FI86745C - Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa - Google Patents

Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa Download PDF

Info

Publication number
FI86745C
FI86745C FI864110A FI864110A FI86745C FI 86745 C FI86745 C FI 86745C FI 864110 A FI864110 A FI 864110A FI 864110 A FI864110 A FI 864110A FI 86745 C FI86745 C FI 86745C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
plasmid
yeast
sequence
dna
recombinant dna
Prior art date
Application number
FI864110A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI86745B (fi
FI864110A (fi
FI864110A0 (fi
Inventor
Merja Penttilae
Paeivi Lehtovaara-Helenius
Jonathan Knowles
Tuula Teeri
Helena Nevalainen
Irma Salovuori
Original Assignee
Alko Ab Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8518918&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI86745(C) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Alko Ab Oy filed Critical Alko Ab Oy
Priority to FI864110A priority Critical patent/FI86745C/fi
Publication of FI864110A publication Critical patent/FI864110A/fi
Publication of FI864110A0 publication Critical patent/FI864110A0/fi
Publication of FI86745B publication Critical patent/FI86745B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86745C publication Critical patent/FI86745C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/945—Trichoderma

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

1 86745
Sellulolyyttisiä entsyymejä tuottavat hiivakannat ja mene telmät ja välineet niiden rakentamiseksi
Selluloosan täydellisen hydrolyysin glukoosiksi on osoitettu edellyttävän kolmea erityyppistä sellulolyyttistä aktiivisuutta. Tärkeimmät selluloosan liukenemiseen vaikuttavat entsyymit ovat endoglukanaasi (EC 3.2.1.4) ja sellobiohydro-laasi (EC 3.2.1.91) (1, 2). Glukoosin tuottamiseksi tarvitaan vielä kolmatta entsyymiä, β-glukosidaasia (EC 3.2.1.21). Mekanismia, jolla nämä kolme erityyppistä entsyymiä vaikuttavat hajottaessaan selluloosan täydellisesti, ei vielä tarkoin tunneta.
Samat rihmamaiset homeet tuottavat erityyppisten sellulo-lyyttisten entsyymien useita erilaisia isoentsyymejä, jotka ilmeisesti vaikuttavat synergisesti hydrolyysissä (3, 4, 5, 6).
Selityksessä ja oheisissa patenttivaatimuksissa käytetyt termit endoglukanaasi II ja III ovat nykyisen terminologian mukaan endoglukanaasi I ja endoglukanaasi II, joiden lyhenne on EGI ja EGII.
Trichoderman on osoitettu tuottavan ainakin kahta immunolo-gisesti erilaista sellobiohydrolaasia, CBH I ja CBH II, ainakin kahta endoglukanaasia, ENDO II ja ENDO III sekä β-glukosidaasia. Vaikka selluloosan entsymaattinen hydrolyysi etenee nopeimmin kaikkien näiden entsyymien läsnäollessa, CBH I yksinään kykenee hajottamaan kiteisen selluloosan glukoosiksi ja sellobioosiksi (7, 8, 9).
Kaksi ryhmää on raportoinut T. reesein CBH I -entsyymiä koo-daavan geenin molekulaarisen kloonauksen ja tämän geenin täydellinen sekvenssi tunnetaan (10, 11).
Hiiva on tärkeä teollisuusorganismi, jota käytetään panimo-teollisuudessa, viininvalmistuksessa, leipomisessa, etanolin 2 86745 ja yksisoluproteiinin tuotannossa sekä aivan hiljattain myös lääkeaineiden, kuten interferonin, kasvuhormonin ja hepatiitti B -virusantigeenin, tuotossa. Hiivat eivät tuota selluloosaa hajottavia entsyymejä. Selluloosaa hajottavien hii-vakantojen kehittäminen mahdollistaisi sellaisten olemassa olevien prosessien parantamisen, joissa käytettävä raaka-aine sisältää selluloosaa tai glukaaneja. Yhtä tärkeää olisi mahdollisuus kehittää aivan uusia prosesseja, joita nykyisin ei vielä voida toteuttaa.
Oluen suodatuksen ja selkeytyksen yhteydessä ongelmia aiheuttavat β-glukaanit, jotka ovat peräisin ohranjyvistä ja joilla on korkea molekyylipaino. Panimoteollisuudessa käytetään mikrobiperäisiä β-glukanaaseja poistamaan nämä β-glukaanit. Mikäli oluen tuottamiseen käytetty hiiva kykenisi tuottamaan endoglukanaaseja, oluen suodattaminen parantuisi huomattavasti ja suodatuskustannukset laskisivat. Siirtämällä erillisiä homeperäisiä sellulaasigeenejä hiivaan on mahdollista saada aikaan hiivakantoja, jotka tuottavat vain yhtä sellulaasientsyymiä. Tällaiset hiivakannat tuottaisivat entsyymejä käytettäviksi esimerkiksi selluloosa- ja paperiteollisuudessa. Paperinvalmistukseen käytettävää selluloosaa voitaisiin turvottaa esikäsittelemällä sitä yhdellä sellu-laasientsyymillä, joka saisi aikaan turpoamisen ilman huomattavaa selluloosan hydrolysointia.
Vieras geeni voidaan siirtää hiivaan kahdella tavalla. Yksinkertaisinta on liittää koko geeni luovuttajaorganismin kromosomista hiivavektoriin ja transformoida hiivasolut. Mikäli hiivan geneettinen järjestelmä tunnistaa sopivan sekvenssin siirretyssä geenissä, geeni ilmentyy. Kuitenkin, käytännössä tämä on harvinaista ja riippuu ainakin osaksi luovuttajaorganismin ja hiivan geneettisestä etäisyydestä.
Esimerkiksi viidestä Aspergillus niqerin geenistä, joita testattiin Saccharomyces cerevisiaessa, vain yhden todettiin ilmenevän (12). Tämän vuoksi oi voida olettaa, että hetero-logiset geenit ilman muuta ilmenisivät hiivassa.
3 86745
Toinen menetelmä geenin ilmentymisen aikaansaamiseksi hiivassa on liittää hiivan promoottorisekvenssiin joko kromoso-maalinen geeni tai cDNA-kopio lähetti-RNA:sta, joka koodaa halutun proteiinin synteesiä. Tällä tavoin hiivassa on saatu ilmenemään ihmisen eukariootti-interferoni (13), hepatiitti B -viruksen pinta-antigeeni (14), vasikan renniini (15) ja hiiren n-amylaasi (16).
Näistä ja muista tutkimuksista selviää, että vaikka cDNA tai geeni saadaan aina ilmentymään, on hyvin vaikea ennalta arvioida tuotteen määrä ja sijainti solussa ilman kokeilua. Montenecourt (1) kuvasi pääpiirteittäin erilaisia mahdollisia kloonausmenetelmiä T. reesein sellulaasigeenin kloonaamiseksi, mutta ei kuvannut menetelmiä, joita käyttäen päämäärät voitaisiin saavuttaa.
