FI95199B - Menetelmä liposomaalisen prostaglandiinivalmisteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 · 95199 5

Menetelmä liposomaalisen prostaglandiinivalmisteen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en liposomal prostaglandinkomposition

Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee menetelmää liposomaalisen prostaglandiinivalmisteen valmistamiseksi. Prostaglandiinit ovat ara-kidonihappometaboliitteja. Tässä keksinnössä esitetään eri-10 tyisesti sellaisia prostaglandiineihin liittyviä liposomeja, joissa käytetään prostaglandiinia E,. Käsite prostaglandiini käsittää myös synteettiset yhdisteet, jotka ovat rakenteellisesti sukua luonnollisesti esiintyville prostaglandiineil-le.

15

Prostaglandiinit ovat olennaisesti kaikissa ihmisen kudoksissa ja kehonesteissä esiintyviä aineita, ja ne saavat aikaan laajan vaikutuskirjon käsittäen käytännössä kaikki biologiset toiminnot. Nämä aineet ovat peräisin 20 hiiltä si-20 sältävistä välttämättömistä rasvahapoista (yleisin prekurso-ri on arakidonihappo) ja syntetisoituvat biologisesti sellaisiksi rakenteiksi, kuten 20 hiiltä sisältävien prosta-glandiinien alla esitetty alaluokka Ej ("PGE!") : 25 0 ^ Il

OH

35

Muita prostaglandiinialaluokkia merkitään kirjaimilla, ja ne erottaa toisistaan substituutiot syklopentaanirenkaaseen. Tällaisia alaluokkia ovat prostaglandiini E- ja F„-sarjat, jotka ovat eniten tutkitut, alaluokkien A, B, ja C ollessa 40 E-sarjan johdannaisia. Prostaglandiineja A-F pidetään "primäärisinä prostaglandiineina"; prostaglandiinien G2 ja H2 2 95199 (sykliset endoperoksidit) ja tromboksäänien Aj ja B2 rakenteet on selvitetty viime aikoina: Goodman et ai., toim.; The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., New York, s. 668-676). Muita bioaktiivisia aineita, 5 joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, ovat prostasyk-liinit ja leukotrieenit.

Prostaglandiineilla on erilaisia fysiologisia vaikutuksia, kuten verisuonia laajentava vaikutus, ääreisverenkierron pa-10 rantaminen ja antilipolyysi. Prostaglandiineja käytetään terapeuttisesti monissa tiloissa, käsittäen, muttei rajoittavasti, valtimokäytävän, synnytyspolttojen alkamiseen lasketulla hetkellä johtavan kohdun supistusten stimuloinnin kuten myös abortin, keuhkoahdistustaudin, ja ruoansulatus-15 kanavan haavaumien suppression eläimillä. Niitä käytetään myös pikkuvaltimoiden kovettumisen ennaltaestoon.

Liposomit ovat täysin suljettuja lipidikaksoiskerrosmembraa-neja, jotka sisältävät pidätetyn vesikerrostilavuuden. Lipo-20 somit voivat olla unilamellaarisia rakkuloita (omaten yhden ainoan membraanikaksoiskerroksen) tai multilamellaarisia rakkuloita (sipulimaisia rakenteita, joille on ominaista monikerroksiset membraanikaksoiskerrokset, jotka kaikki on erotettu seuraavasta vesikerroksella). Kaksoiskerros koostuu 25 kahdesta lipidin yksinkertaisesta kerroksesta, joilla on • hydrofobinen "häntä"-alue ja hydrofiilinen "pää"-alue. Mem braanikaksoiskerroksen rakenne on sellainen, että lipidin yksinkertaisten kerrosten hydrofobiset (ei-pooliset) "hännät" orientoituvat kaksoiskerroksen keskustaa kohden kun 30 taas hydrofiilinen "pää" orientoituu vesikerrosta kohden.

Alkuperäinen liposomin valmistus: Bangham et ai.; J. Mol.

Biol., 1965, 12 s. 238-252, käsitti fosfolipidien suspendoi-misen orgaaniseen liuottimeen, joka haihdutettiin sitten 35 kuiviin, jolloin reaktioastiaan jäi fosfolipidikalvo. Seu- raavaksi lisättiin sopiva määrä vesifaasia, seos sai "turvota", ja saadut liposomit, jotka koostuvat multilamellaari-sista rakkuloista (MLV), dispergoitiin mekaanisesti. Tämä 3 95199 tekniikka muodostaa pohjan pienten sonikoitujen unilamellaa-risten rakkuloiden kehittämiselle, jonka on kuvannut: Papa-hadjopoulos et ai; Biochim. Biophys, Acta., 1968, 135, s. 624-638, ja suurten unilamellaaristen rakkuloiden.

5

Unilamellaarisia rakkuloita voidaan tuottaa suulakepuristus-laitetta käyttäen menetelmällä, jonka on kuvannut: Cullis et ai.; PCT-patenttihakemus W0 86/00238, 16. tammikuuta 1986, nimellä "Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesi-10 des", joka sisällytetään tähän viitaten. Tällä tekniikalla valmistetut rakkulat, joita kutsutaan nimellä LUVETS, suula-kepuristetaan paineen alaisina membraanisuodattimen läpi. Rakkuloita voidaan valmistaa myös suulakepuristustekniikalla 200 nm:n suodattimen lävitse, tällaiset rakkulat tunnetaan 15 nimellä VET200.

Toinen liposomien muodostamiseen käytetty tekniikka on "reverse phase evaporation" (REV)-menetelmä, jonka on kuvannut: Papahadjopoulos; US-patenttijulkaisu 4 235 871, julkaistu 25 20 marraskuuta 1980. Tässä menetelmässä muodostetaan oligola-mellaarisia lipidirakkuloita, joissa kapseloitava vesiker-rosmateriaali lisätään lipideihin orgaanisessa liuottimessa, jolloin muodostuu vesi öljyssä -tyyppinen emulsio. Orgaaninen liuotin poistetaan, jolloin muodostuu geeli. Geeli dis-25 pergoidaan vesiväliaineeseen, jolloin se muuttuu suspensiok-• si. Edelleen toinen tekniikka on detergentti-dialyysi-mene- telmä (Enoch et ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei., 76:145). Tässä menetelmässä lipidi sekoitetaan pinta-aktiivisen aineen, kuten deoksikolaatin kanssa, vesiväliaineessa, soni-30 koidaan, ja pinta-aktiivinen aine poistetaan geelisuodatuk-sella. Edelleen toinen tekniikka on etanoli-infuusio-tekniikka (Batzri et ai., 1973, Biochim. Biophys. Acta., 298:1015), pienten unilamellaaristen rakkuloiden muodostamiseksi, jossa lipidin etanoliliuos ruiskutetaan haluttuun 35 vesikerrokseen, jolloin muodostuu liposomeja, jotka ovat halkaisijaltaan noin 30 nm - noin 2 μπι. Sitten jäännöseta-noli voidaan poistaa pyöröhaihduttimella haihduttamalla.

4 95199

Toinen liposomiluokka, jota voidaan käyttää keksinnössä, on sellainen, jolle on ominaista olennaisen tasainen lamellaa-risen liuenneen aineen jakauma. Tämän luokan liposomeja nimitetään stabiileiksi plurilamellaarisiksi rakkuloiksi 5 (SPLV), kuten on määritelty US-patenttijulkaisussa 4 522 803, Lenk, et ai., yksifaasisiksi rakkuloiksi, kuten kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 558 579, Fountain, et ai., ja pakastetuiksi ja sulatetuiksi multilamellaarisiksi rakkuloiksi (FATMLV), jolloin rakkulat altistetaan ainakin yhdel-10 le pakastus- ja sulatussyklille; tämän menetelmän on kuvannut: Bally et ai.; PCT-patenttijulkaisu 87/00043, 15. tammikuuta 1987, nimellä "Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies". Näiden viitteiden aihetta käsittelevät osat liitetään tähän viitaten.

