FR2816949A1

FR2816949A1 - Copolymere a structure sequencee compose d'un segment saccharidique lie a au moins un segment hydrophobe bioerodable, et particules correspondantes

Info

Publication number: FR2816949A1
Application number: FR0014900A
Authority: FR
Inventors: Cedric Chauvierre; Patrick Couvreur; Denis Labarre; Christine Vauthier
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2002-05-24
Anticipated expiration: 2020-11-17
Also published as: WO2002039979A1; US20040028635A1; FR2816949B1; AU2002220793A1; EP1355627A1

Abstract

La présente invention a pour objet un copolymère à structure séquencée composé d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe bioérodable de formule générale (I) : (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle :- X représente un radical ON ou CONHR,- Y représente un radical COOR' ou CONHR", avec R, R' et R " représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono- oupoly- hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12 . Elle concerne également des particules à base dudit copolymère et un procédé de préparation correspondant.

Description

L'invention concerne une nouvelle famille de copolymères bioérodables à base d'un polymère de type cyanoacrylate d'alkyle, ou apparenté et de poly-ou oligo-saccharides, particulièrement utiles dans les domaines pharmaceutique, vétérinaire, agroalimentaire et cosmétique, notamment à titre de vecteurs et/ou excipients. Elle propose également un procédé pour préparer ces copolymères.

Les polymères bioérodables formulés généralement sous l'aspect de liposoms, microémulsions, nanosphères, nanocapsules, microsphères, microcapsules, microparticles et nanoparticules constituent des systèmes de délivrance efficaces pour des principes actifs. Parmi ces systèmes, les micro-et nano-particules à base de poly (cyanoacrylate d'alkyle) s'avèrent tout particulièrement intéressantes compte tenu de leur rapide bioérosion comparativement à d'autres

polymères biodégradables, comme les poly (acide lactique)/poly (E- caprolacton) par exemple.

Toutefois, ces particules à base de poly (cyanoacrylate d'alkyle) ne donnent pas entière satisfaction. D'une part, on ne dispose pas aujourd'hui de méthode de préparation efficace pour obtenir ces systèmes avec une structure et/ou une composition contrôlée des polymères entrant dans leur constitution. Par ailleurs, ces particules ont pour inconvénient d'être rapidement captées par les macrophages du système des phagocytes mononucléés. Leur durée de vie, in vivo, est donc très réduite.

La présente invention vise précisément à suppléer aux inconvénients précités et à proposer un nouveau matériau pour particules dont la structure polymère dérive de l'association à un polymère apparenté au poly (cyanoacrylate d'alkyle), d'un segment de nature polyou oligo-saccharidique, telle dextrane par exemple.

Des nanoparticules à base de copolymères blocs amphiphiles comportant des segments de dextrane et de poly (cyanoacrylate d'alkyle)

ont déjà été décrites (S. J. Douglas et al. ; Journal of Controlled Release (1986) 15-23). Toutefois, ces copolymères qui dérivent de la polymérisation anionique de monomères cyanoacrylates en présence de dextrane possèdent des structures greffées. En effet, la polymérisation par voie anionique de cyanocrylates d'alkyle en présence de dextrane conduit au greffage de plusieurs chaînes poly (cyanoacrylates) sur la chaîne polymère de dextrane sans qu'il soit d'ailleurs possible de contrôler le nombre, la taille et la localisation de ces chaînes poly (cyanoacrylates). Enfin, les particules ainsi formées possèdent en surface une couche interfacial de dextrane dont la structure globale entraîne la reconnaissance par le système du complément et les macrophages du Système des Phagocytes Mononucléés (SPM).

La présente invention vise pour sa part à proposer des copolymères dérivant de monomères cyanoacrylates ou équivalents et d'oligo-ou poly-saccharides mais possédant une structure totalement différente. C'est ainsi que dans le cadre de la présente invention, les copolymères se présentent sous une forme séquencée, par opposition aux formes greffées décrites ci-dessus. Cette forme séquencée est en fait inaccessible par la voie de polymérisation anionique discutée précédemment.

La présente invention vise également à proposer une voie de synthèse pour préparer ce type de copolymères séquencés.

Les inventeurs ont ainsi mis en évidence qu'il était possible de polymériser efficacement par voie radicalaire des molécules à forte densité de charge, de type cyanoacrylate, en présence de poly-ou oligosaccharides et ceci en dépit du fait que l'énergie d'activation nécessaire pour cette polymérisation radicalaire soit bien supérieure à celle nécessitée par la polymérisation anionique. En effet, en raison de leur forte densité de charge, les monomères de type cyanoacrylate ou équivalent sont naturellement enclins à générer leur forme anionique

lorsqu'ils sont mis en présence d'un agent nucléophile tels par exemple des anions OH-et donc à polymériser par la voie anionique.

