FI90073B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara pseudoprimyciner - Google Patents

Description

1 90073

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten pseudoprimysii-nien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisten kaavan 1 mukaisten pseudoprimysiinien ja niiden seoksen sekä niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi,

0 ,0H OH OH CH

NHj H

^*9 1¾ wwohoh jossa kaavassa R1 on butyyli, pentyyli tai heksyyli, R2 on 15 vety, hydroksyyli tai O-arabinoosi ja X on epäorgaanisen hapon ioni, edullisesti sulfaatti, tai orgaanisen hapon ioni, edullisesti asetaatti.

Primysiini on makrolidiantibiootti (Nature, 174, 1105/1954), jolla on antibakteerinen aktiivisuus ja se on 20 aktiivinen aineosa kaupallisesti saatavassa EBRIMYCINr- geelissä. Sillä on erinomainen antibakteerinen aktiivisuus eikä sitä vastaan ole vielä kehittynyt resistenssiä. Näiden edullisten ominaisuuksien perusteella sitä käytetään laajalti, mutta nykyään se formuloidaan vain alkoholigee-25 liksi ja sitä käytetään pintakäsittelyissä.

Muiden farmaseuttisten formulaatioiden kehitys on hyvin rajoitettua, koska primysiini on liukenematon tai vain vaikeasti liukoinen veteen ja erilaisiin orgaanisiin liuottimiin.

30 Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada mene telmä, jolla primysiinin liukoisuutta ja siten käyttökelpoisuutta voidaan parantaa.

On todettu yllättävästi, että käsittelemällä primy-siiniä erilaisilla emäksisillä aineilla, nukleofHiisillä 35 aineilla ja/tai metalliyhdisteillä, se voidaan muuttaa uuteen muotoon (uudeksi yhdisteeksi), joka on hyvin liu- 2 90073 koinen veteen ja/tai orgaanisiin liuottimiin ja lisäksi sillä on erinomaiset geeliytymisominaisuudet. Reaktio, joka tapahtuu, on C35-C37-translaktonisaatio, so. primysii-nirengas, jossa on alunperin 35 hiiliatomia, muuttuu ren-5 kaaksi, jossa on 37 hiiliatomia. Tällä reaktiolla aikaansaatua primysiiniä kutsutaan pseudoprimysiiniksi.

Samoin kuin lähtöaineena käytetty primysiini, pseu-doprimysiinikin on kompleksi, so. sekin sisältää eri komponentteja, jotka voidaan erottaa käyttäen menetelmiä, 10 joita käytetään primysiinin erottamiseen (katso HU-patent-ti n:o 196 425).

Vaihtoehtoisesti pseudoprimysiinin komponentit voidaan valmistaa myös primysiinin yksittäisten eristettyjen komponenttien translaktonisaatioreaktiolla. Kaikki tähän 15 asti tunnetut primysiinikomponentit reagoivat samalla tavalla.

Pseudoprimysiinillä sekä sen komponenteilla on an-tibakteerinen aktiivisuus ja niitä voidaan käyttää valmistettaessa farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät 20 suuremman annoksen aktiivista aineosaa. Niiden uuden ra kenteen vuoksi niitä vastaan ei ole vielä kehittynyt resistenssiä.

Kaavan I mukaiset pseudoprimysiinit, niiden seos ja happoadditiosuolat valmistetaan keksinnön mukaan siten, 25 että a) kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien seoksen valmistamiseksi, kaavan II mukaisten primysiinien seos,

0 .OH OH

mu u 1^19¾ 9H ?H |o»3 x sr

NH2 X CHqCHq OH OH OH OH

CH3 λ j 35 jossa R1, R2 ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan varauksellisen emäksisen aineen kanssa tai va- 3 90073 rauksettoman yhdisteen kanssa C35-C37-translaktonisaatio-reaktion suorittamiseksi, jolloin varauksellisina aineina käytetään joko ioneiksi hajoneita suoloja, joiden anionit voivat olla orgaanisia, esim. alkoholaatti, edullisesti 5 metylaatti, etylaatti, fenolaatti; karboksylaatti, edullisesti formiaatti, asetaatti, klooriasetaatti, sukkinaatti; tai epäorgaanisia, esim. karbonaatti, vetykarbonaatti, sulfiitti, sulfidi, fosfaatti, divetyfosfaatti, nitraatti, nitriitti, syanidi, kloridi, bromidi, fluoridi, ja joiden 10 kationit voivat olla alkalimetalleja, edullisesti natrium, kalium, tai maa-alkalimetalleja, edullisesti magnesium, tai siirtymämetalleja, edullisesti rauta; tai kvaternääri-siä ammoniumsuoloja, edullisesti tetrabutyyliammoniumbro-mldia, tai nukleofiilisia aineita, edullisesti ioninvaih-15 tohartseja, ja jolloin varaukseton aine on metallioksidi, metallihydroksidi, edullisesti natriumhydroksidi, barium-hydroksidi, orgaaninen emäs, edullisesti dietyyliamiini, typpi- tai happipitoinen heterosyklinen yhdiste, edullisesti pyridiini, tai 20 b) kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien valmista miseksi, mainittu translaktonisaatio suoritetaan käyttämällä kaavan II mukaista primysiiniä, tai c) kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien valmistamiseksi, kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien seokselle 25 suoritetaan kromatografinen erotus.