15

Liposomi-lääkkeenvälitysjärjestelmässä bioaktiivinen aine, kuten lääke, pidätetään tai liitetään liposomiin ja annetaan sitten hoidettavalle potilaalle. Katso esimerkiksi: Rahman et ai., US-patenttijulkaisu 3 993 754; Sears, US-patentti-20 julkaisu 4 145 410; Papahadjopoulos et ai., US-patenttijul-kaisu 4 235 871; Schnieder, US-patenttijulkaisu 4 114 179; Lenk et ai., US-patenttijulkaisu 4 522 803; ja Fountain et ai., US-patenttijulkaisu 4 588 578.

25 Liposomien käytössä lääkkeiden antoon on muodostunut ongelmia, jotka liittyvät sekä lääkkeen kapselointiin että lääkkeen vapautumiseen hoidon aikana. Kapseloinnissa esiintyy jatkuvaa tarvetta pidätystehojen lisäämiseksi minimoimaan potilaalle annettua lipidiannosta. Lisäksi suuret pidätyste-30 hot merkitsevät, että vain pieni määrä lääkettä menetetään kapselointiprosessin aikana, tärkeä etu, kun kyseessä ovat kalliit lääkkeet. Monien lääkkeiden on havaittu vapautuvan liposomeista nopeasti kapseloinnin jälkeen. Tällainen nopea vapautuminen vähentää liposomikapseloinnin edullisia vaiku-35 tuksia. Niinpä ammattimiehet yrittävät jatkuvasti löytää tapoja alentaa lääkkeiden vapautumisnopeutta liposomeista.

( · V, 5 95199 Näiden kapselointi- ja vapautumisongelmien lisäksi on kaikkein tärkein ongelma löytää kaupallisesti hyväksyttävä tapa lääkkeitä sisältävien liposomien toimittamiseksi kliinikolle. Vaikka liposomien tuottaminen ja antaminen "tarpeen mu-5 kaan"-periaatteella on sovellutuskelpoinen tapa kokeen asetuksessa, on se yleensä epätyydyttävä kliinisessä käytössä. Niinpä esiintyy merkittävää ja jatkuvaa tarvetta menetelmille, joissa liposomit kapseloitujen lääkkeiden kanssa tai ilman voidaan kuljettaa, varastoida ja yleensä siirtää ta-10 vanomaisten kaupallisten jakelukanavien läpi ilman olennaisia vaurioita.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö esittää kapselointitavan, joka parantaa mer-15 kittävästi sekä prostaglandiinin jakautumista ja sitä seu-raavaa pidättämistä liposomiin, ja liposomi / pidätetty prostaglandiini-valmisteen stabiilisuutta. Erityisemmin, liposomit muodostetaan ensin vesiliuoksessa, jolla on suhteellisen emäksinen pH-arvo, ja pH säädetään myöhemmin suhteel-20 lisen happamaan pH-arvoon. Liposomaalisen ulkoisen liuoksen pH-arvon happamaksi säätämisen yhteydessä prostaglandiini liittyy liposomeihin. Tällainen liittyminen voi tapahtua jakaantumisella liposomaalisiin membraaneihin ja mebraanien läpi. Tällainen tapa saa hämmästyttävällä tavalla aikaan 25 prostaglandiinien 50-100-% pidättymisen liposomeihin. Tämän pidättämisen aikaansaavaa puskurijärjestelmää kutsutaan siksi jakaantumisenparantajapuskuriksi (partition-enhancing buffer).

30 Saatujen liposomien koko pienennetään homogeeniseen kokojakaumaan. pH-säädön jälkeen saatava liuos lyofilisoidaan ja se voidaan varastoida käyttöön asti, jolloin se voidaan re-hydratoida vesiliuosta käyttäen. Tällainen menetelmä vaatii kuivumisenestoaineen lisäyksen ennen kuivausmenetelmää (lyo-35 filisointi), joka kuivumisenestoaine säilyttää liposomien hiukkaskoon uudelleen hydratoinnin jälkeen. Tällaisen kuivumisenestoaineen puuttuessa liposomikoostumusta koossapitävät voimat poistuvat vesisuspension poistamisen myötä. Tällainen 6 95199 kuivumisenestoaine voi olla sakkaridi, kuten sakkaroosi, dekstroosi, maltoosi, mannoosi, galaktoosi, raffinoosi, tre-haloosi tai laktoosi. Mannitolia voidaan käyttää minkä hyvänsä muun sakkarideista kanssa. Voidaan myös käyttää muita 5 aineita, kuten albumiinia, dekstraania tai poly(vinyylialko-holia).

Tässä keksinnössä voidaan käyttää huokeita lipidejä, ja suurella joukolla lipidivalmisteita saavutetaan helposti pidä-10 tysteho noin 50 % ja yli (edullisesti 80-100 %). Toinen tämän pH-arvolla ajetun vastaanoton ainutlaatuinen etu on, että lisääntyneestä stabiilisuudesta johtuen nopeus, jolla lääke vapautuu liposomeista, laskee verrattuna liposomeihin, joissa on passiivisesti pidätettyä (ilman pH-gradienttia) 15 prostaglandiinia. Tämä pidätetyn bioaktiivisen aineen hidastunut vapautumisnopeus johtuu valmisteissa käytettyjen vesi-liuosten pH-arvojen erosta (jakaantumisenparantajapuskuroin-tijärjestelmä). Täten jakaantumisenparantajapuskuri tai puskurointi järjestelmä auttaa prostaglandiinien pidättämisessä 20 liposomeissa.

Niinpä tämä keksintö esittää menetelmää liposomaalisen pros-taglandiinivalmisteen valmistamiseksi, joka valmiste käsittää lipidiä, prostaglandiinia, kuivumisenestoainetta ja ja-25 kaantumisenparantajapuskuria, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) lipidin etanoliliuosta sekoitetaan kuivumisenestoaineen vesiliuoksen kanssa, jolloin muodostuu liposomeja; (b) liposomien koko pienennetään; 30 (c) liposomit sekoitetaan prostaglandiinin etanoliliuoksen kanssa; ja (d) vaiheen (c) liposomit lyofilisoidaan.

Prostaglandiini on edullisesti prostaglandiini Ej. Liposo-35 meillä voi olla transmembraanista kemiallista potentiaalia, kuten konsentraatiogradientti, joka on edullisesti pH-gra-dientti. Jakaantumisenparantajapuskurijärjestelmä käsittää kaksi liuosta, joista toinen on kuivumisenestoaineen liuos.

7 - 95199 edullisesti sakkaridiliuos, ja toinen on edullisesti sit-ruunahappoliuos. Sakkaridiliuos on edullisesti dekstroosi, sakkaroosi tai maltoosi, joista mikä hyvänsä voi olla yhdistetty mannitolin kanssa. Muut kuivumisenestoaineet, joita 5 voidaan käyttää, käsittävät dekstraanin, poly(vinyylialkoho-lin) ja albumiinin. Kuivumisenestoaineliuoksen pH-arvo on edullisesti suhteellisen emäksinen, pH noin 3 - noin 11, edullisimmin pH noin 7. Kuivumisenestoaineliuosta, edullisesti sakkaridiliuosta, on läsnä noin 5 - noin 20 paino-%, 10 edullisimmin noin 10 % - noin 12 %. Sitten liposomiliuoksen koko pienennetään esimerkiksi suulakepuristuksella tai homogenisoimalla. Saatava liuos kuivataan lyofilisoimalla. Sit-ruunahappoliuoksen pH-arvo on edullisesti noin 2,5 - noin 4,5, edullisemmin pH 3,0.

