FI97393B - Glyoksyylihapon valmistus glykolihapon entsymaattisella hapetuksella - Google Patents

Description

97393

Glyoksyylihapon valmistus glykolihapon entsymaattisella hapetuksella

Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön ala Tämä keksintö koskee parannettua menetelmää glyoksyylihapon valmistamiseksi glykolihapon glykolaattioksi-daasikatalysoidulla hapetuksella. Vaikka glykolihapon ent-syymikatalysoitu reaktio hapen kanssa on tunnettu useita 10 vuosia, edellä kuvatut menetelmät eivät ole osoittautuneet kaupallisesti edullisiksi useista syistä. Kaikkein tärkein näistä on, että aikaisemmat reaktiot on suoritettu glykolihapon suurilla laimennuksilla, tyypillisesti 40 mM:n tai pienemmillä pitoisuuksilla. Glyoksyylihapon selektiivisyys 15 ja glyoksyylihappotuotteen saannot ovat tavallisesti olleet pienet. Haittana hyvin laimeiden glykolihapon alkuvä-kevyyksien käytöstä on suurten ja kalliiden reaktioastioi-den tarve suurten tuotantonopeuksien saavuttamiseksi. Samoin koska glyoksyylihappo myydään tavallisesti 50-pro-20 senttisena vesiliuoksena (Ullmans), laimeita lähtöreagens-seja käyttäen valmistetun laimean glyoksyylihapon konsent-rointi on kallista. Edelleen mikäli tämä konsentrointi suoritettaisiin haihduttamalla tai käänteisosmoosilla, kaikki haihtumattomat sivutuotteet, kuten oksaali- ja muu-25 rahaishapot ja/tai niiden suolat ja reagoimaton glykoli- happo jäisivät liuokseen epäpuhtauksina. Lopuksi olisi edullista, mikäli reaktiossa käytettyjä suhteellisen kalliita entsyymejä voitaisiin käyttää tehokkaammin tai kierrättää tehokkaasti ja mikäli ympäristölle haitallisia jät-30 teitä ei muodostuisi.

. Tämä keksintö kohdistuu kaupallisesti käytännölli seen menetelmään glyoksyylihapon valmistamiseksi glykoli-hapon glykolaattioksidaasikatalysoidulla hapetuksella nostaen lähtöaineen väkevyyksiä ja käyttäen valikoituja, 35 saantoa parantavia lisäaineita.

2 97393 2. Tekniikan tausta: Tämä keksintö on menetelmä glyoksyylihapon valmistamiseksi hapettamalla glykolihappoa hapella käyttäen gly-kolaattioksidaasientsyymiä reaktion katalyyttinä.

5 N. E. Tolbert et ai., J. Biol. Chem. , Voi. 181, 905 - 914 (1949) ilmoittivat, että tupakanlehdistä uutettu entsyymi katalysoi glykolihapon hapettamista muurahaishapoksi ja C02:ksi glyoksyylihappovälituotteen kautta. He havaitsivat edelleen, että tietyt yhdisteet, kuten etylee-10 nidiamiini estivät glyoksyylihappovälituotteen hapettumisen muiksi tuotteiksi. Hapetukset suoritettiin pH-arvolla n. 8 käyttäen n. 3 - 40 mM (millimolaarinen) glykolihappo-väkevyyksiä lukuunottamatta erästä koetta (sivu 907), jota on hyvin huonosti kuvattu ja jossa glykolihapon alkuväke-15 vyys oli suunnilleen välillä 132 - 196 mM. Ainoat tästä kokeesta annetut yksityiskohdat ovat likimääräinen glykoli happoväke vyys, se seikka että hapetusta ei suoritettu loppuun ja että pieni määrä glyoksyylihapon 2,4-dinitrofe-nyylihydratsonia eristettiin. Erityisesti mitään yksityis-• 20 kohtia ei esitetä reaktion saantojen ja kestoajan suhteen.

Glykolaatin hapetuksen optimi-pH-arvon ilmoitettiin olevan 8,9. Oksaalihapon (100 mM) ilmoitettiin ehkäisevän glyko-laattioksidaasin katalyyttistä vaikutusta.

I. Zelitch ja S. Ochoa, J. Biol. Chem., Voi. 201, 25 707 - 718 (1953), ilmoittivat, että muurahaishapon ja C02:n muodostuminen glykolihapon glykolaattioksidaasikatalysoi-dussa hapetuksessa oli tulosta H202:n ei-entsymaattisesta reaktiosta glyoksyylihapon kanssa, näiden ollessa glykoli-hapon entsyymikatalysoidun hapetuksen ensisijaisia tuot-30 teitä. Niinpä he totesivat, että katalaasin, entsyymin, . joka katalysoi H202:n hajoamista, lisäys paransi suuresti glyoksyylihapon saantoja pienentämällä muurahaishapon ja C02:n muodostusta. Heidän käyttämänsä glykolaattioksidaasi eristettiin pinaatin lehdistä. Sitä käytettiin pH-arvolla 35 noin 8 glykolihapon alkupitoisuuden ollessa 10 mM. He ha- 3 97393 vaitsivat myös, että FMN: n (flaviinimononukleotidi) lisäys paransi suuresti glykolaattioksidaasin tehokkuutta.

J. C. Robinson et ai., J. Biol. Chem., Voi. 237, 2001 - 2009 (1962) havaitsivat myös, että katalaasi lisää 5 glyoksyylihapon saantoa glykolihaposta. He käyttivät ilmeisesti katalaasia ja glykolaattioksidaasia suhteessa n. 80:1. He tulivat myös siihen tulokseen, että katalaasi hajotti sen vetyperoksidin, jota muodostui glykolihapon glykolaattioksidaasilla katalysoidussa reaktiossa hapen 10 kanssa (heidän artikkelissaan glykolaattioksidaasista käytetään nimitystä "lyhytketjuinen L-alfa-hydroksihappo-ok-sidaasi"). He havaitsivat, että FMN auttoi ylläpitämään glykolaattioksidaasiaktiivisuutta. He määrittivät myös, että glykolaattioksidaasilla katalysoidun glykolihapon 15 hapettumisen maksiminopeus sattuu glykolihapon (substraatti) pitoisuuteen 3,3 mM ja että "Reaktiota havaittiin hidastavan:.....(e) näiden substraattien, glykolaatin ja....korkeiden pitoisuuksien.

K. E. Richardson ja N.E. Tolbert, J♦ Biol. Chem., • 20 Voi. 236, 1280 - 1284 (1961) osoittivat, että puskurit, jotka sisälsivät tris(hydroksimetyyli)aminometaania, hidastivat oksaalihapon muodostusta glykolihapon glykolaattioksidaasilla katalysoidussa hapetuksessa. He suorittivat myös reaktionsa pH-arvolla n. 8 ja havaitsivat, että FMN 25 paransi glykolaattioksidaasin tehokkuutta. Heidän käyttä- • mänsä maksimi glykolihappoväkevyys oli 20 mM.