Tämän keksinnön mukaan on aikaansaatu hiivakantoja, jotka kykenevät tuottamaan sellulolyyttisiä entsyymejä, menetelmiä näiden kantojen rakentamiseksi, näiden kantojen rakentamiseen tarvittavia yhdistelmä-DNA-vektoreita, näiden vektoreiden rakentamiseen käytettyjä menetelmiä ja sellulolyyttisten entsyymien cDNA-kopioita, jotka koodaavat näiden entsyymien synteesiä.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patent t ivaat imuks i s sa.
Kromosomaaliset geenit, jotka koodavat kolmea eri sellulaa-sia, CBH I, CBH II ja ENDO II, eristettiin T. reesein X-faa-gin geenikirjastosta differentiaalisella hybridisoinnilla. Näiden geenien fragmentteja käytettiin eristämään täyspitkiä cDNA-palasia T. reesein cDNA-kirjastosta.
cDNA:t kolmea sellulaasia, CBH I, CBH II ja ENDO II, varten ja CBH I -geeni siirrettiin sopiviin 2 μ hiivaplasmideihin. Käytettäessä transformoimaan sopivia hiivakantoja nämä ohjasivat vastaavien sellulaasientsyymien ilmentymistä ja erittymistä. Hiivan tuottamilla sellulaaseilla osoitettiin 4 86745 olevan samanlaiset aktiivisuudet kuin natiivilla home-ent syymillä .
Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuotettu sellulolyyttinen hiivakanta Saccharomyces cerevisiae VTT-RC-84001 on talletettu talletuslaitokseen National Collection of Yeast Cultures, Norwich, Yhdistynyt kuningaskunta, talletusnumerolla NCYC No. R 128, 6. huhtikuuta 1984.
Esillä olevaa keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisemmin viittaamalla oheisiin piirustuksiin.
Kuvio 1 esittää T. reesein sellobiohydrolaasi I (CBH I) kro-mosomaalisen geenin restriktiokarttaa. Koodaava alue on merkitty paksummalla viivalla.
Kuvio 2 esittää T. reesein sellobiohydrolaasi II (CBH II) kromosomaalisen geenin restriktiokarttaa. Koodaava alue on merkitty paksummalla viivalla.
Kuvio 3 esittää T. reesein endoglukanaasi II (ENDO II) kromosomaalisen geenin restriktiokarttaa. Koodaava alue on merkitty paksummalla viivalla.
Kuvio 4 esittää plasmidin YEpNP03 rakentamista T. reeseistä saadun CBH I -geenin kromosomaalisen kopion ilmentämistä varten hiivassa.
Kuvio 5 esittää T. reesein CBH II -geenin cDNA-sekvenssiä plasmidista pTT09.
Kuvio 6 esittää T. reesein ENDO II -geenin cDNA-sekvenssiä plasmidista pTTll. Geenin kromosomaalisessa kopiossa olevat intronien kohdat on merkitty nuolella (I).
Kuvio 7 esittää plasmidin pMPll rakentamista T. reesei CBH I:n ilmentämistä varten hiivassa.
5 86745
Kuvio 8 esittää plasmidin pMP29 rakentamista T. reesei CBH
II:n ilmentämistä varten hiivassa.
Kuvio 9 esittää plasmidin pMP311 rakentamista T. reesei ENDO II:n ilmentämistä varten hiivassa.
Kuvio 10 esittää CBH I:n entsyymiaktiivisuutta, joka on tuotettu hiivakannalla VTT-RC-84001.
Määritelmät, joita tässä yksityiskohtaisessa selostuksessa käytetään, on määritelty US-patenttijulkaisussa 4 388 397 (Gilbert ja Talmadge).
Materiaalit
Bakteerit- ia homekannat, plasmidit ia faaoit. T. reesei -kantaa VTT-D-80133, joka on mutanttikanta, jolla on parantunut sellulolyyttisten entsyymien tuotanto ja joka on saatu kannasta QM 9414 (17) useiden peräkkäisten mutaatiovaiheiden jälkeen (18), käytettiin sellobiohydrolaasi I (CBH I)-, sel-lobiohydrolaasi II (CBH II)-, endoglukanaasi II (ENDO II) -geenien eristämiseen.
Escherichia coli -kannat Q358 ja Q359 ja faagi λ 1059, joita käytettiin T. reesei -geenipankin valmistamisessa, saatiin tri J. Karnelta (19). E. coli HB 101:tä käytettiin isäntänä viidessä transformaatiossa plasmidilla pBR 322. E. coli JM 101 ja faagi M 13 mp 7 (20) ja plasmidit pUC 8 ja pUC 9 (21), joita käytettiin dideoksisekvensoinnissa, olivat F. Sangerin laboratoriosta. Hiivakannat, joita käytettiin olivat Saccharomyces cerevisiae OLI (Mata leu 2-3 leu 2-112 his 3-11 his 3-15 ura 3-251 ura 3-373) (22) ja S. cerevisiae MT302-lc (Mata arg 5-6 leu 2-3 leu 2-112 his 3-11 his 3-15 pep 4-3 ade 1) (23).
12 kb kosmidia p3030, joka saatiin Barbara Hohnilta ja joka replikoituu sekä E. colissa että hiivassa, käytettiin vektorina CBH I:n kromosomaalisen kopion transformoinnissa hii- 6 86745 vaan. Kosmidi p3030 sisältää ampisilliini- ja tetrasyklii-niresistenssigeenit E. colissa ja his 3 -geenin selektoimis-ta varten hiivassa. Vektori sisältää cos-kohdan, joka tekee mahdolliseksi pakkautumisen infektoituneihin λ-faagipartik-keleihin in vitro sekä hiivan 2 μ EcoD-fragmentin. Hiivan ilmentymisvektoria, joka sisälsi fosfoglyserokinaasi (PGK) -geenin promoottorin, käytettiin sellulaasigeenien cDNA-ko-pioiden ilmentämiseen hiivassa (23).
Entsyymit. Restriktioentsyymit hankittiin Amershamilta (UK), Boehringer Mannheimilta (BDR) ja Bethesda Research Laborato-riesilta (Gaithersburg, MD) ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaan. T4-ligaasi ja DNA-polymeraasi I:n suuri alayksikkö olivat Biolabsilta ja vasikan suolistofosfataasi Boehringer Mannheimilta. Käänteistranskriptaasi oli saatu tri J.W. Beardilta (Life Sciences Inc., St. Petersburg, Fla.). Protoplastien valmistuksessa käytettävää entsyymiä Zymolyase 60 000 saatiin Kirin Brewery Co:lta, Japani. E. coli -polymeraasi I:n Klenow-fragmentti oli Boehringer Mannheimilta .