Menetelmässä voidaan käyttää lähtöaineena mitä tahansa primysiinisuolaa, edullinen yhdiste on kuitenkin primysiinisulfaatti, joka on valmistettu fermentaatiolla, tai primysiiniasetaatti, joka on saatu sulfaatista. Primy-30 siiniasetaatin ja muiden primysiinisuolojen kuin sulfaa tin valmistus on kuvattu HU-patentissa n:o 196 822.

Translaktonisaatio on tasapainoreaktio, jossa yleensä saadaan tuotteiden seos suhteessa 1:1 ja se toteutetaan käyttäen joko aineita, joilla on varaus, tai va-35 rauksettomilla yhdisteillä.

4 'O .'73

Varaukselliset aineet ovat pääasiassa ioneiksi hajonneita suoloja, joiden anionit voivat olla orgaanisia, esim. alkoholaatti, edullisesti metylaatti, etylaatti tai fenolaatti, tai karboksylaatti, edullisesti asetaatti, 5 formiaatti, klooriasetaatti, sukkinaatti tai bentsoaatti, tai anionit voivat olla epäorgaanisia, esim. karbonaatti, vetykarbonaatti, sulfaatti, sulfidi, fosfaatti, divetyfos-faatti, nitraatti, nitriitti, syanidi, kloridi, bromidi, fluoridi. Kationit voivat olla alkalimetalleja, edullises-10 ti natrium, kalium, tai maaalkalimetalleja, esim. magnesium, tai siirtymämetalleja, edullisesti rauta.

Lisäksi seuraavia aineita voidaan myös käyttää va-rauksellisina aineina: kvaternäärisiä ammoniumsuoloja, edullisesti tetrabutyyliammoniumbromidia, tai nukleofiili-15 siä aineita, edullisesti ioninvaihtohartseja, esim. Amber-lite IRA 401.

Translaktonisaatioreaktiossa käytetty varaukseton yhdiste voidaan valita metallioksideista ja -hydroksideista, joista edullisia ovat natriumhydroksidi, bariumhydrok-20 sidi ja magnesiumhydroksidi, sekä orgaanisista emäksistä, joista edullisia ovat dietyyliamiini, trietyyliamiini, aniliini, sekä typpeä tai happea sisältävistä heterosyk-lisistä yhdisteistä, joista edullisia ovat pyridiini, ki-noliini, piperatsiini, imidatsoli ja dioksaani.

25 Translaktonisaatioreaktio toteutetaan vesipitoises sa ja/tai orgaanisessa liuotinväliaineessa. Orgaanisina liuottimina käytetään proottisia liuottimia, esim. ali-faattisia alkoholeja, joissa on 1 - 4 hiiliatomia, edullisesti metyylialkoholia, etyylialkoholia, n-butanolia, 30 halogenoituja hiilivetyjä, edullisesti kloroformia, tai aproottisia liuottimia, esim. eetteriä, tai orgaanisia emäksiä, esim. dietyyliamiinia, pyridiiniä, asetonitrii-liä tai dimetyyliformamidia. Edullisia yhdisteitä ovat 1-4 hiiliatomia sisältävät alifaattiset alkoholit yksin 35 tai vesiseoksina.

Reaktio voidaan toteuttaa huoneen lämpötilassa (20-22 eC:ssa), mutta voidaan käyttää myös korotettua 5 ^ 0 0 73 lämpötilaa, esim. palautusjäähdytyslämpötilaa, suuremman reaktionopeuden saavuttamiseksi.

Tämän keksinnön edullisen toteutusmuodon mukaisesti lähtöaineena käytettävä primysiinisuola muutetaan halut-5 taessa asetaatiksi, sen jälkeen pseudoprimysiiniasetaatti valmistetaan edellä kuvatun translaktonisaatioreaktion mukaisesti, reagoimaton primysiiniasetaatti erotetaan pseu-doprimysiiniasetaatista käsittelemällä seosta sopivalla orgaanisella aineella, edullisesti etyyliformiaatilla. 10 Saostunut primysiiniasetaatti suodatetaan pois ja pseudo-primysiini eristetään suodoksesta asetaattina tai haluttaessa vastaavan hapon lisäyksen jälkeen muina suoloina, esim. sulfaattina. Eristäminen toteutetaan edullisesti eetterillä ja/tai vedellä tai asetonitriilillä, minkä jäl-15 keen saatu tuote suodatetaan ja kuivataan.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän vaihtoehdossa b) primysiinikompleksin erotettuja yksittäisiä komponentteja käytetään translaktonisaatiossa, ja siten aikaansaadaan pseudoprimysiinin vastaavat komponentit. Reaktio to-20 teutetaan kuten edellä on kuvattu vaihtoehdon a) osalta.

