PT95776B - Processo para a preparacao de acido glioxilico a partir de acido glicolico - Google Patents

Description

A presente invenção diz respeito a um processo melhorado para a produção de ácido glioxílico mediante oxidação catalisada da glicolato-oxidase do ácido glicõlico. Embora a reacção catalisada por enzima do ácido glicõlico por meio de oxigénio seja já bem conhecida hã muitos anos, os processos anteriormente conhecidos não apresentaram vantagens comerciais por várias razões. A mais importante delas reside no facto de as reacções anteriores se realizarem com diluições elevadas do ácido glicõlico, concentrações normalmente da ordem de 40 mM ou inferiores. A selectividade para o ácido glioxílico e os rendimentos de produção do ácido glioxílico têm sido normalmente baixos. Uma desvantagem da utilização de concentrações iniciais de ácido glicõlico muito diluídas reside na necessidade de reactores maiores e mais caros para se obterem taxas de produção mais elevadas. Do mesmo modo, dado que o ácido glioxílico se vende normalmente em soluções aquosas a 50% (Ullmans), é cara a concentração do ácido glioxílico produzido, utilizando reagentes iniciais diluídos. Além disso, se essas concentrações se tiverem obtido por evaporação ou por osmose inversa, quaisquer subprodutos não voláteis,ItaisScomo^bs:ácidos-õxãíico e fõrmico e/ou os

i seus sais e ãcido;. glicõlico que não reagiu ficarão retidos na solução como impurezas. Finalmente, serã vantajoso se as enzimas relativamente caras utilizadas na reacção puderem ser utilizadas mais eficazmente ou recicladas efectivamente e se não se produzirem quaisquer. resíduos prejudiciais.

A presente invenção fornece um processo prático sob o ponto de vista comercial para a produção de ãcido glioxilico mediante oxidação catalisada da glicolato-oxidase do ãcido glico.lico através do aumento das concentrações dos substratos iniciais e através da utilização de aditivos seleccionados para aumentar o rendimento .

2. Estado da técnica anterior

A presente invenção diz respeito a um processo para a produção de ãcido glioxilico por oxidação de ãcido glicõlico por meio de oxigénio, utilizando uma enzima, a glicolato-oxidase, como catalisador da reacção.

Tolbert, N.E. e outros; J. Biol. Chem., 181, 1949, p. 905-914, referem que uma enzima extraída das folhas do tabaco catalisou a oxidação do ãcido glicõlico em ãcido fõrmico e anidrido carbónico, por meio de um produto intermédio que era o ãcido glioxílico. Também descobriram que certos compostos tais como a etilenodiamina bloqueava a oxidação do ãcido glioxilico intermédio em outros produtos. As oxidações realizavam-se a um pH de cerca de 8, utilizando concentrações de ãcido glicõlico de cerca de 3 - 40 mM (milimolar), excepto numa experiência (p. 907) , muito mal descrita, em que a concentração inicial de ãcido glicõlico estava compreendida algures entre 132 e 196 mM. Os únicos pormenores dados acerca desta /

ú >1- ' >* '‘,'-'¹'’ ú.’ t .¾ experiência, são a concentração aproximada do ãcido glicólieo, o facto de que a oxidação não chegou ao seu termo e que se isolou uma certa quantidade de 2,4-dinitrofenil-hidrazona do ãcido glioxílico. Não foram dados quaisquer pormenores sobre os rendimentos e a duração da reacção. Refere-se que o pH óptimo para a oxidação do glicolato ê de 8,9. Refere também que o ãcido oxãlico (lOOmM) inibe a acção catalítica da glicolato-oxidase.

Zelitch, I. e Ochoa. S., J. Biol. Chem., 201, 1953, p. 707-718, referem que a formação de ãcido fórmico e anidrido carbónico na oxidação catalisada com glicolato-oxidase do ãcido glicólieo resultou da reacção não enzimãtica de ãgua oxigenada com ãcido glioxílico, sendo estes os produtos primários da oxidação catalisada do ãcido glicólieo. Assim, eles observaram que a adição de catalase, uma enzima que catalisa a decomposição de ãgua oxigenada, aumenta enormemente o rendimento de ãcido glioxílico, por supressão da formação de ãcido fórmico e anidrido carbónico. A glicolato-oxidase que eles utilizaram foi isolada de folhas de espinafres. Utilizaram-na a um pH de cerca de 8, com uma concentração inicial de ãcido glicólieo de 10 mM. Descobriram também que a adição de FMN (flavina-mononucleotido) aumenta enormemente a eficiência da glicolato-oxidase.

Robinson, J. C. e outros; J. Biol. Chem., 237, 1962, p. 2001-2009, também descobriram que a catalase aumenta o rendimento de ãcido glioxílico a partir de ãcido glicólieo. Aparentemente eles utilizaram uma taxa de cerca de 80:1 de catalase: glicolato-oxidase. Também concluíram que a catalase decompunha a ãgua oxigenada produzida na reacção catalisada do ãcido glicólieo pela glicolato-oxidase com oxigénio (no artigo deles, a glicolato-oxidase é referida como oxidase do ãcido L-alfa-hidroxi de cadeia curta). Eles descobriram *

/4 que ' ο FMN era útil para manter a actividade da glicolato-oxidase. Também determinaram que a taxa máxima de oxidação de ácido glicólico catalisada por glicolato-oxidase ocorre a uma concentração de ácido glicólico (substrato) de 3,3 mM e que, Se verificou que a reacção era inibida, por:......e) elevadas concentrações destes substratos, glicolato, e.......

Richardson, K.E. e Tolbert, N.E., J. Biol. Chem., 1961, 236, p. 1280-1284, mostraram que tampões contendo tris-(hidroximetil)-aminometano inibem a formação de ácido oxãlico na oxidação do ácido glicólico catalisada por glicolato-oxidase. Eles também realizaram a reacção a um pH de cerca de 8 e verificaram que o FMN aumenta a eficiência da glicolato-oxidase. A concentração máxima de ácido glicólico que utilizaram foi de 20 mM.

Clagett, C.O. Tolbert, N.E. e Burris, R.H., J. Biol. Chem., 178, 1949 ,p.977-987, descobriram que o pH óptimo para a oxidação do ácido glicólico catalisada por glicolato-oxidase com oxigénio estava compreendido entre cerca de 7,8 e 8,6 e que a temperatura óptima era de 35 - 40°C. A concentração máxima do substrato (ácido glicólico) era de cerca de 20 mM.

Há numerosas outras referências à oxidação do ácido glicólico catalisada por glicolato-oxidase, por exemplo:

- Isolamento da enzima (normalmente inclui um método de ensaio):

I. Zelitch em Methods of Enzymology, Vol. 1, Academic

Press, New York, 1955, p. 528-532, a partir de folhas de tabaco e de espinafres.

M. Nishimura et al., Arch. Biochem. Biophys., Vol. 222,

397-402 (1983), a partir de cotilédones de abóbora menina.

H. Asker e D. Davies, Biochim Biophys. Acta, Vol. 761,

103-108 (1983), a partir de fígado de rato.

t / 5 Μ. J. Emes e Κ. Η. Erismann, Int. J. Biochem., Vol. 16, 1373-1378 (1984), de Lemna Minor L.