15

Lipidi käsittää edullisesti fosfolipidiä, edullisemmin fos-fatidyylikoliinia, edullisimmin munafosfatidyylikoliinia. Liposomien halkaisija on edullisesti 100-500 nm, edullisimmin noin 200 nm. Prostaglandiinin pidättäminen liposomeihin 20 on noin 50-100 %, erityisemmin noin 60-100-%. Liposomaalinen valmiste voidaan antaa potilaalle laskimonsisäisenä ruiskeena. Liposomaalisten prostaglandiinien farmaseuttiset valmisteet voidaan formuloida seoksiksi farmaseuttisen väli- tai apuaineen kanssa.

25 ' Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen valmisteiden lipi- di/prostaglandiini-painosuhde on noin 150:1 - noin 1000:1, edullisemmin noin 300:1 - 800:1, edullisimmin noin 600:1.

30 Liposomit voidaan valmistaa yhdistämällä prostaglandiini lipidin kanssa transmembraanisen pH-gradientin avulla. Tämä gradientti voidaan saada muodostamalla ensin liposomeja emäksisessä vesiväliaineessa, lisäämällä prostaglandiini vesisuspensioon ja säätämällä liposomien ulkopuolinen (ve-35 si)väliaine happamaan pH-arvoon. Emäksinen ulkopuolinen väliaine voi olla sakkaridiliuos, kun säätö happamaan pH-ar-voon puolestaan voi tapahtua hapanta liuosta, kuten sit-ruunahappoliuosta, käyttäen.

8 95199 Tämän keksinnön mukaisesti liposomien koko voidaan pienentää tasaiseen kokojakaumaan suulakepuristamalla ne suodattimien läpi, joissa on suoraan läpi meneviä tai mutkaisia reittejä, tai homogenisoimalla. Tämä koonalennusvaihe suoritetaan en-5 nen prostaglandiinin lisäystä, kuivausvaihetta ja transmem-braanisen pH-gradientin muodostusta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuissa liposomeissa on 10 prostaglandiineja liittyneinä liposomien kanssa. Tällainen liittyminen käsittää prostaglandiinin pidättymisen liposo-miin ja prostaglandiinin mahdollisen liittymisen liposomin ulkopuoliseen tai sisäpuoliseen membraanipintaan.

15 Liposomit voidaan keksinnön mukaisesti muodostaa tavoilla, jotka on esitetty ionisoituville antineoplastisille aineille: Bally et ai.; PCT-patenttihakemus 86/01102, 27. helmikuuta 1986, joka liitetään tähän viitaten. Tämä tekniikka mahdollistaa liposomien lisäyksen ionisoituvilla bioaktiivi-20 silla aineilla (prostaglandiinit), jolloin liposomien mem-braanien läpi muodostuu transmembraaninen konsentraatiogra-dientti, ja lääke kulkee liposomeihin tämän gradientin avulla. Transmembraaninen konsentraatio(ioni)gradientti luodaan muodostamalla yhden tai useamman varautuneen lajin (esimer-25 kiksi Na+, Cl', K+, Li+, H+) konsentraatiogradientti liposo-• mimembraanien läpi. Nämä ionigradientit ovat edullisesti pH

(H+)-gradientteja. Nämä pH-gradientit voivat ajaa ionisoituvien bioaktiivisten aineiden (prostaglandiinit) vastaanottoa liposomimembraanien läpi.

30 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan liposomeja, jotka 1. kapseloivat ensimmäisen vesiväliaineen (suhteellisen happa man tai emäksisen) . PGE^.n tapauksessa on havaittu, että kap-selointitapa, jossa ensimmäinen vesiväliaine on suhteellisen 35 emäksinen (suhteessa toiseen vesivällaineeseen) tuottaa suurimman pidättämisen.

9 95199

Konsentraatiogradientin muodostamiseksi säädetään ensimmäinen ulkopuolinen väliaine (ulkopuolisen pH-arvon säätämisellä) tai lisätään toista ulkopuolista väliainetta (joka voi olla esimerkiksi suhteellisen emäksinen tai hapan suhteessa 5 alkuperäiseen ulkopuoliseen väliaineeseen). PGEjin pidättämisen tapauksessa on edullinen toisen ulkopuolisen väliaineen lisäys, joka väliaine on hapan suhteessa ensimmäiseen ulkopuoliseen väliaineeseen. Jos joko ensimmäinen tai toinen ulkopuolinen väliaine sisältää ionisoituvaa bioaktiivista 10 ainetta (ionisoituvaa prostaglandiinia), jakaa transmembraa-ninen pH (H+)-gradientti (sisäpuoli emäksinen suhteessa ulkopuoleen) lääkkeen liposomeihin siten, että vapaan rakkuloihin liittyneen bioaktiivisen aineen suhteet heijastavat tH+] »i«/utto"suhte:’-t:a* Liposomeihin jää ionigradientti myös 15 lisäyksen loputtua.

Transmembraanista pH-gradienttilisäysmenetelmää voidaan käyttää olennaisesti kaikilla Prostaglandiineilla, jotka esiintyvät sopivaan vesivällaineeseen liuonneina ionisoitu-20 vassa tilassa. Prostaglandiinien tapauksessa tällainen ionisoituva ryhmä voi olla rasvahappoketjun karboksyyliryhmä (katso kaava I edellä). Edullisesti prostaglandiini on myös suhteellisen lipofiilinen niin, että se jakaantuu liposomi-membraaneihin. Esimerkit joistain prostaglandiineista, joita 25 voidaan lisätä liposomeihin tällä menetelmällä ja joita sen : vuoksi voidaan käyttää tässä keksinnössä, käsittävät muiden ohella PGEjtn, PGE2:n, PGG:n ja PGF:n.

Yksinkertaisen prostaglandiinien liposomeihin lisäämisen li-30 säksi voidaan pH-gradienttilisäysmenetelmää käyttää lisäämään useita prostaglandiineja joko samanaikaisesti tai vai-, heittain.

Edullisia menetelmiä liposomien muodostamiseksi ovat mene-35 telmät, joissa muodostetaan unilamellaarisia rakkuloita, edullisimmin suuria unilamellaarisia rakkuloita.

10 95199 Tällainen edullinen keksinnön mukainen menetelmä liposomien muodostamiseksi on etanoliruiskutusmenetelmä, jonka on kuvannut Batzri et ai. (1973, Biochim. et Biophys. Acta., 298:1015), jolloin lipidi sekoitetaan ensin säilöntäaineen, 5 esimerkiksi butyloidun hydroksitolueenin (BHT) kanssa etanolissa 5 %:iin kokonaisvesitilavuudesta, ja sitten tämä liuos lisätään hitaasti ensimmäiseen vesivällaineeseen. Tämä ensimmäinen vesiväliaine voi olla vesiliuos, kuten edullisesti kuivumisenestoaineen liuos tai puskuri, kuten esimerkiksi 10 sitraatti tai fosfaatti. Tällainen puskuriliuos voi lisäksi käsittää kuivumisenestoainetta. Kuivumisenestoaine voi käsittää sakkaridia, kuten sakkaroosia, maltoosia, laktoosia tai dekstroosia, tai sakkaridien yhdistelmän, kuten joko sakkaroosin, maltoosin, laktoosin tai dekstroosin mannitolin 15 kanssa. Edullisesti käytetään maltoosia. Muut sakkaridit voivat käsittää esimerkiksi mannoosin, galaktoosin, raf-finoosin tai trehaloosin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita kuivumisenestoaineita, kuten dekstraania, albumiinia, ja poly(vinyylialkoholia). Tämän ensimmäisen vesiliuoksen 20 pH-arvo on emäksinen suhteessa toiseen vesiliuokseen ja on edullisesti pH 3,0 - noin 11,0, edullisimmin noin pH 7,0.