C.O. Clagett, N.E. Tolbert ja R.H. Burris, J. Biol. Chem., Voi. 178, 977 - 987 (1949) havaitsivat, että optimi pH glykolihapon glykolaattioksidaasikatalysoidulle hape-30 tukselle hapella oli n. 7,8 - 8,6 ja optimilämpötila oli 35 - 40 °C. Heidän käyttämänsä maksimi substraatin (glyko-lihappo) pitoisuus oli n. 20 mM.

Kirjallisuudessa on lukuisia muita viittauksia glykolihapon hapetukseen katalysoituna glykolihappo-oksidaa-35 silla, esimerkiksi: 4 97393

Entsyymin eristäminen (tavallisesti sisältää määritysmenetelmän ): I. Zelith, Methods of Enzymology, Voi. 1, Academic Press, New York, 1955, sivut 528 - 532, pinaatin ja tupa-5 kan lehdistä, M. Nishimura et ai., Arch. Biochem. Biophys, Voi. 222, 397 - 402 (1983), kurpitsan sirkkalehdistä, H. Asker ja D. Davies, Biochem. Biophys. Acta, Voi. 761, 103 - 108 (1983), rotan maksasta, 10 M.J. Emes ja K.H. Erismann, Int. J. Biochem., Voi.

16, 1373 - 1378 (1984), lajista Lemna Minor L.

Entsyymin rakenne: E. Cederlund et ai., Eur. J. Biochem♦, Voi. 173, 523 - 530 (1988).

15 Y. Lindquist ja C. Branden, J♦ Biol. Chem. Voi.

264, 3624 - 3628 (1989).

Kaikissa edellä mainituissa kirjallisuusviitteissä ja kaikissa muissa, joita on tutkittu [yhtä poikkeusta lukuunottamatta, joka on mainittu edellä N.E. Tolbert et 20 ai: in artikkelissa J. Biol. Chem., Voi. 181, 905 - 914 (1949)] käytetty glykolihapon maksimi alkuväkevyys on n. 40 mM, pH on tavallisesti ollut n. 8-9, FMN:a lisätään toisinaan, amiinia toisinaan ja toisinaan lisätään katalaasia. Muita lisäaineita glyoksyylihapon saannon pa-25 rantamiseksi on myös mainittu.

Lukuisia tavallisia kemiallisia (ei-entsymaattisia) menetelmiä glyoksyylihapon teolliseksi syntetisoimisek-si on ehdotettu, kts. esimerkiksi US-patentit 3 281 460, 4 146 731 ja 4 235 684 sekä Ullmanns Encyklopadie der 30 technischen Chemie, 4. painos, Voi. 12, Verlag Chemie, ; Weinheim, 1976, sivu 381 (tässä Ullmanns). Joissakin näis tä menetelmistä tuotetaan ympäristölle haitallisia tuotteita. Missään näistä ei tarkastella glykolihapon hapettamista glyoksyylihapoksi.

5 97393

Vaikka glykolihappo on kaupallinen tuote, tämän hakemuksen tekijän tiedon mukaan kukaan ei ole aikaisemmin tarkastellut glykolihapon glykolaattioksidaasilla katalysoidun hapetuksen käyttöä glyoksyylihapon valmistamiseksi.

5 On arveltu, että tämä voi johtua kemistien ja kemian insinöörien perehtymättömyydestä entsyymireaktioihin (biokemiaan), biokemistien tietämättömyydestä, että tällainen menetelmä olisi toivottava, suhteellisen pienistä saannoista tai konversioista, jotka on ilmoitettu useimmissa 10 kirjallisuusviitteissä, ilmoitetusta substraatin inhibi- toitumisesta ja/tai aikaisemmin käytetyn substraatin pienistä pitoisuuksista.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee menetelmää glyoksyylihapon 15 valmistamiseksi, jossa menetelmässä saatetaan vesiliuok sessa pH-arvolla n, 7 - 10 glykolihappo, glykolaattioksi-daasi ja happi (02) kosketukseen, joka parantaa glyoksyylihapon saantoa, jossa menetelmässä glyoksyylihapon alkupi-toisuus on 200 - n. 2 500 mM. Menetelmä on kaupalliseen 20 tuotantoon käytännössä soveltuva, koska sille on tunnusomaista, että se suoritetaan suhteellisen suurilla glyko-lihappopitoisuuksilla. Optimiolosuhteissa se antaa myös erittäin suuret glyoksyylihapon saannot suurella konversiolla ja käyttää tehokkaasti hyväksi menetelmässä käyte-25 tyt suhteellisen kalliit entsyymit.

’ Glykolihapon 200 - n. 2 500 mM pitoisuuksia voidaan käyttää ja glykolaattioksidaasikatalyytin lisäksi yhtä tai useampia yhdisteitä, kuten katalaasia ja tiettyjä amiineja on myös läsnä glyoksyylihapon saantojen parantamiseksi. 30 Lisättyä FMN:a on valinnaisesti läsnä entsyymin tuottavuu- ; den parantamiseksi. Happea, tavallisesti ilmasta tai puh taammassa muodossa (kuten hapen teollista laatua) käytetään hapettimena reaktiossa. Reaktio voidaan suorittaa ilmakehän painetta korkeammissa hapen paineissa reaktiono-35 peuden nostamiseksi.

6 97393

Keksinnön kuvaus Tämä keksintö koskee glykolihapon glykolaattioksi-daasilla katalysoitua hapetusta.

On määritetty, että jopa noin 2 500 mM substraatin 5 alkupitoisuuksilla voidaan saada korkeat glyoksyylihapon saannot. Saantoa voidaan edelleen maksimoida lisäämällä katalaasia tai muita lisäaineita yksin tai yhdistelmänä. Suuri saanto on odottamaton ottaen huomioon substraatin inhibitoitumisen ja/tai mahdollisen tuotteen inhibitortu-10 misen glykolaattioksidaasista ja myös katalaasin mahdollisen inhibitoitumisen, kun sitä on läsnä (substraatin ja tuotteen inhibitoitumisen selostuksen suhteen kts.

M. Dixon et ai., Enzymes, 3. painos, Academic Press, New York, 1979, sivut 96 - 97, 126 - 127 ja T. Godfrey ja 15 J. Reichelt, Industrial Enzymology, The Nature Press, New York, 1979, sivu 847). Olemme todella havainneet, että yli n. 2 500 mM:n glykolihapon alkupitoisuuksilla glykolaatti-oksidaasikatalysoitu reaktio on suhteellisen hidas. Tämä reaktionopeuden hidastuminen tulee havaittavaksi yli 20 1 500 mM alkupitoisuuksilla ja käy vähitellen huonommaksi, kun substraatin pitoisuus kasvaa. Onneksi tämä hidastuminen tapahtuu riittävän suurella pitoisuudella niin, että käytännön prosessia voidaan operoida. Ei ole osoitettu johtuuko tämä reaktionopeuden hidastuminen substraatin tai 25 tuotteen inhibitoitumisesta tai jostakin muusta tekijästä.

