FR2611723A1 - Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue - Google Patents
Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue Download PDFInfo
- Publication number
- FR2611723A1 FR2611723A1 FR8702696A FR8702696A FR2611723A1 FR 2611723 A1 FR2611723 A1 FR 2611723A1 FR 8702696 A FR8702696 A FR 8702696A FR 8702696 A FR8702696 A FR 8702696A FR 2611723 A1 FR2611723 A1 FR 2611723A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- hirudin
- sequence
- vector
- vector according
- coding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
VECTEUR PERMETTANT L'EXPRESSION ET LA SECRETION PAR LES CELLULES DE MAMMIFERES DE MOLECULES D'HIRUDINE, DE SES VARIANTS OU ANALOGUES, SOUS FORME MATURE ET ACTIVE.
Description
La présente invention concerne des vecteurs d'expression dune séquence d'ADN codant pour l'hirudine ou un de ses analogues, la sécrétion de l'hirudine dans le milieu de culture de cellules eucaryotes supérieures contenant ces vecteurs, des procédés permettant d'obtenir une hirudine active & partir de ces cultures ainsi que l'hirudine obtenue.
L'hirudine,-petit peptide à activité anticoagulante présent dans les glandes salivaires des sangsues est un inhibiteur spécifique et très efficace de la thrombine. Son intérêt thérapeutique comme agent anticoagulant est évident. Des séquences codantes correspondant à différentes formes de l'hirudine naturelle ont déjà été clonées et exprimées dans des microorganismes, notamment, dans les bactéries (FR-A-84 04755 et xi/85 04418) et dans les levures (FR-A-85 06672).
Au moins 3 variants naturels de l'nirudine sont décrits dans la littérature (Markwardt 1970 ; Petersen et al. 1976 ; Markwardt et Walsmann 1976 ; Chang 1983 ; Dodt et al. 1984, 1985, 1986 : brevet français FR-A-84 04755).
Le premier variant, HV1, correspond à l'hirudine qu'on isole du corps de la sangsue ; le deuxième, HV2 (Harvey et al. 1986) diffère du premier par 9 acides aminés ; le troisième (Dodt et al. 1986) est identique à HV2 jusqu'à la sérine 32 mais diffère par 10 acides aminés dans la partie Cterminale, qui comprend, en outre, un acide aminé supplémentaire (ala63). Ce troisième variant sera désigné ci-après HV3
D'autre part, divers analogues de ces variants ont été décrits notamment dans le brevet français 86 16723.
D'autre part, divers analogues de ces variants ont été décrits notamment dans le brevet français 86 16723.
Ces variants sont plus particulièrement du type comportant un acide aminé différent de l'acide aminé de la forme naturelle en position 47 ou 63, en particulier [Lys47] HV2 [Arg47] HV2 [His47] HV2 [Glu63] HV2 [Asp63] HV2
Dans ce qui suit, on utilisera la terminologie "variant de l'hirudine" pour désigner les trois formes HV1, HV2 et HV3 et l'expression "analogue" pour-désigner des molécules dont la structure est voisine de celle des variants mais qui comportent des modifications au niveau d'un ou plusieurs acides aminés tout en conservant l'activité anti-thrombinique de l'hirudine.
Dans ce qui suit, on utilisera la terminologie "variant de l'hirudine" pour désigner les trois formes HV1, HV2 et HV3 et l'expression "analogue" pour-désigner des molécules dont la structure est voisine de celle des variants mais qui comportent des modifications au niveau d'un ou plusieurs acides aminés tout en conservant l'activité anti-thrombinique de l'hirudine.
La molécule naturelle d'hirudine est sulfatée sur le résidu tyrosine 63 (Bagdy et al. 1976). Cette modification post-traductionnelle peut avoir des conséquences sur l'activité de l'hirudine comme inhibiteur de la thrombine, comme le suggèrent les études cinétiques de Stone et Hofsteenger (1986). En effet, lorsque l'hirudine est désulfatée, la constante d'inhibition de la réaction hirudine-thrombine est 10 fois plus élevée qu'avec la molécule sulfatée.
