FR2982152A1 - Polysaccharides sulfates agent d'hydratation de la peau - Google Patents

Abstract

L'invention concerne procédé cosmétique non thérapeutique pour améliorer la fonction barrière de la peau et/ou hydrater la peau comprenant l'application sur la peau d'un composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un polysaccharide sulfaté comprenant de 2 % à 60 % en poids, par rapport au poids total du polymère, de motif rhamnose. Utilisation dudit polysaccharide sulfaté comme agent hydratant de la peau.

Description

La présente invention concerne un procédé cosmétique d'hydratation de la peau utilisant un polysaccharide sulfaté à motif rhamnose particulier. La peau est un tissu dont les cellules sont jointives, et solidaires les unes des autres. Le tissu cutané forme un revêtement externe comprenant des glandes sébacées ou sudori- pares, et les follicules pileux. La peau, et notamment le cuir chevelu, sont des épithéliums à renouvellement continuel. Le renouvellement, ou desquamation, est un processus coordonné et finement régulé aboutissant à l'élimination des cellules superficielles, de façon insensible et non visible.

La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment super- ficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme. L'épiderme est conventionnellement divisé en une couche basale de kératinocytes constituant la couche germinative de l'épiderme, une couche dite épineuse constituée de plusieurs couches de cellules polyhédriques disposées sur les couches germinatives, une à trois couches dites granuleuses constituées de cellules aplaties contenant des inclusions cytoplasmiques distinctes, les grains de kératohyaline et enfin, un ensemble de couches supérieures appelées couches cornées (ou stratum corneum), constituée de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation appelés cornéocytes. Les cornéocytes sont des cellules anucléées principalement constituées d'une matière fibreuse contenant des cytokératines, entourée d'une enveloppe cornée. Il y a en perma- nence production de nouveaux kératinocytes pour compenser la perte en continu de cellules épidermiques au niveau de la couche cornée selon un mécanisme dénommé desquamation. Toutefois, un déséquilibre entre la production des cellules au niveau de la couche basale et le taux de desquamation peut notamment conduire à des formations d'écailles à la sur- face de la peau. De même, un déficit de différentiation terminale des cellules du stratum corneum, pour diverses raisons, peut conduire à la formation d'amas de cellules de grandes tailles, épais, visibles à l'oail nu, et dénommés « squames », ou dans d'autres situations, à un amincissement du stratum corneum. Les troubles de cette différentiation terminale peuvent aboutir à une fragilité, voire un défaut des propriétés barrières de l'épiderme, à une déshydratation chronique du stratum corneum, une perte d'élasticité mécanique, des tiraillements, ainsi qu'à un manque d'éclat et de transparence de la peau. A titre d'exemple de facteurs favorisant cette altération de la qualité de surface de la peau, on peut mentionner le stress, la période hivernale, un excès de sébum, un défaut d'hydratation. Ces désordres apparaissent aussi dans le cas des peaux sèches de sujets âgés.

Ainsi une altération de la barrière cutanée peut se produire en présence d'agressions externes de type agents irritants (détergents, acides, bases, oxydants, réducteurs, solvants concentrés, gaz ou fumées nocives), sollicitations mécaniques (frottements, chocs, abrasion, arrachement de la surface, projection de poussières, de particules, rasage ou épila- tion), déséquilibres thermiques ou climatiques (froid, sécheresse, radiations), xénobio- tiques (micro-organismes indésirables, allergènes) ou d'agressions internes de type stress psychologique. L'une des étapes critiques dans le processus de différentiation terminale du stratum cor- neum est la réticulation des précurseurs protéiques l'enveloppe cornée (EC). Ce phéno- mène joue un rôle essentiel dans le développement et le maintien de la cohésion cutanée, les propriétés physiques de la peau comme la fonction barrière, et est une étape cruciale dans le processus de différentiation terminale. L'enveloppe cornée est un composant essentiel des cornéocytes. Chez les sujets en bonne santé, une altération de la fonction barrière, en particulier du visage, peut être as- sociée à la présence d'enveloppe cornée immature et fragile dans les couches superficielles du stratum corneum (Hirao T et al. I FSCC Mag 2002; 6(2):103-109). La maturation de l'enveloppe cornée depuis les couches profondes jusqu'aux couches superficielles du stratum corneum peut être caractérisée par des paramètres morpholo- gigues et biophysiques ou mécaniques. Les actifs hydratants classiquement utilisés, comme les humectants, les polymères hydratants, les corps gras comme la vaseline modifient de façon transitoire les propriétés superficielles de la peau. Ces actifs peuvent entraîner un assouplissement mécanique du stratum corneum, une augmentation de son état d'hydratation, une amélioration du micro- relief de la peau par formation d'un film en surface de la peau. Généralement, ces effets ne sont pas rémanents dans le temps et ne durent que quelques heures. De plus, après nettoyage de la peau, ces actifs sont éliminés et l'effet d'assouplissement mécanique de la peau, l'amélioration de la texture de la peau ou de ses propriétés optiques disparaissent. Par ailleurs, l'utilisation de filmogènes sur la peau, en particulier l'utilisation de polysaccharides humectants comme le carraghénane, conduit souvent à un effet "tenseur" de la peau, une augmentation du module élastique de la peau et cette rigidification de surface entraîne un inconfort de la peau.