Or, les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible, d'une part, de ralentir efficacement la manifestation de cette polymérisation notamment à travers le contrôle du pH du milieu de polymérisation et, d'autre part, de privilégier la polymérisation par voie radicalaire. Enfin, contre toute attente, la voie de polymérisation radicalaire proposée par les inventeurs s'avère plus rapide que la polymérisation anionique.

En conséquence, la présente invention a pour premier objet un copolymère à structure séquencée composé d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe bioérodable de formule générale (1) :

dans laquelle : - X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR'ou CONHR", avec R, R'et R"représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en Cl à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en Ci à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono-ou poly-hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C1.

Dans le segment de formule générale (1), X représente de préférence un radical CN. Plus préférentiellement, Y représente un radical COOR'avec R'tel que défini précédemment.

Par structure séquencée, on entend désigner selon l'invention une structure qui dérive de l'établissement d'une liaison covalente entre au moins l'une des extrémités du segment de nature saccharidique et l'une

des extrémités de la chaîne polymère de formule générale (1). Sont ainsi du domaine de l'invention, des structures copolymères comprenant soit un unique segment de formule générale (1) lié à une extrémité du segment de nature saccharidique, soit deux segments de formule générale (1), identiques ou différents, liés respectivement de part et d'autre du segment saccharidique. Par opposition aux structures greffées évoquées précédemment, les copolymères revendiqués ne possèdent pas de ramification (s) latérale (s) de nature saccharidique sur le segment hydrophobe, ni de ramification (s) latérale (s) de nature hydrophobe sur le segment de nature saccharidique.

La liaison covalente, établie entre les deux types de segment, est généralement de nature C-C ou C-O-C. De préférence, elle dérive de la polymérisation radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule (vil) :

dans laquelle X et Y sont tels que définis précédemment, en présence d'un poly-ou oligo-saccharide.

Cette polymérisation radicalaire est de préférence conduite dans les conditions exposées ci-après pour le procédé revendiqué.

En particulier, elle est réalisée à des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur radicalaire Redox convenable.

Le segment de nature saccharidique dérive d'un oligo-ou polysaccharide d'origine naturelle ou synthétique, modifié ou non.

On entend par polysaccharide modifié tout polysaccharide ayant subi un changement sur son squelette, comme par exemple l'introduction de fonctions réactives, le greffage d'entités chimiques (molécules, chaînons aliphatiques, chaînes de PEG, etc...). Il existe dans le commerce des polysaccharides modifiés par greffage de la biotine, de

composés fluorescents, etc. D'autres polysaccharides greffés avec des chaînes hydrophiles (ex. PEG) ont été décrits dans la littérature. On peut également envisager d'utiliser dans le cadre de la présente invention des polysaccharides modifiés à l'image de ceux décrits dans la référence Jozefowicz and Jozefonvicz, Biomaterials, 18,1633-1644 (1997). Bien sûr, cette modification ne doit pas affecter la polymérisation du monomère de formule générale (ici) en présence de l'oligo-ou poly-saccharide modifié.

Selon une variante préférée de l'invention, l'oligo-ou polysaccharide mis en oeuvre selon l'invention peut déjà en soi posséder des propriétés et/ou activités biologiques. Par exemple, il peut conférer des propriétés anticoagulantes, vaccinantes, de ciblage ou encore de masque pour éviter la capture par les macrophages du SPM.

C'est ainsi qu'il peut s'agir : - d'oligo-ou poly-saccharides présentant des propriétés antigéniques comme par exemple ceux d'origine bactérienne ou virale,

- d'oligo-ou poly-saccharides dotés d'activité biologique comme par exemple l'héparine, les sulfate d'héparane, sulfate de dermatane, sulfate de dextrane et sulfate de pentosane, le dextrane substitué par des groupes carboxyliques et sulfates ou sulfonates, les polysaccharides sulfatés extraits des algues (fucanes et fucoïdanes), les poly (acides sialiques), l'acide hyaluronique sulfaté qui possèdent des activités anticoagulantes, anti-inflammatoires à des degrés variables, et/ou - d'oligo-ou poly-saccharides intervenant dans les processus de reconnaissance cellulaire et de signalisation cellulaire comme par exemple, les poly (acides sialiques), le sulfate d'héparane, les antigènes des groupes sanguins, les polysaccharides et lipopolysaccharides de diverses souches bactériennes, des chaînes oligosaccharidiques des glycoprotéines membranaires et/ou circulantes, et des chaînes oligosaccharidiques des glycolipides).

Les copolymères dérivant de ce type de polysaccharides s'avèrent bien entendu particulièrement intéressants en terme d'utilisation thérapeutique, dans la mesure où naturellement ils sont dotés d'une activité biologique propre et donc peuvent être utilisés tels quels à ce titre.