D'autre part, un inhibiteur naturel de la thrombine, le co-facteur II de l'héparine (HCII, Briginshaw et al. 1974) contient 2 résidus sulfatés qui jouent un rôle dans l'activité inhibitrice antithrombine (Hortin et al. 1986).
I1 apparaît donc important, à côté des travaux antérieurs, d'exprimer l'hirudine dans des cellules capables de modifier la molécule de la même manière que la molécule naturelle et, en particulier, d'effectuer la sulfatation de la tyrosine.
Différentes cellules de mammifères sont capables d'effectuer la sulfatation des résidus tyrosine (Huttner, 1982 ; Liu et al. 1985).
La présente invention concerne l'expression de l'hirudine dans les cellules eucaryotes supérieures. Celle-ci peut être obtenue en plaçant la séquence codante correspondante, sous forme d'un bloc d'ADN fonctionnel, dans un vecteur approprié. Plus particulièrement, la présente invention concerne un vecteur d'expression de l'hirudine, d'un variant ou d'un analogue de lthirudine, sous forme de protéine mature, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur comportant la séquence d'ADN codant pour l'hirudine en aval d'un bloc d'ADN assurant l'expression de ladite séquence dans les cellules en cause et son excrétion après clivage d'une séquence signal, permettant de libérer, dans le milieu de culture, l'hirudine, ses variants ou analogues, sous forme d'une protéine active.
De préférence, la séquence codant pour l'hirudine, l'un de ses variants ou analogues1 est située en aval d'une séquence codant pour un peptide signal qui est clivé et permet la sécrétion de la protéine mature. I1 est important que le site de clivage soit situé de préférence juste avant le premier acide aminé de la protéine mature, en effet la présence d'acides aminés résiduels à l'extrémité N-terminale de l'hirudine diminue très fortement son activité antithrombinique.
La présente invention concerne les vecteurs d'expression du bloc fonctionnel d'ADN codant pour l'hirudine.
Plus particulièrement, on utilisera comme vecteur - soit un vecteur viral pour obtenir une expression temporai
re du bloc fonctionnel, - soit un vecteur destiné à l'intégration du bloc fonctionnel
dans 1'ADN cellulaire pour obtenir une lignée cellulaire
transformée exprimant ledit bloc fonctionnel de manière
stable.
re du bloc fonctionnel, - soit un vecteur destiné à l'intégration du bloc fonctionnel
dans 1'ADN cellulaire pour obtenir une lignée cellulaire
transformée exprimant ledit bloc fonctionnel de manière
stable.
Bien qu'il soit possible d'utiliser divers vecteurs dans le cadre de l'invention, on utilisera de préférence un vecteur viral de type poxvirus, en particulier un virus de la vaccine.
La technologie de clonage et d'expression de gènes par le virus de la vaccine est connue, elle est décrite par exemple dans les brevets WO/85 05376 et wu/85 04810.
De préférence, les séquences codantes de la protéine étrangère seront situées dans une partie non essentielle du génome du virus, par exemple dans le gène TK, ce qui permet, en outre, une sélection des virus recombinants TK-.
Parmi les signaux de contrôle nécessaires à l'expression, on pourra utiliser le promoteur viral du gene codant pour la protéine 7,5 K ou bien d'autres promoteurs efficaces de la vaccine.
Parmi les séquences utilisables pour favoriser l'excrétion de la protéine, il faut citer celle codant pour le peptide signal de l'alphal-antitrypsine humaine.
Cette séquence sera mise en phase avec la séquence codante de l'hirudine, de préférence sans introduire d'acides aminés résiduels entre le site de clivage et la protéine mature. Pour cela, au niveau de la jonction précurseurséquence codante mature, la séquence de 1'ADN sera de préférence celle qui est représentée dans la figure 3ii pour le variant HV2. I1 en serait de même pour les autres variants.
L'invention concerne en outre des plasmides bactériens comportant tout ou partie des séquences précédentes.
L'invention concerne également des cellules eucaryotes suprieures, notamment de mammifères, infectées par les vecteurs viraux décrits précédemment. Parmi les cellules particulièrement intéressantes, il faut citer les cellules BHK21.
