FR2555602A1 - Enzyme et composition d'enzymes degradant les pentosanes, leurs procedes d'obtention et d'application - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE COMPOSITION D'ENZYME PRESENTANT UNE ACTIVITE DE PENTOSANE, EN PARTICULIER A DES TEMPERATURES ELEVEES, ET SON PROCEDE D'OBTENTION. LA COMPOSITION EST PREPAREE PAR FERMENTATION DE TALAROMYCES EMERSONII, EN PARTICULIER DE LA SOUCHE IMI116815, ET EVENTUELLEMENT PAR DES MOYENS D'AUGMENTATION DE L'ACTIVITE DE PENTOSANASE PAR RAPPORT A D'AUTRES ACTIVITES ENZYMATIQUES. APPLICATIONS A LA CUISSON DU PAIN, A LA FABRICATION DE L'AMIDON, A LA PRODUCTION DE FOURRAGES ENSILES MIXTES ET D'ALIMENTS POUR ANIMAUX, A L'EXTRACTION DU THE ET DU CAFE, ETC.

Description

La présente invention concerne un nouveau procédé de biodégradation des

pentosanes, une enzyme utile à cette

fin et un procédé d'obtention d'une composition la conte-

nant. Les pentosanes constituent une classe de poly-

mères d'un ou de plusieurs pentoses naturels. Ils se ren-

contrent dans diverses sources naturelles telles que des céréales, par exemple le blé et l'avoine, des plantes, par

exemple le thé et le café, les algues, les fruits, les lé-

gumes et le sorgho, et leur présence est indésirable pour

un certain nombre d'applications de ces sources naturelles.

Ainsi, par exemple, des pentosanes se trouvent dans les farines de céréales, dans lesquelles ils fixent l'eau, et

ils contribuent à durcir ou à rassir le pain après cuisson.

Dans ce cas, une réduction de la teneur en pentosanes de la farine diminue la tendance au durcissement. Dans un autre exemple, des pentosanes se trouvent dans le cafe et se rencontrent dans les gommes solubles extraites en même temps que le café lors de la fabrication de granulés ou de poudre de café instantané. La réduction de la teneur en pentosanes de ces matières permet d'atteindre de plus hautes teneurs en matières solides lors de l'extraction et il en

résulte des économies notables dans le processus de fabri-

cation.

Dans la description du brevet britannique

N 1 421 127, la demanderesse décrit un procédé de produc-

tion d'enzymes qui dégradent les $-glucanes provenant de l'orge et les e1,4/e-1,3-glucanes apparentés. La principale enzyme obtenue est une 0-1, 4/0-1,3-glucanase, d'un intérêt particulier dans le traitement de l'orge, bien qu'il soit dit que des activités de 0-glucanase, de laminarinase, d'hydroxyéthyl-cellulase, de cellulase et d'a-amylase puissent également être présentes. Des microorganismes de

l'espèce Penicillium emersonii sont employés comme la sour-

ce d'enzyme, et en particulier la souche qui a été déposée au Commonwealth Mycological Institute, Kew, Grande-Bretagne,

sous le numéio IMI 116815.

La demanderesse est maintenant en mesure de faire fermenter Talaromyces emersonii (initialement dénommé Penicillium emersonii) afin de produire une autre enzyme, une pentosanase, qui catalyse la dégradation de pentosanes, en particulier des pentosanes provenant du blé. La classe de ces enzymes est connue en général et diverses enzymes

individuelles ont été utilisées, entre autres, en boulan-

gerie, dans la fabrication de l'amidon, l'agriculture, le brassage, l'extraction de tissus végétaux et la fabrication de matières colorantes végétales. Cependant, dans un grand nombre de ces applications, il est couramment fait usage de températures élevées et il existe un besoin pour une pentosanase thermostable qui conserve une bonne activité

sur une large plage de températures élevées.

Ainsi, selon l'un des aspects de la présente in-

vention, la demanderesse fournit une enzyme susceptible d'être obtenue par fermentation à partir d'une souche des espèces Talaromyces emersonii, en particulier à partir de

Talaromyces emersonii Stolk, synonyme de Penicillium emer-

sonii Stolk IMI 116815, ou d'un mutant de celle-ci, et qui est capable de catalyser la dégradation de pentosanes. Il a été découvert que cette nouvelle enzyme peut être obtenue avec un bon rendement et à une concentration élevée de façon

satisfaisante pour un usage commercial.

