DE2435303B1 - Method for the determination of lipoproteins in blood serum - Google Patents

Description

Dies ist wohl darauf zurückzuführen, daß der Farbstoff direkt bei seiner Entstehung von den Lipoproteinen absorbiert wird. Die Herstellung des Farbstoffes unter Verwendung von Ausgangsmaterialien, von denen mindestens eines wasserlöslich bzw. serumlöslich ist, erlaubt das Arbeiten in wäßrigem Medium, so daß sich die Verwendung von organischen Lösungsmitteln, die die Lipoproteine und damit auch das Analysenergebnis beeinträchtigen können, erübrigt. Der Farbstoff wird vorzugsweise aus einem Leukofarbstoff durch eine Redoxreaktion hergestellt. Die Verwendung solcher Leukofarbstoffe für biochemische Reaktionen ist allgemein bekannt und beispielsweise in »Methoden der enzymatischen Analyse«, herausgegeben von Hans Ulrich Bergmeyer, 3.Auflage 1974, Band 1, S. 145 bis 153 beschrieben. Besonders geeignete Leukofarbstoffe sind die Tetrazoliumverbindungen, die durch Reduktion in ein stark gefärbtes Formazan übergehen, das in Wasser schwer löslich ist. Diese Tetrazoliumsalze werden in der Biochemie hauptsächlich dazu verwendet, um in Körperflüssigkeiten oder in Gewebeschnitten das Vorhandensein von reduzierten Pyridincoenzymen durch Bildung eines stark gefärbten Formazans anzuzeigen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden demgegenüber alle zur Herstellung des Farbstoffs benötigten Ausgangsmaterialien dem Serum zugegeben, da nicht die Farbstoffbildung zum Nachweis bestimmter Stoffe dient, sondern der entstehende Farbstoff die Aufgabe hat, im Serum stets vorhandene Lipoproteine anzufärben. This is probably due to the fact that the dye is directly involved its formation is absorbed by the lipoproteins. The manufacture of the dye using starting materials at least one of which is water soluble or is serum-soluble, allows you to work in an aqueous medium, so that the Use of organic solvents that remove the lipoproteins and thus also the Can affect the analytical result, superfluous. The dye is preferred made from a leuco dye through a redox reaction. The use of such Leuco dyes for biochemical reactions is well known and for example in "Methods of Enzymatic Analysis", edited by Hans Ulrich Bergmeyer, 3rd edition 1974, Volume 1, pp. 145 to 153. Particularly suitable leuco dyes are the tetrazolium compounds that are reduced to a strongly colored formazan pass over, which is sparingly soluble in water. These tetrazolium salts are in the Biochemistry mainly used to break into body fluids or into tissue sections the presence of reduced pyridine coenzymes due to the formation of a strongly colored Formazans to display. In contrast, in the method according to the invention all raw materials required for the production of the dye are added to the serum, because it is not the dye formation that serves to detect certain substances, but the The resulting dye has the task of staining lipoproteins that are always present in the serum.

Die Reduktion des Tetrazoliumsalzes erfolgt, wie in der Biochemie üblich, zweckmäßigerweise mit der reduzierten Form eines Pyridincoenzyms, wobei vorteilhafterweise ein hierfür geeigneter Katalysator bzw. The tetrazolium salt is reduced as in biochemistry usual, expediently with the reduced form of a pyridine coenzyme, wherein advantageously a suitable catalyst or

Elektronenüberträger verwendet wird. Ein allgemein bekannter Katalysator ist Phenazinmethosulfat, das allerdings etwas lichtempfindlich ist.Electron carrier is used. A well known catalyst is phenazine methosulfate, which is, however, somewhat sensitive to light.

Ein als Katalysator geeignetes Enzym ist die Diaphorase. Weitere Reduktionsvermittler sind bestimmte kondensierte Phenoxazine und Phenthiazine, wie sie in der deutschen Offenlegungsschrift 1959410 beschrieben sind. Ein typischer Vertreter dieser Verbindungen ist Meldolablau. Diese Verbindungen sind in oxydiertem Zustand gefärbt, was aber die Einfärbung der Lipoproteine durch die gebildeten Formazane nicht beeinträchtigt. An enzyme suitable as a catalyst is diaphorase. Further Reduction mediators are certain condensed phenoxazines and phenthiazines, such as they are described in the German Offenlegungsschrift 1959410. A typical one A representative of these compounds is Meldola blue. These compounds are in oxidized State colored, but what the coloring of the lipoproteins by the formed formazans not affected.