L'invention concerne également des cellules de mammifères transformées de manière permanente par un vecteur d'expression décrit précédemment, c'est-à-dire des cellules dans lesquelles le bloc fonctionnel d'ADN est intégré dans 1'ADN chromosomique, et sécrétant l'hirudine dans le milieu de culture.
Exemple 1 Construction des plasmides pTG1970, pTG2902 et
pTG2906
Le cADN codant pour l'hirudine a été placé en aval d'une séquence signal destinée à assurer l'excrétion de la molécule mature hors des cellules. La séquence signal utilisée est celle de l'al-antitrypsine (a-AT) d plasmide pTG1954. Ce plasmide a été construit pour assurer la synthèse et l'excrétion de l'a-antitrypsine argus (brevet français 86.09608). La structure du pTG1954 est présentée dans la figure 1.
pTG2906
Le cADN codant pour l'hirudine a été placé en aval d'une séquence signal destinée à assurer l'excrétion de la molécule mature hors des cellules. La séquence signal utilisée est celle de l'al-antitrypsine (a-AT) d plasmide pTG1954. Ce plasmide a été construit pour assurer la synthèse et l'excrétion de l'a-antitrypsine argus (brevet français 86.09608). La structure du pTG1954 est présentée dans la figure 1.
On trouve un site de restriction StuI dans la région qui code pour la séquence signal et un site BamHI au début de la séquence codante de la molécule mature. Ces deux sites de restriction peuvent être utilisés pour insérer le gène de 1 'hirudine.
A l'autre extrémité du gène a-AT on trouve un site
EcoRI. Une double digestion EcoRI-StuI ou -BamHI permet 1'é- limination du gène a-AT.
EcoRI. Une double digestion EcoRI-StuI ou -BamHI permet 1'é- limination du gène a-AT.
a) pTG1970
Les étapes de la construction du plasmide sont schématisées dans la figure 2. Le pTG1954 est digéré par BamHI et EcoRI puis traité & la phosphatase alcaline. Ce traitement élimine toute la séquence codante de l'-antitrypsine mature sauf les 2 premiers codons.
Les étapes de la construction du plasmide sont schématisées dans la figure 2. Le pTG1954 est digéré par BamHI et EcoRI puis traité & la phosphatase alcaline. Ce traitement élimine toute la séquence codante de l'-antitrypsine mature sauf les 2 premiers codons.
Un fragment d'ADN portant la séquence de l'hirudine, variant
HV2, a été récupéré à partir d'une construction antérieure pTG730 (décrite dans le brevet français 86.16723), par digestion avec AccI et EcoRI. Le fragment d'ADN AccI-EcoRI de 230 pb isolé par électrophorèse sur gel contient le gène de l'hirudine sauf les 2 premiers codons.
HV2, a été récupéré à partir d'une construction antérieure pTG730 (décrite dans le brevet français 86.16723), par digestion avec AccI et EcoRI. Le fragment d'ADN AccI-EcoRI de 230 pb isolé par électrophorèse sur gel contient le gène de l'hirudine sauf les 2 premiers codons.
Ce fragment d'ADN est ensuite réinséré dans le vecteur pTG1954 ouvert par BamHI et EcoRI, à l'aide d'un adaptateur synthétique BamHI-AccI (figure 2). La jonction correcte entre les sites BamHI et AccI est vérifiée par séquençage. Le plasmide obtenu est nommé pTG1970.
La figure 32 montre la séquence en nucléotides et en acides aminés de la région du site de clivage de la séquence signal du pTG1970.
Les premiers acides aminés constituent la séquence signal de 1'-AT ; le clivage s'effectue après le résidu ala (comme indiqué par une flèche sur la figure 3î) ;les 2 premiers acides aminés après le clivage sont Glu et Asp, qui proviennent des codons en amont du site BamHI ; la séquence de l'hirudine commence après le résidu Asp. Le premier acide aminé de cette séquence est modifié de isoleucine en leucine à cause de la séquence de l'adaptateur.