Les polysaccharides convenant tout particulièrement à l'invention sont ou dérivent du D-glucose (cellulose, amidon, dextrane, cyclodextrine), D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosane, manane, fructosane), fucose (fucane). La majorité de ces polysaccharides contiennent les éléments carbone, oxygène et hydrogène. Les polysaccharides conformes à l'invention peuvent également contenir du soufre et/ou de l'azote. Ils peuvent ainsi dériver de glycoprotéine ou de glycolipide. De même, l'acide hyaluronique (composé d'unités N-acétyle glucosamin et acide glucuronique), le poly (acide sialique) encore dénommé acide colominique ou poly (acide N-acétylneuraminique), le chitosane, la chitine, l'héparine ou t'orosomucoïde contiennent de l'azote, tandis que la gélose, polysaccharide extrait d'algues marines, contient du soufre sous la forme de sulfate acide (XDH-O-SOgH). L'acide chondroitinsulfurique contient simultanément du soufre et de l'azote.

Selon une variante préférée de l'invention, le polysaccharide possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/moie.

Dans le cas particulier du dextrane et de l'amylose (C6HOg) n, n varie entre 10 et 620 et de préférence entre 33 et 220. Dans le cas de l'acide hyaluronique, la masse molaire varie entre 5 103 et 5 106 g/mole, de préférence entre 5 104 et 2 106 g/mole. Dans le cas du chitosane, la masse molaire varie entre 6 103 et 6 105 g/mole, de préférence entre 6 103 et 15 104 g/mole.

A titre illustratif des polysaccharides convenant plus particulièrement à l'invention, on peut citer les polydextrose comme le

dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amylose, les cyclodextrins, l'acide hyaluronique, l'héparine, l'amylopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la

chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide poly (glucuronique), le poly (acide N-acétylneuraminique), l'acide poly (mannuronique), et leurs dérivés (comme par exemple le sulfate de dextrane, les esters de l'amylose, l'acétate de cellulose, le sulfate de pentosane, etc).

Dans le cas particulier d'un polysaccharide cyclique à l'image des cyclodextrine, son couplage covalent avec un composé de formule générale (tut), lors de la polymérisation radicalaire, a pour effet de provoquer une ouverture du cycle et donc de conduire le polysaccharide à adopter une structure linéaire conforme à l'invention.

Sont plus particulièrement préférés le dextrane, l'héparine, le poly (acide N-acétylneuraminique), l'amylose, le chitosane, la pectine et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés.

Avantageusement, les copolymères possèdent une teneur en oligo-ou poly-saccharide contrôlée.

Le copolymère revendiqué peut se présenter sous une forme soluble ou sous l'aspect d'un précipité, de micelles ou de particules. Selon un aspect avantageux de l'invention, il se présente sous l'aspect de particules. Il peut s'agir de micro-ou nano-particules.

Dans le cas particulier des particules et des micelles, il est vraisemblable que le copolymère possède une structure organisée comme suit : les chaînes de même nature, c'est-à-dire saccharidiques ou hydrophobes, se regroupent entre elles, soit pour constituer la structure coeur de la micelle ou particule, soit la couronne en brosse autour de cette structure coeur. Leur répartition entre la structure coeur et la couronne va bien entendu dépendre de la nature, aqueuse ou organique, du solvant dans lequel sont dispersées les particules ou micelles. Par couronne brosse, on entend désigner une structure dans laquelle les segments constituant la couronne sont liés par l'une de leurs extrémités aux segments constituant le coeur. Leurs extrémités libres constituent la périphérie de la couronne. Ainsi, en milieu aqueux, les segments

hydrophobes sont regroupés de manière à constituer le coeur et les segments polysaccharidiques sont disposés en couronne brosse tout autour de ce coeur. Dans un solvant de type organique, cette organisation entre les deux types de segment est inversée : le coeur est de nature hydrophile et donc constitué par les segments saccharidiques et la couronne en brosse est de nature hydrophobe et donc constituée par les segments de formule générale (1).

Dans le cas des copolymères de structure greffée décrits précédemment, cette structure couronne brosse ne peut exister en milieu aqueux, dans la mesure où plusieurs segments hydrophobes sont liés par liaison covalente à une unique chaîne polysaccharidique.

Un second aspect de l'invention concerne des particules constituées d'un copolymère conforme à l'invention.

A titre représentatif des particules revendiquées, on peut plus particulièrement citer celles composées d'un copolymère dérivant de la polymérisation du :

- poly (cyanoacrylate d'isobutyle), poly (cyanoacrylate d'isohexyle), poly (cyanoacrylate de N-butyle), poly (cyanoacrylate de N-propyle), poly (cyanoacrylate d'éthyle) ou poly (cyanoacrylate de méthoxyéthyle) en présence de dextrane, ou - poly (cyanoacrylate d'isobutyle) en présence d'héparine, de chitosane ou de pectine.

Les particules revendiquées peuvent avoir une taille comprise entre 1 nm et 1 mm et de préférence entre 60 nm et 100 m.

Généralement, les particules ayant une taille comprise entre 1 et 1000 nm sont alors dénommées nanoparticules. Les particules de taille variant de 1 à plusieurs milliers de microns font référence à des microparticules.