Tämä menetelmä muodostaa liposomeja, jotka pidättävät sakka-ridiliuoksen.

25 Saadun liposomiliuoksen liposomien koko alennetaan homo-: geeniseksi populaatioksi esimerkiksi suulakepuristuksella suodattimen läpi, edullisesti 0,2-μπι huokoskokoon, suodattimen ollessa joko suorareittinen tai mutkaisen reitin omaava. Tällainen populaatio voidaan muodostaa suulakepurista-30 maila tavoilla, jotka kuvaa: Cullis et ai.; PCT-patenttijulkaisu 86/00238, 16. tammikuuta 1986, jonka aihetta koskevat ' osat liitetään tähän viitaten. Tällaiset suulakepuristusta vat, joissa liposomit ajetaan suodattimen läpi paineella, mahdollistavat liposomien koon suhteen homogeeniset populaa-35 tiot. Suulakepuristus voidaan suorittaa yhden tai useammassa suodattimen läpi tapahtuvassa ajossa; esimerkiksi suorareit-tisen membraanisuodattimen (esimerkiksi Nucleopore-polykar- V,' • bonaattisuodatin) tai mutkaisen reitin omaavan suodattimen ,, 95199 (esimerkiksi Nucleopore membrafil-suodattimen (sekoitettuja selluloosaestereitä) , joka on kooltaan 0,2 /zm) . Kun liposo-mit ajetaan suodattimen läpi useammin kuin kerran, ajojen lukumäärän määrää haluttu liposomikoko, t.s., edullisesti 5 noin 0,20 /zm.

Tämän keksinnön mukaisesti käytettyjen suodattimien koko valitaan halutun lopullisen liposomituotteen koon mukaan. Tämän keksinnön mukaisesti ovat edullisia esimerkiksi liposo-10 mit, joiden keskimääräinen halkaisija on noin 0,20 /zm.

Edullisesti muodostetaan liposomeja, joiden koko on noin 20-500 nm, edullisemmin sellaisia, joiden halkaisijakoko on noin 300 nm - noin 500 nm, edullisesti sellaisia, joiden 15 keskimääräinen koko on 200 nm, koska tämän kokoisten lipo-somien tiedetään kulkevan keuhkojen kapillaariputkien läpi, ja pystyvän sen vuoksi kulkemaan muihin elimiin ja kudoksiin. Sen vuoksi suulakepuristusvaiheessa valitaan käytettäväksi suodatin, jonka huokoskoko on noin 0,20 /im.

20

Muita menetelmiä liposomien koon pienentämiseksi tässä edellä kuvattuun homogeeniseen kokojakaumaan ovat altistaminen ultrasonikoinnille, French Press-tekniikka, hydrodynaaminen leikkaus, homogenisointi esimerkiksi kolloidimyllyä tai Gau-25 lin-homogenisaattoria käyttäen tai muut tekniikat koon pienentämiseksi. Käytettäessä esimerkiksi Gaulin-homogenisoin-timenetelmää liposomeja, joiden koko on pienennettävä, kierrätetään jatkuvatoimisesti astiasta esimerkiksi homogeni-saattoriin virtausnopeudella 2 1/min niin, että 1-1 panosta 30 varten liposomeja kierrätetään 4 min paineella 965 bar. Voidaan käyttää lämmönvaihdinta panoksen lämpötilan pitämiseksi : alle noin 30°C:ssa.

Saadut liposomit, joiden koko on pienennetty, ovat kokonsa 35 suhteen homogeenisiä. Liposomien Gaussin jakautumalla on keskiarvo 200 nm, alueen ollessa noin 20 - noin 500 nm.

♦ 12 95199

Saatu liposomituote, jonka liposomien koko on pienennetty, voidaan steriilisuodattaa 0,2 μπι:η Millipak-suodattimen (Millipore, Inc., Bedford, MA) läpi. Saadut liposomit, joiden koko on pienennetty ja jotka on suodatettu, sekoitetaan 5 etanoliin liuotetun prostaglandiinin kanssa. Sitten prosta-glandiini/liposomituote voidaan steriilisuodattaa 0,2 μπΐ:η suodattimen läpi. Tuote voidaan myös laimentaa lisäämällä vesiliuosta. Tuote kuivataan (dehydratoidaan) ja varastoidaan käyttöön asti. Edullisissa suoritusmuodoissa tuote, 10 jonka liposomien koko on pienennetty, täytetään pieniin lää-kepulloihin, lyofilisoidaan ja varastoidaan käyttöön asti.

Lyofilisoitu tuote voidaan muodostaa uudelleen välittömästi ennen käyttöä vesiliuoksella, jonka pH-arvo on suhteellisen 15 hapan tai emäksinen ensimmäiseen vesivällaineeseen nähden. Tämä toinen vesiväliaine on edullisesti suhteellisen hapan. Tämän vesiväliaineen lisääminen muodostaa pH-gradientin.

Käytetystä liposominmuodostustavasta huolimatta transmem-20 braanisen pH-gradientin muodostamiseksi liposomilluokseen lisätään ulkopuolista väliainetta, joka käsittää vesiliuoksen, jolla on toinen pH-arvo (toinen ulkopuolinen väliaine), jolla liuoksella on suhteellisen hapan pH suhteessa ensimmäiseen ulkopuoliseen väliaineeseen. Tämän toisen vesiliuok-25 sen pH-arvo on yleensä noin 2,5 - noin 4,5, edullisesti noin : 3,0-3,5, edullisimmin noin 3,0. Liposomiliuoksen pH-arvo on ensimmäisen ulkopuolisen väliaineen säädön yhteydessä esimerkiksi tätä toista vesiliuosta lisäämällä noin 3,0 - noin 4,5, edullisesti noin 3,0. Vaihtoehtoisesti, jos ensimmäinen 30 vesiliuos olisi suhteellisen hapan, olisi toinen vesiliuos suhteellisen emäksinen.

• • · Tällainen ulkopuolisen väliaineen pH-arvon säätö jakaa bioaktiivisen aineen (prostaglandiinin) liposomimembraaneihin 35 ja membraanien väliin, lisäten prostaglandiinin liposomeihin tehokkaasti. Tämän keksinnön mukaista jakaantumisenparanta-japuskuriparia, jolla on edellä kuvatut pH-gradientit, pros- 13 95199 taglandiinin pidätysteho on noin 50-100 %, erityisemmin 60-100 %, ja edullisimmin 80-100 %.

Sitoutumatta mihinkään teoriaan uskotaan, että kuivumisenes-5 toaineen tehtävä valmisteessa on säilyttää liposomien koko ja eheys kuivausprosessin aikana ja uudelleenhydratoinnin jälkeen. Jätettäessä kuivumisenestoaine pois liposomivalmisteesta uudelleenhydratoitujen liposomien pidätysteho on alhainen (suunnilleen noin 30% ja alle), eikä liposomikoko 10 pysy lyofilisoinnin jälkeen.

