FI87234B

FI87234B - Metod, vilken selektivt oekar den proportunella andelen av enstaka huvudkomponenter av teikoplanin a2 komplex.

Info

Publication number: FI87234B
Application number: FI861834A
Authority: FI
Inventors: Anacleto Gianantonio; Francesco Assi; Giancarlo Lancini
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1985-05-21
Filing date: 1986-04-30
Publication date: 1992-08-31
Also published as: HUT42528A; AU597251B2; ES555133A0; ES8708017A1; FI87234C; IL78832A; DE3666839D1; EP0204179A1; PH23805A; DK165703B; ZA863400B; IE861334L; DK233086A; KR940005656B1; ATE47883T1; PT82612B; JPS61268195A; GR861226B; HU195858B; FI861834A0

Description

1 87234

MENETELMÄ, JOKA SELEKTIIVISESTI LISÄÄ TEIKOPLANI INI A2:n KOMPLEKSIN YKSITTÄISTEN PÄÄKOMPONENTTIEN SUHTEELLISTA OSUUTTA

Teikoplaniini (aikaisemmin nimetty teikomysiini) on glyko-5 peptidinen antibiootti, jota tuotetaan viljelemällä kantaa Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121. Tämä antibiootti on aktiivinen pääasiassa gram-positiivisten baktee-reiden aiheuttamia infektioita vastaan.

Menetelmän mukaan, joka on kuvattu US-patentissa 4,239,751, 10 teikoplaniini eristetään tuottavan kannan käymisliemistä kompleksina, joka sisältää kolme tekijää, nimeltään A^ , ja A^. Tekijää A^ on vallitsevassa määrin edellä mainitun kannan käymisliemistä saadussa antibioottikömpieksissa ja se on kaikkein tärkein biologisilta vaikutuksiltaan. Teki-15 jää A ^ ja tekijää A^ on ainoastaan vähäisissä määrin.

US-patentin 4,239,751 mukaan teikoplaniini A2 (T-A2) eristetään tei kopl ani ini-kompl eksin muistaa tekijöistä pylväs-kromatografisesti, käyttäen SephadexCj^1 LH-20:tä, joka on ristiinkytketyn polydekstraanigeelin hydroksipropyylij o h -20 dannainen, jonka ekskluusioraja on molekyylipaino noin 4000 .

Laajemmassa mittakaavassa suoritetuista valmistus- ja puhdistusmenetelmistä (esimerkiksi näitä menetelmiä on esitetty EPO-patenttijulkaisussa No 0122969) saadaan tavallisesti 25 teikomysiinituote pääasiallisesti muodostuneena teikopla- niini Akista, johon on liittyneenä pieni määrä teikoplanii-ni Agia. Tämä tuote on sopiva käytettäväksi terapeuttisissa sovellutuksissa. Katso: Drugs of the Future; Voi. 9,

No 6, 1984, sivut 429-430, toimittaja J.R. Prous Publishers, 30 Barcelona, Espanja.

Artikkelissa, jonka ovat julkaisseet A. Borghi, C. Coronelli et ai. julkaisussa Journal of Antibiotics, Voi. 37., No 6, 2 87234 sivut 615-620, 10.06.1984, osoitetaan, että teikoplaniinin tekijä A £ (T-A2) on puolestaan viiden läheistä sukua olevan pääkomponentin, joilla on hyvin samanlainen polaari-suus , seos .

5 Nämä komponentit, joita merkitään T-A2-1, T-A2-2, T-A2-3, T-A2-4 ja T-A2-5, eristetään käyttäen ensimmäisessä vaiheessa käänteisfaasi-jakaantumiskromatografiaa normaali paineessa silanoidussa piihappogeelipylväässä . Komponenttien T-A2-3, T-A2-4 ja T-A2-5 puhdistaminen vaatii seuraa-10 van vaiheen, jossa käytetään puolipreparatiivista HPLC:tä Whatman Partisil ® ODS M-9-pylväässä, joka eluoidaan 0 ,2-prosenttisei 1 a vesipitoisella ammoniumformiaatti-asetoni tri i 1 i-seoksel 1 a (76:24). Kaikki mainitut komponentit ovat kemiallisesti ja biologisesti karakterisoituja . Katso 15 myös GB-pa tenttihakemusju1 kaisu No 2,121,401.

Rakenteelliset tutkimukset, joita ovat esittäneet J.C. Barna, D.M. Williams et ai. julkaisussa J. Am. Chem. Soc.

1984 , 1 06 , 4895-4902 , osoittavat, että teikopla niini A^:n pääkomponentit voidaan esittää seuraavalla rakennekaa-20 valla: li 3 87234

H CH-OH

un r \ 5- O Cl OR Cl

o M-M

'h T h \ IOS LOI IPX

ch3^ r H Ί s "h j P NH H I 0 H 0 1 ΝΗ3+

v"r ίο! o: M

m o iOi

101 oh ': 'o J

HO '

H, H ^ °H

ho η—μΌ' Τ' h HO Jsa. 0; , CH?0H u H ^ jossa:

R H

_ R'HN-P^ 0H /

R = / X

/ 1, Λ-οη M.. - 0 H / / och9oh H A 2 T-A2-1: R1 = -C0-(CH2)2-CH=CH-(CH2)4-CH3 ((Z)-4-dekenoyyli) 5 T-A2-2: R1 = -CO-(CH2)^-CH(CH3)2 (8-metyylinonanoyyli) T-A2-3: R1 = -CO-(CH2)g-CH3 (n-dekanoyyli) CH„ / 3 T-A2-4: R’ = -CO-(CH,,)c-CH (8-metyylidekanoyyli ) 2 6 \ C2H5 T-A2-5: R1 = -CO-(CH2)η-CH(CH3)2 (9-metyylidekanoyyli) 4 87234

In vitro- ja in vivo-testit, jotka on esitetty edellä mainitussa GB-pa tentti hakemusjulkaisussa No 2,121,401, osoittavat, että jokainen komponenteista T-A2-2, T-A2-3, T-A2-4 ja T-A2-5 on aktiivisempi kuin teikoplaniini A^-kompieksi 5 kokonaisena.