Yleiset kasvualustat. E. colia HB101 kasvatettiin L-lihalie-messä. Transformantit selektoitiin L-maljoilla, joihin oli lisätty 1,5 % agaria ja 100 pg/ml ampisilliiniä. L-maljoille lisätyn tetrasykliinin pitoisuus oli 10 pg/ml. Täydellinen YPG-alusta hiivan kasvattamista varten sisälsi 1 % hiiva-uutetta, 2 % peptonia ja 2 % glukoosia. Hiivaminimialusta, YMB, sisälsi 0,67 % hiivatyppialustaa (Difco, Detroit, USA) ja 2 % sokeria (laktoosi, sellobioosi, tärkkelys tai glukoosi). Lisättyjen aminohappojen lopullinen pitoisuus oli, kuten on kuvattu (24). Hiivamaljojen kiinteyttävänä aineena käytettiin 2 % agaria (Difco Bacto Agar). Hiivaprotoplastien malja-alustaan lisättiin osmoottiseksi stabilaattoriksi 1,2 M sorbitolia. Maljauksessa hiivaprotoplastien regeneraatioon käytetty top-agar valmistettiin kuten minimialusta, mutta käyttämällä 3 % puhdistettua agaria (Difco) kiinteyttävänä aineena.
7 86745
Kaikki menetelmät, ellei toisin mainita, suoritetaan kuten julkaisussa Maniatis et ai. 1982 (25) on kuvattu.
T. reesei-homeen sellulolyyttisten geenien eristäminen ia karakterisointi
Polyadenyloitu (polyA*) lähetti-RNA, joka on eristetty T. reesein sellulaaseja aktiivisesti tuottavista myseeleistä, ohjaa kaniinin retikulosyyttilysaatissa in vitro usean suuren polypeptidin syntymistä, jotka saostuvat vasta-aineilla, jotka on valmistettu puhdistettuja sellulolyyttisia entsyymejä vastaan. Lähetti-RNA, joka eristettiin repressoidusta, glukoosilla kasvaneesta myseelistä, ei ohjaa näiden sellu-laasispesifisten polypeptidien synteesiä. Tätä indusoitujen ja repressoitujen populaatioiden välistä eroa käytetään hyväksi identifioitaessa kokoelmaa hybridi-A-faageja, jotka sisältävät T. reesein sellulolyyttisiä entsyymejä tuotettaessa voimakkaasti ilmeneviä geenejä.
Sellulaasispesifisen indusoidun mRNA:n eristystä varten T. reeseitä (kanta VTT-D-80133) kasvatettiin Baileyn ja Nevalaisen (26) kuvaamalla tavalla, paitsi että alusta sisälsi 2 % laktoosia ja 2 % liukoista rankkia. Kasvatuksen aikana otetuista näytteistä määritettiin aktiivisuus värjättyä Avi-celiä, hydroksietyyliselluloosaa (HEC) ja liukoista proteiinia kohtaan (26) . Arvio pelkistävistä sokereista tehtiin Sumnerin (27) menetelmällä.
Soluperäinen RNA eristettiin myseelistä Ohin ja Shortin muunnetulla menetelmällä (28). Jäädytetty myseeli jauhettiin hienoksi jauheeksi nestemäisessä typossä ja suspendoitiin puskuriin, joka sisälsi 20 niM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M NH4, 1 mM Mg (0Ac)2, 10 mM Na-jodiasetaattia, 0,5 mg/ml polyvinyy-lisulfaattia ja 2 % Na-dodekyylisulfaattia (SDS). Tämän jälkeen inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia, liukenematon aines poistettiin sentrifugoimalla 13000 g 10 minuutin ajan.
s 86745
Poly( A )*-fraktio puhdistettiin kromatografisesti oligo(dT)-selluloosapylväällä (Bethesda Research Laboratories) (29) ja in vitro -translaatio tehtiin kaniinin retikulosyyttilysaa-tilla käyttäen 35S-metioniiniä (Amersham International Ltd.) (30). Immunosaostus suoritettiin Dobbersteinin (31) mukaan käyttäen puhdistettua CBH I-, CBH II- tai ENDO II -proteiinia vastaan valmistettua antiseerumia, tai vastaavalla esi-immunoseerumilla.
Taulukossa 1 on esitetty spesifisiä sellulaaseja vastaan valmistetuilla vasta-aineilla saostuvien proteiinien mole-kyylipainot, jotka on analysoitu 7,5-15 % SDS-polyakryy-liamidigeeleissä (32).
Taulukko 1
Antiseerumi In vivo In vitro CBH I 71 000 67 000 CBH II 63 000 48 000 ENDO II 62 000 53 000 T. reesei -geenipankin rakentaminen suoritettiin seuraavasti .
Trichoderma reesein konidioita idätettiin nestemäisessä alustassa, joka sisälsi 1,5 % KH2P04, 0,5 % (NH4)2S04, 0,06 % MgS04*7H20, 0,06 % CaCl2, 0,15 % proteoosipeptonia, 0,03 % ureaa, 2 % sakkaroosia ja minimisuolat. Viljelmiä inkuboitiin ravistelussa 29°C:ssa noin 12 tuntia. Tumien eristäminen suoritettiin käyttämällä hieman muunneltua Hautalan et ai. menetelmää (33). DNA eristettiin raa'asta tuma-pelletistä, joka oli saatu homogenoidun myseelin differenti-aalisentrifugoinnilla. Raakaa tumapellettiä käsiteltiin SDS-amylaasiliuoksella (100 mM EDTA pH 8,0, 140 mM NaCl, 1 % natriumdodekyylisulfaattia ja 3,3 % α-amylaasia, saatu yhtiöltä Merck, Darmstadt, BRD) 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Tämän jälkeen lisättiin proteinaasi K:ta (lopullinen pitoisuus 0,8 % p/til.) ja inkubointia jatkettiin kahden tunnin ajan 9 86745 37°C:ssa varovasti ravistaen. Inkuboinnin jälkeen solujät-teet poistettiin sentrifugoimalla ja DNA seostettiin super-natantista etanolilla. Sen jälkeen DNA puhdistettiin CsCl-sentrifugoinnilla. T. reesein kromosomaalinen DNA hajotettiin osittain MboI:llä ja jaettiin fragmentteihin sakka-roositiheysgradienttisentrifugoinnin avulla. Viisitoista 20 kb fragmenttia ligatoitiin Bam HI-pilkottuun λ 1050 DNA:hän. Rekombinanttimolekyylien in vitro pakkaaminen suoritettiin käyttäen pakkausuutteita, jotka oli valmistettu Hohnin menetelmällä, kuten Maniatis et ai. (25) ovat kuvanneet.
