 25 mg/0,5 ml) (TMS mint belső standard, delta = 0,00 ppm (a következő jel-csoportok figyelhetők meg: 0,7—1,5 (m); 1,8— 2,2 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2— 8,1 (m);
g) egy sóképzésre képes sav-funkcióval rendelkezik;
h) egy sóképzésre képes bázis-funkcióval rendelkezik;
i) molekulasúly kb. 1877, FAB tömegspektrometriával meghatározva;
teichomycin A2 3 faktor: fehér amorf por, amely melegítés hatására 205°C-on kezd elbomlani, és teljesen elbomlik 250°C-on, mimellett a következő tulajdonságokkal rendelkezik:
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; enyhén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;
rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban és széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
— O,1N sósavban:
lambdafflflx 278 nm (E^ — 49,2) — pH 7,4 foszfát-pufferben: larnbdamax 278 nm (EtTm = 50,8) — 0,lN nátriumhidroxidban: larnbdamax 297 nm (EÍJt. = 72,7);
c) IR abszorpciós spektruma nujolban a következő megfigyelhető abszorpciós maximumokat mutatja: 3700—3100, 2960— 2850 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol);
d) felem-ahalízise, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség = 12,0%), a következő közelítő százalékos összetételt (átlag) mutatja: szén 56,26%; hidrogén 5,20%; nitrogén 6,69%; klór 3,95%; oxigén (a különbség alapján) 27,90%;
e) retenciós idő (ír) 23,3 perc inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ-os Zorbax® ODS oszlopot alkalmazva, az eluálást a B oldat 0—50% lineáris grádiense mellett — az A oldatban — végezve, 40 perc alatt (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril, O,1N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM - NaH2PO4:acetonitril 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml/perc áramlási sebességgel. Belső standard: 3,5-dihidroxitoluol, t* 8,84 perc);
f) 270 MHz-en Ή NMR spektruma DMSO-d6-ban, néhány csepp D2O hozzáadásával (koncentráció 25 mg/0,5 ml) (TMS mint belső standard, delta = 0,00 ppm) a következő jel-csoportokat mutatja: 0,7—
-9193538
1,5 (m), 1,8-2,0 (m), 2,7—4,5 (m),4,6— 5,7 (m), 6,2—8,0 (m);
g) sóképzésre képes sav-funkcióval rendelkezik;
h) sóképzésre képes bázis-funkcióval rendelkezik;
i) molekulasúly kb. 1877, FAB tömegspektrometriával meghatározva;
teichomycin A2 4 faktor: fehér amorf por, amely melegítés hatására kb. 210°C-on, sötétedni kezd, és teljesen elbomlik 250°C-on, mimellett
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, dimetilformamidban, dimetilszulfoxidban és propilénglikolban; gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben; rosszul oldható metanolban és etanolban, csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban és széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
— O,1N sósavban:
lambda„lM 278 nm (Ej?m = 52,5) — pH 7,4 foszfát-pufferben:
larnbdamax 278 nm (E’£m = 52,5) — O,1N nátriumhidroxidban:
lambdamex 297 nm = 75,5)
c) IR abszorpciós spektruma nujolban a következő abszorpciós maximumokat mutatja·. 3700—3100, 2960—2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízise, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség = 9,8%), a következő közelítő százalékos összetételt mutatja (átlag): szén 56,50%; hidrogén 5,10%; nitrogén 6,50%; klór 3,80%; oxigén (a különbség alapján) 28,10%;
e) retenciós idő (ír) 25,8 perc inverz fázisú