Selon un aspect particulier de l'invention, la

demanderesse fournit une enzyme susceptible d'être prépa-

rée par fermentation à partir d'une souche des espèces T. emersonii, en particulier de T. emersonii IMI 116815, ou d'un mutant de celle-ci, et qui est capable de catalyser la dégradation du xylane. Le xylane est un polymère d'un

pentose, le xylose.

On a constaté que cette nouvelle enzyme est ther-

mostable, c'est-à-dire qu'elle conserve une bonne activité à des températures élevées, et est,%par suite, d'un intérêt particulier dans la dégradation de pentosanes à hautes températures. Par exemple, dans des mesures de stabilité faites en utilisant l'enzyme préparée conformément au mode

opératoire de l'exemple 1 décrit ci-après, l'enzyme conser-

ve encore 50 % de son activité initiale après chauffage à

95 C pendant six minutes à pH 5,0 en l'absence de substrat.

L'enzyme présente également une relation température-acti-

vité avantageuse, et manifeste une activité optimale à 87 + 2 C par utilisation d'un substrat de xylane de balles d'avoine tout en conservant 45 % de son activité optimale à 950C. Ce fait est inhabituel pour une enzyme d'origine fongique, et se différencie nettement, par exemple, des résultats obtenus avec la 0-glucanase indiquée ci-dessus qui présente un optimum mal défini à 60-70 C et conserve

seulement 40 % de son activité de pointe à 800C.

En utilisant une préparation d'enzyme brute obte-

nue par le mode opératoire de l'exemple 1 décrit ci-après, on mesure les caractéristiques suivantes présentées par l'enzyme conforme à l'invention:

(a) le pH correspondant à l'activité optimale de la nou-

velle enzyme est de 5,0, mesuré à 50 C en utilisant du xylane de balles d'avoine comme substrat de pentosane; (b) la température correspondant à l'activité optimale de la nouvelle enzyme est de 87 2 C, mesurée à pH 5, 0 en utilisant du xylane de balles d'avoine comme substrat de pentosane;

(c) la présence de xylose, de glucose ou de maltose préala-

blement ajouté n'a aucun effet sur l'activité de l'en-

zyme lorsqu'elle est ultérieurement éprouvée à pH 5,0 et à 50 C en utilisant un substrat de xylane de balles d'avoine. L'enzyme conforme à l'invention peut généralement

être préparée en faisant fermenter un inoculum de T. emer-

sonii, par exemple T. emersonii IMI 116815 ou un de ses mutants, dans un milieu nutritif lui convenant. Cependant, la demanderesse a découvert que la quantité de pentosanase produite naturellement peut être accrue par rapport à la

quantité de $-glucanase produite par une modification ap-

propriée du milieu de fermentation. Une caractéristique

préférée de la présente invention consiste en une prépara-

tion d'enzyme, et en un procédé d'obtention de cette prépa-

ration, obtenue directement par fermentation de Talaromyces

emersonii, de préférence T. emersonii IMI 116815, dans la-

quelle le niveau de l'activité de pentosanase par rapport à l'activité d'une quelconque 0-1,4/$-1,3-glucanase est, du fait de cette modification, plus élevé que celui qui est

obtenu de façon classique.

La fermentation peut être conduite par des métho-

des bien connues dans l'industrie de la fermentation. La

souche de T. emersonii peut ainsi être cultivée sous con-

ditions aérobies, de préférence en culture immergée, avec agitation ou brassage avec de l'air ou de l'oxygène. Le milieu de fermentation utilisé doit contenir une source de carbone assimilable, une source d'azote digestible et, si on le désire, des substances favorisant la croissance ainsi

que des sels minéraux.

Les sources de carbone appropriées comprennent des matières riches en pentosanes, par exemple des céréales

telles que l'orge et le blé, des matières solubles de rési-

dus ou autres sous-produits de la distillation de malt ou de grains, de la cellulose, par exemple de la variété Solka

Floc, ou du xylane.

Les sources d'azote appropriées comprennent, par exemple, l'orge, des matières solubles de résidus ou autres sous-produits de la distillation de malt ou de grains, la farine de soja, des nitrates ou des sels d'ammonium tels

que le dihydrogénophosphate d'ammonium.

Dans le cas o l'on désire augmenter le niveau de l'activité de la pentosanase par rapport à l'activité d'une quelconque 0-glucanase, il est souhaitable d'utiliser une source de carbone ou d'azote choisie parmi Scotagran (un mélange de matières solubles avec des grains d'orge séchés), le nitrate d'ammonium, les sirops de résidus de distillation de moûts fermentés, les boulettes de maïs (grains de maïs séchés mélangés avec des matières solubles),

le sirop de Curne et l'extrait soluble de maïs.