• <

Samoin valitun lisäaineen (kun sitä on läsnä) suuret pitoisuudet, kuten amiinin, jota lisätään saannon lisäämiseksi, voisivat aiheuttaa toisen tai molempien entsyymien inhibitoitumisen tai jopa pilaantumisen.

30 Vaikka substraatin suuri pitoisuus on avain tässä kuvattuun kaupallisesti hyödylliseen prosessiin, muita tekijöitä, jotka parantavat prosessin hyödyllisyyttä, ovat korkea selektiivisyys glyoksyylihappotuotteeksi ja substraatin suuri konversio glyoksyylihappotuotteeksi. Jotta 35 saataisiin glyoksyylihapon suuri saanto hyvin vähäisellä 7 97393 sivutuotteella tai -reaktiolla, on havaittu edulliseksi lisätä reaktioseokseen lisäaineita, jotka parantavat gly-oksyylihapon saantoa, joko entsyymikatalaasia tai valikoitua amiinia, kuten etyleenidiamiinia. Parhaat saannot saa-5 daan, kun sekä katalaasia että valikoitua amiinia lisätään reaktioon. Lisäksi glykolaattioksidaasin tuottavuuden parantamiseksi flaviinimononukleotidia (jäljempänä FMN) voidaan valinnaisesti lisätä pieniä määriä.

Termillä "saanto" tarkoitetaan tässä saatua glyok-10 syylihapon prosenttia laskettuna glykolihapon kokonaismäärästä, joka on läsnä reaktion alussa. Termillä "konversio" tarkoitetaan tässä reaktion alussa läsnä olevan glykolihapon prosenttia, joka on reagoinut muodostaen minkä tahansa muun tuotteen. Termillä "selektiivisyys" tarkoitetaan täs-15 sä reagoineesta glykolihaposta saadun glyoksyylihapon prosenttia. Tästä seuraa matemaattisesti, että saanto on yhtä kuin konversio kertaa selektiivisyys. Termillä "entsyymin tuottavuus" tarkoitetaan entsyymiyksikköä kohti tuotettua glyoksyylihapon määrää.

20 Glykolihappoa (2-hydroksietikkahappo) on saatavana kaupallisesti yhtiöltä E.I. duPont de Nemours and Company, Inc. Kyseessä olevassa reaktiossa sen alkupitoisuus on välillä 200 - n. 2 500 mM, edullisesti n, 250 - 1 500 nM ja kaikkein edullisimmin n. 500 - 1 000 mM. Koska glyko-25 laattioksidaasikatalysoitu hapetus suoritetaan pH-arvolla 7 - 10, hapetuksen aikana glykolihapon arvellaan olevan läsnä glykolaattianionina. Tässä on ymmärrettävä, että termin glykolihappo käyttö, kun viitataan glykolihappoon väliaineessa, jonka pH on yli n. 4, viittaa glykolaatti-30 anioniin.

Glykolaattioksidaasientsyymi voidaan eristää useista lähteistä (supra). Kirjan Enzyme Nomenclature 1984 (Recommendations of the Nomenclature Committee in the International Union of Biochemistry on the Nomenclature 35 and Classification of Enzyme Catalyzed Reactions), Acade- « 8 97393 mic Press, New York, 1984 (jäljempänä IUB), sivut 52 - 53, tämän tyyppisen entsyymin systemaattinen nimi on (S)-2-hydroksihappo-oksidaasi ja sen numero on E.C. 1.1.3.15. IUB liitetään täten viitteenä tähän esitykseen. Reak-5 tiossa käytetyn glykolaattioksidaasin tulee olla läsnä tehokkaana pitoisuutena tavallisesti pitoisuutena n. 0,001 - 1 000 IU/ml ja edullisesti n. 0,1 - 4 IU/ml. IU (kansainvälinen yksikkö) määritellään entsyymin määräksi, joka katalysoi substraatin yhden mikromoolin muuttumi-10 sen minuutissa. Menettely tämän entsyymin määrittämiseksi löytyy kirjallisuusviitteestä I. Zelitch ja S. Ochoa, J. Biol. Chem., Voi. 201, 707 - 718 (1953), joka liitetään viitteenä tähän esitykseen. Tätä menetelmää käytetään myös talteen otetun tai kierrätetyn glykolaattioksidaasin ak-15 tiivisuuden määrittämiseen.

Reaktioliuoksen pH-arvon tulisi olla n. 7 - 10, edullisesti n. 8,0 - 9,5 ja kaikkein edullisimmin 8,0 -9,0. pH-arvoa voidaan ylläpitää puskurin avulla, sillä entsyymin aktiivisuus vaihtelee pH-arvon mukaan. On myös 20 havaittu, että reaktion pH laskee hieman reaktion edistyessä, joten on usein hyödyllistä aloittaa reaktio läheltä entsyymin maksimiaktiivisuuden pH-alueen yläpäätä, arvosta n. 9,0 - 9,5 ja antaa sen laskea reaktion aikana. On myös havaittu, että tietyt amiinit, kuten etyleenidiamiini 25 ja tris(hydroksimetyyli)metyyliamiini (jäljempänä TRIS) parantavat glyoksyylihapon saantoa. Vaikka epäorgaanisia puskureita voidaan käyttää, on edullista käyttää ylimäärin (yli glykolihapon molaarisen määrän) näitä amiineja toimimaan puskureina sekä parantamaan saantoja. Etyleenidiamii-30 ni on etusijalla. Näin ollen näitä amiineja käytetään amiinin ja glykolihapon (lähtömäärä) välisessä moolisuh-teessa n. 1,0 - 3,0, edullisesti n. 1,0 - 2,0 ja kaikkein edullisimmin r. 1,05 - 1,33. Tällä alueella tarkka arvo voidaan säätää halutun pH-arvon saamiseksi. Käytettäessä 35 hyvin emäksisiä amiineja suurilla amiinin ja glykolihapon 9 97393 välisillä suhteilla saattaa olla tarpeen säätää pH-arvoa lisäämällä happoa, esimerkiksi kloorivety- tai rikkihappoa. Käytettäessä vähemmän emäksisiä amiineja, kuten TRIS:iä, saattaa olla tarpeen lisätä emästä halutun 5 pH-arvon ylläpitämiseksi. Vaikka on mahdollista käyttää suurempia määriä amiineja, tällaisilla suuremmilla määrillä on tavallisesti vain vähäistä tai ei lainkaan edullista vaikutusta ja ne aiheuttavat kustannushaitan, erityisesti tuotteen eristyksessä. Näin ollen olisi edullista käyttää 10 pienintä amiinin ja glykolihapon välistä suhdetta, joka on yhdenmukainen halutun saannon, selektiivisyyden ja pH-ar-von saavuttamisen kanssa.