Sen tähden on ilmeistä, että menetelmä, joka selektiivisesti lisää teikoplaniini A^n jokaisen pääkomponentin tuotantoa, on ensisijaisena kohteena teikoplan iin in teollisessa tuottamisessa. Se voisi tarjota merkittävän teknisen edun 10 koskien sekä yksittäisten T-A2-pääkomponenttien eristämistä puhtaaksi muodoksi että mahdollisuutta saada T-A2-komp-leksissa rikastumaan aktiivisimmat komponentit. Lisäksi mahdollisuus muuttaa yksittäisten T-A2-pääkomponenttien suhdetta T-A2-kompleksissa suuressa teollisessa mittakaa-15 vassa tapahtuvassa käymisessä, tarjoaa käyttökelpoisen kei non säilyttää vakiona käymistuotteen koostumus, jonka tulee pysyä standardi ohjeissa . Toisin sanoen, kun mistä tahansa syystä (esim. johtuen teollisesta vi1jelyalustan modifikaatiosta, jossa käytetään vähemmän kalliita aineita) yksit-20 täisten komponenttien prosentuaalinen koostumus pyrkii eroamaan standardi koostumuksesta, mahdollisuus selektiivisesti lisätä jokaista T-A2-pääkomponenttia, merkitsee käyttökelpoista keinoa tällaisen puutteen korjaamiseksi.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä, joka seiektiivises-25 ti lisää yksittäisten T-A2-pääkomponenttien suhdetta T-A2- kompleksissa. Vielä tarkemmin, tämän keksinnön kohteena on menetelmä, jolla saadaan teikoplaniini selektiivisesti rikastumaan missä tahansa pääkomponentis saan T-A2-1, T-A2-2, T-A2-3, T-A2-4 ja T-A2-5, jossa menetelmässä Actinoplanes 30 teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121-kannan tai sen mutantin, joka tuottaa T-A2-kompleksia saman metabolisen kaavion mukaisesti, vi1jelyalustaan lisätään selektiivisesti tehokas määrä T-A2:n glukoosi amiini osaan liittyneen, karakterisen asyyliryhmän sopivaa prekursoria (katso edellä merkityksiä, 35 jotka on annettu tähteelle R'), jäljempänä: "T-A2:n glukoo- 5 87234 siamiiniosan kunkin asyyliryhmän sopiva prekursori".

Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että : a) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-1:n suhteellista 5 osuutta T-A2-kömpieksissa, on linolihappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat ja sen esterit mono- ja polyhydroksi-a 1 empi a 1kanolien kanssa; b) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-2:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa , on väliini, sen hapon ja emäs- 10 ten kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, alfa-keto-isovaleriaanahappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, sen esterit monoja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa, isovoihappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suo-15 lat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa, isobutanoli ja sen happojen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat; c) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-3:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa, on öljyhappo, sen emästen kans- 20 sa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa; d) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-4:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa, on isoleusiini, sen happojen ja emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suo- 25 lat, aifa-keto-beta-metyylivaleriaanahappo , sen emästen kanssa saadut mikro-organismie 11 e myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa, 2--metyylivoi happo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja polyhydrok-30 si-alempialkanolien kanssa, 2-metyylibutanoli ja sen happojen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät esterit; 6 87234 e) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-5:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa, on leusiini, sen happojen ja emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, is ova 1 eria anahappo , sen emästen kanssa saadut mikro-5 organismille myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja poly-hydroksi-alempiä!kanolien kanssa, aifa-keto-isokaproni-happo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyt-tömöt suolat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-aiempialka-nolien kanssa, isoamyylialkoholi ja sen happojen kanssa 10 saadut mikro-organismille myrkyttömät esterit.

Suolat emästen kanssa, jotka ovat myrkyttömiä mikro-organis-mille, ovat suoloja, joissa annetun kationin tyyppi ja kon-sentraatio on sellainen, että se ei heikennä mikro-organismiviljelmän kasvua tai toivotun antibiootin tuotantoa huo-15 mättävässä määrin. Esimerkkejä mainituista kationeista ovat natrium, kalium, ammonium ja vastaavat.

Esterit mono- ja polyhydroksi-a 1empia 1kano1ien kanssa ovat estereitä (C^)a 1 kanolien kanssa, joissa on 1, 2, 3, 4, 5 tai 6 hydroksifunktio ta per molekyyli.

20 Käytettäessä (C^-Cg)alkanoleja, niiden täytyy olla erilaisia kuin ne, jotka toimivat muiden T-A2-pääkomponenttien prekursoreina (esim. isobutanoli, isoamyylialkoholi ja 2-metyylibutanoli) jollei toivota yhden tai useamman mainitun komponentin samanaikaisesti lisääntyvän.

25 Edullisia esimerkkejä polyhydroksi-alkanoleista ovat glyseroli ja propyleeniglykoli.

Kun alempialkanolia on läsnä erilaisissa enantiomeerisissa ja epimeerisissä muodoissa, tässä esitetyssä selityksessä ja vaatimuksissa, tarkoitetaan sekä yksittäistä muotoa erik-30 seen että yksittäisten muotojen seosta missä tahansa suhteessa .

