FR2535461A1 - REAGENT FOR THE DETERMINATION OF B-LIPOPROTEINS - Google Patents
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Abstract
LES B-LIPOPROTEINES SONT DETERMINEES QUALITATIVEMENT OU QUANTITATIVEMENT EN UTILISANT UN REACTIF COLORIMETRIQUE CONSTITUE PRINCIPALEMENT PAR UN DES DERIVES DU TRIPHENYL-METHANE DANS LEQUEL LA PRESENTE CONSTANTE DES SUBSTITUANTS DE L'HYDROGENE INDIQUES DANS LA FORMULE I EST ESSENTIELLE : (CF DESSIN DANS BOPI) FORMULE DANS LAQUELLE R ET R, QUI PEUVENT ETRE IDENTIQUES OU DIFFERENTS, SONT DES ATOMES HAL, ET X PEUT ETRE H OU UN CATION MONOVALENT ET, DE PLUS, LES ATOMES H ARYLIQUES, QUI NE SONT PAS MONTRES, PEUVENT ETRE EGALEMENT SUBSTITUES. PARMI CES DERIVES DU TRIPHENYLMETHANE, LE MORDANT BLEU 1 (CI 43830) ET LE MORDANT BLEU 29 (CI 43825) SONT PARTICULIEREMENT APPROPRIES. CES DERIVES SONT DESIGNES DANS LA PRESENTE DEMANDE PAR "COLORANTS B-LIPOPROTEIQUES". UTILISATION DE CE REACTIF COLORIMETRIQUE POUR IDENTIFIER LES B-LIPOPROTEINES ET LES DOSER.B-LIPOPROTEINS ARE DETERMINED QUALITATIVELY OR QUANTITATIVELY BY USING A COLORIMETRIC REAGENT CONSTITUTED MAINLY BY ONE OF THE DERIVATIVES OF TRIPHENYL-METHANE IN WHICH THE PRESENT CONSTANT OF HYDROGEN SUBSTITUENTS INDICATED IN THE FORMULA (CFINOPROTE I) (CFINOPROTEINS) INDICATED IN THE FORMULA (CFINOPROTEIN I) (CFINOPROTEINS). IN WHICH R AND R, WHICH MAY BE THE SAME OR DIFFERENT, ARE HAL ATOMS, AND X MAY BE H OR A MONOVALENT CATION AND, IN ADDITION, H ARYL ATOMS, WHICH ARE NOT SHOWN, MAY ALSO BE SUBSTITUTED. OF THESE DERIVATIVES OF TRIPHENYLMETHANE, BLUE MORDANT 1 (CI 43830) AND BLUE MORDANT 29 (CI 43825) ARE PARTICULARLY APPROPRIATE. THESE DERIVATIVES ARE DESIGNATED IN THIS APPLICATION BY "B-LIPOPROTEIC COLORANTS". USE OF THIS COLORIMETRIC REAGENT TO IDENTIFY B-LIPOPROTEINS AND ASSAY THEM.
Description
Réactif pour la détermination des P-lipoprotéines.Reagent for the determination of β-lipoproteins.
La présente invention concerne l'utilisation d'un "colorant pour tlipoprotéines dans l'identification des i-lipoprotéines Plus particulièrement,elle concerne l'utili- sation d'un colorant pour -11 poprotéienes dans une solution The present invention relates to the use of a lipoprotein dye in the identification of i-lipoproteins. More particularly, it relates to the use of a dye for -11 poproteal in a solution.
tampon et en présence de tensio-actifs cationiques ou non- buffer and in the presence of cationic or non-cationic surfactants
ioniaues appropriés et de groupes anioniques provenant de sels appropriate ionic and anionic groups derived from
métalliques ou d'acides minéraux, dans la déterminationsemi- metallic or mineral acids, in the
quantitative ou auantitative des -lipoprotéines. quantitative or quantitative of lipoproteins.
Les lipoprotéines sont connues pour agir comme Lipoproteins are known to act as
supports liquides dans le sang.liquid carriers in the blood.
Elles peuvent être divisées en quatre fractions principales qui se différencient par la composition des -15 liquides supportés, les protéines porteuses, leur taille, They can be divided into four main fractions which are differentiated by the composition of the supported liquids, the carrier proteins, their size,
leur densité, leur mobilité électrophorétique et leurs carac- their density, their electrophoretic mobility and their
téristiques antigènes.antigenic characteristics.