Toinen lisäaine, jota voidaan käyttää glyoksyyliha-pon saannon nostamiseen, on katalaasientsyymi. Katalaasi 15 [tämä on systemaattinen nimi, numero E.C. 1.11.1.6 (IUB)] katalysoi vetyperoksidin hajoamista vedeksi ja hapeksi ja sen arvellaan parantavan saantoja kyseessä olevassa prosessissa kiihdyttämällä vetyperoksidin hajoamista, joka on ensisijainen tuote glykolihapon ja hapen glykolaattioksi-20 daasilla katalysoidussa reaktiossa glyoksyylihapon muo dostamiseksi. Katalaasin pitoisuuden tulisi olla n. 50 -100 000 IU/ml ja edullisesti n. 350 - 14 000 IU/ml. On edullista, että katalaasin ja glykolaattioksidaasin pitoisuudet säädetään edellä esitetyillä alueilla niin, että 25 katalaasin ja glykolaattioksidaasin välinen suhde (kumpikin mitattuna IU-yksiköissä) on vähintään n. 250:1.

FMN on valinnaisesti lisätty aineosa, jota käytetään 0,0 - n. 2,0 mM:n pitoisuus ja edullisesti n. 0,01 -0,2 mM. Arvellaan, että FMN parantaa glykolaattioksidaasin 30 tuottavuutta. Glykolaattioksidaasin tuottavuudella tarkoi tetaan glykolihapon määrää, joka konvertoituu glyoksyyli-hapoksi yhtä yksikköä kohti entsyymiä. On ymmärrettävä, että lisätyn FMN:n pitoisuus on lisänä mahdolliseen entsyymissä olevaan FMN:än, koska FMN:ä lisätään myös usein 35 entsyymiin entsyymin valmistuksen aikana. FMN:n rakenne ja 10 97393 menetelmä sen analysoimiseksi löytyvät kirjallisuusviitteestä K. Yagai, Methods of Biochemistry Analysis, Voi. X, Interscience Publishers, New York, 1962, sivut 319 - 355, joka liitetään täten viitteenä tähän esitykseen.

5 Happi (02) on hapetin, jolla glykolihappo konvertoi daan glyoksyylihapoksi. Se voidaan lisätä esimerkiksi kaasuna reaktioon sekoittamalla nestettä kaasun ja nesteen rajapinnalla tai happea läpäisevän membraanin läpi. Vaikkei haluta sitoutua tähän hypoteesiin, arvellaan että 10 useimmissa olosuhteissa reaktionopeutta kontrolloi ainakin osittain se nopeus, jolla happea voidaan liuottaa vesipitoiseen väliaineeseen. Näin ollen vaikka happi voidaan lisätä reaktioon ilmassa olevana happena, on edullista käyttää suhteellisen puhdasta hapen muotoa ja käyttää jopa 15 korotettuja paineita. Vaikka mitään hapen paineen ylärajaa ei tunneta, hapen paineet korkeintaan n. 5 MPa:in ovat edullisia ja korkeintaan n. 1,5 MPa:in ovat kaikkein edullisimpia. Sekoittaminen on tärkeää korkean hapen liukene-misnopeuden (ja siten reaktionopeuden) ylläpitämiseksi. 20 Mikä tahansa sopiva sekoituksen muoto, kuten hämmentäminen on hyödyllinen. Kuten alaan perehtyneet hyvin tietävät suuren leikkausnopeuden sekoitus tai sekoitus, joka tuottaa vaahtoa, saattaa pienentää entsyymien aktiivisuutta ja on tämän vuoksi vältettävä.

25 Reaktiolämpötila on tärkeä muuttuja, koska se vai kuttaa reaktionopeuteen ja entsyymien stabiilisuuteen. Reaktiolämpötilaa välillä n. 0 - 40 °C, edullisesti välillä n. 5 - 30 °C ja edullisimmin välillä 5 - 20 eC voidaan käyttää. Tietenkään lämpötila ei saisi olla niin matala, 30 että vesi alkaa jäätyä. Nämä edulliset lämpötilat ovat matalampia kuin aikaisemmin ilmoitetut ja ottavat huomioon entsyymin aktiivisuuden säilymisen samoin kuin reaktionopeuden (glykolaatin hapettumisnopeuden). Lämpötilaa voidaan säätää tavallisin menetelmin, kuten, siihen kuiten-35 kaan rajoittumatta, käyttäen vaipalla varustettua reaktio- • 11 97393 astiaa ja johtamalla asianmukaisessa lämpötilassa olevaa nestettä vaipan läpi.

Reaktioastia voi olla valmistettu mistä tahansa materiaalista, joka on inertti reaktion aineosille.

5 Reaktion päätyttyä entsyymit voidaan poistaa suo dattamalla tai jos niitä on läsnä riittävän pienet määrät niin, ettei niiden läsnäolosta ole haittaa, ne voidaan denaturoida lämmittämällä 70 °C:seen 5 minuutiksi. Amiinit on sopivinta poistaa käyttäen ioninvaihtohartsia. Hapanta 10 kationinvaihtohartsia käytetään amiinin poistoon, Sopivia hartseja ovat Amberlite CG120, Amberlite IR120 (valmistaja Rohm & Haas Co. ) ja Dowex 50 (valmistaja Dow Chemical Co.). Amiini voidaan ottaa sitten talteen ja kierrättää sen jälkeen käsittelemällä hartsia vahvalla emäksellä. 15 Entsyymien suodatusta ja amiinin talteenottoa kuvataan tarkemmin esimerkeissä.

Glyoksyylihappotuote on hyödyllinen vaniliinin, etyylivaniliinin valmistuksessa, samoin käytettynä ionin-vaihtohartseina ja happamana katalyyttinä farmaseuttisessa 20 teollisuudessa (Ullmanns). Kuten edellä mainittiin, sitä myydään tavallisesti 50-painoprosenttisena vesiliuoksena. On myös ymmärrettävä, että viittaus glyoksyylihappoon tässä patenttihakemuksessa voi tarkoittaa myös glyoksylaatti-anionia, erityisesti kun glyoksyylihappo on läsnä liuok-25 sessa, jonka pH on yli n. 2,3.

Seuraavissa esimerkeissä ja kokeissa hämmentäminen suoritettiin magneettisella sekoitinsauvalla ellei toisin mainita. Jäljelle jäänyt entsyymiaktiivisuus mitattiin poistamalla reaktiosta pieni jae ja määrittämällä suoraan 30 standardi määritystekniikkaa käyttäen (supra).

Näissä esimerkeissä ja kokeissa on ratkaisevaa, että analyyttinen menetelmä on täsmällinen. On havaittu, että korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) on * erinomainen analyyttinen menetelmä ja sitä käytettiin täs-35 sä ilmoitettuihin analyyseihin.