- estrutura da enzima:

E. Cederlund et al., Eur, J. Biochem., Vol. 173, 523-5,30 (1988) .

Y. Lindquist e C. Branden, J. Blol. Chem., Vol. 264,

3624-3628 (1989).

Em todas as referências anteriores e em todas as outras que se estudaram / com a única excepção referida acima na discussão de N. E. Tolbert et al., J. Biol. Chem., Vol. 181, 905-9,14 (1949) / a concentração inicial máxima de ãcido glicõlico que foi utilizada foi de cerca de 40 mM, e o pH foi normalmente de cerca de 8 - 9, algumas vezes adicionou-se FMN, algumas vezes adicionou-se uma amina e algumas vezes adicionou-se catalase. Também foram mencionados outros aditivos para melhorar o rendimento em ãcido glioxílico.

Numerosos processos químicos vulgares (não enzimãticos) têm sido propostos para a síntese industrial do ãcido glioxílico. Ver, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas n^s 3 281 469, 4 146 731 e 4 235 684, assim como Ullmanns Encyklopadie der technischem Chemie, 4 th Ed., Vol. 12, Verlag Chemie, Weinheim, 1976, p. 381 (aqui designada por Ullmanns)'. Alguns destes processos originam produtos prejudiciais ao ambiente. Nenhum destes contempla a oxidação do ãcido glicõlico em ãcido glioxílico.

Embora o ãcido glicõlico seja um produto comercial, a requerente não tem conhecimento de que alguém tenha utilizado anterior mente a oxidação do ãcido glicõlico catalisada por glicolato-oxidase para a produção de ãcido glioxílico. Especula-se que isto se deve â falta de familiaridade que os químicos e os engenheiros f- 6 químicos têm com reacções enzimãticas (bioquímica), ã falta de reconhecimento pelos bioquímicos de que estes processos são desejáveis, aos rendimentos relativamente baixos ou às taxas de conversão referidas na maior parte da literatura e às baixas concentra ções e/ou inibição do substrato referidas para os substratos previamente utilizados.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de ácido glioxílico que consiste em fazer contactar, em uma solução aquosa a um pH compreendido entre cerca de 7 e cerca de 10, ãcido glicólico, glicolato-oxidase e oxigénio > ^na presença de uma quantidade efectiva de um aditivo que melhora o rendimento em ãcido glioxílico, enquanto a concentração inicial de ãcido glicólico está compreendida entre 200 e cerca de 2500 mM. O processo ê prático para a produção comercial, sendo caracterizado pelo facto de se realizar com concentrações relativamente elevadas de ãcido glicólico. Em condições óptimas, também dá rendimentos muito elevados de ãcido glioxílico com elevadas taxas de conversão e utiliza de uma forma eficaz enzimas relativamente baratas.

Pode-se utilizar concentrações de ãcido glicólico compreen didas entre 200 e cerca de 2500 mM e, para além do catalisador glicolato-oxidase, podem estar presentes um ou mais compostos tais como catalase e certas aminas, para melhorar o rendimento em ãcido glioxílico. A adição de FMN é opcional e serve para melhorar a produtividade da enzima. O oxigénio, normalmente do ar ou na sua forma mais pura (tal como um oxigénio de grau industrial) utiliza-se como oxidante na reacção. A reacção pode realizar-se a pressões de

-/ 7 .ν oxigénio acima da pressão atmosférica para aumentar o grau de conversão.

Descrição da invenção

A presente invenção diz respeito à oxidação do ãcido glicólico catalisada por glicolato-oxidase.

Verificou-se que se podem obter rendimentos elevados em ãcido glioxílico utilizando concentrações iniciais elevadas de substrato da ordem de 2500 mM. 0 rendimento pode ainda ser maximizado pela adição de catalase ou outros aditivos isolados ou combinados . O rendimento elevado é inesperado face â inibição do substarto e/ou à possível inibição do produto da glicolato-oxidase referenciados e também à possível inibição da catalase, quando presente (para uma discussão do substrato e inibição do produto, ver M. Dixon et al., Enzymes, 3rd Ed., Academic Press, New York, 1979, p. 96-7, 126-7 e T. Godfrey e J. Reichelt, Industrial Enzymology,

The Nature Press, New York, 1983, p. 847). Na verdade a requerente verificou que para uma concentração inicial de ãcido glicólico superior a 2500 mM, a reaeção de oxidação catalisada por glicolato-oxidase é relativamente lenta. Esta lentidão da taxa de reaeção torna-se notada para uma concentração inicial superior a 1500 mM e torna-se gradualmente pior à medida que a concentração do substrato aumenta. Felizmente que esta lentidão ocorre a concentrações suficientemente elevadas de modo a poder-se realizar um processo prãtico. Não estã provado que esta lentidão da reaeção se deva â inibição do substrato ou do produto ou a qualquer outro factor. Também as concentrações elevadas de um aditivo seleccionado (quando presente), tal como uma amina adicionada para aumentar o rendimento, pode também causar inibição ou mesmo desnaturação de uma ou ambas as enzimas.

Embora esta concentração elevada do substrato seja a chave para o processo comercialmente útil aqui descrito, outros factores potenciam a utilidade do processo, como seja a elevada selectividade para o produto do acido glioxílico e a elevada conversão do substrato em produto de ácido glioxílico. Para se conseguir alcançar um rendimento elevado de ácido glioxílico com muito pouco subproduto ou reacções colaterais, torna-se vantajoso adicionar à mistura reaccional aditivos que melhorem o rendimento de ácido glioxílico, quer a enzima catalase ou uma amina seleccionada, tal como a etilenodiamina. Obtêm-se os melhores rendimentos quando se adiciona a catalase e a amina seleccionada à reacção. Além disso, para aumentar a produtividade da glicolato-oxidase, pode-se eventual mente adicionar, em pequenas quantidades, mononucleotido de flavina (aqui designado por FMN).

termo rendimento significa aqui a percentagem de ácido glioxílico obtida e baseia-se na quantidade total de ácido glicõlico presente no início da reacção. 0 termo conversão significa aqui a percentagem de ácido glicõlico presente no início da reacção que reagiu para formar qualquer outro produto. 0 termo selectividade significa aqui a percentagem de ácido glioxílico obtida a partir do ácido glicõlico que reagiu. Segue-se que, matematicamente, o rendimento equivale ã selectividade dos tempos de conversão. 0 termo produtividade da enzima significa a quantidade de ácido glioxílico produzida'por unidáde de enzima.

ácido glicõlico (ácido 2-hidroxiacético) é comercializado por E. I. du Pont de Nemours and Company, Inc. Na presente reacção (

Λ· a sua concentração inicial varia entre 200 e cerca de 2500 mM, de preferência entre cerca de 250 e cerca de 1500 mM e ainda com maior preferência entre cerca de 500 e cerca de 1000 mM. Dado que a reacção de oxidação catalisada por glicolato-oxidase se realiza a um pH compreendido entre 7 e 10, crê-se que durante a oxidação o,ácido glicólico está presente sob a forma do anião glicolato.

Deve entender-se aqui que a utilização do termo ácido glicólico, quando se refere ao ácido glicólico num meio com um pH superior a cerca de 4, se refere ao anião glicolato.