Rekombinanttifaagit siirrettiin agarista nitroselluloosa-filttereille (Schleicher & Schull, BA 85) Bentonin ja Davisin (34) kuvaamalla tavalla. Koettimina käytettiin indusoidusta mRNA:sta (kuvattu aikaisemmin) ja glukoosin läsnäollessa kasvatetusta homeesta eristetystä mRNArsta valmistettua cDNA:ta. cDNA:n ensimmäisen säikeen synteesi suoritettiin Efstradiatisin et ai. menetelmällä (35), mutta käyttäen 10 pCi:tä 32 ρα ATP 50 μΐ reaktiota kohden. In situ -plakki-hybridisaatio suoritettiin Maniatiksen et ai. mukaan (25). Hybridisaatio havaittiin filttereiden autoradiografiällä Kodak X-OMAT-filmillä. Positiiviset plakit poimittiin 1 ml:aan SM-puskuria (25), johon oli lisätty tippa kloroformia, ja ne varastoitiin -4°C:ssa.
Hybridifaagit, jotka hybridisoituivat vain indusoidulla, sellulaasia koodavia sekvenssejä sisältävällä lähetti-RNA:-11a tehtyyn cDNA:han, puhdistettiin perusteellisesti ja ne testattiin uudelleen hybridisoimalla molempien koettimien kanssa. Joukko indusoituvaan sellulaasikoettimeen vahvasti hybridisoituvia erillisiä klooneja identifioitiin ja valittiin tarkempiin tutkimuksiin.
Hybridifaagit, jotka sisälsivät geenejä, jotka indusoituivat homeen tuottaessa sellulaaseja, ryhmiteltiin ensin restrik-tioentsyymikartoituksen mukaan. Sitten erityinen sellulaasi-geeni jokaisessa ryhmässä tunnistettiin lähetti-RNA:n hybri-diselektiolla.
10 86745 DBM-paperia saatiin Schleicher & Schulliltä (Keene, NH) ja se aktivoitiin valmistajan ohjeiden mukaan. DNA:n sitoutuminen aktivoituun paperiin, RNA:n hybridisaatio ja eluutio suoritettiin Maniatiksen et ai. mukaan (25). RNA:n translaatio suoritettiin Amersham International Ltd:Itä hankitun kaniinin retikulosyyttilysaatin avulla ja tuotetut proteiinit leimattiin 35S-metioniinilla. Proteiinit analysoitiin autoradiografiällä Kodak X-OMAT-filmeillä sen jälkeen kun proteiinit oli erotettu denaturoivassa 7-15 % polyakryy-liamidigradienttigeelissä.
Tietystä faagista hybridiselektion avulla saatujen proteiinien koko ja niiden ristireaktio spesifisen antiseerumin kanssa on esitetty taulukossa 2.
Taulukko 2
Hybridifaagi nro 44A W17A W12A
Hybridiselektiossa saadun lähetin tuottaman pää- proteiinin molekyylipaino 67 000 48 000 53 000 Pääproteiinin ristireaktio antiseerumin kanssa seuraavia vastaan: CBH I + CBH II + ENDO II +
Kloonin 44A yksinkertainen ja kaksinkertainen hajotus analysoitiin 0,6 % ja 1,5 % agaroosigeelillä. Fragmentit siirrettiin elektroforeettisesti Gene Screen -membraaneille (New England Nuclear, MA) ja hybridisoitiin indusoituun cDNA-koettimeen valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Tällä menetelmällä mahdollistettiin kolmen sellulaasigeenin restriktioentsyymikarttojen rakentaminen. Restriktioentsyy-mikartat on esitetty kuvioissa 1, 2 ja 3.
11 86745 CBH I-, CBH II- ja ENDO II-geenien nukleotidisekvenssit muodostettiin dideoksisekvensoinnilla (36) käyttäen restrik-tioentsyymifragmentteja tai DNA-fragmentteja, jotka saatiin "shotgun"-menetelmällä (37).
Kromosomaalisen CBH I-qeenin sisältävän hiivavektorin rakentaminen
Hybridifaagin 44A (11) DNA, joka sisälsi Trichoderma reesein hypersellulolyyttisen mutanttikannan VTT-D-80133 CBH I, hajotettiin Pst I:llä, jolloin saatiin seos fragmentteja, joista yksi oli noin 12 kb pituinen ja sisälsi koko CBH I -geenin omien säätelysekvenssiensä kanssa. Saadut DNA-frag-mentit liitettiin hiivakosmidiin p3030, joka oli osittain hajotettu samalla entsyymillä.
Edellä kuvatulla DNA-seoksella transformoitiin hiivakanta OLI kohdassa his*. Transformointi suoritettiin oleellisesti Gerbaudin et ai. kuvaamalla tavalla (38). Transformoidut solut maljattiin hiivaminimialustalle, joka sisälsi leusii-nia ja urasiilia, mutta josta puuttui histidiini.
Klooneja testattiin edelleen in situ -plakkihybridisaation avulla T. reeseistä lähtöisin olevan CBH I -geenin läsnäolon havaitsemiseksi.
Vahingoittumattoman CBH I -geenin läsnäolo hiivassa varmistettiin eristämällä kokonais-DNA (39) transformanttipesäk-keistä ja hajottamalla se restriktioentsyymeillä Bgl II ja Hinc II. DNA siirrettin nitroselluloosafiltteriin (40) aga-roosigeelistä ja hybridisoitiin M13-koettimeen (41), joka sisälsi 0,7 kb pituisen Eco Rl -fragmentin CBH I -geenistä. Kuviossa 4 on esitetty CBH I -geenin sisältämän hybridiplas-midin rakentaminen.
i2 867 45 CBH 1-, CBH II- ja ENDO II -entsyymejä koodaavien täyspit-kien cDNA:iden eristäminen cDNA-pankki T. Teeseistä valmistettiin indusoidusta mRNA:-sta, joka oli eristetty soluista kuten aikaisemmin on kuvattu. Kuitenkin, sen jälkeen kun jäädytetty myseeli oli jauhettu nestemäisessä typessä, se suspendoitiin 5 tilavuuteen guanidiniumisotiosyanaattipuskuria, kuten on kuvannut Ma-niatis et ai. (25). Sen jälkeen RNA:n valmistus suoritettiin, kuten on kuvattu (42).
cDNAin ensimmäisen säikeen synteesi suoritettiin Maniatiksen mukaan (25) ja toisen säikeen synteesi suoritettiin Gubler ja Hoffmannin mukaan (43). Sen jälkeen kaksoissäikeistä cDNAita käsiteltiin T4-polymeraasilla, jotta saatiin tylppiä päitä, ja pienet cDNA-palaset, vähemmän kuin 500 nukleotidiä pitkät, poistettiin kuljettamalla CL-4B-kolonnin lävitse (Pharmacia). Pitkät cDNA-palaset liitettiin Sma Iillä hajotettuun ja fosfataasilla käsiteltyyn pUC 8 -vektorivalmis-teeseen. Ligaatioseosta käytettiin E. coli -kannan JM 105 transformointiin, ja cDNA-pankki varastoitiin nitrosellu-loosafilttereille.