Il existe donc un besoin d'actifs améliorant l'état d'hydratation de la peau, en particulier des peaux sèches ou âgées, en évitant les tiraillements et les sensations d'inconfort lors de leur application sur la peau.

Le maintien ou le rétablissement d'une enveloppe cornée présentant une maturation cor- recte est essentiel pour préserver une fonction barrière de bonne qualité assurant une protection contre les agressions externes et une hydratation durable de la peau, en particulier de l'épiderme. De manière inattendue, il a été trouvé que ces buts peuvent être atteints en utilisant des polysaccharides sulfatés à motifs rhamnose particuliers qui favorisent la maturation des enveloppes cornées des cornéocytes; cette induction de la différentiation permet une amélioration durable de la qualité de surface de la peau, en particulier de l'état d'hydratation de la peau Les inventeurs ont découvert que certains polysaccharides à motif rhamnose décrits ci- après sont de bons agents pour améliorer la fonction barrière de la peau . Ces polysaccharides sont donc de bons agents hydratants de la peau, en particulier de la peau sèche. De plus, ces polysaccharides lors de l'application sur la peau ne présentent pas de sensation d'inconfort, de tiraillement de la peau.

Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé cosmétique non thérapeutique pour améliorer la fonction barrière de la peau et/ou hydrater la peau comprenant l'application sur la peau d'un composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un polysaccharide sulfaté comprenant de 2 % à 60 % en poids, par rapport au poids total du polymère, de motif rhamnose. Ledit procédé cosmétique convient pour le traitement de la peau sèche. L'invention a en outre pour objet l'utilisation cosmétique d'un polysaccharide sulfaté à motif rhamnose tel que décrit précédemment comme agent hydratant de la peau.

Les polysaccharides sulfatés à motifs rhamnose utilisés selon l'invention peuvent être choisis parmi les ulvanes, et les exopolysaccharides sulfatés à motif rhamnose. Le rhamnose est présent dans ces polysaccharides en une teneur allant de 2 % à 60 % en poids, par rapport au poids total du polysaccharide, et de préférence allant de 5 % à 40 % en poids. Préférentiellement, cette teneur en rhamnose peut aller de 5 % à 30 % en poids, par rapport au poids total du polysaccharide. Avantageusement, le taux de sulfatation des polysaccharides peut aller de 1 % à 30 % en poids, par rapport au poids du polysaccharide. De préférence ce taux de sulfatation peut aller de 2 % à 20 % en poids.