A enzima glicolato-oxidase pode isolar-se a partir de numerosas fontes (supra). Dé acordo com o livro Enzyme Nomenclature 1984, (Recommendations of the Nomenclature Commitee if the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalyzed Reactions), Academic Press, New York, 1984 (aqui designado por IUB), p. 52-3, o nome sistemático para este tipo de enzima ê (S)-2-hidroxi-ãcido-oxidase e o seu numero ê E.C. 1.1.2.15. O IUB inclui-se aqui como referência. A glicolato-oxidase utilizada na reacção deve estar presente em uma concentração efecti va, normalmente uma concentração compreendida entre cerca de 0,001 e cerca de 1000 Ul/ml, de preferência entre cerca de 0,1 e cerca de 4 Ul/ml. Uma UI (Unidade Internacional) define-se como sendo a quantidade de enzima que catalisara a transformação de um micromole de substrato por minuto. Em I. Zelitch e S. Ochoa, J. Biol. Chem., Vol. 201, 707-718 (1953), descreve-se um processo de ensaio desta enzima que se inclui aqui como referência. Este método também se utiliza para ensaiar a actividade da glicolato-oxidase recuperada ou reciclada.

O pH da solução reaccional deve estar compreendido entre cerca de 7 e cerca de 10, de preferência entre cerca de 8,0 e cerca de 9,5 e ainda mais preferencialmente entre 8,0 e 9,0. Pode-se manter o pH por meio de um tampão, uma vez que actividade da enzima varia com o pH. Verificou-se também que o pH da reacção diminui levemente à medida que a reacção prossegue, de modo que ê muitas vezes útil, iniciar a reacção próximo do valor final mais elevado do intervalo de pH da actividade máxima da enzima, cerca de 9,0 - 9,5 e deixar que ele decresça durante a reacção. Verificou-se que certas aminas, tal como a etilenodiamina e a tris-(hidro ximetil)-metilamina (aqui designada por TRIS) melhoram o rendimento em ácido glioxílico. Embora se possam utilizar tampões inorgânicos, e preferível utilizar um excesso (superior à quantidade molar de ácido glicólico) destas aminas, para actuarem como tampões, assim como melhorarem o rendimento. A etilenodiamina ê a preferida. Assim estas aminas utilizam-se numa relação molar de amina/ácido glicólico (quantidade inicial) de cerca de 1,0 a cerca de 3,0, de preferência de cerca de 1,0 a cerca de 2,0 e, ainda com maior preferên- cia, entre cerca de 1,05 e cerca de 1,33. Dentro desta gama, pode-se ajustar o valor exacto para se obter o pH desejado. Com aminas muito básicas utilizadas a taxas muito elevadas entre a amina e o ácido glicólico, pode ser necessário ajustar o pH, por exemplo adicionando ácido, como por exemplo ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Com aminas menos básicas como a TRIS, pode ser necessário adicionar uma base para manter o pH desejado. Embora seja possível utilizar quantidades maiores de aminas, essas quantidades maiores raramente têm efeitos benéficos e implicam uma penalização nos custos, especialmente no isolamento do produto. Assim, deve-se utilizar a taxa mais baixa de amina ácido glicólico consistente com a obtenção do rendimento desejado, da selectividade e do pH.

Outro aditivo que pode ser utilizado para aumentar o rendimento do ácido glioxílico é a enzima catalase. A catalase £ este ê o nome sistemático, numero E.C. 1.11.1.6. (IUB) J catalisa a decomposição do peréxido de hidrogénio em água e oxigénio e crê-se que melhora os rendimentos no presente processo por aceleração da decomposição do perôxido de hidrogénio que ê um produto primário na reaeção do acido glicõlico e oxigénio catalisada por glicolato-oxidase para formar ácido glioxílico. A concentração da catalase deve? estar compreendida entre cerca de 50 e cerca de 100 000 Ul/ml, de preferência entre cerca de 350 e cerca de 14 000 Ul/ml. É preferível ajustar as concentrações de catalase e de glicolato-oxidase dentro dos valores atrás referidos, de modo que a relação (medida em UI para cada) de catalase: glicolato-oxidase seja pelo menos de cerca de 250:1.

O FMN ê um ingrediehtefacultativo a ser adicionado, em uma concentração compreendida entre 0,0 e cerca de 2,0 mM, de preferência entre cerca de 0,01 e cerca de 0,2 mM. Crê-se que o FMN aumenta a produtividade da glicolato-oxidase. Por produtividade da glicolato-oxidase entende-se a quantidade de ácido glicêlico convertido em ácido glioxílico por unidade de enzima. Deve entender-se que a concentração do FMN adicionado é uma adição a qualquer FMN presente com a enzima, porque o FMN também se adiciona muitas vezes à enzima durante a preparação desta última. A estrutura do FMN e um método para a sua análise encontra-se em K. Yagai, Methods of Biochemistry Analysis, Vol. X, Interscience Publishers, New York, 1962, p. 319-355, que aqui se inclui como referência.

oxigénio (O₂) é o oxidante para a conversão do ácido glicõlico em ácido glioxílico. Por exemplo, pode ser adicionado comoum gás à reaeção por agitação do líquido na interface gãs-líquidc ou através de uma membrana permeável ao oxigénio. Embora não querendo estar limitados por esta hipótese, crê-se que, na maior parte destas condições, a velocidade da reacção ê pelo menos parcialmente controlada pela velocidade com que o oxigénio pode ser dissolvido no meio aquoso. Assim, embora se possa adicionar o oxigénio à reacção como oxigénio do ar, ê preferível utilizar uma forma relativamente pura de oxigénio, e usar mesmo pressões elevadas. Embora não seja conhecido nenhum limite superior para a pressão de oxigénio, preferem-se pressões de oxigénio de até 50 atmosferas, e ainda com mais vantagem até 15 atmosferas. A agitação ê importante para manter uma elevada taxa de dissolução do oxigénio (e portanto da reacção). Qualquer forma de agitação conveniente é útil, tal como a agitação vulgar. Como ê bem conhecido pelos especialistas na matéria, qualquer agitação com corte ou agitação que produza espuma pode diminuir a actividade das enzima(s) e por isso deve ser evitada.

A temperatura de reacção ê uma variável importante, dado que afecta a taxa de conversão da reacção e a estabilidade das enzimas. Pode-se utilizar uma temperatura de reacção compreendida entre cerca de 0 e cerca de 40°C, de preferência um intervalo compreendido entre cerca de 5 e cerca de 30°C e ainda mais preferivelmente compreendida num intervalo de 5 a 20°C. Claro que a temperatura não deve ser tão baixa que a ãgua comece a congelar. Estas temperaturas preferidas são inferiores às referidas anteriormente e têm em consideração a preservação da actividade das enzimas assim como a taxa de reacção (oxidação do glicolato). A temperatura pode ser controlada por métodos vulgares, tais como, mas nao limitada a eles, utilizando um reactor revestido e fazendo passar um líquido, à temperatura apropriada, pelo revestimento.

*’ .'D reactor deve ser construído de qualquer material que seja inerte para os ingredientes da reacção.

