FR2794025A1

FR2794025A1 - Composition destinee a la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifere

Info

Publication number: FR2794025A1
Application number: FR9906892A
Authority: FR
Inventors: Philippe Erbs; Richard Jund
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 1999-05-25
Publication date: 2000-12-01
Also published as: HK1046426A1; AU774391B2; EP1183371A2; AU4931400A; WO2000071078A2; CA2374941A1; JP2003500342A; WO2000071078A3

Abstract

La présente invention concerne une composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53,(ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique,lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit mammifère.

Description

La présente invention concerne une composition cytotoxique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie de la protéine p53 et une seconde séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, notamment antitumorale ou antivirale. La présente invention est particulièrement utile dans le cadre de la mise en oeuvre d'un traitement par thérapie génique de maladies prolifératives ou infectieuses.

La p53 est une phosphoprotéine nucléaire intervenant notamment dans le contrôle de l'expression des protéines impliquées dans le cycle cellulaire (Ozbun et al, 1995, Adv.

Cancer Res. 66,71-141- Selter et al, 1994, Int. J. Biochem.

26,145-154) et participant à de nombreux processus cellulaires liés à la stabilité du génome et à l'apoptose cellulaire (Harris et al, 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88, 1442-1445 ; Kastan et al, 1991, Cancer Res. 51, 6304-6311 ; Kuerbitz et al, 1992, PNAS, 89,7491-7495).

Le gène p53 a été identifié et séquence. La séquence du cDNA est décrite dans Matlashewski et al., 1984, EMBO J., 3,3257-3262 et celle de la protéine dans Lamp , 1986, Mol.

Cell Biol., 6,1379-1385. De même, des variants polymorphiques naturels et fonctionnels ont été identifiés pour lesquels certains amino acides sont remplacés par d'autres sans toutefois affecter la fonction p53. Par ailleurs, de nombreuses mutations ont été décrites dans la littérature relative au cancer qui peuvent se traduire par une perte de la fonction de cette protéine (Holstein et al, 1991, Science, 253,49-53 ; Levine et al, 1991, Nature, 351, 453-456). Par exemple, Baker et al, (1989, Science, 244, 217) ont constaté que dans plus de 70% des tumeurs colorectales la fonction de ce gène p53 est perdue.

Par ailleurs, plusieurs études in vitro ont montré que la restauration de l'activité p53 dans les cellules déficientes pour cette activité permet de supprimer la croissance cellulaire ou d'induire l'apoptose des cellules

(Baker et al, 1990, Science, 249,912-915 ; Shaw et al, 1992, PNAS, 89,4495-4499). De façon similaire, plusieurs études ont confirmé qu'il est possible de supprimer in vivo la croissance des cellules tumorales par l'application d'une thérapie visant à restaurer de l'activité du gène p53 défectueux (Fujiwara et al, 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86, 1458-1462 ; Wills et al, 1994, Hum. Gene Therapy, 5,1079- 1088 ; Hamada et al, 1996, Cancer Res. 56, 3047-3054).

En outre, faisant suite aux travaux de Lowe et al.

(1993, Cell 74,957-967, 1994, Science 266,807-810) mettant en évidence une résistance accrue de cellules tumorales n'exprimant pas le gène p53 à l' égard de différents types d'agents cytotoxiques et radiations, l'utilisation de la protéine p53 fonctionnelle, ou de son gène, a été envisagée afin de développer une méthode de sensibilisation des cellules tumorales auxdits agents. Plus particulièrement, il a été montré que la transfection d'une cellule tumorale humaine de colon dont le gène p53 est rendu inactif par mutation avec un plasmide exprimant le gène p53 sauvage permet in vitro de sensibiliser cette cellule au 5Fluorouracile (5-FU) (Yang et al, 1996, Clin. Cancer. Res.

2,1649-1657).

Nous avons maintenant mis en évidence de nouvelles compositions cytotoxiques dont les différents constituants sont choisis de façon à obtenir un effet synergique de leurs activités respectives et des propriétés améliorées desdits constituants. Plus particulièrement, de telles compositions permettent d'inhiber ou de retarder la prolifération cellulaire en induisant la mort spécifique des cellules tumorales, une meilleure présentation des antigènes et/ou une stimulation des cellules immunes de l'organisme hôte. La présente invention offre une alternative avantageuse et efficace aux techniques de l'art antérieur, notamment pour traiter le cancer de l'homme ou de l'animal.

L'invention concerne en premier lieu une composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou

antiviral, ou toute applications nécessitant la mort cellulaire, chez un mammifère comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53, (ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit mammifère.

Dans le cadre de la présente invention, il est possible d'utiliser en (i) l'intégralité de la séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide p53 ou une partie seulement de ce polypeptide, ou un polypeptide dérivé ou muté, dans la mesure où la fonction de p53 est conservée.

De telles séquences sont bien connues de l'homme du métier et il est possible de se référer par exemple à Matlashewski et al., 1984, EMBO J., 3,3257-3262 , Prives et al., 1994, Cell, 78,543-546 ou Chen et al., 1996, Gene et Deve., 10, 2438-2451, dont les contenus sont incorporés dans la présente demande.

Par polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique , on entend désigner toute substance peptidique susceptible d'induire ou d'activer une réponse immune dirigée spécifiquement contre une cellule tumorale (l'activité cytotoxique est alors appelée activité antitumorale) ou une cellule infectée par un virus (l'activité cytotoxique est alors appelée activité antivirale) ou d'inhiber la croissance et/ ou la division d'une telle cellule tumorale ou infectée. Selon un cas préféré, ladite activité cytotoxique se traduit par la mort de ladite cellule.

Etant donné les propriétés du polypeptide p53 comme transactivateur transcriptionnel (Farmer et al., 1992, Nature, 358,83-86) ou comme polypeptide capable d'interagir avec d'autres protéines (Harris, 1996, Carcinogenesis, 17,

1187-1198), l'activité p53 peut être mesurée par l'analyse de l'arrêt du cycle cellulaire en phase Gl/S et G2/M, de l'induction de l'apoptose, de la suppression de la transformation cellulaire induite par les oncogènes ou de l'inhibition de l'angiogénèse.

L'activité cytotoxique d'un polypeptide donné, notamment une activité anti-tumorale, peut être évaluée in vitro par la mesure de la survie cellulaire soit par des tests de viabilité à court terme (tel que par exemple le test au bleu tryptan ou MTT), soit par des tests de survie clonogénique (formation de colonies) (Brown et Wouters, 1999, Cancer Research, 59,1391-1399) ou in vivo par la mesure de la croissance des tumeurs (taille et/ou volume) dans un modèle animal (Ovejera et Houchens, 1981, Semin.

Oncol., 8,386-393).

Selon une première variante, l'invention concerne une composition caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est choisi parmi les cytokines, les protéines codées par un gène appelé gène suicide et les facteurs protéiques antiangiogéniques.

Plus particulièrement, lorsque ledit polypeptide en (ii) est une cytokine, il s'agit préférentiellement d'une cytokine choisie parmi les interférons [alpha], ss et y, les interleukines, et notamment l'IL-2, l'IL-4 l'IL-6, l'IL-10 ou l'IL-12, les facteurs nécrosant des tumeurs (TNF) et les facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...).