Les sels minéraux que l'on peut utiliser dans le

milieu de fermentation peuvent être, par exemple, les sul-

fates ou chlorures de potassium, de magnésium ou de sodium.

Les substances favorisant la croissance que l'on peut utiliser comprennent les oligo-éléments tels que le

manganèse, le fer, le zinc, le cuivre ou le phosphore.

Le milieu de fermentation renferme avantageuse-

ment de l'orge en une concentration dans la plage de 0,2

à 3,5 % en poids par volume, des matières solubles de rési-

dus de distillation ou autres sous-proudits de la distilla-

tion de malt ou de grains en une concentration dans la plage ae 0,4 à 5,5 % en poids par volume, et de 0,2 à 3,0 %

de cellulose en poids par volume.

Les conditions de culture telles que la tempéra-

ture, le pH et le temps de fermentation sont choisies de telle façon que la souche employée puisse accumuler une quantité maximale de l'enzyme désirée. Par exemple, la fermentation est avantageusement conduite à une température comprise dans la plage de 35-60 C, de préférence de 50-54 C, à un pH de 3,5-4,5 et pendant i à 20 jours, de préférence

7 à 10 jours.

Le liquide de culture brut peut être utilisé di- rectement pour son activité enzymatique, ou bien, si on le désire, on peut sécher le bouillon de culture entier et utiliser la poudre résultante. Si on le désire, on peut effectuer une certaine purification de la pentosanase, par exemple par des techniques de chromatographie, pour obtenir une préparation d'enzyme ayant une activité de pentosanase

accrue par rapport à l'activité de toute $-1,4/1,3-gluca-

nase, et une méthode pour effectuer une telle purification

ainsi que le produit obtenu constituent des aspects supplé-

mentaires de l'invention.

En variante, l'enzyme, qui est exocellulaire, peut être extraite du produit de fermentation grâce, par exemple, à des méthodes classiques. Ainsi, par exemple, une première

étape consiste normalement à séparer par filtration le my-

célium formé, de préférence au moyen d'une filtration à pré-

couche, c'est-à-dire en utilisant un filtre ayant été re-

couvert d'un adjuvant d'assistance de la filtration. Le filtrat résultant peut être directement utilisé ou alors peut commodément être concentré, de préférence sous vide,

afin d'obtenir l'enzyme sous forme d'un concentré liquide.

Le concentré liquide peut être lui-même utilisé en tant que source d'enzyme. Si on le désire, on peut ajouter à ces concentrés liquides des substances telles que le chlorure de sodium, le benzoate de sodium ou le métabisulfite de

sodium qui confèrent à l'enzyme une stabilité à la conser-

vation, une thermostabilité et/ou une stabilité bactério-

logique. En variante, le concentré liquide peut être ab-

sorbé dans une matière solide appropriée, par exemple du blé ou de l'orge broyés, éventuellement en présence d'un support tel que la carboxyméthylcellulose sodique, et la

masse humide résultante séchée pour fournir un produit d'en-

zyme actif. Si on le désire, le concentré liquide peut être lui-même séché, par exemple par séchage par pulvérisation, lyophilisation ou séchage au rouleau, afin d'obtenir une

composition d'enzyme sèche.

A moins que l'extraction ne soit poussée, ce qui, à des fins commerciales, est ordinairement évité pour des raisons économiques et n'est pas nécessaire vu la gamme des utilisations auxquelles peut s'appliquer une composition plus brute, la composition présentera également d'autres

activités enzymatiques.

Dans le cas o l'on désire un produit solide d'enzyme, il peut être obtenu à partir du filtrat ou d'un concentré liquide de celui-ci, par des méthodes classiques telles qu'une précipitation par addition, par exemple d'un

excès de solvant organique miscible à l'eau tel qu'un al-

cool, par exemple l'éthanol, ou qu'une cétone, par exemple l'acétone. On peut utiliser une précipitation directe ou

bien une précipitation sur un support, des supports typi-

ques comprenant par exemple l'amidon, la méthyl-cellulose

ou la carboxyméthyl-cellulose sodique.