Tämän menetelmän vaihtoehdon c) mukaisesti pseudoprimysiinin komponentit saadaan vaihtoehdossa a) saadun pseudoprimysiinikompleksin kromatografisella erotuksella. Erottaminen voidaan toteuttaa pylväs- tai ohutkerroskroma-25 tografiällä. Koska pseudoprimysiinin liukoisuus on parempi kuin primysiinin, kromatografinen erotus voidaan yleensä toteuttaa helposti yksinkertaisella pylväskromatografiällä.

Tämän keksinnön mukaisesti pylväskromatografinen 30 erotus toteutetaan edullisesti käyttäen kolonnin täytteenä silikageeliä (esim. Kieselgel 60) suspendoituna käytettävään eluenttiin. Erotettava primysiinisuola viedään myös kolonniin liuotettuna käytettävään eluenttiin. Kehitykseen käytettävä eluentti voi olla veden ja yhden tai 35 useamman erilaisen orgaanisen liuottimen seos. On todettu, että orgaanisen hapon läsnäolo eluentissa parantaa 6 ) O 0 7 3 erotuksen tehokkuutta. Orgaanisina liuottimina käytetään edullisesti alkoholia (alkoholeja), esim. metanolia, etanolia, butanolia, tai halogenoituja liuottimia, esim. kloroformia, dikloorimetaania jne., ja orgaanisina happoina 5 edullisesti etikkahappoa. Edullinen liuotinsysteemi on alempi faasi seoksesta kloroformi:metanoli:etikkahappo:vesi, 9:6:3:4 stabiloituna 1 tilavuus-%:11a metanolia.

Kehityksen aikana otetaan talteen fraktiot, jotka sisältävät identtisiä aineita (testataan ohutkerroskroma-10 tografialla, TLC), ja haihduttamisen jälkeen saadaan neljä komponenttia. TLC-kokeet toteutetaan silikageelillä, edullisesti levyillä Kieselgel 60 F254 (Merck) tai HPTLC HP-KF (Whatmann) käyttäen 10 μ1:η näytteitä. Eluenttina on kloroformin, metanolin, muurahaishapon, veden, formaldehydin 15 ja n-butanolin seos (160:53:6:9:3), ja kehitykseen käytetään klooritoluidiinia tai etanolia, joka sisältää 1 % fosforomolybdeenihappoa.

Pseudoprimysiinin kromatografisella erotuksella aikaansaadaan komponentit, jotka ovat samanlaisia kuin 20 primysiinin komponentit, so. Ax, A2, A3, Ba, B2, B3, Cx, C2, C3. Kaavan (I) mukaisen pseudoprimysiinikompleksin komponentit ovat seuraavat: pseudoprimysiini-A1, jossa R1 on butyyli, R2 on 0-arabi noo-si ja X on edellä mainittu; 25 pseudoprimysiini-A2, jossa R1 on pentyyli, R2 on 0-arabi- noosi ja X on edellä mainittu; pseudoprimysiini-A3, jossa R1 on heksyyli, R2 on 0-arabi-noosi ja X on edellä mainittu; pseudoprimysiini-Bx, jossa R1 on butyyli, R2 on vety, X on 30 edellä mainittu; pseudoprimysiini-B2, jossa R1 on pentyyli, R2 on vety, X on edellä mainittu; pseudoprimysiini-B3, jossa R1 on heksyyli, R2 on vety, X on edellä mainittu; 35 pseudoprimysiini-Ci, jossa R1 on butyyli, R2 on hydroksyy-li, X on edellä mainittu; 7 9 O O 7 3 pseudoprimysiini-C2, jossa R1 on pentyyli, R2 on hydroksyy-li, X on edellä mainittu; pseudoprimysiini-C3, jossa R1 on heksyyli, R2 on hydroksyy-11, X on edellä mainittu, 5 sekä niiden happoadditiosuolat.