HPLC-vel elemezve, 5p-os Zorbax® ODS oszlopot alkalmazva, az eluálást a B oldat 0—50% lineáris grádiense mellett — az A oldatban — 40 perc alatt végezve (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril, O,1N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PO4:acetonitril, 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva), 2 ml (perc áramlási sebességgel) belső standard: 3,5—dihidroxi-toluol, tK 8,84 perc);
í) sóképzésre képes sav-funkcióval rendelkezik;
g) sóképzésre képes bázis-funkcióval rendelkezik;
h) molekulasúlya kb. 1891, FAB tömegspektrometriával meghatározva;
teichomycin A2 5 faktor: fehér amorf por, amely melegítés hatására 210°C-on sötétedni kezd, és teljesen elbomlik 250°C-on, mimellett
a) korlátlanul oldható vízben pH 7,0 felett vagy pH 2 alatt, dimetilformamidban, di10 metilszulfoxidban és propilénglikolban: gyengén oldható metilcelloszolvban és glicerinben;
rosszul oldható metanolban és etanolban; csaknem oldhatatlan kloroformban, benzolban, n-hexánban, acetonitrilben, etiléterben, acetonban, etilacetátban és széntetrakloridban;
b) UV abszorpciós spektruma a következő abszorpciós maximumokat mutatja:
— 0,lN sósavban:
lambdamax 278 nm (E*^, = 49,6) — pH 7,4 foszfát-pufferben: lambdamfix 278 nm (Ej* = 51,8) — 0,lN nátriumhidroxidban: lambdamox 297 nm (Ε,Τ™ = 78,9)
c) IR abszorpciós spektruma nujolban a kővetkező helyeken mutat megfigyelhető abszorpciós maximumokat: 3700—3100, 2960—2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol);
d) elem-analízise, miután a mintát előzetesen kb. 140°C-on közömbös atmoszférában szárítottuk (súlyveszteség=10,l%) a következő közelítő százalékos összetételt mutatja (átlag): szén 56,60%; hidrogén 5,05%; nitrogén 6,63%; klór 3,85%; oxigén (a különbség alapján) 27,87%;
e) retenciós ideje (t«) 26,4 perc inverz fázisú HPLC-vel elemezve, 5 μ-os Zorbax ODS oszlop alkalmazásával, az eluálást a B oldat 0—50%-os lineáris grádiense mellett — az A oldatban — 40 perc alatt végezve (A oldat: 9:1 25 mM NaH2PO4:acetonitril, 0,1 N NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva; B oldat: 3:7 25 mM NaH2PO4:acetonitril, 0,lN NaOH-dal pH 6,0-ra pufferolva, (2 ml/perc áramlási sebességgel) (belső standard: 3,5-dihidroxi-toluol, ír 8,84 perc);
f) sóképzésre képes sav-funkcióval rendelkezik;
g) sók'épzésre képes bázis-funkcióval rendelkezik;
h) molekulasúly kb. 1896, FAB tömegspektrometriával meghatározva — valamint e vegyületek gyógyászati szempontból elfogadható sói, előnyösen alkálifém, alkáliföldfém- és ammóniumsói előállítására, azzal jelle mezve, hogy a teichomycin A2-t inverz fázisú megosztásos vagy ioncserélő kromatográfiával az egyes faktorokra választjuk szét és kívánt esetben a kapott vegyületeket ismert módon gyógyászati szempontból elfogadható sókká alakítjuk át.
2) Az 1) igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztást oszlop-kromatográfiával végezzük, szilanizált szilikagél oszlop alkalmazásával és a kifejlesztést grádiens elucióval végezzük, acetonitril híg vizes ámmóniumformiátos oldatával.
3) A 2) igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oszlopot acetonitril 0,2%-10193538
-os ammóniumformiátos oldatával fejlesztjük ki, 10—20% lineáris acetonitril-grádiens alkalmazásával.
4) A 3) igénypont szerinti eljárás az egyes faktoroknak az oszlopról kinyert, két faktort 5 tartalmazó keverékből való előállítására, azzal jellemezve, hogy inverz fázisú oszlop-kromatográfiát alkalmazunk, oktadecilszilán oszlop és kifejlesztőként 24:76 acetonitril:
:0,2%-os vizes ammóniumformiát alkalmazásával.