Selon un mode de réalisation préféré, ladite cytokine est sélectionnée parmi l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron gamma (IFN-y). L'interleukine-2 est notamment responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, de la multiplication et de l'activation des cellules du système immunitaire (pour la séquence en acide nucléique voir notamment FR 85 09480). L'IFN-y active les cellules phagocytaires et accroît l'expression des antigènes de surfaces de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (pour la séquence en acide nucléique

voir notamment FR 85 09225).

Selon une seconde variante, l'invention concerne également une telle composition caractérisée en ce que ledit polypeptide en (ii) présente au moins une activité enzymatique sélectionnée parmi l'activité thymidine kinase, l'activité purine nucleoside phosphorylase, l'activité guanine ou uracile ou orotate phosphoribosyl transférase et l'activité cytosine désaminase.

Plusieurs études ont permis d'identifier des polypeptides qui ne sont pas toxiques en tant que tels mais qui présentent des propriétés enzymatiques catalytiques capables de transformer une substance inactive (prédrogue), par exemple un nucléoside ou un analogue de nucléoside, en substance hautement toxique pour la cellule, par exemple un nucléoside modifié qui peut être incorporé dans les chaînes d'ADN ou d'ARN en élongation, avec pour conséquence, notamment, l'inhibition de la division cellulaire ou des dysfonctionnements cellulaires conduisant à la mort de la cellule renfermant de tels polypeptides. Les gènes codant pour de tels polypeptides sont dits gènes suicides . De nombreux couples gène suicide/ prédrogue sont actuellement disponibles. On peut citer plus particulièrement, les couples : - la thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1 (TK HSV-1) et l'acyclovir ou le ganciclovir (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028 ; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552 ; Ram et al., 1997, Nat. Med. 3,1354-1361) ; - le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide (Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978) ; - la purine nucleoside phosphorylase d'Escherichia coli (E. Coli) et la 6-methylpurine deoxyribonucleoside (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238) ; - la guanine phosphoribosyl transférase d'E. coli et la 6-thioxanthine (Mzoz et Moolten, 1993, Human Gene Therapy

4,589-595) et - la cytosine désaminase (CDase) et la 5fluorocytosine (5FC).

Plus particulièrement, la CDase est un enzyme qui intervient dans la voie métabolique des pyrimidines par laquelle la cytosine exogène est transformée par le biais d'une désamination hydrolytique en uracile. Des activités CDases ont été mises en évidence chez les procaryotes et les eucaryotes inférieurs (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteriol.

102,607-615 ; Beck et al., 1972, J. Bacteriol. 110, 219- 228 ; De Haan et al., 1972, Antonie van Leeuwenhoek 38,257- 263 ; Hoeprich et al., 1974, J. Inf. Dis. 130, 112-118 ; Esders et Lynn, 1985, J. Biol. Chem. 260,3915-3922) mais elles sont absentes chez les mammifères (Koechlin et al., 1966, Biochem Pharmacol. 15, 435-446 ; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153). Les gènes FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) et codA d'E. coli codant respectivement pour la CDase de ces deux organismes sont connus et leurs séquences publiées (EP 402 108 ; et al., 1997, Curr. Genet. 31,1-6 ; W093/01281).

La CDase désamine également un analogue de la cytosine, la 5-fluorocytosine (5-FC) en 5-fluorouracile (5FU) qui est un composé hautement cytotoxique notamment lorsqu' il est converti en 5-fluoro-UMP (5-FUMP). Les cellules dépourvues d'activité CDase, en raison soit d'une mutation inactivante du gène codant pour l'enzyme, soit de leur déficience naturelle pour cette enzyme (par exemple les cellules mammifères) sont résistantes au 5-FC (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615 ; Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol. 1989 171,2124-2127). Par contre, il a été montré qu'il est possible de transmettre la sensibilité au 5-FC à des cellules mammifères dans lesquelles la séquence codant pour une activité CDase a été transférée (Huber et al., 1993, Cancer Res. 53,4619-4626 ; Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,33-37 ; WO 93/01281). De plus, dans ce cas, les cellules

avoisinantes non transformées deviennent également sensibles au 5-FC (Huber et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8302-8306). Ce phénomène, appelé effet de voisinage (bystander en anglais), est dû à l'excrétion par les cellules exprimant l'activité CDase, de 5-FU qui intoxique les cellules voisines par simple diffusion à travers la membrane cellulaire. Cette propriété de diffusion passive du 5-FU constitue un avantage par rapport au système de référence tk/GCV pour lequel l'effet de voisinage nécessite un contact avec les cellules qui expriment tk (Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,1831-1835). Cet effet constitue par conséquent un atout supplémentaire de l'utilisation de la CDase dans le cadre de la thérapie génique, notamment anticancéreuse.

Cependant, la sensibilité au 5-FC varie beaucoup selon les lignées cellulaires. Une faible sensibilité est observée par exemple dans des lignées tumorales humaines PANC-1 (carcinome de pancréas) et SK-BR-3 (adénocarcinome du sein) transduites par un rétrovirus exprimant le gène codA d'E. Coli (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175). Ce phénomène indésirable pourrait s'expliquer par l'absence ou la faible conversion endogène du 5-FU formé par l'action enzymatique de la CDase en 5-FUMP cytotoxique. Cette étape, normalement assurée dans les cellules mammifères par l'orotate phosphorybosyl transférase (Peters et al., 1991, Cancer 68,1903-1909), peut être absente dans certaines tumeurs et rendre ainsi la thérapie génique, basée sur la CDase, inopérante.

Chez les procaryotes et eucaryotes inférieurs, l'uracile est transformée en UMP par l'action de l'uracile phosphoribosyl transférase (présentant par conséquent une activité UPRTase). Cette enzyme convertit également le 5-FU en 5-FUMP. Ainsi des mutants furl de la levure S. cerevisiae sont résistants à de fortes concentrations de 5-FU (10 mM) et de 5-FC (10 mM) car en absence d'activité UPRTase, le 5FU, provenant de la désamination du 5-FC par la CDase, n'est

pas transformé en 5-FUMP cytotoxique (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102,607-615). Les gènes upp et FUR1 codant pour l'UPRTase respectivement d'E. coli et de S. cerevisiae ont été clonés et séquences (Andersen et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204,51-56 ; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157).

Au sens de la présente invention, un polypeptide ayant une activité UPRTase désigne un polypeptide capable de convertir l'uracile ou un de ses dérivés en un analogue monophosphaté et, en particulier la 5-FU en 5-FUMP. Par mutation , il faut entendre l'addition, la délétion et/ou la substitution d'un ou plusieurs résidus à un endroit quelconque dudit polypeptide.

L'UPRTase native dont il est question dans la présente invention peut être d'une origine quelconque, notamment procaryotique, fongique ou de levure. A titre illustratif, les séquences d'acide nucléique codant pour les UPRTases d'E. coli (Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204,51-56), de Lactococcus lactis (Martinussen et Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463), de Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol. Int 41,1117-1124) et de Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J.

