FR2699538A1 - Sous-unité d'une capsule protéique CS31A modifiée par au moins un peptide hétérologue, capsule protéique CS31A et microorganismes portant ces sous-unités; procédés d'obtention et utilisation de ceux-ci. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne la sous-unité de la capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue, ainsi que la capsule protéique CS31A comportant une telle sous-unité et les micro-organismes qui portent une capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés de la sous-unité est modifiée par au moins un peptide hétérologue. L'invention concerne aussi les procédés d'obtention de telles sous-unités, des capsules protéiques CS31A les comportant et des micro-organismes qui portent ces capsules protéiques CS31A, ainsi que l'utilisation de ceux-ci pour la préparation de vaccins, la production de peptides et la préparation de tests immunologiques.
Description
SOUS-UNITE D'UNE CAPSULE PROTEIQUE CS31A
MODIFIEE PAR AU MOINS UN PEPTIDE HETEROLOGUE, CAPSULE
PROTEIQUE CS31A COMPORTANT UNE TELLE SOUS-UNITE ET
MICRO-ORGANISMES DONT LA MEMBRANE EXTERNE PORTE DE
TELLES SOUS-UNITES; PROCEDES D'OBTENTION ET UTILISATION
DE CEUX-CI.
MODIFIEE PAR AU MOINS UN PEPTIDE HETEROLOGUE, CAPSULE
PROTEIQUE CS31A COMPORTANT UNE TELLE SOUS-UNITE ET
MICRO-ORGANISMES DONT LA MEMBRANE EXTERNE PORTE DE
TELLES SOUS-UNITES; PROCEDES D'OBTENTION ET UTILISATION
DE CEUX-CI.
La présente invention concerne la sous-unité de la capsule protéique CS31A, dénommée protéine ClpG, dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue.
L'invention concerne aussi la capsule protéique CS31A comportant une telle sous-unité, ainsi que les micro-organismes qui portent une capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés de la sous-unité est modifiée par au moins un peptide hétérologue.
L'invention concerne encore les procédés d'obtention de telles sous-unités, des capsules protéiques CS31A les comportant et des micro-organismes portant ces capsules protéiques CS31A, ainsi que l'utilisation de ceux-ci pour la préparation de vaccins, la production de peptides et la préparation de tests immunologiques.
La membrane externe des micro-organismes comporte des structures protéiques diverses telles que des flagelles, pili, fimbriae ou des capsules protéiques, conférant notamment auxdits micro-organismes des propriétés de mouvement ou d'attachement.
Ces structures comportent des molécules hautement antigéniques ayant permis de préparer à partir de la structure protéique isolée de ces micro-organismes ou à partir des micro-organismes eux-mêmes, des vaccins correspondants aux divers types d'antigènes isolés dans ces micro-organismes. Ainsi la demande de brevet français publiée sous le numéro 2 466 251 propose un vaccin anticolibacillaire animal contenant au moins un antigène provenant de différentes souches d'Escherichia
Coli.
Coli.
En outre, ces molécules constituent autant de protéines porteuses dans lesquelles peuvent être introduits des épitopes étrangers conférant aux dites protéines un caractère antigénique nouveau dont l'immunogénicité permet l'utilisation comme vaccin.
Ainsi la demande de brevet européen publiée sous le numéro 264 150 décrit des micro-organismes dont la membrane externe porte des pili dont la composition a été modifiée par un changement de la séquence protéique de la sous-unité.
Les structures membranaires comme les pili, les fimbriae ou les capsules protéiques apparaissent plus avantageuses dans le domaine de la vaccination que les protéines de membrane externe. En effet dans le cas des pili l'ensemble de la protéine structurale est à ltextérieur de la cellule, alors que pour les protéines de membrane externe, certaines régions polypeptidiques seulement sont présentées à la surface cellulaire et l'accessibilité à ces protéines risque d'être entravée par le lipopolysaccharide et les enveloppes capsulaires.
De plus, les sous-unités des fimbriae ou des capsules protéiques sont présentées à la surface bactérienne en nombre beaucoup plus élevé que les protéines de membrane externe.
En outre, la purification d'une protéine de membrane est plus difficile que celle de protéines qui sont totalement extérieures aux micro-organismes comme les pili ou fimbriae.
La nature des micro-organismes concernés par l'invention dépend uniquement de leur capacité à produire la capsule protéique CS31A; il s'agit plus particulièrement de bactéries de la famille des enterobacteriacae appartenant aux espèces Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae.
De nombreux travaux ont été effectués sur les pili de E.coli, et plus particulièrement les sousunités fimbriales K88 et K99 ont été largement décrites.
Des travaux plus récents ont mis en évidence chez une souche sauvage de E.coli dénommée 31A+ dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2 466 251, une structure protéique dénommée CS31A. L'opéron gouvernant la biogénèse de cette structure a été cloné dans un organisme hôte, et le gène codant pour la sousunité de CS31A, dénommée Clpg, a été localisé, caractérisé et séquencé. (C. Martin, C. Boeuf, F.
Bousquet; Microbial Pathogenesis 1991; 10: 429-442) (J. P. Girardeau, Y. Bertin, C. Martin, M. DerVartanian,
C. Boeuf; Journal of Bacteriology; Dec. 1991, vol. 173,
No. 23, p. 7673-7683) ; (M. J. Korth, R. A. Schneider,
S. L. Moseley; Infection and Immunity; July 1991, vol.
C. Boeuf; Journal of Bacteriology; Dec. 1991, vol. 173,
No. 23, p. 7673-7683) ; (M. J. Korth, R. A. Schneider,
S. L. Moseley; Infection and Immunity; July 1991, vol.
59, No 7, p. 2333-2340).
La structure CS31A est une capsule protéique moins organisée et plus souple que les flagelles et fimbriae lesquels sont davantages organisés et rigides; en conséquence, il apparait que la taille des peptides susceptibles d'être exprimés dans les fimbriae et flagelles pourra difficilement dépasser une quinzaine d'acides aminés, alors que l'utilisation des capsules protéiques CS31A permet d'obtenir l'introduction de séquences étrangères de taille plus importante, comptant jusqu'à une centaine d'acides aminés.
Cependant l'introduction de séquences peptidiques hétérologues n'est possible au niveau de la protéine que dans certains sites permissifs dont il faut déterminer la taille et la position.
La présente invention a précisément pour objet la définition des régions de la protéine ClpG dans lesquelles des peptides hétérologues peuvent être introduits sans perturber la biogénèse de la capsule protéique CS31A.
Les techniques utilisées pour le clonage et le séquençage du gène codant pour la sous-unité de CS3iA, ainsi que pour l'identification des régions de ladite sous-unité acceptant des insertions et/ou substitutions hétérologues seront décrites dans la description détaillée de l'invention. I1 sera plus particulièrement fait référence dans ce qui suit à la figure 9 représentant la séquence nucléotidique du gène codant pour la sous-unité de CS31A et la séquence polypeptidique déduite de cette séquence nucléotidique.
L'identification des régions potentiellement permissives a tout d'abord consisté à définir des régions variables dans une famille de protéines apparentées à CS31A, à savoir K88 et F41, puis les épitopes continus, d'une part des sous-unités dénaturées et d'autre part de la protéine native, puis à définir l'accessibilité desdits épitopes continus.
Les épitopes continus correspondent souvent aux régions variables de ces protéines. De plus, s'agissant des régions immunodominantes de la protéine, ces zones paraissent particulièrement indiquées pour présenter au système immunitaire des épitopes vaccinants introduits dans des protéines recombinantes.
L'étude immunostructurale a permis de localiser clairement les épitopes continus dans des régions variables, lesquelles sont généralement flexibles, hydrophiles et accessibles aux anticorps dans la protéine native. Ainsi à condition qu'elles soient permissives, les régions variables immunoréactives délimitées par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions suivantes : 10-19, 38-58, 88-106, 144-172, 184-220 et 223-245, seront choisies pour des modifications par des peptides hétérologues.
Outre la comparaison des séquences de CS31A,
K88 et F41, et l'étude immunostructurale de CS31A, une technique de mutagénèse insertionelle au hasard a complété l'étude des zones de la protéine CS31A suceptibles d'accepter des additions ou substitutions de peptides hétérologues.
K88 et F41, et l'étude immunostructurale de CS31A, une technique de mutagénèse insertionelle au hasard a complété l'étude des zones de la protéine CS31A suceptibles d'accepter des additions ou substitutions de peptides hétérologues.
La mise en oeuvre de ces techniques a permis d'identifier de façon présomptive quatre régions aptes à accepter des modifications par des peptides hétérologues sans affecter la biogénèse de CS31A :
- Région A recouvrant le peptide signal et l'extrémité N-terminale de la protéine mature délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -13 et +8.
- Région A recouvrant le peptide signal et l'extrémité N-terminale de la protéine mature délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -13 et +8.
- Région B, délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 58.
- Région C, délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 123 et 164.
- Région D, délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 183 et 257.
En conséquence, l'invention concerne une sous-unité d'une capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés est modifié au niveau d'au moins une des régions A, B, C et D définies ci-dessus, par au moins un peptide hétéroloque.
La région A accepte l'introduction de 4 à 20 acides aminés hétérologues par mutagénèse insertionelle au hasard. L'invention concerne plus particulièrement une sous-unité de la capsule CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue, entre les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -1 et +1.
La région B contient une séquence variable, dénommée V1, délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 58. Des insertions de 4 à 18 acides aminés ont été obtenues par mutagénèse insertionelle au hasard dans la région B. De plus, la région B comporte deux peptides particulièrement immunogènes et antigéniques dans la forme dénaturée de la protéine, ceux-ci sont délimités respectivement par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 19 et 38 et 58. L'invention concerne donc plus particulièrement une sous-unité de la capsule CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par l'introduction d'au moins un peptide hétérologue, au niveau de l'un au moins de ces deux peptides.
La région C contient une séquence variable, dénommée V2, délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 123 et 150. Des insertions de 4 à 18 acides aminés hétérologues ont été obtenues par mutagénèse insertionelle au hasard dans la région C. De plus, la région C contient dans sa partie C-terminale, un épitope continu délimité par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 151 et 160. L'invention concerne donc plus particulièrement une sous-unité de la capsule CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par l'introduction d'au moins un peptide hétérologue, au niveau de cet épitope.
La région D contient une région variable, dénommée V3, délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 183 et 221. Cette région contient le seul épitope continu antigénique et immunogène dans la protéine native, celui-ci est délimité par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 188 et 196. De plus, la partie C-terminale de la région D comporte trois autres peptides immunogènes et antigéniques dans la forme dénaturée de la protéine, ceux-ci sont délimités respectivement par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 211 et 219, 223 et 231 et 235 et 246. L'invention concerne donc plus particulièrement une sous-unité de la capsule CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par l'introduction d'au moins un peptide hétérologue au niveau de l'un au moins de ces quatre peptides.
Différents épitopes, notamment vaccinants, provenant de bactéries, de parasites ou de virus peuvent être introduits dans la protéine ClpG.
Ainsi l'invention concerne la sous-unité d'une capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue choisi parmi l'épitope C ou l'épitope A du virus de la gastroentérite transmissible du porc, un épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin, l'épitope C3 du virus polio, un épitope de la protéine VP1 du virus de la fièvre afteuse.
A titre d'exemple, on peut citer l'introduction de l'épitope C ou de l'épitope A du virus de la gastroentérite transmissible (GET) du porc dans l'une au moins des régions permissives de la protéine
ClpG constituant la sous-unité de CS31A. La sous-unité ou la capsule protéique ou encore le micro-organisme, ainsi modifiés présente ltépitope C et/ou ltépitope A, et sont particulièrement utiles pour la préparation d'un vaccin contre le virus de la gastroentérite transmissible chez le porc.
ClpG constituant la sous-unité de CS31A. La sous-unité ou la capsule protéique ou encore le micro-organisme, ainsi modifiés présente ltépitope C et/ou ltépitope A, et sont particulièrement utiles pour la préparation d'un vaccin contre le virus de la gastroentérite transmissible chez le porc.
On peut encore citer à titre d'exemple, l'introduction d'un épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin dans l'une au moins des régions permissives de la protéine ClpG constituant la sous-unité de
CS31A, et l'utilisation soit de la sous-unité, soit de la capsule protéique, soit d'un micro-organisme modifié génétiquement afin d'exprimer au niveau de la capsule protéique CS31A l'épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin, pour la préparation d'un vaccin contre la diarrhée à rotavirus chez le veau.
CS31A, et l'utilisation soit de la sous-unité, soit de la capsule protéique, soit d'un micro-organisme modifié génétiquement afin d'exprimer au niveau de la capsule protéique CS31A l'épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin, pour la préparation d'un vaccin contre la diarrhée à rotavirus chez le veau.
Les modifications de la séquence protéique de la sous-unité sont avantageusement réalisées par des techniques de génie génétique, consistant à modifier la séquence d'ADN sauvage codant pour la sous-unité, afin d'obtenir une séquence en acides aminés modifiée.
Outre les modifications consistant en la substitution et/ou la suppression et/ou l'addition de une ou plusieurs bases au niveau de la séquence d'ADN codante, et nlentrainant aucune conséquence sur la biogénèse de la sous-unité, on entend tout particulièrement par modification, l'introduction dans l'ADN sauvage d'un fragment d'ADN étranger dont la séquence et sa phase de lecture dans le gène recombinant déterminent la séquence polypeptidique hétérologue introduite dans la séquence en acides aminés de la sousunité. Il peut alors s'agir du remplacement d'un fragment de l'ADN sauvage par un fragment d'ADN étranger ou de l'addition d'un fragment d'ADN étranger.
L'invention concerne donc aussi les procédés permettant d'obtenir une sous-unité d'une capsule CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue, consistant à introduire au niveau d'au moins une des régions permissives A, B, C, D du gène sauvage codant pour la sous-unité, au moins un fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue. Les séquences hétérologues sont introduites
- par clonage après mutagénèse dirigée conduisant à la création de sites de restriction permettant des insertions ou des substitutions;
- par clonage dans des sites de restriction tels que EcoR1, introduits par mutagénèse insertionnelle au hasard;
- par insertion dirigée en clonant directement la séquence hétérologue entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG.
- par clonage après mutagénèse dirigée conduisant à la création de sites de restriction permettant des insertions ou des substitutions;
- par clonage dans des sites de restriction tels que EcoR1, introduits par mutagénèse insertionnelle au hasard;
- par insertion dirigée en clonant directement la séquence hétérologue entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG.
Le fragment d'ADN étranger peut être naturel ou synthétique; il est choisi ou préparé en fonction du peptide que l'on souhaite exprimer au niveau de la sous unité de CS31A, lui même déterminé selon l'application envisagée.
L'invention concerne aussi les capsules protéiques CS31A comportant une sous-unité ClpG modifiée selon l'invention, ainsi que les micro-organismes dont la membrane externe porte de telles capsules. Celles-ci peuvent être obtenues par exemple en cultivant une bactérie E. coli exprimant les gènes gouvernant la biogénèse de la capsule CS31A modifiée par au moins un fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue. De manière avantageuse, la culture précédente est réalisée soit sur un milieu de culture gélosé permettant la collecte des bactéries à la surface de la gélose, soit sur un milieu liquide en fermenteur permettant la collecte des bactéries après centrifugation.Une fraction enrichie en capsule CS31A modifiée peut être obtenue à partir de ces micro-organismes par une agitation vigoureuse des suspensions bactériennes issues de la collecte à la surface de la gélose ou culture en fermenteur. Après centrifugation à 5000 g, on obtient un surnageant riche en capsule CS31A modifiée. Celle-ci peut être avantageusement purifiée à partir d'une fraction précipitée au sulfate d'ammonium 20 % par une étape de chromatographie à interaction hydrophobe sur phényl Sépharose. L'élution par l'eau permet d'obtenir un produit de haut poids moléculaire dont le degré de pureté est supérieur à 90 %. A partir de cette fraction, les sous-unités CS31A modifiées peuvent être facilement purifiées par filtration moléculaire sur une colonne de
Sephacryl S 300 en présence de chlorure de guanidium 6 M.
Sephacryl S 300 en présence de chlorure de guanidium 6 M.
La sous-unité de CS31A présente un caractère fortement antigénique et immunogénique.
L'introduction d'un peptide hétérologue au sein de cette sous-unité, dans les régions définies précédemment, permet de conférer un caractère antigénique nouveau tant à la sous-unité qu'aux micro-organismes dont les capsules CS31A portent une telle sous-unité.
La capsule protéique CS31A constitue en outre un système particulièrement adapté à la production de peptides destinés notamment à la préparation de tests immunologiques; les protéines hybrides obtenues par introduction dans le gène codant pour la protéine ClpG d'un ADN codant pour un peptide hétérologue préalablement déterminé, peuvent être avantageusement utilisées, soit en tant qu'antigène pour la détection d'anticorps, soit en tant qu'immunogène pour produire des anticorps contre des protéines par exemple de pathogènes qu'il est impossible de cultiver.
Ainsi l'invention concerne l'utilisation de la sous-unité de CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétéroloque, la capsule protéique CS31A comportant une telle sous-unité, ou encore les micro-organismes dont la membrane externe porte de telles capsules protéiques CS3îA, en tant que principe actif pour la fabrication de compositions immunogènes.
Ces compositions immunogènes peuvent avantageusement être mises en oeuvre pour la préparation de vaccins humains ou animaux ou encore de tests immunologiques, utiles en santé humaine ou animale.
D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description qui suit, se rapportant au clonage et au séquençage du gène codant pour la sousunité de CS31A, ainsi qu'à l'identification des régions de la sous-unité ClpG pouvant accepter des peptides hétérologues et à l'intoduction de tels peptides dans les régions déterminées, et enfin à l'immunogènicité des peptides hétérologues dans les protéines ClpG recombinantes produites par les bactéries.
A) MATERIEL ET METHODES
1) Souches E. coli et plasmides
- DB 6433 : A(lacZYA), pro, met, Su III, Xs,
Nal r, Rif r. (Davis RW, Botstein D, Roth JR. In
Advanced bacterial genetics. New York : Cold Spring
Harbor laboratory 1980).
1) Souches E. coli et plasmides
- DB 6433 : A(lacZYA), pro, met, Su III, Xs,
Nal r, Rif r. (Davis RW, Botstein D, Roth JR. In
Advanced bacterial genetics. New York : Cold Spring
Harbor laboratory 1980).
- 31A : souche sauvage hébergeant p31A, déposée à la collection de l'Institut Pasteur, 25 Rue du
Docteur Roux, Paris 15, sous le NO I105.
Docteur Roux, Paris 15, sous le NO I105.
- Orne 6 : souche sauvage de sérotype 017:
K7: H18 produisant CS31A, utilisée pour purifier CS31A.
K7: H18 produisant CS31A, utilisée pour purifier CS31A.
Cette souche E. coli ne porte pas d'autres protéines de surface susceptibles d'interférer ou compliquer la purification de CS31A.
Les souches bactériennes utilisées pour le transfert de plasmides recombinants par transformation sont
- DH5 a : F-80 dlac Zamias, end Al, rec Al, hsdR17 (rk,m+k) sup E44, thi-l, gyr A, rel Al, A(lac
ZYA -arg F), U169, X-. (Bethesda Research Laboratories,
Life Technologies, Inc.).
- DH5 a : F-80 dlac Zamias, end Al, rec Al, hsdR17 (rk,m+k) sup E44, thi-l, gyr A, rel Al, A(lac
ZYA -arg F), U169, X-. (Bethesda Research Laboratories,
Life Technologies, Inc.).
- JM 109 : F'traD36, lac Iq, A(lacZ)AM15, proAB, recAl, end Al, gyr A96, thi, hsd R17, supE 44ex4~
rel Al, A (lac-proAB). (Yanisk-Perron C, Viera J,
Messing J, (1985).Gene 33, 103-119).
rel Al, A (lac-proAB). (Yanisk-Perron C, Viera J,
Messing J, (1985).Gene 33, 103-119).
Les plasmides pDSPH524, pPSX83 et pDEV41155 utilisés et construits durant ce travail sont décrits au chapitre E ci-après relatif à la complémentation intergénique.
Les cultures sont réalisées en milieu Luria
Bertani (LB) liquide ou solide additionné des antibiotiques appropriés aux concentrations de 100 Rg/ml ou 50 pig/ml pour l'ampicilline, 25 Ag/ml pour le chloramphénicol et 10 g/ml pour la tétracycline.
Bertani (LB) liquide ou solide additionné des antibiotiques appropriés aux concentrations de 100 Rg/ml ou 50 pig/ml pour l'ampicilline, 25 Ag/ml pour le chloramphénicol et 10 g/ml pour la tétracycline.
La production de bêta-galactosidase est mise en évidence par la coloration bleue des colonies sur un milieu LB contenant 2 mM dtisopropyl-bêta-D-thio- galactoside (IPTG) et 40 ,ug/ml de 5-bromo-4-chloro-3indolyl-bêta-D-galactopyranoside (X-gal).
Les enzymes de restriction sont utilisées selon les recommandations des fabricants.
Les conditions de digestion par la Dnase I sont de 1 ng/ g d'ADN circulaire pendant 15-20 mn à 250C dans le tampon Dnase (200 mM Tris-HCl; pH 7,5; 15 mM MnCl2; 1 mg BSA/ml).
La T4-DNA polymérase est utilisée à 3,3 U/pg d'ADN à 220C pendant 30 mn et le fragment
Klenow de 1'ADN polymérase de E.coli à 2,5 U/pLg d'ADN à 220C pendant 30 mn en présence de lmM de dNTP. Le tampon polymérase est : 200 mM Tris-HCl; pH 7,5; 10 mM MgC12; 1 mM DTT.
Klenow de 1'ADN polymérase de E.coli à 2,5 U/pLg d'ADN à 220C pendant 30 mn en présence de lmM de dNTP. Le tampon polymérase est : 200 mM Tris-HCl; pH 7,5; 10 mM MgC12; 1 mM DTT.
La T4-DNA ligase est employée à 0,2 U/Ag d'ADN à 100C pendant la nuit pour la ligation des bouts cohésifs, à 1 U/llg d'ADN à 40C pendant la nuit pour la ligation d'extrémités franches et à 10 U/,ug d'ADN à 40C pendant la nuit pour la ligation des linkers non phosphorylés. Le tampon utilisé pour la ligation de ces linkers est : 660 mM Tris-HCl; pH 7,5; 50 mM MgC12; 50 mM DTT; 1 mg/ml BSA; 10 mM Hexamine Cobalt (III) chloride; 2 mM ATP; 5 mM spermidine.
2) Préparation des linkers (annealing)
Afin d'effectuer la ligation, les linkers doivent être préhybridés. La concentration des linkers
EcoRI non phosphorylés est de 1 ,ug/lll dans du TE (lOmM
Tris-HCl; pH 8,0; 1 mM EDTA). La solution contenant les oligonucléotides est incubée 1 mn à 800C, puis transférée dans un bécher de 500 ml contenant de 1 1eau à 650C. Le bécher est placé dans la glace. Lorsque la température atteint 40C les linkers préhybridés peuvent alors être congelés à -200C avant leur utilisation.
Afin d'effectuer la ligation, les linkers doivent être préhybridés. La concentration des linkers
EcoRI non phosphorylés est de 1 ,ug/lll dans du TE (lOmM
Tris-HCl; pH 8,0; 1 mM EDTA). La solution contenant les oligonucléotides est incubée 1 mn à 800C, puis transférée dans un bécher de 500 ml contenant de 1 1eau à 650C. Le bécher est placé dans la glace. Lorsque la température atteint 40C les linkers préhybridés peuvent alors être congelés à -200C avant leur utilisation.
3) Préparation d'ADN
Les plasmides sont extraits soit par la méthode du lysat alcalin soit par la méthode du "boiling" pour les minipréparations des ADN (Maniatis et al. 1982. Molecular Cloning, a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory). La préparation de plasmides à l'aide de kits d'extraction Quiagen a aussi été utilisée pour la purification de l'ADN.