CBH I:tä, CBH Uita ja ENDO Uita koodavat täyspitkät cDNAit eristettiin cDNA-pankista käyttäen spesifisiä restriktio-fragmentteja koettimina. CBH Iin identifioimiseksi käytettiin kromosomaalisen geenin 5'-päästä olevaa radioaktiivista Eco RI-Hind III -fragmenttia identifioimaan pitkä cDNA. Kloonista, joka sisälsi tälle Eco RI-Hind III -fragmentille homologisia sekvenssejä, saatua plasmidia pTTOl karakterisoitiin edelleen sekvensoimalia cDNA-päät kaksoissäikeisellä dideoksisekvensoinnilla. 1 pg puhdistettua plasmidia denaturoitiin 0,4 M NaOH huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan pitoisuudessa 100 ng/yl. 5 μΐ sekvensoivaa tai käänteisse-kvensoivaa primeeriä (Amersham) lisättiin ja seos saostet-tiin etanolilla. Pesun jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen 10 liaan 7 mM MgCl^ita 14 mM Trisissä, pH 8. Sekven-sointireaktiot suoritettiin yleisten menetelmien (36) mukaan i3 8 6 7 45 paitsi, että lämpötila pidettiin 37°C:ssa. CBH II - cDNA:t eristettiin Pvu II -fragmenttia käyttäen kromosomaalisen geenin 5'-päästä ja plasmidista pTT09, joka oli karakterisoitu CBH I-cDNA:n suhteen. ENDO II-cDNA:t identifioitiin käyttäen Kpn Ι-Sal I -fragmenttia geenin 5'-päästä ja plasmidista pTTll, joka oli myös karakterisoitu CBH I - cDNA:n suhteen. Sitten kaikki cDNA:t sekvensoitiin sen määrittämiseksi, että niiden sekvenssit vastasivat sitä geeniä, josta ne oli transkriptoitu. CBH II:n ja ENDO II:n cDNA:n DNA-sek-venssit on esitetty kuvioissa 5 ja 6. CBH I - cDNA-sekvenssi oli identtinen jo aiemmin kuvatun kanssa (10).
cDNA;ta sisältävien ilmentämisvektorien rakentaminen ho-mesellulaasien tuottamista varten hiivassa
Tehokas hiivan ilmentämisvektori pMA 91 on koottu käyttäen hiivan fosfoglyserokinaasin (PGK) geenin säätelysekvenssejä (23). Entsyymin aminohapposekvenssiä koodaavat sekvenssit on poistettu geenistä ja korvattu yksinkertaisella Bgl II -kohdalla. Tämä poistettu geeni on sitten sisällytetty hiiva/co-li-vaihtoplasmidiin.
a) CBH I -ilmentämisvektori (Kuvio 7) CBH I - cDNA poistettiin plasmidista (pTTOl, Kuvio 7) hajottamalla Hinc II:11a ja cDNA-fragmentti eristettiin agaroosi-geelistä.
Ilmentämisvektori pMA 91 hajotettiin Bgl II:11a ja päät syötettiin sisään Klenow-fragmentin kanssa. Vektoria käsiteltiin fosfataasilla, se liitettiin cDNA:han ja transformoitiin E. coli -kantaan HB101 selektoimalla leusiinivektori-geenin ilmentymisen suhteen (Kuvio 7). Plasmidi-DNA eristettiin useista transformanteista ja ne kloonit, jotka sisälsivät cDNA-jakson oikeassa asemassa suhteessa PGK-promootto-riin - identifioituna restriktioentsyymianalyysillä - otettiin talteen. DNA, joka saatiin yhdestä näistä klooneista (pMP 11), transformoitiin sitten hiivakantaan MT 302-lc me- i4 8 6 7 45 netelmällä, joka on aikaisemmin kuvattu, selektoimalla kan nassa VTT-RC-84011 esiintyvä pMA 91:n leusiinimarkkeri.
b) CBH II -ilmentämisvektori (Kuvio 8) CBH II - cDNA poistettiin plasmidista pTT 09 käyttäen Eco Rl- ja Bam HI -entsyymejä. DNA-päät syötettiin sisään Kle-now-fragmentin kanssa. cDNA-fragmentit eristettiin agaroosi-geelistä ja liitettiin vektoriin pMA 91, joka oli valmistettu samoin kuin CBH I:lle.
Ligaatioseos siirrettiin HB101:een ja cDNA:n sisältäviin klooneihin oikeisiin merkittyihin asemiin. Kuviossa 8 on esitetty DNA-sekvenssi pMA 91:n ja cDNA:n välisissä liitoskohdissa.
Plasmidia pMP 29, jossa oli cDNA oikeassa asemassa, käytettiin sitten transformoimaan hiiva MT302-lc selektoimalla leusiinimarkkerin suhteen, jolloin saatiin kanta VTT-RC-84012.
c) ENDO II -ilmentämisvektori (Kuvio 9) ENDO II - cDNA siirrettiin pMA 91:een täsmälleen samoin kuin CBH II - cDNA. Kuviossa 9 on esitetty DNA-sekvenssit pMA 91:n ja ENDO II - cDNA:n välisissä liitoskohdissa. Plasmidi pMP 311, joka sisälsi ENDO II - cDNA:n oikeassa asemassa, siirrettiin hiivaan, kuten aikaisemmin on kuvattu, jolloin saatiin kanta VTT-RC-84013.
Hybridihiivakantoien kasvattaminen se1lu1olyyttisten entsyymien CBH I, CBH II ia ENDO II tuottamiseksi
Kantaa VTT-RC-84001, jossa oli YEpNP03, kasvatettiin hiivan minimialustalla, joka sisälsi leusiinia ja urasiilia, kolme päivää, minkä jälkeen lisättiin täydellistä alustaa (1/3 tilavuus), jotta solut jakautuisivat vielä kerran.
is 86745
Kantoja VTT-RC-84011 (CBH I - cDNA), VTT-RC-84012 (CBH II -cDNA) ja VTT-RC-84013 (ENDO II - cDNA) kasvatettiin hiivan minimialustalla, joka sisälsi arginiiniä, histidiiniä ja adeniiniä, kolmen päivän ajan, minkä jälkeen lisättiin täydellistä alustaa 1/3 tilavuudessa, jotta solut jakautuisivat vielä kerran. Viljelmien lopullinen tilavuus on noin 150 ml.
Eri fraktioiden valmistaminen entsyymiaktiivisuuden sijainnin analysoimiseksi
Hybridihiivaviljelmistä valmistettiin kolme fraktiota entsyymiaktiivisuuden analyysia varten. Fraktio 1 sisälsi kasvualustaa ilman soluja. Fraktio 2 sisälsi supernatanttia, joka jäi jäljelle, kun protoplasti oli pelletoitu, ja fraktio 3 sisälsi supernatanttia lysoiduista protoplasteista.