Bacteriol. 177, 271-274) peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention. Mais on préfère tout particulièrement mettre en oeuvre une UPRTase de levure et notamment celle codée par le gène FUR1 de S. cerevisiae dont la séquence divulguée dans Kern et al. (1990, Gene 88,149-157) est introduite ici par référence. A titre indicatif, les séquences des gènes et celles des UPRTases correspondantes peuvent être trouvées dans la littérature et les banques de données spécialisées (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline...).

Par ailleurs, la demande PCT/FR99/00904 décrit un gène FUR1 dépourvu de 105 nucléotides en 5' de la partie codante permettant la synthèse d'une UPRTase délétée des 35 premiers résidus en position N-terminale et débutant à la méthionine en position 36 dans la protéine native. Le

produit d'expression du gène mutant, désigné FUR1#105, est capable de complémenter un mutant furl de S. cerevisiae. En outre, le mutant tronqué présente une activité UPRTase supérieure à celle de l'enzyme native. Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le polypeptide codé selon l'invention est un mutant de délétion d'une UPRTase native. La délétion est de préférence localisée dans la région N-terminale de l'UPRTase d'origine. Elle peut être totale (concerner l'ensemble des résidus de ladite région N-terminale) ou partielle (concerner un ou plusieurs résidus continus ou non dans la structure primaire). D'une manière générale, un polypeptide est constitué de parties Nterminale, centrale et C-terminale, chacune représentant environ le tiers de la molécule. Par exemple, l'UPRTase de S. cerevisiae ayant 251 acides aminés, sa partie N-terminale est constituée des 83 premiers résidus débutant à la méthionine dite initiatrice située en première position de la forme native. Quant à l'UPRTase d'E. coli, sa partie Nterminale couvre les positions 1 à 69.

Ainsi, d'une manière tout à fait préférée, le polypeptide selon PCT/FR99/00904 dérive d'une UPRTase native au moins par délétion de tout ou partie de la région Nterminale en amont du second codon ATG de ladite UPRTase native. La délétion totale de la région précitée est préférée. Par exemple, l'UPRTase codée par le gène FUR1 comprend un premier codon ATG (codon ATG initiateur) en position +1 suivi d'un second en position +36. Ainsi, la délétion des résidus +1 à 35 peut être envisagée dans le cadre de la présente invention, donnant un polypeptide débutant à la méthionine trouvée normalement en position +36 de la forme native.

Un polypeptide préféré selon PCT/FR99/00904 comprend une séquence en acides aminés sensiblement telle que représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 1, débutant au résidu Met en position 1 et se terminant au résidu Val en position 216. Le terme sensiblement fait

référence à un degré d'identité avec ladite séquence IDS NO: 1 supérieure à 70%, avantageusement supérieur à 80%, de préférence, supérieure à 90% et, de manière tout à fait préférée, supérieur à 95%. Encore plus préférentiellement, il comprend la séquence en acides aminés représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 1. Comme mentionné cidessus, il peut comporter des mutations supplémentaires. On peut citer notamment la substitution du résidu sérine en position 2 (position 37 dans l'UPRTase native) par un résidu alanine.

En outre, les demandes de brevet W096/16183 et PCT/FR99/00904 décrivent l'utilisation d'une protéine de fusion codant pour une enzyme à deux domaines ayant les activités CDase et UPRTase et démontrent que le transfert d'un gène hybride codA::upp ou FCY1::FUR1 ou FCY1::FUR1#105 porté par un plasmide d'expression augmente la sensibilité au 5-FC de cellules B16 transfectées. Les séquences protéiques et nucléiques décrites dans ces deux demandes sont incorporées dans la description de la présente demande.

Selon un autre mode de réalisation, le polypeptide selon PCT/FR99/00904 est un polypeptide de fusion dans lequel il est fusionné en phase avec au moins un second polypeptide. Bien que la fusion puisse avoir lieu à un endroit quelconque du premier polypeptide, les extrémités N ou C-terminales sont préférées et notamment l'extrémité Nterminale. Avantageusement, la fusion en phase met en oeuvre un second polypeptide présentant une activité cytosine désaminase (CDase) et dérivant d'une cytosine désaminase native, de sorte que le polypeptide de fusion selon l'invention présente les activités CDase et UPRTase. Une fusion FCY1::FUR1 est préférée. Un tel polypeptide bifonctionnel permet d'améliorer la sensibilité des cellules cibles à la 5-FC et à la 5-FU. De préférence, le second polypeptide selon l'invention est capable de métaboliser la 5-FC en 5-FU.

Selon PCT/FR99/00904, on a recours à une CDase

d'origine procaryote ou eucaryote inférieur. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'une CDase de levure et en particulier celle codée par le gène FCY1 de Saccharomyces cerevisiae. Le clonage et la séquence des gènes codant pour les CDases de différentes sources sont disponibles dans la littérature et les banques de données spécialisées. On indique que la séquence du gène FCY1 est divulguée dans Erbs et al. (1997, Curr. Genet. 31, 1-6). Il est bien entendu possible d'utiliser un mutant de CDase ayant une capacité de conversion comparable ou supérieure à celle de l'enzyme native. L'homme de l'art est capable de cloner les séquences CDase à partir des données publiées, de procéder à d'éventuelles mutations, de tester l'activité enzymatique des formes mutantes dans un système acellulaire ou cellulaire selon la technologie de l'art ou en suivant le protocole indiqué ci-après et de fusionner en phase les polypeptides d'activité CDase et UPRTase.

Un exemple préféré est un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés sensiblement telle que représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 2, débutant au résidu Met en position 1 et se terminant au résidu Val en position 373. Le terme sensiblement a la définition donnée précédemment. Un polypeptide comprenant la séquence en acides aminés telle que représentée à l'identificateur de séquence IDS NO: 2 convient tout particulièrement à la mise en oeuvre de l'invention.

Une fusion des activités CDase et UPRTase permet d'améliorer la sensibilité des cellules cibles à la 5-FC et à la 5-FU.

L'homme de l'art est capable de cloner les séquences de CDase ou UPRTase à partir des données publiées, de procéder à d'éventuelles mutations, de tester les activités enzymatiques des formes mutantes dans un système acellulaire ou cellulaire selon la technologie de l'art ou en suivant le protocole indiqué dans la demande PCT/FR99/00904 et de fusionner, notamment en phase, les polypeptides d'activité

CDase et UPRTase, et par conséquent tout ou partie des gènes correspondants.

D'une manière générale, un polypeptide selon l'invention peut être produit par les méthodes conventionnelles de synthèse chimique ou bien par les techniques de l'ADN recombinant (voir par exemple Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ainsi selon le procédé de préparation décrit dans PCT/FR99/00904 on introduit une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide dans une cellule pour générer une cellule transformée, on cultive ladite cellule transformée dans des conditions appropriée pour permettre la production dudit polypeptide et on récolte ledit polypeptide à partir de la culture cellulaire. La cellule productrice peut être d'une origine quelconque et sans limitation, une bactérie, une levure ou bien une cellule de mammifère, dans la mesure où la séquence nucléotidique considérée est soit intégrée dans son génome soit intégrée dans un vecteur d'expression approprié capable de se répliquer. Bien entendu, la séquence nucléotidique est placée sous le contrôle de signaux de transcription et de traduction permettant son expression dans la cellule productrice. Vecteurs d'expression et signaux de contrôle sont connus de l'homme du métier. Quant au polypeptide, il peut être récupéré du milieu ou des cellules (après lyse de celles-ci) et soumises à des étapes de purifications classiques (par chromatographie, électrophorèse, filtration, immunopurification etc...).