Les plasmides sont extraits soit par la méthode du lysat alcalin soit par la méthode du "boiling" pour les minipréparations des ADN (Maniatis et al. 1982. Molecular Cloning, a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory). La préparation de plasmides à l'aide de kits d'extraction Quiagen a aussi été utilisée pour la purification de l'ADN.
4) Transformation
La technique au CaCl2 est employée pour la transformation de E.coli DH5 a et de E.coli JM109 (Maniatis et al. 1982). Un à 10 Al du mélange de ligation sont utilisés pour transformer la souche. Les transformants sont sélectionnés sur LB agar contenant les antibiotiques appropriés.
La technique au CaCl2 est employée pour la transformation de E.coli DH5 a et de E.coli JM109 (Maniatis et al. 1982). Un à 10 Al du mélange de ligation sont utilisés pour transformer la souche. Les transformants sont sélectionnés sur LB agar contenant les antibiotiques appropriés.
5) Electrophorèses
Pour l'analyse de l'ADN, les électrophorèses en gels d'agarose sont réalisées sur des appareils horizontaux en tampon Tris-Borate (Tris 90 mM; acide borique 90 mM; EDTA 2 mM; pH. 8,0) en présence de bromure d'éthidium. Le standard de taille est soit 1'ADN ladder 1 Kb (Gibco-BRL), soit l'ADN ladder VIII (Boerhringer), soit l'ADN ladder 100pb (Pharmacia).
Pour l'analyse de l'ADN, les électrophorèses en gels d'agarose sont réalisées sur des appareils horizontaux en tampon Tris-Borate (Tris 90 mM; acide borique 90 mM; EDTA 2 mM; pH. 8,0) en présence de bromure d'éthidium. Le standard de taille est soit 1'ADN ladder 1 Kb (Gibco-BRL), soit l'ADN ladder VIII (Boerhringer), soit l'ADN ladder 100pb (Pharmacia).
Pour l'analyse des protéines, les gels SDS
PAGE sont réalisés sur des appareils verticaux à la concentration de 10 à 15% de polyacrylamide selon la technique classique décrite par Laemmli (1970. Nature; 227, 680-685).
PAGE sont réalisés sur des appareils verticaux à la concentration de 10 à 15% de polyacrylamide selon la technique classique décrite par Laemmli (1970. Nature; 227, 680-685).
6) Séquençaae
Le séquençage est réalisé sur l'ADN double ou simple brin par la méthode de Sanger et al. (1977.
Le séquençage est réalisé sur l'ADN double ou simple brin par la méthode de Sanger et al. (1977.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467) avec la séquenase -T7 polymérase modifiée, le dATP (a-35 S) et un kit de séquençage (U.S. Biochemical Corp. ou multiwell Amersham).
7) Constructions génétiques
Les techniques classiques de génie génétique utilisées pour les diverses constructions génétiques sont décrites par Maniatis et al. (1982) ou Sambrook et al. (1989)
8) Mutagènèse dirigée
La méthode employée est celle de 1'ADN partiellement simple brin (gap-duplex-DNA). Elle utilise les vecteurs pMa5-8 et pMc5-8 et est décrite par
Stanssens et al. (NAR, 1989, 17, 4441-4454).
Les techniques classiques de génie génétique utilisées pour les diverses constructions génétiques sont décrites par Maniatis et al. (1982) ou Sambrook et al. (1989)
8) Mutagènèse dirigée
La méthode employée est celle de 1'ADN partiellement simple brin (gap-duplex-DNA). Elle utilise les vecteurs pMa5-8 et pMc5-8 et est décrite par
Stanssens et al. (NAR, 1989, 17, 4441-4454).
9) Préparation de la protéine CS31A
La protéine CS31A est purifiée selon deux méthodes, l'une permet d'obtenir une forme purifiée native, l'autre une forme purifiée dénaturée.
La protéine CS31A est purifiée selon deux méthodes, l'une permet d'obtenir une forme purifiée native, l'autre une forme purifiée dénaturée.
Le tableau 1 ci-dessous indique les schémas de purification de la protéine CS31A sous ses formes native ou dénaturée.
Tableau 1
<tb> <SEP> Suspension <SEP> en <SEP> PBS
<tb> <SEP> -1
<tb> <SEP> AMS <SEP> précipitation <SEP> 10-20%
<tb> <SEP> $
<tb> <SEP> addition <SEP> HIC <SEP> HIC <SEP> sepharose <SEP> -+ <SEP> Lyophilisation
<tb> taurodeoxycholate <SEP> pic <SEP> élution <SEP> (eau) <SEP> $
<tb> de <SEP> Na <SEP> jusqu'à <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> repris <SEP> par <SEP> Tris5m <SEP> M
<tb> <SEP> Gnd <SEP> Hcl <SEP> 8,5M
<tb> <SEP> -1 <SEP> -1
<tb> agitation <SEP> 2h <SEP> à <SEP> 200C <SEP> 2h <SEP> à <SEP> 370C
<tb> <SEP> -1 <SEP> -1
<tb> ultracentrifugation <SEP> addition <SEP> de <SEP> Tris <SEP> 5mM
<tb> <SEP> 110000g <SEP> 200mn <SEP> final <SEP> 6M <SEP> Gnd <SEP> Hcl
<tb> <SEP> $ <SEP> $
<tb> <SEP> Ta <SEP> Sephacryl <SEP> S300 <SEP> Gnd <SEP> Hcl <SEP> 6M
<tb> <SEP> $ <SEP> $
<tb> Culot <SEP> CS31A <SEP> natif <SEP> pic2
<tb> <SEP> $
<tb> <SEP> dialyse-lyophylisation
<tb> <SEP> $
<tb> <SEP> cs3lA <SEP> dénturé
<tb>
a) Purification sous forme native (polymérique)
La purification de l'antigène natif de haut poids moléculaire est réalisée selon une méthode simple décrite ci-après dont les différentes étapes permettent d'éliminer la quasi totalité des contaminations, en particulier celles liées aux débris membranaires (protéines et LPS). Le tableaux 1 ci-dessus etle tableau 2 ci-après permettent de suivre les étapes de la purification (dosage du KDO : Méthods in microbiology, vol.5B, p. 209-344). Les bactéries récoltées en PBS à partir d'une culture de 10 flacons de Roux en milieu gélosé Minca décrit par Guinée (Infection and Immunity, 1976, 13, 1369-1377) sont homogénéisées à vitesse maximum pendant 3 x 1 mn à température ambiante puis centrifugées 15 mn à 25000 g.Le surnageant est centrifugé à 100C pendant 30 mn à 55000g. Le surnageant obtenu est soumis à une précipitation séquentielle au sulfate d'ammonium. Le culot obtenu entre 10 et 20 % de saturation est remis en solution dans du PBS pH 7,2 à 40C pendant une nuit, additionné de NaCl (2 M), laissé en équilibre une heure à température ambiante, puis purifié par chromathographie à interactions hydrophobes (HIC) sur phenyl Sepharose CL4B (Pharmacia). La protéine native éluée par l'eau est additionnée de taurodeoxycholate de sodium (DOC) 0,5% puis soumis à une ultra centrifugation de 200 mn à 110.000 g. Le culot (UC en TDC) essentiellement constitué par la protéine CS31A sous forme native de haut poids moléculaire est repris en tampon Tris 10 mM (pH 7,8) et laissé en dissolution à 40C (une nuit sans agitation).
<tb> <SEP> -1
<tb> <SEP> AMS <SEP> précipitation <SEP> 10-20%
<tb> <SEP> $
<tb> <SEP> addition <SEP> HIC <SEP> HIC <SEP> sepharose <SEP> -+ <SEP> Lyophilisation
<tb> taurodeoxycholate <SEP> pic <SEP> élution <SEP> (eau) <SEP> $
<tb> de <SEP> Na <SEP> jusqu'à <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> repris <SEP> par <SEP> Tris5m <SEP> M
<tb> <SEP> Gnd <SEP> Hcl <SEP> 8,5M
<tb> <SEP> -1 <SEP> -1
<tb> agitation <SEP> 2h <SEP> à <SEP> 200C <SEP> 2h <SEP> à <SEP> 370C
<tb> <SEP> -1 <SEP> -1
<tb> ultracentrifugation <SEP> addition <SEP> de <SEP> Tris <SEP> 5mM
<tb> <SEP> 110000g <SEP> 200mn <SEP> final <SEP> 6M <SEP> Gnd <SEP> Hcl
<tb> <SEP> $ <SEP> $
<tb> <SEP> Ta <SEP> Sephacryl <SEP> S300 <SEP> Gnd <SEP> Hcl <SEP> 6M
<tb> <SEP> $ <SEP> $
<tb> Culot <SEP> CS31A <SEP> natif <SEP> pic2
<tb> <SEP> $
<tb> <SEP> dialyse-lyophylisation
<tb> <SEP> $
<tb> <SEP> cs3lA <SEP> dénturé
<tb>
a) Purification sous forme native (polymérique)
La purification de l'antigène natif de haut poids moléculaire est réalisée selon une méthode simple décrite ci-après dont les différentes étapes permettent d'éliminer la quasi totalité des contaminations, en particulier celles liées aux débris membranaires (protéines et LPS). Le tableaux 1 ci-dessus etle tableau 2 ci-après permettent de suivre les étapes de la purification (dosage du KDO : Méthods in microbiology, vol.5B, p. 209-344). Les bactéries récoltées en PBS à partir d'une culture de 10 flacons de Roux en milieu gélosé Minca décrit par Guinée (Infection and Immunity, 1976, 13, 1369-1377) sont homogénéisées à vitesse maximum pendant 3 x 1 mn à température ambiante puis centrifugées 15 mn à 25000 g.Le surnageant est centrifugé à 100C pendant 30 mn à 55000g. Le surnageant obtenu est soumis à une précipitation séquentielle au sulfate d'ammonium. Le culot obtenu entre 10 et 20 % de saturation est remis en solution dans du PBS pH 7,2 à 40C pendant une nuit, additionné de NaCl (2 M), laissé en équilibre une heure à température ambiante, puis purifié par chromathographie à interactions hydrophobes (HIC) sur phenyl Sepharose CL4B (Pharmacia). La protéine native éluée par l'eau est additionnée de taurodeoxycholate de sodium (DOC) 0,5% puis soumis à une ultra centrifugation de 200 mn à 110.000 g. Le culot (UC en TDC) essentiellement constitué par la protéine CS31A sous forme native de haut poids moléculaire est repris en tampon Tris 10 mM (pH 7,8) et laissé en dissolution à 40C (une nuit sans agitation).
Le tableau 2 ci-dessous indique les mesures de contrôle de la purification de CS31A par mesure du
KDO résiduel.
KDO résiduel.
Tableau 2
CS31A natif
Orne 6 (UC en TDC)
Protéines
mg % des protéine % pds sec KDO
totales totales bactéries total gg
Surnageant 12000g 54,60 100 4,23 0,110
Surnageant 50000g 52,00 95 4,03 0,110
Surnageant 20% 29,45 54 2,22 0,065
Culot 20% 5,40 9,9 0,42 0,009
HIC élué 2M NaC1 0,35 0,7 0,03 0
HIC élué eau 1,806 3,3 0,14 0 UC en TDC 1,033 1,9 0,08 0 110000q 200mn
b) Purification de CS31A sous forme dénaturée (sous-unité)
L'antigène de haut PM purifié (lyophilisat
HIC) comme décrit dans le tableau 1, est dissocié en sous-unités (30 kDa) par 8,5 M de chlorure de guanidium (Gnd, Hcl) 2h à 37 OC. La concentration est ramenée à 6 M de (Gnd, Hcl) par addition de Tris (pH 7,8) et la protéine est purifiée par une chromatographie sur gel permeation sur Sephacryl S 300 (Pharmacia) en tampon dissociant (Tris pH 7,8; Gnd, Hcl 6 M). Le produit correspondant à l'élution d'une protéine de 30 KDalton est recueilli, dialysé contre un tampon acétate d'ammonium (5 mM pH 7,8), lyophilisé et conservé à -800C.
CS31A natif
Orne 6 (UC en TDC)
Protéines
mg % des protéine % pds sec KDO
totales totales bactéries total gg
Surnageant 12000g 54,60 100 4,23 0,110
Surnageant 50000g 52,00 95 4,03 0,110
Surnageant 20% 29,45 54 2,22 0,065
Culot 20% 5,40 9,9 0,42 0,009
HIC élué 2M NaC1 0,35 0,7 0,03 0
HIC élué eau 1,806 3,3 0,14 0 UC en TDC 1,033 1,9 0,08 0 110000q 200mn
b) Purification de CS31A sous forme dénaturée (sous-unité)
L'antigène de haut PM purifié (lyophilisat
HIC) comme décrit dans le tableau 1, est dissocié en sous-unités (30 kDa) par 8,5 M de chlorure de guanidium (Gnd, Hcl) 2h à 37 OC. La concentration est ramenée à 6 M de (Gnd, Hcl) par addition de Tris (pH 7,8) et la protéine est purifiée par une chromatographie sur gel permeation sur Sephacryl S 300 (Pharmacia) en tampon dissociant (Tris pH 7,8; Gnd, Hcl 6 M). Le produit correspondant à l'élution d'une protéine de 30 KDalton est recueilli, dialysé contre un tampon acétate d'ammonium (5 mM pH 7,8), lyophilisé et conservé à -800C.
10) Préparation des anticorps spécifiques
Les anticorps ont été préparés chez le lapin (soit contre la protéine native soit contre la protéine dénaturée) par 4 injections intra-dermiques de 250 Rg de protéines purifiées, à 15 jours d'intervalle en présence d'adjuvant de Freund incomplet. Les IgG ont été purifiées par chromathographie d'affinité sur Protéine A
Sépharose (Pharmacia) et marquées à la biotine par la méthode décrite par Hantowich et al. (Journal Nuclear
Medecine 1987; 28; 1294-1302).
Les anticorps ont été préparés chez le lapin (soit contre la protéine native soit contre la protéine dénaturée) par 4 injections intra-dermiques de 250 Rg de protéines purifiées, à 15 jours d'intervalle en présence d'adjuvant de Freund incomplet. Les IgG ont été purifiées par chromathographie d'affinité sur Protéine A
Sépharose (Pharmacia) et marquées à la biotine par la méthode décrite par Hantowich et al. (Journal Nuclear
Medecine 1987; 28; 1294-1302).
Les antipeptides ont été obtenus par trois injections intra-dermiques de peptides synthétiques couplés à l'olvalbumine par la glutaraldelhyde ou par la
Bis-aminobenzidine sur résidu tyrosine (présence d'un
NH2 dans le peptide) suivant les techniques décrites par
Van Regenmortel et al. (Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Synthetic polypeptides as antigens, 1988).
Bis-aminobenzidine sur résidu tyrosine (présence d'un
NH2 dans le peptide) suivant les techniques décrites par
Van Regenmortel et al. (Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Synthetic polypeptides as antigens, 1988).
Afin d'éviter les réactions non spécifiques, les anticorps utilisés sont absorbés contre les différentes souches bactériennes, soit avec des cellules entières, soit avec des extraits cétoniques obtenus à partir de préparations cellulaires ultra soniquées.
11) Techniques immunologiques
- La présence de l'antigène CS31A sur des bactéries absorbées sur un filtre de nitrocellulose est révélée par une méthode immunologique en utilisant des anticorps spécifiques polyclonaux dirigés soit contre la protéine préparée sous forme native ou dénaturée, soit contre des peptides couplés à l'ovalbumine. La fixation des anticorps non marqués est détectée par des IgG de chèvre anti-lapin marquées à la péroxydase (Nordic), celle des IgG biotinylées par la streptavidine couplée à la péroxydase (Pierce) le substrat étant le 4chloronaphtol. Les protéines séparées par SDS-PAGE sont transférées sur membrane de nitrocellulose, laquelle est ensuite soumise à un test de détection immunologique avec les divers anticorps spécifiques décrits ci-dessus selon la technique dite du "Western blot".
- La présence de l'antigène CS31A sur des bactéries absorbées sur un filtre de nitrocellulose est révélée par une méthode immunologique en utilisant des anticorps spécifiques polyclonaux dirigés soit contre la protéine préparée sous forme native ou dénaturée, soit contre des peptides couplés à l'ovalbumine. La fixation des anticorps non marqués est détectée par des IgG de chèvre anti-lapin marquées à la péroxydase (Nordic), celle des IgG biotinylées par la streptavidine couplée à la péroxydase (Pierce) le substrat étant le 4chloronaphtol. Les protéines séparées par SDS-PAGE sont transférées sur membrane de nitrocellulose, laquelle est ensuite soumise à un test de détection immunologique avec les divers anticorps spécifiques décrits ci-dessus selon la technique dite du "Western blot".
- Le dosage des antigènes et des anticorps est réalisé par une méthode ELISA par capture d'anticorps (directe ou "sandwich") pour le dosage des anticorps, et en compétition pour le dosage de l'antigène. La spécificité et le titre des antipeptides sont mesurés par une méthode de capture d'anticorps par les peptides fixés sur des plaques Immulon II (Dynatech).
- La définition des épitopes continus est réalisée par mesure de l'immunoréactivité réactivité de 257 peptides de 9 résidus se chevauchant à un résidu prêt, recouvrant la totalité de la séquence primaire de la protéine.
L'épitope scanning décrit par Geysen et al (1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998) est réalisé grâce à un kit (Cambridge Research Biochemicals
Northwich, UK) fournissant : un logiciel qui permet de piloter la synthèse peptidique et d'exploiter les résultats; les têtes de synthèse activées; les 20 dérivés des acides aminés nécessaires à la synthèse des peptides. La détection des anticorps fixés sur les peptides est assurée par une méthode ELISA, la lecture des plaques (Dynatec MR5000) et la définition des épitopes sont pilotées par le logiciel livré par le fournisseur. Les épitopes ont été définis avec les anticorps dirigés contre la protéine native ou contre la protéine dénaturée.
Northwich, UK) fournissant : un logiciel qui permet de piloter la synthèse peptidique et d'exploiter les résultats; les têtes de synthèse activées; les 20 dérivés des acides aminés nécessaires à la synthèse des peptides. La détection des anticorps fixés sur les peptides est assurée par une méthode ELISA, la lecture des plaques (Dynatec MR5000) et la définition des épitopes sont pilotées par le logiciel livré par le fournisseur. Les épitopes ont été définis avec les anticorps dirigés contre la protéine native ou contre la protéine dénaturée.
L'antigénicité des épitopes ainsi définis a été mesurée soit
- en comparant le profil d'épitope scanning obtenu avant et après compétition avec l'antigène sous forme native;
- en mesurant la diminution du titre d'antipeptides soumis à une compétition avec la protéine native;
- en mesurant la capture des anticorps par la protéine native (ELISA sandwich ou Dot-Blot sur nitrocellulose).
- en comparant le profil d'épitope scanning obtenu avant et après compétition avec l'antigène sous forme native;
- en mesurant la diminution du titre d'antipeptides soumis à une compétition avec la protéine native;
- en mesurant la capture des anticorps par la protéine native (ELISA sandwich ou Dot-Blot sur nitrocellulose).
12) Observation en microscopie électronique
Toutes les observations ont été réalisées avec un microscope électronique EM400 (Philips
Electronic Instrument, Inc., Mahwah, N.J.) avec un courant d'accélération de 80 Kv.
Toutes les observations ont été réalisées avec un microscope électronique EM400 (Philips
Electronic Instrument, Inc., Mahwah, N.J.) avec un courant d'accélération de 80 Kv.
Les bactéries et les extraits purifiés ont été observés (grille 300 mesch recouverts de collodion) après coloration négative par 1 % d'acide phosphotungstique.
Les cellules bactériennes entières ont été observées après marquage à l'or colloïdal après avoir fait agir les anticorps anti-CS31A obtenus contre la protéine native, par la technique décrite par Levine et al. (Infection and Immunity : 1984, 44, 409-420). Le marquage à la ferritine sur coupe de bactérie a été réalisé par la méthode décrite par Orskov et al.
(Infection and Immunity : 1985, 47 : 191-200) . Les anticorps primaires ont été dilués au 1/8, le sérum de chèvre anti IgG de lapin marqué à l'or colloïdal (Jansen
Pharmaceutical, Piscatoway, N.J.) et le sérum de chèvre anti IgG lapin marqué à la ferritine (Miles-Yeda, L td.
Pharmaceutical, Piscatoway, N.J.) et le sérum de chèvre anti IgG lapin marqué à la ferritine (Miles-Yeda, L td.
Rehovot, Israël) ont été utilisés au 1/50.
B) ETUDE MORPHOLOGIOUE DE L'ANTIGENE CS31A
EN MICROSCOPIE ELECTRONIOUE
I - Observations après coloration négative (acide phosphotunastique)
1) Sur cellules entières
La Figure 1 est une photographie représentant une coloration négative x110000 de la souche sauvage de référence E.coli 31A. Cette bactérie exprime à sa surface des flagelles (fl), des fimbriae rigides dénommés 20K (fim) et l'antigène CS31A (clp).
EN MICROSCOPIE ELECTRONIOUE
I - Observations après coloration négative (acide phosphotunastique)
1) Sur cellules entières
La Figure 1 est une photographie représentant une coloration négative x110000 de la souche sauvage de référence E.coli 31A. Cette bactérie exprime à sa surface des flagelles (fl), des fimbriae rigides dénommés 20K (fim) et l'antigène CS31A (clp).
Les fimbriae 20K ont une structure filamenteuse rigide de 5 nm de diamètre et peuvent atteindre une longueur de 1 Fm. L'antigène CS31A ne présente pas cet aspect filamenteux, mais forme une structure capsulaire granuleuse qui enveloppe entièrement la surface de la cellule bactérienne.
2) Sur des extraits totaux
Les structures péricellulaires ont été séparées des cellules bactériennes par Vortex.
Les structures péricellulaires ont été séparées des cellules bactériennes par Vortex.
Après coloration négative (x110 000), on observe clairement sur la photographie de la figure 2 les flagelles (fl) et fimbriae 20K (fim) . L'antigène
CS31A (clp) a l'aspect d'une masse granuleuse qui adhère aux autres structures. Chaque granule a une dimension estimée de 50 x 100 . Ces grains pourraient représenter la sous-unité constitutive de l'antigène CS31A.
CS31A (clp) a l'aspect d'une masse granuleuse qui adhère aux autres structures. Chaque granule a une dimension estimée de 50 x 100 . Ces grains pourraient représenter la sous-unité constitutive de l'antigène CS31A.
3) Sur des extraits purifiés
La photographie de la figure 3 montre l'antigène CS31A purifié de haut poids moléculaire, après coloration négative.
La photographie de la figure 3 montre l'antigène CS31A purifié de haut poids moléculaire, après coloration négative.
La fraction purifiée a un aspect granuleux déjà observé sur les autres préparations. On ne distingue aucune structure fibrillaire, les "grains" semblent désordonnés. Par comparaison, l'extrait purifié d'antigène K88 montre clairement un aspect fibrillaire (photographie de la Figure 4).
Il - Observation après marquage par des anticorps spécifiques
1) Révélation à l'or colloïdal (10 nm) sur cellules entières
Après dépôt sur les grilles, l'antigène
CS31A a été marqué par un anticorps spécifique (lapin), puis revélé par un anti-lapin conjugué à l'or colloïdal.
1) Révélation à l'or colloïdal (10 nm) sur cellules entières
Après dépôt sur les grilles, l'antigène
CS31A a été marqué par un anticorps spécifique (lapin), puis revélé par un anti-lapin conjugué à l'or colloïdal.
Sur la photographie de la figure 5, on observe que les grains d'or sont répartis uniformément autour de la cellule bactérienne, qu'il n'y a pas de marquage de fibres comme on l'observe généralement avec des fimbriae. L'antigène CS31A semble se détacher facilement de la cellule.
2) Révélation à la ferritine sur coupe de 50 nm d'épaisseur
Les bactéries sont marquées par des anticorps spécifiques anti CS31A obtenus en immunisant des lapins et par des anti-IgG de lapin obtenues sur chèvre conjugués à la ferritine. Les cellules sont ensuite enrobées dans une résine synthétique puis coupées.
Les bactéries sont marquées par des anticorps spécifiques anti CS31A obtenus en immunisant des lapins et par des anti-IgG de lapin obtenues sur chèvre conjugués à la ferritine. Les cellules sont ensuite enrobées dans une résine synthétique puis coupées.