Ces particules peuvent être dotées d'une activité biologique soit en raison de la nature du polysaccharide qui les constitue, soit parce

qu'elles incorporent en outre une matière active biologique ou pharmaceutique.

Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. Il peut également s'agir de molécules organiques ou inorganiques synthétiques qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité thérapeutique. Il peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de peptides, de vitamines, de minéraux et/ou de stéroïdes.

A titre représentatif des médicaments susceptibles d'être incorporés dans ces particules, on peut citer les composés antiinflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.

De même, on peut envisager d'associer à ces matières actives des composés destinés à intervenir au niveau de leur profil de libération.

Par exemple, on peut ajouter dans la composition des particules, des chaînes de PEG, ou de polyester (modifiés ou non), et obtenir ainsi des particules dites composites.

On peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de diagnostic. Il peut ainsi s'agir de substances détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi inclure des particules magnétiques, des matériaux radio-opaques (comme par exemple l'air ou le barium) ou des composés fluorescents. Par exemple, les composés fluorescents comme la rhodamine ou le rouge de Nile peuvent être englobés dans des particules à coeur hydrophobe. Alternativement, des émetteurs gamma (par exemple Indium ou Technetium) peuvent y être incorporés. Des composés fluorescents hydrophiles peuvent également

être chargés dans les particules, mais avec un rendement moindre comparativement aux composés hydrophobes, du fait de leur affinité plus réduite avec la matrice.

Enfin, on peut associer à ces particules des peptides/protéines susceptibles de les aider à diffuser à travers les membranes biologiques comme le peptide TAT, ou des composés tels que la protéine ZOT (Zonula Occludes Toxine) et la zonuline ou équivalents, ou tout autre promoteur d'absorption.

Des particules magnétiques commercialisées ayant des propriétés de surface contrôlées peuvent être également incorporées dans la matrice des particules ou attachées de manière covalente à l'un de leurs constituants.

La matière active peut être incorporée dans ces particules lors de leur processus de formation ou au contraire être chargée au niveau des particules une fois que celles-ci sont obtenues. Il est ainsi possible de les charger par adsorption ou par greffage covalent.

Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes façons, par exemple par voies orale, parentérale, oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée, buccale, etc. La voie orale, non invasive, est une voie de choix.

La présente invention a également pour objet l'utilisation des particules à titre de vecteur de principes actifs pharmaceutique, cosmétique, agroalimentaire ou vétérinaire.

Un troisième aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation du copolymère revendiqué.

Plus précisément, la présente invention vise un procédé utile pour la préparation de copolymères séquencés composés d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend la polymérisation par voie radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule générale (11) :

x CH2=C/X y dans laquelle :'

- X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR'ou CONHR" avec R, R'et R"représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à C2o linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C1 à C2o linéaire ou ramifié, un radical acide aminé,

un radical acide mono-ou poly-hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C, ladite polymérisation radicalaire étant réalisée en présence d'au moins une molécule d'un poly-ou oligo-saccharide, dans des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur Redox radicalaire convenable.

De préférence, X représente un radical CN et/ou plus préférentiellement Y représente un radical COOR.

Comme énoncé précédemment, il s'avère possible de privilégier la polymérisation radicalaire, au détriment de la polymérisation anionique naturellement prépondérante, en réalisant notamment la réaction de polymérisation dans des conditions de pH défavorables à la génération d'anions libres, comme par exemple les ions OH-.

Pour ce faire, le pH du milieu réactionnel est de préférence ajusté à une valeur inférieure à 2 et plus préférentiellement inférieure à 1,5.

De manière surprenante, il est apparu que l'ajustement du pH à une telle valeur ne portait pas préjudice à la vitesse de polymérisation.

Contre toute attente et comme il ressort des exemples présents ci-après, la polymérisation radicalaire initiée dans ces conditions de pH s'effectue au contraire à une vitesse supérieure à celle d'une polymérisation anionique. Ceci est notamment illustré par les figures 1 et 2.

Selon une variante préférée de l'invention, la réaction est également réalisée dans des conditions d'atmosphère inerte.

Le solvant est avantageusement choisi de façon à ce que, tout en maintenant des conditions favorables à la polymérisation radicalaire et plus particulièrement à la formation du polymère de formule (1), la solubilité de l'oligo ou poly-saccharide soit complète dans le milieu défini par ce solvant.

Dans la mesure où l'on souhaite privilégier la formation du copolymère directement sous la forme de particules ou de micelles, le solvant est également choisi pour être faiblement ou non solubilisant vis- à-vis du copolymère.

De préférence, la molécule de poly-ou oligo-saccharide est choisie parmi le dextrane, l'héparine, le poly (acide N-acétylneuraminique), l'amylose, le chitosane, la pectine et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés.

Il est également bien entendu choisi pour demeurer inerte vis-à-vis de la polymérisation.

Avantageusement un tel solvant est choisi de préférence parmi les solvants aqueux, hydroalcooliques ou hydroacétoniques.