Lyofilisointitapa voidaan suorittaa joko ennen tai jälkeen pH-gradientin asettamista. Se suoritetaan edullisesti ennen pH-gradientin asettamista, ja edullisimmin ensimmäinen vesi-15 väliaine on suhteellisen emäksinen ja toinen suhteellisen hapan. Tässä tapauksessa liposomi/prostaglandiinivalmisteen uudelleenhydratointi suoritetaan toista (suhteellisen hapanta) liuosta käyttäen, jolloin asetetaan konsentraatiogradi-entti, joka lisää prostaglandiinin tehokkaasti liposomeihin. 20 Jos pH-arvon säätäminen happamaksi suoritetaan ennen lyofi-lisointia, tämä toinen liuos voi sisältää myös kuivumisenes-toaineen ja säilöntäaineet, kuten BHT:n ja/tai etyleenidi-amiinitetraetikkahapon (EDTA). Tämän toisen vesi(happamaksi säätämis)liuoksen pH-arvo on noin 1,0 - noin 3,0, edullises-25 ti noin 3,0. Jos happamaksi säätäminen kuitenkin suoritetaan : seuraavaksi lyofilisoinnin jälkeen, suoritetaan uudelleen- hydratointi käyttäen vesiliuosta, jonka pH on noin 2,5 -noin 4,5, edullisesti noin 3,0, ja ilman kuivumisenestoai-netta. Tämä jäljempi menetelmä, t.s., liuoksen pH-arvon sää-30 täminen happamaksi kuivausvaiheen jälkeen, on edullinen.

• Saadut prostaglandiiniin liittyneet liposomit voidaan li- posominmuodostusmenetelmässä lyofilisoida millä hyvänsä tekniikan tasolla tunnetulla menetelmällä. Tämä kuivaustapa 35 vaatii kuivumisenestoaineen lisäämisen liposomisuspensioon. Tämä kuivumisenestoaine estää lipidien uudelleenjärjestäytymisen liposomissa niin, että koko ja sisällys säilyvät kui-. vausmenetelmän aikana ja uudelleenhydratoinnin läpi. Tällai- 14 95199 set kuivumisenestoaineet ovat laadultaan sopivasti sellaisia, että ne ovat voimakkaita vetysidosakseptoreita, ja niillä on stereokemiallisia ominaisuuksia, jotka säilyttävät liposomikaksoiskerroskomponenttien molekyylinsisäisen etäi-5 syyden. On havaittu, että eräs kuivumisenestoaineryhmä, sak-karidisokerit, ovat erityisen käyttökelpoisia liposomivalmisteisiin sisällytettyinä säilyttämään liposomihiukkaskoko uudelleen hydratoinnin jälkeen. Tämä erityinen sakkaridien ryhmä käsittää esimerkiksi dekstroosin, sakkaroosin ja mal-10 toosin, joita voidaan käyttää noin 5 - noin 20, edullisesti noin 10 paino-% vesifaasista. Muita sakkarideja, joita voidaan käyttää, ovat mannoosi-, galaktoosi-, raffinoosi-, tre-haloosi-, laktoosi- ja trioosisokerit. Mannitoli voi olla yhdistelmänä minkä hyvänsä sakkarideista kanssa, mutta yl-15 lättävällä tavalla on havaittu, ettei mannitoli yksinään käytettynä pysty säilyttämään liposomin kokoa. Mannitolia voidaan käyttää yhdessä sakkaridien kanssa noin 0-2 %:isessa konsentraatiossa, edullisesti l-%:isessa konsentraatiossa. Käytetyn sakkaridin kokonaiskonsentraatio on alueella noin 20 5 % - noin 20 %, edullisesti 10-12 %, edullisimmin noin 10 %. Valmisteisiin voidaan myös sisällyttää lisäsäilöntäai-neita, kuten BHT tai EDTA, esimerkiksi 0,02 mg ΒΗΤ/μΙ etanolia, ja esimerkiksi 0,01 % EDTA:ta 10 %:isessa dekstroosis-sa. Voidaan käyttää myös muita aineita, kuten ureaa, albu-25 miinia, dekstraania tai poly(vinyylialkoholia).

I I

Lyofilisoitua tuotetta uudelleen hydratoitaessa voidaan lisätä vesiliuosta, kuten tislattua vettä, (mikäli pH-gra-dientti asetettiin ennen lyofilisointia). Siinä tapauksessa, 30 että liposomit lyofilisoitiin alkuperäisessä ulkopuolisessa vesiliuoksessaan, uudelleen hydratointi suoritetaan toista vesiliuosta käyttäen, joka asettaa pH-gradientin, joka kuvataan tässä alla (sellainen, joka on suhteellisen hapan tai emäksinen). Edullisessa menetelmässä pH-gradientti asetetaan 35 lisäämällä valmisteeseen suhteellisen hapanta vesiliuosta, kuten edullisesti sitruunahappoliuosta. Uudelleenmuodostus tapahtuu kaikissa tapauksissa noin 20-30°C:ssa, edullisesti 15 95199 25°C:ssa, ja liuokset laimennetaan tarpeen mukaan ja käytetään.

Tässä keksinnössä käsite lipidi tässä käytettynä tarkoittaa 5 mitä hyvänsä sopivaa materiaalia, joka tuottaa vesiväliai-neen kanssa sekoitettaessa kaksoiskerroksen siten, että lipidinä teriaal in hydrofobinen osa orientoituu kaksoiskerrosta kohden kun taas hydrofiilinen osa orientoituu vesifaasia kohtaan. Lipidit käsittävät erittäin hydrofobisia yhdistei-10 tä, kuten triglyseridejä, steroleja, kuten kolesteroli ja amfipaattisia lipidejä. Tämän keksinnön mukaisten liposomi-valmisteiden valmistuksessa edulliset lipidit ovat fosfoli-pidit, kuten fosfatidyylikoliini (PC), fosfatidyylietanoli-amiini (PE), fosfatidyyliseriini (PS), fosfatidyyliglyseroli 15 (PG), fosfatidihappo (PA), fosfatidyyli-inositoli (PI), sfingomyeliini (SPM) ja vastaavat, yksinään tai yhdistelmänä. Fosfolipidit voivat olla synteettisiä tai olla peräisin luonnollisista lähteistä, kuten muna tai soija. Edullisissa suoritusmuodoissa käytetään fosfolipidi munafosfatidyyliko-20 liinia (EPC). Liposomit voivat sisältää myös muita steroidisia komponentteja, kuten koprostanolia, kolestanolia tai kolestaania ja EPC:n ja kolesterolin yhdistelmiä. Liposomit voivat sisältää myös glykolipidejä.

25 Siinä tapauksessa, että liposomit lisätään pH-gradientilla, : { jossa ensimmäinen ulkopuolinen väliaine on emäksinen, sopi vat puskureita sisältävät vesiväliaineet voivat sisältää, muttei rajoittavasti, esimerkiksi sitruunahappo-, meripihka-happo- tai maleiinihappopuskureita, jotka on säädetty pH-30 arvoon 3,0 - noin 11,0, edullisesti noin 7,0. Muissa tapauksissa, joissa ensimmäinen käytetty puskuri on emäksinen, . voidaan käyttää puskureita, kuten fosfaattipuskuria tai nat- riumkloridin 0,9-%:ista vesiliuosta pH-arvossa 7-9. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää natriumkarbonaatti- tai bikarbo-35 naattipuskuria. Tähän seokseen voidaan lisätä muita puskuroituja suolaliuoksia pH-arvossa noin 8,0. Tällaiset puskuroidut suolaliuokset käsittävät fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen "PBS", tris-(hydroksimetyyli)aminometaanihydroklo- 16 95199 ridi("tris")-puskurit ja N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'2-etaanisulfonihapon ("HEPES") ja glysiinin. Edullisimmin ensimmäinen vesiliuos on kuivumisenestoaineen liuos, t.s. sak-karidiliuos, esimerkiksi noin 5-20 % maltoosia (edullisesti 5 noin 10 % maltoosia), pH-arvossa noin 7,0. Tämä liuos käsittää myös EDTA:ta tai vastaavaa säilöntäainetta (BHT) missä hyvänsä farmaseuttisissa tuotteissa hyväksytyssä konsentraa-tiossa (edullisesti noin 0,01 % EDTArta).