Quando a reacção estã completa, podem eliminar-se as enzimas por filtração ou, se estão presentes em quantidades suficientemente pequenas, de modo que a sua presença não seja prejudicial, podem ser desnaturadas por meio de aquecimento a 70°C durante 5 minutos. As aminas eliminam-se mais facilmente utilizando uma resina permutadora de iões. Utiliza-se uma resina permutadora de catiões ácida para eliminar as aminas. As resinas apropriadas incluem Amberlite CG120, Amberlite IR120 (feita por Rohm & Haas Co.) e Dowex 50 (feita por Dow Chemical Co.). Pode-se então recuperar e em seguida reciclar a amina por tratamento da resina com uma base forte. A filtração das enzimas e a reciclagem das aminas estão indicadas a seguir nos exemplos.

produto ácido glioxílico ê útil na preparação de baunilha, etilvanilina assim como pode ser utilizado em resinas permutadoras de iões e como um catalisador ácido na indústria farmacêutica (Ullmanns). Tal como se mencionou antes, vende-se normalmente sob a forma de uma solução aquosa a 50% em peso. Deve-se antender que a referência a ácido glioxílico neste pedido de patente de invenção pode também significar o anião glioxilato, especialmente quando o ácido glioxílico estã presente numa solução cujo pH é superior a cerca de 2,3.

Nos exemplos e experiências que se seguem, fez-se a agitação com um agitador magnético excepto nos casos em que for expressamente indicado. Mediu-se a actividade enzimãtica residual retirando uma alíquõta da reacção e ensaiando directamente utilizando técni cas de ensaio normalizadas (supra).

Ê crucial nestas esperiências e5 exemplos ter um método

analítico rigoroso. Verificou-se que a cromatografia líquida de elevada resolução (HPLC) e um método analítico excelente e utilizou-se para as análises aqui referidas.

Método HPLC

Prepararam-se as amostras para análise misturando 100 jj.1 da mistura reaccional com 300 jj.1 de ácido sulfúrico O,1N, depois filtrando a solução resultante através de uma unidade de filtração Millipore Ultrafree MC (corte a 10 000 mw). As análises para o ácido glicõlico, o ácido glioxílico, o ácido oxãlico e o ácido fõrmico realizaram-se por HPLC numa coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) a 40°C, utilizando como dissolvente uma solução aquosa de ácido sulfúrico (0,01N) e ácido 1-hidroxietano-l,1-difosfõnico (0,1 mM) a 1,0 ml/minuto. O instrumento foi um sistema de HPLC Waters 840 com bombas do modelo 510, um autoánalisador WISP 712 e, Tem sequência ,rum detector UV 490E e um refractõmero diferencial 410.

A análise UV realizou-se a 210 nm. Os tempos de retenção para os ácidos oxãlico, glioxílico, glicõlico, fõrmico e propiõnico (norma interna) foram, respectivamente, de 4,29, 6,09, 7,77, 8,79 e 11,41 minutos.

EXPERIÊNCIA 1

Preparação da glicolato-oxidase a partir de espinafres

Homogenizou-se 2000 g de folhas de espinafres num misturador comercial de 4 litros contendo 1000 ml de um tampão de fosfato de potássio 0,1 M, a um pH de 8,0 e a 40°C. Triturou-se a polpa ff¢(

por meio de 4 camadas de gase, obtendo-se 1800 ml de sumo. Acidificou-se o extracto até pH 5,2 por meio da adição de aproximadamente 1 ml de ácido acético glacial. Centrifugou-se a mistura a 14000 x g durante 15 minutos para se eliminarem os sólidos. Adicionou-se 10',6 ,g/100 ml de extracto de sulfato de amónio sólido ao sobrenadante, para se obter 20% de saturação. Manteve-se o pH entre 7,8 e 8,0 por meio da adição de hidróxido de potássio 6N. Depois de se deixar a solução em repouso durante 15 minutos, centrifugou-se durante 20 minutos a 14000 x g e deitou-se fora o grânulo. Adicionou-se 8,3 g/100 ml de sulfato de amónio ao sobrenadante para se obter uma saturação total de 35%. Recolheu-se o precipitado após 15 minutos por centrifugação a 14000 x g durante 20 minutos. Dissolveu-se o bolo num volume mínimo de cerca de 180 ml de cloridrato de etilenodiamina 20 mM, contendo flavina-mononucleotido 2 mM a um pH igual a 8,0. Uma vez dissolvido, adicionou-se sulfato de amónio até a uma concentração final de 3,2 M. Armazenou-se a suspensão de sulfato de amónio/glicolato-oxidase às escuras e a 4°C.

EXEMPLO 1

Oxidação do ácido glicólico

Colocou-se uma barra de agitação magnética num reactor de aerossóis em vidro Fischer-Porter de 3 onças e adicionou-se 10 ml de uma solução aquosa contendo ácido glicólico 250 mM, etileno diamina (EDA) 330 mM, FMN 0,01 mM, ácido propiõnico (norma interna de HPLC, 75 mM), glicolato-oxidase (GAO) (a partir de espinafres;

2,0 Ul/ml), e catalase ( a partir de Aspergillus niger; 1400 Ul/ml).

pH final da solução foi de 8,9. Selou-se o reactor e deixou-se arrefecer a mistura reaccional até 15°C, depois lavou-se o reactor com oxigénio por meio de pressurização até 70 psig e ventilação à pressão atmosférica cinco vezes com agitação. Pressurizou-se então o reactor até 70 psi de oxigénio e agitou-se a mistura. Retiraram-se alíquotas de 0,10 ml através de uraa porta de amostragem (sem perda de pressão no reactor) a intervalos regulares para análise por HPLC para controlar o progresso da reacção. Apôs 4 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato oxalato e formato, eram, respectivamente, de 98,9%, 0,5% e 0%, e 0,6% o glicolato restante. A actividade remanescente da glicolato-oxidase e da catalase era para ambas de 100% dos seus valores iniciais.

EXEMPLO 2

Oxidação do acido glicõlico

Repetiu-se a reacção do exemplo 1, com a diferença de a etilenodiamina ter sido substituída por hidrogeno-fosfato de potássio 330 mM e de o pH final da solução ter sido ajustado para um pH de 8,0 com acido clorídrico concentrado. Apõs 4 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato, oxalato e formato, eram, respectivamente de 24,4%, 0,3% e 8,4%, e 67,1% o glicolato .restante. A actividade remanescente da glicolato-oxidase e da catalase eram respecti vamente de 95% e 44% dos seus valores iniciais.

EXEMPLO 3

Oxidação do ácido glicõlico

Colocou-se uma barra de agitação magnética num reactor de aerossóis em vidro Fischer-Porter de 3 onças e adicionou-se 50 ml de uma solução aquosa contendo ácido glicõlico 750 mM, etilenodiamina (EDA) 862 mM, FMN 0,1 mM, ácido propiónico (norma interna de HPLC, 75 mM) glicolato-oxidase (GAO) (a partir de espinafres;

1,0 Ul/ml), e catalase (a partir de Aspergillus niger; 1400 Ul/ml).