La photographie de la figure 6 montre que les grains de ferritine sont disposés tout autour d'une structure de type capsulaire qui enveloppe entièrement la cellule bactérienne. Aucune structure fibrillaire n'est marquée par la ferritine.
III - Conclusions de l'étude structurale de
CS31A
Dans un fimbria, les sous-unités (piline) polymérisées, adoptent une structure hélicoïdale plus ou moins WTtendueWr. Dans les fimbriae dits "rigides" (diamètre de 5-7 nm) les sous-unités sont enroulées le long d'un squelette hélicoïdal, les sous-unités d'une spire formant des interactions avec les sous-unités des autres spires. Dans les "fimbrillae" ou fimbriae flexibles (diamètre de 2 nm) les sous-unités sont également enroulées sur un squelette hélicoïdal, mais les sous-unités d'une spire n'ont plus d'interactions directes avec les sous-unités des autres spires. Par contre, les hélices "détendues" peuvent former des fuseaux en associant des centaines de fibres individuelles. Les antigènes K88 et F41 adoptent ce type de structure comme le montre la photographie de la figure 4.
CS31A
Dans un fimbria, les sous-unités (piline) polymérisées, adoptent une structure hélicoïdale plus ou moins WTtendueWr. Dans les fimbriae dits "rigides" (diamètre de 5-7 nm) les sous-unités sont enroulées le long d'un squelette hélicoïdal, les sous-unités d'une spire formant des interactions avec les sous-unités des autres spires. Dans les "fimbrillae" ou fimbriae flexibles (diamètre de 2 nm) les sous-unités sont également enroulées sur un squelette hélicoïdal, mais les sous-unités d'une spire n'ont plus d'interactions directes avec les sous-unités des autres spires. Par contre, les hélices "détendues" peuvent former des fuseaux en associant des centaines de fibres individuelles. Les antigènes K88 et F41 adoptent ce type de structure comme le montre la photographie de la figure 4.
Dans le cas de CS31A, les sous-unités protéiques sont polymérisées, mais ne semblent pas enroulées sur un squelette hélicoïdal et ne forment pas de fimbrillae. Les sous-unités s'associent en masse granuleuse pouvant ressembler à une capsule. Ce type d'organisation de type "capsule like antigen" a été décrit en 1985 par Orskov et al. (An adhesive capsule of Escherichia coli. Infect. Immun. 1985, 47 : 191-200).
Les résultats déjà publiés (Infect. Immun.
56 : 2180-2188) montrent ce type de structure capsulaire. Cependant la terminologie de "capsule like" n'ayant pas été adoptée, le terme de fimbriae qui paraissait convenir a été retenu, mais les travaux menés ultérieurement à partir d'extaits purifiés, confirment pourtant l'aspect non fibrillaire de l'antigène CS31A, comme le montre la photographie de la figure 3.
C) CLONAGE DES GENETS NECESSAIRES A LA
BIOGENESE DE CS31A
Les gènes nécessaires à la biogénèse de
CS31A sont portés sur un plasmide conjugatif, p3lA, hebergé par la souche sauvage de référence E.coli 31A.
BIOGENESE DE CS31A
Les gènes nécessaires à la biogénèse de
CS31A sont portés sur un plasmide conjugatif, p3lA, hebergé par la souche sauvage de référence E.coli 31A.
Ce plasmide de 180 kb, transféré dans la souche E.Coli K12 DB 6433 a été purifié puis restreint de façon partielle par l'endonucléase Sau3AI.
Les fragments de restriction de 9,5 à 11,5 kb sont clonés dans le vecteur pSUP202 (Simon R. et al., 1983) restreint par BamHI et traité à la phosphatase alcaline. Deux cent quatre vingt cinq recombinants résistants au chloramphénicol et sensibles à la tétracycline (Cmr, TcS) ont été testés pour la présence de CS31A grâce à un anticorps polyclonal anti
CS31A. Quatorze donnent une réaction positive. Ils hébergent un plasmide contenant un fragment de restriction de 9 à 11 kb selon le cas, dans l'une ou l'autre orientation.
CS31A. Quatorze donnent une réaction positive. Ils hébergent un plasmide contenant un fragment de restriction de 9 à 11 kb selon le cas, dans l'une ou l'autre orientation.
L'expression des gènes clonés ne semble donc pas dépendre d'un promoteur extérieur. Un fragment HindIII-EcoRI de 8,5 kb, commun à tous les clones est cloné d'une part dans le plasmide vecteur pBR322 coupé par HindIII + EcoRI, conduisant à l'obtention du plasmide pAG315 (Martin C. et al., 1991), et d'autre part dans le plasmide vecteur à faible nombre de copie pHSG575, conduisant à l'obtention du plasmide pEH524 (Martin C. et al., 1991).
La figure 7 représente l'analyse en Western blot d'extraits de bactéries hébergeant les différents plasmides recombinants, et d'un antisérum polyclonal anti-CS31A. Les extraits sont constitués par le surnageant d'une suspension bactérienne chauffée 20 minutes à 600C.
Les sous-unités de CS31A produites par une souche K12 de E.coli hébergeant pAG315 ou pEH524 ont la même masse moléculaire apparente que celles produites par la souche 31A et sont reconnues par les anticorps anti-CS31A.
La figure 8 représente une carte de restriction sommaire de pEH524, ainsi que la carte génétique des déterminants CS31A. Celle-ci a été réalisée à partir de résultats obtenus par mutagénèse insertionnelle de phages Mini-Mu dans pAG315 et étude des protéines synthétisées par les plasmides mutants dans des minicellules, ainsi que par la détermination de la séquence nucléotidique de certains gènes (clpE, clpF, clpG, clpH, clpI). Le gène de structure clpG est indiqué par une étoile. Les lettres représentent les enzymes de restriction suivantes : B = BstXI; C = ClaI; E = EcoRI;
H = HindIII; Hp = HpaI; K = KpnI; N = Nru I; P = PvuII;
S = Sma I; Sc = SacI; Sp = SphI.
H = HindIII; Hp = HpaI; K = KpnI; N = Nru I; P = PvuII;
S = Sma I; Sc = SacI; Sp = SphI.
D) SEOUENCAGE
Le gène codant pour la sous-unité CS31A a été séquencé sur les deux brins par la méthode de
Sanger.
Le gène codant pour la sous-unité CS31A a été séquencé sur les deux brins par la méthode de
Sanger.
La figure 9 représente la séquence complète du gène clpG. On observe la présence d'une seule phase de lecture ouverte de 834 paires de bases débutant au codon d'initiation ATG localisé 60 pb en amont du premier site SphI et se terminant par trois codons stop localisés aux positions 1218, 1227 et 1245. Cette phase de lecture code pour une protéine de 278 résidus correspondant à un poids moléculaire de 28780 daltons.
La sous unité CS31A est synthétisée sous forme d'un précurseur portant une séquence signal de 21 acides aminés clivée devant le résidu tryptophane au moment de l'exportation dans le périplasme. La sous-unité mature est donc constituée de 257 résidus donnant un polypeptide de poids moléculaire déduit de 26777 daltons.
Une séquence AAGGAA située à 10 paires de bases en amont de l'ATG pourrait constituer une séquence de fixation du ribosome (RBS) . La localisation de l'extrémité 5' de l'ARN messager révèle l'existence de deux sites de départ de transcription séparés par 76 pb et suggère que le gène est transcrit à partir d'un tandem de promoteurs indiqués P1 et P2 sur la figure 9.
E) COMPLEMENTATION INTERGENIOUE
La complémentation intergénique permet de manipuler in vitro le gène clpG de la sous-unité constitutive de CS31A sans toucher au reste de l'opéron
CS31A et de vérifier in vivo l'expression des protéines
ClpG modifiées. Elle facilite l'introduction de nouveaux sites de restriction uniques dans le gène clpG, par mutagènése dirigée ou par mutagènése au hasard. Pour la réaliser le gène clpG et les gènes annexes, nécessaires à la biogénèse du CS3lA, ont été sous-clonés séparément dans deux plasmides vecteurs compatibles.
La complémentation intergénique permet de manipuler in vitro le gène clpG de la sous-unité constitutive de CS31A sans toucher au reste de l'opéron
CS31A et de vérifier in vivo l'expression des protéines
ClpG modifiées. Elle facilite l'introduction de nouveaux sites de restriction uniques dans le gène clpG, par mutagènése dirigée ou par mutagènése au hasard. Pour la réaliser le gène clpG et les gènes annexes, nécessaires à la biogénèse du CS3lA, ont été sous-clonés séparément dans deux plasmides vecteurs compatibles.
I - Construction du plasmide transportant les gènes annexes
Le plasmide pDSPH524 dérive du plasmide pEH524 contenant l'opéron CS31A (Martin C. et al.
Le plasmide pDSPH524 dérive du plasmide pEH524 contenant l'opéron CS31A (Martin C. et al.
Microbial. Pathogenesis. 1991; 10 : 429-442) délété du gène clpG de la sous-unité. Pour cela, pEH524 a été restreint par SphI et le fragment Sph I/SphI de 872 pb contenant la région codante du gène clpG a été délété après recircularisation par la T4 ligase du plasmide linéaire généré par SphI. La délétion s'étend de 60 pb en aval du codon d'initiation ATG à 96 pb en aval du premier codon stop TAA du gène clpG (Girardeau J.P. et al. J. of Bacteriology. 1991, 173 : 7673-7683). pDSPH 524 est un plasmide à faible nombre de copie ayant une origine de réplication de type pSC101 et conférant la résistance au chloramphénicol. La figure 10 représente les stuctures des plasmides pEH524 et pDSPH524.
II - Construction des plasmides transportant le aène clpG
1) Dans le plasmide vecteur bluescript SK(+)
- la figure 11 représente le plasmide pSTD41150.
1) Dans le plasmide vecteur bluescript SK(+)
- la figure 11 représente le plasmide pSTD41150.
Le fragment PstI/HpaI de 1,2 kb, porté par pEH524, contenant la région promotrice, la région codante et la région de terminaison du gène clpG, a été cloné dans les sites PstI/SmaI du plasmide vecteur
Bluescript SK(+) (Stratagene). Dans cette construction, la transcription du gène clpG est sous le contrôle de son propre promoteur et orientée dans le sens inverse du sens transcriptionnel dépendant du promoteur Plac du vecteur. Le plasmide pSTD41150, résultant de ce clonage, complémente en trans le plasmide pDSPH524 pour la biogénèse du CS31A. Le site PstI est situé à 255 pb en amont du codon d'initiation ATG du gène clpG.
Bluescript SK(+) (Stratagene). Dans cette construction, la transcription du gène clpG est sous le contrôle de son propre promoteur et orientée dans le sens inverse du sens transcriptionnel dépendant du promoteur Plac du vecteur. Le plasmide pSTD41150, résultant de ce clonage, complémente en trans le plasmide pDSPH524 pour la biogénèse du CS31A. Le site PstI est situé à 255 pb en amont du codon d'initiation ATG du gène clpG.
- la figure 12 représente le plasmide pDEV41155.
Le plasmide pSTD41150 contenant seulement 2 sites EcoRV a été restreint par EcoRV et le fragment
EcoRV/EcoRV de 225 pb a été délété. Le premier site
EcoRV est situé à 40 pb en amont du codon initiateur ATG du gène clpG et le second dans le polylinker du vecteur
Bluescript SK(+) . Le plasmide résultant de cette construction, pDEV41155 porte le fragment EcoRV/HpaI de 0.92 kb du gène clpG. Ce fragment exprime la sous-unité
ClpG lorsque pDEV41155 est complémenté par le plasmide pDSPH 524. pDEV41155 est un plasmide à grand nombre de copies ayant l'origine de réplication Col EI et codant pour la résistance à l'ampicilline (Apr).
EcoRV/EcoRV de 225 pb a été délété. Le premier site
EcoRV est situé à 40 pb en amont du codon initiateur ATG du gène clpG et le second dans le polylinker du vecteur
Bluescript SK(+) . Le plasmide résultant de cette construction, pDEV41155 porte le fragment EcoRV/HpaI de 0.92 kb du gène clpG. Ce fragment exprime la sous-unité
ClpG lorsque pDEV41155 est complémenté par le plasmide pDSPH 524. pDEV41155 est un plasmide à grand nombre de copies ayant l'origine de réplication Col EI et codant pour la résistance à l'ampicilline (Apr).
2) Dans le plasmide vecteur pSELECT-1
Le fragment PstI/HpaI du gène clpG contenant le promoteur, la région codante et la région terminatrice du gène clpG a été cloné dans le vecteur bluescript SK+ restreint par SmaI er PstI. Puis le fragment PstI/XbaI de ce recombinant (contenant le fragment PstI/HpaI précité) a été cloné dans le vecteur p-SELECT-1 restreint par PstI et XbaI, conduisant à l'obtention du plasmide pPSX83.
Le fragment PstI/HpaI du gène clpG contenant le promoteur, la région codante et la région terminatrice du gène clpG a été cloné dans le vecteur bluescript SK+ restreint par SmaI er PstI. Puis le fragment PstI/XbaI de ce recombinant (contenant le fragment PstI/HpaI précité) a été cloné dans le vecteur p-SELECT-1 restreint par PstI et XbaI, conduisant à l'obtention du plasmide pPSX83.
Le plasmide pSELECT-1 (Promega) est un vecteur à grand nombre de copies. Il porte le gène de résistance à la tétracycline et a une origine de réplication (col El) différente de celle de pDSPH524.
La complémentation de CS31A est schématisée sur la figure 13, dans laquelle E représente EcoRV, P représente PstI et Xb représente XbaI. Elle fait intervenir le plasmide pDSPH524 et le plasmide pPSX83 qui contient le seul gène de la sous-unité majeure de
CS31A sous le contrôle de son propre promoteur dans p
SELECT-1. Les bactéries hébergeant à la fois les plasmides pPSX83 et pDSPH524 sont CS31A positives.
CS31A sous le contrôle de son propre promoteur dans p
SELECT-1. Les bactéries hébergeant à la fois les plasmides pPSX83 et pDSPH524 sont CS31A positives.
F) IDENTIFICATION PRESOMPTIVE DES REGIONS DE
LA SOUS-UNITE ClpG POUVANT ACCEPTER DES ADDITIONS
D'ACIDES AMINES OU DES SUBSTITUTIONS HETEROLOGUES
Pour obtenir cette information trois stratégies ont été mises en oeuvre
- Définition des régions variables susceptibles d'accepter des modifications à partir de la comparaison des séquences primaires de la protéine CS31A avec celles des protéines K88 et F41.
LA SOUS-UNITE ClpG POUVANT ACCEPTER DES ADDITIONS
D'ACIDES AMINES OU DES SUBSTITUTIONS HETEROLOGUES
Pour obtenir cette information trois stratégies ont été mises en oeuvre
- Définition des régions variables susceptibles d'accepter des modifications à partir de la comparaison des séquences primaires de la protéine CS31A avec celles des protéines K88 et F41.
- Recherche des épitopes continus dans la protéine CS31A. Les épitopes continus correspondent souvent à des régions variables de la protéine. L'étude de leur accessibilité aux anticorps fournit aussi une information sur leur localisation dans la protéine native.
- La mutagénèse insertionnelle au hasard consiste à insérer de façon aléatoire un court oligonucléotide de synthèse possédant le site de reconnaissance d'une endonucléase de restriction ("linker") dans le gène clpG. L'introduction de ce nouveau site de restriction permet d'insérer ultèrieurement une séquence hétérologue. L'analyse de l'expression des protéines modifiées par complémentation intergénique in vivo et par immunoblotting utilisant des anticorps spécifiques dirigés contre la protéine
ClpG, constitue la base de l'évaluation du degré de permissivité de cette protéine. Les régions permissives sont ensuite localisées et identifiées après analyse de restriction et séquençage nucléotidique.
ClpG, constitue la base de l'évaluation du degré de permissivité de cette protéine. Les régions permissives sont ensuite localisées et identifiées après analyse de restriction et séquençage nucléotidique.
I - Comparaison de séquences
La figure 14 représente l'alignement des séquences primaires déduites des antigènes CS3lA, K88 et
F41. La comparaison de ces séquences indique que CS31A présente une identité de 44% avec la sous-unité de l'antigène K88 et 24% avec la sous-unité de l'antigène
F41. Malgré les importantes divergences observées dans les séquences primaires de CS31A et K88, la conservation de plusieurs régions hydrophobes systématiquement associées à la présence d'un résidu proline suggère que les deux sous-unités adoptent une conformation similaire. Les régions variables susceptibles d'être permissives sont délimitées par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 58 pour la région
B, 123 et 164 pour la région C et 183 et 257 pour la région D.
La figure 14 représente l'alignement des séquences primaires déduites des antigènes CS3lA, K88 et
F41. La comparaison de ces séquences indique que CS31A présente une identité de 44% avec la sous-unité de l'antigène K88 et 24% avec la sous-unité de l'antigène
F41. Malgré les importantes divergences observées dans les séquences primaires de CS31A et K88, la conservation de plusieurs régions hydrophobes systématiquement associées à la présence d'un résidu proline suggère que les deux sous-unités adoptent une conformation similaire. Les régions variables susceptibles d'être permissives sont délimitées par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 58 pour la région
B, 123 et 164 pour la région C et 183 et 257 pour la région D.
II - Recherche des épitopes continus dans la protéine CS31A
Les réponses immunitaires étant différentes contre une protéine présentée sous forme native ou dénaturée, les épitopes continus ont été définis soit avec des anticorps dirigés contre la sous-unité dénaturée, soit avec des anticorps dirigés contre la protéine native de haut poids moléculaire.
Les réponses immunitaires étant différentes contre une protéine présentée sous forme native ou dénaturée, les épitopes continus ont été définis soit avec des anticorps dirigés contre la sous-unité dénaturée, soit avec des anticorps dirigés contre la protéine native de haut poids moléculaire.
1) Définition des épitopes continus des sous-unités dénaturées
La présence d'épitopes continus est recherchée en mesurant la réactivité des antisérums polyclonaux préparés chez 4 lapins (L1, L2, L3, L4) contre la protéine dénaturée vis à vis des 257 nonapeptides chevauchants qui recouvrent la séquence
CS31A.
La présence d'épitopes continus est recherchée en mesurant la réactivité des antisérums polyclonaux préparés chez 4 lapins (L1, L2, L3, L4) contre la protéine dénaturée vis à vis des 257 nonapeptides chevauchants qui recouvrent la séquence
CS31A.
La figure 15 représente en A le profil de réactivité des nonapeptides vis à vis de l'antisérum L2 dirigé contre la protéine CS31A dénaturée; la figure 15 représente en B le profil de réactivité des nonapeptides vis à vis d'un antisérum aspécifique témoin. Cet antisérum témoin est celui d'un lapin immunisé selon le même protocole mais contre une autre protéine, la protéine OmpA.
La figure 16 représente les régions immunoréactives reconnues par les antisérums anti-CS31A dénaturé produits chez les quatre lapins.
Les figures 15 et 16 montrent que les 4 antisérums reconnaissent essentiellement 6 régions contenant les épitopes continus de la molécule dénaturée.
Les peptides suivants ont été retenus : 1019; 37-58; 88-106; 144-172; 184-219 ainsi que la région
C-terminale (232-257). Individuellement les sérums reconnaissent des séquences plus courtes (5 à 7 résidus).
C-terminale (232-257). Individuellement les sérums reconnaissent des séquences plus courtes (5 à 7 résidus).
A ces régions immunodominantes reconnues par tous les animaux, s' ajoutent des régions reconnues seulement par certains antisérums. C'est le cas des peptides 37-44 et 200-207 pour le lapin L1 et 84-93 chez les lapins L3 et L4.
2) Définition des épitopes continus de la protéine native
Ces épitopes ont été définis par le même procédé, mais la réactivité des peptides est observée avec des antisérums préparés contre la protéine native de haut poids moléculaire.
Ces épitopes ont été définis par le même procédé, mais la réactivité des peptides est observée avec des antisérums préparés contre la protéine native de haut poids moléculaire.
La figure 17 représente les régions immunoréactives reconnues par les antisérums anti-CS31A natifs produits chez les lapins (N1) et (N2) , La séquence soulignée 176-196 correspond à la région immunodominante de la protéine CS31A native.
Les antisérums de deux lapins reconnaissent seulement la région 190-197 qui constitue le seul épitope continu présent sur la protéine native.
III - Définition de l'accessibilité des épitopes continus
La mesure de l'antigénicité des peptides définis précédemment permet de préciser leur accessiblité à la surface de la molécule native. Deux méthodes différentes ont été utilisées
1) Première méthode : Modification du profil d'épitope scanning après absorption de l'anticorps polyclonal par la protéine native.
La mesure de l'antigénicité des peptides définis précédemment permet de préciser leur accessiblité à la surface de la molécule native. Deux méthodes différentes ont été utilisées
1) Première méthode : Modification du profil d'épitope scanning après absorption de l'anticorps polyclonal par la protéine native.
Trois situations sont observées, comme le montre l'exemple de la figure 18 représentant les profils de peptide scanning obtenus avec les antisérums anti-CS31A, avant absorbtion par la protéine CS31A native (pics en blanc), et après absorbtion (pics en gris); en A : lapin L1, en B : lapin L2
- Régions 98-106 et 151-160 : la réactivité de l'antisérum absorbé n'est pas modifiée. Les peptides ne sont pas accessibles à la surface de la molécule.
- Régions 98-106 et 151-160 : la réactivité de l'antisérum absorbé n'est pas modifiée. Les peptides ne sont pas accessibles à la surface de la molécule.
- Région 184-191 avec le sérum du lapin L2 et région 200-207 avec le sérum du lapin L1, la réactivité de l'antisérum est totalement abolie. Les peptides sont accessibles et les anticorps correspondants ont une bonne affinité.
- Régions 10-19, 46-58, 92-99, 235-245 : la réactivité vis à vis des peptides est diminuée plus au moins fortement. L'accessibilité est partielle ou l'affinité des anticorps est faible pour le peptide présenté dans la protéine native.
2) Seconde méthode : Capture d'un antipeptide par la protéine native.
Le principe de la mesure consiste soit
- à mesurer en présence de la protéine native, la quantité d'antipeptide capturée par le peptide correspondant absorbé sur une phase solide (Accessibilité ELISA), soit,
- à mesurer directement la quantité d'antipeptide capturée par la protéine native immobilisée sur nitrocellulose ou sur plastique.
- à mesurer en présence de la protéine native, la quantité d'antipeptide capturée par le peptide correspondant absorbé sur une phase solide (Accessibilité ELISA), soit,
- à mesurer directement la quantité d'antipeptide capturée par la protéine native immobilisée sur nitrocellulose ou sur plastique.
a) Production d'antipeptides
Cinq antipeptides ont été produits contre cinq peptides synthétiques de 15 résidus, correspondant aux régions immunodominantes définies précédemment.
Cinq antipeptides ont été produits contre cinq peptides synthétiques de 15 résidus, correspondant aux régions immunodominantes définies précédemment.
Chaque antipeptide a été préparé chez 2 lapins comme décrit dans matériel et méthodes. Le tableau 3 ci-desous présente la séquence, la position et les peptides de la région correspondante.
Tableau 3
Peptides Séquences, positions Antipeptides Positions Nonapeptides
des nonapeptides le plus
réactifs réactif
Y-15-A (Y)-GDSKS1TITQSEPA Y-15-A (H) 42-57 GDSKLLTIT
44 57
Y-15-D (Y)-GDNGKGFFELPMKD Y-15-D (K) 99-112 FELPMKDDS
97 110 D-15-I DNTSIYYGGLVSPAI D-15-I (C) 144-165 (I)YYGGLVSPA
148 162
G-15-Q GOLOAVNPNAGNRGQ G-15-Q (F) 184-201 QLQAVNPNA
185 199 T-15-P TFTNPVVSTTOWSAP T-15-P (A) 238-253 STTQWSAPL
235 249
Les cinq peptides sont localisés dans la séquence primaire sur la figure 19.