Esterit, jotka ovat myrkyttömiä mikro-organismi11 e , ovat tl 7 87234 (^2~^22 )alkanoyyliesterit, joissa aikanoyyliosan tyyppi ja konsentraatio käymisa1 us ta ssa on sellainen, että se ei heikennä mikro-organismi viljelmän kasvua tai toivotun antibiootin tuotantoa huomattavassa määrin. Yleensä su o -5 raketjuiset (C2-C4)alkanolit ovat edullisia.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä käsittää edellä mainitun kannan viljelyn vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvan hii1i1ähteen , assimiloituvan typpi-lähteen ja epäorgaanisia suoloja, tavanomaisissa olosuh-10 teissä, jotka on esitetty tunnetussa tekniikassa teiko- planiinin tuottamiseksi, sillä parannuksella, että selektiivisesti tehokas määrä sopivaa prekursoria lisätään käy-misalustaan ennen kannan ymppäämistä tai käymisprosessin kuluessa, jolloin selektiivisesti lisääntyy yhden tai useam-15 man teikoplani ini A2-kompponettien T-A2-1, T-A2-2, T-A2-3, T-A2-4 ja T-A2-5 tuotanto.

Maininta "sen mutantti, joka tuottaa T-A2-kompleksia saman metabolisen kaavion mukaisesti" tarkoittaa niitä luonnollisia tai keinotelko is ia Actinoplanes teichomyceticus ATCC 20 31121 (peruskanta) -kannan mutantteja, jotka tuottavat T-A2- kompleksia käyttämällä olennaisesti samoja entsymaattis ia systeemejä kuin peruskanta, tuoden T-A2-kompleksiin R' ra sva-a syyliosan.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa sanonnalla "selektiivi-25 sesti tehokas määrä" tarkoitetaan selektiivisen prekursorin määrää, joka lisättäessä vi 1 jelyalustaan muodostaa selektiivisen prekursorin konsentraation, joka on riittävä aikaansaamaan T-A2-kompleksin spesifisen komponentin selektiivisen lisääntymisen, aiheuttamatta myrkyllisiä vaikutuksia 30 mikro-organismiin.

Ravintoviljelyalusta, joka on sopiva T-A2:ta tuottavan kannan käymiseen ja jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa, sisältää tavallisesti: sopivan hiili 1 ä h t e e n , joka voi olla esimerkiksi sokeri (esim. glukoo- s 87234 si, sakkaroosi, maltoosi), polysakkaridi (esim. tärkkelys, dekstraani), polyalkoholi (esim. glyseroli, propyleenigly-köli); sopivan typpi 1 ahteen, joka voi olla esimerkiksi am-moniumsuola, asparagiini, maapähkinäjauho , soijapapujauho , 5 lihauute, tryptoni , peptoni , hiiva-hydrolysaatti , hiiva- uute ja maissineste (corn step liquor); happamia mineraali-suoloja, kuten natriumkloridia , ka 1 siumkarbonaattia , magnesiumsulfaattia.

Käymisen suorittamiseksi käytetään vaihtelevia aikoja 50 -10 200 tuntia, aerobisia olosuhteita, lämpötila on 25°C - 35°C, mieluimmin 27°C - 33°C. Sopivien prekursoreiden selektiivisesti tehokkaan määrän lisääminen voidaan tehdä käymisaiustaan ennen kuin ympätään tuottavalla kannalla, kuitenkin se mieluimmin tehdään 24 - 48 tuntia sen jälkeen, 15 kun käyminen on aloitettu. Lisäys voidaan tehdä yhdellä kertaa tai useissa annoksissa tai jatkuvasti.

Tämän keksinnön mukaisen tyypillisen suoritusmuodon mukaan kaurajauhoagarivinopinnoi11 a oleva Actinoplanes teicho-mycet i cus- ka nta ympätään pulloon, joka sisältää 100 ml 20 kasvualustaa. 36 tunnin kuluttua käytetään viljelmän näyt teitä (5 ml) ympättäessä joukko käymispul1 oja , jotka sisältävät 100 ml käymisa1ustaa. 24 tunnin ja 48 tunnin käymisen jälkeen selektiivisesti tehokas määrä prekursoria lisätään niinkuin on esitetty. Jos halutaan samanaikaisesti 25 kahden tai useamman T-A2-kompleksin pääkomponentin lisääntyvän, samaan käymispul1oon voidaan lisätä kaksi tai useampi prekursori. Käymistä jatketaan vielä 60 - 150 tuntia, kasvualusta sentrifugoidaan ja liemestä otetut näytteet analysoidaan T-A2-pääkomponenttien konsentraation osalta kor-30 keapaine-nestekromatografisesti (HPLC).

Prekursorin lisääminen suoritetaan tavallisesti siten, että se ei muuta etukäteen säädettyä käymisaiustan pH-ar-voa. Näin ollen esimerkiksi, kun vapaat happo-prekursorit lisätään suoraan kasvatusalustaan, pH-arvoa kontrolloidaan l! 9 87234 puskuroimalla kasvatusalusta tai neutra 1 oima11 a välittömästi emäksillä, jotka ovat myrkyttömiä mikro-organismille.

Kun lisättävä prekursori on aminohappo, se voidaan lisätä käymisalustaan sen suolan vesipitoisena liuoksena, joka 5 suola saadaan happojen tai emästen kanssa, jotka eivät ole myrkyllisiä tuottavalle mikro-organismille, esim. hydroklo-ridit ja natriumsuolat. Sekä raseemisia seoksia että optisesti aktiivisia isomeerejä voidaan käyttä prekursoreina.

Kuitenkin ainakin jossain tapauksissa L-muodon lisääminen 10 antaa suurempia saantoja kuin vastaava D-muoto.