10 pH-gradientin asettamiseksi lisätään toista ulkopuolista väliainetta (edullisesti lyofilisointivaiheen jälkeen) tai ensimmäistä väliainetta edullisesti happamaan pH-arvoon säädettynä. Tällaiset toiset ulkopuoliset väliaineet, jotka voivat korvata ensimmäisen ulkopuolisen väliaineen, voivat 15 käsittää puskureita, kuten esimerkiksi sitruunahappoa, maitohappoa tai fosforihappoa pH-arvossa noin 2,5-4,5, edullisimmin noin 3,0. Voidaan myös käyttää suolaliuosta (0,9-%:ista), joka on säädetty sopivaan pH-arvoon (kuten edellä) esimerkiksi 0,1 N suolahapon vesiliuoksella. Edullisimmin 20 ulkopuolisen väliaineen pH-arvo säädetään lisäämällä liposo-miliuokseen suunnilleen ekvivalentti tilavuus sitruunahappo-liuosta (pH noin 2,5 - noin 4,5, edullisesti 3,0). Kummassakin tapauksessa ulkopuolisen liposomiliuoksen lopullinen pH-arvo on noin 2,5 - noin 4,5, edullisesti 3,0-3,5, edullisim-25 min 3,0. Tämä sitruunahappoliuos sisältää myös 5-20 paino-% j kuivumisenestoainetta (sakkaridia, edullisesti maltoosia, edullisesti 10 paino-%) ja säilöntäaineita, kuten BHT:tä ja/tai EDTA:ta farmaseuttisille tuotteille hyväksyttävissä konsentraatioissa (edullisesti 0,01 % EDTA:ta/ml ja 0,02 mg 30 BHT:tä/ml lopullisessa liuoksessa).

Suhteellisen happaman ensimmäisen ulkopuolisen väliaineen tapauksessa voidaan käyttää sitruunahappofosfaattipuskuria pH-arvossa noin 5 - noin 6, tai 0,9-%risen natriumkloridin 35 vesiliuosta, jonka pH on säädetty arvoon noin 3,0 HClrllä, tai mitä hyvänsä muuta edellä mainittua hapanta liuosta. Konsentraatiogradientin asettamiseen käytetty suhteellisen • emäksinen väliaine voi tässä tapauksessa olla fosfaattipus- 17 95199 kuri pH-arvossa noin 8,0, natriumkloridin vesiliuos (0,9-%:inen), jonka pH on säädetty arvoon noin 7-10 natriumhydr-oksidilla, natriumkarbonaatilla, bikarbonaattipuskurilla tai millä hyvänsä edellä mainituista emäksisistä liuoksista.

5

Edullisimmin valmistetaan liposomeja, joissa on alunperin emäksinen väliaine, edullisesti emäksinen sakkaridiliuos pH-arvossa noin 7 - noin 8, edullisimmin noin 7,0. Konsentraa-tiogradientti asetetaan lisäämällä toista (suhteellisen ha-10 panta) puskuria, edullisesti 0,01 M sitruunahappoa, pH-ar-vossa noin 2,5-4,5, joka lisättäessä ensimmäiseen (suhteellisen emäksiseen) ulkopuoliseen väliaineeseen antaa lopullisen pH-arvon noin 3,0. Tällaiset suhteellisen emäksinen / suhteellisen hapan -liuosparit (puskuriparit) parantavat 15 prostaglandiinin jakautumista liposomeihin. Konsentraatio-gradientti voidaan asettaa joko ennen tai jälkeen lyofili-soinnin, tämä lyofilisointivaihe, kuten edellä mainittiin, suoritetaan kuitenkin edullisesti ennen valmisteen pH:n säätämistä happamaan arvoon.

20 Tämän keksinnön mukaisesti käytetyt lipidi/prostaglandiini-painosuhteet voivat olla niin suuria kuin noin 1000:1. Edullisesti ne ovat alueella noin 1000:1 - noin 150:1, edullisemmin noin 900:1 - 200:1; edullisimmin noin 600:1. Lipi-25 di/lääke-painosuhteet noin 150:1 ja yli tuottavat PGE,-pidät-;: tymisen yli 60 %, ja voivat tuottaa pidättymisen 80-100 %.

Tämän keksinnön mukaisten liposomien lyofiliscinti voidaan suorittaa millä hyvänsä tekniikan tasolla liposomien lyofi-30 lisointiin tunnetulla menetelmällä.

Keksinnön mukaisesti liposomit lyofilisoidaan edullisesti pipetoimalla tasaerät veteen suspendoituja liposomeja seeru-mipulloihin (katso lyofilisointiesimerkki), joihin on varus-35 tettu lyofilisointitulpat, ja ne pannaan lyofilisaattoriin. Pulloja pidetään noin 1 min - noin 24 h, edullisesti noin 1 h 0 - 50°C:ssa, edullisesti noin 10°C:ssa. Siteen hyllyn lämpötila lasketaan noin -12 - noin -80°C:een, edullisesti 18 95199 -40°C:een nopeudella noin 20 - 0,005°C/min, edullisesti noin l°C/min. Pulloja pidetään tässä lämpötilassa noin 0,1 h -noin 120 h, edullisesti 3 h. Noin 0,2 h - noin 72 h, edullisesti noin 0,6 h kohdalla lisätään noin 0,0 - noin 13,3 5 kN/m2, edullisesti 0,66 N/m2. Sitten hyllyn lämpötila nostetaan noin -40 - 0°C:een, edullisesti noin -25°C:een, nopeudella noin 20°C - noin 0,005°C/h, edullisesti noin 10°C/h.

Pulloja pidetään yllä olevassa lämpötilassa (edullisesti 10 noin -25°C:ssa) noin 0,1 - noin 120 h, edullisesti noin 12 h, minkä jälkeen hyllyn lämpötila nostetaan noin -20 - noin 0°C:een, edullisesti noin -l0°C:een, nopeudella noin 20 -noin 0,005°C/h, edullisesti noin 10°C/h, ja pidetään noin noin 0,1 - noin 120 h, edullisesti noin 8 h. Sitten hyllyn 15 lämpötila nostetaan noin 2 - noin 40°C:een, edullisesti noin 10°C:een, nopeudella noin 20 - noin 0,005°C/h, edullisesti noin 10°C/h, ja pidetään noin 0,1 - noin 120 h, edullisesti noin 8 h. Sitten hyllyn lämpötila nostetaan noin 20 - noin 80°C:een, edullisesti noin 40°C:een, ja pidetään noin 0,1 -20 noin 120 h, edullisesti noin 16 h. Lopulta hyllyn lämpötila lasketaan noin 5 - noin 30°C:een, edullisesti noin 20°C:een, nopeudella 20 - noin 0,005°C/h., edullisesti noin 10°C/h, ja tätä lämpötilaa pidetään tulppien asettamiseen asti. Sitten pullot typetetään ja varustetaan tulpilla.