Le polysaccharide peut être éventuellement acétyle. Le taux d'acétylation peut aller de 0 à 10 % en poids (taux pondéral de motifs acétyle par rapport au poids total du polymère) . Le polysaccharide utilisé selon l'invention a de préférence un poids moléculaire moyen en en poids est compris entre 1000 et 10.106 Daltons, préférentiellement entre 5000 et 2.106 Da, préférentiellement entre 10 000 et 1,5.106 Da et plus préférentiellement entre 100 000 et 1 200 000 Da . Les polysaccharides sulfatés à motifs rhamnose utilisés selon l'invention peuvent être choisis parmi les ulvanes. Les ulvanes sont des extraits polysaccharidiques sulfatés contenant du rhamnose obtenus à partir d'algues vertes appartenant à l'ordre des ulvales. Les ulvanes sont des polysaccharides anioniques sulfatés solubles dans l'eau qui sont lo- calisés au niveau de la cellule dans la paroi cellulaire. Les ulvanes sont notamment extraits des ulves ou des entéromorphes. Ces algues de couleur verte font partie du phyllum des chlorophytes et de l'ordre des ulvales caractérisées par un thalle en tube (entéromorphe) ou en double couche cellulaire (ulve). Ces extraits ulvanes peuvent être obtenus à partir de nombreuses espèces d'ulves parmi lesquelles on peut citer Ulva lactuca, Ulva rigida, Ulva armoricana, Ulva rotundata et UI- varia obscura, ainsi que plusieurs espèces d'entéromorphes telles que notamment Enteromorpha compressa, Enteromorpha intestinalis et Enteromorpha ramulosa. Les ulvanes représentent de 8 à 29 % du poids sec des algues. Ils sont principalement constitués de rhamnose, d'acide glucuronique, de glucose, de galactose et de xylose et comprennent aussi des groupements sulfates. Ils peuvent également comprendre des quantités variables d'acide galacturonique , d'acide iduronique et de mannose. Le rhamnose est généralement sulfaté en position 3. Le xylose peut également être partiellement sulfaté. La plupart des sucres constitutifs sont distribués selon des séquences répétitives. Les deux majeures sont des séquences disaccharidiques, l'une dénommée acide ulvanobiuronique à 3 sulfates dite de type A (A3s) comprenant du rhamnose 3- sulfate lié à de l'acide glucuronique par une liaison de type 1-4, l'autre dénommée acide ulvanobiuronique à 3 sulfates dite de type B (B3s) comprenant du rhamnose 3-sulfate lié à de l'acide Iduronique par une liaison de type 1-4. La proportion relative des sucres est variable selon le lieu de récolte des ulves, l'espèce et aussi le moment de récoltes dans l'année. Pour l'obtention d'ulvanes par extraction à partir de l'ulve, on peut se reporter aux procédés d'extraction décrits dans Carbohydrate Research 274 (1995) 251-261 ou dans Hydrobiologia 326/327 ;473-480,1996. D'une façon générale, les extraits utilisés selon l'invention sont avantageusement prépa- rés par extraction en milieu aqueux d'ulves et/ou d'entéromorphes, l'étape d'extraction étant avantageusement suivie d'une étape d'ultrafiltration. Par exemple, l'extraction des ulvanes peut être réalisée soit à partir des algues séchées, soit de préférence à partir des algues fraîches congelées à -30°C.

Les algues sont décongelées puis broyées grossièrement en morceaux d'environ 0,5cm et mises à macérer dans de l'oxalate de sodium 0,05 M pendant 2 heures, sous agitation constante, à 85-90°C. La suspension est ensuite filtrée sur toile puis sur Büchner, après ajout de 2% de terre filtrante (Celatom® Diatomite, Eagle-Picher). Le filtrat est alors concentré par ultrafiltration (membrane 10 kDa, Millipore) et diafiltré contre 5 volumes d'eau ultra-pure. Après congélation, l'extrait est lyophilisé et conservé au sec.

Analyses réalisées sur des extraits d'ulvane : La matière sèche, la matière minérale, la matière organique, ainsi que les teneurs en sulfates et en protéines des ulvanes extraits ont été mesurées selon les méthodes suivantes : La teneur en matière sèche (MS) correspond au poids obtenu après séchage 24h à 103°C ; Les teneur en matière organique (MO) et minérale (MM) ont été quantifiée par gravimétrie après 12h à 550°C ; La teneur en sulfate (SO4) a été quantifiée selon Quemener et al. (1997) ; La teneur en protéines a été estimée à partir du dosage d'azote N Kjelhdahl x 6.25 ; La teneur totale en acides uroniques a été déterminée par méthode colorimétrique, à l'aide du m-phényl phénol (Thibault, 1979), en utilisant l'acide D-glucuronique comme étaIon Le profil des sucres (neutres et uroniques) a été réalisé, après méthanolyse acide et chromatographie HPLC en phase inverse (Absorbosphere RP18, 5 pm, 4 x 250 mm) se- Ion Quemener et al. 2000 ; Le profil de distribution des masses molaires de l'ulvane a été établi par chromatographie HPLC d'exclusion stérique (colonne Shodex SB-806M HQ, volume d'injection : 50 pL, phase mobile : 0,05M NaNO3 + 0,02% NaN3, débit : 0,5 mL/min, pression : 20 bars, détecteurs : indice de réfraction et UV multi-longueurs d'ondes).