Peptides Séquences, positions Antipeptides Positions Nonapeptides
des nonapeptides le plus
réactifs réactif
Y-15-A (Y)-GDSKS1TITQSEPA Y-15-A (H) 42-57 GDSKLLTIT
44 57
Y-15-D (Y)-GDNGKGFFELPMKD Y-15-D (K) 99-112 FELPMKDDS
97 110 D-15-I DNTSIYYGGLVSPAI D-15-I (C) 144-165 (I)YYGGLVSPA
148 162
G-15-Q GOLOAVNPNAGNRGQ G-15-Q (F) 184-201 QLQAVNPNA
185 199 T-15-P TFTNPVVSTTOWSAP T-15-P (A) 238-253 STTQWSAPL
235 249
Les cinq peptides sont localisés dans la séquence primaire sur la figure 19.
b) Contrôle de la spécificité et titrage des antipeptides
Ce contrôle est réalisé en ELISA par capture d'anticorps sur peptides fixés sur plaques Immulon II (0,5 Ag/puits). Le titre et la réactivité croisée des antipeptides sont présentés dans le tableau 4 cidessous.
Ce contrôle est réalisé en ELISA par capture d'anticorps sur peptides fixés sur plaques Immulon II (0,5 Ag/puits). Le titre et la réactivité croisée des antipeptides sont présentés dans le tableau 4 cidessous.
Tableau 4
Peptides Y-15-A Y-15-D D-15-I G-15-Q T-15-I
Antipeptides
Y-15-A (H) > 3200 0 0 0 0
Y-15-D (J) 0 > 16000 0 0 500
Y-15-D (K) 0 > 32000 0 0 500
D-15-I (C) o o 8000 0 0
D-15-I (D) o 0 > 32000 500 250
G-15-Q (E) 128 128 128 > 32000 64
G-15-Q (F) 0 32 0 32000 0
T-15-P (A > O 0 0 0 4000
T-15-P (B) 128 250 64 32 4000
Serum 250 (H) 250 (J+K) 64 (C+D) 64 (E+F) 128 (A+B) préimmun
Dans le tableau 4, les lettres entre parenthèses correspondent à l'identification du lapin immunisé. Pour chaque peptide, deux antipeptides ont été produits, à l'exception du peptide Y-15-A.
Peptides Y-15-A Y-15-D D-15-I G-15-Q T-15-I
Antipeptides
Y-15-A (H) > 3200 0 0 0 0
Y-15-D (J) 0 > 16000 0 0 500
Y-15-D (K) 0 > 32000 0 0 500
D-15-I (C) o o 8000 0 0
D-15-I (D) o 0 > 32000 500 250
G-15-Q (E) 128 128 128 > 32000 64
G-15-Q (F) 0 32 0 32000 0
T-15-P (A > O 0 0 0 4000
T-15-P (B) 128 250 64 32 4000
Serum 250 (H) 250 (J+K) 64 (C+D) 64 (E+F) 128 (A+B) préimmun
Dans le tableau 4, les lettres entre parenthèses correspondent à l'identification du lapin immunisé. Pour chaque peptide, deux antipeptides ont été produits, à l'exception du peptide Y-15-A.
c) Accessibilité ELISA
Afin d'éviter les problèmes liés aux différences d'affinité des antipeptides entre les antigènes en compétition (protéine native/peptide), les antipeptides sont d'abord absorbés sur la protéine native (ou sur des bactéries qui la produisent). Après élimination des immuncomplexes par centrifugation, le titre résiduel de l'antipeptide est mesuré par capture d'anticorps sur le peptide correspondant immobilisé en plaque Immulon II. Les antipeptides ont été utilisés à des dilutions, définies d'après les courbes de titration, qui correspondent à une diminution de 50% de la D.O. à 405 nm.
Afin d'éviter les problèmes liés aux différences d'affinité des antipeptides entre les antigènes en compétition (protéine native/peptide), les antipeptides sont d'abord absorbés sur la protéine native (ou sur des bactéries qui la produisent). Après élimination des immuncomplexes par centrifugation, le titre résiduel de l'antipeptide est mesuré par capture d'anticorps sur le peptide correspondant immobilisé en plaque Immulon II. Les antipeptides ont été utilisés à des dilutions, définies d'après les courbes de titration, qui correspondent à une diminution de 50% de la D.O. à 405 nm.
Les résultats de l'accessibilité des épitopes continus de la protéine CS31A sont présentés sur le tableau 5 ci-après.
Tableau 5
Séquences Positions Accessibilité Accessibilité Accessibilité Conclusion
Pepscan Pepscan antipeptide accessi
(graphe) (indice) -bilité
FDMNGTITA 10-18 +(L1) - (+)
MNGTITADA 12-20 +(L2)
-(L1.8)
FNNTIKEMT 35-43 +(L1) + (+)
-(L1.8)
LTITQSEPA 49-57 +(L1) ++ DSKLLTITTQ 45-53 +(L2)
+(L1.8) + (Y) -GDSKLLTITQSEPA 44-57 + (Y-15-A)
VGVGAIPLI 73-81 +(L2) ++ (+)
GNGVALQSS 88-96 +(L1) ++
GNGVALQSS +(L2) (+)
+(L1.8)
DNGKGFFEL 98-106 -(L1) -
DNGKGFFEL -(L2)
-(L1.8) (Y) -GDNGKGFFELPMKD97-1 GO (Y-15-D)
TSVASGNT 142-150 - (L1) - -
-(L1.8)
YYGGLVSPA 153-161 -(L1) +
IYYGGLVSP 152-160 +(L2) ++
-(L1.8)
DNTSIYYGGLVSPAI 148-162 (D-15-I)
GKDAASAVS 165-173 -(L1) +++ (+)
-(L1.8)
LGQLQAVNP 184-192 +++(L2) +++
QVNKNSAVS99-207 +(L1) +++
+(L1.8)
GQLQAVNPNAGNRGQ 185-199 +++ (G-15-Q)
VMTTGDVIA 211-219 +(L1) -
VMTTGDVIA +(L2) +++ (+)
-(L1.8)
ALGIDQGQT 223-231 +(L2) +++ (+)
Tableau 5 (Suite)
Séquences Positions Accessibilité Accessibilité Accessibilité Conclusion
Pepscan Pepscan antipeptide accessi
(graphe) (indice) -bilité
NPWSTTQW 238-246 +(L1) +
TFTNPWSTT 235-243 +(L2) +
-(L1.8)
TFTNPWSTTQWSAP 235-249 ++ ++ (T-15-P)
La figure 20 représente la compétition ELISA pour mesurer l'accessibilité des peptides dans la protéine native CS31A (courbe essai : courbe témoin : O).
Séquences Positions Accessibilité Accessibilité Accessibilité Conclusion
Pepscan Pepscan antipeptide accessi
(graphe) (indice) -bilité
FDMNGTITA 10-18 +(L1) - (+)
MNGTITADA 12-20 +(L2)
-(L1.8)
FNNTIKEMT 35-43 +(L1) + (+)
-(L1.8)
LTITQSEPA 49-57 +(L1) ++ DSKLLTITTQ 45-53 +(L2)
+(L1.8) + (Y) -GDSKLLTITQSEPA 44-57 + (Y-15-A)
VGVGAIPLI 73-81 +(L2) ++ (+)
GNGVALQSS 88-96 +(L1) ++
GNGVALQSS +(L2) (+)
+(L1.8)
DNGKGFFEL 98-106 -(L1) -
DNGKGFFEL -(L2)
-(L1.8) (Y) -GDNGKGFFELPMKD97-1 GO (Y-15-D)
TSVASGNT 142-150 - (L1) - -
-(L1.8)
YYGGLVSPA 153-161 -(L1) +
IYYGGLVSP 152-160 +(L2) ++
-(L1.8)
DNTSIYYGGLVSPAI 148-162 (D-15-I)
GKDAASAVS 165-173 -(L1) +++ (+)
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LGQLQAVNP 184-192 +++(L2) +++
QVNKNSAVS99-207 +(L1) +++
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GQLQAVNPNAGNRGQ 185-199 +++ (G-15-Q)
VMTTGDVIA 211-219 +(L1) -
VMTTGDVIA +(L2) +++ (+)
-(L1.8)
ALGIDQGQT 223-231 +(L2) +++ (+)
Tableau 5 (Suite)
Séquences Positions Accessibilité Accessibilité Accessibilité Conclusion
Pepscan Pepscan antipeptide accessi
(graphe) (indice) -bilité
NPWSTTQW 238-246 +(L1) +
TFTNPWSTT 235-243 +(L2) +
-(L1.8)
TFTNPWSTTQWSAP 235-249 ++ ++ (T-15-P)
La figure 20 représente la compétition ELISA pour mesurer l'accessibilité des peptides dans la protéine native CS31A (courbe essai : courbe témoin : O).
Trois situations sont observées
- Avec les antipeptides G15Q (185-199) et
T15P (235-249), on remarque une diminution de D.O.
- Avec les antipeptides G15Q (185-199) et
T15P (235-249), on remarque une diminution de D.O.
proportionnelle à la quantité de protéine native en compétition avec le peptide. Les antipeptides sont absorbés par les régions correspondantes sur la protéine native. La spécificité du système est vérifiée par la stabilité du titre de l'antipeptide en présence soit d'une protéine étrangère (BSA) soit de bactéries hébergeant un plasmide délété dans la région portant le gène de structure (pDSPH524).
- Avec les antipeptides Y15A (44-57), l'absorption de l'antipeptide n'est mesurable qu'aux fortes concentrations de protéine native. Ceci indique soit, une accessibilité partielle dans la protéine native, soit une faible affinité de l'antipeptide pour la protéine native.
- Avec les antipeptides Y15D (97-110) et
D15I (148-162). Les courbes essai (i), et témoin (O) sont parallèles, il nty a pas de relation entre le titre résiduel de l'antipeptide et la quantité de protéine native utilisée pour la compétition.
D15I (148-162). Les courbes essai (i), et témoin (O) sont parallèles, il nty a pas de relation entre le titre résiduel de l'antipeptide et la quantité de protéine native utilisée pour la compétition.
d) Capture d'antipeptide par la protéine native en DOT-BLOT
Des membranes de nitrocellulose sur lesquelles est déposée une série de dilutions (120 à 0,4 ng) de protéine CS31A purifiée (native ou dénaturée par la chaleur) sont mises en contact avec les anticorps suivants
- chacun des cinq antipeptides (dilutions entre 1/50 et 1/500),
- 1'antisérum polyclonal dirigé contre les sous-unités purifiées dénaturées (dilution 1/500),
- un antisérum (31AL) qui ne reconnait que la protéine native (dilution 1/100).
Des membranes de nitrocellulose sur lesquelles est déposée une série de dilutions (120 à 0,4 ng) de protéine CS31A purifiée (native ou dénaturée par la chaleur) sont mises en contact avec les anticorps suivants
- chacun des cinq antipeptides (dilutions entre 1/50 et 1/500),
- 1'antisérum polyclonal dirigé contre les sous-unités purifiées dénaturées (dilution 1/500),
- un antisérum (31AL) qui ne reconnait que la protéine native (dilution 1/100).
La fixation des anticorps sur les antigènes immobilisés est mesurée comme décrit dans matériel et méthodes.
La figure 21 est une photographie des membranes qui montre la réactivité des différents anticorps vis à vis de l'antigène immobilisé.
Ligne A : Les anticorps sont dirigés contre la protéine dénaturée. On montre que la même quantité d'antigène (natif/dénaturé) est immobilisée sur la membrane.
Ligne B : L'antisérum 31AL indique que l'antigène non dénaturé par la chaleur est bien immobilisé sous forme native.
Ligne C : L'antipeptide G15Q reconnait le peptide (185-200) de la protéine native ou dénaturée. Le peptide est donc accessible et l'antipeptide a une bonne affinité quelle que soit la conformation de la molécule.
Ligne D : Les antipeptides Y15A ; D15I et
T15P reconnaissent mieux la forme dénaturée que la forme native quand ils sont faiblement dilués (1/50). A plus forte dilution (1/500) aucune réaction n1 est observée.
T15P reconnaissent mieux la forme dénaturée que la forme native quand ils sont faiblement dilués (1/50). A plus forte dilution (1/500) aucune réaction n1 est observée.
La plus faible réactivité des peptides dans la protéine native est liée, soit à sa faible accessibilité, soit à la faible affinité de l'antipeptide.
Ligne E : L'antipeptide Y15D ne reconnait que l'antigène dénaturé. Le peptide 97-110 ne semble pas accessible dans la protéine native.
3) Conclusions sur l'étude d'accessibilité des épitopes continus identifiés dans CS31A et les propriétés des régions contenant ces épitopes continus
Les méthodes utilisées donnent de bonnes indications sur l'accessibilité des peptides 44-57, 97110 et 185-199. Par contre, les résultats ne permettent pas de définir clairement l'accessibilité des deux autres peptides (tableau 5).
Les méthodes utilisées donnent de bonnes indications sur l'accessibilité des peptides 44-57, 97110 et 185-199. Par contre, les résultats ne permettent pas de définir clairement l'accessibilité des deux autres peptides (tableau 5).
- Peptide 44-57 : Les résultats obtenus indiquent que cette région est accessible dans la protéine native. Cependant l'anti peptide (Y15A) semble avoir une faible affinité pour le peptide dans son environnement naturel.
- Peptide 97-110 : Tous les résultats indiquent que cette région n'est pas accessible dans la protéine native.
- Peptide 185-199 : Tous les résultats indiquent que cette région est très accessible et que l'antipeptide correspondant (G15Q) a une bonne affinité pour le peptide quelle que soit sa conformation. De plus la disparition de la réactivité des régions 183-191 et 199-207 observée par "épitope scanning" après absorbtion des anticorps par la protéine native indique qu'une large région comptant au moins 24 résidus (183-207) parait facilement accessible aux anticorps.
- Peptide 148-162 : Les résultats indiquent généralement la faible accessibilité de cette région dans la protéine native. Cependant la réactivité en Dot
Blot de l'antipeptide D15I vis à vis de la protéine native est en contradiction avec les autres résultats.
Blot de l'antipeptide D15I vis à vis de la protéine native est en contradiction avec les autres résultats.
L'accessibilité de cette région reste à définir, car les résultats ne permettent pas de trancher entre la non accessibilité de la région ou la mauvaise affinité de 1' antipeptide D15I.
- Région C-Terminale : Cette région semble accessible, mais la superposition des épitopes continus dans cette région ne permet pas une bonne définition de l'accessibilité de chacun d'eux.
Toutes les informations recueillies sur les propriétés des régions contenant les épitopes continus sont présentées dans le tableau 6 ci-après.
Tableau 6
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4) Propriétés générales des régions contenant les épitopes continus (Tableau 6)
- Région 10-19 : cette région est fortement immunogène et tous les sérums dirigés contre la protéine dénaturée (anti-D) réagissent contre elle. L'épitope est localisé dans une région variable, faiblement hydrophile, flexible et accessible.
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4) Propriétés générales des régions contenant les épitopes continus (Tableau 6)
- Région 10-19 : cette région est fortement immunogène et tous les sérums dirigés contre la protéine dénaturée (anti-D) réagissent contre elle. L'épitope est localisé dans une région variable, faiblement hydrophile, flexible et accessible.
- Région 38-58 : cette région est très immunogène. Les différents sérums anti-D permettent de définir trois épitopes chevauchants localisés dans une large région variable interrompue par 4 résidus conservés. La région est hydrophile, très flexible et accessible aux anticorps.
- Région 74-80 : cette région est immunogène chez certains animaux, l'épitope reconnu par les sérums anti-D est situé dans une courte région variable flanquée de régions très conservées. La région contenant l'épitope est hydrophobe et non flexible, elle est cependant accessible aux anticorps.
- Région 88-106 : cette région très immunogène est reconnue par tous les sérums anti-D. On peut définir trois épitopes situés dans la région variable adjacente au cluster P3. L'épitope 88-99 est situé dans une région hydrophile, flexible et accessible, par contre l'épitope immédiatement adjacent 98-106 fait partie d'une région hydrophobe, non flexible et non accessible aux anticorps. L'antipeptide Y15D dirigé contre la séquence 97-110 ne réagit pas contre la protéine native.
- Région 144-172 : la séquence 151-160 est très immunogène chez tous les animaux, les séquences 144-151 et 165-172 sont reconnues par un seul animal.
L'épitope 151-160 est situé dans une région très hydrophobe non flexible. Les autres séquences sont hydrophiles mais peu flexibles. Aucun des épitopes n'est antigénique dans la protéine native. L'antipeptide D15I (148-162) n'est pas fixé par la protéine.
- Région 184-220 : C'est la région la plus immunoréactive de la protéine, elle contient le seul épitope continu (190-197) de la protéine native. La région 190-197 contient la séquence NPN qui est suceptible de former une torsion de la chaine polypeptidique qui pourrait expliquer cette forte immunoréactivité. Tous les animaux reconnaissent la région 184-197, mais la région 200-207 ne réagit que chez un seul animal. L'épitope 184-191 est situé en aval de la séquence NPN dans une région conservée, hydrophobe non flexible mais accessible aux anticorps.
L'antipeptide G15Q (185-199) réagit fortement contre la protéine native. L'épitope 200-207 est localisé dans la région variable (V3) hydrophile, flexible et facilement accessible aux anticorps. La région 211-219 est fortement immunogène chez tous les animaux, elle est située dans V3 dans une partie hydrophobe flexible non accessible.
La région 184-220 semble donc très immunogène, son antigénicité est limitée à la partie amont (184-207).
- Région 223-245 : La région C-terminale est fortement immunoréactive mais la superposition des nombreux épitopes complique leur définition. L'épitope 223-231 est exactement situé dans une région variable faiblement hydrophile, mais très flexible. L'épitope 235-245 est situé dans une région variable hydrophobe peu flexible. L'étude d'accessibilité avec l'antipeptide
T15P (235-249) indique que toute la région est antigénique dans la protéine native.
T15P (235-249) indique que toute la région est antigénique dans la protéine native.
5) Conclusion générale sur l'étude immunostructurale
Les conclusions précédentes font apparaître les points suivants
- L'étude immunostructurale localise clairement les épitopes continus dans des régions variables, généralement flexibles, hydrophiles et accessibles aux anticorps dans la protéine native.
Les conclusions précédentes font apparaître les points suivants
- L'étude immunostructurale localise clairement les épitopes continus dans des régions variables, généralement flexibles, hydrophiles et accessibles aux anticorps dans la protéine native.
- Les insertions d'épitopes étrangers par mutagénèse dirigée dans les régions variables immunoréactives permettront, à condition qu'elles soient permissives, de placer les séquences étrangères dans un environnement conformationnel favorable (flexibilité, accessibilité) à une bonne présentation au système immunitaire.
- A condition qu'elles soient permissives, les régions variables immunoréactives 10-19 ; 38-58 ; 88-106 ; 144-172 ; 184-220 et 223-245 pourront être choisies pour insérer des épitopes étrangers.
- La région V3 (184-220) qui possède le seul épitope continu de la protéine native possède les propriétés immunologiques (immunogénicité et antigénicité) les plus favorables pour la présentation d'épitopes étrangers.
IV - Mutagénèse insertionnelle au hasard dans la protéine ClpG
1) Insertion au hasard de linkers EcoRI et de séquences hétérologues dans le gène clpG
L'introduction par mutagénèse au hasard d'un site unique de restriction EcoRI dans le plasmide pDEV41155 transportant le gène clpG est schématisée sur la figure 22.
1) Insertion au hasard de linkers EcoRI et de séquences hétérologues dans le gène clpG
L'introduction par mutagénèse au hasard d'un site unique de restriction EcoRI dans le plasmide pDEV41155 transportant le gène clpG est schématisée sur la figure 22.
Le plasmide pDEV41155 est partiellement hydrolysé par la Dnase I en présence de Mn++ de telle manière qu'environ 1/3 des molécules soient obtenues sous forme linéaire. On évite ainsi des coupures multiples du plasmide par la Dnase I. Les extrémités protubérantes de pDEV41155 ainsi linéarisé sont transformées en bouts francs par l'action de la T4 DNA polymérase et du fragment klenow de l'ADN polymérase de
E.coli. Les molécules d'ADN linéaire de 3,8 kb ayant subi l'action des polymérases ont été ensuite isolées et purifiées à partir de gels d'agarose. La recircularisation des plasmides a été effectuée en présence d'un excès de linkers EcoRI non phosphorylés et de la T4 DNA ligase.Cinq linkers EcoRI de différentes tailles (8,10 et 12 mer.) ont été utilisés afin d'avoir au moins une insertion ne modifiant pas le cadre de lecture du gène clpG
GGAATTCC (8 mer)
GCGAATTCGG (10 mer)
CGGAATTCCG (10 mer)
CCCGAATTCGGG (12 mer)
CCGGAATTCCGG (12 mer)
Après transformation de la souche E.coli
DH5a, le mélange de transformation est directement mis en culture. L'ADN plasmidique total extrait à partir de cette culture est restreint par l'enzyme EcoRI. Un mélange d'ADN linéaire de 3,8 kb est récupéré et purifié, par électrophorèse en gel d'agarose. Cette étape de digestion par EcoRI a permis d'isoler uniquement les plasmides pDEV41155 ayant inséré les linkers EcoRI monomériques et d'écarter ceux dépourvus de linkers EcoRI ou ceux ayant incorporé des linkers
EcoRI multimériques.
E.coli. Les molécules d'ADN linéaire de 3,8 kb ayant subi l'action des polymérases ont été ensuite isolées et purifiées à partir de gels d'agarose. La recircularisation des plasmides a été effectuée en présence d'un excès de linkers EcoRI non phosphorylés et de la T4 DNA ligase.Cinq linkers EcoRI de différentes tailles (8,10 et 12 mer.) ont été utilisés afin d'avoir au moins une insertion ne modifiant pas le cadre de lecture du gène clpG
GGAATTCC (8 mer)
GCGAATTCGG (10 mer)
CGGAATTCCG (10 mer)
CCCGAATTCGGG (12 mer)
CCGGAATTCCGG (12 mer)
Après transformation de la souche E.coli
DH5a, le mélange de transformation est directement mis en culture. L'ADN plasmidique total extrait à partir de cette culture est restreint par l'enzyme EcoRI. Un mélange d'ADN linéaire de 3,8 kb est récupéré et purifié, par électrophorèse en gel d'agarose. Cette étape de digestion par EcoRI a permis d'isoler uniquement les plasmides pDEV41155 ayant inséré les linkers EcoRI monomériques et d'écarter ceux dépourvus de linkers EcoRI ou ceux ayant incorporé des linkers
EcoRI multimériques.
Les plasmides linéaires renfermant un site
EcoRI, sont soumis à l'action de la T4 DNA ligase en présence d'une cassette-KmR codant pour l'aminoglycoside 3'-phosphotransférase qui confère la résistance à la kanamycine.
EcoRI, sont soumis à l'action de la T4 DNA ligase en présence d'une cassette-KmR codant pour l'aminoglycoside 3'-phosphotransférase qui confère la résistance à la kanamycine.
La cassette Kmr représentée à la figure 23 avec ses sites de restriction multiples et symétriques (MCS) utilisée ici est le fragment EcoRI/EcoRI de 1,28 kb provenant du plasmide pUC4K (Viera J and Messing
J. 1982. Gene 19: 259) et contenant le transposon
Tn 903. Les extrémités 5' et 3' du gène de résistance comportent un polylinker possédant du côte distal de ce gène le site EcoRI et du côté proximal le site PstI. Le clonage de la cassette Kmr dans le site unique EcoRI du plasmide pDEV41155 ayant incorporé un linker EcoRI, est illustré par la figure 24. Les clones obtenus après transformation de la souche DOSA, sont sélectionnés sur leur double résistance à la kanamycine (marqueurs des sites d'insertion) et à l'ampicilline (marqueur du plasmide vecteur). Ainsi, 830 clones Apr Kmr hébergant le plasmide pDEV41155 porteur de la cassette Kmr ont été isolés. Les plasmides mutés ayant une insertion affectant soit l'activité de la bêta lactamase soit la réplication des plasmides ne sont pas retrouvés. Cette sélection favorise l'obtention de mutants ayant la cassette Kmr dans le gène clpG ou dans le reste du vecteur.