O pH final desta solução foi de 8,9. Selou-se o reactor e deixou-se arrefecer a mistura reaccional até 15°C, depois lavou-se o reactor com oxigénio por meio de pressurização até 70 psig e ventilação â pressão atmosférica cinco vezes com agitação. Pressurizou-se então o reactor até 70 psi de oxigénio e agitou-se a mistura. Retiraram-se alíquotas de 0,10 ml a intervalos regulares para análise por HPLC para controlar o progresso da reacção. Após 90 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato, oxalato e formato, eram, respectivamente, de 99,8%, 0,2% e 0% e não houve glicolato residual.

A actividade remanescente da glicolato-oxidase e da catalase eram de, respectivamente, 34% e 88% dos seus valores iniciais.

EXEMPLO 4

Oxidação do ácido glicõlico

Colocou-se uma barra de agitação magnética num reactor de aerossóis em vidro Fischer-Porter de 3 onças e adicíonou-se 10 ml de uma solução aquosa contendo ácido glicõlico 2000 mM, etilenodiamina (EDA) 2100 mM, FMN 0,01 mM, glicolato-oxidase (GAO) (a partir de espinafres; 1,2 Ul/ml) e catalase '(a .partir de Aspergillus niger; 1400 Ul/ml). 0 pH final desta solução foi de 9,0. Selou-se o reactor e deixou-se arrefecer a mistura reaccional até 15°C, depois lavou-se o reactor com oxigénio por meio de pressurização até psig e ventilação à pressão atmosférica cinco vezes com agitação. Pressurizou-se então o reactor até 70 psi de oxigénio e agitou-se a mistura. Retiraram-se alíquotas de 0,10 ml a intervalos regulares para análise por HPLC para controlar o progresso da reacção. Após 31 horas, não havia nenhuma actividade residual de glicolato-oxidase e por isso adicionou-se mais 2,0 Ul/ml de glicolato-oxidase. Após 143 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato,oxalato e formato, eram, respectivamente, de 96,8%, 2,2% e 1,0% e não havia qualquer glicolato remanescente. A actividade remanescente da glicolato-oxidase (baseada no total) e da catalase eram, respectivamente, de 69% edè 100%dos seus valores iniciais.

EXEMPLO 5

Oxidação do ácido glicõlico

Colocou-se uma barra de agitação magnética num reactor de aerossóis em vidro Fischer-Porter de 3 onças e adicionou-se 10 ml de uma solução aquosa contendo ácido glicõlico 250 mM, tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS, 330 mM), FMN 0,02 mM, ácido propiõnico (norma interna de HPLC, 75 mM), glicolato-oxidase (GAO) (a partir de espinafres; 0,25 Ul/ml) e catalase (a-ipartir de Aspergillus niger; 1400 Ul/ml). Ajustou-se o pH final desta solução para 8,3 com hidróxido de sõdio a 5%. Selou-se o reactor e deixou-se arrefecer a mistura reaccional até 30°C, depois lavou-se o reactor com oxigénio por meio de pressurização até 15 psig e ventilação à pressão atmosférica cinco vezes com agitação. Retiraram-se alíquotas de 0,10 ml através de uma porta de amostragem (sem perda de pressão no reactor) a intervalos regulares para análise por HPLC para contro19 violar o progresso da reacção. Após 30 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato oxalato e formato, eram, respectivamente, de 89,5%, 3,3% e 2,8% e não havia qualquer glicolato remanescente. A actividade remanescente do glicolato-oxidase 'e da catalase' eram,· respecti vamente, de 52% e' 60·%-' dos sèus^valõres inicias.

EXEMPLO 6

Oxidação do ácido glicõlico

Repetiu-se a reacção do exemplo 4, com a diferença de as concentrações de ácido glicõlico e de etilenodiamina serem de 2500 mM e 2630 mM, respectivamente, e de não se ter adicionado mais glicolato-oxidase à 31- hora. Após 143 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato, oxalato e formato, eram, respectivamente, de 27,4%, 0%, e 0% e 72,6% o glicolato restante, indicando um decréscimo na taxa da reacção a uma concentração de glicolato de 2500 mM. A actividade remanescente do glicolato-oxidase e da catalase eram respectivamente de 68% e 80% dos seus valores iniciais.

EXEMPLO 7

Efeito da temperatura da oxidação do ácido glicõlico

Determinou-se a dependência da actividade da catalase e da GAO na temperatura da reacção utilizando um reactor de aerossóis em vidro Fischer-Porter de 3 onças. Agitou-se a solução aquosa de 10 ml contendo glicolato 250 mM, etilenodiamina 330 mM, glicolato20 •ç-oxidase 0,5 UI/ml, catalase (1400 UI/ml) e FMN (0,01 mM) a várias temperaturas, a um pH de 8,3 e a uma atmosfera de oxigénio. Após uma hora, os rendimentos de glioxilato nas reacções realizadas a 40°C, 30°C, 15°C e 5°C eram, respectivamente, de 92%, 96%, 99% e 99%, enquanto a actividade residual da catalase/GAO era respectivamente de 38%/87%, 60%/100%, 100%/100% e 100%/100%. Temperaturas de reacção mais baixas resultaram em actividades enzimãticas remanescentes mais elevadas para selectividades de ãcido glioxilico maiores.

EXEMPLO 8

Efeito da pressão de oxigénio na oxidação do ácido glicólico

Utilizando o processo descrito no exemplo 1, agitou-se soluções aquosas de 10 ml contendo ãcido glicólico 250 mM, tampão de TRIS (330 mM, pH 8,3), ãcido propiónico (norma interna de HPLC, 75 mM), glicolato-oxidase (a partir de espinafres; 0,25 UI/ml) catalase (Aspergillus niger; 1400 UI/ml) e FMN 0,2 mM, a 30°C e a 1 atmosfera de ar (0,2 atmosfera de oxigénio) ou a 1, 2, 3, 6 ou 10 atmosferas de oxigénio. As taxas iniciais de produção de ãcido glioxilico (acima dos primeiros 10 - 15% da reacção), às várias pressões de oxigénio utilizadas estão indicadas no quadro seguinte.

Pressão de oxigénio	Taxa
(atmosferas)	(jimoles) /ml/minuto
0,2	0,027
1,0	0,156
2,0	0,301
3,0	0,494
6,0	0,752
10,0	1,025

EXEMPLO 9

Efeito da concentração de glicolato-oxidase na oxidação de ãcido glicólico

Utilizando o processo descrito no exemplo 1, agitou-se soluções aquosas de 10 ml contendo glicolato 250 mM, EDA 330 mM, ãcido propiõnico (norma interna de HPLC, 75 mM), glicolato-oxidase (0,20, 0,40 ou 4,0 Ul/ml), catalase (1400 Ul/ml) e FMN 0,01 mM, a . 15°C, a um pH de 8,9 e a 6 atmosferas de oxigénio. As taxas iniciais de produção de ãcido glioxílico (acima dos primeiros 10 - 15% da reaeção), quando se utilizou 0,20 Ul/ml, 0,40 Ul/ml ou 4,0 Ul/ml de GAO de beterraba foram de 1,37 micromole/ml/minuto, 1,33 micromole/ml/minuto e 1,32 micromole/ml/minuto, respeotivamente. Nestas condições gerais da reaeção, a concentração da enzima não dependeu da taxa de reaeção.