Les références suivantes décrivent les méthodes de dosages utilisées : - Quemener, B., Lahaye, M., Bobin-Dubigeon, C. (1997) Sugar determination in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion exchange chromatogra30 phy. Journal of Applied Phycology, 9, 179-188. - Thibault J.-F. 1979. Automatisation du dosage des substances pectiques par la méthode au méta-hydroxydiphényl. Lebensm-Wiss. Technol., 12, pp. 247-251. - Quemener B., Marot C., Mouillet L., Da Riz V., Diris J. (2000). Quantitative analysis of hydrocolloids in food systems by methanolysis coupled to reverse HPLC. Food Hydrocolloids, 14, pp. 9-17. Comme exemples particuliers d'ulvanes, on peut utiliser ceux ayant les caractéristiques suivantes (en pourcentages pondéraux) : Ulvane UR (extrait à partir de l'algue Ulva rotunda selon le protocole décrit précédem- 45 ment ; évalué dans les exemples 1 et 2) : MS (% MB) = 94,9 % MO (% MS) = 75,9 % MM (% MS) = 24,1 % Na (% MS) = 5,74 % 50 Protéines (N x 6,25) (%MS) = 7,40 % Rhamnose % = 25,30 % Acide glucuronique = 17,40 % Acide iduronique % = 3,20 % Xylose % = 3,4 % 55 Galactose % = 1,80 % 35 40 Glucose % = 0,70 % Teneur en sulfate = 15,70 % Mw (éq. pullulan g/mol) HP-SEC = Bipopulé 1 062 300 Da (54%) 123 200 Da (46%) Les polysaccharides sulfatés à motifs rhamnose utilisés selon l'invention peuvent être choisis parmi les exopolysaccharides sulfatés à motif rhamnose.

Les exopolysaccharides (appelés en abréviation EPS) sont de façon connue des polysaccharides excrétés par diverses souches de bactéries marines. La majorités de ces polysaccharides sont constitués de glucose, de galactose, de rhamnose, et éventuellement d'acide glucuronique et d'acide galacturonique.

Ces exopolysaccharides sulfatés peuvent être obtenus à parti de souches bactériennes de type cyanobactéries ou d'Alteromonas. De tels exopolysaccharides sont par exemples décrits dans la thèse d'Olivier Roger : Etude d'oligosaccharides bioactifs issus d'exopolysaccharides bactériens : obtention, caractérisation et relation structure/fonction (Université paris 13) publiée le 29.11.2002. (http://archimer.ifremer.fr/doc/2002/these-622.pdf). Les exopolysaccharides sulfatés utilisés selon l'invention contiennent des substituants inorganiques sulfates , comme par exemple décrit en page 18 de la thèse citée précédemment.

Comme exemple d'exopolysaccharides sulfatés à motif rhamnose, on peut citer les spirulanes. Les spirulanes sont des extraits polysaccharidiques obtenus à partir de la spiruline qui est à la fois une microalgue et une cyanobactérie (anciennement désignée par le terme « algue bleue » puis cyanophycée). La spiruline est donc une algue bleue planctonique unicellulaire nommée également Arthrospira platensis. La spiruline est notamment composée de protéines végétales (55 % à 70 % de son poids) et de polysaccharides (environ 20% de son poids) dont des polysaccharides sulfatés spé- cifiques dénommés spirulanes. Les spirulanes sont principalement constitués de rhamnose, ribose, mannose, fructose, galactose, xylose, glucose, d'acide glucuronique et d'acide galacturonique et compren- nent aussi des groupements sulfates. Des sucres méthyles peuvent également être pré- sents comme le 3-O-methylrhamnose (acofriose), le 2,3-di-O-methylrhamnose, le 3-0- methylxylose. Ces extraits spirulanes peuvent être obtenus à partir de différentes espèces de spirulines parmi lesquelles on peut citer Arthrospira spirulina ou Spirulina platensis et Spirulina maxima. Comme exemples particuliers de spirulanes , on peut utiliser celui ayant les caractéristiques suivantes : Spirulane (extrait à partir de l'algue Spirulina sp ; évalué dans les exemples 1 et 2) : M S (% M B) = 100 % MO (% MS) = 89,2 % MM (% MS) = 10,8 % Na (% MS) = 2,90 % Protéines (N x 6,25) (% MS) = 51,31 % Rhamnose = 6,60 % Glucose = 3,30 % Galactose = 3,00 % Xylose = 1,30 % Acide glucuronique = 1,40 % Teneur en sulfate = 2,20 % Mw (éq. pullulan g/mol) HP-SEC = 263280 Da.

Les polysaccharides sulfatés à motif rhamnose peuvent être présents dans les compositions cosmétiques dans des teneurs allant de 0,01 à 20 %, de préférence de 0,01 à 15 % et de façon encore plus préférée de 0,1 à 10 % en poids par rapport au poids total de la composition cosmétique.