Tämän keksinnön mukaiselle edulliselle suoritusmuodolle on siksi kuvaavaa, että käytetään L-aminohappo-prekursoria teikopl ani ini A^-kompleksin T-A2-2:n (väliini, sen suola tai esteri), T-A2-4:n (L-isoieusiini , sen suola tai este-15 ri) ja/tai T-A2-5:n (L-leusiini, sen suola tai esteri) konsentraati on lisäämiseksi. Tämän edullisen suoritusmuodon mukaan on myös mahdollista lisätä T-A2-2:n, T-A2-4:n tai T-A2-5:n prosenttia käymistuotteessa aina 90 - 95 prosenttiin kompleksissa.

20 AIempialkaanihappo-prekursoreilla (esim. isovoihappo, 2- -metyylivoi happo, isovaleriaanahappo, alfa-keto-isovaleri-aanahappo, aifa-keto-beta-metyylivaieriaanahappo ja alfa--keto-isokapronihappo) lisäys voidaan tehdä käyttäen niiden suolojen vesipitoista liuosta, jotka suolat saadaan myrkyt-25 tornien emästen kanssa; edullisia ovat tavallisesti ammonium-ja natriumsuolat.

Käytettäessä tyydyttämättömien rasvahappojen, kuten lino-lihapon ja öljyhapon suoloja, sopivana prekursorina ovat edullisia yleensä natriumsuolat. Kuitenkin mitä tahansa 30 emäksen kanssa saatua suolaa, joka ei ole myrkyllinen tuottavalle kannalle, voidaan käyttää.

10 87234

Kun käytetään edellä mainittujen aiempialkanaanihappojen ja tyydyttymättömien rasvahappojen estereitä, jotka saadaan monohydroksialempialkanolien kanssa, prekursoreina, mainitut esterit johdetaan tavallisesti metanolista, etanolista 5 ja propanolista , vaikka voidaan käyttää myös estereitä, jotka valmistetaan C^-Cg-alkanolien kanssa. Tässä tapauksessa C^-Cg-alkanolin täytyy olla erilainen kuin ne, jotka toimivat muiden T-A2-pääkomponenttien prekursoreina (esim. isobutanoli, isoamyylialkoholi ja 2-metyylibutanoli) ellei 10 haluta nostaa yhden tai useamman mainitun komponentin suhteellista osuutta samanaikaisesti.

Edellä mainittujen a 1empia 1kaanihappojen ja tyydyttymättornien rasvahappojen edullisia estereitä polyhydroksi-aiem-pialkanolien kanssa ovat esterit etyleeniglykolin ja glyse-15 rolin kanssa, esim. tri-isobutyriini, tri-oleiini ja tri--1inoleiini.

Tyydyttymättömien rasvahappojen lisääminen voidaan suorittaa myös käyttämällä luonnollisia raaka-aineita, jotka sisältävät mainittuja happoja sellaisinaan tai niiden glyse-20 ridejä. Esimerkiksi kaupallinen soijapapuöljy tavallisesti sisältää noin 20 - noin 35 % öljyhappoa ja noin 50 % -- noin 60 % 1inolihappoja triglyserideinä ; laardi sisältää noin 40 - noin 55 % öljyhappoa; puuvi11ansiemenöljy sisältää noin 20 - noin 45 % öljyhappoa ja noin 30 - noin 55 % li-25 nolihappoa; auringonkukkäsiemenöljy sisältää noin 15 - noin 25 % öljyhappoa ja noin 65 - noin 75 % 1inolihappoa.

AIkanoli-prekursorit, kuten isobutanoli, isoamyylialkoholi ja 2-metyylibutanoli, lisätään tavallisesti sellaisenaan käymisaiustaan. Kuitenkin ne voidaan lisätä myös happojen 30 estereinä, jotka eivät ole myrkyllisiä mikro-organismeille. Näiden happojen tulee olla erilaisia, kuin ne, jotka voivat toimia muiden T-A2-pääkomponenttien prekursoreina (esim. isovoihappo, isovaleriaanahappo, 2-metyylivoi happo, linolihappo jne. ellei toivota samanaikaisesti yhden tai ,, 87234 useamman mainitun komponentin lisääntymistä. Tavallisesti esterit lineaaristen a 1 empi a 1 kaani happojen , kuten etikka-, propioni- ja voihapon kanssa ovat edullisia.

"Selektiivisesti tehokas määrä", joka lisätään käymisalus-5 taan tämän keksinnön mukaisesti riippuu prekursorin tyypistä. Tavallisesti a 1 empi aikaanihappojen (isovoihappo , 2-metyylivoihappo, isova1eriaanahappo) estereiden ja tyydy ttymättömi en rasvahappojen (1inolihappo , öljyhappo) estereiden määrät, joita käytetään halutun konsentraation 10 saamiseksi käymiselustaan, vaihtelevat välillä 0,5 g/1 -- 15 g/1 , edullisen alueen ollessa välillä 1 g/1 - 5 g/1 .

AIempialkanoleil1 a (isobutanoli , 2-metyylibutanoli , iso-amyylia 1koholi) tai niiden happojen kanssa saaduilla mikro-organismille myrkyttömillä estereillä, määrät, joilla 15 saadaan konsentraatio, vaihtelevat välillä 0,5 g/1 - 5 g/1, edullisen käyttöalueen ollessa välillä 1 g/1 - 2 g/1.

Aminohapoilla (esim. väliini, leusiini, isoleusiini) ja keto-hapoilla (alfa-keto-isovaleriaanahappo, alfa-keto--beta-metyylivaleriaanahappo, alfa-keto-isokapronihappo) 20 tai niiden happojen ja emästen kanssa saaduilla suoloilla "selektiivisesti tehokas määrä", joka lisätään käymisalus-taan, vaihtelee tavallisesti välillä 0,5 g/1 - 5 g/1, alueen 1 g/1 - 3 g/1 ollessa edullinen.