Viljelemisen jälkeen hiivasolut kerättiin sentrifugoimalla ja supernatantti otettiin talteen (Fraktio 1). Saatu pelletti pestiin kahdesti tislatulla vedellä ja 1,2 M sorbitolilla. Sitten pelletti uudelleensuspendoitiin protoplastipusku-riin (1,2 M sorbitolia, 10 mM Tris ja 10 mM CaCl, pH 7,6) ja lisättiin Zymolyase 60 000 pitoisuutena 30 pg/ml protoplas-tointisuspensiota. Suspensiota inkuboitiin vesihauteella 37°C:11a 60 minuuttia varovasti sekoittaen. Näin muodostuneet protoplastit pelletoitiin ja saatu supernatantti (peri-plasminen solunsisältö) (Fraktio 2) otettiin talteen entsyymiaktiivisuuden määrityksiä varten. Joissakin tapauksissa fraktio 1 ja 2 konsentroitiin ultrasuodattamalla (Amicon). Protoplastipelletit pestiin kylmällä 1,2 ml sorbitolilla ja uudelleensuspendoitiin 1,2 ml:aan 5 mM sitraattipuskuria, pH
5,0, pelletoitiin ja supernatantti otettiin talteen (Fraktio 3).
i6 86745
Hybridihiivoien tuottaman sellulaasientsvvmin aktiivisuuden mittaus 1. CBH I -aktiivisuus VTT-RC-84001:stä
Kolme eri fraktiota testattiin CBH I -entsyymiaktiivisuuden suhteen käyttäen amorfista kuulamyllyllä jauhettua selluloosaa, jota ainoastaan sellobiohydrolaasit hajottavat (44). Näytteiden kokonaisproteiinipitoisuus oli noin 300 g/ml. Aktiivisen sellobiohydrolaasientsyymin aiheuttama substraatin hydrolyysi mitattiin seuraamalla absorbanssin muutosta aallonpituudella 620 nm. CBH I -tyyppinen aktiivisuus esiintyi ainoastaan fraktiossa 2, periplasmisessa tai intra-muraalisessa tilassa.
Kuviossa 10 on esitetty hiivakannan VTT-RC-84001 tuottama CBH I -entsyymiaktiivisuus, joka emtsyymi erittyi intramu-raaliseen tilaan verrattuna kontrollihiivaan, joka sisälsi ainoastaan vektorin p3030 DNA ja 1 pg Trichoderma - CBH I:tä. Tästä kuviosta nähdään, että hybridihiivakanta tuottaa aktiivista CBH I:tä, joka näyttää olevan vähintään yhtä resistentti inkuboimiselle 50°C:ssa kolmen päivän ajan kuin natiivientsyymi. Hiivan tuottama CBH I edustaa 1-2 % intra-muraalisen tilan proteiinin proteiinista.
Koska homeen intronisekvenssit ovat erilaisia kuin hiivan intronisekvenssit, ei ole todennäköistä, että hiiva poistaisi homegeenin intronit. Todennäköisesti tästä syystä kro-mosomaalisen geenin tuote jää hiivan periplasmiseen tilaan eikä erity solusta kuten cDNA-sekvessin koodaama tuote. Tämä tulos viittaa siihen, että siirrettäessä CBH I:tä koodaava kromosomaalinen geeni hiivaan, saadaan aikaan pienemmän proteiinin tuottaminen, jolla kuitenkin on samantyyppinen aktiivisuus kuin täyspitkällä sellulaasilla.
86745 2. CBH I -aktiivisuus VTT-RC-84011:stä
Kolme eri fraktiota testattiin CBH I -entsyymiaktiivisuuden suhteen kuten juuri on kuvattu. Kuitenkin tässä tapauksessa suurin osa CBH I -tyyppisestä aktiivisuudesta löytyi kasva-tusliuoksesta. Tulokset lopullisella proteiinikonsentraa-tiolla 5 pg/ml hydrolyysin aikana ovat hyvin samanlaiset kuin on esitetty kuviossa 10. Tällä rakenteella tuotettu CBH I -entsyymi edusti 1-5 % kokonaissoluproteiinista.
3. CBH II -aktiivisuus VTT-RC-84012:sta
Kolmesta eri fraktiosta testattiin sellobiohydrolaasiaktii-visuus, kuten on kuvattu kannan VTT-RC-84001 suhteen. Kuten kannalla VTT-RC-84011 suurin osa sellobiohydrolaasityyppi-sestä aktiivisuudesta löytyi kasvualustasta. Tulokset lopullisella proteiinikonsentraatiolla 10 pg/ml ovat samanlaiset kuin on esitetty kuviossa 10. Tällä rakennelmalla tuotettu CBH II -entsyymi edusti 1-5 % kokonaissoluproteiinista.
4. ENDO II -aktiivisuus VTT-RC-84013:sta
Kolme eri fraktiota testattin endoglukanaasiaktiivisuuden suhteen seuraamalla 0,1-prosenttisen β-glukaanin hydrolyysiä 50°C:ssa.
Viidessä minuutissa vapautuvat pelkistävät sokerit mitattiin glukoosina käyttäen dinitrosalisyylihappomenetelmää (45). Suurin osa ENDO II -aktiivisuudesta löytyi kasvualustaan erittyneenä. Tällä rakennelmalla tuotettu ENDO II -entsyymi edusti 1-5 % kokonaissoluproteiinista.
Katsotaan, että keksintö ja monet siihen liittyvät edut ovat ymmärrettävissä edellä esitetystä selityksestä ja että on ilmeistä, että erilaisia muutoksia voidaan tehdä kuvatun proteiinisynteesin menetelmän vaiheisiin ilman että kulkeudutaan pois tämän keksinnön hengestä ja piiristä tai uhrataan kaikki sen materiaaliset edut, joten edellä kuvattu menetelmä on lähinnä edullinen suoritusmuoto.
ie 86745 Lähdeluettelo 1. B.S. Montenecourt, 1983, Technol. in Biotechnology 1_, 156-161.
2. ENARI, T-M. Microbiol. Cellulases, p. 183-223. In: Microbiol. Enzymes and Biotechnologes. William M. Fogarty (ed.). Applied Science Publishers, London and New York.
3. Shoemaker, S.P. and Brown, R.D. Jr. (1978a) Biochim. Biophys. Acta 523, 133-146.
4. Shoemaker, S.P. and Brown, R.D. Jr. (1978b) Biochim. Biophys. Acta 523, 147-161.
5. Fägerstam, L. and Petterson, L.G. (1979) FEBS Lett. 98, 363-367.
6. Fägerstam, L. and Petterson, L. G. (1980) FEBS Lett. 119, 97-100.
7. Sprey, B. and Lambert, C. (1983) FEMS Microbiol. Lett.
18, 217-222.