PCT/FR99/0904 décrit également une séquence nucléotidique codant pour undit polypeptide qui peut être une séquence ADNc ou génomique ou de type mixte. Elle peut éventuellement contenir un ou plusieurs introns, ceux-ci étant d'origine native, hétérologue (par exemple l'intron du gène p-globine de lapin...) ou synthétiques afin d'augmenter l'expression dans les cellules hôtes. Comme déjà indiqué, ladite séquence peut coder pour un polypeptide dérivant de

l'enzyme native ou un mutant présentant une activité comparable ou améliorée. Les séquences employées peuvent être obtenues par les techniques classiques de biologie moléculaire, par exemple par criblage de banque à l'aide de sondes spécifiques, par immunocriblage de banque d'expression, par PCR au moyen d'amorces adéquates ou par synthèse chimique. Les mutants peuvent être générés à partir des séquences natives par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides en mettant en oeuvre les techniques de mutagénèse dirigée, de PCR, de digestion par les enzymes de restriction et ligation ou encore par synthèse chimique. La fonctionnalité des mutants et des constructions peut être vérifiée par le dosage de l'activité enzymatique ou par la mesure de la sensibilité de cellules cibles aux 5-FC et/ou 5-FU.

Par conséquent, selon un cas précis, la composition de l'invention est caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique (ii) est sélectionnée parmi les séquences nucléiques des gènes CodA, upp, FUR1, FCY1 et FUR1A105, ou par une combinaison de tout ou partie desdites séquences.

L'invention concerne plus particulièrement une dite composition caractérisée en ce que ledit polypeptide en (ii) présente au moins une activité CDase et une activité UPRTase.

Par combinaison de séquences d'acide nucléique on entend désigner aussi bien des séquences distinctes qui codent pour au moins deux polypeptides distincts que des séquences fusionnées qui codent pour des polypeptides de fusion, étant entendu que la production de tels polypeptides peut être réalisée sous le contrôle des mêmes éléments de régulation (cassette polycistronique) ou d'éléments indépendants, identiques ou différents, homologues ou hétérologues vis à vis du vecteur les renfermant, constitutifs ou inductibles.

Selon un mode particulier de réalisation, la composition de l'invention comprend au moins une séquence

d'acide nucléique (ii) codant pour un polypeptide de fusion dans lequel un premier polypeptide présentant une activité UPRTase ou CDase est fusionné en phase avec au moins un second polypeptide, ledit second polypeptide présentant une activité CDase ou UPRTase, respectivement. Plus particulièrement, un tel polypeptide est caractérisé en ce que la fusion avec le second polypeptide est réalisée à l'extrémité N-terminale dudit premier polypeptide.

Selon un cas préféré, ladite composition est caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide de fusion est une séquence hybride comprenant : - une première séquence d'acide nucléique codant pour un premier polypeptide présentant une activité UPRTase ou CDase, - une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un second polypeptide présentant une activité Cdase ou UPRTase, respectivement.

Une telle séquence d'acide nucléique hybride codant pour ledit polypeptide de fusion peut en outre renfermer une séquence de type IRES.

L'invention concerne notamment une telle composition pour laquelle la première séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi upp, FUR1 et FUR1A105, et en ce que la seconde séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi CodA et FCY1, et vice-versa. De manière tout à fait préférée, une telle séquence d'acide nucléique hybride est choisie parmi les séquences hybrides décrites dans les demandes de brevet W096/16183 et PCT/FR99/00904.

Selon une troisième variante, la composition selon la présente invention est caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique (ii) est un facteur protéique anti-angiogénique. L'angiogénèse est le processus responsable de la formation de nouveaux capillaires à partir du réseau vasculaire déjà existant. Ce processus complexe est finement régulé dans les tissus sains

par la balance des effets de nombreux facteurs angiogéniques et anti-angiogéniques. Cependant, dans certaines pathologies, et notamment lors de la formation d'une tumeur, ce processus est dérégulé : les facteurs angiogéniques prennent le pas sur les facteurs anti-angiogéniques ce qui permet une vascularisation importante des tumeurs et par voie de conséquence leur développement rapide et/ ou l'apparition de métastases. C'est pourquoi, dans le cadre de la présente invention, un facteur anti-angiogénique est considéré comme étant un agent cytotoxique, notamment antitumoral. Parmi les différents facteurs antiangiogéniques connus à l'heure actuelle on peut notamment citer l'angiostatine, l'endostatine, le facteur plaquettaire PF4, la thrombospondine-1, le PRP (pour Proliferin Related Protein), le VEGI (pour Vascular Endothelial Growth Inhibitor) et l'urokinase.

Les séquences d'acide nucléique (i) ou (ii) peuvent être aisément obtenues par clonage, par PCR ou par synthèse chimique selon les techniques conventionnelles en usage. Il peut s'agir de gènes natifs ou dérivés de ces derniers par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieur nucléotides. Par ailleurs, leur séquences sont largement décrites dans la littérature consultable par l'homme de l'art.

La présente invention a également trait à une composition telle que présentée ci-dessus caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) sont insérées dans un vecteur recombinant d'origine plasmidique ou virale, ainsi qu'à un tel vecteur recombinant portant de telles séquences nucléotidiques placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte.

Plus particulièrement, les compositions de l'invention peuvent comprendre lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) insérées dans un même vecteur recombinant ou dans des vecteurs recombinants distincts.

Par vecteur recombinant selon l'invention, on entend désigner un vecteur d'origine plasmidique ou virale, et éventuellement un tel vecteur associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle et/ ou la stabilité dudit vecteur et/ou la protection dudit vecteur in vivo à l'égard du système immunitaire de l'organisme hôte. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art (voir par exemple Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32,115- 121 ; Hodgson et Solaiman , 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342 ; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647- 654). A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides notamment cationiques, de liposomes, de protéines nucléaires ou virales ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Des exemples de tels composés sont notamment disponibles dans les demandes de brevet WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 ou WO 99/05183. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc...) et des lipides neutres (DOPE).

Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagène), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57,193-201). De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de réplication assurant l'initiation de la réplication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on

retiendra l'origine ColEl pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/EBNAl si l'on désire qu'il soit autoréplicatif dans une cellule hôte mammifère, Lupton et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5,2533-2542 ; Yates et al., Nature 313,812-815). Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...). Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36,1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire).

S'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant d'un poxvirus (virus de la vaccine, notamment MVA, canaripox... etc), d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un foamyvirus ou d'un virus associé à l'adénovirus. On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif et non intégratif. A cet égard, les vecteurs adénoviraux conviennent tout particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention. Toutefois, il convient de noter ici que dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, la nature du vecteur revêt peu d'importance.

Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour l'application cancer. Un rétrovirus recombinant selon l'invention comporte généralement les séquences LTR, une région d'encapsidation et la séquence nucléotidique selon l'invention placée sous le contrôle du LTR rétroviral ou d'un promoteur interne tels que ceux décrits ci-après. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, félin, humain, etc. ) et en particulier du MoMuLV (Moloney murine leukemia virus), MVS (Murine sarcoma

virus) ou Friend murine retrovirus (Fb29). Il est propagé dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc...). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTR (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes françaises 94 08300 et 97 05203).

On pourra également avoir recours à un vecteur adénoviral défectif pour la réplication c'est à dire dépourvu de tout ou partie d'au moins une région essentielle à la réplication sélectionnée parmi les régions El, E2, E4 et. Une délétion de la région El est préférée. Mais elle peut être combinée à d'autres modification(s) / délétion(s) touchant notamment tout ou partie des régions E2, E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles défectives sont complémentées en trans au moyen d'une lignée de complémentation et/ou d'un virus auxiliaire afin d'assurer la production des particules virales d'intérêt. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes internationales WO 94/28152 et WO 97/04119). A titre illustratif, la délétion de la majorité de la région El et de l'unité de transcription E4 est tout particulièrement avantageuse. Dans le but d'augmenter les capacités de clonage, le vecteur adénoviral peut en outre être dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle. Selon une autre alternative, on peut mettre en oeuvre un vecteur adénoviral minimal retenant les séquences essentielles à l'encapsidation, à savoir les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la région d'encapsidation. Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que

du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adénovirus d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine, simienne...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128 : 171-176 ; Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989,70: 165-172 ; Jouvenne et al., Gene, 1987,60: 21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995,76: 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5. Un vecteur adénoviral selon la présente invention peut être généré in vitro dans Escherichia coli (E. coli) par ligation ou recombinaison homologue (voir par exemple la demande internationale WO 96/17070) ou encore par recombinaison dans une lignée de complémentation. Les différents vecteurs adénoviraux ainsi que leurs techniques de préparation sont connus (voir par exemple Graham et Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, vol 7, p 109-128 ; Ed : E.J. Murey, The Human Press Inc).

Les éléments nécessaires à l'expression sont constitués par l'ensemble des éléments permettant la transcription de la séquence nucléotidique en ARN et la traduction de l'ARNm en polypeptide, notamment les séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requises pour permettre l'excrétion ou l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. Ces éléments peuvent être régulables ou constitutifs. Bien entendu, le promoteur est adapté au vecteur retenu et à la cellule hôte On peut citer, à titre d'exemples, les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycérate Kinase), MT (metallothioneine ; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7,838-848), a-1 antitrypsine, CFTR, les promoteurs du gène codant pour la créatine kinase

musculaire, pour l'actine, pour le surfactant pulmonaire, immunoglobuline, p-actine (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2,426-436), SRa (Takebe et al., 1988, Mol. Cell.

Biol. 8,466-472), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Virus), le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur de MPSV, le promoteur TK-HSV-1, le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus), les promoteurs du virus de la vaccine p7.5K pH5R, pKlL, p28, p11 et les promoteurs adénoviraux E1A et MLP ou une combinaison desdits promoteurs. Il peut également s'agir d'un promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumorale ou cancéreuse. On peut citer notamment les promoteurs des gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96,2775-2782), CEA (pour carcinoma embryonic antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tyrosinose surexprimé dans les mélanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53,3860-3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1,170-175) et a-fétoprotéine surexprimée dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res.

57,461-465). Le promoteur précoce du Cytomégalovirus (CMV) est tout particulièrement préféré. Il est également possible d'utiliser une région promotrice tissu-spécifique, notamment lorsque la tumeur à traiter est issue d'un type cellulaire particulier, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices.

Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments additionnels améliorant l'expression de la séquence nucléotidique selon l'invention ou son maintien dans la cellule hôte. On peut citer notamment les séquences introniques (WO 94/29471), séquences signal de sécrétion, séquences de localisation nucléaire, sites internes de réinitiation de la traduction de type IRES, séquences poly A de terminaison de la transcription.

Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne plus particulièrement un vecteur recombinant, notamment un vecteur adénoviral défectif pour la réplication, comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53, (ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte et étant définies comme indiqué cidessus.

La présente invention a également pour objet une particule virale, notamment adénovirale, comprenant un vecteur viral recombinant selon l'invention. Une telle particule virale peut être générée à partir d'un vecteur viral selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art. Sa propagation est effectuée notamment dans une cellule de complémentation adaptée aux déficiences du vecteur. S'agissant d'un vecteur adénoviral, on aura par exemple recours à une lignée de complémentation telle que décrite dans la demande WO 94/28152, à la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36,59-72), la lignée A549-E1 (Imler et al., 1996, Gene Therapy 3,75-84) ou une lignée permettant une double complémentation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Krougliak et Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586 ; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2,775-783 ; demande internationale WO 97/04119). On peut également employer des virus auxiliaires pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives. Par cellule de complémentation, on entend une cellule capable de fournir en trans les facteurs précoces et/ou tardifs nécessaires à l'encapsidation du génome viral dans une capside virale pour

générer une particule virale contenant le vecteur recombinant. Ladite cellule peut ne pas complémenter à elle seule toutes les fonctions défectives du vecteur et dans ce cas peut être transfectée/ transduite par un vecteur/ virus auxiliaire apportant les fonctions complémentaires.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale, selon lequel : (i) on introduit un vecteur recombinant selon l'invention dans une cellule, notamment une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une dite cellule transfectée, (ii) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et (iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.

Bien entendu, la particule virale peut être récupérée du surnageant de culture mais également à partir des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/ décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium...).

L'invention a également trait à une cellule hôte eucaryote comprenant les fragments d'ADN présents dans la composition selon l'invention. Ladite cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence, une cellule humaine. Il s'agira de préférence d'une cellule 293, LCA4 ou PERC6. Une telle cellule est notamment utile pour produire les particules virales à haut titre, sans générer de particules compétentes pour la réplication . L' invention concerne également une cellule hôte comprenant une séquence nucléotidique, un vecteur recombinant selon

l'invention ou infectée par une particule virale selon l'invention. Aux fins de la présente invention, une cellule hôte est constituée par toute cellule transfectable par un vecteur recombinant ou infectable par une particule virale, tels que définis ci-avant. Une cellule de mammifère et notamment humaine convient tout particulièrement. Elle peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée dans le génome ou non (épisome). Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine quelconque, notamment hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), musculaire (cellule satellite, myocyte, myoblaste, muscle lisse...), cardiaque, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.

L'invention concerne également une composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral, ou toute applications nécessitant la mort cellulaire, chez un mammifère comprenant : (i) tout ou partie du polypeptide p53, (ii) tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdits polypeptides étant définis comme indiqué précédemment.

Un autre objet selon l'invention consiste en une formulation destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère caractérisée en ce qu'elle comporte une composition (à base d'acide nucléique ou de polypeptide telle que décrite précédemment), un vecteur adénoviral ou une particule virale selon l'invention, ainsi qu'un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Un tel support est préférentiellement isotonique, hypotonique ou faiblement hypertonique et présente une force ionique relativement faible, tel que par exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, un tel support peut renfermer tout solvant, ou liquide aqueux ou partiellement aqueux tel que de l'eau stérile non pyrogène.