Le solvant choisi est acidifié avec un acide organique ou minéral et de préférence un acide nitrique pour obtenir un pH adéquat au déroulement de la polymérisation radicalaire.

En ce qui concerne les quantités respectives en oligo-ou polysaccharide et monomère de formule générale (tut), elles peuvent varier largement. Le procédé revendiqué a précisément pour avantage de permettre un contrôle de la structure du copolymère que l'on souhaite préparer. Les quantités en réactifs introduits sont également fonction de leurs masses moléculaires respectives et de leurs degrés de solubilité dans le milieu réactionnel.

En ce qui concerne l'amorceur Redox, il s'agit généralement de mélanges d'agents oxydants et réducteurs, organiques ou inorganiques, générant des radicaux durant l'étape de transfert électronique. Cette

génération de radicaux a pour avantage de nécessiter une énergie d'activation faible contrairement aux amorceurs radicalaires classiques, ce qui permet d'amorcer des polymérisations radicalaires à des températures relativement basses (0-50 C).

L'amorceur Redox utilisé comprend de préférence au moins un sel métallique choisi parmi les sels de Ce4+, V5+, C, Min3+. Selon une variante préférée de l'invention, il s'agit de Ce4+. Il est généralement introduit sous la forme de nitrate de cérium et d'ammonium.

La concentration en initiateur radicalaire est également susceptible d'influencer le déroulement de la polymérisation radicalaire. C'est ainsi que la composition du copolymère et la longueur des séquences respectives du polysaccharide et du polymère de formule générale (1) sont modulables en fonction de la concentration en amorceur. Son ajustement relève des compétences de l'homme de l'art.

En ce qui concerne la température réactionnelle, elle est ajustée à une valeur compatible avec l'amorçage de la polymérisation.

Généralement, cette température est comprise entre 0 et 50oC.

En ce qui concerne l'ordre d'introduction des différents réactifs, on procède de préférence à une solubilisation de l'oligo-ou poly-saccharide au sein du solvant choisi, puis à l'ajout de l'amorceur radicalaire Redox.

Le monomère de formule (II) est ensuite introduit dans le mélange.

A l'issue du procédé, le copolymère peut être obtenu sous une forme soluble ou sous la forme de micelles, poudres ou particules. De préférence, il est obtenu directement sous la forme de particules. Les particules peuvent être chargées en matières actives soit après leur préparation ou durant leur préparation.

Lorsque le copolymère est obtenu sous la forme d'une poudre, il est bien entendu possible de formuler cette poudre à l'état de particules, en utilisant des techniques de transformation adéquates. A titre illustratif de ces techniques, on peut plus particulièrement mentionner les

techniques d'émulsification-évaporation de solvant, d'émulsificationdiffusion de solvant ou de nanoprécipitation.

Les particules répondent aux spécificités exposées précédemment.

Selon une variante de l'invention, la polymérisation du composé de formule générale (II) est réalisée en présence de la matière active à charger.

A la fin de la polymérisation, on peut procéder si nécessaire à une neutralisation du pH du milieu réactionnel. De préférence, celui-ci est ajusté à une valeur demeurant inférieure ou égale à 7,5. Le copolymère est récupéré par des techniques conventionnelles.

Selon une variante préférée de l'invention, on procède préalablement à l'isolement du copolymère à une complexation du sel métallique résultant de la réaction de l'amorceur radicalaire. Cette complexation qui relève des compétences de l'homme de l'art, permet d'éliminer ces sels métalliques.

Les exemples et figures figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.

FIGURES
Figure 1 : Cinétiques de polymérisations radicalaires selon l'invention du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de dextrane, de chitosane ou de pectine.

Figure 2 : Cinétiques de référence de polymérisations anioniques du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de dextrane ou de chitosane.

MATERIEL ET METHODE - La taille des particules polymères (diamètre hydrodynamique moyen) est déterminée à l'aide d'un nanosizer (Coulter N4 PLUS&commat;) par diffusion quasi-élastique d'un rayonnement laser.

- La charge de surface des particules est déterminée à l'aide d'un Zétasizer 4 Malvern&commat;. Pour se faire, les suspensions sont diluées au 1/200"'dans du chlorure de potassium à 1 mol/1.

EXEMPLE 1 :
Dans un tube en verre de 2 cm de diamètre, 0,1375 g de dextrane sont dissous dans 8 mi HN03 (0,2 molli), sous agitation magnétique à 40 C et avec un léger bullage à l'argon. Après 10 minutes, 2 mi de solution acide d'ions cérium (8. 10-2 M de cérium ammonium nitrate dans HN03 à 0,2 molli) puis 0,5 ml de cyanoacrylate d'isobutyle sont ajoutés. Après 10 minutes, le bullage à l'argon est arrêté et le tube en verre est bouché. Après 40 min, l'agitation est arrêtée et le tube en verre refroidi sous l'eau du robinet. Le pH est ajusté avec NaOH (1N) pour qu'après l'ajout de 1,25 ml de tri sodium citrate dihydrate (1,02 M) il arrive directement à une valeur de 7 0, 5. Enfin, la suspension est stockée au réfrigérateur.