« I

12 97393 HPLC-menetelmä Näytteet analyysiä varten valmistettiin sekoittamalla 100 μΐ reaktioseosta 300 pl:an 0,1 N H2S04 ja suodattamalla sitten saatu liuos Millipore Ultrafree MC-suoda-5 tinyksikön läpi (moolimassan 10 000 katkaiseva jae). Gly-kolihapon, glyoksyylihapon, oksaalihapon ja muurahaishapon analyysi suoritettiin HPLC-tekniikalla Bio-Rad Aminex HPX-87H-kolonnilla (300 x 7,8 mm) 40 °C:ssa käyttäen liuottimena H2S04:n vesiliuosta (0,01 N) ja 1-hydroksietaani-l,Ι-ΙΟ difosfonihappoa (0,1 mM) nopeudella 1,0 ml/min. Laitteisto oli Waters 840 HPLC-systeemi, jossa oli Model 510-pumput, 712 WISP automaattinäytteenotin ja peräkkäin 490E UV-de-tektori ja 410 differentiaalinen taitekerroinmittari. UV-analyysi suoritettiin 210 nm:n aallonpituudella. Oksaa-15 lihapon, glyoksyylihapon, glykolihapon, muurahaishapon ja propionihapon (sisäinen standardi) retentioajat olivat samassa järjestyksessä 4,29, 6,09, 7,77, 8,79 ja 11,41 minuuttia.

Koe 1 20 Glyokolaattioksidaasin valmistus pinaatista

Pinaatin lehtiä (2 000 g) homogenoitiin 4 l:n kaupallisessa sekoittimessa, joka sisälsi 1 000 ml 0,1 M ka-liumfosfaattipuskuria, pH 8,0 40 °C:ssa. Massa pursotet-tiin 4-kerroksisen juustokankaan läpi, jolloin saatiin 25 1 800 ml mehua. Puriste hapotettiin pH-arvoon 5,2 lisää- mällä suunnilleen 1 ml jääetikkaa. Seosta sentrifugoitiin nopeudella 14 000 x g 15 minuutin ajan kiintoaineiden poistamiseksi. Yläpuoliseen nesteeseen lisättiin kiinteää ammoniumsulfaattia (10,6 g/100 ml puristetta) 20 %:n kyl-30 lästyksen saavuttamiseksi. pH-arvoa pidettiin välillä 7,8 - 8,0 lisäämäällä 6 N KOH. Kun liuoksen oli annettu seistä 15 minuuttia, sitä sentrifugoitiin 20 minuuttia nopeudella 14 000 x g ja sakka heitettiin pois. Ammoniumsulfaattia (8,3 g/100 ml) lisättiin yläpuoliseen nesteesen 35 kaikkiaan 35 %:n kyllästyksen saavuttamiseksi. Sakka ke- 4 · • 13 97393 rättiin talteen 15 minuutin kuluttua sentrifugoimalla nopeudella 14 000 x g 20 minuutin ajan. Sakka liuotettiin minimitilavuuteen (n. 180 ml) 20 mM etyleenidiamiini- HCl:a, pH 8,0, joka sisälsi 2 mM flaviinimononukleotidia.

5 Sen liuettua ammoniumsulfaattia lisättiin 3,2 M loppuväke-vyyteen.Glykolaattioksidaasi-ammoniumsulfaattisuspensiota säilytettiin pimeässä 4 °C:ssa.

Esimerkki 1

Glykolihapon hapettaminen 10 88,7 ml:n lasiseen Fischer-Porter-aerosolireaktio- astiaan asetettiin magneettisekoitinsauva ja 10 ml vesiliuosta, joka sisälsi glykolihappoa (250 mM), etyleenidi-amiinia (EDA) (330 mM), FMN (0,01 mM), propionihappoa (HPLC:n sisäinen standardi 75 mM), glykolaattioksidaasia 15 (GAO) (pinaatista; 2,0 IU/ml) ja katalaasia (Aspergillus niger-lajista, 1 400 IU/ml). Tämän liuoksen loppu-pH oli 8,9. Reaktioastia suljettiin ja reaktioseos jäähdytettiin 15 °C:seen, minkä jälkeen astia huuhdeltiin hapella paineistamalla se 585 kPa paineeseen ja vapauttamalla ilmake-20 hän paineeseen viisi kertaa samalla hämmentäen. Astia paineistettiin sitten 483 kPa happipaineesen ja seosta hämmennettiin. Pieniä jakeita (0,10 ml) poistettiin näytteen-ottoaukon kautta (ilman paineen menetystä astiassa) säännöllisin aikavälein HPLC-analyysiä varten reaktion etene-25 misen seuraamiseksi. Neljän tunnin kuluttua glyoksylaatin, : oksalaatin ja formaatin HPLC-saannot olivat samassa jär jestyksessä 98,9 %, 0, 5 % ja 0 % ja 0,6 % glykolaattia jäi jäljelle. Glykolaattioksidaasin ja katalaasin jäljelle jääneet aktiivisuudet olivat molemmat 100 % alkuarvois-30 taan.

Esimerkki 2

Glykolihapon hapetus

Esimerkin 1 reaktio toistettiin paitsi, että ety-leenidiamiini korvattiin K2HP04:lla (330 mM) ja liuoksen 35 lopu-pH säädettiin arvoon 8,0 väkevällä HCl:lla. Neljän 14 97393 tunnin kuluttua glyoksylaatin, oksalaatin ja formaatin HPLC-saannot olivat 24,4 %, 0,3 % ja 8,4 % samassa järjestyksessä ja 67,1 % glykolaattia jäi jäljelle. Glykolaatti-oksidaasin ja katalaasin jäljelle jääneet aktiivisuudet 5 olivat samassa järjestyksessä 95 % ja 44 % alkuarvoistaan. Esimerkki 3 Glykolihapon hapetus 88,7 ml:n lasiseen Fischer-Porter-aerosolireaktio-astiaan asetettiin magneettisekoitinsauva ja 50 ml vesi-10 liuosta, joka sisälsi glykoihappoa (750 mM), etyleenidi-amiinia (862 mM). FMN (0,1 mM), propionihappoa (HPLC:n sisäinen standardi, 75 mM), glykolaattioksidaasia (pinaatista; 1,0 IU/ml) ja katalaasia (Aspergillus niger-lajis-ta, 1 400 IU/ml). Tämän liuoksen loppu-pH oli 8,9. Reak-15 tioastia suljettiin ja reaktioseos jäähdytettiin 15 °C:seen, minkä jälkeen astia huuhdeltiin hapolla paineistamalla se 585 kPa paineeseen ja vapauttamalla ilmakehän paineeseen viisi kertaa samalla hämmentäen. Astia paineistettiin sitten 483 kPa happipaineeseen ja seosta 20 hämmennettiin ja 0,10 ml:n pieniä jakeita poistettiin säännöllisin väliajoin HPLC-analyysiä varten reaktion etenemisen seuraamiseksi. 90 tunnin kuluttua glyoksylaatin, oksalaatin ja formaatin HPLC-saannot olivat 99,8 %, 0,2 % ja 0 % samassa järjestyksessä eikä mitään glykolaattia 25 jäänyt jäljelle. Glykolaattioksidaasin ja katalaasin jäl-: jelle jääneet aktiivisuudet olivat samassa järjestyksessä 34 % ja 88 % alkuarvoistaan.