Für das Anfärben der Lipoproteine wird vorzugsweise so vorgegangen, daß das Serum zuerst mit dem Leukofarbstoff und gegebenenfalls dem Katalysator versetzt wird und erst dann der die Redoxreaktion einleitende Reaktionspartner zugesetzt wird. Von besonderem Vorteil ist die Zugabe mindestens eines der Ausgangsprodukte für den Farbstoff in fester Form. Eine unnötige Verdünnung des Serums kann auf diese Weise vermieden werden. Für die feste Zugabeform eignen sich mit besonderem Vorteil Filterpapierstückchen oder andere poröse Träger, die mit dem jeweiligen Ausgangsmaterial imprägniert sind. Dabei können solche Ausgangsmaterialien, die miteinander verträglich sind, zugleich auf dem selben Träger aufgebracht sein. The procedure for staining the lipoproteins is preferably as follows: that the serum is first mixed with the leuco dye and optionally the catalyst is added and only then the reactant initiating the redox reaction is added will. The addition of at least one of the starting products is particularly advantageous for the dye in solid form. An unnecessary dilution of the serum can affect this Way to be avoided. They are particularly advantageous for the solid form of addition Pieces of filter paper or other porous supports that hold the respective starting material are impregnated. In this case, those starting materials that are compatible with one another can be used are to be applied at the same time on the same carrier.

Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform näher erläutert. The invention will become apparent from the following description of a preferred one Embodiment explained in more detail.

Beispiel Ein Papierstreifen von guter Filterpapierqualität wird in eine wäßrige Lösung getaucht, die oxydiertes farbloses p-Nitroblautetrazoliumchlorid und Phenazinmethosulfat in gesättigter Konzentration enthält. Man läßt kurz abtropfen und trocknet im Exsiccator über einem geeigneten Trocknungsmittel. Nach dem Trock- nen werden aus dem Papier runde Scheibchen mit einem Durchmesser von etwa 5 mm ausgestanzt. Example A paper strip of good filter paper quality is used in immersed in an aqueous solution, the oxidized colorless p-nitro blue tetrazolium chloride and phenazine methosulfate in saturated concentration. It is allowed to drain briefly and dries in the desiccator over a suitable drying agent. After drying nen round discs with a diameter of about 5 mm are punched out of the paper.

In ähnlicher Weise imprägniert man Filterpapier mit einer gesättigten Lösung von NADH. Nach dem Trocknen werden Rechtecke mit einer Grundfläche von 20Quadratmillimeter ausgeschnitten. Die Rechteckform wurde gewählt, um gegenüber den runden Plättchen leicht unterscheiden zu können und eine abfallfreie Teilung des Filterpapiers zu erhalten. In a similar way, filter paper is impregnated with a saturated one Solution from NADH. After drying, rectangles with a base of 20 square millimeters become cut out. The rectangular shape was chosen to be opposite to the round platelets easy to distinguish and a waste-free division of the filter paper obtain.

Die trockenen Plättchen werden getrennt voneinander in bestimmten Mengeneinheiten verpackt und entsprechend der Empfindlichkeit der einzelnen Reagentien aufbewahrt. 0,2 ml Patientenserum, das nicht älter als 24 Stunden ist, werden nun zunächst mit einem runden Plättchen versetzt, das den Tetrazoliumleukofarbstoff und den Elektronenüberträger enthält. Man schüttelt einige Zeit, um die beiden Substanzen aus dem Papier in Lösung zu bringen. Nunmehr gibt man ein rechteckiges Plättchen hinzu und schüttelt ebenfalls. The dry platelets are separated from each other in certain Units of quantity packed and according to the sensitivity of the individual reagents kept. 0.2 ml of patient serum that is not older than 24 hours is now initially mixed with a round plate that contains the tetrazolium leuco dye and contains the electron carrier. Shake the two substances for some time from the paper into solution. Now give a rectangular plate and shakes too.

Dabei färbt sich das Serum dunkelblau bis graphitschwarz. Man läßt noch etwa 10 Minuten stehen und trägt das Serum dann in geeigneter Weise auf einen entsprechend vorbereiteten Objektträger für die Elektrophorese auf.The serum turns dark blue to graphite black. One lets Stand for another 10 minutes and then wear the serum in a suitable manner on one appropriately prepared slides for electrophoresis.

Die Elektrophorese wird über einen Zeitraum von 20 bis 30 Minuten durchgeführt, wobei mit einer Stromstärke von 4 m/A pro Objektträger gearbeitet wird. The electrophoresis is done over a period of 20 to 30 minutes carried out, working with a current of 4 m / A per slide will.