L'inoculum de T. emersonii utilisé dans la fermen-

tation peut être obtenu, par exemple, en développant pro-

gressivement une culture en surface de l'organisme. Le dé-

veloppement jusqu'à une fermentation de phase productive peut commodément être effectué en conduisant un stade de croissance végétative en laboratoire suivie par une ou plusieurs étapes d'ensemencement dans des récipients de

fermentation agités.

Ainsi, dans une préparation d'inoculum typique, l'organisme est ensemencé en stries sur un milieu nutritif

solide, par exemple un milieu de gélose contenant une pep-

tone (par exemple 0,5 % en poids/volume), du chlorure de sodium (par exemple 0,4 % en poids/volume), du glycérol (par exemple 0,75 % en poids/volume), de la mélasse (par exemple 0,8 % en poids/volume), du dihydrogénophosphate de

potassium (par exemple 0,006 % en poids/volume) et du sul-

fate de magnésium (par exemple 0,005 % de MgSO4.7H20 en

poids/volume) ayant été préalablement stérilisé, par exem-

ple par passage à l'autoclave à environ 120 C pendant 15 minutes, et mis à refroidir. L'incubation est de préférence conduite à environ 37 C pendant environ 10 jours, après quoi les spores produites sont utilisées pour inoculer un

milieu liquide destiné à la croissance végétative, stéri-

lisé par exemple par passage à l'autoclave à environ 120 C pendant 15 minutes, et contenant de l'extrait de malt (par exemple 3,3 % en poids/volume), de l'extrait de levure (par exemple 2,0 % en poids/volume) et du dihydrogénophosphate d'ammonium (par exemple 0,6 % en poids/volume). La culture est de préférence conduite jusqu'à ce qu'il existe un bon développement mycénien, par exemple, pendant environ 72

heures à 45 C lorsqu'on utilise environ 500 ml de milieu.

La culture végétative résultante est ensuite-

utilisée pour inoculer un premier stade d'ensemencement sous agitation. Le milieu convenant à ce stade contient de préférence les mêmes composants que ceux précédemment décrits pour le milieu de fermentation principale, et est

préparé de préférence en stérilisant ensemble tous les in-

grédients dans le récipient du stade d'ensemencement, par exemple par injection de vapeur d'eau. Un milieu typique

convenant au stade d'ensemencement est le "Milieu A" dé-

crit ci-après au tableau 1. En utilisant environ 40 litres de milieu, la culture est de préférence effectuée à environ C pendant environ 76 heures sous agitation rotative, par exemple à 420 tr/min, et aération, par exemple à 50 litres/

minute d'air.

La culture d'ensemencement ainsi obtenue peut ensuite être utilisée pour inoculer un stade de production

comme décrit ci-dessus ou, si davantage de semence est né-

cessaire, peut être utilisée dans des stades d'ensemence-

ment ultérieurs, de nature identique au premier.

Il est possible d'obtenir des mutants de T. emer-

sonii destinés à être utilisés dans les processus de fer-

mentation, par des méthodes classiques d'amélioration des

souches, par exemple par utilisation de radiations ioni-

santes (par exemple les rayons X et y, la lumière ultra-

violette; ou la lumière ultraviolette en présence d'un agent photosensibilisant tel que le 8-méthoxypsoralène), de

produits chimiques (par exemple l'oxyde nitreux; l'hydro-

xylamine; des analogues de bases pyrimidiques tels que le -bromo-uracile; les acridines; des agents alkylants tels que le méthanesulfonate d'éthyle ou le gaz moutarde; le peroxyde d'hydrogène; les phénols ou le formaldéhyde),

de techniques thermiques ou génétiques (par exemple, re-

combinaison, transduction, transformation, lysogénisation,

conversion lysogénique et techniques de sélection des mu-

tants spontanés).

L'activité d'enzyme requise peut être déterminée

dans le liquide de culture ou en tout point dans une opéra-

tion d'isolement grâce à un simple essai conçu afin de do-

ser les sucres réducteurs libérés par l'action de l'enzyme sur un substrat de pentosane. Ainsi, dans un essai, un

échantillon de la préparation d'enzyme à mesurer est con-

venablement dilué et est ensuite mis à incuber pendant 10 minutes avec un excès du xylane de pentosane, à 50 C dans un tampon acétate de pH 5,0. Le sucre libéré est dosé en tant qu'équivalent de maltose par addition d'un réactif consistant en sel alcalin de l'acide 3,5-dinitrosalicylique,

chauffage pendant 5 minutes sur bain-marie bouillant, re-

froidissement rapide à l'eau glacée, mesure de l'absorption de la solution à 540 nm et conversion de cette mesure en un

équivalent de maltose par référence à une courbe d'étalon-

nage obtenue en préparant des dilutions-type de maltose de

teneur en eau connue et en les faisant réagir avec le réac-

tif dinitrosalicylique dans les conditions qui viennent d'être décrites. De la manière utilisée ici, une unité d'enzyme libère 1 mg d'équivalent de maltose par minute

dans les conditions d'essai à 50 C et pH 5,0.