5) A 3) igénypont szerinti eljárás teichomycin A2 2 faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy a teichomycin A2 komplexet 9:1 0,2%-os ammóniumformiát:acetonitril keverékben oldjuk, a pH-t NaOH hozzáadásával kb. 7,5-re állítjuk be, a kapott oldatot szilanizált szilikagél oszlopon vezetjük át, az oszlopot acetonitril 10—20%-os lineáris gradiensével — 0,2%-os ammóniumformiát oldat20 bán — fejlesztjük ki, a teichomycin A2 2 faktorra nézve jellegzetes, azonos HPLC profilú frakciókat egyesítjük, a szerves oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a fennmaradó vizes oldatot szilanizált szilikagél oszlopon való átvezetéssel sómentesítjük, az oszlopot vízzel mossuk, az eluátumot kis térfogatra betöményítjük és a tei.chdmycin A2 2 faktort nem-oldószer hozzáadásával a 10 koncentrátumból tiszta állapotban kicsapjuk.
6) Eljárás antibakteriális hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy aktív komponensként egy, az 15 1) igénypont szerint előállított vegyületet, vagy az 1) igénypont szerint előállított öt faktor közül kettőt, hármat, négyet vagy valamennyi ilyen faktort tartalmazó keveréket ismert módon szokásos segédanyagokkal ke20 verünk össze.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8216590 | 1982-06-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU193538B true HU193538B (en) | 1987-10-28 |
Family
ID=10530888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU832029A HU193538B (en) | 1982-06-08 | 1983-06-07 | Process for separating pure 1, 2, 3, 4 and 5 factores of teichomycine a2 |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4542018A (hu) |
| JP (5) | JPS591423A (hu) |
| KR (1) | KR900008246B1 (hu) |
| AU (1) | AU560966B2 (hu) |
| BE (1) | BE896993A (hu) |
| BG (1) | BG60529B2 (hu) |
| CA (1) | CA1208204A (hu) |
| CH (1) | CH657139A5 (hu) |
| DE (1) | DE3320342A1 (hu) |
| DK (1) | DK159117C (hu) |
| ES (2) | ES522941A0 (hu) |
| FI (1) | FI73697C (hu) |
| FR (1) | FR2528050B1 (hu) |
| GB (1) | GB2121401B (hu) |
| GR (1) | GR78267B (hu) |
| HK (1) | HK55887A (hu) |
| HU (1) | HU193538B (hu) |
| IE (1) | IE55025B1 (hu) |
| IL (1) | IL68819A0 (hu) |
| IT (1) | IT1212085B (hu) |
| LU (1) | LU84853A1 (hu) |
| MY (1) | MY8700002A (hu) |
| NL (1) | NL8301980A (hu) |
| NO (1) | NO159104C (hu) |
| NZ (1) | NZ204480A (hu) |
| PH (1) | PH19533A (hu) |
| PT (1) | PT76831B (hu) |
| SE (1) | SE459094B (hu) |
| SG (1) | SG70686G (hu) |
| SU (1) | SU1318170A3 (hu) |
| UA (1) | UA6025A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA833607B (hu) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8307847D0 (en) * | 1983-03-22 | 1983-04-27 | Lepetit Spa | Antibiotics l 17054 and l 17046 |
| US4696817A (en) * | 1983-10-11 | 1987-09-29 | The Dow Chemical Company | Extraction of teichomycin A2 from whole culture fermentation broth |
| GB8333624D0 (en) * | 1983-12-16 | 1984-01-25 | Lepetit Spa | Antibiotics l 17054 and l 17392 |
| GB8415092D0 (en) * | 1984-06-13 | 1984-07-18 | Lepetit Spa | Ester derivatives |
| GB8415093D0 (en) * | 1984-06-13 | 1984-07-18 | Lepetit Spa | Antibiotic l 17392 |
| GB8428619D0 (en) * | 1984-11-13 | 1984-12-19 | Lepetit Spa | Derivatives of antibiotic l 17046 |