J. 1982. Gene 19: 259) et contenant le transposon
Tn 903. Les extrémités 5' et 3' du gène de résistance comportent un polylinker possédant du côte distal de ce gène le site EcoRI et du côté proximal le site PstI. Le clonage de la cassette Kmr dans le site unique EcoRI du plasmide pDEV41155 ayant incorporé un linker EcoRI, est illustré par la figure 24. Les clones obtenus après transformation de la souche DOSA, sont sélectionnés sur leur double résistance à la kanamycine (marqueurs des sites d'insertion) et à l'ampicilline (marqueur du plasmide vecteur). Ainsi, 830 clones Apr Kmr hébergant le plasmide pDEV41155 porteur de la cassette Kmr ont été isolés. Les plasmides mutés ayant une insertion affectant soit l'activité de la bêta lactamase soit la réplication des plasmides ne sont pas retrouvés. Cette sélection favorise l'obtention de mutants ayant la cassette Kmr dans le gène clpG ou dans le reste du vecteur.
Pour sélectionner les insertions de la cassette Kmr situées uniquement dans le gène clpG, celui-ci a été excisé et recloné dans le même plasmide vecteur de départ n'ayant pas été traité par la Dnase I.
Pour cela, les plasmides pDEV41155 transportant la cassette Kmr ont été digérés à la fois par Apal et SacI (figure 24). Les sites ApaI et SacI sont respectivement situés à 78 pb en amont et 893 pb en aval du codon d'initiation ATG du gène clpG.
La figure 24 indique le protocole de sélection positive des insertions des linkers Eco RI et du polylinker Eco RI-PstI-Eco RI dans le gène clpG.
Les fragments ApaI/SacI de 2,25 Kb contenant le gène clpG muté par l'insertion de la cassette Kmr sont purifiés à partir de gels d'agarose et clonés dans les sites ApaI / SacI du vecteur Bluescript SK. Après transformation de la souche E.coli DH5a, 867 clones Kmr,
Apr ayant la cassette Kmr dans le gène clpG ont été sélectionnés.
Apr ayant la cassette Kmr dans le gène clpG ont été sélectionnés.
La présence de sites de restriction multiples et symétriques aux extrémités de la cassette
Kmr a été mise à profit pour introduire des séquences hétérologues de différentes tailles dans le gène clpG après excision de la cassette. Cette excision a été réalisée à partir de l'ADN plasmidique extrait des clones Apr Kmr par coupure avec EcoRI ou PstI. La figure 24 illustre deux constructions simples conduisant à l'excision de la cassette Kmr par délétion. La recircularisation de l'ADN linéarisé par EcoRI conduit à l'insertion de 8 à 12 bp et celle de l'ADN linéarisé par
PstI aboutit à l'insertion de 50 à 54 pb.
Kmr a été mise à profit pour introduire des séquences hétérologues de différentes tailles dans le gène clpG après excision de la cassette. Cette excision a été réalisée à partir de l'ADN plasmidique extrait des clones Apr Kmr par coupure avec EcoRI ou PstI. La figure 24 illustre deux constructions simples conduisant à l'excision de la cassette Kmr par délétion. La recircularisation de l'ADN linéarisé par EcoRI conduit à l'insertion de 8 à 12 bp et celle de l'ADN linéarisé par
PstI aboutit à l'insertion de 50 à 54 pb.
Au niveau de la protéine ClpG cela correspond à une insertion de 3 ou 4 acides aminés dans la première situation et de 17 à 18 acides aminés dans la seconde situation. Après excision de la cassette, les plasmides recircularisés sont transférés dans la souche
E.coli DH5a contenant le plasmide pDSPH524 afin de tester l'expression des gènes clpG mutés.
E.coli DH5a contenant le plasmide pDSPH524 afin de tester l'expression des gènes clpG mutés.
La figure 25 représente les séquences nucléotidiques résultant des insertions des linkers
EcoRI (à gauche de la figure) et du polylinker EcoRI
PstI-EcoRI (à droite de la figure) dans le gène clpG et leurs séquences peptidiques correspondantes. Les trois séquences peptidiques correspondant aux trois cadres de lecture possibles d'une même séquence d'ADN sont déduites à partir de chacun des cinq linkers EcoRI utilisés.
EcoRI (à gauche de la figure) et du polylinker EcoRI
PstI-EcoRI (à droite de la figure) dans le gène clpG et leurs séquences peptidiques correspondantes. Les trois séquences peptidiques correspondant aux trois cadres de lecture possibles d'une même séquence d'ADN sont déduites à partir de chacun des cinq linkers EcoRI utilisés.
2) Expression des aènes clpG mutés
La permissivité de la protéine ClpG a été évaluée par un test de complémentation intergénique in vivo permettant de savoir si les protéines ClpG modifiées par les différentes insertions de séquences hétérologues de 3 à 18 acides aminés sont toujours fonctionnelles pour la biogénèse des polymères de surface CS31A.
La permissivité de la protéine ClpG a été évaluée par un test de complémentation intergénique in vivo permettant de savoir si les protéines ClpG modifiées par les différentes insertions de séquences hétérologues de 3 à 18 acides aminés sont toujours fonctionnelles pour la biogénèse des polymères de surface CS31A.
Au total 5895 clones ont été analysés par immunoblotting in situ sur colonies avec un antigène polyclonal spécifique du CS31A natif. Ainsi, 739 clones (12,5 %) se sont révélés positifs pour la production du
CS31A. Ces résultats indiquent que les protéines ClpG ayant incorporées 3 à 18 acides aminés sont correctement exportées et intégrées dans la structure polymérique du
CS31A et qu'il existe des régions permissives dans la protéine ClpG.
CS31A. Ces résultats indiquent que les protéines ClpG ayant incorporées 3 à 18 acides aminés sont correctement exportées et intégrées dans la structure polymérique du
CS31A et qu'il existe des régions permissives dans la protéine ClpG.
3) Localisation des récrions permissives de la protéine ClpG
Un mélange de plasmides recombinants extraits des 739 clones positifs pour la biogénése du CS31A a été soumis à l'analyse de restriction. La localisation du site EcoRI dans le gène clpG muté par rapport à d'autres sites de restriction uniques (XhoI et
XbaI) existants sur le plasmide vecteur de part et d'autre du gène clpG (figure 12) a permis de positionner les insertions de 3 à 54 pb dans ce gène. Différentes régions de la protéine ClpG tolérant l'addition de 3 à 18 acides aminés supplémentaires ont pu ainsi être identifiées.
Un mélange de plasmides recombinants extraits des 739 clones positifs pour la biogénése du CS31A a été soumis à l'analyse de restriction. La localisation du site EcoRI dans le gène clpG muté par rapport à d'autres sites de restriction uniques (XhoI et
XbaI) existants sur le plasmide vecteur de part et d'autre du gène clpG (figure 12) a permis de positionner les insertions de 3 à 54 pb dans ce gène. Différentes régions de la protéine ClpG tolérant l'addition de 3 à 18 acides aminés supplémentaires ont pu ainsi être identifiées.
Une carte des insertions permissives a été établie. La figure 26 représente la séquence de la protéine ClpG et indique la localisation des insertions des linkers EcoRI (i) et du polylinker EcoRI-PstI-EcoRI Les Les flèches verticales indiquent les positions approximatives des insertions permissives dans la protéine ClpG. La localisation des sites permissifs est déterminée par analyse de restriction. Les régions (I) et (II) représentées par des rectangles désignent les deux principales régions permissives. Les zones hachurées indiquent les épitopes linéaires de la protéine ClpG.
Les résultats montrent que les 44 insertions répertoriées se répartissent tout le long de la séquence protéique de ClpG. Deux régions principales semblent toutefois se dégager dans lesquelles un grand nombre d'insertions ont été positionnées. La première région (I) localisée à l'extrêmité N-terminale entre les acides aminés 11 et 36 contient 13 insertions. La seconde région (II) localisée dans la partie centrale de la protéine ClpG entre les acides aminés 125 et 156 contient 16 insertions.
En conclusion, les résultats obtenus démontrent qu'il est possible d'insérer 3 à 18 acides aminés dans la protéine ClpG sans affecter la biogénèse des polymères de surface CS31A.
V - Conclusion générale concernant les zones potentiellement permissives de la protéine CS31A
La synthèse des résultats obtenus selon 3 méthodes complémentaires pour identifier les zones accessibles à la surface de la molécule et potentiellement permissives pour les insertions ou substitutions hétérologues dans la protéine CS31A, est la suivante
- La région A identifiée par mutagénèse insertionelle au hasard accepte l'introduction de 4 à 20 acides aminés hétérologues.
La synthèse des résultats obtenus selon 3 méthodes complémentaires pour identifier les zones accessibles à la surface de la molécule et potentiellement permissives pour les insertions ou substitutions hétérologues dans la protéine CS31A, est la suivante
- La région A identifiée par mutagénèse insertionelle au hasard accepte l'introduction de 4 à 20 acides aminés hétérologues.
- La région B avec sa région variable V1 et ses peptides immunogènes 10-19 et 38-58 antigéniques dans la forme native est permissive puisque des insertions hétérologues ont été obtenues par mutagénèse au hasard, en particulier au niveau du peptide 10-19.
- La région C avec sa région variable V2 contient dans sa partie terminale un épitope continu (peptide 151-160) mais qui n' est pas antigénique dans la protéine native. Toutefois plusieurs insertions ont été obtenues par mutagénèse au hasard et la permissivité de cette région paraît donc intéressante.
- La région D avec sa région variable V3 contient le seul épitope continu antigénique et immunogène dans la protéine sous forme native, ce qui en fait une région immunodominante majeure. Dans sa partie
C-terminale plusieurs peptides sont immunogènes et antigéniques dans la forme dénaturée de la protéine.
C-terminale plusieurs peptides sont immunogènes et antigéniques dans la forme dénaturée de la protéine.
Enfin quelques insertions ont été obtenues par mutagénèse au hasard.
G) CHOIX DES EPITOPES VIRAUX
Cinq épitopes ont été choisis pour ces exemples
Il s'agit des épitopes C et A de la glycoprotéine S du virus de la gastro-entérite transmissible (GET) du porcelet, d'un épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin, de ltépitope C3 de la protéine de capside VPl du poliovirus de type 1 (Mahoney) et d'un épitope de la protéine de capside VP1 du virus de la fièvre aphteuse (FMDV). Les ADN codant pour ces épitopes sont obtenus par synthèse chimique.
Cinq épitopes ont été choisis pour ces exemples
Il s'agit des épitopes C et A de la glycoprotéine S du virus de la gastro-entérite transmissible (GET) du porcelet, d'un épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin, de ltépitope C3 de la protéine de capside VPl du poliovirus de type 1 (Mahoney) et d'un épitope de la protéine de capside VP1 du virus de la fièvre aphteuse (FMDV). Les ADN codant pour ces épitopes sont obtenus par synthèse chimique.
Les codons choisis sont ceux les plus fréquemment utilisés dans le gène clpG. Les extrémités des molécules d'ADN codant pour un épitope varient en fonction de la localisation de l'insertion afin qu' elles soient compatibles avec les sites de restriction introduits dans clpG.
La figure 27 indique les séquences des oligonucléotides de synthèse utilisés, codant pour les épitopes GET, Rotavirus, Polio et FMDV. La séquence de l'épitope lui même est représentée par des lettres en relief.
H) CLONAGE DE L L'ADN CORRESPONDANT AUX
EPITOPES VIRAUX ET EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
I - Après mutagénèse dirigée
Les régions V2 (acide aminé 123 à acide aminé 150) et V3 (acide aminé 183 à acide aminé 221) ont été choisies dans ces exemples pour l'insertion d'épitopes. Des sites de restriction uniques ont été créés aux endroits désirés par mutagénèse dirigée en utilisant des oligonucléotides synthétiques porteurs de la mutation choisie. Pour cela, la méthode de l'ADN partiellement simple brin et les vecteurs pMa 5-8 et pMc 5-8 ont été utilisés.
EPITOPES VIRAUX ET EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
I - Après mutagénèse dirigée
Les régions V2 (acide aminé 123 à acide aminé 150) et V3 (acide aminé 183 à acide aminé 221) ont été choisies dans ces exemples pour l'insertion d'épitopes. Des sites de restriction uniques ont été créés aux endroits désirés par mutagénèse dirigée en utilisant des oligonucléotides synthétiques porteurs de la mutation choisie. Pour cela, la méthode de l'ADN partiellement simple brin et les vecteurs pMa 5-8 et pMc 5-8 ont été utilisés.
Le fragment Hind III-XbaI de pPSX83 a été cloné dans ces vecteurs, conduisant à l'obtention des plasmides pMcHX et pMaHX. Après mutagénèse, les fragments HindIII-XbaI provenant de pMcHX muté et pMaHX muté ont de nouveau été clonés dans p-SELECT-1.
La présence des mutations souhaitées est confirmée par analyse de restriction et par séquençage nucléotidique par la méthode de Sanger.
L'expression des protéines recombinantes est vérifiée par des tests immunologiques sur bactéries entières ou des extraits bruts à 600C (Immunodots et
Western blot).
Western blot).
1) Manipulations de V2
Les modifications de la région V2 sont indiquées dans la figure 28. Dans les mutants 2 et 5, l'acide aminé 11, tyrosine, est remplacé par un résidu thréonine. Dans le mutant 6, les acides aminés 131 à 141 ont été délétés.
Les modifications de la région V2 sont indiquées dans la figure 28. Dans les mutants 2 et 5, l'acide aminé 11, tyrosine, est remplacé par un résidu thréonine. Dans le mutant 6, les acides aminés 131 à 141 ont été délétés.
Les plasmides mutants sont introduits par transformation dans une souche contenant pDSPH 524 et la présence de CS31A est recherchée par tests immunologiques sur extraits à 600C après électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant (Western blot).
Les mutants 1 à 5 produisent CS31A en quantité comparable à la souche témoin hébergeant pPSX83 + pDSPH 524.
Le mutant 6 ne produit pas de CS31A comme le montre la figure 29.
a) Introduction des épitopes et expression des protéines recombinantes
- un ADN synthétique codant pour l'épitope du GET posséde des extrémités compatibles avec les sites de restriction HpaI/SpeI (figure 27d). Il a remplacé le fragment HpaI et SpeI du gène clpG des mutants 3 et 4 générant respectivement les plasmides pGC32 et pGC19 (figure 30b et 30c).
- un ADN synthétique codant pour l'épitope du GET posséde des extrémités compatibles avec les sites de restriction HpaI/SpeI (figure 27d). Il a remplacé le fragment HpaI et SpeI du gène clpG des mutants 3 et 4 générant respectivement les plasmides pGC32 et pGC19 (figure 30b et 30c).
- un ADN synthétique codant pour l'épitope du GET possède deux extrémités compatibles avec SpeI (figure 27a). Il a été inséré en phase dans le site SpeI du gène clpG des mutants 2 et 4, générant respectivement les plasmides pGC1 et pGC4 (figure 30a et 30c). Il a également remplacé le fragment SpeI/SpeI du mutant 5, générant le plasmide pGC44 (figure 30d).
- un ADN synthétique codant pour l'épitope du FMDV (figure 27g) possède des extrémités compatibles avec HpaI et SpeI. Il a remplacé le fragment de restriction HpaI/SpeI du gène clpG du mutant 2, générant le plasmide pFl(figure 30a).
Dans la figure 30 on a indiqué pour chacun des mutants la synthèse (+) ou non (-) de la protéine et la production (+) ou non (-) de la capsule CS31A.
Les plasmides pGC32, pGC19, pGC44, pGC1, pGC4 et pF1 sont introduits individuellement dans la souche de complémentation. Des Western blot sont effectués sur des extraits à 600C provenant de ces souches. Les anticorps polyclonaux anti-CS31A ou antipeptide G15Q décrits précédemment ne reconnaissent pas un polypeptide avec le poids moléculaire attendu mais avec un poids moléculaire plus élevé d'environ 60 kDa. Dans des expériences dtimmunodots, les bactéries entières sont CS31A négatives. La sous-unité ClpG est donc synthétisée mais n'est pas exportée et polymérisée à la surface bactérienne. Elle est certainement bloquée dans le périplasme en association avec une autre protéine qui n'a pas encore été identifiée.
La figure 31 est une photographie d'un "Western blot" réalisé à partir d'extraits à 6 0 OC concentrés 10 fois de bactéries hébergeant les mutants 1 à 6 (+pDSPH 524) et de l'anticorps polyclonal anti
CS31A.
CS31A.
Ce résultat n'est pas incompatible avec l'utilisation vaccinale de telles bactéries recombinantes.
b) Conclusions pour la région V2
La région V2 apparait globalement permissive d'après les expériences de mutagenèse au hasard.
La région V2 apparait globalement permissive d'après les expériences de mutagenèse au hasard.
Cependant certains acides aminés doivent être importants puisque l'introduction (insertions et sbstitutions) des séquences nucléotidiques codant pour différents épitopes perturbe la biogénèse de CS31A. Il est nécessaire de déterminer plus précisément dans cette zone la localisation exacte des sites permissifs.
2) Manipulation de V3
Les modifications de la région V3 sont indiquées dans la figure 32; dans cette figure les nucléotides et les acides aminés marqués d'une étoile sont ceux qui ont été modifiés par mutagénèse.
Les modifications de la région V3 sont indiquées dans la figure 32; dans cette figure les nucléotides et les acides aminés marqués d'une étoile sont ceux qui ont été modifiés par mutagénèse.
Dans le mutant 7, le résidu glutamine en position 186 est remplacé par un résidu glutamate. Un site de restriction SacI est ainsi crée. De plus, un résidu glutamine en position 199 est remplacé par un résidu leucine. Un site de restriction SpeI est ainsi créé.
Dans le mutant 8, un site de restriction Hpa
I est crée au niveau du codon valine en position 190. Un résidu asparagine en position 203 est remplacé par un résidu thréonine, créant ainsi un site de restriction
Spe I.
I est crée au niveau du codon valine en position 190. Un résidu asparagine en position 203 est remplacé par un résidu thréonine, créant ainsi un site de restriction
Spe I.
Dans les mutants 9 et 10, un résidu asparagine en position 203 est remplacé par un résidu thréonine, créant ainsi un site de restriction SpeI. De plus dans le mutant 9 un résidu valine en position 217 est remplacé par un résidu leucine. Un site de restriction BglII est ainsi créé.
Les plasmides mutants sont introduits par transformation dans une souche hébergeant pDSPH 524 et la présence de CS31A est recherchée par tests immunologiques sur bactéries entières et sur extraits à 600C après électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant. Les mutants 8, 9 et 10 produisent CS31A en quantité comparable à la souche témoin hébergeant pPSX83 + pDSPH 524. Le mutant 7 en produit légèrement moins.
La figure 33 est une photographie d'un "Western blot" réalisé à partir d'extraits à 600C concentrés 10 fois et de l'anticorps polyclonal anti
CS31A; en 1 : pPSX 83 + pDSPH 524 ; en 2 : mutant 9 + pDSPH 524 ; en 3 : mutant 8 + pDSPH 524 ; en 4 : mutant 7+ pDSPH 524.
CS31A; en 1 : pPSX 83 + pDSPH 524 ; en 2 : mutant 9 + pDSPH 524 ; en 3 : mutant 8 + pDSPH 524 ; en 4 : mutant 7+ pDSPH 524.
a) Introduction des épitopes et expression des protéines recombinantes
- Dans le mutant 9
Cinq ADN synthétiques dont 2 codant pour l'épitope C du GET, un pour l'épitope A du GET, un pour l'épitope du rotavirus et le dernier pour l'épitope polio, et ayant des extrémités cohésives SpeI et BglII (figure 27), ont remplacé le fragment SpeI/BglII du mutant 9, générant respectivement les plasmides pGG103, pGP105, pGA102, pR104 et pP101 (figure 34b).
- Dans le mutant 9
Cinq ADN synthétiques dont 2 codant pour l'épitope C du GET, un pour l'épitope A du GET, un pour l'épitope du rotavirus et le dernier pour l'épitope polio, et ayant des extrémités cohésives SpeI et BglII (figure 27), ont remplacé le fragment SpeI/BglII du mutant 9, générant respectivement les plasmides pGG103, pGP105, pGA102, pR104 et pP101 (figure 34b).
Dans la figure 34 on a indiqué la synthèse (+) ou non (-) de la protéine, la production (+) ou non (-) de la capsule CS31A.
En Western blot ou en dot-blot, les sousunités recombinantes CS31A/épitope sont très bien reconnues par les polyclonaux anti-CS31A quoique plus faiblement pour pGA102 et pR104. De plus, la sous-unité hybride codée par pGA102 a un poids moléculaire plus faible que la sous-unité sauvage. La figure 35 est une photographie d'un "Western blot" réalisé à partir d'extraits concentrés 10 fois de bactéries hébergeant certaines constructions réalisées dans la région V3 et d'un antisérum polyclonal anti-CS31A.
Les bactéries entières hébergant pGG103 ou pGP105+ pDSPH 524 sont reconnues par un anticorps monoclonal dirigé contre lrépltope C du GET.
- Dans le mutant 8
Trois ADN synthétiques, codant l'un pour l'épitope polio, le second pour l'épitope C du GET, et le troisième pour l'épitope FMDV, et ayant des extrémités compatibles HpaI et SpeI (figure 27), a remplacé le fragment de restriction HpaI/SpeI du mutant 8, générant respectivement les plasmides pP688, pGP684 et pF681 (figure 34a).
Trois ADN synthétiques, codant l'un pour l'épitope polio, le second pour l'épitope C du GET, et le troisième pour l'épitope FMDV, et ayant des extrémités compatibles HpaI et SpeI (figure 27), a remplacé le fragment de restriction HpaI/SpeI du mutant 8, générant respectivement les plasmides pP688, pGP684 et pF681 (figure 34a).
Les bactéries hébergeant pP688 + pDSPH 524 ou pF 681 + pDSPH 524 sont très faiblement reconnues par les anticorps polyclonaux CS31A. En Western blot, les sous-unités recombinantes sont également reconnues de façon plus faible que la sous unité témoin. Par contre les bactéries hébergeant pGP684 + pDSPH524 sont fortement reconnues par les anticorps polyclonaux anti
CS31A et par l'anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope C du GET
- Dans le mutant 10
Un ADN synthétique de séquence
XhoI
CT AGC GAC TCG AGC TTC TTT TCG TAC GGT GAG ATT CCT AGT
T S D S S F F S Y G E I P S codant pour l'épitope C du GET (S D S S F F S Y G E I P) et ayant des extrémités compatibles SpeI a été inséré dans le site SpeI du mutant 10, générant le plasmide pGC326. Cet ADN synthétique comporte un site unique XhoI du coté 5'.En Western immunoblotting la sous-unité recombinante exprimée par les bactéries hébergeant pGC326 + pDSPH524 est fortement reconnue par les anticorps polyclonaux anti-CS31A et par l'anticorps monoclonal anti-épitope C du GET. La sous-unité hybride codée par pGC326 a un poids moléculaire plus élevé que la sous-unité sauvage en raison de l'addition des douze acides aminés de l'épitope C.
CS31A et par l'anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope C du GET
- Dans le mutant 10
Un ADN synthétique de séquence
XhoI
CT AGC GAC TCG AGC TTC TTT TCG TAC GGT GAG ATT CCT AGT
T S D S S F F S Y G E I P S codant pour l'épitope C du GET (S D S S F F S Y G E I P) et ayant des extrémités compatibles SpeI a été inséré dans le site SpeI du mutant 10, générant le plasmide pGC326. Cet ADN synthétique comporte un site unique XhoI du coté 5'.En Western immunoblotting la sous-unité recombinante exprimée par les bactéries hébergeant pGC326 + pDSPH524 est fortement reconnue par les anticorps polyclonaux anti-CS31A et par l'anticorps monoclonal anti-épitope C du GET. La sous-unité hybride codée par pGC326 a un poids moléculaire plus élevé que la sous-unité sauvage en raison de l'addition des douze acides aminés de l'épitope C.
b) Conclusions pour la région V3
Les résultats obtenus concordent bien avec les études immunostructurales. Cette région apparait comme très permissive : 5 épitopes différents ont été introduits dans 2 sites différents de la région V3, conduisant dans tous les les cas à la production de CS3lA, quoique de façon plus faible dans le mutant 8 pour les épitopes polio et FMDV et dans le mutant 9 pour l'épitope A du GET et l'épitope du rotavirus.