Bei der Reduktion des Leukofarbstoffs wurde ein lipophiler Farbstoff gebildet, der sich direkt an die Lipoproteine anlagerte. Dadurch, daß der Farbstoff in Gegenwart der Lipoproteine gebildet wird, ist die Einfärbung der Lipoproteine sehr intensiv und beständig. Die mit den Filterpapierstückchen eingebrachte Substanzmenge reicht aus, um die im Serum vorhandenen Lipoproteine vollständig anzufärben, wobei ein im Serum verbliebener Farbüberschuß sich bei der Elektrophorese nicht nachteilig auswirkt. Die einzelnen Lipoproteine werden während der Elektrophorese aufgetrennt, wobei sie als farbige Streifen wandern. When the leuco dye was reduced, it became a lipophilic dye formed, which attached directly to the lipoproteins. In that the dye is formed in the presence of the lipoproteins, is the coloring of the lipoproteins very intense and persistent. The amount of substance introduced with the pieces of filter paper is sufficient to completely stain the lipoproteins present in the serum, whereby an excess of color remaining in the serum is not disadvantageous in electrophoresis affects. The individual lipoproteins are separated during electrophoresis, where they wander as colored stripes.

Nach Beendigung der Elektrophorese kann direkt mit der Auswertung begonnen werden, was makroskopisch oder densitometrisch mit einem Elektrophoreseschreiber erfolgen kann. Eine besondere nachträgliche Fixierung ist nicht erforderlich. Durch die Bildung des kräftigen Tetrazoliumfarbstoffs (Formazan) in Gegenwart der B-Lipoproteine werden diese so stark angefärbt, daß die einzelnen Lipoproteine auch noch nach Beendigung der Elektrophorese deutliche und gut gefärbte Bande ergeben, die in einfacher Weise ausgewertet werden können. After completion of the electrophoresis, the evaluation can be started directly be started, what macroscopically or densitometrically with an electrophoresis recorder can be done. A special subsequent fixation is not required. By the formation of the strong tetrazolium dye (formazan) in the presence of the B-lipoproteins these are so strongly stained that the individual lipoproteins even after completion the electrophoresis clearly and well-colored bands show that in a simple manner can be evaluated.

Claims (12)