Pseudoprimysiinin komponenteille ominaiset Rf-arvot ovat seuraavat:

Ai Rf = 0,30 B2 Rf = 0,55 Cx Rf = 0,36 10 A2 Rf = 0,32 B2 Rf = 0,57 C2 Rf = 0,38 A3 Rf = 0,34 B3 Rf = 0,59 C3 Rf = 0,40 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetun pseudoprimy-siinikompleksin tai sen komponenttien liukoisuus on paljon 15 parempi kuin lähtöaineena käytetyn primysiinikompleksin ja/tai sen komponenttien liukoisuus. Esimerkiksi primysii-niasetaatti on käytännöllisesti katsoen liukenematon veteen, etanoliin ja metanoliin, kun taas pseudoprimysiini-asetaatin liukoisuus veteen on 5 g/10 ml, etanoliin 20 5 g/10 ml ja metanoliin 10 g/10 ml, mikä tarkoittaa mer kittävää parannusta liukoisuudessa.

Liukoisuuden parannus yksittäisillä pseudoprimysiinin komponenteilla on sama kuin edellä mainitun pseudopri-mysiinikompleksin kohdalla, so. esim. pseudoprimysiini-25 Aj-asetaatin liukoisuus veteen ja etanoliin on 5 g/10 ml ja metanoliin 10 g/10 ml. Siten tämä pseudoprimysiinikomp-leksi ja/tai sen komponentit ovat sopivia farmaseuttisten formulaatioiden valmistukseen, jotka formulaatiot sisältävät suuremman annoksen aktiivista aineosaa.

30 Eräs toinen edullinen pseudoprimysiinin ja sen kom ponenttien ominaisuus on erinomainen geeliytymiskapasi-teetti: vesipitoisessa väliaineessa geelin muodostuminen alkaa välittömästi liukoisuusrajalla ja orgaanisessa liuo-tinväliaineessa stabiili geeli muodostuu useiden tuntien 35 seisottamisen jälkeen.

8 90073

Mainittua geeliytymiskapasiteettia voidaan käyttää edullisesti hyväksi valmistettaessa tiettyjä farmaseuttisia formulaatioita, esim. geelejä, voiteita, jne.

Pseudoprimysiinin ja/tai sen komponenttien suolat 5 voidaan muuttaa haluttaessa vapaiksi yhdisteiksi ja/tai ne voidaan muuttaa toiseksi suolaksi.

Samalla tavoin kuin alkuperäisellä primysiinikomp-leksilla ja/tai sen komponenteilla, pseudoprimysiinikomp-leksilla ja/tai sen komponenteilla on myös antibioottinen 10 aktiivisuus ennen kaikkea gram-positiivisia bakteereita vastaan, mutta suurempina annoksina ne ovat tehokkaita myös gram-negatiivisia bakteereita vastaan.

Taulukko 1

Pseudoprimysiinikompleksin ja sen komponenttien 15 aktiivisuusspektri polyresistenttejä ihmisen patogeenisiä mikrobikantoja vastaan.

Tutkitut kannat: 1. ) Bacillus subtilis 2. ) Bacillus cereus 20 3.) Bacillus licheniformis 4. ) Staphylococcus aureus 5. ) Staphylococcus epidermis 6. ) Micrococcus-kannat 7. ) Sporosarcina ureae 25 Tutkitut yhdisteet: I. ) Pseudoprimysiiniasetaatti II. ) Pseudoprimysiini-A^-asetaatti III. ) Pseudoprimysiini-A^-asetaatti IV. ) Pseudoprimysiini-B^-asetaatti 30 V.) Pseudoprimysiini-Bg-asetaatti VI.) Pseudoprimysiini-C^-asetaatti 9 9 O G 7 3 MIC-arvot (pg/ml)

Tutkitut kannat Tutkitut yhdisteet

I II III IV V VI

1. 2,5-5 5-10 2,5 2,5 2,5 2,5 5 2. 2,5-5 5-10 2,5 2,5 2,5 2,5 3. 2,5-5 5-10 2,5 2,5 2,5 2,5 4. 2,5-5 5-10 555 2,5 5. 2,5-5 5-10 5 5 5 2,5 6. 0,75 2,5 2,5 2,5 1 1-2,5 10 7. 0,5 1 0,5 2,5 0,75 0,5 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetun pseudoprimy-siinikompleksin ja sen komponenttien toksisuus tutkittiin naaras- ja koirashiirillä, saaduista tuloksista on yhteen-15 veto taulukossa 2.

Taulukko 2

Pseudoprimysiinikompleksin ja sen komponenttien toksisuustiedot.

20 Tutkittu yhdiste _LD-arvot (mq/kq)_ _i.v._p.o._ koiras naaras_koiras naaras

Pseudoprimysiini- asetaatti 17,66 18,78 1724 1583 25 Pseudoprimysinaali- asetaatti 13,30 14,75 937 806

Keksintöä havainnollistetaan yksityiskohtaisesti seuraavilla esimerkeillä.