Les résultats obtenus concordent bien avec les études immunostructurales. Cette région apparait comme très permissive : 5 épitopes différents ont été introduits dans 2 sites différents de la région V3, conduisant dans tous les les cas à la production de CS3lA, quoique de façon plus faible dans le mutant 8 pour les épitopes polio et FMDV et dans le mutant 9 pour l'épitope A du GET et l'épitope du rotavirus.
De plus cette région est située à l'exterieur de la molécule puisque les épitopes C du GET sont reconnus sur les bactéries recombinantes par les anticorps monoclonaux correspondants. Cette région très tolérante apparait donc comme une région de choix pour l'insertion de polypeptides étrangers devant être présentés à l'extérieur de la molécule. L'introduction de séquences étrangères peut donc être réalisée soit par substitution, à partir des mutants 7, 8 et 9, soit par insertion additionnelle à partir du mutant 10.
3) Manipulation dans la région D
A partir des mutants 7, 8 et 9 (figure 32) des substitutions ont été réalisées entre la région V3 (délimitée dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 186 et 221) et l'acide aminé C-terminale (représénté dans la figure 9 par l'asparagine situé en position 257) de la sous unité ClpG.
A partir des mutants 7, 8 et 9 (figure 32) des substitutions ont été réalisées entre la région V3 (délimitée dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 186 et 221) et l'acide aminé C-terminale (représénté dans la figure 9 par l'asparagine situé en position 257) de la sous unité ClpG.
a) Dans le mutant 7
L'ADN correspondant au plasmide recombinant du mutant 7, qui contient un site unique SpeI dans la région V3 (figure 32) et un site unique XbaI dans le polylinker du vecteur pSelectl, a été restreint par SpeI et XbaI. Du fait de la compatibilité des extrémités générées par SpeI et XbaI, le plasmide ainsi restreint a pu être recircularisé par la T4 DNA ligase pour donner le plasmide pDSX28. Cette opération a permis d'éliminer les 59 derniers acides aminés C-terminaux de la sousunité ClpG situés dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions 198 et 257, et de fusionner à la protéine ClpG une séquence étrangère de 100 acides aminés codés par une partie de 1'ADN du vecteur en phase avec le reste du gène clpG non modifié.
L'ADN correspondant au plasmide recombinant du mutant 7, qui contient un site unique SpeI dans la région V3 (figure 32) et un site unique XbaI dans le polylinker du vecteur pSelectl, a été restreint par SpeI et XbaI. Du fait de la compatibilité des extrémités générées par SpeI et XbaI, le plasmide ainsi restreint a pu être recircularisé par la T4 DNA ligase pour donner le plasmide pDSX28. Cette opération a permis d'éliminer les 59 derniers acides aminés C-terminaux de la sousunité ClpG situés dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions 198 et 257, et de fusionner à la protéine ClpG une séquence étrangère de 100 acides aminés codés par une partie de 1'ADN du vecteur en phase avec le reste du gène clpG non modifié.
Les résultats obtenus en Western immunoblotting avec les anticorps polyclonaux anti-CS31A indiquent que les bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 + pDSX28 expriment toujours, bien que faiblement, la capsule CS31A.
b) Dans le mutant 8
L'ADN correspondant au plasmide recombinant du mutant 8, qui contient un site unique HpaI dans la région V3 (figure 32) et un site unique SmaI dans le polylinker du vecteur pSelectl, a été restreint par HpaI et SmaI. En raison des extrémités franches générées par
HpaI et SmaI, le plasmide ainsi restreint a pu être recircularisé par la T4 DNA ligase pour donner le plasmide pDHS68. Cette manipulation a abouti à l'élimination des 67 derniers acides aminés C-terminaux de la sous-unité ClpG stués dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions 199 et 257, et à l'introduction par fusion génétique d'une séquence étrangère de 84 acides aminés codés par une partie de 1'ADN du vecteur en phase avec le reste du gène clpG non modifié.
L'ADN correspondant au plasmide recombinant du mutant 8, qui contient un site unique HpaI dans la région V3 (figure 32) et un site unique SmaI dans le polylinker du vecteur pSelectl, a été restreint par HpaI et SmaI. En raison des extrémités franches générées par
HpaI et SmaI, le plasmide ainsi restreint a pu être recircularisé par la T4 DNA ligase pour donner le plasmide pDHS68. Cette manipulation a abouti à l'élimination des 67 derniers acides aminés C-terminaux de la sous-unité ClpG stués dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions 199 et 257, et à l'introduction par fusion génétique d'une séquence étrangère de 84 acides aminés codés par une partie de 1'ADN du vecteur en phase avec le reste du gène clpG non modifié.
Les résultats obtenus en Western immunoblotting avec les anticorps polyclonaux anti-CS31A indiquent que les bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 + pDHS68 expriment toujours, bien que faiblement, le CS31A.
c) Dans le mutant 9
L'ADN correspondant au plasmide recombinant du mutant 9, qui contient un site unique BglII dans la région V3 (figure 32) et un site unique BamHI dans le polylinker du vecteur pSelect, a été restreint par BglII et BamHI. En raison de la compatibilité des extrémités cohésives générées par BglII et BamHI, le plasmide ainsi restreint a pu être recircularisé par la T4 DNA ligase pour donner le plasmide pDBB10. Cette recircularisation a eu pour effet d'éliminer les 41 derniers acides aminés
C-terminaux de la sous-unité ClpG situés dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions 216 et 257, et d'introduire par fusion génétique une séquence étrangère de 84 acides aminés codés par une partie de 1'ADN du vecteur en phase avec le reste du gène clpG non modifié.
L'ADN correspondant au plasmide recombinant du mutant 9, qui contient un site unique BglII dans la région V3 (figure 32) et un site unique BamHI dans le polylinker du vecteur pSelect, a été restreint par BglII et BamHI. En raison de la compatibilité des extrémités cohésives générées par BglII et BamHI, le plasmide ainsi restreint a pu être recircularisé par la T4 DNA ligase pour donner le plasmide pDBB10. Cette recircularisation a eu pour effet d'éliminer les 41 derniers acides aminés
C-terminaux de la sous-unité ClpG situés dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions 216 et 257, et d'introduire par fusion génétique une séquence étrangère de 84 acides aminés codés par une partie de 1'ADN du vecteur en phase avec le reste du gène clpG non modifié.
Les résultats obtenus en Western immunoblotting avec les anticorps polyclonaux anti-CS31A indiquent une très bonne réactivité des bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 + pDBB10.
II - Après mutagénèse insertionnelle au hasard
1) Principe
Le procédé de mutagénèse insertionnelle au hasard qui a permis de détecter les régions permissives dans la protéine ClpG, a été mis à profit pour l'insertion de ltépitope C du virus de la gastroentérite transmissible (GET) du porc. Cet épitope continu est un site antigénique majeur de la glycoprotéine externe E2 qui est le meilleur candidat comme antigène protecteur potentiel, puisqu'il est capable d'induire des anticorps neutralisants et de stimuler l'immunité à médiation cellulaire.
1) Principe
Le procédé de mutagénèse insertionnelle au hasard qui a permis de détecter les régions permissives dans la protéine ClpG, a été mis à profit pour l'insertion de ltépitope C du virus de la gastroentérite transmissible (GET) du porc. Cet épitope continu est un site antigénique majeur de la glycoprotéine externe E2 qui est le meilleur candidat comme antigène protecteur potentiel, puisqu'il est capable d'induire des anticorps neutralisants et de stimuler l'immunité à médiation cellulaire.
Un oligonucléotide de synthèse correspondant à la séquence nucléotidique codant pour l'épitope C est inséré dans le site EcoRI qui a été préalablement placé dans les sites permissifs du gène clpG par insertion au hasard d'un linker EcoRI. Les clones mutés dans le gène clpG ayant incorporé l'oligonucléotide sont analysés par immunoblotting à l'aide d'un anticorps polyclonal spécifique de la protéine ClpG et d'un anticorps monoclonal spécifique de ltépitope C du coronavirus GET.
2) Méthode
a) Insertion de l'épitope C du virus GET
Un oligonucléotide double brin non phosphorylé codant pour l'épitope C du GET (acides aminés 361-372), de séquence SD : SDSSFFSYGEIP, et comportant un site EcoRI aux extrémités 5' et 3', a été synthetisé. Cet oligonucléotide contient un site de restriction BspEI (BspMII, AccIII, Kpn 21, MroI) (5'- TCC GGA-3') qui facilite la sélection des recombinants possédant ltépitope C.
a) Insertion de l'épitope C du virus GET
Un oligonucléotide double brin non phosphorylé codant pour l'épitope C du GET (acides aminés 361-372), de séquence SD : SDSSFFSYGEIP, et comportant un site EcoRI aux extrémités 5' et 3', a été synthetisé. Cet oligonucléotide contient un site de restriction BspEI (BspMII, AccIII, Kpn 21, MroI) (5'- TCC GGA-3') qui facilite la sélection des recombinants possédant ltépitope C.
Les séquences oligonuclétidique et peptidique correspondant à l'épitope C introduit dans le linker EcoRI sont indiquées figure 36.
Le choix des codons est basé sur la fréquence des codons préférentiellement utilisés dans le gène clpG. L'oligonucléotide double brin non-phosphorylé en 5' a été mis en présence de la T4 DNA ligase et d'un mélange d'ADN de pDEV41155 préalablement linéarisé par
EcoRI dont le site est présent dans différentes régions permissives du gène clpG. Après transformation des
E.coli DOSA, le mélange de transformation a été mis directement en culture dans du LB liquide avec de l'ampicilline. L'ADN plasmidique total extrait à partir de cette culture a été restreint par BspEI. Un mélange d'ADN linéaire est récupéré et purifié à partir d'un gel d'agarose. Cette étape a permis d'isoler uniquement l'ADN plasmidique ayant inséré ltoligonucléotide correspondant à l'épitope C.Cet ADN est recircularisé par ligation et transféré dans la souche E.coli DHSa hébergeant le plasmide pDSPH524 afin de tester par complémentation intergénique la présence de ltépitope C dans les polymères de surface CS31A.
EcoRI dont le site est présent dans différentes régions permissives du gène clpG. Après transformation des
E.coli DOSA, le mélange de transformation a été mis directement en culture dans du LB liquide avec de l'ampicilline. L'ADN plasmidique total extrait à partir de cette culture a été restreint par BspEI. Un mélange d'ADN linéaire est récupéré et purifié à partir d'un gel d'agarose. Cette étape a permis d'isoler uniquement l'ADN plasmidique ayant inséré ltoligonucléotide correspondant à l'épitope C.Cet ADN est recircularisé par ligation et transféré dans la souche E.coli DHSa hébergeant le plasmide pDSPH524 afin de tester par complémentation intergénique la présence de ltépitope C dans les polymères de surface CS31A.
b) Immunoréactivité des protéines hybrides
ClpG-épitope C
Au total 1000 clones ayant incorporé ltépitope C du GET ont été obtenus et analysés pour la production des polymères de surface CS31A et pour l'antigénicité de l'épitope C. Les clones synthétisant la protéine CS31A à la surface des bactéries mutantes ont été détectés par un test d'immunodétection in situ sur colonies en utilisant un sérum anti-CS31A natif.
ClpG-épitope C
Au total 1000 clones ayant incorporé ltépitope C du GET ont été obtenus et analysés pour la production des polymères de surface CS31A et pour l'antigénicité de l'épitope C. Les clones synthétisant la protéine CS31A à la surface des bactéries mutantes ont été détectés par un test d'immunodétection in situ sur colonies en utilisant un sérum anti-CS31A natif.
Ainsi, 492 clones mutants (49%) se sont révélés positifs pour la production de CS31A, suggérant que les protéines hybrides, ClpG-épitope C, sont intégrées dans la structure finale de CS31A. Pour examiner l'antigénicité de l'épîtope C, ces 492 clones CS31A+ ont été testés par immunoblotting in situ sur colonies avec les anticorps monoclonaux Mab 3b.5 spécifiques de l'épitope C du virus
GET (Delmas, B. et al. 1990 J. Gen. Viro. 71: 1313).
GET (Delmas, B. et al. 1990 J. Gen. Viro. 71: 1313).
La figure 37 indique l'immunoréactivité des protéines ClpG modifiées
- En A : Immunoréactivité avec l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 anti-épitope C du GET (Delmas, B. et al. 1990 J. Gen. Viro. 71: 1313) par immunoblotting in situ sur colonies.
- En A : Immunoréactivité avec l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 anti-épitope C du GET (Delmas, B. et al. 1990 J. Gen. Viro. 71: 1313) par immunoblotting in situ sur colonies.
- En B : Western blotting avec un sérum anti-ClpG (a) et avec l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 (b) des protéines ClpG modifiées (canaux 1-4 et 6-10) et non modifiées (canal 5) en conditions dénaturantes.
La figure 37A montre que seulement 11 colonies (2 %) réagissent avec l'anticorps Mab 3b.5.
L'immunoréactivité de ces protéines hybrides avec l'anticorps Mab 3b.5 et avec les anticorps polyclonaux anti-CS31A natif est confirmée par Western blotting en conditions dénaturantes (figure 37B) et non dénaturantes. En conditions dénaturantes (SDS-PAGE, 1000C/ 5mn) tous les 11 clones (seulement 9 sont montrés dans la figure 37B) réagissent avec les deux types d'anticorps et présentent une plus faible migration électrophorétique que la protéine ClpG sauvage, due à la présence des 16 acides aminés supplémentaires correspondant à l'épitope C. En conditions non dénaturantes (PAGE sans SDS et sans chauffage à 1000C pendant 5 mn) les profils électrophorétiques montrent une structure oligomérique des protéines ClpG hybrides, semblable à la protéine ClpG sauvage.
c) Localisation de l'épitope C dans la protéine ClpG hybride
La localisation de l'épitope C dans la protéine ClpG hybride est déterminée par séquençage. Les résultats indiquent que chez les 11 clones mutants l'épitope C est inséré exactement entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG.
La localisation de l'épitope C dans la protéine ClpG hybride est déterminée par séquençage. Les résultats indiquent que chez les 11 clones mutants l'épitope C est inséré exactement entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG.
La figure 38 représente la séquence de l'oligonucléotide codant pour l'épitope C du GET introduit entre le peptide signal et la protéine mature de la préprotéine ClpG.
L'analyse par séquençage de lTADN plasmidique de quelques clones mutants exprimant le
CS31A mais pas l'épitope C du GET, indique que l'ADN synthétique codant pour cet épitope a été inséré dans une mauvaise orientation à l'intérieur même de la séquence signal de clpG situé dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions -21 et + 1 de CS31A (figure 14). Quatre insertions de séquences hétérologues ont été obtenues (les séquences hétérologues additionnelles sont soulignées)
- La première entre les acides aminés situés aux positions -13 et -12 de la figure 9 -21 -13 -12
MKKTLIALA GIPEFHHRKRKNYHOIPALA VAVSAV
- La deuxième entre les acides aminés situés aux positions -7 et +8 de la figure 9 -21 -7 +8
MKKTLIALAVAVSAV PEFRNFTIGKERTITEFR GSFDM
- La troisième entre les acides aminés situés aux positions -6 et +1 de la figure 9 -21 -1 +1
MKKTL IALAVAVSAVS GAAAHA EFRNFT IGKERT I TEFRA W
- La quatrième entre les acides aminés situés aux positions -6 et -1 de la figure 9 -21 -6 -1
MKKTLIALAVAVSAVS RNSGISPOEKKELSLNSG AW
La phase de lecture ayant été respectée on comprend la raison pour laquelle la capsule CS31A, à l'inverse de l'épitope C, est toujours exprimée. Cela montre que la séquence signal de ClpG peut être une région permissive et qu'il peut exister plusieurs sites de coupure par la signal peptidase à l'intérieur de la séquence signal de ClpG.
CS31A mais pas l'épitope C du GET, indique que l'ADN synthétique codant pour cet épitope a été inséré dans une mauvaise orientation à l'intérieur même de la séquence signal de clpG situé dans la figure 9 entre les acides aminés aux positions -21 et + 1 de CS31A (figure 14). Quatre insertions de séquences hétérologues ont été obtenues (les séquences hétérologues additionnelles sont soulignées)
- La première entre les acides aminés situés aux positions -13 et -12 de la figure 9 -21 -13 -12
MKKTLIALA GIPEFHHRKRKNYHOIPALA VAVSAV
- La deuxième entre les acides aminés situés aux positions -7 et +8 de la figure 9 -21 -7 +8
MKKTLIALAVAVSAV PEFRNFTIGKERTITEFR GSFDM
- La troisième entre les acides aminés situés aux positions -6 et +1 de la figure 9 -21 -1 +1
MKKTL IALAVAVSAVS GAAAHA EFRNFT IGKERT I TEFRA W
- La quatrième entre les acides aminés situés aux positions -6 et -1 de la figure 9 -21 -6 -1
MKKTLIALAVAVSAVS RNSGISPOEKKELSLNSG AW
La phase de lecture ayant été respectée on comprend la raison pour laquelle la capsule CS31A, à l'inverse de l'épitope C, est toujours exprimée. Cela montre que la séquence signal de ClpG peut être une région permissive et qu'il peut exister plusieurs sites de coupure par la signal peptidase à l'intérieur de la séquence signal de ClpG.
Ce travail démontre qu'il est possible d'insérer un peptide hétérologue de 20 acides aminés aussi bien dans la préprotéine ClpG que dans la protéine mature sans pertuber la biogénèse de CS31A et de telle manière qu'il soit antigénique chez la protéine native.
III - Insertion dirigée de l'épitoge C du virus GET entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG
Un oligonucléotide (42 mer) double brin nonphosphorylé codant pour l'épitope C de 9 acides aminés (SSFFSYGEI) et comportant le site SphI (5'-GCATGC-3') à chacune de ses extrémités a été synthétisé. Cet oligonucléotide contient les sites de restriction PstI,
XhoI et NsiI. L'insertion de l'oligonucléotide de synthèse dans le site unique SphI du plasmide recombinant pDEV41155 (figure 12) est montrée par la figure 39. Le plasmide recombinant résultant de cette insertion est appelé pGISA. La figure 39 représente le schéma d'insertion de l'épitope C du GET entre le peptide signal et la protéine mature de la préprotéine
ClpG.La séquence en caractère gras désigne la séquence de l'oligonucléotide de synthèse qui a été insérée dans le gène clpG. La séquence en acides aminés correspondant à l'épitope C du GET est encadrée. La séquence des 14 acides aminés marqués en caractères gras correspond au peptide qui a été ajouté dans la séquence peptidique de la protéine ClpG mature.
Un oligonucléotide (42 mer) double brin nonphosphorylé codant pour l'épitope C de 9 acides aminés (SSFFSYGEI) et comportant le site SphI (5'-GCATGC-3') à chacune de ses extrémités a été synthétisé. Cet oligonucléotide contient les sites de restriction PstI,
XhoI et NsiI. L'insertion de l'oligonucléotide de synthèse dans le site unique SphI du plasmide recombinant pDEV41155 (figure 12) est montrée par la figure 39. Le plasmide recombinant résultant de cette insertion est appelé pGISA. La figure 39 représente le schéma d'insertion de l'épitope C du GET entre le peptide signal et la protéine mature de la préprotéine
ClpG.La séquence en caractère gras désigne la séquence de l'oligonucléotide de synthèse qui a été insérée dans le gène clpG. La séquence en acides aminés correspondant à l'épitope C du GET est encadrée. La séquence des 14 acides aminés marqués en caractères gras correspond au peptide qui a été ajouté dans la séquence peptidique de la protéine ClpG mature.
Le site SphI dans le gène clpG est localisé à 7 pb en amont du codon TGG qui correspond au premier acide aminé (Tryptophane :W) de la protéine ClpG mature.
Le site de coupure initial (AHA/WT) de la signal peptidase a été modifié et optimisé (AHA/AD) . Le résultat final de l'insertion conduit à l'addition de 14 acides aminés (ADSSFFSYGEIMHA) dans la séquence peptidique de la protéineClpG mature entre la position -1 et +1 de la séquence peptidique initiale.
Après clonage de l'oligonucléotide de synthèse dans le site SphI du gène clpG et tranformation de la souche E.coli DH5a, les clones hybrides ont été testés par immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif et l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 spécifique de l'épitope C.
Deux techniques immunologiques ont été utilisées : l'immunodétection in situ des protéines hybrides natives sur colonies et l'immunodétection des protéines hybrides dénaturées sur Western blots.
Dans les deux cas, les résultats indiquent une immunoréactivité des protéines hybrides, ClpGépitope C, avec les deux types d'anticorps. Ceci démontre que les protéines ClpG hybrides sont normalement exportées et polymérisées pour constituer le
CS31A et que l'épitope C est exposé à la surface de celui-ci.
CS31A et que l'épitope C est exposé à la surface de celui-ci.
IV - Coinsertion d'épitopes viraux dans la protéine ClpG
1) Coinsertion des épitopes A et C du virus
GET
a) Entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG
a.l) Un oligonucléotide (36 mer) double brin non phosphorylé de séquence (5' - TCG ATG AAG AGA TCT GGC TAT GGT CAG CCT ATT GCG - 3'
3' - AC TTC TCT AGA CCG ATA CCA GTC GGA TAA CGC AGC T
codant pour 1'épitope A de 12 acides aminés (SMKRSGYGQPIA) et comportant un site compatible avec
XhoI (5'-CTC GAG-3') à chacune de ses extrémités a été synthétisé. Cet oligonucléotide qui contient le site de restriction BglII (5'-AGA TCT-3') a été inséré dans le site unique XhoI du plasmide recombinant pGISA (Chapitre
H paragraphe III et figure 39). Le site XhoI est situé immédiatement en amont de la séquence codant pour l'épitope TGEV C.Ainsi la coinsertion des épitopes A et
C du virus GET entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG correspond finalement à une séquence hétérologue additionnelle de 26 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
1) Coinsertion des épitopes A et C du virus
GET
a) Entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG
a.l) Un oligonucléotide (36 mer) double brin non phosphorylé de séquence (5' - TCG ATG AAG AGA TCT GGC TAT GGT CAG CCT ATT GCG - 3'
3' - AC TTC TCT AGA CCG ATA CCA GTC GGA TAA CGC AGC T
codant pour 1'épitope A de 12 acides aminés (SMKRSGYGQPIA) et comportant un site compatible avec
XhoI (5'-CTC GAG-3') à chacune de ses extrémités a été synthétisé. Cet oligonucléotide qui contient le site de restriction BglII (5'-AGA TCT-3') a été inséré dans le site unique XhoI du plasmide recombinant pGISA (Chapitre
H paragraphe III et figure 39). Le site XhoI est situé immédiatement en amont de la séquence codant pour l'épitope TGEV C.Ainsi la coinsertion des épitopes A et
C du virus GET entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG correspond finalement à une séquence hétérologue additionnelle de 26 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
<tb> <SEP> -1 <SEP> +1
<tb> AHAADSLMKEÉGYQASffijL,Ç$TGGEEvLiMHA <SEP> -ClpG
<tb> <SEP> piope <SEP> + <SEP> 26 <SEP> Epitope <SEP> GET <SEP> A <SEP> L <SEP> L <SEP> amines
<tb> <SEP> I <SEP> +26acidesaminés
<tb>
L'ensemble du gène clpG modifié comportant à la fois la séquence codant pour l'épitope A et celle codant pour l'épitope C du virus GET a été replacé par clonage moléculaire dans son opéron d'origine qui avait été préalablement cloné dans le plasmide pHSG575 (Martin C. et al., 1991). La construction finale a conduit à l'obtention du plasmide pGAC524.