Le pH de la formulation est en outre ajusté et tamponné afin

de répondre aux exigences d'utilisation in vivo. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même que des agents de solubilisation, de stabilisation, de préservation. Pour une administration injectable, on préfère une formulation en solution aqueuse, non-aqueuse ou isotonique. Elle peut être présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche (poudre, lyophilisat...) susceptible d'être reconstituée de manière extemporanée par un diluant approprié.

Selon un mode particulier de l'invention, ladite formulation comporte en outre des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prodrogue capable d'être transformée en molécule cytotoxique par un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique.

Une telle prodrogue sera notamment sélectionnée dans le groupe consistant en l'acyclovir ou le ganciclovir (GCV), la cyclophosphophamide, la 6-méthylpurine deoxyribonucleoside, la 6-thioxanthine, la cytosine ou un de ses dérivés ou l'uracile ou un de ses dérivés. De manière tout à fait préférée, ladite prodrogue est la 5fluorocytosine (5FC) ou la 5-fluorouracile (5-FU ).

Par ailleurs, notamment dans le cadre de formulations renfermant une composition selon la seconde variante évoquée ci-dessus, il convient de noter que ladite formulation peut également comprendre une ou plusieurs substances potentialisant l'effet cytotoxique du 5-FU. On peut citer en particulier, les drogues inhibant les enzymes de la voie de biosynthèse de novo des pyrimidines (par exemple celles citées ci-après), les drogues telles que la Leucovorin (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol.

18, 685-692) qui en présence du produit du métabolisme du 5FU (5-FdUMP) augmente l'inhibition de la thymidylate synthase ce qui entraîne une diminution du pool de dTMP nécessaire à la réplication et enfin les drogues telles que le méthotréxate (Cadman et al., 1979, Science 250,1135-

1137) qui en inhibant la dihydrofolate réductase et en élevant le pool d'incorporation de PRPP (phosphoribosylpyrophosphate) provoque l'augmentation de 5FU dans l'ARN cellulaire.

Une formulation selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique et s'adresse plus particulièrement aux maladies prolifératives (cancers, tumeurs, resténose...etc) et aux maladies d'origine infectieuse, notamment virale pour lesquelles il est nécessaire de limiter la prolifération des cellules infectées (induites par les virus de l'hépatite B ou C, le HIV, l'herpès, les rétrovirus....etc.).

Une formulation selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle en vue d'une administration par voie locale, parentérale ou digestive.

Les voies d'administration envisageables sont multiples. On peut citer par exemple la voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale, intrapulmonaire ou intratrachéale. Pour ces trois derniers modes de réalisation, une administration par aérosol ou instillation est avantageuse. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu, de la maladie à traiter ou encore du ou des gène (s) à transférer.

Les préparations à base de particules virales selon l'invention peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 1013 ufp et, de préférence, 106 et 1012 ufp. Pour ce qui est du vecteur recombinant selon l'invention, des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, 0,5 à 5 mg peuvent être envisagées. Une composition à base

de polypeptides comprend de préférence de 0,05 à 10 g et, de manière tout à fait préférée, de 0,5 à 5 g dudit polypeptide. Bien entendu, les doses peuvent être adaptées par le clinicien.

La présente invention est également relative à l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'une composition, d'un vecteur recombinant ou d'une particule virale selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique, notamment pour la préparation d'un médicament antitumoral ou antiviral destiné à inhiber la croissance ou provoquer le rejet d'une tumeur ou la mort d'une cellule infectée. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible ou à sa périphérie, dans les poumons par aérosol, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde appropriée...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient. Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers, tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée. Parmi les applications envisageables, on peut citer les cancers du sein, de l'utérus (notamment ceux induits par les papillomas virus), de la prostate, du poumon, de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'oesophage, du larynx du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie etc...). Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles lisses de la paroi vasculaire (resténose). Enfin pour ce qui est des maladies infectieuses, l'application au SIDA peut être envisagée.

Il est par ailleurs envisageable, le cas échéant et

sans sortir du cadre de la présente invention, de procéder à des administrations simultanées ou successives par des voies différentes des différents composants compris dans la composition ou la formulation pharmaceutique selon l'invention.

L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement des maladies par thérapie génique, caractérisé en ce que l'on administre à un organisme ou à une cellule hôte ayant besoin d'un tel traitement une séquence nucléotidique, un vecteur recombinant, une particule virale ou une cellule hôte selon l'invention.

Lorsque la méthode de traitement met en oeuvre une séquence nucléotidique, un vecteur recombinant ou une particule virale permettant l'expression d'un polypeptide selon l'invention ayant une activité UPRTase, il peut être avantageux d'administrer en outre une seconde séquence nucléotidique codant pour un second polypeptide présentant une activité CDase, ladite seconde séquence nucléotidique étant portée par ledit vecteur recombinant ou particule virale ou par un vecteur ou une particule virale indépendante. Dans ce dernier cas, l'administration des séquences UPRTase et CDase peut être simultanée ou consécutive, l'ordre d'administration étant sans importance.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement comprend également une étape supplémentaire selon laquelle on administre à l'organisme ou la cellule hôte des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prédrogue, avantageusement d'un analogue de cytosine et, en particulier de la 5-FC. A titre illustratif, une dose de 50 à 500 mg/kg/jour peut être employée avec une préférence pour 200 mg/kg/jour. Dans le cadre de la présente invention, la prédrogue est administrée selon les pratiques standards et ceci de manière préalable, concomittante ou encore postérieure à celle de l'agent thérapeutique selon l'invention. La voie orale est préférée. On peut administrer

une dose unique de prédrogue ou des doses répétées pendant un temps suffisamment long pour permettre la production du métabolite toxique au sein de l'organisme ou de la cellule hôte.

Selon une mode avantageux de l'invention, l'utilisation thérapeutique ou la méthode de traitement est associée à un second traitement du patient par chirurgie (notamment par ablation de la tumeur partiellement ou totalement), par radiothérapie ou chimiothérapie. Dans ce cas particulier, le traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante ou fait suite audit second traitement. De manière préféré, ce traitement sera appliqué suite audit second traitement.

Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer les différents objets de la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif.

La figure 1 montre l'effet antiprolifératif in vitro d'un tampon (Mock), d'un adénovirus vide (Ad-null), d'un adénovirus exprimant FCU1 (Ad-FCUl) ou p53 (Ad-p53) ou p53 et FCU1(Ad-p53FCU1) sur les cellules SW480 à une MOI de 1 en absence de prodrogue (100% correspond à la viabilité des cellules non infectées).

La figure 2 montre l'effet antiprolifératif in vitro de Mock, d'un adénovirus vide, d'un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 sur les cellules B16FO à une MOI de 100 en absence de prodrogue (100% correspond à la viabilité des cellules non infectées).

La figure 3 montre l'effet antiprolifératif in vitro de Mock, d'un adénovirus vide, d'un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 sur les cellules LoVo à une MOI de 1 en absence de prodrogue (100% correspond à la viabilité des cellules non infectées).

La figure 4 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FU des cellules SW480 infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 (100% correspond à la

viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue).

La figure 5 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FU des cellules B16FO infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue).

La figure 6 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FU des cellules LoVo infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue).