A ce stade, une suspension colloïdale stable de particules de copolymères est obtenue. Les particules de copolymères peuvent alors être purifiées.

La purification des particules de copolymères s'effectue comme suit :
Des boudins à dialyse (Spectra/Por&commat; CE MWCO : 100000) sont régénérés 30 minutes avec de l'eau osmosée, et les suspensions colloïdales passées au vortex puis introduites dans les boudins.

On réalise deux dialyses successives de 1 H30 contre 5 litres d'eau osmosée qui sont suivies d'une autre dialyse d'une nuit contre 5 litres d'eau osmosée.

Les suspensions colloïdales de particules de copolymères ainsi purifiées et contenues dans les boudins à dialyse sont récupérées puis conservées à +4 oC ou éventuellement séchées par lyophilisation.

La lyophilisation des particules de copolymères s'effectue comme suit :
Les lyophilisations sont effectuées sans addition de cryoprotecteur.
Les suspensions colloïdales de particules de copolymères sont aliquotées dans des piluliers puis congelées (-18OC). La lyophilisation (Bioblock Scientific Christ alpha 1-4) est réalisée pendant 48 heures. Les lyophilisas (poudres blanches) sont conservés au réfrigérateur.

Reconstitution des particules :
Pour reconstituer la suspension de nanoparticules à partir du lyophilisant, une masse déterminée de lyophilisat est dispersée dans un volume connu d'eau Milli afin que le rapport masse de Iyophilisat/volume d'eau soit de 1%. La suspension est homogénéisée à l'aide d'un vortex à la vitesse maximale puis des ultrasons pendant quelques minutes à l'aide d'un sonicateur (Branson 5200&commat;).

EXEMPLE 2
Le même protocole que celui décrit en exemple 1 est reproduit en utilisant 0,1375 g d'héparine, 0,0230 g de chitosane ou 0,0230 g de pectine à la place du dextrane.

EXEMPLE 3
Le protocole de l'exemple 1 est reproduit en substituant au cyanoacrylate d'isobutyle, l'un des monomères suivants : - le cyanoacrylate d'isohexyle, - le cyanoacrylate de N-butyle, - le cyanoacrylate de N-propyle, - le cyanoacrylate d'éthyle, ou - le cyanoacrylate de 2-méthoxyéthyle.

EXEMPLE 4
CARACTERISATION DES PARTICULES
Les copolymères obtenus en exemples 1,2 et 3 sont caractérisés en termes de taille, de stabilité et de charge.

Taille des suspensions :
Les suspensions ont été préalablement diluées avec de l'eau Milli
Le tableau 1 ci-après récapitule les tailles des particules des différentes suspensions nanoparticulaires élaborées :
Tableau 1

<tb>
<tb> Polysaccharides
<tb> Monomères <SEP> Dextrane <SEP> Héparine <SEP> Chitosane <SEP> Pectine
<tb> 0,1375 <SEP> g <SEP> 0,1375 <SEP> g <SEP> 0,0230g <SEP> 0,0230
<tb> Cyanoacrylate <SEP> d'isohexyl <SEP> 236 <SEP> 3 <SEP> nm <SEP> 87 <SEP> ~ <SEP> 2 <SEP> nm <SEP> # <SEP> 1 <SEP> m <SEP> # <SEP> 1 <SEP> m
<tb> Cyanoacrylate <SEP> d'isobutyle <SEP> 290 <SEP> 2 <SEP> nm--Cyanoacrylate <SEP> de <SEP> N-buty <SEP> ! <SEP> e <SEP> 227 <SEP> 3 <SEP> nm--Cyanoacrylate <SEP> de <SEP> N-propyle <SEP> 275 <SEP> 2 <SEP> nm--Cyanoacrylate <SEP> d'éthyle <SEP> 443 <SEP> : <SEP> 7 <SEP> nm--Cyanoacrylate <SEP> de <SEP> 2-
<tb> 375 <SEP> ~ <SEP> 10 <SEP> nm
<tb> méthoxyéthyle
<tb>

Les écarts types représentent la répétabilité des mesures.

Stabilité des suspensions :
La stabilité des suspensions obtenues a été évaluée en fonction de la taille des particules au cours du temps.

Le tableau 2 ci-après rend compte des résultats obtenus.