8. Chanzy, H., Henrissat, B., Vuong, R. and Schulein, M. (1983) FEBS Lett. 153, 113-118.
9. Nummi, M., Niku-Paavola, M.L., Lappalainen, A.,
Enari, T.M. and Raunio, V. (1983) Biochem. J. 215, 677-683. 1
Il
Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. and Innis, M. (1983) Biotechnol. 1. 691-696.
i9 36745 11. Teeri, T., Salovuori, I. and Knowles J. (1983), Bio-technol. 1, 696-699.
12. Penttilä, M.E., Nevalainen, K.M.H., Raynal, A. and Knowles, J.C.K. 1984: Molec., Gen. Genetics, in press.
13. Hitzeman, R.A., F.E. Hagie, H.L. Levine, D.V. Goeddel, G. Aminerer & B.D. Hall: Expression of a human gene for interferon in yeast. Nature 293, 717-722 (1981).
14. Valenzuela, P.,A. Medina, W.J. Rutter, G. Aminerer & B.D. Hall: Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast. Nature 298, 347-350 (1982 ) .
15. Mellor, J., M.J. Dobson, M.A. Roberts, M.F. Tuite, J.S. Lmtage, S. White, P.A. Lowe, T. Patel, A.J.
Kingsman & S.M. Kingsman: Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharorayces cerevisiae. Gene 24 (1983): 1-14.
16. K.K. Thomsen, 1983, Carlsberg Res. Commun. 48 p.
545-555.
17. Mandels, M., Weber, J. and Parrek, R. (1971) Appi. Microbiol. 21_, 152-154.
18. Nevalainen K.M.H. 1981: Appi. Environ. Microbiol. 41: 595-596.
19. Karn, J., Brenner, S., Barnett, L., and Cesaveni, G.
1980. Novel bacteriophage λ cloning vector. Proc. Natl. Acad. Sci. 77:5172-5176.
20. Messing, J., Crea, R., and Seeburg, P.H. 1981. A system lor shotgun DNA soguoncing. Nucleic: Acids Kes. 9: 309-321.
2o 867 45 21. Vieira, J. and Messing, J. 1982: Gene 19:259-268.
22. Boy-Marcotte, E., Jaquet, M, (1982) A dictyostelium discoideum DNA fragment complements a Saccharomyces cerevisiae ura3 mutant. Gene 20:433-440.
23. Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, N.A., Tuite, M.F., Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A., Patel, T.,
Kingsman, A.J. and Kingsman, S.M. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene 24: 1-14.
24. Sherman, F., Fink, G.R. and Hicks, J.B. 1981. Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory,
New York. p. 62.
25. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1982. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
26. Bailey, M.J. and Nevalainen, K.M.H. 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase. Enzyme Microb. Technol. 3:153-157.
27. Sumner, J.B. and Somers, G.F. (1949) in Laboratory experiments in biological chemistry 2nd ed. pp. 38-39, Academic Press, New York.
28. Ohi, S., and Short, J. 1980. A general procedure for preparing messenger RNA from eukaryotic cells without using phenol. J. Appi. Microbiol. 2:398-413.
29. Aviv, H. and Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. 69 1408-1412.
21 86 745 30. Pelham, H.R.B. and Jackson, R.J. (1976) Env. J. Biochem. 67 pp. 247-256.
31. Dobberstein, B., Garoff, H. and Wawen, G. (1979) Cell 17, 759-769.
32. Laemmli, U. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
33. Hautala, J.A., Corner, B.H., Jacobson, J.W., Patel, G.L. and Giles, N.H. 1977. Isolation and characterization of nuclei from Neurospova erässä. J. Bacterial. 130: 704-713.
34. Benton, W.D. and Davis, R.W. 1977. Screening λ gt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. Science 196:180-182.
35. Efstradiatis, A., Kafatos, F.C., Haxara, A.M. and Maniatis, T. 1976. Enzymatic in vitro synthesis of globin genes. Cell 7:279-288.
36. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467.
37. Deiniger, P.L. 1983: Anal. Biochem. 129: 21b-223.
38. Gerbaud, C., Faurnier, P., Blanc, H., Aigle, M.,
Heslot, H. and Guerinau, M. 1979. Gene 5^:233-253.
39. Sherman F. Fink, G.R. and Hicks, J.B. 1981: Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 77-80.
40. Southern, E.M. 1975. J. Mol. Biol. 98: 503-517.
41. Hu, N. and Messing, S. 1982. Gene 17: 271-277.
22 86745 42. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. and Rutter, W.J. 1979. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299.
43. Gubler and Hoffman 1983: Gene 25:263 44. Nummi, M., Fox, P.C., Niku-Paavola, M.L., and Enari, T-M. 1981 Anal. Biochem. 116:133-136.
45. Kirsop, B.H. 1953: J. Inst. Brewing 59:378.

Claims (22)

  1. 23 86745 Patenttivaatiinukset
  2. 1. Eristetty tai geenitekniikalla valmistettu DNA-sekvens-si, tunnettu siitä, että se koodaa Trichoderma reeseistä peräisin olevaa sellulaasientsyymiä sellobiohyd-rolaasi II ja että se kykenee sopivasti ilmentämisvektoriin liitettynä ilmentämään proteiinia, jolla on sellulolyyttistä aktiivisuutta, kun se on transformoitu isäntäorganismiin vektorin avulla ja että mainittu DNA-sekvenssi koodaa seu-raavaa aminohapposekvenssiä: Met!leValGlyIlele'j7hrThrLeuAla7hr!.etjAla7hrleijAlaAlaSerValProLeuGluGluArgGlnAlaCysSerSerYal TrpGlyGlnCysGlyGlyGlnAsn7rp5erGlyProThrCysCysAlaSef-SlySerThrCysValTyrSerAsnAsp7yr7yrSerGln CysLeuProGlyAl aAl aSerSerSerSerSerlhrArgAl aAl aSerThrThrSerArgYal SerProThrThrSerA.-jSerSerSer AI aThrProProProGlySerThrThrThrArgValProProValGlySerGlyThrAlaThrTyrSerGlyAsnProPneYalGIyVal ThrProTrpAlaAsnAIaTyrTyrAlaSs^GluValSerSerl.euAlaneProSerLeuThrGlyAlartetAlaTnrÄlaAlaAlaAla ValAlaLysValP roSac7rpLeuAsp7iiri.euAspl.ys7hrProLeuMetGluG1 n7hrLe'jAlaAsp! 