30 Esimerkki 1 60,0 g (53,23 mmol) primysiinisulfaattia ja 8,5 g (26,94 mmol) bariumhydroksidia, joka sisältää 8 kidevettä, suspendoidaan seokseen, jossa on 800 ml metanolia ja 200 ml vettä, ja keitetään 2,5 tuntia, minkä jälkeen lisätään 35 20 ml etikkahappoa ja keittämistä jatketaan 30 minuuttia.

10 90 0 73

Sen jälkeen bariumsulfaatti suodatetaan kuumana pois, suo-dos haihdutetaan, öljymäinen jäännös liuotetaan 100 ml:aan metanolia ja liuokseen lisätään tipoittain ja sekoittaen 200 ml etyyliformiaattia noin 20 minuutin aikana huoneen 5 lämpötilassa. Sen jälkeen reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä, kiinteää jäännöstä trituroidaan 100 ml:11a etyylieetteriä, suodatetaan ja valkoinen kiinteä jauhe kuivataan tyhjössä 70 eC:ssa. Tuotteena saadaan 26,0 g pseudoprimysiiniase-10 taattia, saanto 43,3 %; s.p. 106 “C; ominaiskiertokyky +35° (0,2-prosenttisessa metanoliliuoksessa).

Esimerkki 2 60.0 g (52,77mmol) primysiinisulfaattia suspendoi-daan 800 ml:aan metanolia ja siihen lisätään 2,14 g (53,5 15 mmol) natriumhydroksidia liuotettuna 200 ml:aan vettä. Suspensiota keitetään 2,5 tuntia sekoittaen, sen jälkeen kuumaan reaktioseokseen lisätään 20 ml etikkahappoa, sekoitusta jatketaan 30 minuuttia ja seos haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan 100 ml:aan metanolia ja liuok-20 seen lisätään 200 ml etyyliformiaattia sekoittaen noin 20 minuutin aikana. Reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä, jäännöstä trituroidaan seoksella, jossa on 450 ml dietyylieetteriä ja 9 ml vettä, näin saatu suspensio suodatetaan, saatu aine 25 kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saadaan 25 g (41,6 %) pseudoprimysiiniasetaattia, s.p. 106 °C.

Esimerkki 3 60.0 g (52,23 mmol) primysiinisulfaattia suspendoi-daan 200 ml:aan vettä, joka sisältää 2,9 g (27,35 mmol) : 30 natriumhydroksidia, seokseen lisätään 800 ml metanolia ja , sitä keitetään 2,5 tuntia sekoittaen. Sen jälkeen liuok seen lisätään 20 ml etikkahappoa ja keitetään vielä 30 minuuttia. Reaktioseos haihdutetaan tyhjössä, jäännös liuotetaan 100 ml:aan metanolia, liukenematon aine (nat-35 riumsulfaatti) suodatetaan pois ja liuokseen lisätään 11 ; li 073 200 ml etyyliformiaattia tipoittain ja sekoittaen noin 20 minuutin aikana ja saostunut reagoimaton primysiiniase-taatti suodatetaan pois. Suodokseen lisätään 33,5 ml 2 N kloorivetyä tipoittain ja sekoittaen, saatu pseudopri-5 mysiinisulfaatti suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Saadaan 24,5 g (40,8 %) pseudoprimysiinisulfaattia valkoisena jauheena, s.p. 127 °C, ominaiskiertokyky +26,5° (0,2-prosenttisessa metanoliliuoksessa).

Esimerkki 4 10 30,0 g (26,38 mmol) primysiiniasetaattia suspendoi- daan 900 ml:aan metanolin ja veden seosta (2:1), lisätään 10 g kuivaa Amberlite IRA-401-ioninvaihtohartsia (OH-muo-dossa) ja seosta sekoitetaan 4 tuntia 60 eC:ssa. Sen jälkeen hartsi suodatetaan pois, suodokseen lisätään 10 ml 15 etikkahappoa ja 100 ml butanolia ja liuos haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan 50 ml:aan metanolia ja seokseen lisätään voimakkaasti sekoittaen 100 ml etyyliformiaattia tipoittain noin 15 minuutin aikana huoneen lämpötilassa. Saostunut reagoimaton primysiiniasetaatti suoda-20 tetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäljelle jäänyttä ainetta trituroidaan dietyylieetterillä. Suspensio suodatetaan ja kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saadaan 14,0 g (46,6 %) pseudoprimysiiniasetaat-tia, s.p. 106 "C.