Kun aiempialkaanihappoja (esim. isovoihappoa , 2-metyyli-25 voihappoa, isovaleriaanahappoa), tyydyttymättömiä rasvahappoja (esim. 1inolihappoa , öljyhappoa) tai näiden suoloja lisätään suoraan käymisalustaan, "selektiivisesti tehokas määrä" vaihtelee tavallisesti välillä 0,1 g/1 - 2,5 g/1, alueen 0,3 g/1 - 1,5 g/1 ollessa edullinen.

30 Suuremmat konsentraatiot ovat vielä tehokkaita edistäen T-A2-paäkomponenttien selektiivistä lisääntymistä, mutta T-A2-kompleksin kokonaissaanto pienenee, koska ilmenee toksisia vaikutuksia mikro-organismilla.

12 87234

Seuraavat esimerkit kuvaavat yksityiskohtaisesti tämän keksinnön eräitä spesifisiä suoritusmuotoja.

ESIMERKKI 1 YLEINEN MENETELMÄ 5 Kannan Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 yksi kaura-agarvinopinta ympättiin 500 ml:n pulloon, joka sisälsi 100 ml seuraavaa kasvualustaa: glukoosia 10 g/1 peptonia Difco 4 g/1 10 hiivauutetta 4 g/1

MgS04 0,5 g/1

CaC03 5 g/1 standardi oiigoalkuainetta 1 ml jokaista liuoksista

A, B j a C

15 vettä 1000 ml (pH säädettiin arvoon 6,7 steriloinnin jälkeen)

Liuos A: 10 % natriumkloridi (paino/til.)

Liuos B: 10 % kalsiumkloridi (paino/til.)

Liuos C: H2B0^: 50 mg; CuSO^: 4 mg; KI: 10 mg; FeCl^: 20 mg; 20 MgSO^: 40 mg; FeSO^: 40 mg; (NH^^MoO^: 20 mg; 100 mlrssa tislattua vettä.

Kasvatettiin 36 tuntia pyörivässä ravistelijassa, jonka jälkeen käytettiin 5 ml viljelmää ympättäessä testipullot ja standardipul 1ot, jotka sisälsivät jokainen 100 ml käymis-25 alustaa, jonka koostumus oli seuraava: hiivaa (yeast lisate) 5 g/1 asparagi inia 1 ,5 g/1 glukoosia 20 g/1

MgS04 0,5 g/1 30 CaC03 5 g/1 standardi oligoalkuainetta 1 ml jokaista liuoksista

A, B ja C

87234 vettä 1000 ml (pH säädettiin arvoon 6,9 steriloinnin jälkeen)

Liuokset A, B ja C samat kuin edellä.

Käyminen suoritettin 28-30°C:ssa pyörivässä ravistelijassa .

5 24 tunnin kuluttua lisättiin sopiva prekursori. Viljelmä sentrifugoitiin 72 tunnin kuluttua ja näytteet, jotka olivat 50 jul lientä, analysoitiin T-A2-pääkomponenttien kon-sentraation suhteen.

Analyysi suoritettiin käyttäen seuraavaa HPLC-menetelmää:

10 a. EROTTAMINEN GRAD IENTTI-KÄÄNTEISFAASIJAKAANTUMI SELLA

Laite: pumppu Varian 5000 A; detektori Varian 254 mikrometrillä : injektori Rheodyne model 7125; integraattori Spectra Physics model 4000; (B) 15 Kolonni: Zorbax^ ODS 5 mikrometriä, 4,6 x 150 mm; (Du Pont)

Liikkuva faasi: A) CH-jCN: 0,025 M NaH2P04 1:9, pH 6,0 B) C H 3 C N: 0,025 M NaH2P04 7:3 , pH 6,0

Gradient ti 20 profiili: lineaarinen alkaen 0 prosentista B:tä - 50 prosenttiin B:tä 30 minuutissa, virtausnopeus 2 ml/min.

Injektio: 50 μΐ käymislientä retentioajat (minuutteja) 25 T-A2-1 = 16,9 T-A2-2 = 18,0 T-A2-3 = 18,6 T-A2-4 = 20,5 T-A2-5 = 20,9 14 87234

Sisäinen standardi: 3,5-dihydroksitoiueeni (retentioaika 6,3 minuuttia).

b. PROSENTUAALINEN JAKAUTUMINEN

Komponentit erotettiin edellä esitetyllä menetelmällä ja 5 niiden suhteellinen jakautuminen saatiin prosenttina viiden piikin kokonaisalasta, käyttäen alaprosenttimenetelmää.

15 87234

LO

I CO CD Γ-'- CJD r-- CO CM^j-OD r^OO^LO

£«yj #S #t #t #t * rt f» *t Λ #t Π r< ro lo o *— io n cd co en m co co I N N !\J <— «— CSJ ·>— CM CO r^.

l·— I C3C0O <— CM LT) r-LDOLn ζ-yj ri r> MAA Λ Λ Λ rt ^ r» rt C ^ eoo^ ef σι n cm o eo LO en co '

I CM CM CM -— CO «d- CO

I—

CO

i *— co «d- Ln>d-e\j *d- lo «d- CMit^-uno rt r< rt » rt rt rtrert rc rt r» rt CS-S CO CD CD O CM CT1 OCO'd- ΙΩ N σι Ccl I ·>— CMICNJ CMJ'— CM ---- (—