<tb> AHAADSLMKEÉGYQASffijL,Ç$TGGEEvLiMHA <SEP> -ClpG
<tb> <SEP> piope <SEP> + <SEP> 26 <SEP> Epitope <SEP> GET <SEP> A <SEP> L <SEP> L <SEP> amines
<tb> <SEP> I <SEP> +26acidesaminés
<tb>
L'ensemble du gène clpG modifié comportant à la fois la séquence codant pour l'épitope A et celle codant pour l'épitope C du virus GET a été replacé par clonage moléculaire dans son opéron d'origine qui avait été préalablement cloné dans le plasmide pHSG575 (Martin C. et al., 1991). La construction finale a conduit à l'obtention du plasmide pGAC524.
L'immunodétection in situ des protéines modifiées natives sur colonies et l'immunodétection des protéines hybrides dénaturées sur Western blots avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40) et des anticorps monoclonaux anti-sites C et A du GET a démontré que les protéines trihybrides, épitope TGEV A-épitope TGEV C
ClpG, étaient encore immunoréactives. Ceci indique que la protéine ClpG trihybride était exprimée, exportée et polymérisée pour constituer la capsule CS31A.
ClpG, étaient encore immunoréactives. Ceci indique que la protéine ClpG trihybride était exprimée, exportée et polymérisée pour constituer la capsule CS31A.
a.2) Une autre construction analogue à celle-ci a été réalisée, mais différente quant à l'agencement des épitopes A et C du virus GET en amont du gène clpG. Dans ce cas l'épitope A a été inséré non pas avant le site C, mais après celui-ci entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine
ClpG
Un oligonucléotide (36 mer) double brin non phosphorylé de séquence
(5' - G AAA AGA TCT GGT TAT GGA CAG CCG ATT GCA GTG CA 3' - AC GTC TTT TCT AGA CCA ATA CCT GTC GGC TAA CGT C - 51) codant pour l'épitope A de 12 acides aminés (KRSGYGQPIAVH) et comportant un site compatible avec le site NsiI (5'-ATG CAT-3') à chacune de ses extrémités à été synthétisé. Cet oligonucléotide contenant le site
BglII (5'-AGA TCT-3') a été inséré dans le site unique
NsiI du plasmide recombinant pGISA (Chapitre H paragraphe III et figure 39). Le site NsiI est situé immédiatement en aval de la séquence codant pour l'épitope TGEV C. La coinsertion des épitopes A et C du virus GET entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG correspond à une séquence hétérologue additionnelle de 26 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
ClpG
Un oligonucléotide (36 mer) double brin non phosphorylé de séquence
(5' - G AAA AGA TCT GGT TAT GGA CAG CCG ATT GCA GTG CA 3' - AC GTC TTT TCT AGA CCA ATA CCT GTC GGC TAA CGT C - 51) codant pour l'épitope A de 12 acides aminés (KRSGYGQPIAVH) et comportant un site compatible avec le site NsiI (5'-ATG CAT-3') à chacune de ses extrémités à été synthétisé. Cet oligonucléotide contenant le site
BglII (5'-AGA TCT-3') a été inséré dans le site unique
NsiI du plasmide recombinant pGISA (Chapitre H paragraphe III et figure 39). Le site NsiI est situé immédiatement en aval de la séquence codant pour l'épitope TGEV C. La coinsertion des épitopes A et C du virus GET entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine ClpG correspond à une séquence hétérologue additionnelle de 26 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
<tb> <SEP> -1 <SEP> +1
<tb> A <SEP> H <SEP> A <SEP> A <SEP> D <SEP> S <SEP> S <SEP> F <SEP> F <SEP> S <SEP> Y <SEP> G <SEP> E <SEP> I <SEP> M <SEP> Q <SEP> K <SEP> R <SEP> 8 <SEP> G <SEP> Y <SEP> G <SEP> Q <SEP> P <SEP> I <SEP> A <SEP> V <SEP> H <SEP> A <SEP> W-ClpG
<tb> <SEP> DlsE,itope <SEP> GET <SEP> L <SEP> 1 <SEP> Epitope <SEP> TGEV <SEP> C <SEP> I <SEP> I <SEP> Epitope <SEP> GET <SEP> A
<tb> <SEP> I <SEP> acides <SEP> aminés
<tb>
La construction finale a conduit à l'obtention du plasmide pGCA41155.L'immunodétection des protéines hybrides dénaturées sur Western blots avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40) et des anticorps monoclonaux anti-sites C et A du GET a démontré que les protéines trihybrides, épitope TGEV C-épitope TGEV A
ClpG, étaient très immunoréactives. Ceci indique que la protéine ClpG trihybride était exprimée, exportée et polymérisée pour former le CS31A. Cependant le niveau d'expression de ClpG évalué par Western blot avec ces trois types d'anticorps semble plus faible dans le cas du trihybride, NH2-épitope TGEV A-épitope TGEV C-ClpG
COOH, comparativement au trihybride NH2-épitope TGEV Cépitope TGEV A-ClpG-COOH.
<tb> A <SEP> H <SEP> A <SEP> A <SEP> D <SEP> S <SEP> S <SEP> F <SEP> F <SEP> S <SEP> Y <SEP> G <SEP> E <SEP> I <SEP> M <SEP> Q <SEP> K <SEP> R <SEP> 8 <SEP> G <SEP> Y <SEP> G <SEP> Q <SEP> P <SEP> I <SEP> A <SEP> V <SEP> H <SEP> A <SEP> W-ClpG
<tb> <SEP> DlsE,itope <SEP> GET <SEP> L <SEP> 1 <SEP> Epitope <SEP> TGEV <SEP> C <SEP> I <SEP> I <SEP> Epitope <SEP> GET <SEP> A
<tb> <SEP> I <SEP> acides <SEP> aminés
<tb>
La construction finale a conduit à l'obtention du plasmide pGCA41155.L'immunodétection des protéines hybrides dénaturées sur Western blots avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40) et des anticorps monoclonaux anti-sites C et A du GET a démontré que les protéines trihybrides, épitope TGEV C-épitope TGEV A
ClpG, étaient très immunoréactives. Ceci indique que la protéine ClpG trihybride était exprimée, exportée et polymérisée pour former le CS31A. Cependant le niveau d'expression de ClpG évalué par Western blot avec ces trois types d'anticorps semble plus faible dans le cas du trihybride, NH2-épitope TGEV A-épitope TGEV C-ClpG
COOH, comparativement au trihybride NH2-épitope TGEV Cépitope TGEV A-ClpG-COOH.
Cette différence peut provenir du type d'agencement des épitopes A et C dans la protéine ClpG qui conduit à une conformation plus ou moins contraignante de l'ensemble de la séquence hétérologue susceptible d'affecter une des étapes impliquées dans la biogènèse de CS31A. Elle peut aussi découler du système de complémentation utilisé pour l'étude de l'expression de CS31A dans chacune de ces constructions (Trans ou Cis complémentation).
b) Dans la région V3
b.l) Un oligonucléotide de 36 mer double brin non phosphorylé de séquence (51 - CTA GCG ACT CGA GCT TCT TTT CGT ACG GTG AGA TTC - 3'
3' - GC TGA GCT CGA AGA ARA GCA TGC CAC TCT AAG GAT C - 5') codant pour l'épitope C de 12 acides aminés (SDSSFFSYGEIP) et comportant un site compatible avec le site SpeI (5'-ACT AGT-3') a été synthétisé. Cet oligonucléotide qui contient les sites de restriction
XhoI (5'-CTC GAG-3') et SplI (5'-CGT ACG-3') a été inséré dans le site unique SpeI du plasmide pGA102 (Figure 34) comportant la séquence codant pour ltépitope
A du virus GET (Figure 27). Dans la construction finale l'épitope TGEV C a donc été placé immédiatement en amont de l'épitope TGEV A.Le plasmide résultant de la coinsertion de ces deux épitope est le pGCA 102
b.l) Un oligonucléotide de 36 mer double brin non phosphorylé de séquence (51 - CTA GCG ACT CGA GCT TCT TTT CGT ACG GTG AGA TTC - 3'
3' - GC TGA GCT CGA AGA ARA GCA TGC CAC TCT AAG GAT C - 5') codant pour l'épitope C de 12 acides aminés (SDSSFFSYGEIP) et comportant un site compatible avec le site SpeI (5'-ACT AGT-3') a été synthétisé. Cet oligonucléotide qui contient les sites de restriction
XhoI (5'-CTC GAG-3') et SplI (5'-CGT ACG-3') a été inséré dans le site unique SpeI du plasmide pGA102 (Figure 34) comportant la séquence codant pour ltépitope
A du virus GET (Figure 27). Dans la construction finale l'épitope TGEV C a donc été placé immédiatement en amont de l'épitope TGEV A.Le plasmide résultant de la coinsertion de ces deux épitope est le pGCA 102
<tb> NH2-ClpG-NKTSDSSFFSYGE <SEP> P <SEP> PSrKRSGYGQPm <SEP> GDL-ClpG-COOH
<tb> <SEP> I <SEP> Epitope <SEP> I <SEP> ( <SEP> Epitope
<tb> <SEP> TGEV <SEP> C <SEP> TGEV <SEP> A
<tb>
Les protéines ClpG hybrides ont été testées par immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40), un anticorps monoclonal anti-site A du GET et l'anticorps Mab 3b5 spécifique de l'épitope C. Deux techniques immunologiques ont été utilisées, l'immunodétection in situ des protéines hybrides natives sur colonies, et l'immunodétection des protéines hybrides dénaturées sur Western blots (Figure 40).
<tb> <SEP> I <SEP> Epitope <SEP> I <SEP> ( <SEP> Epitope
<tb> <SEP> TGEV <SEP> C <SEP> TGEV <SEP> A
<tb>
Les protéines ClpG hybrides ont été testées par immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40), un anticorps monoclonal anti-site A du GET et l'anticorps Mab 3b5 spécifique de l'épitope C. Deux techniques immunologiques ont été utilisées, l'immunodétection in situ des protéines hybrides natives sur colonies, et l'immunodétection des protéines hybrides dénaturées sur Western blots (Figure 40).
Les résultats indiquent une très bonne immunoréactivité du trihybride NH2-ClpG-épitope TGEV Cépitope TGEV A-ClpG-COOH, avec les trois anticorps.
Cependant, les résultats obtenus sur Western blots avec des anticorps polyclonaux anti-CS31A indiquent qu'une sous-population de ce trihybride est tronquée au niveau de l'épitope TGEV A. En effet, deux bandes ont été visualisées sur Western blots; une bande supérieure dominante correspondant au trihybride complet et une bande inférieure faible correspondant seulement à la partie protéique de ClpG située en amont de l'épitope
TGEV A.
TGEV A.
b.2) Un oligonucléotide (36mer) double brin non phosphorylé de séquence (5' - TCG ATG AAG AGA TCT GGC TAT GGT CAG CCT ATT GCG - 3'
3' - AC TTC TCT AGA CCG ATA CCA GTC GGA TA CGC AGC T - 5') codant pour l'épitope A du GET de 12 acides aminés (SMKRSGYGQPIA) et comportant un site compatible avec
XhoI (5'-CTC GAG- 3') à chacune de ses extrémités a été synthétisé. Cet oligonucléotide qui contient le site unique BglII (5'-AGA TCT- 3') a été inséré dans le site unique XhoI du plasmide recombinant pGC326, situé en amont de la séquence codant pour l'épitope TGEV C (chapitre H, paragraphe I).La coinsertion des épitopes
A et C du GET correspond à une séquence hétérologue additionnelle de 24 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
3' - AC TTC TCT AGA CCG ATA CCA GTC GGA TA CGC AGC T - 5') codant pour l'épitope A du GET de 12 acides aminés (SMKRSGYGQPIA) et comportant un site compatible avec
XhoI (5'-CTC GAG- 3') à chacune de ses extrémités a été synthétisé. Cet oligonucléotide qui contient le site unique BglII (5'-AGA TCT- 3') a été inséré dans le site unique XhoI du plasmide recombinant pGC326, situé en amont de la séquence codant pour l'épitope TGEV C (chapitre H, paragraphe I).La coinsertion des épitopes
A et C du GET correspond à une séquence hétérologue additionnelle de 24 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
<tb> T <SEP> SD <SEP> SMKRS <SEP> GY <SEP> GQP <SEP> I <SEP> AS <SEP> F <SEP> FS <SEP> Y <SEP> GEIP
<tb> <SEP> Epitope <SEP> - <SEP> Il <SEP> Epitope
<tb> <SEP> TGEV <SEP> A <SEP> TGEV <SEP> C
<tb> <SEP> + <SEP> 24 <SEP> acides <SEP> aminés
<tb>
La construction finale a conduit à l'obtention du plasmide pGAC326. L'immunodétection des protéines trihybrides dénaturées sur Western blots avec un sérum anti-CS31A natif et des anticorps anti-TGEV A et anti-TGEV C montre que le CS31A est exprimé par les bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 + pGAC326.
<tb> <SEP> Epitope <SEP> - <SEP> Il <SEP> Epitope
<tb> <SEP> TGEV <SEP> A <SEP> TGEV <SEP> C
<tb> <SEP> + <SEP> 24 <SEP> acides <SEP> aminés
<tb>
La construction finale a conduit à l'obtention du plasmide pGAC326. L'immunodétection des protéines trihybrides dénaturées sur Western blots avec un sérum anti-CS31A natif et des anticorps anti-TGEV A et anti-TGEV C montre que le CS31A est exprimé par les bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 + pGAC326.
Cependant, une large population de protéines trihybrides semble être tronquée au niveau de ltépitope A. Trois bandes ont été visualisées sur Western blots avec le polyclonal anti-CS31A; une bande supérieure mineure correspondant au trihybride complet, une large bande intermédiaire correspondant à la partie protéique située en amont de l'épitope TGEV A et une bande inférieure faible correspondant à la partie protéique de ClpG située en aval de l'épitope TGEV A.
2) Coinsertion de 1'épitope TGEV C et de 1'épitope C3 du VP1 du virus de la polio type 1
A partir du plasmide pGISA (figure 39) et pP101 figure 34) les séquences nucléotidiques codant pour l'épitope TGEV C et l'épitope C3 de VP1 ont été simultanément replacées par clonage moléculaire dans l'opéron CS31A qui avait été préalablement cloné dans le plasmide pHSG575 (Martin et al., 1991). La construction finale conduit à l'obtention du plasmide pPOGI1011. Dans cette construction l'épitope TGEV C est situé entre le peptide signal et le peptide mature de ClpG entre les acides aminés -1 et +1 des figures 9 et 32, et l'épitope
C3 du VP1 dans la région V3 du ClpG entre les acides aminés situés dans les figures 9 et 39 aux positions 202 et 215.L'étude de l'expression de la protéine ClpG comportant à la fois l'épitope TGEV C et l'épitope C3 du
VP1 a montré que la biogènèse de CS31A était détectable mais faible. En effet, les résultats obtenus en Western immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif (Figure 40) et avec l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 spécifique de l'épitope TGEV C indiquent une baisse du niveau d'expression du ClpG par rapport à la protéine homologue non modifiée.
A partir du plasmide pGISA (figure 39) et pP101 figure 34) les séquences nucléotidiques codant pour l'épitope TGEV C et l'épitope C3 de VP1 ont été simultanément replacées par clonage moléculaire dans l'opéron CS31A qui avait été préalablement cloné dans le plasmide pHSG575 (Martin et al., 1991). La construction finale conduit à l'obtention du plasmide pPOGI1011. Dans cette construction l'épitope TGEV C est situé entre le peptide signal et le peptide mature de ClpG entre les acides aminés -1 et +1 des figures 9 et 32, et l'épitope
C3 du VP1 dans la région V3 du ClpG entre les acides aminés situés dans les figures 9 et 39 aux positions 202 et 215.L'étude de l'expression de la protéine ClpG comportant à la fois l'épitope TGEV C et l'épitope C3 du
VP1 a montré que la biogènèse de CS31A était détectable mais faible. En effet, les résultats obtenus en Western immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif (Figure 40) et avec l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 spécifique de l'épitope TGEV C indiquent une baisse du niveau d'expression du ClpG par rapport à la protéine homologue non modifiée.
3) Coinsertion des épitopes A et C du TGEV et de l'épitope C3 du VP1 de la polio type 1
Un oligonucléotide (36 mer) doule brin non phosphorylé de séquence
(5' - G AAA AGA TCT GGT TAT GGA CAG CCG ATT GCA GTG CA - 3'
3' - AC GTC TTT TCT AGA CCA ATA CCT GTC GTC GGC TAA CGT C - 5' > codant pour l'épitope A de 12 acides aminés (KRSGYGQPIAVH) et comportant un site compatible avec le site NsiI (5'-ATG CAT-3') à chacune de ces extrémités a été synthétisé.
Un oligonucléotide (36 mer) doule brin non phosphorylé de séquence
(5' - G AAA AGA TCT GGT TAT GGA CAG CCG ATT GCA GTG CA - 3'
3' - AC GTC TTT TCT AGA CCA ATA CCT GTC GTC GGC TAA CGT C - 5' > codant pour l'épitope A de 12 acides aminés (KRSGYGQPIAVH) et comportant un site compatible avec le site NsiI (5'-ATG CAT-3') à chacune de ces extrémités a été synthétisé.
Cet oligonucléotide qui contient le site BglII (5'-AGA
TCT-3') a été inséré dans le site unique NsiI du plasmide recombinant pPOGI1011 (chapitre H, paragraphe
IV). Ce plasmide contient la séquence nucléotidique codant pour l'épitope C3 du VP1 situé dans la région V3 de ClpG (entre les acides aminés situés aux positions 202 et 215 des figures 9 et 32) et celle codant pour l'épitope TGEV C situé entre le peptide signal et le peptide mature du ClpG (entre les acides aminés situés aux positions -1 et +1 des figures 9 et 32). Le site
NsiI est situé immédiatement en aval de la séquence codant pour l'épitope TGEV C. Le plasmide résultant de cette construction est le pPOGCA 101.Ainsi la coinsertion des épitopes TGEV C, TGEV A et de l'épitope
C3-polio dans ClpG correspond à une séquence hétérologue additionnelle de 26 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
TCT-3') a été inséré dans le site unique NsiI du plasmide recombinant pPOGI1011 (chapitre H, paragraphe
IV). Ce plasmide contient la séquence nucléotidique codant pour l'épitope C3 du VP1 situé dans la région V3 de ClpG (entre les acides aminés situés aux positions 202 et 215 des figures 9 et 32) et celle codant pour l'épitope TGEV C situé entre le peptide signal et le peptide mature du ClpG (entre les acides aminés situés aux positions -1 et +1 des figures 9 et 32). Le site
NsiI est situé immédiatement en aval de la séquence codant pour l'épitope TGEV C. Le plasmide résultant de cette construction est le pPOGCA 101.Ainsi la coinsertion des épitopes TGEV C, TGEV A et de l'épitope
C3-polio dans ClpG correspond à une séquence hétérologue additionnelle de 26 acides aminés par rapport à la protéine ClpG originelle
<tb> <SEP> NH2-ClpG-| <SEP> TGEV <SEP> C <SEP> -TGEVA----C3polio-CîpG-CooH
<tb> <SEP> | <SEP> IKQr;f <SEP> I <SEP> NPAST <SEP> I,
<tb> I <SEP> I
<tb> AAD <SEP> S <SEP> SFFSYGElMQKRSGYGQP <SEP> tAHAW
<tb> +1
<tb>
Les résultats obtenus en Western immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40) et avec les anticorps monoclonaux anti-sites A ou C du GET indiquent une baisse importante du niveau d'expression du tetrahybride, NH2-ClpG-TGEV C-TGEV A
C3 polio-ClpG, par rapport à la protéine ClpG non modifiée et même par rapport à l'ensemble des trihybrides obtenus.
<tb> <SEP> | <SEP> IKQr;f <SEP> I <SEP> NPAST <SEP> I,
<tb> I <SEP> I
<tb> AAD <SEP> S <SEP> SFFSYGElMQKRSGYGQP <SEP> tAHAW
<tb> +1
<tb>
Les résultats obtenus en Western immunoblotting avec un sérum anti-CS31A natif (figure 40) et avec les anticorps monoclonaux anti-sites A ou C du GET indiquent une baisse importante du niveau d'expression du tetrahybride, NH2-ClpG-TGEV C-TGEV A
C3 polio-ClpG, par rapport à la protéine ClpG non modifiée et même par rapport à l'ensemble des trihybrides obtenus.
I) CONCLUSION CONCERNANT L'INSERTION
D'EPITOPES VIRAUX DANS LA PROTEINE CLPG
Parmi les 4 régions A, B, C et D permissives pour les insertions ou substitutions hétérologues, le clonage d'ADN synthétiques correspondant à différents épitopes viraux a été réalisé dans les régions A, C et
D.
D'EPITOPES VIRAUX DANS LA PROTEINE CLPG
Parmi les 4 régions A, B, C et D permissives pour les insertions ou substitutions hétérologues, le clonage d'ADN synthétiques correspondant à différents épitopes viraux a été réalisé dans les régions A, C et
D.
1) Dans la
Des constructions par insertion ont été obtenues selon deux stratégies différentes (insertions après mutagénèse au hasard ou insertions dirigées par clonage direct) . Dans les deux cas la séquence correspondant à l'épitope C du virus GET a été clonée en position N-terminale entre le peptide signal et la peptide mature de la pré-protéine ClpG (entre les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -1 et +1).
Des constructions par insertion ont été obtenues selon deux stratégies différentes (insertions après mutagénèse au hasard ou insertions dirigées par clonage direct) . Dans les deux cas la séquence correspondant à l'épitope C du virus GET a été clonée en position N-terminale entre le peptide signal et la peptide mature de la pré-protéine ClpG (entre les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -1 et +1).
Dans les deux cas, la protéine hybride, ClpG-épitope C du virus GET, est produite en quantité importante et l'épitope est reconnu par l'anticorps monoclonal chez la protéine hybride sous sa forme native.
Dans quelques cas, des séquences peptidiques hétérologues de 5 à 20 acides aminés ont été introduites par insertion ou substitution après mutagénèse au hasard dans la préprotéine ClpG entre les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -13 et +8 sans perturber la biogénèse de CS31A.
2) Dans la région C
Cinq constructions différentes comportant la séquence correspondant à l'épitope C du virus GE-T (pGC32, pGC19, pGC1, pGC4 et pGC44) et une sixième construction (pF1) codant pour un épitope de la protéine
VP1 du virus de la fièvre aphteuse, ont été obtenues par insertion ou substitution. Dans tous les cas, la biogénèse de la protéine capsulaire hybride CS31Aépitope est affectée, les sous-unités protéiques n'étant plus exportées et polymérisées à la surface de la bactérie.
Cinq constructions différentes comportant la séquence correspondant à l'épitope C du virus GE-T (pGC32, pGC19, pGC1, pGC4 et pGC44) et une sixième construction (pF1) codant pour un épitope de la protéine
VP1 du virus de la fièvre aphteuse, ont été obtenues par insertion ou substitution. Dans tous les cas, la biogénèse de la protéine capsulaire hybride CS31Aépitope est affectée, les sous-unités protéiques n'étant plus exportées et polymérisées à la surface de la bactérie.
3) Dans la réaion D
Dans cette région ont été obtenues
a) Par substitution
- Trois constructions comportant la séquence correspondant à l'épitope C du virus GET (pGG103, pGP105, pGP684), 2 constructions avec la séquence codant pour l'épitope C3 du virus polio (pP101 et pP688), une construction avec la séquence de l'épitope A du GET (pGA102) et une avec la séquence de l'épitope du rotavirus bovin (pR104), et enfin une construction avec la séquence correspondant à un épitope de VP1 du virus de la fièvre aphteuse (pF681). Les plasmides pGG103, pGP105 et pGP684 permettent d'obtenir une bonne expression des protéines hybrides, CS31A-épitope C du
GET, à la surface de la bactérie.Avec les 3 plasmides l'épitope C du virus GET est reconnu par l'anticorps monoclonal dans la protéine hybride sous sa forme native. Avec les constructions codant pour les protéines hybrides CS31A-épitope C3 du virus polio, le plasmide pP1Ol permet une bonne expression de la protéine hybride mais elle est faible avec pP688. Avec la construction codant pour un épitope de VP1 du virus de la fièvre aphteuse (pF681), l'expression de la protéine hybride est faible. Elle est proche de celle du témoin avec celles codant pour l'épitope A du GET (pGA102) ou l'épitope du rotavirus bovin (pR104).