L'enzyme conforme à l'invention est utile pour

divers objectifs pour lesquels sont utilisées d'autres pen-

tosanases. Ainsi, par exemple, elle peut être utilisée dans

la cuisson, afin de réduire la teneur naturelle en pento-

sanes de la farine de blé et d'améliorer ainsi la conser-

vation des qualités du pain. Elle peut être utilisée dans la fabrication et l'hydrolyse de l'amidon, afin d'abaisser

la teneur en pentosanes des céréales et de réduire la vis-

cosité des bouillies d'amidon qui, autrement, affecteraient

de manière nuisible l'efficacité et le coût de la récupéra-

tion de l'amidon et de l'hydrolyse subséquente. Elle peut être utilisée en agriculture, afin d'améliorer la qualité

des fourrages -ensilés mixtes et des aliments pour animaux.

Elle peut être utilisée dans le brassage, pour améliorer la production et l'extraction des sucres susceptibles de fermenter lorsque le fardeau renferme par exemple du blé ou du sorgho, et pour la prévention ou le traitement de certains types de trouble. Elle peut être utilisée pour l'extraction de tissus végétaux, par exemple l'extraction

du thé, du café et des fruits; et pour extraire des algi-

nates à partir d'algue; et dans la fabrication de matières colorantes végétales naturelles. Pour certaines de ces

applications, la thermostabilité de l'enzyme est particu-

lièrement avantageuse en regard destempératures auxquelles

sont conduites les opérations.

Selon un autre aspect de l'invention, la deman-

deresse fournit en conséquence une méthode de réduction de

la teneur en pentosanes d'une matière contenant des pento-

sanes, méthode consistant en la mise en contact de ladite

matière avec une enzyme de l'invention.

Des pentosanes typiques qui peuvent être dégradés avec l'enzyme de l'invention comprennent ceux qui se trou- vent dans des céréales telles que le blé et l'avoine; des plantes telles que le thé et le café et leurs extraits; les fruits; les légumes; les algues et le sorgho. Dans un exemple, le pentosane peut être du xylane, par exemple du O10 xylane de balles d'avoine. Dans une forme préférée de mise

en application, la mntière contenant des pentosanes à dé-

grader provient du blé.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention,

la demanderesse fournit une méthode de réduction de la te-

neur en xylane d'une matière contenant du xylane, méthode

dans laquelle la matière est mise en contact avec une en-

zyme conforme à l'invention.

L'enzyme ou la composition conforme à l'invention peut être utilisée en employant les méthodes habituellement rencontrées dans la technologie des enzymes. Ainsi, par exemple, l'enzyme peut être mise en contact avec un milieu aqueux contenant le substrat soit en suspension, soit en mélange, soit encore en solution. La température de réaction peut varier selon la nature exacte de la réaction mais se situe en général dans la plage de 3595 C, avantageusement à l'extrémité supérieure de cette plage, à 90 C et plus dans certaines applications. Le pH du mélange réactionnel peut se situer par exemple dans la plage de 4,0-6,5, de préférence de 4,5-5,5 et notamment à pH 5,0. Si on le

désire, le mélange réactionnel peut contenir d'autres enzy-

mes ajoutées, par exemple une a-amylase.

La souche de Talaromyces emersonii qui a été uti-

lisée est une sous-culture de celle qui a été déposée au Commonwealth Institute, Kew, Angleterre, sous le numéro IMI 116815 en 1972, avant qu'ait été signé le Traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt de Microorganismes aux fins des Formalités de Délivrance de

Brevets (Budapest 1977). La demanderesse a récemment redé-

posé cette souche au LIre dépositaire le 19 Novembre 1984 sous le nunmro CIl OC 290604 et sous les conditions du Traité de Budapest et la demanderesse considère que ces deux souches sont identiques et que

dacune de celles-ci est utilisable.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Toutes les températures sont exprimées en C et tous les

pourcentages sont exprimés en poids/volume.

Exemple 1.