Esimerkki 4 Glykolihapon hapetus 30 88,7 ml:n lasiseen Fischer-Porter-aerosolireaktio- astiaan asetettiin magneettisekoitinsauva ja 10 ml vesi-liuosta, joka sisälsi glykolihappoa (2 000 mM), etyleeni-diamiinia (2 100 mM), FMN (0,01 mM), glykolaattioksidaasia (pinaatista, 1,2 IU/ml) ja katalaasia (Aspergillus niger-35 lajista, 1 400 IU/ml). Tämän liuoksen loppu-pH oli 9,0.

15 97393

Reaktioastla suljettiin ja reaktioseos jäähdytettiin 15 °C:seen, minkä jälkeen astia huuhdeltiin hapella paineistamalla se 585 kPa paineeseen ja vapauttamalla ilmakehän paineeseen viisi kertaa samalla hämmentäen. Astia 5 paineistettiin sitten 483 kPa happipaineeseen ja seosta hämmennettiin ja 0,10 ml:n pieniä jakeita poistettiin säännöllisin väliajoin HPLC-analyysiä varten reaktion etenemisen seuraamiseksi. 31 tunnin kuluttua mitään glyko-laattioksidaasiaktiivisuutta ei ollut jäljellä, joten vie-10 lä 2,0 IU/ml glykolaattioksidaasia lisättiin. 143 tunnin kuluttua glyoksylaatin, oksalaatin ja formaatin HPLC-saannot olivat samassa järjestyksessä 96,8 %, 2,2 % ja 1,0 % eikä mitään glykolaattia jäänyt jäljelle. Glykolaattioksi-daasin (kokonaismäärästä laskettuna) ja katalaasin jäljel-15 le jääneet aktiivisuudet olivat samassa järjestyksessä 69 % ja 100 % alkuarvoistaan.

Esimerkki 5

Glykolihapon hapetus 88,7 ml:n lasiseen Fischer-Porter-aerosolireaktio-20 astiaan asetettiin magneettisekoitinsauva ja 10 ml vesi-liuosta, joka sisälsi glykolihappoa (250 mM), tris(hydrok-simetyyli)aminometaania (TRIS, 370 mM), FMN (0,02 mM), propionihappoa (HPLC:n sisäinen standardi, 75 mM), glykolaattioksidaasia (pinaatista, 0,25 IU/ml) ja katalaasia 25 (Aspergillus niger-lajista, 1 400 IU/ml). Tämän liuoksen loppu-pH säädettiin arvoon 8,3 5-prosenttisella NaOH:lla. Reaktioastia suljettiin ja reaktioseos jäähdytettiin 30 °C:seen, minkä jälkeen astia huuhdeltiin hapella paineistamalla se 205 kPa paineeseen ja vapauttamalla il-30 makehän paineeseen viisi kertaa samalla hämmentäen. Astia paineistettiin sitten 103 kPa:n happipaineeseen samalla hämmentäen. Pieniä jakeita (0,10 ml) poistettiin näytteen-ottoaukon kautta (ilman astian paineen menetystä) säännöllisin väliajoin HPLC-analyysiä varten reaktion etenemisen 35 seuraamiseksi. 30 tunnin kuluttua glyoksylaatin oksalaatin 16 97393 ja formaatin HPLC-saannot olivat samassa järjestyksessä 89,5%, 3,3% ja 2,8% eikä mitään glykolaattia jäänyt jäljelle. Glykolaattioksidaasin ja katalaasin jäljelle jääneet aktiivisuudet olivat samassa järjestyksessä 52 % 5 ja 60 % alkuarvoistaan.

Esimerkki 6

Glykolihapon hapetus

Esimerkin 4 reaktio toistettiin paitsi, että glykolihapon ja etyleenidiamiinin pitoisuudet olivat samassa 10 järjestyksessä 2 500 mM ja 2 630 mM eikä uutta glykolaat-tioksidaasia lisätty 31 tunnin kohdalla. 143 tunnin kuluttua glyoksylaatin, oksalaatin ja formaatin HPLC-saannot olivat samassa järjestyksessä 27,4 %, 0 % ja 0 % ja 72,6 % glykolaattia jäi jäljelle, mikä osoitti reaktionopeuden 15 laskua 2 500 mM:n glykolaattipitoisuudella. Glykolaattioksidaasin ja katalaasin jäljelle jääneet aktiivisuudet olivat samassa järjestyksessä 68 % ja 80 % alkuarvoistaan.

Esimerkki 7 Lämpötilan vaikutus glykolihapon hapetukseen 20 Katalaasin ja GA0:n aktiivisuuden riippuvuus reaktiolämpötilasta määritettiin käyttäen 88,7 ml:n lasista Fischer-Porter-aerosolireaktioastiaa. Vesiliuoksia (10 ml), jotka sisälsivät glykolaattia (250 mM), etyleeni-diamiinia (330 mM), glykolaattioksidaasia (0,5 IU/ml), , 25 katalaasia (1 400 IU/ml) ja FMN (0,01 mM) hämmennettiin lämpötiloissa pH-arvolla 8,3 100 kPa:n happipaineessa.

Yhden tunnin kuluttua glyoksylaatin saannot reaktioista, jotka suoritettiin 40, 30, 15 ja 5 °C:ssa, olivat samassa järjestyksessä 92 %, 96 %, 99 % ja 99 % samalla, kun jäl-30 jelle jääneet katalaasi/GAO-aktiivisuudet olivat samassa järjestyksessä 38/87 %, 60/100 %, 100/100 % ja 100/100 %. Alemmat reaktiolämpötilat johtavat korkeampiin jäljelle jääneisiin entsyymiaktiivisuuksiin suurilla glyoksyyliha-pon selektiivisyyksillä.

17 97393

Esimerkki 8

Happipaineen vaikutus glykolihapon hapetukseen Käyttäen esimerkissä 1 kuvattua menettelyä vesi-liuoksia (10 ml), jotka sisälsivät glykolihappoa 5 (250 mM), TRIS-puskuria (330 mM, pH 8,3), propionihappoa, (HPLC:n sisäinen standardi, 75 mM), glykolaattioksidaasia (pinaatti, 0,25 IU/ml), katalaasia (Aspergillus niger, 1 400 IU/ml) ja FMN (0,2 mM), hämmennettiin 30 °C:ssa ilmakehän ilmanpaineessa (20 kPa happea) tai 100, 200, 300, 10 600 tai 1 000 kPa:n happipaineissa. Glyoksyylihapon tuo tannon alkunopeudet (reaktion ensimmäisen 10 - 15 %:n aikana) käytetyillä eri happipaineilla on lueteltu seuraa-vassa taulukossa.