Trois fractions lipoprotéiques peuvent être déter- Three lipoprotein fractions can be
minées dans le sérum prélevé à jeun, à savoir les lipopro- in the serum taken on an empty stomach, namely lipoprotein
téines à très basse densité (VLDL), la lipoprotéine à basse densité (LDL) et la lipopritéine à haute densité (HDL) Dans le sérum post-prandial, une quatrième fraction est rencontrée, à savoir la chylomicra, dont la présence dans les sujets à jeun very low density (VLDL), low density lipoprotein (LDL) and high density lipopritein (HDL) In the post-prandial serum, a fourth fraction is encountered, namely chylomicra, whose presence in subjects with an empty stomach
est pathologique.is pathological.
La détermination des diverses fractions de lipopro- The determination of the various fractions of lipoprotein
téines est d'un intérêt cliniaue considérable du fait qu'elles sontentre autres 1 directement en rapport avec la pathologie de 1 ' artériosclérose Les procédés classiques pour déterminer les diverses fractions de lipoprotéines sont: 1) L'électrophorèse 2) L'ultracentrifugation 3) Les procédés immunologiques et immuno-électrophorétiques These are of considerable clinical interest because they are, inter alia, directly related to the pathology of arteriosclerosis. The conventional methods for determining the various lipoprotein fractions are: 1) Electrophoresis 2) Ultracentrifugation 3) Immunological and immunoelectrophoretic processes
4) Les procédés immunonéphélométriques. 4) Immunonephelometric processes.
On connaît des procédés colorimétriques dans lesquels la concentration des protéines est obtenue plus ou moins approximativement par détermination du cholestérol et des Colorimetric methods are known in which the concentration of proteins is obtained more or less approximately by determination of cholesterol and
lipides liés aux protéines.lipids bound to proteins.
En particulier, en ce qui concerne les LDL, c'est-à-dire les protéines qui sont considérées couramment In particular, with regard to LDL, that is to say the proteins that are commonly considered
pour être directement en rapport avec la pathologie de l'artérios- to be directly related to the pathology of the arteriosus
clérose, on ne connaît pas de procédésdirectsspectrophoto- clerose, there are no known processes
métriquespour leur détermination.metrics for their determination.
Les auteurs de la présente invention ont découvert que les -lipoprotéines réagissent d'une façon spécifique avec un colorant pour P -lipoprotéines et ceci constitue une The present inventors have found that lipoproteins react specifically with a dye for lipoproteins and this
partie intégrale de la présente invention. integral part of the present invention.
Par conséquent, un premier objet de la présente invention est l'utilisation (dans l'identification des l 4-lipoprotéines) d'un colorant pour r-lipoprotéines qu'on appellera colorant -lipoprotéique choisi parmi les dérivés du triphénylméthane dans lesquels la présence constante des substituants de l'hydrogène indiqués dans la formule générale ( 1) est essentielle: Therefore, a first object of the present invention is the use (in the identification of 4-lipoproteins) of a dye for r-lipoproteins which will be called lipoprotein dye selected from triphenylmethane derivatives in which the presence constant of the hydrogen substituents indicated in the general formula (1) is essential:
H O H O
XOOC C OOXXOOC C OOX
(i)(I)
H C HH C H
""
R 1 R 2R 1 R 2
formule dans laquelle R 1 et R 2;qui peuvent être identiques ou différents,représentent des atomes d'halogène, et X peut être de l'hydrogène ou un cation monovalent etde plus, les hydrogènes du noyau aryle 1 qui ne sont pas montrésipeuvent wherein R 1 and R 2, which may be the same or different, represent halogen atoms, and X may be hydrogen or a monovalent cation and furthermore, the hydrogens of the aryl ring 1 which are not shown are
également être substitués.also be substituted.