25 Esimerkki 5

Natriummetylaattiliuokseen, joka on valmistettu 0,31 g:sta (13,48 mmol) natriummetallia ja 50 ml:sta metanolia vedettömissä reaktio-olosuhteissa, lisätään 15,0 g (13,19 mmol) primysiiniasetaattia, saatua suspensiota 30 sekoitetaan voimakkaasti yhden tunnin ajan, minkä jälkeen lisätään 10 ml etikkahappoa ja reaktioseos haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan 250 ml:aan metanolia varovasti kuumentaen ja liuokseen lisätään 50 ml etyyliformiaattia tipoittain huoneen lämpötilassa 10 minuutin ai-35 kana. Reagoimaton primysiinisulfaatti suodatetaan pois, i2 :> o e 7 3 suodos haihdutetaan tyhjössä, jäännöstä trituroidaan seoksella, jossa on 112 ml dietyylieetteriä ja 2,2 ml vettä, suspensio suodatetaan ja kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 eC:ssa. Tuotteena saadaan 7,0 g (46,6 %) pseudoprimy-5 siiniasetaattia, s.p. 106 eC.

Esimerkki 6 15.0 g (13,19 mmol) primysiiniasetaattia suspendoi-daan 50 ml:aan metanolia, lisätään 1,56 g (13,48 mmol) natriumfenolaattia ja suspensiota sekoitetaan voimakkaasti 10 yhden tunnin ajan 60 °C:ssa. Saatuun liuokseen lisätään 10 ml etikkahappoa ja liuotin tislataan pois alipaineessa. Jäännös liuotetaan 250 ml:aan metanolia varovasti kuumentaen ja liuokseen lisätään 50 ml etyyliformiaattia tipoit-tain ja sekoittaen noin 20 minuutin aikana. Reagoimaton 15 primysiiniasetaatti suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan tyhjössä, jäännöstä trituroidaan seoksella, jossa on 112 ml dietyylieetteriä ja 2,2 ml vettä, minkä jälkeen saatu suspensio suodatetaan ja kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saadaan 7,0 g (46,6 %) 20 pseudoprimysiiniasetaattia, s.p. 106 °C.

Esimerkki 7 6.0 g (5,27 mmol) primysiiniasetaattia suspendoi-daan 400 ml:aan n-butanolia ja lisätään 0,49 g (6,0 mmol) natriumasetaattia. Reaktioseosta keitetään sekoittaen 25 yhden tunnin ajan, minkä Jälkeen liuotin tislataan pois ja jäännös liuotetaan 10 ml:aan metanolia. Näin saatuun liuokseen lisätään 20 ml etyyliformiaattia tipoittain noin 20 minuutin aikana huoneen lämpötilassa sekoittaen, minkä jälkeen reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, 30 suodos haihdutetaan alipaineessa ja jäännöstä trituroidaan 30 ml:11a asetonitriiliä. Näin saatu suspensio suodatetaan ja kiineä aine kuivataan 70 ”C:ssa tyhjössä. Tuotteena saadaan 2,8 g (46,6 %) pseudoprimysiiniasetaattia, s.p. 106 °C.

13 :? 0 0 73

Esimerkki 8 6.0 g (5,27 mmol) primysiiniasetaattia suspendoi-daan 400 ml:aan n-butanolia ja seokseen lisätään 6,0 mmol epäorgaanista reagenssia, joka liukenee huonosti metano- 5 liin (esim. natriumkloridia, natriumsulfaattia, natrium-sulfiittia, natriumvetykarbonaattia, rauta(III)fosfaattia, kaliumnitraattia, natriumnitriittiä, kaliumbromidia, ka-liumfluoridia, magnesiumoksidia, natriumsyanidia, natrium-divetyfosfaattia, rauta(II)sulfidia, jne.). Reaktioseosta 10 keitetään sekoittaen yhden tunnin ajan, siihen lisätään 5 ml etikkahappoa, minkä jälkeen liuotin tislataan pois tyhjössä. Jäljelle jäänyt kiinteä aine liuotetaan kuumentaen 10 ml:aan metanolia, liukenematon aine suodatetaan pois ja suodokseen lisätään 20 ml etyyliformiaattia tipoittain 15 ja sekoittaen noin 20 minuutin aikana huoneen lämpötilassa. Reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäännöstä trituroidaan dietyylieetterillä. Näin saatu suspensio suodatetaan ja kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saa-20 daan 2,8 g (46,6%) pseudoprimysiiniasetaattia, s.p. 106 CC.

Esimerkki 9 6.0 g (5,27 mmol) primysiiniasetaattia suspendoi-daan 400 ml:aan n-butanolia, seokseen lisätään 1,0 g (3,1 25 mmol) tetrabutyyliammoniumbromidia, keitetään kaksi tuntia, minkä jälkeen lisätään 5,0 ml etikkahappoa ja liuotin tislataan pois tyhjössä. Kiinteää jäännöstä trituroidaan 30 ml:11a kloroformia, saatu suspensio suodatetaan, kiinteä aine liuotetaan kuumentaen 10 ml:aan metanolia, minkä 30 jälkeen liuokseen lisätään huoneen lämpötilassa 20 ml etyyliformiaattia tipoittain ja sekoittaen noin 20 minuutin aikana. Reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäännöstä trituroidaan dietyylieetterillä. Saatu suspensio suodatetaan ja 35 kuivataan tyhjössä 70 eC:ssa. Tuotteena saadaan 2,8 g (46,6 %) pseudoprimysiiniasetaattia, s.p. 106 eC.