Les 3 premiers acides aminés de la molécule mature, après clivage, sont donc Glu, Asp, Leu ; le reste de la molécule est identique à l'hirudine native.
b) pTG2902
La construction du pTG2902 a été effectuée de la même manière que celle du pTG1970 : le pTG1954 a été digéré avec les enzymes StuI et EcoRI, pour y insérer le même fragment d'ADN AccI-EcoRI de pTG730, qui porte la séquence de l'hirudine.
La construction du pTG2902 a été effectuée de la même manière que celle du pTG1970 : le pTG1954 a été digéré avec les enzymes StuI et EcoRI, pour y insérer le même fragment d'ADN AccI-EcoRI de pTG730, qui porte la séquence de l'hirudine.
Comme StuI coupe dans la séquence signal, la jonction entre celle-ci et la protéine mature est délétée. On la remplace par un adaptateur synthétique StuI-AccI qui permet de déterminer exactement la jonction entre la séquence signal et la molécule d'hirudine.
La stratégie utilisée est schématisée dans la figure 2 et les séquences de nucléotides et d'acides aminés de cette région sont présentées dans la figure 3ii.
On voit, sur la figure 3ii que le remplacement de la séquence signal par l'adaptateur place la séquence de l'hirudine native immédiatement après le résidu alanine du site de clivage.
Par conséquent un clivage correct de la molécule synthétisée par pTG2902 doit donner une molécule d'hirudine native.
c) pTG2906
Le pTG2906 a été construit de la même maniere que le pTG2902, avec un adaptateur contenant un codon supplémentaire de manière à reconstituer la paire d'acides aminés qui est reconnue par l'enzyme responsable du clivage de la séquence signal.
Le pTG2906 a été construit de la même maniere que le pTG2902, avec un adaptateur contenant un codon supplémentaire de manière à reconstituer la paire d'acides aminés qui est reconnue par l'enzyme responsable du clivage de la séquence signal.
La molécule d'hirudine synthétisée par cette construction contiendra donc un acide aminé supplémentaire (acide glutamique) à l'extrémité NH2, comme le montre la figure 3iii.
Exemple 2 Sélection de virus de la vaccine recombinants
portant les constructions hirudine des pTG1970,
2902 et 2906.
portant les constructions hirudine des pTG1970,
2902 et 2906.
La séquence codante de l'hirudine des 3 plasmides pTG1970, 2902 et 2906 est placée en aval du promoteur de la protéine 7.5 K du virus de la vaccine et l'ensemble de ce bloc fonctionnel est inséré dans le gène TK de la vaccine, comme dans la construction initiale pTG1954 (exemple 1 cidessus, décrit dans le brevet français 86.0968).
La sélection de virus de la vaccine recombinants, TK ayant intégré le bloc fonctionnel d'expression de l'hirudine est effectuée selon des techniques devenues classiques et décrites notamment dans le brevet français 84.06499.
Pour chaque construction, 4 plages de virus TKont été choisies pour réinfecter un tapis de cellules BHK2l.
L'ADN des cellules infectées est extrait et analysé, selon des techniques classiques.
Après digestion par HindIII, 1'ADN est soumis à l'électrophorèse de gel d'agarose à 0,8 t. L'ADN est ensuite transféré sur nitrocellulose et identifié à l'aide d'oligonucléotides phosphorylés au 32p, spécifiques de la séquence signal de l'a-AT ou de la séquence de l'hirudine. Après 17 heures d'incubation à 400C l'épreuve est soumise à l'autoradiographie. Celle-ci révèle que tous les virus recombinants
TK- ont intégré les séquences du plasmide. Pour chaque construction, un virus est choisi pour être analysé en détails
VV.TG.Hir1970
W .TG.Hir2902
VV.TG.Hir2906.
TK- ont intégré les séquences du plasmide. Pour chaque construction, un virus est choisi pour être analysé en détails
VV.TG.Hir1970
W .TG.Hir2902
VV.TG.Hir2906.
Exemple 3. Dosage de l'activité hirudine présente dans le
milieu de culture des cellules BHK2l infectées
par les virus recombinants.
milieu de culture des cellules BHK2l infectées
par les virus recombinants.