Un second objet de la présente invention est une composition appropriée comprenant: i) un%"col Orant -lipoprotéique*en solution tampon; ii) un agent chélatantpouvant séquestrer les ions métalliques interférants présents dans l'échantillon;en vue d'obtenir une réaction plus spécifique; iii) des groupes minéraux et anioniques; iv) et éventuellement des tensio-actifs cationiques ou non- ionioues. Donc, la composition définitive peut comprendre: A second subject of the present invention is a suitable composition comprising: i) a buffer -antoprotein * in buffer solution; ii) a chelating agent capable of sequestering the interfering metal ions present in the sample; in order to obtain a reaction more specific, iii) inorganic and anionic groups, iv) and optionally cationic or non-ionic surfactants Thus, the final composition may include:
a) Un système tampon pouvant maintenir le p H entre 3 et 7. a) A buffer system that can maintain the pH between 3 and 7.
b) Un agent de chélation pouvant séquestrer les ions métal- (b) A chelating agent capable of sequestering metal ions
liques et en particulier le fer.and in particular iron.
Les agents de chélation particulièrement apptopriés sont Especially suitable chelating agents are
l'acide citrique et ses'sels/et l'acide éthylènediamino- citric acid and sesels / and ethylenediamino acid
tétracétique et ses sels qui peuvent agir également comme tetracetic acid and its salts which may also act as
couples tampons.buffer pairs.
c) Un tensio-actif cationique ou non-ionique et>en particulier, des tensio-actifs cationiques tels que les sels de c) a cationic or nonionic surfactant and> in particular, cationic surfactants such as
basa ammonium quaternaires dans lesquels les groupes non- quaternary ammonium bases in which non-organic groups
hydrophobes sont des groupes alkyles Parmi ceux-ci, le hydrophobic are alkyl groups among them, the
bromure de cétyltriméthylammonium s'est montré particu- cetyltrimethylammonium bromide was particularly
lièrement approprié.appropriate.
d) Des groupes anioniques tels que des halogénures, des nitrates, des sulfates, des phosphates, etc,qui peuvent être ajoutés au mélange sous forme de sels ou sous d) Anionic groups such as halides, nitrates, sulphates, phosphates, etc., which can be added to the mixture in the form of salts or
forme d'acide.form of acid.
L'efficacité du procédé selon la présente invention est déterminée en isolant par chromatographie les protéines The efficiency of the process according to the present invention is determined by isolating by chromatography the proteins
d'un ensemble de sérumshumainsqui dans des conditions appro- of a set of human serums which under appropriate conditions
priées donnent une réaction positive avec un colorant j-lipo- required give a positive reaction with a dye-lipo
j, protéique"et en les identifiant par voie immunologique à l'aide protein and identify them immunologically with the aid of
d'anti-sérumsspécifiqu Es.anti-serum specific Es.
En même temps, les auteurs de la présente invention ont vérifié que les autres protéines sériques fractionnées ne donnaient pas de réaction positive,dans des conditions At the same time, the authors of the present invention verified that other fractionated serum proteins did not give a positive reaction under conditions
analoguesavec le colorant p-lipoprotéique. analogous with the p-lipoprotein dye.
La présente invention est illustrée par les exemples The present invention is illustrated by the examples
descriptifs et non-limitatifs ci-après. descriptive and non-limiting below.
EXEMPLE 1EXAMPLE 1
Compositionsréactivespour identifier les lipoprotéines A) Réactif: Tampon d'acétate de potassium 0,5 Bromure de cétyltriméthylammonium 270 mg/litre Bleu 1 pour Mordant 70 mg/l, Mg C 12 6 H 20 60 g/l Acide citrique 0,026 M, citrate de sodium tribasique 0,038 M. B) Réactif identique au précédent dans lequel le Bleu 1 pour Kordant est remplacé par le Bleu pour Mordant 29 avec une Reactive compositions for identifying lipoproteins A) Reagent: Potassium acetate buffer 0.5 Cetyltrimethylammonium bromide 270 mg / liter Blue 1 for Mordant 70 mg / l, Mg C 12 6 H 20 60 g / l Citric acid 0.026 M citrate tribasic sodium 0.038 M. B) Reagent identical to the previous one in which the Blue 1 for Kordant is replaced by Blue for Mordant 29 with a
concentration de 80 mg/l.concentration of 80 mg / l.
EXEMPLE 2EXAMPLE 2
Identification des p-lipoprotéines dans un sérum humain Identification of p-lipoproteins in a human serum
A) 0,1 ml de sérum est ajouté à 2 ml du réactif A précité. A) 0.1 ml of serum is added to 2 ml of the reagent A above.