25

Lyofilisointitekniikasta riippumatta menetelmä alentaa näytteen vesipitoisuuden alle noin 2 %:n, edullisesti alle noin 1 %:n. Nykyisiä menetelmiä käyttäen liposomaalinen prosta-glandiinivalmiste lyofilisoidaan pisteeseen, jossa se sisäl-30 tää 0-2 % vettä, ja edullisesti 0-1 % vettä.

Lyofilisoidut prostaglandiini/liposomivalmisteet voivat olla stabiileja ainakin yhden vuoden varastoitaessa 6°C:ssa tai 25°C:ssa. Stabiilisuustutkimukset suoritettiin esimerkin 14 35 menetelmien mukaisesti, ja niissä käytetään valmisteen HPLC (high pressure liquid chromatography)-analyysiä. Yhden vuoden säilytyksen jälkeen 6°C:ssa ei läsnä ollut PGEi:n hajoamistuotteita.

95199

Lyofilisoituja liposomeja käytettäessä uudelleenhydratointi suoritetaan lisäämällä liposomeihin vesiliuosta, esimerkiksi tislattua vettä, ruiskeeseen tarkoitettua vettä (WFI) tai puskuria tai vesiliuosta, jolla on sopiva pH, kuten edellä 5 kuvattiin, ja antamalla niiden olla rauhassa uudelleenhydra-toimiseksi. Liposomit voidaan suspendoida uudelleen vesi-liuokseen sekoittamalla liuosta varovasti. Uudelleenhydratointi voidaan suorittaa noin 25°C:ssa. Jos prostaglandiini lisättäisiin liposomeihin ennen dehydratointia, eikä halut-10 taisi muita koostumuksen muutoksia, uudelleenhydratoituja liposomeja voitaisiin käyttää suoraan hoitoon liposomiin kapseloitujen lääkkeiden antoon tunnetuilla tavoilla.

Liposomien valmistuksen aikana lisätään etanolia lipidien 15 suspendoimiseksi. Voidaan myös käyttää etanolin seoksia, kuten heksaani:etanolia (95:5). Heksaani:etanolia (95:5) käytetään edullisesti lipidien suspendoimista aloitettaessa, ja etanolia käytetään edullisesti lipidien ja prostaglandiinin yhdessä tapahtuvan sekoituksen aikana. Liuottimet vali-20 taan niiden bioyhteensopivuutensa, alhaisen toksisuutensa ja liuotuskykyjensä perusteella.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatuja liposomeja voidaan käyttää terapeuttisesti nisäkkäillä, käsittäen ihmi-25 sen, tulehdusten hoitoon tai hoidettaessa tiloja, jotka vaa-: tivat lääkkeen pitkitettyä vapauttamista bioaktiivisessa muodossaan. Tällaisiin tiloihin kuuluvat muttei rajoittavasti tautitilat, kuten sellaiset, joita voidaan hoitaa Prostaglandiineilla .

30

Valmisteen antotapa saattaa määrätä organismin kohdat ja so-·· lut, johon yhdiste annetaan. Tämän keksinnön mukaisesti val mistetut valmisteet voidaan antaa yksinään, mutta yleensä ne annetaan seoksena farmaseuttisen väliaineen kanssa, joka on 35 valittu aiotun antoreitin ja vakio farmaseuttisen käytännön mukaisesti. Valmisteet voidaan antaa parenteraalisena ruiskeena, esimerkiksi valtimonsisäisesti tai laskimonsisäisesti. Valmisteet voidaan antaa myös oraalisesti, ihonalaisesti 20 95199 tai lihaksensisäisesti. Niitä voidaan käyttää parenteraali-seen antoon esimerkiksi steriilinä vesiliuoksena, joka voi sisältää muita liuenneita aineita, esimerkiksi tarpeeksi suoloja tai glukoosia liuoksen tekemiseksi isotoniseksi.

5 Prostaglandiini Ej-liposomit voidaan esimerkiksi antaa paren-teraalisesti annostelulla 5,0 ng/kg kehonpainoa/min, 2 h aikana, kerran tai kahdesti päivässä. Ammattimiehet saattavat nähdä mielessään muita käyttökohteita, jotka riippuvat valmisteen erityisistä ominaisuuksista.

10

Oraaliseen antoon tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja prostaglandiini/liposomivalmisteita voidaan käyttää tablettien, kapseleiden, pastillien, jauheiden, siirappien, eliksiirien, vesiliuosten ja -suspensioiden ja vastaavien muo-15 dossa. Tablettien tapauksessa väliaineet, joita voidaan käyttää, käsittävät laktoosin, natriumsitraatin ja fosfori-hapon suolat. Tableteissa käytetään yleisesti erilaisia hajoamista edistäviä aineita (disintegrant), kuten tärkkelys, ja voiteluaineita, kuten magnesiumstearaatti. Kapselimuodos-20 sa annettavaksi käyttökelpoisia laimennusaineita ovat laktoosi ja suurimolekyylipainoiset polyetyleeniglykolit. Vaadittaessa oraaliseen käyttöön tarkoitettuja vesisuspensioita voidaan käyttää määrättyjä makeutus- ja/tai makuaineita.

25 Annettaessa ihmisille hoitotarkoituksiin prostaglandiinihoi-toon vastaaviin tautitiloihin määrittää viimekädessä lääkettä määräävä lääkäri ihmispotilaalle annettavan annostelun, ja tämän voidaan katsoa vaihtelevan yksilön iän, painon ja vasteen mukaan kuten myöskin potilaan sairauden luonteen ja 30 vakavuuden mukaan. Lääkkeen annos liposomaalisessa muodossa on yleensä suunnilleen sama kuin vapaata lääkettä käytettä-:* essä. Joissain tapauksissa voi kuitenkin olla välttämätöntä käyttää annoksia, jotka ovat näiden rajojen ulkopuolella.

35 Seuraavat esimerkit esitetään ainoastaan kuvausmielessä, eikä niitä ole katsottava keksinnön suoja-alaa rajoittaviksi.

2i 95199

Lyof ilisoint ies imerkki

Halkiopäätyisillä butyylikumitulpilla varustetut meripihkan-väriset lyofilisointiputket, jotka olivat kapasiteetiltaan ’ 5,0 ml, täytettiin 1,0 ml:11a vesiliuokseen suspendoituja 5 liposomeja, jotka sisälsivät pidätettyä PGE^tä. Nämä pullot asetettiin ruostumattomasta teräksestä valmistetuille hyllyille lyofilisaattoriin (PV-24 Stokes Lyophilizer), joka oli varustettu Honeywell DCP7700 Digital Control Programmer-ohjaustietokoneella. Pulloja pidettiin 1 h 10°C:ssa. Sitten 10 hyllyn lämpötila laskettiin -40°C:een nopeudella l°C/min. Pulloja pidettiin 3 h -40°C:ssa tyhjiössä alle 0,66 N/m2, joka asetettiin kohdalla 0,6 h sen jälkeen, kun lämpötila -40°C oli saavutettu. Sitten hyllyn lämpötila nostettiin -25°C:een nopeudella 10°C/h tyhjiössä alle 0,66 N/m2.

15

Pulloja pidettiin 12 h -25°C:ssa alle 0,66 N/m2:ssä. Sitten hyllylämpötila nostettiin -10°C:een nopeudella 10°C/h, ja pidettiin 8 h. Sitten hyllylämpötila nostettiin +10°C:een nopeudella 10°C/h ja pidettiin 8 h. Sitten hyllylämpötila 20 nostettiin 40°C:een ja pidettiin 16 h alle 0,66 N/m2:ssä. Lopuksi hyllylämpötila laskettiin 20°C:een alle 0,66 N/m2:ssä nopeudella 10°C/h ja pidettiin tässä lämpötilassa tulpilla sulkemiseen asti. Putket huuhdeltiin takaisin ty-pellä ja suljettiin.