L'activité de l'hirudine est mesurée par sa capacité d'inhiber la thrombine.
Après l'infection par les virus recombinants, les cellules BHK21 sont incubées A 37*C. Le milieu de culture est récolté après 24 ou 48 heures et centrifugé pour éliminer les débris cellulaires. Des aliquotes de ce milieu sont testées pour leur capacité d'inhiber la thrombine, selon une méthode classique.
240 mU de thrombine sont incubées dans 900 p1 de tampon
TB (150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8,0, 0,1 % PEG) en présence
de différents volumes de surnageant de culture, pendant 20
minutes à température ordinaire. L'activité résiduelle de
la thrombine est mesurée après addition de 100 jil de subs
trat (100 nmoles Chromozym TH-Boerhinger Mannheim) par la
variation de densité optique à 410 nm après 4 minutes.
TB (150 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8,0, 0,1 % PEG) en présence
de différents volumes de surnageant de culture, pendant 20
minutes à température ordinaire. L'activité résiduelle de
la thrombine est mesurée après addition de 100 jil de subs
trat (100 nmoles Chromozym TH-Boerhinger Mannheim) par la
variation de densité optique à 410 nm après 4 minutes.
La figure 4 présente, pour chaque virus recombinant, une courbe d'inhibition de la thrombine représentative. Le milieu de culture des cellules infectées avec le virus de la vaccine sauvage sert de témoin.
On voit que seul le recombinant VV.TG.Hir2902 (c'est à-dire celui qui produit l'hirudine native) provoque une inhibition efficace de la thrombine.
On calcule que l'inhibition de 50 % de la thrombine (240 mU) est obtenue avec 70 iil de milieu, ce qui correspond approximativement à une concentration d'hirudine de 0,1 pg/ml
Dans ce test, on ne détecte pas d'hirudine active avec les constructions W .TG.Hirl970 et 2906. Il est possible que les acides aminés additionnels à l'extrémité NH2 rendent la molécule inactive.
Dans ce test, on ne détecte pas d'hirudine active avec les constructions W .TG.Hirl970 et 2906. Il est possible que les acides aminés additionnels à l'extrémité NH2 rendent la molécule inactive.
Dépôt de souche représentative de l'invention
La souche 5K pTG2902 a été déposée à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 Rue du Docteur
Roux, Paris, le 27 janvier 1987 sous le n 1648.
La souche 5K pTG2902 a été déposée à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 Rue du Docteur
Roux, Paris, le 27 janvier 1987 sous le n 1648.
REFERENCES
Bagdy, D., Barabas, E., Gram, L., Petersen, T.E. & Magnusson,
S. Methods Enzymol. 45, 669-678 (1976).
Bagdy, D., Barabas, E., Gram, L., Petersen, T.E. & Magnusson,
S. Methods Enzymol. 45, 669-678 (1976).
Briginshaw, G.F. & Shanberge, J.N. Arch. Biochem. Biophys.
161, 683-690 (1974).
Chang, J.Y. FEBS Letters 164, 307-313 (1983).
Dodt, J., Mueller, H.P., Seemüller, U. & Chang, J.Y. FEBS
Letters 165, 180-184 (1984).
Letters 165, 180-184 (1984).
Dodt, J., Seemüller, U., Maschler, R. & Fritz, H. Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985).
Dodt, J., Machleidt, W., Seemüller, U., Maschler, R. & Fritz,
H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986).
H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986).
Harvey, R.P., Degryse, E., Stefani, L., Schamber, F.,
Cazenave, J.P., Courtney, M., Tolstoshev, P. & Lecocq,
J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1084-1088 (1986).
Cazenave, J.P., Courtney, M., Tolstoshev, P. & Lecocq,
J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1084-1088 (1986).
Hortin, G., Tollefsen, D.M. & Strauss, A.W. J. Biol. Chem.
261, 15827-15830 (1986).
Huttner, W.B. Nature 299, 273-276 (1982).
Lui, M.C., Yu, S., Sy, J., Redman, C.M. & Lipmann, F. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 7160-7164 (1985).