Le spectre d'absorption du mélange réactionnel ainsi obtenu est lu avec un spectrophotomètre par rapport à un essai à blanc constitué par 2 ml de réactif et 0,1 ml de solution physiologique Un pic situé entre 640 et 590 nm avec un maximum d'absorption compris entre 600 et 610 nm indique The absorption spectrum of the reaction mixture thus obtained is read with a spectrophotometer compared with a blank test consisting of 2 ml of reagent and 0.1 ml of physiological solution. A peak situated between 640 and 590 nm with an absorption maximum between 600 and 610 nm indicates
la présence des P-lipoprotéines dans le sérum. the presence of β-lipoproteins in the serum.
B) 0,1 ml de sérum est ajouté à 2 ml du réactif B précité en opérant de la même façon que pour l'exemple 2 (A) Un pic situé entre 640 et 770 nm avec un maximum d'absorption entre 580 et 590 nm indique la présence de lipoprotéines dans le sérum. B) 0.1 ml of serum is added to 2 ml of the aforementioned reagent B in the same way as for example 2 (A) A peak situated between 640 and 770 nm with an absorption maximum between 580 and 590 nm indicates the presence of lipoproteins in the serum.
EXEMPLE 3EXAMPLE 3
Composition réactive pour déterminer les lipoprotéines Le réactif est constitué par: Reagent composition for determining lipoproteins The reagent consists of:
Solution chromogène analogue aux réactifs de l'exemple 1. Chromogenic solution analogous to the reagents of Example 1.
Solution pour essai à blanc identique à la solution Solution for blank test identical to the solution
chromogène mais sans colorant lipoprotéique. chromogenic but without lipoprotein dye.
EXEMPLE 4EXAMPLE 4
Détermination des L-lipoprotéines dans des sérums humains Les quantités ci-après sont introduits avec une pipette dans des tubes à essais selon le schéma indiqué: Echantillon Blanc 1 Echantillon Blanc 2 blanc Determination of L-lipoproteins in human sera The following quantities are introduced with a pipette into test tubes according to the scheme indicated: Sample Blank 1 Sample White 2 blank
Sérum ml 0,05 0,05 -Serum ml 0.05 0.05 -
Solution phvysiologiqueml 0,05 0,05 Solution chrcnogène ml 1,5 1,5 Solution pour essai à mi 1,5 1,5 blanc Après avoir laissé 20 minutes, la densité optique de l'échantillon est lue à 615-620 nm par rapport à l'essai à blanc 1 (A 1), et la densité optique de l'échantillon à blanc Physiological solution 0.05 0.05 Chromogenic solution ml 1.5 1.5 Solution for test at 1.5 1.5 1.5 white After leaving 20 minutes, the optical density of the sample is read at 615-620 nm by 1 (A 1), and the optical density of the blank sample
est lue à 615-620 nm par rapport à l'essai à blanc 2 (A 2). is read at 615-620 nm from blank 2 (A 2).
A, c'est-à-dire A 1 A 2 'est proportionnel à la concentration A, that is, A 1 A 2 'is proportional to the concentration
des -lipoprotéines dansle sérum.lipoproteins in the serum.
EXEMPLE 5EXAMPLE 5
Comparaison sérums humains sont essayés par le procédé de Comparison human sera are tested by the method of
l'exemple 4.example 4.
Les @-lipoprotéines sont dosées dans les mêmes sérums par le procédé d'immunodiffusion radial, (plaques The β-lipoproteins are assayed in the same sera by the radial immunodiffusion method (plates
fournies par la Société BEHRINGWERKE AG). provided by BEHRINGWERKE AG).
Le coefficient de corrélation des résultats obtenus The correlation coefficient of the results obtained
par les deux procédés, rest 0,86.by both methods, 0.86 remains.
Claims (4)
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EP0414935A1 (en) * | 1989-08-30 | 1991-03-06 | Miles Inc. | Method and composition for the assay of albumin |
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- 1983-10-25 GB GB08328420A patent/GB2129129A/en not_active Withdrawn
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- 1983-10-28 ES ES527175A patent/ES527175A0/en active Granted
- 1983-10-28 JP JP58201135A patent/JPS5995461A/en active Pending
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