La figure 7 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules SW40 infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue).

La figure 8 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules B16FO infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue).

La figure 9 montre la sensibilisation en présence de différentes concentrations de 5FC des cellules LoVo infectées par Mock, un adénovirus vide, un adénovirus exprimant FCU1 ou p53 ou p53 et FCU1 (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de prodrogue).

La figure 10 représente le taux de survie de souris B6D2 dans lesquelles ont été implantées des cellules tumorales B16FO traitées par différentes compositions adénovirales.

EXEMPLES :
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.

Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de

clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de recombinaison homologue sont de préférence réalisées dans la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow). Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260.

En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées ou transduites et cultivées selon les techniques standards bien connues de l'homme du métier.

EXEMPLE 1 : Construction d'un adénovirus exprimant p 53 (Adp53).

La région codante de p53 a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pC53-SN3 (Baker et al., 1990, Science 249,912-915) utilisé comme matrice et des amorces suivantes :
En 5' terminal 5'ggcagccagaattccttccgggtcac3'
En 3' terminal 5'ggctgtcagtggggatctagaagtggag3'
Les sites EcoRI et XbaI ont été introduits respectivement en 5' et en 3' de la séquence codante de p53. le fragment PCR de p53 a été coupé par EcoRI et XbaI puis inséré dans le plamide pCI-neo (Promega Corp) pour donner le plasmide pCI-neop53. Le fragment XhoI-XbaI de pCI-neop53 renfermant le gène p53 est isolé et introduit dans le vecteur pTG6600 (Lathe et al, 1987, Gene 57,193-201) clivé par ces mêmes enzymes, pour donner le vecteur de transfert

pTG6600p53. Le vecteur adénoviral Adp53 est reconstitué par recombinaison homologue dans la souche E.coli BJ5183 entre le fragment PacI-BstEII de pTG6600p53 et le vecteur pTG6624 linéarisé par ClaI. La construction finale Adp53 contient le génome de l'Ad5 délété de l'essentiel des régions El (nucléotides 459 à 3328) et E3 (nucléotides 28249 à 30758) et en lieu et place de El, une cassette d'expression du gène p53 placé sous le contrôle du promoteur précoce CMV et des séquences d'épissage hybrides ss-globine/Ig. Les particules virales sont générées par transfection dans une lignée de cellules 293 (ATCC CRL1573) qui complémentent la fonction El.

EXEMPLE 2 : Construction d'un adénovirus exprimant une unité bicistronique p53-IRES-FCUl (Adp53FCUl).

Le fragment NcoI-SalI du plasmide pCI-neoFCUl décrit dans la demande de brevet française No. 98. 05054 renfermant le gène de fusion FCU1 est isolé et introduit dans le vecteur pTG4369 linéarisé par NcoI-SalI. Le plasmide pTG4369FCUl ainsi obtenu contient le gène FCU1 en aval de la séquence IRES (pour Internai Ribosome Entry Site ou site interne d'entrée des ribosomes) de EMCV (encephalomyocarditis virus). Le fragment SacI-NotI de pCIneop53 est isolé puis inséré dans le vecteur pTG4369FCUl linéarisé par SacI-NotI pour donner le vecteur pTG4369p53FCUl dans lequel le gène p53 est placé en amont de la séquence IRES. Le fragment NheI-MluI de pTG4369p53FCUl renfermant la séquence p53IRESFCUl est inséré dans le vecteur pTG6600 clivé par ces mêmes enzymes pour donner le vecteur de transfert pTG6600p53IRESFCUl. Le vecteur adénoviral Adp53FCUl est reconstitué par recombinaison homologue dans la souche E.coli BJ5183 entre le fragment PacI-BstEII de pTG6600p53IRESFCUl et le vecteur pTG6624 linéarisé par ClaI. La construction finale Adp53FCUl contient le génome de l'Ad5 délété de l'essentiel des régions El (nucléotides 459 à 3328) et E3 (nucléotides 28249

à 30758) et en lieu et place de El, une cassette d'expression du bicistron p53-FCUl placé sous le contrôle du promoteur précoce CMV et des séquences d'épissage hybrides -globine/Ig. Les particules adénovirales sont générées par transfection dans une lignée de cellules 293 (ATCC CRL1573) qui complémentent la fonction El.

EXEMPLE 3 : de l'adénovirus exprimant le gène de fusion FCU1 (AdFCUl).

Le fragment XhoI-MluI de pCI-neoFCUI (décrit dans la demande de brevet français No. 98. 05054) renfermant le gène de fusion FCU1 est isolé et introduit dans le vecteur pTG6600 linéairisé par XhoI-MhuI pour donner le vecteur de transfert pTG6600FCUl. Comme décrit précédemment, la recombinaison homologue entre le fragment PacI-BstEII portant FCU1 et isolé de pTG6600FCUl et le vecteur pTG6624 linéarisé par ClaI permet de générer le vecteur adénoviral pTG6624FCUl délété des régions El et E3 et comportant à la place de El le gène FCU1 placé sous le contrôle du promoteur CMV et des séquences d'épissage hybrides P-globine/Ig. Les particules adénovirales sont générées par transfection dans une lignée de cellules 293 (ATCC CRL1573) qui complémentent la fonction El.

EXEMPLE 4 : Infection par les adénovirus AdFCUl, Adp53 et Adp53FCU1.

4. 1 Résultats in vitro.

Les constructions adénovirales des exemples précédents sont utilisées pour infecter in vitro 3 lignées cellulaires tumorales : - la lignée tumorale humaine SW480 (adénocarcinome de colon/ATCC CCL-228) dont le gène p53 n'est pas fonctionnel, - la lignée cellulaire tumorale humaine LoVo (adénocarcinome de colon/ ATCC CCL-229) dont le gène p53 est fonctionnel et

- la lignée mélanome de souris B16(FO) (ATCC CRL- 6322)
Les cellules sont infectées (MOI de 1 pour SW480 et LoVo et MOI de 100 pour B16(FO)) puis cultivées en présence ou en absence de prodrogue (5-fluorocytosine (5FC) ou 5fluorouracile (5FU)) à différentes concentrations. Après trypsinisation (à J+10 pour SW480 et à J+8 pour B16(FO)), la viabilité des cellules est évaluée au bleu trypan. Les valeurs reportées correspondent aux moyennes obtenues après 4 comptages.

En absence de prodrogue (Figures 1 à 3), on observe un effet antiprolifératif des cellules infectées par un adénovirus exprimant p53 (Adp53 et Adp53FCUl) dans les lignées SW480 principalement et plus faiblement dans les lignées B16FO. Toutefois, malgré l'expression de p53 qui induit l'apoptose ou la suppression de la croissance des cellules, aucun effet antiprolifératif n'est pas observé dans la lignée LoVo ; cela indique que la seule administration de p53, notamment dans des cellules tumorales dont le gène p53 est fonctionnel, est insuffisante, voire inopérante, pour permettre la mise en oeuvre d'un protocole de thérapie antitumorale efficace.

