CN103105496A - 一种时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CEA、CA199、Cyfra21-1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CEA、CA199、Cyfra21-1中的应用。该试剂盒包括：分别抗SCC、CEA、CA199、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1、Tb³⁺标记的抗CA199、Sm³⁺标记的抗SCC、Dy³⁺标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。本发明试剂盒可用于食管癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对食管癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义，同时检测四个肿瘤标志物，简化了检测步骤，提高了检测数据综合分析的特异性和灵敏性。

Description

一种时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测食管癌肿瘤标志物指标SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用。

背景技术

食管癌是指由食管发生的恶性肿瘤，其发生往往有一个漫长的过程，也就是说不可能象感冒发热一样突然冒出来。一般认为，食管癌的发生要经过上皮不典型增生、原位癌、***、转移癌等阶段。不典型增生和原位癌可以完全治愈。食管鳞状上皮不典型增生是食管癌的重要癌前病变，由不典型增生到癌变一般需要几年甚至十几年。食管***又称进展期癌，约近半的患者可以治愈，但到了转移癌治愈的可能性较小，一般只能控制病情，因此，食管癌重在早期诊断。在早期、更加准确的确诊食管癌依然是治疗该疾病的关键。

目前，诊断食管癌的常用检测指标有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1等几种。在实际诊断食管癌时，一般是用SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种指标综合确诊食管癌，因为四种综合的分析在特异性和敏感度上明显高于单一指标。常规实验室或医疗单位用于检测该四项指标通常采用单一试剂盒，即一个试剂盒针对一种肿瘤标记物的检测，此种方式存在的缺点是：1、检测步骤繁多，费时费力；2、目前四种标记物分别采用四种单指标试剂盒进行检测，然后再进行综合判断，由于不同生产厂家的试剂盒存在差异，且同一厂家的不同试剂盒由于检测的标记物不同可能会存在控制条件、参数的差异而导致检测结果存在误差，此种误差在综合分析四种标记物的特异性和敏感性上会产生较大的影响，可能导致判断结果相差甚远。因此，开发一种能够在相对同一的检测条件下同时检测该四种食管癌肿瘤标记物的试剂盒，就能降低由于人为原因造成的检测误差，大大提高综合分析检测结果的特异性和敏感性，为下一步的研究或判断做出准确的结论提供更充分的依据。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种在同一反应体系内同时综合检测食管癌肿瘤标志物指标SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种该试剂盒的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，把四种食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，该试剂盒包括：分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1、Tb³⁺标记的抗CA199、Sm³⁺标记的抗SCC、Dy³⁺标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。

所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为：把分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入100μl的所述抗体包被液，于37℃包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入200μl的封板液，于室温封闭2小时或置于4℃环境中过夜，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板。

所述抗体包被液中，分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的第一株单克隆抗体的浓度均为0.006～0.014g/L。

所述的用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1、Tb³⁺标记的抗CA199、Sm³⁺标记的抗SCC、Dy³⁺标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体中，用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1抗体、Tb³⁺标记的抗CA199抗体、Sm³⁺标记的抗SCC抗体、Dy³⁺标记的抗CEA抗体的质量配比为：Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1抗体:Tb³⁺标记的抗CA199抗体:Sm³⁺标记的抗SCC抗体:Dy³⁺标记的抗CEA抗体=（4～8）:（4～7）:（4.5～9.5）:（10～13）。

分析缓冲液的制备方法为：向每升浓度为0.05mol/L、pH值为8.0的Tris-Hcl缓冲液中加入9g NaCl、0.5g NaN₃、10g BSA、0.1ml吐温-40、5g聚乙二醇，混合均匀，即制得分析缓冲液。

所述共用荧光增强剂的制备方法为：解离部分：将70～200μmol的PTA、2～7μmol的氧化钇、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合，用水定容至1升，用乙酸调pH值至3.5，制得解离部分；增强部分：将0.1～0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至1L，制得增强部分。

所述洗涤液的制备方法为：在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得洗涤液。

所述质控品为SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1标准品的混合物。

一种时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用。

试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用，包括以下步骤：

（1）用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种标准品的混合溶液；

（2）将待测样品与步骤（1）制备的四种标准品混合溶液分别加入抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分别与SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1结合的标记有稀土离子螯合物的第二株单克隆抗体混合抗体，之后加入共用荧光增强剂，进行时间分辨荧光免疫检测，得到发光值；

（3）根据测定的具有系列浓度梯度的包含SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种标准品的混合溶液的发光值做标准曲线；