Les compositions utilisées selon l'invention contiennent un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec les tissus cutanés tels que la peau et le cuir chevelu. Ce milieu physiologiquement acceptable peut être plus particulièrement constitué d'eau et éventuellement d'un solvant organique physiologiquement acceptable choisi par exemple parmi les alcools inférieurs comportant de 1 à 8 atomes de carbone et en parti- culier de 1 à 6 atomes de carbone, comme l'éthanol, l'isopropanol, le propanol, le butanol ; les polyéthylène glycols ayant de 6 à 80 unités oxyde d'éthylène et les polyols comme le propylène glycol, l'isoprène glycol, le butylène glycol, la glycérine et le sorbitol.

Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes galé- niques classiquement utilisées pour une application topique et notamment sous forme de solutions aqueuses, hydroalcooliques, d'émulsions huile-dans-eau (H/E) ou eau-danshuile (E/H) ou multiple (triple : E/H/E ou H/E/H), de gels aqueux, ou de dispersions d'une phase grasse dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non ionique (liposomes, niosomes, oléosomes). Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. En outre, les compositions utilisées selon l'invention peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent être éventuellement appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, et par exemple sous forme de stick.

La composition utilisée selon l'invention comprendre des adjuvants usuellement em- ployés dans le domaine cosmétique, et notamment choisis parmi l'eau; les huiles ; les cires, les pigments, les charges, les colorants, les tensioactifs, les émulsionnants ; les actifs cosmétiques, les filtres UV, les polymères, les épaississants, les polymères filmogènes, les conservateurs, les parfums, les bactéricides , les absorbeurs d'odeur, les antioxydants.

Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le do- maine considéré, et par exemple de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Les exemples ci-après illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.

Exemple 1 : Evaluation du potentiel d'hydratation In vivo, il a été mis en évidence qu'un défaut d'hydratation de la peau et un défaut de la fonction barrière de la peau étaient corrélés avec une augmentation du taux d'enveloppes cornées immatures. Un test in vitro sur peau reconstruite a été conduit pour déterminer l'influence de plusieurs polysaccharides sulfatés à motif rhamnose sur le taux d'enveloppe cornée immatures . Les épidermes reconstruits d'Episkin® ont été utilisés pour évaluer l'activité hydratante de plusieurs polysaccharides sulfatés à motif rhamnose.

Les Episkin J7 ont été cultivés avec les polysaccharides sulfatés à motif rhamnose évalués pendant 7 jours. Après isolement du stratum, les enveloppes cornées ont été extraites. Trois types d'enveloppes cornées, matures, intermédiaires et immatures sont identifiés et comptées par un logiciel d'analyse d'image développé spécifiquement. Traitements : Les kits d'Episkin® ont été réceptionnés à 7 jours (J7) de culture. La gélose de transport est changée au profit du milieu de différentiation. Chaque échantillon a été traité par 30 pl d'eau ou de polysaccharide sulfaté à évaluer en solution dans l'eau. Les kits ainsi traités ont été mis en culture en étuve humide à 37°C sous CO2. Cette procédure (changement du milieu de culture et traitement) a été appliquée à J7, J9, J10 et J13.

A J14, les échantillons ont été punchés (découpe de disques - punch - de diamètre 4 mm). Les punchs ont été réservés aux coupes histologiques (coloration Hématoxyline Éosine Safran). L'épiderme restant a été récupéré et le stratum corneum a été isolé par digestion trypsique (mise en contact 1 heure à température ambiante - TA = 25 °C - solution de trypsine bovine de pancréas à 10% (commercialisé par la société Sigma-Aldrich sous la référence Trypsin from bovine pancreas (ref : T9201) - powder, >7,500 BAEE units/mg solid ) dans tampon Tris-HCI à pH 8) . Les stratum corneum ont été rincés dans 3 bains successifs d'eau ultrapure. Puis ils ont été séchés pendant 24 heures en boîte de dessiccation (en présence de gel de silice en grenailles Chameleon® C 1-3 mm vendu par la société WWR ; agent dessicant). Les stratum corneum ont été alors punchés (punch diamètre 4mm) pour la préparation des enveloppes cornées (EC). Un test de viabilité cellulaire (MTT) est réalisé.