CM

i 'd-oen «— *d- o co ·*— lo en o >d- co rt rt rt r* rt λ r»rtr> rtrcr>r<

O CM CM CM O CO CT> ^d" CO f-~ LO LO CM

i rococo inr-^oo cm cm -- cococo-— I— I o-— co LDcocn ocor-^ ot^oo rtrtrt rirtrt rt rs r» *t r< rt rt

<C OJ CVJ T— CD CD C\J «C— ^ OJOJ^—O

ΙΟ I— 4-> ^ C <0 (OB ^ (O B (0 CO fö ·— CO CD LO CTi LO CO LD o CD CT) ^ fO (71 •f- CD «vf Ο Γ^. .<—s O^^CTi t— ΓΟ LO nj N ΙΟ CO ςΤ ΓΟΟ COCOOO Π3 OcJ ID Γν </> *— «— *— i— CO «3· OJ «—

C 1. ε O

O O 3 3

*r— 3 *r— CO

Ο Ξ co ί- B

^ Ξ 4-> =3 3 (0 '·- ·«- C i-

i. ^ +J

4—> Λ3

03 fO C

C ·*- —'

^ C

•r- 03 Π3 *·- ,r"

4-) ··— CO CZ

Φ C 3 ··“ CO v— <U ·Γ“

\/ r- I— CO

>j r— r— LO OLO 3 LO LO

:π3 \ ·Γ- *r— <— ro ** co ** Φ * ^

(Λ CD ΦΦΦ > CD 'τ— c\j *ι— CD »— Cvl I— O <*— C\J CVJ

•i“ III

_l I I —I

LO

16 87234

• «— eri en LO

CM Λ Λ λ n ft a-s cm cd o •γ η- oo en en »— en C\J λ Λ n #i rs

*=C S'? CM 00 VO O VO

I ·"— «— CM V— h- oo • r-~ o oo cd <3- CM Λ rv r> «v «v C co »—oo *3- r-v I «3- «d- «— »— I— CM -— I CM fC5 CM »— ro en C\J *> ' r~~ r» λ aa

«=C ^ LO C LO CD CM

I CO ·»“· *— *— CM CM

(— φ

O

e • t—

• CM I CD OO CD CM

CM ·(— « #v <£·'/> CD S- CM CM CTt *—

1 +-> «— «— CM OO

I— ro

-M

on

O

O ·— C

+-> \ -r- C 03

<0 E CL

*3 E

00 Π3 ^

CO i- o O 00 «—LO

en LO CD CM LO ^ LO

fOO N »- OO M CO ΓΟ C S- o :na ··-* :π3 O E +-> ^ f— :n3 </) s. * |-

i— CO

O "— rö □I »r- ^ fÖ e r- *r~

03 C OJ

-M T- -f- ,—

<D C -r- O

LO ·.- Φ e -r- ,— -r- >i *— — LO O r—

103 \ 03 " I I

LOCn > CM ’f— CM ·ί— CM LO

»- I Sv —* —Il h-

LO

17 87234 I r-" et lo et Λ Λ #\ »* »» et ^ c\j en et *— h- et e I CM CTi *— co -*— . p— £\J #\ Λ · #* *» •r- e LO LO CO LO o

4— > I ’T— *— C\J CO

rO I— ro

LO

IrO

r— CO

.— t CO CO CM CM LO

• j— t\ #» w\ rv

>, <t^ CD LO LO LO CD

CU \— +->

LO

<u *O>

5- C\J

:<o i *— co r*-- -r- co *i—5 C\J * Λ #\ n λ

<U C ?>? et CM CD CM LO

o I et LO LO et et ^ t—

fO

> I CM LO et CO f-'- rö CM * ^ λ e fd C ^ CM CM·*— CM·*—

S- I

13 h-

OJ

CO

ro •r-j O i— +-> \ ;r0 C ro

r- rO E

i— rO E

:r0 to ro

E LOS- O CD 00 CO LO

I— ·ι~ CT> LO CO LO CM LO

Q) ro O et et CM et CM

4-> C S-

Φ O

e 'ρω O E

E ^

:rO

i— r—

i— O

>> e 4-> ro

CU -M

-M ·»“ =3

r- _Q

LO · · +-> O *r- <d -m cu e ία» co rO >> ;rO co -4—> Do

r— >, »— =3 -M

.— O :r0 T-JO CU

CU .— co en CU o *— CM E *— cm

T3 =3 -r- CO I

LU 4-> _J >—« CM

18 87234 ESIMERKKI 2 YLEINEN MENETELMÄ

Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121-kanta esiviljeltiin 500 ml:n ravistelupullossa, joka sisälsi 5 100 ml seuraavaa kasvualustaa: 1ihauutetta 3 g/1 tryptonia 5 g/1 hiivauutetta 5 g/1 glukoosia 1g/l 10 liukenevaa tärkkelystä 24 g/1 ka 1 siumkarbonaa11ia 5 g/1 vettä 1000 ml (pH säädettiin steriloinnin jälkeen arvoon 6,7)

Pulloja ravisteltiin 24 tuntia 28-30°C:ssa, jonka jälkeen 15 esiviljelmää käytettiin ympättäessä käymisastiat, joista jokainen sisälsi 10 litraa seuraavaa ravintoalustaa: 1i hauutetta 4 g/1 peptonia 4 g/1 hiivauutetta 1 g/1 20 natriumkloridia 2,5 g/1 soijapapu jauhoa 10g/l glukoosia 50 g/1 kai siumkarbonaattia 5 g/1 vesijohtovettä q.s. 1000 ml 25 (pH säädettiin steriloinnin jälkeen arvoon 6,9).