Hapen paine Nopeus 15 ( kPa )_ ymol/ml/min 20 0,027 100 0,156 200 0,301 300 0,494 20 600 0,752 1 000 1,025

Esimerkki 9

Glykolaattioksidaasin pitoisuuden vaikutus glykoli-hapon hapetukseen 25 Käyttäen esimerkissä 1 kuvattua menettelyä vesi- liuoksia (10 ml), jotka sisälsivät glykolaattia (250 mM), EDA:a (330 mM), propionihappoa (HPLC:n sisäinen standardi, 75 mM), glykolaattioksidaasia (0,20, 0,40 tai 4,0 IU/ml), katalaasia (1 400 IU/ml) ja FMN (0,01 mM), hämmennettiin 30 15 °C:ssa ja pH-arvolla 8,9 600 kPa:n happipaineessa.

Glyoksyylihapon tuotannon alkunopeudet (reaktion ensimmäisen 10 - 15 %:n aikana) käytettäessä 0,20 IU/ml, 0,40 IU/ml tai 4,0 IU/ml, juurikas-GAO:a olivat samassa järjestyksessä 1,37 pmol/ml/min, 1,33 pmol/ml/min ja 1,32 pmol/-35 ml/min. Näissä yleisissä reaktio-olosuhteissa ei esiinty- 18 97393 nyt mitään reaktionopeuden riippuvuutta entsyymin pitoisuudesta.

Esimerkki 10 Glykolihapon hapetus 5 Glyoksyylihapon entsymaattisen synteesin havainnol listaminen suuressa mittakaavassa suoritettiin laitteessa Amicon Model 2000 High-Output Stirred Cell, jossa suoda-tusmembraani oli korvattu 1,6 mm paksulla TeflonR-levyllä ja jossa oli magneettikäyttöinen melasekoitin. Glykolaat-10 tioksidaasia (2 000 IU, eristetty pinaatista) lisättiin 2,0 l:an liuosta, joka sisälsi glykolihappoa (113 g, 1,49 mol), etyleenidiamiinia (95 g, 1,58 mol), FMN (9,7 mg, 0,02 mmol) ja katalaasia [2,8xl06 IU, Aspergillus niger-lajista (Sigma)] ja saatua seosta (loppu-pH = 8,9) 15 hämmennettiin 15 °C:ssa 600 kPa:n happipaineessa. Pieniä jakeita poistettiin säännöllisin väliajoin HPLC-analyysiä varten reaktion etenemisen seuraamiseksi. 77 tunnin kuluttua reaktioseoksen HPLC-analyysi osoitti, että glyoksyyli-happo (110 g, 99,6 %:n saanto), muurahaishappo (0,2 %) ja 20 oksaalihappo (0,2 %:n saanto) olivat ainoat reaktiotuotteet; saavutettiin glykolihapon täydellinen konversio. Glykolaattioksidaasin ja katalaasin aktiivisuudet olivat samassa järjestyksessä 74 % ja 87 % alkuaktiivisuuksis-taan. Reaktio päätettiin pirskottamalla liuosta typellä ja 25 lämmittämällä sitten reaktioseos 70 °C:seen 5 minuutiksi typpisuojakaasussa. Saostunut proteiini poistettiin sent-rifugoimalla ja FMN poistettiin suodattamalla reaktioseos aktiivihiilen läpi. Mahdollinen jäljelle jäänyt liukoinen proteiini poistettiin suodattamalla käyttäen Millipore 30 Minitan suodatussysteemiä, jossa oli moolimassan 10 000 jakeen katkaiseva suodatin, minkä jälkeen glyoksylaatti ja etyleenidiamiini (EDA) erotettiin ioninvaihtokromatogra-fialla.

Amberlite CG-120-hartsia (900 g, Rohm S. Haas, 100 -35 200 mesh, 4,5 mekv./g) suspendoitiin 1,0-N HCl:on, jolloin saatiin 2,0 1 paisunutta hartsia, joka huuhdeltiin sitten tl 19 97393 tislatulla vedellä ylimääräisen HCl:n poistamiseksi. Mitoiltaan 50 x 100 cm:n Pharmacia K-kolonniin pakattiin 1 900 ml pestyä hartsia, 2,0 1 tislattua vettä pumpattiin sitten kolonnin läpi nopeudella 8,0 ml/min, minkä jälkeen 5 puolet glyoksyylihappo/etyleenidiamiini (EDA)-reaktioseok- sesta (joka sisälsi 0,78 mol EDA:a ja 0,75 mol glyoksyyli-happoa) panostettiin kolonnin yläpäähän virtausnopeudella 8 ml/min. Glyoksyylihappoa kerättiin talteen alun vesi-eluointivaiheen aikana, jota seurattiin absorbanssilla 10 aallonpituudella 254 nm. Noin 2,2 1 glyoksyylihappoa sisältävää eluanttia kerättiin talteen. Etyleenidiamiini eluoitiin 3,4 1:11a 1 N NaOH, jolloin saatiin 0,77 mol EDA:a (talteenotto 99 %). Kolonni tasapainotettiin uudelleen pesemällä 1 N HCl:lla (2,4 1) ja sen jälkeen 3 1:11a 15 tislattua vettä kloridin poistamiseksi. Yhdistetyt kolon- nijakeet, jotka sisälsivät glyoksyylihappoa ja jotka oli saatu kahden 1,1 l:n glyoksyylihappo/EPA-eluaatin ionin-vaihtokolonnierotuksesta, yhdistettiin ja väkevöitiin kiertohaihdutuksella 40 °C:ssa, jolloin saatiin 50-paino-20 prosenttinen liuos, joka sisälsi 1,40 mol (94 %:n saanto) glyoksyylihappoa; tuotetun glyoksyylihapon puhtaus oli yli 99.5 % määritettynä 13-NMR-spektroskopialla ja HPLC-analyy-sillä.

Esimerkki 11 25 Glykolihapon hapetus ' Esimerkin 1 reaktio toistettiin paitsi, että kata- laasin lisäys jätettiin pois. Neljän tunnin kuluttua gly- oksylaatin, oksalaatin ja formaatin HPLC-saannot olivat samassa järjestyksessä 6,2 %, 0,7 % ja 16,3 % ja 7,1 % 30 glykolaattia jäi jäljelle, mikä osoittaa saatuja alempia selektiivisyyksiä, kun katalaasi puuttuu. Glykolaattioksi-daasin jäljelle jäänyt aktiivisuus oli 5 % alkuarvostaan.