| GB8512795D0 (en) * | 1985-05-21 | 1985-06-26 | Lepetit Spa | Increasing ratio of components of teicoplanin a2 complex |
| US4694069A (en) * | 1985-09-30 | 1987-09-15 | Smithkline Beckman Corporation | Kibdelosporangium aridum SK&F-AAD-609 |
| JPS61241319A (ja) * | 1986-04-25 | 1986-10-27 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 新規エーテル‐エステルブロツク共重合体を含有する室温硬化性組成物 |
| US4845194A (en) * | 1987-02-27 | 1989-07-04 | Eli Lilly And Company | Glycopeptide recovery process |
| GB8715735D0 (en) * | 1987-07-03 | 1987-08-12 | Lepetit Spa | De-mannosyl teicoplanin derivatives |
| US4996148A (en) * | 1987-07-13 | 1991-02-26 | Eli Lilly And Company | A80407 antibiotics |
| US5213797A (en) * | 1987-07-13 | 1993-05-25 | Eli Lilly And Company | A80407 antibiotics |
| GB8720980D0 (en) * | 1987-09-07 | 1987-10-14 | Lepetit Spa | Derivatives |
| US5194424A (en) * | 1988-12-27 | 1993-03-16 | Gruppo Lepetit Spa | C63 -amide derivatives of 34-de(acetylglucosaminyl)-34-deoxy-teicoplanin and their use as medicaments against bacteria resistant to glycopeptide antibiotics |
| WO1992010516A1 (en) * | 1990-12-05 | 1992-06-25 | Gruppo Lepetit S.P.A. | 38-decarboxy-38-hydroxymethyl derivatives of teicoplanin antibiotics, and a process for preparing them |
| US5606036A (en) * | 1991-03-27 | 1997-02-25 | Gruppo Lepetit Spa | Antibiotic A 40926 ester derivatives |
| CA2250578C (en) | 1996-04-23 | 2003-06-24 | Versicor Inc. | Improved chemical process for preparing amide derivatives of antibiotic a 40926 |
| KR100476818B1 (ko) * | 2002-07-19 | 2005-03-17 | 종근당바이오 주식회사 | 테이코플라닌 에이 투 정제 방법 |
| US20060074014A1 (en) * | 2002-11-18 | 2006-04-06 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections |
| US7119061B2 (en) * | 2002-11-18 | 2006-10-10 | Vicuron Pharmaceuticals, Inc. | Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections |
| MXPA05005338A (es) | 2002-11-18 | 2005-12-14 | Vicuron Pharm Inc | Metodos para administrar dalbavancin para el tratamiento de infecciones bacterianas. |
| EP1806150A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-11 | NEED PHARMA S.r.l. | Teicoplanin composition |
| CN102718843B (zh) * | 2012-06-30 | 2014-05-14 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种替考拉宁单组份的制备方法 |
| CN114112612A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-03-01 | 丽珠集团福州福兴医药有限公司 | 一种替考拉宁i5杂质的分离纯化方法及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1496386A (en) * | 1975-03-05 | 1977-12-30 | Lepetit Spa | Antibiotics |
-
1983
- 1983-05-12 FI FI831660A patent/FI73697C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-05-16 NO NO831754A patent/NO159104C/no not_active IP Right Cessation
- 1983-05-19 ZA ZA833607A patent/ZA833607B/xx unknown
- 1983-05-25 AU AU14968/83A patent/AU560966B2/en not_active Expired
- 1983-05-27 GR GR71483A patent/GR78267B/el unknown
- 1983-05-31 IL IL68819A patent/IL68819A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-05-31 DK DK245883A patent/DK159117C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-06-01 GB GB08315003A patent/GB2121401B/en not_active Expired
- 1983-06-01 PH PH28999A patent/PH19533A/en unknown
- 1983-06-01 ES ES522941A patent/ES522941A0/es active Granted
- 1983-06-02 IT IT8321432A patent/IT1212085B/it active Protection Beyond IP Right Term