25 : Esimerkki 1

Munafosfatidyylikoliinin (41 ml) 108 mg/ml:n liuosta heksaa-ni:etanolissa (95:5), (yhteensä 4,428 mg EPC:tä) mitattiin kapasiteetiltaan 500 ml:n pyöreäpohjaiseen kolviin, ja hek-30 saani:etanoli poistettiin pyöröhaihduttimella vesihauteella, joka oli asetettu 37°C:een. Kolviin lisättiin etanolia (2,0 . ;· ml), joka sisälsi 30 mg BHT, ja kuiva lipidikalvo suspendoi- tiin. Lisättiin vielä 1,0 ml etanolia EPC:n täysin suspen-doimiseksi.

Valmistettiin 1 1 10-%:ista maltoosiliuosta, ja pH säädettiin arvoon 7,4 1,0 N natriumhydroksidilla. Liuos sterili- 35 22 95199 soitiin ajamalla se 0,22 μιη:η Millipak 40 -suodattimen läpi, joka oli esikasteltu steriilillä vedellä.

EPC/BHT/etanoliliuos lisättiin tipoittain 1,0 ml:n ruiskul-5 la, joka oli varustettu 21-numeroisella mittaneulalla, nopeudella noin 1,0 ml/min, sekoitettuun liuokseen, jossa oli noin 800 ml 10-%:ista maltoosia, 2000 ml:n astiaan. Tämä toistettiin EPC/BHT/etanolikokonaismäärällä, noin 8,0 ml.

Kun kaikki lipidi oli lisätty, pyöreäpohjainen kolvi huuh-10 deltiin 2:11a peräkkäisellä noin 3,0 ml:n maltoosiliuoseräl-lä, ja lisättiin maltoosiastiaan. Liuos täytettiin 1000 ml:aan lisäämällä 10-%:ista maltoosiliuosta.

Esimerkki 2 15 Esimerkin 1 menetelmällä valmistetut liposomit homogenisoitiin Gaulin Model 30 CD -homogenisaattorilla. Liposomit lisättiin 5 l:n umpinaiseen astiaan, johon oli kiinnitetty putki Gaulin-homogenisaattoriin ja 316 l:n ruostumattomasta teräksestä valmistettuun hygieeniseen lämmönvaihtimeen, joka 20 oli kiinnitetty Gaulin-homogenisaattorin alavirtapäähän, liposomiliuoksen lämpötilan pitämiseksi alle 30°C:ssa. 5 l:n astiaan kiinnitettiin typpilähde (1,4 bar) liposomien syöttämiseksi paineella Gaulin-homigenisaattoriin. Liposomi-liuosta kierrätettiin Gaulin-homogenisaattorin läpi paineel-25 la 965 bar noin 4 min virtausnopeudella noin 1,9 1/min. Li-: posomien keskihalkaisija homogenisoinnin jälkeen oli noin 150-200 nm kokojakauma-alueen ollessa noin 20-500 nm, mitattuna kvasielastisella valonhajonnalla Nicomp Particle Sizer -laitetta (Nicomp Instruments, Inc., Goleta, CA) käyttäen.

30

Esimerkki 3 *:· Esimerkin 2 tavalla homogenisoituja liposomeja (700 ml) suo datettiin 0,2 μπΐ:η Millipak-suodattimen läpi, ja sekoitettiin 1500 ml:n astiassa sekoituslevyllä. Lisättiin tipoit-35 tain prostaglandiini E,:n (3,85 mg PGE, 1,4 ml:ssa etanolia) etanolista liuosta 5,0 ml:n pipetistä. PGE,:n lisäyksen jälkeen suspension steriilisuodatettiin 0,2 μιη:η Millipak-suodattimen läpi, ja täytettiin 1,0 ml:n erät seerumipulloihin.

23 95199 Täytetyt pullot lyofilisoitiin lyofilisointiesimerkin menetelmällä.

Esimerkki 4 5 Esimerkin 3 PGE^liposomipullo muodostettiin uudelleen käyttämällä 1,0 ml steriiliä sitruunahappoa, pH 3,0 ja pulloa ravisteltiin käsin täysin uudelleen suspendoimiseksi.

Esimerkki 5 10 Esimerkin 3 lyofilisoituja liposomeja sisältävä pullo sus-pendoitiin uudelleen 1,0 ml:aan liikkuvafaasi HPLC-standar-diin (60 % vettä, pH 2,2, 40 % HPLC-laatuista asetonitrii-liä, joka sisälsi β-naftolia konsentraatiossa 50 μg/ml) .

Näyte suodatettiin Millipore HV4 0,45 /un:n suodatinruisku-15 kärkisuodattimen läpi kapasiteetiltaan 2,0 ml:n HPLC-pul-loon. Näyte ajettiin Rainin HPLC:llä käyttäen 50 μ1:η ylikuormitusta 20 μ1:η lisäyssilmukkaan virtausnopeudella 1,25 ml/min 15 cm:n käänteisfaasikolonniin (Rainin C-18-kolonni), joka oli kytketty Gilson 116 -detektoriin, joka oli asetettu 20 205 nm:lle. Kromatografiakolonnia ajettiin 13 min. Identifi oitiin PGEt:tä ja β-naftolia vastaavat huiput.

Näytepullon PGE,-konsentraatio laskettiin huipun alan standardi lineaarisella regressioanalyysillä ja verrattiin PGEj:n 25 HPLC-standardikäyrään. Kullekin testatulle näytteelle ajet-: tiin 3 pulloa ja laskettiin keskimääräinen konsentraatio.

• · * ·

Claims (15)

95199

1. Menetelmä liposomaalisen prostaglandiinivalmisteen valmistamiseksi, joka valmiste käsittää lipidiä, prostaglan-diinia, kuivumisenestoainetta ja jakaantumisenparantajapus- 5 kuria, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) lipidin etanoliliuosta sekoitetaan kuivumisenestoaineen vesiliuoksen kanssa, jolloin muodostuu liposomeja; (b) liposomien koko pienennetään; (c) liposomit sekoitetaan prostaglandiinin etanoliliuoksen 10 kanssa; ja (d) vaiheen (c) liposomit lyofilisoidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää seuraavan vaiheen: 15 (e) liposomit muodostetaan uudelleen suhteellisen happamalla liuoksella.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapan liuos on sitruunahapon vesiliuos. 20

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prostaglandiini on prostaglandiini El.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että lipidi käsittää munafosfatidyyli-koliinia.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel-30 mä, tunnettu siitä, että kuivumisenestoaine käsittää sakka- ridia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaridi on dekstroosi, sakkaroosi tai maltoosi. 35

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaridi on maltoosi. 25 9 5 1 99

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidi käsittää munafosfatidyylikoliinia ja kuivumisenestoaine käsittää maltoosia.

10. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että kuivumisenestoaineen vesiliuos vaiheessa (a) on suhteellisen emäksinen vesiliuos.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siilo tä, että vaiheen (a) liposomien koko pienennetään homogenisoimalla.

12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaridi on sakkaridiliuoksen muodossa, joka si- 15 sältää noin 5-20 % (paino/tilavuus) sakkaridia.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaridiliuos sisältää noin 10 % (paino/tilavuus) sakkaridia. 20

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liposomien keskihalkaisija on noin 100-200 nm.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-25 tä, että lipidi/prostaglandiini-painosuhde on noin 300:1 - : 1000:1. « 26 95199