Extraction des enveloppes cornées : Les punchs ont été placés dans des microtubes de 2 ml et immergés dans 1,5 ml de tampon de dénaturation (Tris-HCI 100 mM pH 8.5, Dithiothréitol 20mM, sodium lauryl sulfate 2 %, EDTA 5mM1). Les échantillons ont été portés à 100° C dans un bain sec pendant 10 minutes sans agitation. Ils ont été centrifugés (3000 tours/min, 10min, 20°C). Les culots ont été récupérés. La phase de dénaturation a été appliquée 3 fois. Les culots finaux ont été repris dans 0,5 ml de tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) sans Ca2+ et Mg 2+ et vortexés.

Les suspensions cellulaires ont été déposées sur lames fonctionnalisées (SuperFrost Gold Plus à raison de 100 pl dans un puits de 15X16 mm (GeneFrame), séchés à température ambiante à l'abri de la poussière pendant 24 heures. Les lames ont été fixées au méthanol à -20°C pendant 10 minutes, puis séchées sous hotte.

Quantification des différents types d'enveloppes cornées (matures, intermédiaires et immatures) : immunomarquaqe involucrine et contre-coloration lipidique : Protocole : Les lames immunomarquées ont été visionnées sous microscope (DM6000B Leica) suivant 2 modes d'observation : contraste de phase et fluorescence. Le contraste de phase fournit une image en niveau de gris nous permettant de visualiser l'ensemble des cellules présentes dans le champ. Le mode fluorescence (jeu de filter- cube) a été utilisé pour visualiser les fluorochromes fixées à l'échantillon : - Le Nile Red est une sonde fluorescente permettant de localiser les zones hydrophobes plus particulièrement les lipides. Il est mis en évidence par le filtre N2.1. Ce marqueur met en évidence les cellules matures. - L'Alexa Fluor® 488 est un fluorochrome sans spécificité particulière. Il est couplé à un anticorps secondaire. Celui-ci reconnaît spécifiquement l'anticorps primaire, spécifique de l'involucrine. La visualisation a été réalisée grâce au filtre L5. Ce marqueur met en évidence les cellules immatures. Filtercube Corrélation Fluoro- Excitation Excitation Dichromatic Supression Filter chrome/filtercube Range Filter Mirror N2.1 Nile Red Green BP 560515- 580 LP 590 L5 Alexa Fluor 488 Blue BP 480/40 505 BP 527/30 - Hydratation des lames dans DPBS (Dulbecco's PBS) 10 min à TA Saturation dans DPBS / BSA (Bovine Serum Albumine) à 5 % 20 min à TA Saturation dans DPBS / BSA à 0.2 % 10 min à TA - Dépôt de 100 pl d'anti-corps primaire ([Monoclonal anti-involucrine Clone SY5] au 1/100ème) 1h à l'obscurité en milieu humide sous agitation légère o Rinçages X3 dans DPBS (3 fois 5 min) sous agitation Dépôt de 100p1 anti-corps secondaire ([Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG (H+L) 2mg/ml - A11001 Invitrogen] au 1/100ème) 1h à l'obscurité en milieu humide sous agitation légère o 3 Rinçages dans DPBS (3 fois 5 min) sous agitation Coloration au Nile Red dans une solution aqueuse à 75% de glycérol pendant 10min à TA o 3 Rinçages au DPBS (3 fois 5 min) sous agitation o Rinçage rapide à l'acétone Montage au Citifluor AF1 Les différents types d'enveloppes cornées (marquées au Nile Red, mises en évidence par l'Alexa Fluor® 488) sont dénombrés sur les images acquises au microscope à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images (Image J) en utilisant une macro de comptage. On connaît alors pour chaque échantillon le nombre de cellules matures et le nombre de cellules immatures, que l'on compare aux témoins sur lesquels seul le solvant a été appliqué. On a déterminé le pourcentage d'augmentation des enveloppes cornées matures par rap- port au témoin eau.

On a obtenu les résultats suivants : Polysaccharide sulfaté testé Teneur testée (en % en Variation de la maturation poids) des enveloppes cornées ( % par rapport au témoin eau) Ulvane UR 3 + 12 Spirulane 3 + 66 Ces résultats montrent que les 2 polysaccharides sulfatés étudiés induisent une forte augmentation du taux d'enveloppes matures après traitement . Cette augmentation très significative de la maturation de l'enveloppe cornée a un impact favorable sur la fonction barrière du stratum corneum, son hydratation et sa résistance face au dessèchement et aux variations d'hygrométrie extérieure. Exemple 2 : Evaluation de l'assouplissement mécanique du stratum corneum et du confort d'application On a utilisé un appareil de DMA (Dynamic Mechanical Analysis) vendu sous la référence ElectroForce® 3100 par la société Bose.