•4

EXEMPLO 10

Oxidação do ácido glicõlico

Realizou-se a demonstração da síntese enzimática do ácido glioxílico em larga escala numa célula de agitação de elevada saída Amicon modelo 2000, em que se substituiu a membrana de fil~ í*r) traçao por uma folha de Teflon>—' com uma espessura de 1,6 mm e que tinha um agitador magnético. Adicionou-se glicolato-oxidase (2000 UI, isolada de espinafres) a uma solução de 2,0 litros contendo 113 g (1,49 moles) de ácido glicõlico, 95 g (1,58 moles) de etilenodiamina, 9,7 mg (0,02 mmõle) de FMN e 2,8 x 10^ UI de catalase a partir de Aspergillus niger (sigma) J e agitou-se a mistura resultante a um pH final de 8,9, a 15°C e a 6 atmosferas de oxigénio. Retiraram-se alíquotas a intervalos regulares para análise por HPLC para controlar o progresso da reacção. Após 77 horas, a análise por HPLC da mistura reaccional indicou que o ácido glioxílico (110 g, 99,6% de rendimento), o ácido fõrmico (0,2%) e o ácido oxãlico (0,2% de rendimento) eram os únicos produtos da reacção; atingiu-se a conversão completa do ácido glicõlico. As actividades da glicolato-oxidase e da catalase eram de 74% e de 87% das suas actividades iniciais, respectivamente. A reacção terminou quando se aspergiu a mistura com azoto e depois se aqueceu a mistura reaccional até 70°C durante 5 minutos sob atmosfera de azoto. Eliminou-se a proteína precipitada por centrifugação e eliminou-se o FMN por filtração da mistura reaccional através de carvão activado. Qualquer outra proteína solúvel remanescente foi eliminada por filtração utilizando um sistema de filtração Millipore Minitan com um filtro de corte de 10 000 mw e depois separou-se o glioxilato e a etilenodiamina (EDA) por cromatografia de permuta iõnica.

Suspenderam-se 900 g de Amberlite CG-120 (Rohm & Haas,

100-200 mesh, 4,5 meq/g) em acido clorídrico 1,0 N para se obter 2,0 litros de resina inchada, que se lavou depois com agua destilada para eliminar o excesso de ácido clorídrico. Carregou-se uma coluna Pharmacia K de 50 x 100 cm com 1900 ml de resina lavada, bombou-se 2,0 litros de água destilada através da coluna a 8,0 ml/mi nuto e carregou-se então na coluna metade da mistura reaccional de ácido glioxílico/etilenodiamina (EDA) (contendo 0,78 moles de EDA e 0,75 mole de ácido glioxílico) a uma velocidade de 8 ml/minutò. Recolheu-se o ácido glioxílico durante a fase de eluição de água inicial, que se controlou por absorvência a 254 nm. Recolheu-se aproximadamente 2,2 litros de eluente contendo ácido glioxílico. Eluiu-se a etilenodiamina com 3,4 litros de hidróxido de sódio IN, obtendo-se 0,77 mole de EDA (recuperação de 99%). Reequilibrou-se a coluna lavando-a com 2,4 litros de ácido clorídrico IN, seguida de 3 litros de água destilada para eliminar o cloreto. Combinaram-se e concentraram-se as fracções de coluna combinadas contendo ácido glioxílico da separação da coluna permutadora de iões de duas fracções de 1,1 litro do eluído ácido glioxílico/EDA por evaporação rotativa a 40°C para se obter uma solução a 50% em peso contendo 1,40 moles (rendimento de 94%) de ácido glioxílico; a pureza do ácido glioxílico produzido era maior do que 99,5% do que a determinada por espectroscopia de RMN do C ou por analise de

HPLC.

EXEMPLO 11

Oxidação do ácido glicólico

Repetiu-se a reacção do exemplo 1, com a diferença de se ter omitido a adição de catalase. Após 4 horas, os rendimentos da HPLC em glioxilato, oxalato e formato, eram, respectivamente, de 6,2%, 0,7% e 16,3% e permanecia 7,1% de glicolato, indicando as selectividades mais baixas obtidas quando a catalase está ausente. A actividade remanescente da glicolato-oxidase foi de 5% do seu valor inicial.

EXEMPLO 12

Oxidação do ácido glicólico

Preparou-se uma solução para armazenagem misturando

12,5 g de água desionizada, 300 mg de ácido glicólico, 1,2 g de TRIS e 1,0 g de uma solução 0,02 mM de FMN em um tampão de fosfato a um pH de 6,8. Colocou-se uma porção de 10 g da solução de armazenagem num balão de Erlenmeyer de 250 ml de catalase de fígado de bovino (comprada na Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 63178, numero de catálogo C-10, cerca de 1200 Ul/mg). Centrifugou-se uma porção de 0,5 g de uma suspensão de glicolato-oxidase (número de catálogo da Sigma G-4136, a partir de açúcar de beterraba, contendo a solução sulfato de amónio 2,4 M, TRIS 10 mM, FMN 5 mM e tendo cerca de 7,5 Ul/ml) e deitou-se fora o líquido. Adicionou-se o sólido â solução no balão de Erlenmeyer. O pH era de 8,5. Purgou-se o frasco com oxigénio durante 5 minutos a cerca de 200 ml de oxi- 25 génio por minuto. Selou-se o frasco e depois agitou-se com um agitador durante 23 horas. A analise por HPLC (similar mas não exactamente igual à descrita antes) mostrou que o glicolato tinha sido completamente oxidado para glioxilato e uma pequena quantidade de oxalato.

EXEMPLO 13

Oxidação do ãcido glicõlico'utilizando um reactor de membrana

Preparou-se uma solução para armazenagem misturando 12,4 ml de ãgua desionizada, 305 mg de ãcido glicõlico, 1,0 g de uma solução 0,15 mM de FMN em um tampão de fosfato a um pH de 7,5 e 1,3 g de uma solução a 20% em peso de etilenodiamina em ãgua. Preparou-se uma mistura reaccional misturando 12 g da solução de armazenagem com 4 mg de catalase de fígado de bovino (Sigma, numero de catálogo C-10, cerca de 2800 Ul/mg) e o solido centrifugado a partir de 1,0 g de uma suspensão comercial de glicolato-oxidase (número de catálogo da Sigma G-8620, a partir de espinafres, contendo uma solução de sulfato de amõnio 3,2 M, FMN 2 mM e tendo cerca de 2,8 Ul/ml). O pH era de 9,1.

O reactor tinha 3 componentes: um tubo de borracha de silicone com 3,65 m de comprimento e 1,6 mm de diâmetro interno por 3,2 mm de diâmetro externo; uma bomba peristãltica Masterflex e um tubo de ensaio em vidro de 100 mm de comprimento com 10 mm de diâmetro interior que serviu como reservatório. Os tubos para e da bomba passavam através de um septo que fechava o reservatório do tubo de ensaio. Colocou-se a mistura reaccional no reactor e depois bombou-se através do tubo durante cerca de 23 horas a uma velocidade de 3,5 ml/minuto. Durante este tempo cerca de 5 ml estava no tubo e cerca de 5 ml estava no reservatório (mas tudo circulava). Envolveu-se o tubo numa corrente de ar. A análise por HPLC (similar mas não exactamente igual â descrita antes) mostrou que o glicolato tinha sido completamente oxidado para glioxilato e uma pequena quantidade de oxalato.