Markwardt, F. Methods Enzymol. 19, 924-932 (1970).
Markwardt, F. & Walsmann, P. Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem.
348, 1381-1386 (1976).
Petersen, T.E., Roberts, H.R., Sottrup-Jensen, L. & BR<
Magnusson, S. Protides, Biol., Fluids, Proc. Colloq.
Magnusson, S. Protides, Biol., Fluids, Proc. Colloq.
23, 145-149 (1976).
Stone, S.R. & Hofsteenger, J. J. Biochem. 25, 4622-4628
(1986).
(1986).
Claims (16)
1. Vecteur d'expression de l'hirudine, d'un variant ou d'un analogue dc l'hirudine, dans des cellules eucaryotes supérieures, sous forme de protéine mature, carac térisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur comportant la séquence d'ADN codant pour l'hirudine, l'un de ses variants ou analogues, en aval d'un bloc d'ADN assurant l'expression de ladite séquence dans les cellules en cause et son excrétion après clivage d'une séquence signal, permettant de libérer, dans le milieu de culture, l'hirudine, ses variants ou analogues, sous forme d'une protéine active.
2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'hirudine, l'un de ses variants ou analogues est située en aval d'une séquence codant pour un peptide signal qui est clivé et permet la sécrétion de la protéine mature.
3. Vecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur viral.
4. Vecteur selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le vecteur viral est un poxvirus.
5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le vecteur viral est un virus de la vaccine.
6. Vecteur selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la séquence signal et la séquence d'ADN codant pour 1'hirudine ou l'un de ses variants sont placées sous le contrôle d'un promoteur du virus de la vaccine, pour constituer un bloc d'expression fonctionnel.
7. Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que le promoteur est le promoteur du gène codant pour la protéine 7,5 K de la vaccine.
8. Vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 & 7 caractérisé en ce que le bloc d'expression fonctionnel "promoteur-séquence signal-séquence codante" est inséré dans le gène TK du virus de la vaccine.
9) Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la séquence permettant l'excrétion de la molécule mature est celle codant pour le peptide signal de l'aplphal-antitrypsine humaine.
10) Vecteur selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'au niveau de la jonction entre la séquence signal et l'extrémité 5' de la séquence codant pour l'hirudine ou l'un de ses variants, la séquence de 1'ADN n'apporte pas d'acide aminé supplémentaire à la molécule.
mature clivée.
11) Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce que la séquence d'ADN à la jonction précurseur-séquence codante est la séquence représentée à la figure 3ii pour le variant HV2.
12) Cellule de mammifère infectée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11.
13) Cellule selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule BHK2l.
14) Cellules de mammifères transformées de manière permanente par un vecteur selon les revendications 1 et 2 et ayant intégré le bloc fonctionnel d'ADN de l'hirudine dans 1'ADN chromosomique et sécrétant de l'hirudine mature dans le milieu de culture.
15) Procédé de préparation d'hirudine, de ses variants ou analogues, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon l'une des revendications 12 à 14 sur un milieu approprié et on récupère l'hirudine, ses variants ou analogues sous forme mature.