Cette technique permet d'étudier les propriétés viscoélastiques du stratum corneum. On sollicite sinusoïdalement le matériau et on mesure sa déformation. On peut alors déterminer le module de conservation (E') du stratum corneum, qui le caractérise mécaniquement. Cette grandeur est directement liée aux propriétés élastiques du stratum corneum. On a étudié l'impact de plusieurs polysaccharides sulfatés sur ce module de conserva- tion. Préparation des échantillons et Protocole : La surface de l'échantillon de Stratum Corneum à tester est de 2 cm2 (1 cm X 2 cm). Les échantillons ont été préalablement conditionnés à 75% d'humidité relative pendant mini- mum 12 heures, et la mesure a été également réalisée à 75% d'humidité relative. On a préparé des solutions de polysaccharide sulfaté à 1% (extrait sec) dans l'eau. On a déposé 10 pl/cm2 de solution à tester, sur l'échantillon de stratum. La solution a été étalée sur le stratum corneum de manière à recouvrir la surface entière.

L'amplitude dynamique de sollicitation a été réglée à 40 pm, ce qui correspond à une déformation dans le domaine élastique du Stratum Corneum (0,2 % de déformation). On a sollicite chaque échantillon à la fréquence de 1 Hz, selon la plus grande longueur. On a utilise toujours du stratum corneum provenant du même donneur.

On a également évalué, à titre comparatif, le carraghénane (polysaccharide sulfaté sans motif rhamnose) vendu sous la dénomination Satiagum UTC 10 par la société Cargill. Pour chaque polysaccharide sulfaté évalué, on a calculé la variation du module élastique mesuré avec chaque échantillon traité, pendant les deux premières heures de traitement, (E2h) par rapport à celui du même échantillon non traité à t=0 (E0). AE = E2h / E0 On a obtenu les résultats suivants : Polysaccharide testé AE Ulvane UR 1,2 Spirulane 1,4 carraghénane 2,7 Les résultats obtenus montrent que l'application des polysaccharides sulfatés à motif rhamnose de type Ulvane, Spirulane sur sur le stratum corneum humain entraîne une augmentation de module élastique faible (varaiation inférieure à 1,5), voire nulle au cours des deux premières heures de séchage, au contraire des autres types de polysaccharides sulfatés de type carraghénane ou porphyridium. Les polysaccarides sulfatés à motifs rhamnose conduisent donc après l'application sur la peau à un effet de confort (absence de tiraillement) nettement supérieur pendant les premières minutes et heures de l'application, à celui du carraghénane. Exemple 3 : Evaluation de la rémanence de l'hydratation et la rémanence de la fonction barrière On a mesuré l'évolution de la dureté de cornéocytes matures et immatures en fonction de différents taux d'hygrométrie ambiante. Des strippings vernis ont été réalisés en extrême surface et en profondeur sur des peaux qualifiées de type normal par un dermatologue. Les prélèvements en extrême surface permettent un approvisionnement en cornéocytes matures (à enveloppe rigide). Les pré- lèvements en profondeur (c'est-à-dire à la jonction avec l'épiderme) permettent un approvisionnement en cornéocytes mature (avec une enveloppe fragile). Des cornéocytes isolés ont été prélevés de ces strippings. Les cornéocytes sont obtenus après agitation directe du stripping et centrifugation en tampon Tris-HCI et Triton X 100.

L'état de maturation de ces cornéocytes à enveloppe rigide et fragile a été caractérisé par les mêmes types de marquage que ceux décrits dans l'exemple 1. Il a donc été ainsi validé que l'on disposait d'une population de cornéocytes à enveloppe mature et d'une population de cornéocytes à enveloppe immature. Les essais ont été réalisés sur ces deux types de population de cornéocytes.

On a utilisé la technique de nanoindentation en employant l'appareil MTS Nanoindentor XP Les mesures ont été effectuées dans une enceinte thermostatée à 30 °C et à hygrométrie contrôlée à différentes taux d'hygrométrie (humidité relative) respectivement de 20 % , 50 % et 70 %. A 30 °C.

Par l'application d'une force normale sur la surface du cornéocyte, à l'aide d'un système bobine / aimant et par la mesure du déplacement d'un poinçon indéformable en diamant à l'aide de capteur capacitif, la technique de nanodureté instrumentée permet de déterminer les grandeurs mécaniques comme la dureté du cornéocyte testé à une profondeur don- née. Les essais de nano-indentation ont été realisés à un taux de déformation imposé (P'/P =3.10-2 5-1 ; P est la charge appliquée et P' est la dérivée de cette charge) et à une charge maximale de 1 mN. L'amplitude de la composante sinusoïdale du signal est de 7 nm et la fréquence de travail de 32 Hz. Un indent a été réalisé sur chaque cornéocyte.