Au contraire, on constate qu'en présence de différentes concentrations de prodrogue 5FU (Figures 4 à 6), les cellules infectées par Adp53 sont sensibilisées par rapport aux cellules non infectées ou infectées par un adénovirus non recombinant illustrant ainsi l'action connue de p53 dans la toxicité du 5FU. Toutefois, conformément à la présente invention, on constate également que, de manière surprenante, la présence de FCU1 augmente très sensiblement la toxicité du 5FU dans les cellules (100% correspond à la viabilité des cellules infectées en absence de 5FU) traduisant ainsi un effet clairement synergique des deux types d'agent.

Les figures 7 à 9 illustrent les résultats analogues obtenus en utilisant 5FC comme prodrogue.

Ces résultats mettent en évidence qu'il existe une synergie entre les produits d'expression de FCU1 et de p53 pour l' induction de la mortalité lorsque le 5FC ou le 5FU sont utilisés comme prodrogues.

4. 2 Résultats in vivo.

Des cellules B16F(0) (3.105 cellules) sont injectées par voie sous cutanée à 4 groupes de 8 souris immunocompétentes B6D2 à JO. Dès que les tumeurs deviennent palpables (environ J+9), les constructions adénovirales comprenant le gène p53 (Adp53) ou les gènes p53 et FCU1 (Adp53FCUl) ou une construction adénovirale non recombinante (Ad null) sont injectées à une dose de 5.108 UI à trois jours consécutifs (J+9, J+10 et J+ll). A partir de J+9,1 ml d'une solution saline à 0,9% ou 1 ml d'une solution de 5-FC à 1% sont injectées par voie intrapéritonéale, deux fois par jour. Les résultats présentés à la figure 10 mettent en évidence une augmentation du taux de survie des souris dans lesquelles a été injecté l'Adp53FCUl et qui ont été traitées au 5-FC .

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT : (A) NOM : S.A.

(B) RUE: 11 rue de Molsheim (C) VILLE : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : (G) TELEPHONE : 88 27 91 00 (H) TELECOPIE : 88 27 91 41 (ii) TITRE DE L'INVENTION : destinée à la mise en #uvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : cerevisiae (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE : UPRTase delta 35 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 1 :
Met Ala Ser Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn
1 5 10 15
Gln Leu Leu Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Arg Asn Lys Asn Thr Thr Arg
20 25 30
Pro Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu
35 40 45
Glu Gly Leu Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp
50 55 60
Thr Asn Glu Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Ser Ile Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp
85 90 95

Cys Cys Arg Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu
100 105 110
Glu Thr Ala Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile
115 120 125
Ser Glu Arg Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly
130 135 140
Ser Ala Ile Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro
145 150 155 160
Glu Arg Ile Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu
165 170 175
Lys Tyr His Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Asp Arg Gly Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp
195 200 205
Phe Gly Asp Arg Tyr Tyr Cys Val
210 215 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 373acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iii) ANTI-SENS : (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : cerevisiae (vii) SOURCE IMMEDIATE: (B) CLONE : de fusion fcyl::furl delta 35 (FCU1) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 2 :
Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp
1 5 10 15
Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro
20 25 30
Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg
35 40 45
Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu
50 55 60
Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys
65 70 75 80

Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly
85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val
100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu
115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe
130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ala Ser 145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu
165 170 175 Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Arg Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe
180 185 190 Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu Glu Gly Leu
195 200 205 Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp Thr Asn Glu
210 215 220 Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly Val Ser Ile 225 230 235 240 Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp Cys Cys Arg
245 250 255 Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu Glu Thr Ala
260 265 270 Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Arg
275 280 285 Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala Ile
290 295 300 Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro Glu Arg Ile 305 310 315 320 Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Lys Tyr His
325 330 335 Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu Asp Arg Gly
340 345 350 Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp Phe Gly Asp
355 360 365 Arg Tyr Tyr Cys Val
370

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53, (ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit mammifère.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité antitumorale ou antivirale est choisi parmi les cytokines, les protéines codées par les gènes suicides et les facteurs protéiques anti-angiogéniques.

3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est une cytokine choisie parmi les interférons a, P et y, les interleukines, les facteurs nécrosant des tumeurs et les facteurs stimulateurs de colonies.

4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est l'interleukine-2 (IL-2).

5. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est l'interféron gamma (IFN-y).

6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polypeptide présente au moins une activité cytotoxique sélectionnée parmi l'activité thymidine kinase, l'activité purine nucleoside phosphorylase, l'activité guanine phosphoribosyl transférase et l'activité cytosine désaminase.

7. Composition selon la revendication 6,

caractérisée en ce que ledit polypeptide présente au moins une activité CDase et une activité UPRTase.

8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique (ii) est sélectionnée parmi CodA, upp, FUR1, FCY1 et FUR1#105.

9. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit polypeptide est un polypeptide de fusion dans lequel un premier polypeptide présentant une activité UPRTase ou CDase est fusionné en phase avec au moins un second polypeptide, ledit second polypeptide présentant une activité CDase ou UPRTase, respectivement.

10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la fusion avec le second polypeptide est réalisée à l'extrémité N-terminale dudit premier polypeptide.

11. Composition selon la revendication 9-10, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide de fusion est une séquence hybride comprenant : - une première séquence d'acide nucléique codant pour un premier polypeptide présentant une activité UPRTase, - une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un second polypeptide présentant une activité CDase.

12. Composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que la première séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi upp, FUR1 et FUR1#105, et en ce que la seconde séquence d'acide nucléique est sélectionnée parmi CodA et FCY1.

13. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est un facteur protéique antiangiogénique choisi parmi l'angiostatine, l'endostatine, le facteur plaquettaire PF4, la thrombospondine-1, le PRP, le VEGI et l'urokinase.

14. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) sont insérées dans un vecteur recombinant

d'origine plasmidique ou virale.

15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) sont insérées dans le même vecteur recombinant.

16. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ii) sont insérées dans des vecteurs recombinants distincts.

17. Vecteur comprenant : (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie du polypeptide p53, (ii) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique, lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte.

18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.

19. Particule virale comprenant un vecteur selon la revendication 18.

20. Procédé de préparation d'une particule virale selon la revendication 19, selon lequel : (i) on introduit un vecteur viral selon la revendication 18 dans une cellule capable de produire ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule transfectée, (ii) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et (iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.

21. Composition destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral chez un mammifère comprenant : (i) tout ou partie du polypeptide p53, (ii) tout ou partie d'un polypeptide ayant au

moins une activité cytotoxique, selon laquelle ledit polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique est tel que défini dans les revendications 1 à 13.

22. Formulation destinée à la mise en oeuvre d'un traitement antitumorale ou antiviral chez un mammifère caractérisée en ce qu'elle comporte une composition selon l'une des revendications 1 à 16, un vecteur selon les revendications 17-18 , une particule virale selon la revendication 19, ou une composition selon selon la revendication 21, ainsi qu'un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

23. Formulation selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comporte des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prodrogue capable d'être transformée en molécule cytotoxique par un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique.

24. Formulation selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite prodrogue est sélectionnée parmi la 5-fluorouracile (5-FU) et la 5-fluorocytosine ((5FC) .

25. Utilisation d'une composition selon les revendications 1 à 16, d'un un vecteur selon les revendications 17-18 , d'une particule virale selon la revendication 19, ou d'une composition selon selon la revendication 21, pour la préparation d'un médicament antitumoral ou antiviral.