EXPERlSNCIA 2

Oxidação do ácido glicólieo

Num tubo centrífugo de polipropileno de 15 ml colocaram-se 3 ml de uma solução aquosa contendo ãcido glicólieo 3,3mM, fosfato ãcido de potássio 33 mM (pH 8,0), glicolato-oxidase (espinafres, 0,33 Ul/ml), catalase (fígado de bovino, 1400 Ul/ml) e FMN (0,01 mM). Manteve-se a solução a 30°C ao ar e retiraram-se alíquotas de 0,15 ml. Filtrou-se através de um filtro Millipore (10 000 MW) e analisou-se por HPLC. Passada 1 hora, os rendimentos em glioxilato, oxalato e formato eram de 80,9%, 3,8% e 0%, respectivamente, e o restante era . 15,5% de glicolato. Passadas duas horas, os rendimentos de glioxilato, oxalato e formato eram de 80,6%, 19,7% e 0%, respectivamente, e não havia glicolato remanescente.

Embora se tenham descrito antes as realizações preferidas da presente invenção, deve entender-se que não hã qualquer intenção de a limitar às descrições precisas aqui mencionadas e deve entender-se que a requerente se reserva o direito de todas as modificações e alterações que caibam no âmbito da presente invenção, tal como se define nas reivindicações anexas.

Claims (100)

1. - Processo para a preparação de ãcido glioxílico ca racterizado pelo facto de se fazer contactar, em solução aquosa, a um pH compreendido entre cerca de 7 e cerca de 10, ãcido glicólico, numa concentração inicial compreendida entre 200 mM e cerca de 2500 nM, glicolato-oxidase e oxigénio, na presença de uma quantidade eficaz de um ou mais aditivos que melhorem o rendimento em ãcido glioxílico.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a concentração inicial de ãcido glicólico estar compreendida entre cerca de 250 mM e cerca de 1500 mM.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de a concentração inicial de ácido glicólico estar compreendida entre cerca de 500 mM e cerca de 1000 mM.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o glicolato-oxidase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 0,001 e cerca de 1000 UX/ml.

5.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado pelo facto de o glicolato-oxidase estar presente numa concentração compreendida, entre cerca de 0,1 e cerca de 4 UI/ /ml.

Processo de acordo facto de o pH estar

6.rizado pelo 8,0 e 9,5.

7.rizado pelo

8,0 e 9,0.

8.rizado pelo com a reivindicação 1, caracte compreendido entre cerca de

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte facto de o pH estar compreendido entre cerca de

Processo de acordo com a reivindicação 3, caracte facto de o pH estar compreendido entre cerca de _ζ/

-298,0 e 9,5.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se ajustar o pH inicial da reacção para cerca de 9,5 e deixar que ele diminua até cerca de 8,0 à medida que a reacção prossegue.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os aditivos que melhoram o rendimento de ãcido glioxílico serem aminas escolhidas entre etilenodiami na, tris-(hidroximetil)-metilamina ou misturas de ambas.

11.terizado pelo

Processo facto de de acordo o aditivo com a reivindicação 10, carac ser etilenodiamina.

12.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de os aditivos que melhoram o rendimento de ãcido glioxílico serem aminas escolhidas entre etilenodiami na, tris-(hidroximetil)-metilamina ou misturas de ambas.

13.terizado pelo

Processo facto de de acordo o aditivo com a reivindicação 12 ser etilenodiamina.

carac

14.- Processo de acordo com a reivindicação 10, carac terizado pelo facto de a amina que se adiciona como aditivo es

I /30Ζ' tar presente em excesso em relação â quantidade molar de ácido glicólico.

15.- Processo de acordo com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,0 e cerca de 3,0.

16.- Processo de acordo com a reivindicação 15, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci. do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0.

17.- Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,05 e cerca de

1,33.

18. - Processo para a preparação selectiva de ácido glioxílico caracterizado-pelo facto de se fazer contactar, em solução aquosa, a um pH compreendido entre cerca de 7 e cerca de 10, ãcido glicólico, numa concentração inicial compreendida entre 200 mM e cerca de 2500 mM, glicolato-oxidase e oxigénio.

19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado pelo facto de a catalase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 50 e cerca de 100000 UI/ /ml.

20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac terizado pelo facto de a catalase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 350 e cerca de 14000 Ul/ml.

21. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a relação entre a catalase e a glicolato-oxidase ser de, pelo menos, 250:1.

22. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de tanto a catalase como a amina escolhida estarem presentes como aditivos.

23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci do glicõlico estar compreendida entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0, a concentração inicial de catalase estar compreendida entre cerca de 50 e cerca de 100 000 Ul/ml e a concentração inicial de glicolato-oxidase estar compreendida entre cerca de 0,001 e cerca de 1000 Ul/ml.

24.- Processo de acordo com a reivindicação 23, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci do glicõlico estar compreendida entre cerca de 1,05 e cerca de

1,33, a concentração inicial de catalase estar compreendida en tre cerca de 350 e cerca de 14 000 Ul/ml e a concentração inicial de glicolato-oxidase estar compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 4,0 Ul/ml.

25.terizado pelo

8,0 e 9,5.

Processo de acordo com a reivindicação 24, carac facto de o pH estar compreendido entre cerca de

26.- Processo de acordo com terizado pelo facto de a temperatura cerca de 0°C e cerca de 40°C.

a reivindicação 25, carac □ * _ estar compreendida entre

27. - Processo.de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 3Q°C.

28. - Processo de acordo com a reivindicação 27, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 30°C.

29. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar o oxigénio na forma gasosa

-33e à pressão atmosférica.

30. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar o oxigénio na forma gasosa e à pressão atmosférica em excesso.

31. - Processo de acordo com a reivindicação 30, carac terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio na forma gasosa e a uma pressão até cerca de 50 atmosferas.

32. - Processo de acordo com a reivindicação 31, carac terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio na forma gasosa e a uma pressão até cerca de 15 atmosferas.

33. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de tanto a catalase como a amina escolhida estarem presentes como aditivos.

34. - Processo de acordo com a reivindieação 33, carac * — terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,0 e cerca de 3,0, a concentração inicial de catalase estar compreendida entre cerca de 50 e cerca de 100 000 Ul/ml e a concentração inicial de glicolato-oxidase estar compreendida entre cerca de 0,001 e cerca de 1000 Ul/ml.

35. - Processo de acordo com a reivindicação 34, terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,05 e cerca de

1,33, a concentração inicial de catalase estar compreendida en tre cerca de 350 e cerca de 14 000 Ul/ml e a concentração inicial de glicolato-oxidase estar compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 4,0 Ul/ml.

36. - Processo de acordo com a reivindicação 35, caraç terizado pelo facto de o pH estar compreendido entre cerca de 8,0 e 9,5.

37. - Processo de acordo com a reivindicação 36, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 0°C e cerca de 40°C.

38. - Processo de acordo com a reivindicação 37, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 30°C.