On cultive Talaromyces emersonii IMI 116815 à 37'C pendant 10 jours sur un milieu de gélose stérilisé dans un autoclave et contenant 0,5 % de peptone, 0,4 % de NaCl, 0,75 % de glycérol, 0,8 % de mélasses, 0,006 % de

KH2PO4 et 0,005 % de MgSO4.7H20.

Les spores produites sont utilisées pour inocu-

ler des flacons d'un milieu liquide stérilisé par passage en autoclave et contenant 3,3 % d'extrait de malt, 2,0 %

d'extrait de levure et 0,6 % de dihydrogénophosphate d'am-

monium. On place les flacons sur une secoueuse rotative (210 tours/mn; excentricité de 4,9 cm) pendant 3 jours à C. La culture végétative résultante (400 ml) est utilisée pour inoculer 40 litres de Milieu A (tableau 1)

stérilisé par injection de vapeur d'eau dans un fermenta-

teur en acier inoxydable d'une capacité de 50 litres. La culture est agitée à 420 tours/minute et aérée à 50 litres/

mn pendant 75 heures à 50 C.

La culture résultante (4,5 litres) est utilisée pour inoculer 40 litres de Milieu A (tableau 1) stérilisé par injection de vapeur d'eau dans un fermentateur en acier inoxydable d'une capacité de 50 litres. La culture

est agitée à 420 tours/minute et aérée à 50 litres/mn pen-

dant 75 heures à 50 C.

La culture résultante (4,5 litres) est utilisée pour inoculer 40 litres de Milieu A stérilisé par injection de vapeur d'eau dans un fermentateur en acier inoxydable d'une capacité de 50 litres. La culture est agitée à 420 tours/minute et aérée à 50 litres/mn pendant 36 heures à 500C. La culture résultante (16 litres) est utilisée pur inoculer 32 litres de Milieu B (tableau 1) stérilisé par injection de vapeur d'eau dans un fermentateur en acier

inoxydable d'une capacité de 50 litres.

La culture est aérée à 50 litres/minute et agitée par intermittence à 420 tours/minute à 50 C pendant 10 jours. On ajoute de l'eau stérile à un débit moyen de

1,5 litres par jour.

Un titrage du fluide exocellulaire donne une

concentration de l'enzyme selon l'invention de 36 V /g.

TABLEAU 1

Ingrédients Milieu A (%) Milieu B (%) Orge broyée 1,0 3,38 Matières solubles de résidus de distillation 2,25- 5,06 "Solka Floc" 2,25 2,53

(NH4)2 H2PO4 0,34 0,77

K2S04 0,12 0,27

MgSO4.7H20 0,01 0,11 NaCl 0,11 0,11 MnSO4. 4H20 0,0005 0,001 FeSO4.7H20 0, 004 0,008 ZnSO4. 7H20 0,004 0,008 CuSO4.5H20 0,0005 0,001

H3PO4 0,5 1,02

Eau jusqu'à 100 %

Exemple 2.

Mise en évidence de la variation du rapport pentosanase:

glucanase sur la fermentation.

a) Des spores sont produites comme dans l'exemple 1 et utilisées pour inoculer un stade d'ensemencement dans

des flacons de 250 ml contenant 40 ml de Milieu A sté-

rilisé par passage en autoclave. Les flacons sont mis à incuber à 45 C pendant 72 heures, en secouant à 200 tours/minute. La culture résultante (4 ml) est utilisée pour inoculer 40 ml de Milieu B stérilisé par passage

en autoclave dans des flacons de 250 ml. Après incuba-

tion à 45 pendant 12 jours, en secouant à 200 tours/ minute, le fluide de culture exocellulaire est titré pour déterminer les activités de pentosanase (P) et de $-glucanase (G) de l'orge, et l'on calcule le rapport P:G. b) On utilise essentiellement le m&me système qu'en a) cidessus. En supprimant le Solka Floc et en incorporant du xylane d'épeautres d'avoine (2,2 %), on obtient un rapport P:G

de 71 % supérieur à celui obtenu en a).

Exemple 3.

Pour démontrer l'activité de pentosanase de l'en-

zyme produite dans l'exemple 1, on met à incuber une solu-

tion de pentosane à 1 % à 50'C dans un tampon à pH 5,0 en

présence de l'enzyme ajoutée (système d'essai) ou avec ad-

dition d'une quantité équivalente d'eau (système témoin).

Le substrat de pentosane utilisé est le xylane, provenant

*de balles d'avoine.