Tableau 2

<tb>
<tb> Produits
<tb> Temps <SEP> Dextrane/poly <SEP> (cyano- <SEP> Hépahne/poly <SEP> (cyanoacrylate <SEP> d'isobutyle) <SEP> acrylate <SEP> d'isobutyle)
<tb> T0 <SEP> 290 <SEP> ~ <SEP> 2 <SEP> nm <SEP> 87 <SEP> ~ <SEP> 2 <SEP> nm
<tb> To <SEP> + <SEP> dialyse <SEP> 297 <SEP> ~ <SEP> 3 <SEP> nm <SEP> 93 <SEP> ~ <SEP> 2 <SEP> nm
<tb> Tp <SEP> + <SEP> dialyse, <SEP> conservation <SEP> 1 <SEP> mois <SEP> 282+4 <SEP> nm <SEP> 113 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> nm
<tb> To <SEP> + <SEP> dialyse, <SEP> conservation <SEP> 6 <SEP> mois <SEP> 290 <SEP> ~ <SEP> 2 <SEP> nm <SEP> 102 <SEP> ~ <SEP> nm
<tb> To <SEP> + <SEP> dialyse <SEP> + <SEP> lyophilisation
<tb> conservation <SEP> 6 <SEP> mois <SEP> 312 <SEP> # <SEP> 7 <SEP> nm
<tb> redispersion <SEP> + <SEP> sonication
<tb> T0 <SEP> + <SEP> dialyse <SEP> + <SEP> lyophilisation
<tb> conservation <SEP> 14 <SEP> mois <SEP> 296 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> nm
<tb> redispersion <SEP> + <SEP> sonication
<tb>
To : jour de la préparation.

Les écarts types représentent la répétabilité des mesures.

Potentiel Zéta : Le tableau 3 ci-après rend compte des résultats obtenus. Tableau 3

<tb>
<tb> Suspensions <SEP> Potentiel <SEP> Zéta <SEP> (mV) <SEP> Ecarts <SEP> types <SEP> (mV)
<tb> Dextrane/poly <SEP> (cyanoacrylate <SEP> d'isobutyle) <SEP> -10, <SEP> 6 <SEP> 0,9
<tb> Hépanne/poly <SEP> (cyanoacrylate <SEP> d'isobutyle)-36, <SEP> 1 <SEP> 1,4
<tb>

On note que le potentiel Zéta obtenu avec les particules Héparine/poly (cyanoacrylate d'isobutyle) est inférieur à celui obtenu avec

les particules Dextrane/poly (cyanoacrylate d'isobutyle).

Ces résultats reproduisent donc la différence d'électronégativité naturelle entre l'héparine et le dextrane. A l'évidence, le polysaccharide présent dans chacune des deux types de particules est localisé à la surface de celles-ci.

EXEMPLE 5
CINETIQUE DE POLYMERISATION Matériel et appareillage : - Spectromètre de type PC2000 Plug-in (Ocean Optics Europe) inséré dans un ordinateur de type PC, une source lumineuse HL-2000-LL (Ocean Optics Europe), des fibres optiques (200 et 100 um) (Top sensor systems FC-UV, Ocean Optics Europe) et un logiciel 001 Base V 1.5 (Ocean Optics Europe).

- Tube en verre à fond rond de 2 cm de diamètre pour réaliser la polymérisation.

- Bague en téflon avec des trous à 0 , 900 eut 1800. La taille des trous est ajustée pour servir de support aux fibres optiques et la taille de la bague en téflon est ajustée au tube en verre dans lequel sera réalisée

la polymérisation. Les fibres optiques sont montées sur la bague en position 00 et 1800 pour des mesures d'absorbance.

Dans cet essai a été suivie la cinétique de polymérisation radicalaire du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de dextrane, chitosane ou de pectine.

La polymérisation est réalisée selon le protocole décrit dans les exemples 1 à 3 dans le tube en verre de 2 cm de diamètre placé dans un bain marie à 40 C et sur lequel est montée la bague en téflon supportant les fibres optiques reliées au spectromètre et à la source lumineuse. Le bullage à l'argon est placé de façon à ne pas perturber l'acquisition des

mesures. Le bruit de fond est enregistré avant l'introduction de la solution acide d'ions cérium (8. 10-2 M de cérium ammonium nitrate dans HNO3 à 0, 2 mot/1). La référence est enregistrée après l'addition de la solution acide d'ions cérium (8. 10-2 M de cérium ammonium nitrate dans HNO3 à 0,2 molli). L'enregistrement de la cinétique de polymérisation est démarré dès l'addition des 0,5 mi de monomère. Elle s'effectue par l'acquisition quasi-instantanée d'un spectre d'absorbance sur une large gamme de longueur d'onde (400-800 nm) toutes les 30 secondes pendant 50 min. Les absorbances mesurées à la longueur d'onde de 650 nm sont retenues pour tracer les courbes de l'absorbance en fonction du temps reflétant ainsi la cinétique de polymérisation.

Les résultats sont présentés en figure 1.

En figure 2 est rendue compte à titre comparatif la cinétique d'une polymérisation anionique réalisée avec le même monomère en présence de dextrane ou de chitosane mais en l'absence de l'amorceur redox responsable de la polymérisation radicalaire.

On note que le démarrage de la polymérisation anionique est retardé comparativement à la polymérisation radicalaire.