L'analyse des résultats est basée sur les valeurs quantitatives des grandeurs mécaniques de dureté, entre 10 nm et l'enfoncement maximal, soit entre 50 nm et 100 nm. Ainsi l'évolution de la dureté en fonction de l'enfoncement plastique dans le matériau a été mise en évidence en fonction du taux d'hygrométrie.

On a obtenu les résultats suivants : Dureté Hv (MPa) Hygrométrie HR Hygrométrie HR Hygrométrie HR 20% 50% 70% Cornéocyte ma- 158 135 99 ture Cornéocyte im- 155 113 39 mature On a ainsi constaté que la dureté des cornéocytes immatures diminue très fortement lorsque le taux d'hygrométrie augmente (baisse de 74,8 % entre les duretés à 20 % HR et à 70 % HR). Tandis que la dureté des cornéocytes matures diminue bien plus faiblement (baisse de 37,3 % entre les duretés à 20 % HR et à 70 % HR). Cette modification importante de la dureté des cornéocytes immatures est due à une plus grande sensibilité à l'eau de ces cornéocytes immatures. Au contraire, les cornéocytes matures sont nettement moins sensibles à l'eau et résistent mieux aux variations d'hygrométrie : l'enveloppe lipidique liée hydrophobe et fortement organisée joue un rôle osmo-protecteur. Ce maintien de la dureté des cornéocytes matures vis-à-vis des conditions extrêmes d'hygrométrie (grande sécheresse) est le garant d'un maintien des propriétés physiques de la peau dans des conditions d'extrême sécheresse ou d'extrême humidité ou des va- riations fortes des conditions extérieures (climatisation, etc...). L'eau contenue dans la cellule est donc maintenue quand le cornéocyte est mature. Les polysaccharides sulfatés favorisent la maturation du cornéocyte. Le cornéocyte mature présente des propriétés mécaniques qui sont maintenues à différentes hygrométries, au contraire du cornéocyte immature.

En conclusion, les polysaccharides sulfatés testés précédemment ont donc un effet béné- fique sur la rémanence de la fonction barrière de la cellule et donc du stratum corneum, et sur la rémanence de l'hydratation de la cellule et donc du stratum corneum. Exemple 4 : gel hydratant de la peau On prépare une composition de soin hydratant de la peau comprenant les ingrédients sui- vants Acide acrylique réticulé (CARBOPOL 941) 0,3 % - Ulvarane UR 0,5 % - Conservateurs qs - Eau qsp 100,0 % Le gel appliqué sur la peau confère à celle-ci un bon effet d'hydratation sans tiraillement.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Procédé cosmétique non thérapeutique pour améliorer la fonction barrière de la peau et/ou pour hydrater la peau comprenant l'application sur la peau d'un composition com- prenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un polysaccharide sulfaté com- prenant de 2 % à 60 % en poids, par rapport au poids total du polymère, de motif rhamnose.
2. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que polysaccharide sulfaté comprend de 5 à 40 % en poids, par rapport au poids total du polymère, de motif rhamnose.
3. 3. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que polysaccharide sulfaté comprend un taux de sulfatation des polysaccharides allant de 1 % à 30 % en poids, par rapport au poids du polysaccharide.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le polysaccharide sulfaté est choisi parmi les ulvanes, et les exopolysaccharides sulfatés à motif rhamnose.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le polysaccharide sulfaté est choisi parmi les ulvanes.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le polysaccharide sulfaté est choisi parmi les spirulanes.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le polysaccharide sulfaté est choisi parmi les exopolysaccharides sulfatés à motif rhamnose constitués de glucose, de galactose, de rhamnose, et éventuellement d'acide glucuronique et d'acide galacturonique.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le polysaccharide sulfaté est présent dans la composition en une teneur allant de 0,01 à 20 %en poids, par rapport au poids total de la composition.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la composition comprend un adjuvant cosmétique choisi parmi l'eau, les huiles, les cires, les pigments, les charges, les colorants, les tensioactifs, les émulsionnants ; les actifs cosmétiques, les filtres UV, les polymères, les épaississants, les polymères filmo- gènes, les conservateurs, les parfums, les bactéricides , les absorbeurs d'odeur, les an- tioxydants.
10. 10. Utilisation cosmétique d'un polysaccharide sulfaté à motif rhamnose selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comme agent hydratant de la peau.