14 >0 0 73

Esimerkki 10 6.0 g (5,27 mmol) primysiiniasetaattia suspendoi-daan seokseen, jossa on 360 ml n-butanolia ja 60 ml dietyyliamiinia, ja seosta keitetään sekoittaen 4,5 tun- 5 tia. Sen jälkeen reaktioseos väkevöidään puoleen tyhjössä, siihen lisätään 5 ml etikkahappoa ja liuotin tislataan pois tyhjössä. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan metanolia ja saatuun liuokseen lisätään 20 ml etyyliformiaattia tipoit-tain ja sekoittaen huoneen lämpötilassa noin 20 minuutin 10 aikana. Reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan, jäännöstä trituroidaan dietyylieet-terillä, suspensio suodatetaan ja kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saadaan 2,8 g (46,6%) pseu-doprimysiiniasetaattia, s.p. 106 °C.

15 Esimerkki 11 60.0 g (52,77 mmol) primysiiniasetaattia keitetään 3,5 tuntia 400 ml:ssa pyridiiniä, minkä jälkeen näin saatu liuos haihdutetaan tyhjössä, jäännös uutetaan etanolilla (2 x 50 ml), minkä jälkeen etanoli haihdutetaan ja jäännös 20 liuotetaan 100 ml:aan metanolia ja näin saatuun liuokseen lisätään 200 ml etyyliformiaattia tipoittain ja sekoittaen huoneen lämpötilassa noin 20 minuutin aikana. Reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäännöstä trituroidaan dietyylieetterillä, 25 saatu suspensio suodatetaan ja kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saadaan 25 g (41,6 %) pseudo-primysiiniasetaattia, s.p. 106 °C.

Esimerkki 12 1.0 g (0,89 mmol) primysiini-Aj^-sulfaattia (valmis-30 tettu HU-patentin n:o 196 425 mukaisesti) ja 0,14 g (0,45 mmol) bariumhydroksidia, joka sisältää 8 kidevettä, sus-pendoidaan seokseen, jossa on 13,5 ml metanolia ja 3,5 ml vettä. Reaktioseosta keitetään sekoittaen 2,5 tuntia, ja kun seokseen on lisätty 0,4 ml etikkahappoa, sekoittamista 35 jatketaan 30 minuuttia. Sen jälkeen reaktion aikana muo- is - O 0 7 3 dostunut bariumsulfaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan, öljymäinen jäännös liuotetaan 1,6 ml:aan metanolia ja saatuun liuokseen lisätään 3,4 ml etyyliformiaattia tipoittain ja sekoittaen huoneen lämpötilassa noin 20 mi-5 nuutin aikana. Reagoimaton primysiiniasetaatti suodatetaan pois, suodos haihdutetaan tyhjössä, saatu suspensio suodatetaan ja valkoinen kiinteä aine kuivataan tyhjössä 70 °C:ssa. Tuotteena saadaan 0,43 g (43 %) pseudoprimy-siini-A^asetaattia, s.p. 108 °C.

10 Esimerkki 13

Pseudoprimysiinin komponenttien erotus pylväskroma-tografiällä 1.) Kromatografinen erotus?

Erotettava näyte: 6,8 g pseudoprimysiiniasetaattia 15 (valmistettu jonkin esimerkeistä 1, 2, 4 - 11 mukaisesti) liuotettuna 30 ml:aan eluenttia.

Kolonni: Φ 3,6 cm, pituus 90 cm, täytetty silikageelillä (Kieselgel 60, Merck, 20 partikkelikoko 0,063 - 0,100 mm) suspendoituna eluenttiin.

Eluentti: kloroformin, metanolin ja etikkaha- pon (9:6:3:4) seoksen alempi faasi, joka on stabiloitu 1 tilavuus-%:lla 25 metanolia.

Virtausnopeus: 1,75 ml/seos

Talteenotettujen fraktioiden tilavuus: 10 ml Fraktioiden aktiivisen aineosan pitoisuus testattiin TLC:llä.

30 2) TLC-koe

Koe suoritettiin Kieselgel 60 (Merck) -levyil lä käyttäen 10 pl:n näytettä.