Dans cette région ont été obtenues
a) Par substitution
- Trois constructions comportant la séquence correspondant à l'épitope C du virus GET (pGG103, pGP105, pGP684), 2 constructions avec la séquence codant pour l'épitope C3 du virus polio (pP101 et pP688), une construction avec la séquence de l'épitope A du GET (pGA102) et une avec la séquence de l'épitope du rotavirus bovin (pR104), et enfin une construction avec la séquence correspondant à un épitope de VP1 du virus de la fièvre aphteuse (pF681). Les plasmides pGG103, pGP105 et pGP684 permettent d'obtenir une bonne expression des protéines hybrides, CS31A-épitope C du
GET, à la surface de la bactérie.Avec les 3 plasmides l'épitope C du virus GET est reconnu par l'anticorps monoclonal dans la protéine hybride sous sa forme native. Avec les constructions codant pour les protéines hybrides CS31A-épitope C3 du virus polio, le plasmide pP1Ol permet une bonne expression de la protéine hybride mais elle est faible avec pP688. Avec la construction codant pour un épitope de VP1 du virus de la fièvre aphteuse (pF681), l'expression de la protéine hybride est faible. Elle est proche de celle du témoin avec celles codant pour l'épitope A du GET (pGA102) ou l'épitope du rotavirus bovin (pR104).
- Trois constructions comportant une séquence hétérologue de 41 acides aminés (plasmide pDBB10), de 84 acides aminés (plasmide pDHS68) et de 100 acides aminés (plasmide pDSX68) . Ces trois différentes séquences hétérologues ont été insérées dans la partie -COOH terminale de la protéine ClpG par substitution d'un fragment peptidique délimité dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 190 et 257, et plus précisément
entre les acides aminés situés aux positions 216 et 257 pour pDBB10,
entre les acides aminés situés aux positions 190 et 257 pour pDHS68,
entre les acides aminés situés aux positions 198 et 257 pour pDSX68.
entre les acides aminés situés aux positions 216 et 257 pour pDBB10,
entre les acides aminés situés aux positions 190 et 257 pour pDHS68,
entre les acides aminés situés aux positions 198 et 257 pour pDSX68.
Parmi ces 3 constructions n'abolissant pas la biogénèse de CS31A, celle correspondant au plasmide pDBB10 permet une meilleure expression de ClpG.
b) Par insertion
Une construction comportant la séquence correspondant à l'épitope C du virus GET (plasmide pGC326) entre les acides aminés de ClpG situés dans la figure 9 aux positions 203 et 204. La protéine hybride
ClpG-épitope C, qui est fortement reconnue par les anticorps polyclonaux anti-CS31A et l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 anti-épitope C, est largement exprimée à la surface des bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 et pGC326.
Une construction comportant la séquence correspondant à l'épitope C du virus GET (plasmide pGC326) entre les acides aminés de ClpG situés dans la figure 9 aux positions 203 et 204. La protéine hybride
ClpG-épitope C, qui est fortement reconnue par les anticorps polyclonaux anti-CS31A et l'anticorps monoclonal Mab 3b.5 anti-épitope C, est largement exprimée à la surface des bactéries hébergeant les plasmides pDSPH524 et pGC326.
Enfin plusieurs séquences hétérologues correspondant soit à deux épitopes différents d'un même virus (épitope TGEV A et TGEV C), soit à deux épitopes différents d'un même virus (TGEV A + TGEV C) plus un épitope d'un autre virus (épitope C3 de VP1 du virus polio type 1) ont été coinsèrées avec succès dans la même protéine ClpG sans perturber la biogènèse de CS31A.
Les trihybrides, TGEV A-TGEV C-ClpG, ont été obtenus en coinsérant les épitopes TGEV A et TGEV C soit en position N-terminale (région A), soit dans la région V3 de ClpG (région D). Un tetrapeptide, TGEV A-TGEV C-C3 polio-ClpG, a été obtenu en coinsérant les épitopes TGEV
A et TGEV C en position N-terminale et l'épitope C3 polio dans la région V3. Toutes les protéines trihybrides sont reconnues à la fois par les anticorps monoclonaux anti-TGEV A et anti-TGEV C et par l'anticorps polyclonal anti-ClpG. Par contre le tetrahybride est reconnu fortement par l'anticorps polyclonal anti-ClpG, faiblement par l'anticorps monoclonal anti-TGEV C mais pas par l'anticorps anti
TGEV A.
A et TGEV C en position N-terminale et l'épitope C3 polio dans la région V3. Toutes les protéines trihybrides sont reconnues à la fois par les anticorps monoclonaux anti-TGEV A et anti-TGEV C et par l'anticorps polyclonal anti-ClpG. Par contre le tetrahybride est reconnu fortement par l'anticorps polyclonal anti-ClpG, faiblement par l'anticorps monoclonal anti-TGEV C mais pas par l'anticorps anti
TGEV A.
J) IMMUNOGENICITE DES PROTEINES HYBRIDES
MESUREE PAR LA PRODUCTION D'ANTICORPS ANTI-CS31A ET
ANTI-EPITOPE C DU GET APRES IMMUNISATION DE SOURIS
Des bactéries entières produisant des protéines hybrides ont été inoculées à des lots de 5 souris Swiss de lignée OF1 non consanguines selon les différents protocoles d'immunisation suivants
Protocole 1
J0 : 6.108 bactéries dans 0,3 ml d'un mélange à parties égales d'eau physiologique (phy) et d'adjuvant incomplet de Freund (AIF).
MESUREE PAR LA PRODUCTION D'ANTICORPS ANTI-CS31A ET
ANTI-EPITOPE C DU GET APRES IMMUNISATION DE SOURIS
Des bactéries entières produisant des protéines hybrides ont été inoculées à des lots de 5 souris Swiss de lignée OF1 non consanguines selon les différents protocoles d'immunisation suivants
Protocole 1
J0 : 6.108 bactéries dans 0,3 ml d'un mélange à parties égales d'eau physiologique (phy) et d'adjuvant incomplet de Freund (AIF).
J22 : 2.108 bactéries dans 0,1 ml du mélange phy/AIF.
J36 : 2.108 bactéries dans 0,1 ml du mélange phy/AIF.
Protocole 2
J0 : 6.108 bactéries dans 0,3 ml d'un mélange à parties égales d'eau physiologique (phy) et d'adjuvant incomplet de Freund (AIF).
J0 : 6.108 bactéries dans 0,3 ml d'un mélange à parties égales d'eau physiologique (phy) et d'adjuvant incomplet de Freund (AIF).
J22 : 2.108 bactéries dans 0,lml du mélange phy/AIF.
Protocole 3
J0 : 2.108 bactéries dans 0,1 ml du mélange à parties égales phy/AIF.
J0 : 2.108 bactéries dans 0,1 ml du mélange à parties égales phy/AIF.
J7 : 2.108 bactéries dans 0,1 ml du mélange à parties égales phy/AIF.
J14 : 2.108 bactéries dans 0,1 ml du mélange à parties égales phy/AIF.
Les titres en anticorps anti-CS31A ont été mesurés selon une méthode ELISA indirecte. Dans les puits des plaques ELISA sensibilisés avec la protéine
CS31A purifiée, des dilutions au 1/2 du sérum des souris sont ajoutées. Après incubation puis lavage, on fait agir des anti-IgG de souris marquées à la péroxydase.
CS31A purifiée, des dilutions au 1/2 du sérum des souris sont ajoutées. Après incubation puis lavage, on fait agir des anti-IgG de souris marquées à la péroxydase.
Après incubation et lavage, les IgG sont révèlées par H2O2 en présence de 2-2'-azino-bis(3éthylbenzthiazoline-6-sulfonic acide) dénommé ABTS, puis on lit l'intensité de la coloration à 405 nm. Le titre en anticorps est défini à partir des courbes de titration.
Les titres des anticorps dirigés contre le peptide hétérologue introduit dans CS31A sont mesurés selon cette même méthode, mais en sensibilisant les plaques ELISA soit avec un peptide synthétique, soit avec les particules virales du GET. Les mesures ont été effectuées avec le peptide correspondant à l'épitope du site C du GET de séquence : TVSDSSFFSYGEIPF.
Les résultats obtenus avec des lots de cinq souris inoculées selon les protocoles d'immunisation 1, 2 ou 3 sont rassemblés dans le tableau 7 ci-dessous.
Tableau 7
<tb> Inoculation <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> Titre <SEP> des <SEP> anticorps <SEP> dans <SEP> le <SEP> sérum <SEP> de
<tb> produisant <SEP> CS31A <SEP> recombinant <SEP> 5 <SEP> souris, <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> après <SEP> la <SEP> dernière
<tb> ou <SEP> non <SEP> inoculation <SEP> selon <SEP> les <SEP> protocoles
<tb> <SEP> d'immunisation <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> ou <SEP> 3.
<tb>
<tb> produisant <SEP> CS31A <SEP> recombinant <SEP> 5 <SEP> souris, <SEP> 10 <SEP> jours <SEP> après <SEP> la <SEP> dernière
<tb> ou <SEP> non <SEP> inoculation <SEP> selon <SEP> les <SEP> protocoles
<tb> <SEP> d'immunisation <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> ou <SEP> 3.
<tb>
<SEP> A <SEP> : <SEP> anti-CS31A; <SEP>
<tb> <SEP> B <SEP> : <SEP> anti-peptide <SEP> GET <SEP> site <SEP> C.
<tb>
<tb> <SEP> B <SEP> : <SEP> anti-peptide <SEP> GET <SEP> site <SEP> C.
<tb>
<SEP> C <SEP> : <SEP> anti-particules <SEP> virales <SEP> GET
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Témoin <SEP> pPSX83 <SEP> dans <SEP> A <SEP> 4096 <SEP> 4096 <SEP> 4096 <SEP> 2048 <SEP> 4096
<tb> E. <SEP> coli <SEP> JM <SEP> 109 <SEP> B <SEP> O <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> 0
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> C <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> 0
<tb> Epitope <SEP> GET <SEP> site <SEP> C <SEP> dans <SEP> la <SEP> A <SEP> 512 <SEP> 1024 <SEP> 1024 <SEP> NF <SEP> 512
<tb> région <SEP> A <SEP> (E. <SEP> coli <SEP> DH5a) <SEP> B <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> Protocole <SEP> 3 <SEP> C <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O
<tb> Epitope <SEP> GET <SEP> site <SEP> C <SEP> dans <SEP> la <SEP> A <SEP> <SEP> 32 <SEP> 2048 <SEP> 1024 <SEP> 256 <SEP> 32
<tb> région <SEP> A <SEP> (E.<SEP> coli <SEP> DH5a) <SEP> B <SEP> NF <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> 0
<tb> Protocole <SEP> 3 <SEP> C <SEP> NF <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> I <SEP> A <SEP> <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> 4096 <SEP> 8192 <SEP> 8192
<tb> <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> pGG103 <SEP> (E.<SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> í <SEP> A <SEP> 2048 <SEP> 4096 <SEP> 16000 <SEP> 16000 <SEP> 16000
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> 64 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> Protocole <SEP> 2 <SEP> A <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> 2048 <SEP> 2048 <SEP> 8192
<tb> <SEP> B <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 528 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> pGP105 <SEP> (E. <SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> I <SEP> A <SEP> <SEP> 2048 <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> 128 <SEP> 384
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 128 <SEP> 528 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> O <SEP> 0
<tb> pGP684 <SEP> (E.<SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> I <SEP> A <SEP> <SEP> 256 <SEP> 528 <SEP> 384 <SEP> 384 <SEP> 528
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 28 <SEP> 0 <SEP> 64
<tb> <SEP> C <SEP> 0 <SEP> 500 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> pGP684 <SEP> (E. <SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> A <SEP> NF <SEP> NF <SEP> NF <SEP> NF <SEP> NF
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 256 <SEP> 32 <SEP> 128 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Dans le tableau 7, les lignes A correspondent aux titres anti-CS31A, les lignes B aux titres anti-peptide GET site C, les lignes C aux titres anti-particules virales GET (NF, indique les titrage qui n'ont pas été faits).
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Témoin <SEP> pPSX83 <SEP> dans <SEP> A <SEP> 4096 <SEP> 4096 <SEP> 4096 <SEP> 2048 <SEP> 4096
<tb> E. <SEP> coli <SEP> JM <SEP> 109 <SEP> B <SEP> O <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> 0
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> C <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> 0
<tb> Epitope <SEP> GET <SEP> site <SEP> C <SEP> dans <SEP> la <SEP> A <SEP> 512 <SEP> 1024 <SEP> 1024 <SEP> NF <SEP> 512
<tb> région <SEP> A <SEP> (E. <SEP> coli <SEP> DH5a) <SEP> B <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> Protocole <SEP> 3 <SEP> C <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O
<tb> Epitope <SEP> GET <SEP> site <SEP> C <SEP> dans <SEP> la <SEP> A <SEP> <SEP> 32 <SEP> 2048 <SEP> 1024 <SEP> 256 <SEP> 32
<tb> région <SEP> A <SEP> (E.<SEP> coli <SEP> DH5a) <SEP> B <SEP> NF <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> 0
<tb> Protocole <SEP> 3 <SEP> C <SEP> NF <SEP> O <SEP> O <SEP> O <SEP> O
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> I <SEP> A <SEP> <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> 4096 <SEP> 8192 <SEP> 8192
<tb> <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> pGG103 <SEP> (E.<SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> í <SEP> A <SEP> 2048 <SEP> 4096 <SEP> 16000 <SEP> 16000 <SEP> 16000
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> 64 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> Protocole <SEP> 2 <SEP> A <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> 2048 <SEP> 2048 <SEP> 8192
<tb> <SEP> B <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 528 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> pGP105 <SEP> (E. <SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> I <SEP> A <SEP> <SEP> 2048 <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> 128 <SEP> 384
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 128 <SEP> 528 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O <SEP> O <SEP> 0
<tb> pGP684 <SEP> (E.<SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> I <SEP> A <SEP> <SEP> 256 <SEP> 528 <SEP> 384 <SEP> 384 <SEP> 528
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 28 <SEP> 0 <SEP> 64
<tb> <SEP> C <SEP> 0 <SEP> 500 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> pGP684 <SEP> (E. <SEP> coli <SEP> JM109) <SEP> A <SEP> NF <SEP> NF <SEP> NF <SEP> NF <SEP> NF
<tb> Protocole <SEP> 1 <SEP> B <SEP> 0 <SEP> 256 <SEP> 32 <SEP> 128 <SEP> 0
<tb> <SEP> C <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Dans le tableau 7, les lignes A correspondent aux titres anti-CS31A, les lignes B aux titres anti-peptide GET site C, les lignes C aux titres anti-particules virales GET (NF, indique les titrage qui n'ont pas été faits).
Les réponses anti-CS31A montrent que le protocole d'immunisation 1 est le plus efficace. Les bactéries hébergeant les plasmides pGG103 ou pGP105 induisent une production d'anticorps anti-CS31A en quantité aussi et même plus importante que la bactérie témoin avec le plasmide pPSX83. Les bactéries recombinantes qui produisent des protéines hybrides en faible quantité comme E. coli JM109 avec les plasmides pP688 ou pF681 induisent une réponse anti-CS31A faible (titres de 1/50 à 1/400), ces résultats ne figurant pas dans le tableau 7.
Des anticorps dirigés contre le peptide correspondant à l'épitope du site C du GET ont été produits chez une partie des souris immunisées avec des bactéries recombinantes. Avec le test ELISA antipeptide, dans le cas où le peptide est situé dans la région V3 de CS31A (plasmides pGG103, pGP105, pGP684) 9 souris sur 25 ont des anticorps reconnaissant le peptide. Le résultat est positif pour une souris sur 14 immunisées avec la protéine hybride portant l'épitope C dans la région A. Avec le test ELISA anti-particules virales GET, deux souris sur quatorze immunisées avec la protéine hybride CS31A-épitope C du GET en position Nterminale, ont des anticorps reconnaissant le peptide du site C dans l'environnement de la protéine virale. Un résultat positif est obtenu pour trois souris sur 25 lorsqu'elles sont immunisées avec la protéine hybride où l'épitope C du GET est dans la zone V3 de la région D.
L'anticorps mnoclonal Mab 3b.5 anti-site-C du GET titre environ 1/8000 dans le test ELISA antipeptide et 1/3000 dans le test ELISA anti-partcules virales, soit en moyenne seulement 20 à 50 fois plus que le sérum des souris immunisées avec les bactéries recombinantes. L'immunisation des souris a été réalisée avec des bactéries entières et non pas avec des protéines hybrides purifiées ou semi-purifiées. En dépit de la multiplicité des motifs immunogènes à la surface de la bactérie, le système immunitaire a répondu vis à vis de l'épitope C du GET présenté dans l'environnement complexe de la protéine CS31A hybride sur la bactérie.
Les titres des antisérums ne sont pas corrélés selon que l'on détecte des anticorps anti-peptide ou des anticorps anti-protéine virale. Ceci signifie que parmi les différents anticorps susceptible d'être induits en immunisant des animaux différents contre un même motif antigénique dans un environnement protéique donné, ce ne sont pas des anticorps identiques qui reconnaissent la conformation du peptide isole et celle de ce même peptide dans l'environnement de la protéine virale.
Enfin, une partie seulement des souris a produit des anticorps contre le peptide. Ce résultat était prévisible puisqu'il a été utilisé une lignée non consanguine où varient le complexe majeur d'histocompatibilité et le répertoire immunologique des souris. Cet aspect de la réponse immunitaire souligne la nécessité d'otenir des bactéries recombinantes exprimant plusieurs épitopes vaccinants contre un même pathogène afin de pouvoir élargir la protection à la majorité des animaux vaccinés. Comme cela a été décrit précédemment des bactéries recombinantes exprimant les épitopes A et
C du GET ont été obtenues. Il est envisageable d'introduire un troisième épitope du GET. Une autre alternative permettant de présenter plusieurs motifs immunogènes d'un même virus, consiste à vacciner les animaux avec un mélange de bactéries recombinantes portant des épitopes vaccinants différents.
C du GET ont été obtenues. Il est envisageable d'introduire un troisième épitope du GET. Une autre alternative permettant de présenter plusieurs motifs immunogènes d'un même virus, consiste à vacciner les animaux avec un mélange de bactéries recombinantes portant des épitopes vaccinants différents.
Références
- B. A. D. Stocker (1990). Res. Microbiol., AI, 787-796.
- B. A. D. Stocker (1990). Res. Microbiol., AI, 787-796.
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Microbiol., AI, 1013-1017.
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C. Leclerc, S. Van Der Werf, C. Nanciel, M. Hofnung (1990). Res. Microbiol., AI, 963-969.
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O'Connor (1990). Res. Microbiol., AI, 1009-1012.
- S. Pistor, G. Hobom (1990) . Res.
Microbiol., 141, 879-881.
Claims (21)
1) Sous-unité de la capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue.
2) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés comprend au moins une insertion d'un peptide hétérologue et/ou au moins une substitution par un peptide hétérologue.
3) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon l'une des revendication 1 et 2, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est modifiée au niveau d'au moins une des régions suivante
- région recouvrant le peptide signal et l'extrémité N-terminale de la protéine mature délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux position -13 et +8;
- région délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 58;
- région délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 123 et 164;
- région délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 183 et 257.
4) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon la revendication 3, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est modifiée entre les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -1 et +1.
5) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon la revendication 3, caractérisée en que sa séquence en acides aminés est modifiée au niveau de l'un au moins des épitopes délimités dans la figure 9 par les acides aminés situés d'une part aux positions 10 et 19 et d'autre part 38 et 58.
6) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon la revendication 3, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est modifiée au niveau de l'épitope délimité dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 151 et 160.
7) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon la revendication 3, caractérisée en que sa séquence en acides aminés est modifiée au niveau de l'un au moins des épitopes délimités dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 188 et 196, 211 et 219, 223 et 231 et 235 et 246.
8) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue provenant de bactéries, de parasites ou de virus.
9) Sous-unité d'une capsule protéique CS31A selon la revendication 8, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue choisi parmi : l'épitope C ou l'épitope A du virus de la gastroentérite transmissible du porc, un épitope de la protéine VP6 du rotavirus bovin, l'épitope C3 du virus polio, un épitope de la protéine VP1 du virus de la fièvre afteuse.
10) Procédé d'obtention d'une sous-unité d'une capsule protéique CS31A dont la séquence en acides aminés est modifiée par au moins un peptide hétérologue selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on introduit dans le gène codant pour la sousunité au moins un fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue est introduit par clonage dans le gène codant pour la sous-unité après mutagénèse dirigée conduisant à la création de sites de restriction, par clonage dans des sites de restriction introduits par mutagénèse insertionnelle au hasard, ou par insertion dirigée d'un épitope hétérologue entre le peptide signal et le peptide mature de la pré-protéine de la sousunité.
12) Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue est introduit au niveau du segment du gène codant pour l'une des régions suivantes de la sous-unité
- région recouvrant le peptide signal et l'extrémité N-terminale de la protéine mature délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions -13 et + 8;
- région délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 10 et 58;
- région délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 123 et 164;
- région délimitée par les acides aminés situés dans la figure 9 aux positions 183 et 257.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue est introduit au niveau du segment du gène codant pour la région de la sous-unité délimitée dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions -1 et +1.
14) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue est introduit au niveau du segment du gène codant pour l'une des régions de la sous-unité délimitées dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 10 et 19 et 38 et 58.
15) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue est introduit au niveau du segment du gène codant pour la région de la sous-unité délimitée dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 151 et 160.
16) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour un peptide hétérologue est introduit au niveau du segment du gène codant pour la région de la sous-unité délimitée dans la figure 9 par les acides aminés situés aux positions 188 et 196, 211 et 219, 223 et 131 et 235 et 246.
17) Capsule protéique CS31A comportant une sous-unité selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
18) Micro-organisme ayant une membrane externe portant des capsules protéiques CS31A selon la revendication 17.
19) Composition a activité immunogène comprenant en tant que principe actif au moins une sousunité d'une capsule protéique selon l'une des revendications 1 à 9, ou une capsule protéique selon la revendication 17, ou au moins un micro-organisme selon la revendication 18.
20) Utilisation d'une composition immunogène selon la revendication 19 pour la préparation de vaccins.
21) Utilisation d'une composition immunogène selon la revendication 20 pour la préparation de tests immunologiques.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9215464A FR2699538B1 (fr) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | Sous-unité d'une capsule protéique CS31A modifiée par au moins un peptide hétérologue, capsule protéique CS31A et microorganismes portant ces sous-unités; procédés d'obtention et utilisation de ceux-ci. |
| AU68087/94A AU6808794A (en) | 1992-12-22 | 1993-12-21 | cs31a protein capsule subunit modified by at least one heterologous peptide, cs31a protein capsule comprising said subunit, micro-organisms having such subunits on their outer membrane, and methods for preparing and using same |
| EP94903914A EP0684996A1 (fr) | 1992-12-22 | 1993-12-21 | Sous-unite d'une capsule proteique cs31a modifiee par au moins un peptide heterologue, capsule proteique cs31a comportant une telle sous-unite et micro-organismes dont la membrane externe porte de telles sous-unites; procedes d'obtention et utilisation de ceux-ci |
| US08/491,954 US6096321A (en) | 1992-12-22 | 1993-12-21 | ClpG subunit of CS31A protein capsule containing heterologous peptides |
| PCT/FR1993/001281 WO1994014967A2 (fr) | 1992-12-22 | 1993-12-21 | Sous-unite d'une capsule proteique cs31a modifiee par au moins un peptide heterologue, capsule proteique cs31a comportant une telle sous-unite et micro-organismes dont la membrane externe porte de telles sous-unites; procedes d'obtention et utilisation de ceux-ci |
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|---|---|---|---|
| FR9215464A Expired - Fee Related FR2699538B1 (fr) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | Sous-unité d'une capsule protéique CS31A modifiée par au moins un peptide hétérologue, capsule protéique CS31A et microorganismes portant ces sous-unités; procédés d'obtention et utilisation de ceux-ci. |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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- 1993-12-21 US US08/491,954 patent/US6096321A/en not_active Expired - Fee Related
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