Käymisastioita inkuboitiin aerobisesti, samalla hämmentäen 24 tuntia, jonka jälkeen sopiva prekursori lisättiin. Käymistä jatkettiin edelleen 90 tuntia, jonka jälkeen käymi s -astioista korjattiin tuote. Liemestä otetut näytteet (100 30 ml) suodatettiin pH-arvossa 11 (pH säädettiin lisäämällä 20-prosenttista (paino/til.) natriumhydroksidia) ja analysoitiin menetelmällä, joka esitettiin esimerkissä 1 injek- I9 87234 toi ma 11a 40 μΐ jokaista suodatettua näyteliuosta, jonka pH oli säädetty arvoon 7,38 0,1 M fosfaattipuskurilla.

LO

20 87234

I CO et Γ— CM CO N ro M

£\J *1 #t «t A «< «t A «t ft cm ro o *— lo cd r- lo h-

I CO o CO LO COCO O N C\J

£\j «t rt et #t et et et * #t

et LO f— N LT) CO CT> LO I

1 <— *— <«— CO CO CO

I—

CO

I CD *— CD «s* en CM CM CTi LO

e* et ft ft ft ft A ft ft

<t LO LO *3- CD KO en LD «— OO

I T— T— CM T— *— l·-

CM

I en cd r— ·«— o co co cn co « fl fl ft ft ft #t #t #t <t^s o CD LO *— e^-cr» CD CD *—

I LO LO ^ CM CM

(—

I LO LO LOCO CD CD 00 CM

£\j rt et et et et et c> et et

C et1 co LO CM ej-LO CM ej- LO

I *— LO

h" O I— \ ·«- C <d S-

rd E CU

ro Ξ 4-» LO fO </>

CO S- 00*d- ej- LO CM CM <D CD LO CD

•»-CD r^-oo LO (T> ocr> ·<- cm ςτ ro id o LO LO r— lo cor- ·— r— co lo c >> O >,

‘1- +J

o E <u

^ E

c o

Cl fd «d

♦I- SZ

c rd ·»— •r- ·γ- o <u c: > +-> *— -f— -r— <D ο -r- Γ ΟΟ C 0J >> ^ -r- I— >» >> r— r— O 4->

:rd\ ·»— *r- I LO CD I LO CD <U *— CO LO

LO CTJ Q) Q) -Γ- ·Γ- X— E

r- S- I

_J I— I— CM

LO

21 87234 I rv.*— LO ro ro co rv- σι σ' o

£\J Λ At At At Λ At Ai At At M

<C 0-5 Oirv LO ΓΟ CO «LT *— CO *— CO

h- *3·

I OO^j- Cv CO LO CO CO LO OO

ζ\] Λ#* K rt A A A A A A

<C S'S c\j *— to *3- «— <3- »— ·*— i oo *1- I—

OO

i toto oi in w ^j-uo cvi «d- to £\J At At A» A» Λ At Λ At At At

eC&« *3- co in N N OOOO O OI OI

h-

CM

I ID Oi oi co oo *— r— oocnoo £\J A A A A A A A Ai A A» «=C r, ? en m rv cd o en eri en co lo i roro lo CO co lo rv rv co co κ ι coo en lo ^— co co rocvjcn C\J At At A» Ai At At At AI At At <C 0-5 CO LO CO C\l ΓΟ COCO C\J ΓΟ ^- h- O .— 03

e Π3 O

03 E 3 '"v rc E co <o lo ra E o s) s- 3 *— rv ro m o ^ evi 3 co rv o

•r- CT) *1“' CO LO QOOOJ Π3 CO *— ·<— LO rv LO

030 S- LO CO LO^TOJ I— LO (XI i— ^fCOOJ

£=&.+-> O

O ^ 03 3 3 -ii ·!- e -I- «O 4-> O E v-A +-> ε ·- ^ +->3 0 03 03 *r— S- O 03 S- 3

Cl £- +-> j*: Q. >> ro lo 03 +^ e 3

-C 3 —-CL

•i- _Q ---

O O O

> to 0-03

+-> ·ι- *r- CL ΤΟ» r— I 03 C

LO >, T- -C T- >*> i— ·ι— -r- >•>1— +-> LO LO >> O LO LO i— :π3\ a» » * >> > *» * 03 lo en E<3>*— +-> *— co lo o o *— > *— cv) co

•f- I <D LO I

_j c\j 2: *—« _i 22 β 7234

LO

I «o- cm co co co lo cm r·-*·.

c\j ********* C r^oor^ CJi <«— CM O CTi

I LO CO

h- ^r I o ro co cxi cr> co lo lo CM ********* <C LO *— Γ'-'. CO -- -- a> LO r^ I -- <5j“ I— ro

l CTi CO LO LO CO LO CO CO

CXI *********

Co? CM LO *“ CO CO —~ O LO LO

1 CMCOCM ^— ^“

CM

I ^ CO CO o CTi ^3- -- LO

CM *********

Co'S LOLOCO —- -- C- —- LO c

I CM CO CM CO CO CO CM CO CO

1—

I CO *— O'» CO LO CM CO CO

CM *********

Co? N CO σι *— CM «O’ LO CM CM

I CO co CO

Ιο

4-j ιέ X ro Π3 ro E ^ E

UI ro »“ CO X CM O O O O O

•I— i_ r^OCO 00 LO LO CO

Π3 CJ) LO C'* LO C"* CO CO CO CM

c o O £- O -Γ-

^ E

>> ro

*»“5 C O

i— >> (O 1 1 -f- CL

:θ O ·Γ“5 <o -Γ- ·ι— r— CL

C *— I— -r- c C O (O

O) :o s. o o -c sz

E >1 ro CL) S- £»- O fO

O) -r-5^1— Ω. CX C

··— «— ro ro rO i— ro (Λθ:θ3 > ^ ^ rt3 ro 4-J C ««— ZJ J*: O o LO O -Γ- CU ro CL c (/) CO (Λ * (Λ r— S-