Eluenttina käytettiin kloroformin, metanolin, muurahaishapon, veden ja formaldehydin seosta 35 (130:53:6:9:3:3) ja kehitys suoritettiin klooritoluidii- 16 9 O C 7 3 nllla tai etanolilla, jossa oli 1 % fosforomolybdeenihap-poa. Kromatografisesti identtiset fraktiot yhdistettiin, laimennettiin 10 ml:11a metanolia ja haihdutettiin tyhjössä. Kiinteää jäännöstä trituroitiin dietyylieetterillä, 5 suodatettiin ja kiinteä valkoinen jauhe kuivattiin tyhjössä 70 °C:ssa. Siten saatiin seuraavat komponentit: 25 x

Komponentti Paino Saanto s.p. [a]D

(g) (%) CC) (·) 10 Pseudoprimysiini- A^-asetaatti 1,60 23,5 108 +38,4

Pseudoprimysiini- A^-asetaatti 0,30 4,4 110 +52,1

Pseudoprimys i ini- 15 C^-asetaatti 0,98 14,4 104 +42,2

Pseudoprimysi ini -

Bj-asetaatti 0,45 6,6 103 +50,0

Pseudoprimysiini-

Bg-asetaatti 0,10 1,4 103 +45,0 20 x Ominaiskiertokyky määritettiin 0,2-prosenttisessa metanoliliuoksessa

Claims (5)

17 '> ,'i07 3 *

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien ja niiden seoksen sekä 5 niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, 0 «OH OH OH OH NHj h {I> 10 ΝΗο X® I OK I OH OH OH OH

2 C^CHfH3 jossa kaavassa R1 on butyyli, pentyyli tai heksyyli, Rz on vety, hydroksyyli tai O-arabinoosi ja X on epäorgaanisen 15 hapon ioni, edullisesti sulfaatti, tai orgaanisen hapon ioni, edullisesti asetaatti, tunnettu siitä, että a) kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien seoksen valmistamiseksi, kaavan II mukaisten primysiinien seos, OH OH j*CH3 x s <n> //c'NY^r^(Tv~TvttT'oi NH2 X® CH-jCH-, oh oh oh oh ch3 3 25 jossa R1, R2 ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan varauksellisen emäksisen aineen kanssa tai varauksettoman yhdisteen kanssa C35-C37-translaktonisaatio-reaktion suorittamiseksi, jolloin varauksellisina aineina 30 käytetään joko ioneiksi hajoneita suoloja, joiden anionit voivat olla orgaanisia, esim. alkoholaatti, edullisesti metylaatti, etylaatti, fenolaatti; karboksylaatti, edullisesti formiaatti, asetaatti, klooriasetaatti, sukkinaatti; tai epäorgaanisia, esim. karbonaatti, vetykarbonaatti, 35 sulfiitti, sulfidi, fosfaatti, divetyfosfaatti, nitraatti, 18 'HI 07 3 nitriitti, syanidi, kloridi, bromidi, fluoridi, ja joiden kationit voivat olla alkalimetalleja, edullisesti natrium, kalium, tai maa-alkalimetalleja, edullisesti magnesium, tai siirtymämetalleja, edullisesti rauta; tai kvaternääri-5 siä ammoniumsuoloja, edullisesti tetrabutyyliammoniumbro-midia, tai nukleofiilisia aineita, edullisesti ioninvaih-tohartseja, ja jolloin varaukseton aine on metallioksidi, metallihydroksidi, edullisesti natriumhydroksidi, barium-hydroksidi, orgaaninen emäs, edullisesti dietyyliamiini, 10 typpi- tai happipitoinen heterosyklinen yhdiste, edullisesti pyridiini, tai b) kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien valmistamiseksi, mainittu translaktonisaatio suoritetaan käyttämällä kaavan II mukaista primysiiniä, tai 15 c) kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien valmista miseksi, kaavan I mukaisten pseudoprimysiinien seokselle suoritetaan kromatografinen erotus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen 20 pseudoprimysiini, jossa R1 on butyyli ja R2 on O-arabinoosi (pseudoprimysiini-Aj), R1 on pentyyli ja R2 on O-arabinoosi (pseudoprimysiini-A2), R1 on heksyyli ja R2 on O-arabinoosi (pseudoprimysiini-A3), R1 on butyyli ja R2 on vety (pseudoprimysiini-B1),

25 R1 on pentyyli ja R2 on vety (pseudoprimysiini-B2), R1 on heksyyli ja R2 on vety (pseudoprimysiini-B3), R1 on butyyli ja R2 on hydroksyyli (pseudoprimysiini-C3), R1 on pentyyli ja R2 on hydroksyyli (pseudoprimysiini-C2), tai • 30 R1 on heksyyli ja R2 on hydroksyyli (pseudoprimysiini-C3), tai sen happoadditiosuola. i9 g0 0 7 3