（4）以测定的待测样品中的SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1发光值和标准品中SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1各自的标准曲线的发光值做比较，得出待测样品中SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1各自的含量。

所述待测样品为人体血清。

进一步的，所述包被缓冲液的制备方法为：取浓度为0.05mol/L、pH值为8.6的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得包被缓冲液。

所述封板液的制备方法为：向浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA，配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得封板液。

本发明提供的试剂盒，采用时间分辨荧光免疫检测方法，实现同时综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的目的。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是一种以稀土离子为标记物，根据稀土离子螯合物的发光特点，用时间分辨技术测定特异性荧光的技术方法。TRFIA利用稀土离子的激发光和发射光的波长不同，同时发射光具有长的衰减时间，这样可以有效的排除非特异性荧光的干扰，具有线性范围宽、灵敏度高和稳定性好等优点，另外，可以利用不同的稀土离子的不同的发射光波长和不同的衰减时间，实现同一反应体系内同时检测多个标志物，这样和单个指标分开检测相比可以节约时间、人员、试剂等，这些特点正好适合本发明的同时在同一反应体系内检测多指标。

本发明提供的食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1时间分辨荧光免疫检测试剂盒，具有非常好的线性范围，检测SCC的线性范围为1ng/ml～50ng/ml，检测限为0.5ng/ml；检测CA199的线性范围为20U/ml～300U/ml，检测限为10U/ml；检测CEA的线性范围为1.5ng/ml～190ng/ml，检测限为1ng/ml；检测Cyfra21-1的线性范围为2ng/ml～290ng/ml，检测限为1ng/ml。各检测指标的正常参考值分别为：SCC为0～2.5ng/ml；CA199为0～37U/ml；CEA为0～5ng/ml；Cyfra21-1为0～3.5ng/ml。本发明提供的食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1时间分辨荧光免疫检测试剂盒可用于食管癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对食管癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义。

采用本发明提供的试剂盒可实现在同一反应体系内同时综合检测食管癌肿瘤标志物四项指标SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1，检测操作简单，步骤少，所需时间短，方便快捷；检测结果准确，避免了现有的采用四种单项试剂盒分别检测四项指标SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1再进行综合判断而引起的判断误差，大大提高了检测结果的特异性和敏感性，为下一步的研究或判断做出准确的结论提供了可靠依据。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的试剂盒同一微孔内同一反应体系反应原理示意图；

图2为本发明实施例1提供的试剂盒与Abbott公司的单指标试剂盒测试SCC相关回归分析图；

图3为本发明实施例1提供的试剂盒与深圳新产业公司的单指标试剂盒测试CA199相关回归分析图；

图4为本发明实施例1提供的试剂盒与Abbott公司的单指标试剂盒测试CEA相关回归分析图；

图5为本发明实施例1提供的试剂盒与北京科美东雅公司的单指标试剂盒测试Cyfra21-1相关回归分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本实施例提供的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，包括：抗SCC的抗体H00006317-M01、抗CA199的抗体ab3982、抗CEA的抗体MAM02-008、抗Cyfra21-1的抗体M01300M四种单克隆抗体组成的混合抗体包被的微孔板；用Eu³⁺标记的R106抗体（抗Cyfra21-1的抗体）、用Tb³⁺标记的ab116024抗体（抗CA199的抗体）、用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体（抗SCC的抗体）、用Dy³⁺标记的MAM02-881抗体（抗CEA的抗体）四种单克隆抗体组成的混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种标准品混合组成的质控品。该试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、底物等其它相关试剂。

本实施例提供的试剂盒中，抗SCC抗体H00006317-M01、H00025816-A01购自Abnova公司；抗CA199的抗体ab3982、ab116024购自Abcam公司；抗CEA的抗体MAM02-008、MAM02-881购自Meridian公司；抗Cyfra21-1的抗体M01300M购自Meridian公司；抗Cyfra21-1的抗体R106是自制兔多抗。

H00006317-M01、ab3982、MAM02-008、M01300M四种单克隆抗体组成的混合抗体包被的微孔板的制备方法为：把混合抗体用包被缓冲液稀释，制得混合抗体包被液，混合抗体包被液中，分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的第一株单克隆抗体的浓度均为0.012g/L，即混合抗体包被液中，抗体H00006317-M01、ab3982、MAM02-008、M01300M的浓度均为0.012g/L，然后向微孔板的每个孔中分别加入100μl的混合抗体包被液，于37℃包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入200μl的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板，密封于铝箔袋中，4℃保存备用。