Des échantillons du système d'essai sont prélevés au bout de 10 minutes, 30 minutes et 22,5 heures, refroidis brutalement pour éviter une réaction supplémentaire puis

appliqués en gouttes sur des plaques carrées de chromato-

graphie en couche mince de 20 cm de côté recouvertes de 0,25 mm de gel de silice. On applique également des gouttes

de solutions de sucre de référence et du système témoin.

La phase mobile est constituée par un mélange nbutanol:pyridine:éthanol:eau (20:15:25:10). La détection s'effectue par pulvérisation, sur les plaques séchées, de molybdate d'ammonium à 5 % dans l'acide sulfurique à 5 %,

puis en chauffant à 105 C pendant 15 minutes.

Tous les échantillons d'essai présentent, entre

autres, une tache d'une valeur de Rf identique à celle pré-

sentée par la solution de sucre de référence à base de xy-

lose. Etant donné que l'échantillon témoin ne donne qu'une seule tache à l'origine, cette tache d'essai ne peut provenir d'une contamination par le xylose du substrat ni

de son hydrolyse chimique: elle doit provenir d'une dé-

gradation enzymatique du pentosane.

Exemple 4.

L'essai comparatif suivant est destiné à illus-

trer l'utilité potentielle de l'enzyme selon l'invention

dans un procédé de digestion enzymatique d'amidon de blé.

On secoue énergiquement l'enzyme (2 ml) préparée

selon l'exemple 1, de la farine de blé de qualité infé-

rieure (155 g), du chlorure de sodium (2 g), du chlorure

de calcium (0,17 g), de l'alpha-amylase bactérienne "Terma-

myl" (Novo Industri A/S) (1 ml) et de l'eau (250 ml) dans un flacon en verre. On ajuste le pH à 6,5 en utilisant de la soude caustique. Le goulotdu récipient est recouvert afin de minimiser l'évaporation et le flacon est maintenu pendant 5 heures à une température de 90 C. L'hydrolyse de l'amidon se produit (résultat négatif de l'essai à l'iode) et la viscosité du produit de digestion est de

43 mPa.s.

Dans une expérience témoin dans laquelle on omet l'enzyme de l'invention, la viscosité finale du produit de

digestion est de 127 mPa.s.

Les exemples suivants illustrent des expériences

effectuées pour caractériser l'enzyme selon l'invention.

Dans chaque exemple, l'enzyme utilisée est préparée selon la méthode de l'exemple 1, à la différence qu'on ajoute

de petites quantités de benzoate de sodium et de métabi-

sulfite de sodium au fluide exocellulaire comme stabili-

sants bactériologiques. L'activité enzymatique est déter-

minée dans chaque exemple en utilisant un excès de solution aqueuse à 1 % de xylane de balles d'avoine comme substrat de pentosane et en mesurant l'augmentation de l'activité réductrice après une incubation de 10 minutes, en référence

à une courbe d'étalonnage du xylose. Le pH et la tempéra-

ture de chaque incubation sont indiqués dans les exemples.

Exemple 5.

La relation pH-activité est obtenue à une tempé-

rature de 50 C.

pH 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 % d'activité maximale 62 85 100 84 70 47 Une hydrolyse importante se produit dans toute

la gamme illustrée.

Exemple 6.

On étudie la stabilité thermique en maintenant les échantillons à des températures de 60, 70, 80, 90 et C en l'absence de substrat et en prélevant des quantités à intervalles de temps pour obtenir une famille de courbes activité résiduelle-temps. L'activité restante est mesurée à pH 5,0 et à 50 C: - à 60"C, on ne décèle pas de perte d'activité au bout de minutes, - à 70 C, il subsiste encore 70 % de l'activité initiale après 1 heure, - à 80 C, il subsiste encore 70 % de l'activité initiale après 30 minutes, - à 90 C, il subsiste encore 50 % de l'activité initiale après 8 minutes, - à 95 C, il subsiste encore 50 % de l'activité initiale

après 6 minutes.

Exemple 7.

La relation température-activité est obtenue à un pH de.5,0. Un examen de la courbe activité-température

révèle qu'une activité de pointe se produit à 87 2 C.

Les activités aux températures individuelles étudiées,

exprimées en pourcentages de ce maximum, sont les suivan-

tes:

15.. .

% d'activité 13 24 41 57 86 [100] 90 45 maximale Température C 40 50 60 70 80 [87 2] 90 95 Les résultats confirment la stabilité thermique

inhérente de la nouvelle enzyme, comme indiqué dans l'exem-

ple 5. L'enzyme peut être à l'évidence utilisée à des tem-

pératures supérieures à 90 C.