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung der Lipoproteine im Blutserum durch Anfärben mit einem lipophilen Farbstoff, elektrophoretische Auftrennung der Lipoproteine und optische, insbesondere densitometrische Auswertung des erhaltenen Pherogramms, dadurch gekennzeichnet, daß der die Lipoproteine anfärbende lipophile Farbstoff in Gegenwart des Blutserums hergestellt wird. Claims: 1. Method for determining the lipoproteins in the Blood serum by staining with a lipophilic dye, electrophoretic separation of the lipoproteins and optical, especially densitometric evaluation of the obtained Pherogram, characterized in that the lipophilic which stains the lipoproteins Dye is produced in the presence of the blood serum. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lipophile Farbstoff aus wasserlöslichen, insbesondere serumlöslichen Ausgangsprodukten hergestellt wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that the lipophilic Dye made from water-soluble, in particular serum-soluble, starting materials will. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der lipophile Farbstoff durch Redoxreaktion, insbesondere Reduktion, aus einem Leukofarbstoff hergestellt wird. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the lipophilic dye by redox reaction, in particular reduction, from a leuco dye will be produced. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst der Leukofarbstoff und ein gegebenenfalls verwendeter Katalysator im Serum gelöst und erst dann der die Redoxreaktion einleitende Reaktionspartner zugegeben wird. 4. The method according to claim 3, characterized in that first the leuco dye and an optionally used catalyst dissolved in the serum and only then is the reactant that initiates the redox reaction added. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Leukofarbstoff ein Tetrazoliumsalz verwendet wird. 5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that a tetrazolium salt is used as the leuco dye. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Katalysator Phenazinmethosulfat verwendet wird. 6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that phenazine methosulfate is used as a catalyst. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als die Redoxreaktion einleitender Reaktionspartner ein Pyridincoenzym, insbesondere NADH, verwendet wird. 7. The method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that that as the reactant initiating the redox reaction, a pyridine coenzyme, in particular NADH, is used. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Ausgangsprodukte zur Bildung des Farbstoffs in festem Zustand in das Serum gegeben wird. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that at least one of the starting materials for the formation of the dye in the solid state is added to the serum. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Ausgangsprodukte zur Bildung des Farbstoffs im Verhältnis zum Lipoidgehalt des Serums in einem begrenzten Überschuß zugegeben wird. 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that at least one of the starting materials for the formation of the dye in proportion is added to the lipoid content of the serum in a limited excess. 10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Ausgangsprodukte in Form eines mit dem Ausgangsprodukt imprägnierten Filterpapiers in das Serum gegeben wird. 10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that at least one of the starting products in the form of one impregnated with the starting product Filter paper is added to the serum. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Leukofarbstoff und der Katalysator auf das gleiche Filterpapier aufgetrocknet und in Form dieses Papiers gemeinsam dem Serum zugegeben werden. 11. The method according to claim 10, characterized in that the leuco dye and the catalyst is dried on the same filter paper and in the form of this Paper can be added to the serum together. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Bildung des lipophilen Farbstoffs bzw. nach Zugabe der zur Bildung des Farbstoffs dienenden Ausgangsprodukte noch etwa 10 Minuten wartet, bevor mit der elektrophoretischen Auftrennung begonnen wird. 12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that after formation of the lipophilic dye or after addition of the for formation the starting products serving for the dye wait about 10 minutes before using the electrophoretic separation is started. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Lipoproteine im Blutserum durch Anfärben mit einem lipophilen Farbstoff, elektrophoretische Auftren- nung der Lipoproteine und optische, insbesondere densitometrische Auswertung des erhaltenen Pherogramms. Bei der bekannten Lipoproteinfärbung wird zunächst Ölrot oder auch Sudanschwarz in Alkohol bei 37"C gelöst und dann bei dieser Temperatur mit Wasser bis zu einer 50%igen alkoholischen Lösung verdünnt. Diese Lösung ist leicht übersättigt und bei Einhaltung der Temperatur von 37"C etwa 2 Tage haltbar. The invention relates to a method for determining lipoproteins in the blood serum by staining with a lipophilic dye, electrophoretic separation tion of the lipoproteins and optical, especially densitometric evaluation of the obtained Pherogram. In the case of the known lipoprotein coloring, it first turns oil red or else Sudan black dissolved in alcohol at 37 "C and then with water at this temperature diluted up to a 50% alcoholic solution. This solution is slightly oversaturated and can be kept for about 2 days if the temperature of 37 "C is maintained. Diese Lösung verwendet man zum Anfärben der Lipoproteinbande nach Durchführung der Elektrophorese.This solution is used to stain the lipoprotein bands Performing electrophoresis. Bevor die Bande angefärbt werden können, wird noch eine Fixierung, ein Waschvorgang und eine anschließende Trocknung vorgenommen.Before the bands can be stained, a fixation is required, carried out a washing process and a subsequent drying. Man hat auch schon versucht, Ölrot in Alkohol zu lösen und mit dieser Lösung das Serum vor dessen elektrophoretischer Auftrennung direkt anzufärben. Attempts have also been made to dissolve oil red in alcohol and with this Solution to stain the serum directly before its electrophoretic separation. Hierbei haben sich jedoch erhebliche Schwierigkeiten ergeben. Einmal sind die Lipoproteine bzw. ihre Lipidbestandteile gegenüber Alkohol empfindlich, so daß sie beim Anfärben mit der alkoholischen Lösung Veränderungen erfahren. Andererseits ergeben die angefärbten Lipoproteine nach der Elektrophorese nur schwach angefärbte Lipoproteinbande, was einer quantitativen Auswertung entgegensteht.However, considerable difficulties have arisen here. Once are the lipoproteins or their lipid components sensitive to alcohol, so that they experience changes when staining with the alcoholic solution. on the other hand the stained lipoproteins yield only weakly stained ones after electrophoresis Lipoprotein band, which contradicts a quantitative evaluation. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Lipoproteinbestimmung zu vereinfachen und gleichzeitig eine quantitative Auswertung zu ermöglichen. The object of the invention is to determine the lipoprotein to simplify and at the same time enable a quantitative evaluation. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der die Lipoproteine anfärbende lipophile Farbstoff in Gegenwart des Blutserums hergestellt wird. Die Herstellung des Farbstoffs erfolgt vorzugsweise aus wasserlöslichen, insbesondere serumlöslichen Ausgangsprodukten. The invention is characterized in that the lipoproteins coloring lipophilic dye is produced in the presence of the blood serum. the The dye is preferably prepared from water-soluble, in particular serum-soluble starting products. Ölrot und Sudanschwarz sind lipophile Farbstoffe, weshalb sie in mehr oder weniger verdünnten alkoholischen Lösungen zur Anwendung kommen. Obwohl die Lipoproteine selbst ebenfalls lipophil sind, ist eine derart intensive Anfärbung mit Ölrot oder Sudanschwarz, daß auch nach Beendigung der Elektrophorese noch deutlich gefärbte Lipoproteinbande erhalten bleiben, nicht möglich. Wird dagegen, wie es beim erfindungsgemäßen Verfahren der Fall ist, der Farbstoff erst in Gegenwart der Lipoproteine gebildet, dann erfolgt eine wesentlich intensivere Anfärbung der Lipoproteine. Oil red and Sudan black are lipophilic dyes, which is why they are used in more or less dilute alcoholic solutions are used. Even though the lipoproteins themselves are also lipophilic, is such an intense color with oil red or Sudan black, that is still clear even after the electrophoresis has ended colored lipoprotein bands are retained, not possible. Will mind how it in the process of the invention is the case, the dye only in the presence of Lipoproteins are formed, the lipoproteins are then stained much more intensely.