其中，包被缓冲液的制备方法为：取浓度为0.05mol/L、pH值为8.6的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得包被缓冲液。封板液的制备方法为：向浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA，配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得封板液。

用Eu³⁺标记的R106抗体、用Tb³⁺标记的ab116024抗体、用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体、用Dy³⁺标记的MAM02-881抗体四种单克隆抗体组成的混合抗体的制备方法为：将Eu³⁺标记的R106抗体、Tb³⁺标记的ab116024抗体、Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体、Dy³⁺标记的MAM02-881抗体以质量比：Eu³⁺标记的R106抗体:用Tb³⁺标记的ab116024抗体:用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体:用Dy³⁺标记的MAM02-881抗体=5:5:8:11混合，制得混合抗体。

其中用Eu³⁺标记的R106抗体、用Tb³⁺标记的ab116024抗体、用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体、用Dy³⁺标记的MAM02-881抗体的制备方法为：每种抗体的标记流程步骤相同，只是分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的抗体分别对应的稀土离子螯合物标记物为N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Tb、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Dy、N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Eu。下面以N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm标记抗SCC抗体H00025816-A01为例，其具体制备方法和步骤为：

（1）标记前应用截留分子量为50kDa的离心柱对抗体H00025816-A01进行标记前纯化处理，具体步骤如下：悬空加入1mg H00025816-A01抗体于50kDa的离心柱中，9000rpm离心8分钟，弃掉滤液；往离心柱中加入200μl标记缓冲液，9000rpm离心8分钟，弃掉滤液，该步骤重复四次，最后一次将离心管取出，弃掉滤液；往离心柱中加入50μl标记缓冲液，让其静置1分钟，然后将离心柱的滤膜反转装入离心管中，8000rpm离心6分钟，收集滤液，即得到待标记的抗体H00025816-A01；其中，标记缓冲液为50mmol/L、pH值为9.0的碳酸盐缓冲液；

（2）称取稀土离子螯合物标记物N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm 0.2mg，加入80μl超纯水进行溶解，制成螯合试剂；将螯合试剂加入到盛有待标记抗体H00025816-A01的EP管中，混合均匀；置于摇床上4℃过夜，制得标记好的抗体H00025816-A01，即用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体；

用三倍柱体积的PBS缓冲液作为柱平衡液平衡Superdex 200 1×30cm柱，用移液器吸取用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体缓慢上样，用洗脱液进行洗脱，流速控制在1ml/min，蛋白检测仪检测到蛋白峰收集样品，将收集的目的产物经过0.22μm滤膜除菌；用比活度测定方法对标记抗体进行标记率的计算与分析。长期储存标记抗体可以将高纯度的BSA加入到标记抗体溶液中，BSA的终浓度为0.1%，可置于4℃或-20℃进行保存。

分析缓冲液的制备方法为：向每升浓度为0.05mol/L、pH值为8.0的Tris-Hcl缓冲液中加入9g NaCl、0.5g NaN₃、10g BSA、0.1ml吐温-40、5g聚乙二醇，混合均匀，即制得分析缓冲液。

共用荧光增强剂的制备方法为：解离部分：将200μmol的PTA、2μmol的氧化钇、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合，用水定容至1升，用乙酸调pH值至3.5，制得解离部分；增强部分：将0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至1升，制得增强部分。

洗涤液的制备方法为：在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得洗涤液。

质控品为SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1标准品的混合物。SCC、CEA购自Abnova公司，CA199购自Acris公司，Cyfra21-1购自Meridian公司。

实施例2

本发明实施例1提供的试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用，即采用本发明实施例1提供的试剂盒，同时综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1时间分辨荧光免疫检测方法，其反应原理如图1所示，采用双抗体夹心法，包括以下步骤：

（1）用分析缓冲液稀释SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种蛋白标准品混合物，即质控品，制成具有系列浓度梯度包含有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种蛋白标准品的混合溶液；