CO ,— rO O ·!— ·»— *— *r— CO >> CU

i— -r- Q. CJ) O O O >> r—

>,i— ·γ- TJrOC +-> O 4-^0 4-> O E rO

:ro\ > i- <ro -r- φ a φ a o a ro > to en 3 ro·»- S* CL Q_ ^ CX O olo •I- OOiOOOOIroirOlfOtn UI * _] O- *— _j oo e ·«“ <:1-C «.e ö -e »—·*«— 23 87254

Vertailua varten myristiinihappoa , tripa 1 mitiinia ja tri-steariinia lisättiin neljään käymisastiaan konsentraatiossa ollessa vastaavasti 1 g/1, 5 g/1 ja 10 g/1 edellä esitetyissä olosuhteissa. Minkään T-A2-pääkomponentin suhteen 5 ei havaittu lisääntymistä.

ESIMERKKI 3

Kantaa Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 esiviljelti in kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Esiviljel-män pulloja käytettiin ympättäessä käymisastia, joka s i -10 sälsi 10 litraa ravintoalustaa, joka on esitetty esimerkissä 2 .

Käymisastia inkuboitiin aerobisesti, samalla hämmentäen 25°C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen lisättiin 2 g/1 L-va-liinia. L-valiini oli etukäteen liuotettu veteen (2 g/15 15 ml) lisäämällä rikkihappoa pH-arvoon 3 asti ja saatua liuosta oli hämmennetty 120°C:ssa 10 minuutin ajan.

Käymistä jatkettiin 25°C:ssa edelleen 50 tuntia, jonka jälkeen käymisastiasta otettiin tuote talteen.

Liemi suodatettiin pH-arvossa 11 ja analysoitiin menetel-20 mä n mukaan, joka on esitetty esimerkissä 1, se sisälsi 220 /jg/1 T-A2-kompl eksia, jolla oli seuraava koostumus: T-A2-1: 2%; T-A2-2: 95%; T-A2-3: 3%.

Claims

87234
1. Menetelmä teikoplaniini A2:n (T-A2) valmistamiseksi selektiivisesti rikastettuna minkä tahansa pääkomponenttinsa T-A2-1, T-A2-2, T-A2-3, T-A2-4 tai T-A2-5 suhteen, tunnettu siitä, että kannan Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121, viljelyalustaan lisätään T-A2:n glu-koosiamiiniosan kunkin asyyliryhmän sopivaa prekursoria, jolloin a) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-l:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa on linolihappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,1-2,5 g/l:n määränä ja sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempi-alkanolien kanssa 0,5-15 g/l:n määränä, b) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-2:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa on väliini, sen happojen ja emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,5-5 g/l:n määränä, alfa-keto-isovaleriaanahappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa 0,5-5 g/l:n määränä, isovoihappo ja sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,1- 2,5 g/l:n määränä, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa 0,5-15 g/l:n määränä tai isobuta-noli ja sen happojen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät esterit 0,5-5 g/l:n määränä, c) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-3:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa on öljyhappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,1-2,5 g/l:n määränä, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa 0,5-15 g/l:n määränä, d) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-4:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa on isoleusiini, sen happojen ja li 25 87234 emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,5-5 g/l:n määränä, alfa-keto-beta-metyylivaleriaana-happo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempi-alkanolien kanssa 0,5-5 g/l:n määränä, 2-metyylivoihappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,1-2,5 g/l:n määränä, sen esterit mono- ja poly-hydroksi-alempialkanolien kanssa 0,5-15 g/l:n määränä tai 2-metyylibutanoli ja sen happojen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät esterit 0,5-5 g/l:n määränä, e) sopiva prekursori, joka lisää T-A2-5:n suhteellista osuutta T-A2-kompleksissa on leusiini, sen happojen ja emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,5-5 g/l:n määränä, isovaleriaanahappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat 0,1- 2,5 g/l:n määränä, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alem-pialkanolien kanssa 0,5-15 g/l:n määränä, alfa-keto-iso-kapronihappo, sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, sen esterit mono- ja polyhydroksi-alempialkanolien kanssa 0,5-5 g/l:n määränä tai isoamyyli-alkoholi ja sen happojen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät esterit 0,5-5 g/l:n määränä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään on lino-lihappo tai sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 0,3-1,5 g/1.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on li-nolihapon esteri mono- tai polyhydroksi-alempialkanolin kanssa, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 1-5 g/1. 26 8 7 2 3 4
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on väliini tai sen happojen ja emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 1-3 g/1.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on iso-voihappo tai sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 0,3-1,5 g/1. G. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on iso-voihapon esteri mono- tai polyhydroksi-alempialkanolin kanssa, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 1-5 g/1.
7. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on iso-butanoli tai sen happojen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät esterit, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 1-2 g/1.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on öl-jyhappo tai sen emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 0,3-1,5 g/1.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on öl-jyhapon esteri mono- tai polyhydroksi-alempialkanolin kanssa, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 1-5 g/1. 27 87254
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että sopiva prekursori, joka lisätään, on iso-leusiini tai sen happojen ja emästen kanssa saadut mikro-organismille myrkyttömät suolat, ja vastaava selektiivisesti tehokas määrä vaihtelee välillä 1-3 g/1.
11. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käyminen suoritetaan lämpötilassa, joka on välillä 25eC ja 35°C, ja mieluimmin välillä 27°C ja 35eC.
12. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sopiva pre-kursorin lisääminen suoritetaan 24-48 tuntia sen jälkeen, kun käyminen on alkanut. 28 87234