Esimerkki 12

Glykolihapon hapetus 35 Valmistettiin varastoliuos sekoittamalla keskenään 12.5 g ionivaihdettua vettä, 300 mg glykolihappoa, 1,2 g

• I

20 97393 TRIS ja 1,0 g 0,02 mM FMN-liuosta pH-arvoltaan 6,8 olevassa fosfaattipuskurissa. 10 g:n annos varastoliuosta asetettiin 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon yhdessä 2 mg:n kanssa häränmaksakatalaasia (ostettu yhtiöltä Sigma Chemical Co., 5 St. Louis, MO, 63178, luettelonumero C-10, n. 1200 IU/mg). 0,5 g:n annos glykolaattioksidaasisuspensiota (Sigma luettelonumero G-4136, sokerijuurikkaista, liuoksen sisältäessä 2,4-M (NH4)2S04, 10-mM TRIS, 5 mM FMN ja entsyymin määrän ollessa n. 7,5 IU/ml) sentrifugoitiin ja neste heitettiin 10 pois. Kiinteä aine lisättiin Erlenmeyer-pullossa olevaan liuokseen. Liuoksen pH oli 8,5. Pulloa huuhdeltiin hapella 5 minuutin ajan virtausnopeudella n. 200 ml 02/min. Pullo suljettiin ja sitä ravisteltiin kiertokankitoimisella ra-vistimella n. 23 tunnin ajan. HPLC-analyysi (samantapai-15 sella, muttei tarkalleen samalla kuin edellä kuvattiin) osoitti, että glykolaatti oli täysin hapettunut glyoksy-laatiksi ja pieneksi määräksi oksalaattia.

Esimerkki 13

Glykolihapon hapetus käyttäen "membraanireaktoria" 20 Valmistettiin varastoliuos sekoittamalla keskenään 12,4 ml ionivaihdettua vettä, 305 mg glykolihappoa, 1,0 g 0,15 mM FMN pH-arvoltaan 7,5 olevassa fosfaattipuskurissa ja 1,3 g etyleenidiamiinin 20-painoprosenttista vesiliuosta. Valmistettiin reaktioseos sekoittamalla keskenään 12 g 25 varastoliuosta, 4 mg häränmaksakatalaasia (Sigma, luettelonumero C-10, n. 2 800 IU/mg) ja sentrifugoitu kiinteä aine 1,0 g:sta kaupallista glykolaattioksidaasisuspensiota (Sigma G-8620, joka sisälsi 3,2 M (NH4)2S04, 2 mM FMN, 2,8 IU/ml, joka glykolaattioksidaasi oli eristetty pinaa-30 tista). Seoksen pH oli 9,1.

; Reaktorissa oli 3 komponenttia, 3,65 m pitkä sisä- halkaisijaltaan 1,6 mm ja ulkohalkaisijaltaan 3,2 mm oleva silikonikumiletku (Dow Corning Corp.), Masterflex-letku-pumppu ja sisähalkaisijaltaan 10 mm:n 100 mm pitkä (lasi-35 nen) koeputki, joka toimi säiliönä. Letkut pumppuun ja 21 97393 pumpusta kulkivat väliseinän läpi, joka sulki koeputkisäi-liön. Reaktioseos pantiin reaktoriin ja sitä pumpattiin sitten letkun läpi 23 tunnin ajan nopeudella 3,5 ml/min. Tänä aikana noin 5 ml oli letkussa ja 5 ml oli säiliössä 5 (mutta koko seosta kierrätettiin ympäri). Letju kierrettiin löysälle vyyhdelle kevyessä ilmavirrassa. HPLC-ana-lyysi (samantapainen, muttei tarkalleen sama kuin edellä kuvattiin) osoitti glykolaatin täydellistä hapettumista glyoksylaatiksi ja pieneksi määräksi oksalaattia.

10 Koe 2

Glykolihapon hapetus 15 ml: n polypropeeniä olevaan sentrifugiput-keen asetettiin 3 ml vesiliuosta, joka sisälsi glykolihap-poa (3,3 mM), K2HP04 ( 33 mM, pH 8,0), glykolaattioksi-15 daasia (pinaatti, 0,33 IU/ml), katalaasia (häränmaksa, 1 400 IU/ml) ja FMN (0,01 mM). Liuosta pidettiin 30 °C:ssa ilmassa ja 0,15 ml:n pieniä jakeita poistettiin, suodatettiin moolimassan 10 000 jakeen katkaisevan Millipore-suo-dattimen läpi ja analysoitiin HPLC-laitteella. Yhden tun-20 nin kuluttua glyoksylaatin, oksalaatin ja formaatin saannot olivat samassa järjestyksessä 80,9 %, 3,8 % ja 0 % ja 15,5 % glykolaattia jäi jäljelle. Kahden tunnin kuluttua glyoksylaatin, oksalaatin ja formaatin saannot olivat samassa järjestyksessä 80,6 %, 19,7 % ja 0 % eikä glykolaat-25 tia jäänyt jäljelle.

Vaikka edellä on kuvattu tämän keksinnön edullisia toteutusmuotoja, on ymmärrettävä, ettei tarkoituksena ole rajoittaa tätä keksintöä tarkasti tässä selostettuihin ratkaisuihin ja edelleen on ymmärrettävä, että varataan 30 oikeus kaikkiin muutoksiin ja modifikaatteihin, jotka osuvat liitteenä olevien patenttivaatimusten määrittelemään keksinnön suojapiiriin.

Claims (10)

1. 97393
2. 1. Menetelmä glyoksyylihapon valmistamiseksi, jossa glykolihappo, glykolaattioksidaasi ja happi saatetaan ve-5 siliuoksessa pH:ssa n. 7 - 10, kosketukseen keskenään, tehokkaan määrän yhtä tai useampia lisäaineita läsnäollessa, jotka parantavat glyoksyylihapon saantoa, tunnettu siitä, että glykolihapon alkuväkevyys on 200 - n. 2 500 mM.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäaineena on läsnä katalaa-sia.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäaineena on läsnä myös 15 amiinia, joka on valittu ryhmästä etyleenidiamiini, tris-(hydroksimetyyli)metyyliamiini ja näiden seokset, ja amiinin ja glykolihapon välinen suhde alussa on n. 1,0-3,0, ja katalaasin pitoisuus on n. 50 - 100 000 IU/ml.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me- 20 netelmä, tunnettu siitä, että glykolihapon alku- väkevyys on n. 250 - 1 500 mM.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykolaattioksidaa-sia on läsnä n. 0,001 - 1 000 IU/ml. /25 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että katalaasin alkuväkevyys on n. 350 - 1 400 IU/ml.
7. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että flaviinimononuk- 30 leotidiä on läsnä pitoisuutena, joka alussa on n. 2,0 mM tai pienempi.
8. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalaasin ja gly-kolaattioksidaasin välinen suhde on vähintään n. 250:1. 97393
9. 9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on n. 0 -40 eC edellyttäen kuitenkin, ettei lämpötila ole niin alhainen, että reaktioseoksessa oleva vesi jäätyy.
10. 10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happi lisätään kaasuna, paineessa, joka vaihtelee ilmakehän paineesta jopa 50 ilmakehän paineeseen. 97393