（2）分别取100μl待测样品人体血清和步骤（1）制备的四种蛋白标准品混合溶液，加入H00006317-M01、ab3982、MAM02-008、M01300M四种单克隆抗体组成的混合抗体包被的微孔板的不同孔中，37℃温育1小时，三次洗涤（洗涤时所用洗涤液的配制方法为：每升PBS缓冲液中加入9g氯化钠、0.5ml吐温-20，摇匀，即可），之后加入100μl混合标记抗体工作液（用分析缓冲液以体积比1:2500稀释混合标记抗体储存液，制得混合标记抗体工作液，每100μl该混合标记抗体工作液中含有用Eu³⁺标记的R106抗体50ng、用Tb³⁺标记的ab116024抗体50ng、用Sm³⁺标记的H00025816-A01抗体80ng、用Dy³⁺标记的MAM02-881抗体110ng，其余为分析缓冲液），震荡均匀，37℃温育1小时，用洗涤液洗5次，在吸水纸上控干，加入200μl共用荧光增强剂的解离部分，震荡5分钟，加入20μl共用荧光增强剂的增强部分，震荡8分钟，在时间分辨荧光仪上测量荧光强度，激发光波长为315nm；647nm、612nm、544nm、575nm分别为Sm³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺的最强的发射光峰；500微秒、200微秒、50微秒、20微秒分别为Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺的延迟时间；分别测量各自的发光值。把不同浓度的SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种蛋白混合标准品中各指标分别和各自的发光值做标准曲线，得到不同指标的各自标准曲线，待测样品人体血清的浓度按标准曲线计算得出。得到试剂盒的精密度：SCC分析内和分析间的变异系数分别为4%～6.9%、5.6%～8.4%；CA199分析内和分析间的变异系数分别为3.9%～6%、4.8%～7.8%；CEA分析内和分析间的变异系数分别为4.2%～7.1%、5.3%～8.1%；Cyfra21-1分析内和分析间的变异系数分别为3.7%～5.9%、5.7%～8.9%。

实施例3

用本发明的试剂盒检测40份血清样本得到的SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四个指标的数值和用同样的40份血清样本分别用Abbott公司的单指标试剂盒测试SCC、深圳新产业公司的单指标试剂盒测试CA199、Abbott公司的单指标试剂盒测试CEA、北京科美东雅公司的单指标试剂盒测试Cyfra21-1所得到的数据分别做回归相关性分析，分别对应附图2、3、4、5，从附图可以看出，本发明试剂盒测试得到的各指标数据和分别用单指标试剂盒测试得到的数据具有很好的相关性。

Claims (10)

1.一种时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，把四种食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，其特征在于：该试剂盒包括：分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1、Tb³⁺标记的抗CA199、Sm³⁺标记的抗SCC、Dy³⁺标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。

2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，其特征在于：所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为：把分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入100μl的所述抗体包被液，于37℃包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入200μl的封板液，于室温封闭2小时或置于4℃环境中过夜，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板。

3.根据权利要求2所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，其特征在于：所述抗体包被液中，分别抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的第一株单克隆抗体的浓度均为0.006～0.014g/L。

4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，其特征在于：所述的用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1、Tb³⁺标记的抗CA199、Sm³⁺标记的抗SCC、Dy³⁺标记的抗CEA第二株单克隆抗体混合抗体中，用Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1抗体、Tb³⁺标记的抗CA199抗体、Sm³⁺标记的抗SCC抗体、Dy³⁺标记的抗CEA抗体的质量配比为：Eu³⁺标记的抗Cyfra21-1抗体:Tb³⁺标记的抗CA199抗体:Sm³⁺标记的抗SCC抗体:Dy³⁺标记的抗CEA抗体=（4～8）:（4～7）:（4.5～9.5）:（10～13）。

5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，其特征在于：所述共用荧光增强剂的制备方法为：解离部分：将70～200μmol的PTA、2～7μmol的氧化钇、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合，用水定容至1升，用乙酸调pH值至3.5，制得解离部分；增强部分：将0.1～0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至1L，制得增强部分。

6.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，其特征在于：所述洗涤液的制备方法为：在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN₃溶液防腐处理，制得洗涤液。

7.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒，其特征在于：所述质控品为SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1标准品的混合物。

8.一种权利要求1-7任一所述的时间分辨荧光法综合检测食管癌试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用。

9.根据权利要求8所述的试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种标准品的混合溶液；

（2）将待测样品与步骤（1）制备的四种标准品混合溶液分别加入抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分别与SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1结合的标记有稀土离子螯合物的第二株单克隆抗体混合抗体，之后加入共用荧光增强剂，进行时间分辨荧光免疫检测，得到发光值；

（3）根据测定的具有系列浓度梯度的包含SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四种标准品的混合溶液的发光值做标准曲线；

（4）以测定的待测样品中的SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1发光值和标准品中SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1各自的标准曲线的发光值做比较，得出待测样品中SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1各自的含量。

10.根据权利要求9所述的试剂盒在综合检测食管癌肿瘤标志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的应用，其特征在于：所述待测样品为人体血清。

Images