Claims

un radical acide mono-ou poly-hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en Cs à C12
2. Copolymère selon la revendication 1, caractérisé en ce que X représente en formule générale (1) un radical CN.

dans laquelle : - X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR'ou CONHR" avec R, R'et R"représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en Ci à C2o linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C1 à C2o linéaire ou ramifié, un radical acide aminé,

REVENDICATIONS 1. Copolymère à structure séquencée composé d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe bioérodable de formule générale (1) :
3. Copolymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que Y représente en formule générale (1) COOR'avec R'tel que défini en revendication 1.
4. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le segment polysaccharidique est lié par l'une de ses extrémités à un unique segment de formule générale (1) ou est lié à chacune de ses deux extrémités, à un segment de formule générale (1), les deux segments hydrophobes étant identiques ou différents.

<Desc/Clms Page number 22>
5. Copolymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le segment de nature saccharidique dérive d'un oligo-ou poly-saccharide naturel ou synthétique, modifié ou non.
6. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'oligo-ou poly-saccharide possède des propriétés et/ou activités biologiques.
7. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'oligo-ou poly-saccharide est choisi parmi les polydextrose comme le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amylose, les cyclodextrins, l'acide hyaluronique, l'héparine, opectine, la

cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide poly (glucuronique), le poly (acide N-acétylneuraminique), l'acide poly (mannuronique) et leurs dérivés.
8. Copolymère selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit de dextrane, d'héparine, de poly (acide N-acétylneuraminique), d'amylose, de chitosane, de pectine, d'acide hyaluronique, ou un de leurs dérivés.
9. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est obtenu par polymérisation radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule générale (II) :

dans laquelle X et Y sont tels que définis en revendication 1,2 ou 3, en présence d'un poly-ou oligo-saccharide.

<Desc/Clms Page number 23>
10. Copolymère selon la revendication 9, caractérisé en ce que la polymérisation radicalaire est réalisée à des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur radicalaire Redox convenable.
11. Copolymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous l'aspect de particules.
12. Particule caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un copolymère selon l'une des revendications 1 à 10.
13. Particule selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est composée d'un copolymère dérivant de la polymérisation du : - poly (cyanoacrylate d'isobutyle), poly (cyanoacrylate d'isohexyle), poly (cyanoacrylate de N-butyle), poly (cyanoacrylate de N-propyle), poly (cyanoacrylate d'éthyle) ou poly (cyanoacrylate de méthoxyéthyle) en présence de dextrane, ou - poly (cyanoacrylate d'isobutyle) en présence d'héparine, de chitosane ou de pectine.
14. Particule selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle présente une taille comprise entre 1 nm et 1 mm.
15. Particule selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce qu'elle incorpore une matière biologique ou pharmaceutique.
16. Utilisation de particules selon l'une des revendications 12 à 15, à titre de vecteur de principes actifs pharmaceutique, agroalimentaire, cosmétique ou vétérinaire.

<Desc/Clms Page number 24>
17. Procédé utile pour la préparation de copolymères séquencés composés d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend la polymérisation par voie radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule générale (il) :

dans laquelle : - X représente un radical CN, ou CONHR, - Y représente un radical COOR'ou CONHR" avec R, R'et R"représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en Cl à Coo linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono-ou poly-hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, ladite polymérisation radicalaire étant réalisée en présence d'au moins une molécule d'un poly-ou oligo-saccharide, dans des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur Redox radicalaire convenable.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que dans le dérivé de formule (ici), X représente un radical CN et/ou Y représente un radical COOR'avec R'tel que défini en revendication 17.
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que la polymérisation radicalaire est réalisée à un pH inférieur à 2 et de préférence inférieure à 1,5.

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20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que la polymérisation radicalaire est réalisée dans un solvant dans lequel l'oligo-ou poly-saccharide est sous forme soluble et le copolymère attendu, faiblement ou non soluble.
21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que la molécule de poly-ou oligo-saccharide est choisie parmi le

dextrane, l'héparine, le poly (acide N-acétylneuraminique), l'amylose, le chitosane, la pectine et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés.
22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que l'amorceur radicalaire Redox comprend au moins un sel métallique choisi parmi les sels de Ce4+, V5+, Car6+, Mn3+ et de préférence un sel

41 métallique de Ce4+.
23. Procédé selon l'une des revendications 17 à 22, caractérisé en ce que l'on solubilise le poly-ou oligo-saccharide au sein du solvant, on ajoute l'amorceur radicalaire Redox puis le monomère de formule générale (ici).
24. Procédé selon l'une des revendications 17 à 23, caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée en présence d'une matière active à charger dans lesdites particules.
25. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le copolymère est isolé du milieu réactionnel après neutralisation du pH du milieu réactionnel.
26. Procédé selon l'une des revendications 17 à 25, caractérisé en ce qu'on procède préalablement à l'isolement du copolymère à une

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complexation du sel métallique résultant de la réaction de l'amorceur radicalaire.
27. Procédé selon l'une des revendications 17 à 26, caractérisé en ce que le copolymère est obtenu sous la forme de particules et/ou micelles.