16) Hirudine, variant ou analogue obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 15.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8702696A FR2611723B1 (fr) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8702696A FR2611723B1 (fr) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2611723A1 true FR2611723A1 (fr) | 1988-09-09 |
FR2611723B1 FR2611723B1 (fr) | 1989-09-08 |
Family
ID=9348440
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR8702696A Expired FR2611723B1 (fr) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2611723B1 (fr) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0402159A1 (fr) * | 1989-06-09 | 1990-12-12 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Polypeptide à activité inhibitrice pour la thrombine et son procédé de préparation |
EP0446315A1 (fr) * | 1989-09-05 | 1991-09-18 | Biotech Australia Pty Ltd | Produit recombinant. |
US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0162782A1 (fr) * | 1984-05-22 | 1985-11-27 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression du facteur IX et lignées cellulaires produisant le facteur IX actif |
WO1986003517A1 (fr) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Gen-Bio-Tec Gesellschaft Für Gentechnologische Und | Sequence d'adn codant une proteine semblable a l'hirudin et procede de preparation de cette proteine |
WO1986006406A1 (fr) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
-
1987
- 1987-02-27 FR FR8702696A patent/FR2611723B1/fr not_active Expired
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0162782A1 (fr) * | 1984-05-22 | 1985-11-27 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression du facteur IX et lignées cellulaires produisant le facteur IX actif |
WO1986003517A1 (fr) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Gen-Bio-Tec Gesellschaft Für Gentechnologische Und | Sequence d'adn codant une proteine semblable a l'hirudin et procede de preparation de cette proteine |
WO1986006406A1 (fr) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA, vol. 83, no. 4, février 1986, pages 1084-1088, Washington, US; R.P.HARVEY et al.: "Cloning and expression of a cDNA coding for the anticoagulant hirudin from the bloodsucking leech, Hirudo medicinalis" * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
EP0402159A1 (fr) * | 1989-06-09 | 1990-12-12 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Polypeptide à activité inhibitrice pour la thrombine et son procédé de préparation |
US5166318A (en) * | 1989-06-09 | 1992-11-24 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Polypeptide having thrombin inhibiting activity |
EP0446315A1 (fr) * | 1989-09-05 | 1991-09-18 | Biotech Australia Pty Ltd | Produit recombinant. |
EP0446315A4 (en) * | 1989-09-05 | 1992-08-05 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Recombinant product |
US5298400A (en) * | 1989-09-05 | 1994-03-29 | Biotechnology Australia Pty. Ltd. | Polynucleotide constructs for secreted glycosylated plasminogen activator inhibitor-2 (PAI-2) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2611723B1 (fr) | 1989-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2515468B2 (ja) | ヒト抗トロンビンiii | |
EP0158564B1 (fr) | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformées et procédé de préparation de l'hirudine | |
EP0746611B1 (fr) | Procede d'augmentation de la production de proteines recombinantes liees au bisulfure a l'aide de (saccharomyces cerevisiae) | |
AU676145B2 (en) | A human kunitz-type protease inhibitor variant | |
US5373090A (en) | Aprotinin analogues and a process for the production thereof | |
CA1341501C (fr) | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees | |
RU2198179C2 (ru) | Модифицированный сигнальный пептид энтеротоксина - ii e. coli и микроорганизм, экспрессирующий белок слияния упомянутого пептида с гетерологичным белком | |
JP3345420B2 (ja) | 新規のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体 | |
HUT70292A (en) | Human kunitz-type protease inhibitor variants | |
EP0273800B1 (fr) | Variants de l'hirudine, leur utilisation et leur préparation | |
JP2916228B2 (ja) | 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用 | |
PT94680B (pt) | Processo para a obtencao de uma proteina tendo actividade de urato oxidase gene recombinante que a codifica vector de expressao portador deste gene microorganismos procariotas e celulas eucariotas transformados por este vector de expressao | |
FR2611723A1 (fr) | Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue | |
CA1339875C (fr) | Psti humain modifie | |
EP0435776B1 (fr) | Promoteur artificiel pour l'expression de protéines dans la levure | |
CA2164221A1 (fr) | Inhibiteur de la tryptase | |
JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
JPH0584084A (ja) | マウス・インターロイキン−1産生プラスミド及びそれを用いたマウス・インターロイキン−1の製造法 | |
CA2124330A1 (fr) | Nouveau variant de l'hirudine, methode de production et anticoagulant en contenant a titre d'ingredient actif | |
WO2000017238A1 (fr) | Proteine ayant un effet de promotion de la proliferation cellulaire | |
DK164283B (da) | Polypeptid med cystatin c aktivitet, dna-sekvens til udtrykkelse af 3-des-oh-cystatin c eller en modifikation deraf, fremgangsmaade til fremstilling af 3-des-hydroxy-cystatin c eller en modifikation deraf, plasmid og mikroorganisme til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af 3-des-oh-cystatin c eller en modifikation deraf til fremstilling af et terapeutisk praeparat |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ER | Errata listed in the french official journal (bopi) |
Free format text: 36/88 |
|
ST | Notification of lapse |