Ceci se distingue d'un optimum médiocrement défi-

ni de 60-7o0 C pour la 6-glucanase de l'orge du brevet bri-

tannique Ne 1 421 127. A 80 C, on n'enregistre que 40 % de

l'activité de pointe.

Exemple 8.

Dans une étude préliminaire visant à déterminer si l'activité de l'enzyme est affectée par les produits de la réaction et/ou d'autres sucres présents dans un produit de digestion représentatif dans un procédé industriel, on ajoute séparément à l'enzyme trois sucres simples (xylose,

glucose et maltose) que l'on titre ensuite à 50 C et pH 5,0.

Chacun des sucres est ajouté en une quantité équivalant à

la quantité de xylose libérée par le substrat dans les con-

ditions de l'analyse.

Il n'y a pas d'inhibition ni d'accentuation de l'activité enzymatique et ainsi, à l'évidence, l'activité enzymatique ne se trouve pas affectée par l'accumulation des sucres simples comme il s'en produit dans de nombreuses

applications industrielles.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Enzyme, caractérisée en ce qu'elle peut être

obtenue à partir d'une souche de l'espèce Talaromyces emer-

sonii ou d'un mutant de celle-ci, et qui est capable de ca-

talyser la dégradation de pentosanes.

2. Enzyme selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente un pH d'activité optimale, mesuré à C, d'environ 5,0, et une température d'activité optimale, mesurée à pH 5, 0, de 87 2 C, et en ce qu'elle conserve environ 50 % de son activité initiale après chauffage à C pendant six minutes à pH 5,0, toutes mesures étant faites en utilisant un substrat de pentosane constitué de

xylane de balles d'avoine.

3. Composition d'enzyme, caractérisée en ce qu'elle comprend une enzyme selon la revendication 1 ou 2 en mélange avec une e-1,4/>1l,3-glucanase et dans laquelle le niveau d'activité de pentosanase a été augmenté par rapport au niveau d'activité de 0-1,4/B-1,3-glucanase par modification du milieu de fermentation dans lequel chacune

est produite.

4. Enzyme ou composition selon l'une quelconque

des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la souche

utilisée est Talaromyces emersonii IMI 116815, CiI CC 290604

ou un mutant de celles-ci.

5. Procédé de préparation d'une composition d'en-

zyme présentant une activité de pentosanase, caractérisé

en ce qu'il comprend la fermentation d'une souche de micro-

organismes de l'espèce Talaromyces emersonii dans un milieu nutritif lui convenant, ce par quoi est produit un bouillon

contenant ladite enzyme.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé

en ce que le niveau de l'activité de pentosanase est aug-

menté par rapport au niveau de l'activité de 0-1,4/0-1,3-

glucanase par modification du milieu nutritif.

7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, carac-

térisé en ce que le niveau de l'activité de pentosanase est

augmenté par rapport au niveau de l'activité de $-1,4/0-1,3-

glucanase par une étape de purification subséquente à la fermentation.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 5 à 7, caractérisé en ce que la souche est Talaromyces

emersonii IMI 116815, CMI CC 290604 ou un mutant de celle-ci.

9. Procédé de réduction de la teneur en pentosanes d'une matière contenant des pentosanes, caractérisé en ce qu'elle consiste à mettre en contact ladite matière avec une enzyme ou une composition selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé

en ce que la matière contenant des pentosanes est une cé-

réale choisie parmi le blé et l'avoine, une plante choisie parmi le thé et le café ou un extrait de ceux-ci, un fruit

ou un légume.

11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, ca-

ractérisé en ce que la matière contenant des pentosanes

est l'amidon.

12. Procédé selon la revendication 9 ou 10, ca-

ractérisé en ce que la matière contenant des pentosanes

est du blé ou provient du blé.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 9 à 12, caractérisé en ce que l'enzyme est mise en contact avec la matière contenant des pentosanes dans un milieu aqueux à une température située dans la plage de

-95 C et à un pH situé dans la plage de 4,0 à 6,5.

14. Utilisation d'une composition contenant une

enzyme du type pentosanase provenant d'une souche de l'es-

pèce Talaromyces emersonii dans la réduction de la teneur

en pentosanes d'une céréale choisie parmi le blé et l'avoi-

ne, d'une plante choisie parmi le thé et le café ou un ex-

trait de ceux-ci, d'un fruit ou d'un légume.