39. - Processo de acordo com a reivindicação 38, carac » * — terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 20°C.

40. - Processo de acordo com a reivindicação 37, carac terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio na forma gasosa carac o aci e à pressão atmosférica.

41. - Processo de acordo coma reivindicação 31, carac terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio na forma gasosa e a uma pressão até cerca de 15 atmosferas.

42. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a FMN estar presente no processo.

43. - Processo de acordo com a reivindicação 10, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

44. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

45. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

46.- Processo de acordo com a reivindicação 42, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial de cerca de 2,0 mM ou inferior.

47.- Processo de acordo com a reivindicação 46, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial compreendida entre cerca de 0,01 e cerca de 0,2 mM.

48. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar o oxigénio necessário â reacção sob a forma gasosa e se fazer contactar o oxigénio com a solução aquosa por agitação da solução numa interface entre o oxigénio e a solução reaccional.

49. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio necessário à reacção sob a forma gasosa e se fazer contactar o oxigénio com a solução aquosa por agitação da solução numa interface entre o oxigénio e a solução reaccional.

50. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar o oxigénio através de uma membrana permeável ao oxigénio.

51. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac > ' - terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio através de uma membrana permeável ao oxigénio.

52. - Processo de acordo com a reivindicação 48, carac terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio sob a forma de ar.

53.- Processo de acordo com a reivindicação 51, carac

-37•η terizado pelo facto de se adicionar o oxigénio sob a forma de ar.

54. - Processo de acordo com a reivindicação 48, carac terizado pelo facto de o oxigénio estar praticamente na sua forma pura.

55. - Processo de acordo com a reivindicação 49, carac terizado pelo facto de o oxigénio estar praticamente na sua forma pura.

56. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se submeter a agitação.

57. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a temperatura da reaeção estar compreen dida entre cerca de 0°C e cerca de 40°C, na condição de, contu do, a temperatura não ser tão baixa que faça congelar a água na mistura reaccional.

58. - Processo de acordo com a reivindicação 57, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 30°C.

59. - Processo de acordo com a reivindicação 58, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre // cerca de 5°C e cerca de 20°C.

60. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a temperatura da reacção estar compreen dida entre cerca de 0°C e cerca de 40°C, na condição de, contu do, a temperatura não ser tão baixa que faça congelar a água na mistura reaccional.

61. - Processo de acordo com a reivindicação 60, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 30°C.

62. - Processo de acordo com a reivindicação 61, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 20°C.

63. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminar por filtração qualquer enzi ma presente após a reacção.

64. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado pelo facto de a concentração inicial de ácido glicõli co estar compreendida entre cerca de 500 mM e cerca de

1000 mM.

65.- Processo de acordo com a reivindicação 61, carac terizado pelo facto de o glicolato-oxidase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 0,001 e cerca de 1000 Ul/ml.

66. - Processo de acordo com a reivindicação 65, carac terizado pelo facto de o glicolato-oxidase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de

4 Ul/ml.

67. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado pelo facto de o pH estar compreendido entre cerca de 8,0 e 9,0.

68. - Processo.de acordo, com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de o pH estar compreendido entre cerca de 8,0 e 9,5.

69. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de a amina se escolher entre etilenodiamina ou tris-(hidroximetil)-metilamina.

70. - Processo de acordo com a reivindicação 69, carac terizado pelo facto de o aditivo ser etilenodiamina.

71.- Processo de acordo com a reivindicação 69, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o áci do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0.

72.- Processo de acordo.com a reivindicação 71, carac terizado pelo facto de a relação entre a amina inicial e o ãci do glicólico estar compreendida entre cerca de 1,05 e cerca de 1,33.

73. - Processo de acordo com a reivindicação 72, carac terizado pelo facto de a catalase. estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 50 e cerca de 100000 Ul/ml.

74. - Processo de acordo com a reivindicação 78, carac terizado pelo facto.de a catalase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 350 e cerca de 14000 Ul/ml.

75. - Processo de acordo com a reivindicação 71, carac terizado pelo facto de a catalase estar presente numa concentração compreendida entre cerca de 350 e cerca de 14000 Ul/ml.

76. - Processo de acordo com a reivindicação 75, carac terizado pelo facto de a concentração inicial de glicolato-oxi. dade estar compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 4 Ul/ml.

-4177.- Processo de acordo terizado pelo facto de a relação glicolato-oxidase ser pelo menos com a reivindicação 76, carac inicial entre a catalase e a compreendida entre 250 e 1.

78. - Processo de acordo com a reivindicação 77, carac terizado pelo facto de o pH estar compreendido entre cerca de 8,0 e 9,5.

79. - Processo de acordo com a reivindicação 78, carac * ___ terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 0°C e cerca de 40°C.

80.- Processo de acordo com a reivindicação 79, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 30°C.

81. - Processo de acordo com a reivindicação 80, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 20°C.

82. - Processo de acordo com a reivindicação 79, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial de cerca de 2,0 mM ou inferior.

83.- Processo de acordo com a reivindicação 82, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração

-42inicial compreendida entre cerca de 0,01 e cerca de 0,2 mM.

84. - Processo de acordo com a reivindicação 81, carac terizado pelo facto de a relação entre a catalase e a glicolato-oxidase ser de, pelo menos, 250:1.

85. - Processo de acordo com a reivindicação 3, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

86. - Processo.de acordo com a reivindicação 44, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial de cerca de 2,0 mM ou inferior.

87. - Processo de acordo com a reivindicação 86, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial compreendida entre cerca de 0,01 e cerca de 0,2 mM.

88. - Processo de acordo com a reivindicação 37, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

89. - Processo de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

90. - Processo de acordo com a reivindicação 89, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial de cerca de 2,0 mM ou inferior.

91. - Processo de acordo com a reivindicação 90, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial compreendida entre cerca de 0,01 e cerca de 0,2 mM.

92. - Processo de acordo com a reivindicação 43, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente numa concentração inicial de cerca de 2.,0 mM ou inferior.

93. - Processo de acordo com a reivindicação 93, carac terizado pelo facto de a. FMN estar presente numa concentração inicial compreendida entre cerca de 0,01 e cerca de 0,2 mM.

94. - Processo de acordo com a reivindicação 20, carac terizado pelo facto de a concentração inicial de glicolato-oxidase estar compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de

4 Ul/ml.

95. - Processo de acordo com a reivindicação 94, carac terizado pelo facto de o pH estar compreendido entre cerca de 8,0 e 9,5.

96. - Processo de acordo com a reivindicação 95, carac terizado pelo facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 0°c e cerca de 40°C.

97. - Processo de acordo com a reivindicação 96, carac terizado ceio facto de a temperatura estar compreendida entre cerca de 5°C e cerca de 20°C.

98. - Processo de acordo com a reivindicação 97, carac terizado pelo facto de a FMN estar presente.

99. - Processo de acordo.com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se eliminar qualquer enzima presente após a reacção por filtração e/ou aquecimento.

100. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se eliminar qualquer amina presente após a reacção, utilizando .uma resina, permutadora de iões.

101. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de se eliminar qualquer amina presente após a reacção, utilizando uma resina permutadora de iões.