- 1983-06-03 NL NL8301980A patent/NL8301980A/nl active Search and Examination
- 1983-06-04 DE DE3320342A patent/DE3320342A1/de active Granted
- 1983-06-07 SE SE8303211A patent/SE459094B/sv not_active IP Right Cessation
- 1983-06-07 CH CH3124/83A patent/CH657139A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1983-06-07 BE BE0/210960A patent/BE896993A/fr not_active IP Right Cessation
- 1983-06-07 IE IE1329/83A patent/IE55025B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-06-07 SU SU833604953A patent/SU1318170A3/ru active
- 1983-06-07 NZ NZ204480A patent/NZ204480A/en unknown
- 1983-06-07 HU HU832029A patent/HU193538B/hu unknown
- 1983-06-07 PT PT76831A patent/PT76831B/pt unknown
- 1983-06-07 KR KR1019830002517A patent/KR900008246B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-06-07 UA UA3604953A patent/UA6025A1/uk unknown
- 1983-06-07 CA CA000429836A patent/CA1208204A/en not_active Expired
- 1983-06-07 US US06/502,043 patent/US4542018A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-06-08 FR FR8309522A patent/FR2528050B1/fr not_active Expired
- 1983-06-08 LU LU84853A patent/LU84853A1/fr unknown
- 1983-06-08 JP JP58102508A patent/JPS591423A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-15 ES ES536770A patent/ES536770A0/es active Granted
-
1986
- 1986-08-29 SG SG706/86A patent/SG70686G/en unknown
-
1987
- 1987-07-30 HK HK558/87A patent/HK55887A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-12-30 MY MY2/87A patent/MY8700002A/xx unknown
-
1989
- 1989-10-24 JP JP1276997A patent/JPH02291278A/ja active Granted
- 1989-10-24 JP JP1276999A patent/JPH02288888A/ja active Granted
- 1989-10-24 JP JP1276998A patent/JPH02288887A/ja active Granted
- 1989-10-24 JP JP1277000A patent/JPH02291279A/ja active Granted
-
1994
- 1994-02-24 BG BG98541A patent/BG60529B2/bg unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU193538B (en) | Process for separating pure 1, 2, 3, 4 and 5 factores of teichomycine a2 | |
| KR910008626B1 (ko) | 항생물질 l 17054의 순수 제제의 제조 방법 | |
| NL192989C (nl) | Antibioticum, werkwijze voor de bereiding en farmaceutisch preparaat dat dit antibioticum bevat. | |
| HU194317B (en) | Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof | |
| JPH0653746B2 (ja) | 抗生物質ｌ１７３９２及びその塩の化学的製造方法 | |
| JP2997510B2 (ja) | 抗生物質ｇｅ２２７０因子ａ▲下１▼、ａ▲下２▼、ａ▲下３▼およびｈ | |
| DE69108972T2 (de) | Antibiotika GE 2270 Faktoren B1, B2, C1, D1, D2, E und T. | |
| CA1088441A (en) | Antibiotics, neoviridogriseins, and their method of production | |
| JPH07114704B2 (ja) | 抗生物質ａ４２８６７およびその付加塩 | |
| US4264736A (en) | Antibiotic 890A10 | |
| HU193905B (en) | Process for preparing glycopeptide antibiotics by means of bioconversion | |
| JPH0430400B2 (hu) | ||
| US3973015A (en) | Antibiotic A16884 | |
| US3682886A (en) | Antibiotic 18.631 r.p. | |
| JPH01240196A (ja) | 新規グリコペプチド系抗生物質ｐａ−４５０５２ | |
| US4264735A (en) | Method of producing antibiotic 890A9 | |
| US3853992A (en) | Antibiotic em-98 | |
| Cassidy et al. | Antibiotic 890A 10 | |
| JPH0566111B2 (hu) | ||
| Cassidy et al. | Method of producing antibiotic 890A 9 | |
| JPH03197489A (ja) | 抗生物質ｔａｎ―１１７１およびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: AVENTIS BULK S.P.A., IT |