1 eAr:"nrAl aAsn LysAsnGlyGIyAsnTyrAlaGlyGl.iPheYalVa iTyrAspLeuProAsoArgAspCysAiaAlaLeuAlaSerAsnGiyGiuTyrSer 11 eA 1 aAspGly jly < a 1A1 aLy S*y r„y sAsn7y>-; IsAspThrI leArgGln! leVal V a 1G ϊ liTyrSerAsPi leAr; nrUeuLeu Vai: leGluProAssis-LeuAlaAs.iLeuVaKr.rÄsnLeuGlyThrProLysCysAlaAsnAlajlnSerAiaTyrLeujluCys: le AsnTy rAl aVal ThrG 1 nLe jAsnLeuProAs.-.ValAl aMetTyrLeuAspAl aGly.Hi sAl aG ly'rpLeyGlylrpP'-pA! aAsnGl n AspProAlaAlaGlni.euPneAlaAsnValTyrLysAsnAlaSerSerProArgAlai.euArgGlyLeuAlaThrÄsnValAlaAsnTyr AsnGlyT ppAsnlleThrSerProProSerTyrThrGlnGlyAsnAlaValTyrAsnGluLysLeuTyrneHisAUneGlyProleu LeuA 1aAsnHi sGlylrpSerAsnAlaPhePhe!le7hrAspG!nGlyArgSerGlyLysGlnProlhrGlyGInGlnGlnT rpGlyAsp 7p?CvsAsnVal 11 eG’.y'hrGly- neGly 11 eArgProSerAl aAsnYiirGlyAspSs^LiuLiuAspSerPfieValTrj/alLysPrp GlyG lyG1uCysAspGly7hrSerAsaSerSerAlaPrcArgPheAspSerHlsCysA1aleuP roAspA1aLsuGln?rpAla?roGln Ai aGlyAl a7rpPneGl nAl a7yr5neYalGlnliuLeii7nrAsnAlaAsn?poSep?nei.eu tai olennaisesti samanlaista aminohapposekvenssiä, jolla on sellobiohydrolaasi II:n entsymaattinen aktiivisuus. 24 86 745
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa sellobiohydrolaasi II:n aktiivisuutta ja että sillä on seuraava nukleotidijärjestys: CTTGTAAGATCACCCTCTGTGTATTGCACC ATGATTGTCGGCATTCTCACCACGCTGGCTACGCTGGCCACACTCGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAGCGGC'AAGCTTGtTCAAGCGTC TGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTÄrTCCAACGACTATTACTCCCAG TGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCC GCGACGCCTCCACCTGGTTCIACTACTACCAGAr.TACCICCAGTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTC ACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTnTGAAGTTAGCAOCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCTGCAfiCÄGCT GTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAAC AAGAATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGC6AATACTCT ATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAArAIAAGAACIATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAATATTCCGATATCCGGACCCTCCTG GTTATTGAGCCTGACrCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATC AACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGATGTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAA gacccggccgctcagctatttgcaaatgtttacaagaatgcatcgtctccgagagctcttcgcggattggcaaccaatgtcgccaactac AACGGGTGGAACATTACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACCTCTT CTTGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCäAGGTCGATCSGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGAC TGGTGCAATGTGATCGGCACCGGArTTGGTArTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCrGGATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCA ggcggcgagtgtgacggcaccagcgacagcagtgcgccacgatttgactcccactgtgcgctcccagatgccttgcaaccggcgcctcaa gctggtgcttggttccaagcctactttgtgcagcttctcacaaacgcaaacccatcgttcctgtaäggctttcgtgaccgggcttcaaac AATGATGTGCGATGGTGTGGTTCCCGGTTCGCGGAGTCTTTGTCTACrTTGGTTGTCTGTCGCAGGTCCGTAGACCGCAAATGAGCAACT GATG6ATTGTTGCCAGCGATACTATAATTCACATGGATGGTCTTTGTCGATCAGTAGGCTAGAGAGAGAGAGAGAACATCTATCCACAAT GTCGAGTGTCTATT tai olennaisesti samanlainen nukleotidisekvenssi, joka koodaa aminohapposekvenssiä, jolla on sellobiohydrolaasi II:n entsymaattinen aktiivisuus.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että DNA on Trichoderma Teeseistä peräisin oleva mRNA:n cDNA-kopio, joka koodaa sellobiohydrolaasi Uita. 1 2 I: Signaalisekvenssi, tunnettu siitä, että se ai 2 kaansaa proteiinimateriaalin erittymisen solun ulkopuolelle ja että se on Trichoderma Teeseistä peräisin oleva sellobio-
  5. 25 S 6 7 45 hydrolaasi II -entsyymin signaalisekvenssi, jolla on seuraa- va aminohapposekvenssi: MetlleValGlylleLeuThrThrLeuAlaThrLeuAlaThrLeuAlaAlaSerValProLeuGluGluArg
  6. 5. Eristetty tai geenitekniikalla valmistettu DNA-sekvens-si, tunnettu siitä, että se koodaa Trichoderma Teeseistä peräisin olevaa sellulaasientsyymiä endoglukanaasi II ja että se kykenee sopivasti ilmentäinisvektoriin liitettynä ilmentämään proteiinia, jolla on sellulolyyttistä aktiivisuutta, kun se on transformoitu isäntäorganismiin vektorin avulla ja että mainittu DNA-sekvenssi koodaa seuraavaa aminohapposekvenssiä : MetAl*ProSerValThrLeuProleuThrThrAI ai leleuAl alieAIaArgleuValAlaAl «GlnGInProGlyThrSerThrPro GluValHIsProlysLeuThrThrTyrlysCysThrLysSerGlyGlyCysValAlaGlnASpThrSerValValLeuAspTrpAsnTyr ArgT rpMetHi sAspAlaAsnTyrAsnSerCysThrValAsnGlyGlyValAsnThrThrLeuCysProAspGluAlaThrCysGlyLyl AsnCysPhelleGl nGlyValAlpTyrAl *A1 aSerGlyValThrThrSerGlySerSerLeuThrtletAsnGI nTyrMetProSerSer SerGlyGlyTyrSerSerValSerProArgLeuTyrleuleuAspSerAspGlyGliiTyrValMetleulyil.euAsnGlyGli»GluLeu SerPheAspValAspLeuSerAlaLeuProCysGlyGluAsnGlySerLeuTyrleuSerGInMetAspGluAsnGlyGlyA)aAsnGln TyrAsnThrAlaGlyAlaAsnTyrGlySerGlyTyrCyiAspAlaGInCysProValGInThrT rpArgAsnGlyThrteuAsnThrSer H<sGlnGlyGlnGlyPheCysCysA$nGluWetAspIleLeuGluGlyAsn$erArgAl»AsnAl*LeulhrProHisSerCysThrA1a ThrAlaCysAspSerAlaGlyCysGlyPbeAsnProTyrGlySerGlyTyrLysSerTyrTyrGlyProGlyAspThrValAspThrSer LysThrPheThrIleileThrGlnPheAsnThrAspAsnGtySerProSerGlyAsnLeuValSerlleThrArgLysTyrGln...... VaJAspIleProSerAlaGlnProGlyGIyAspThrlleSerSerCysProSerAlaSerAlaTyrGlyGlyleuAlaThrMetGIyly* AlaLeuSerSerGlyMetValLeuValPheSerlleTrpAsnAspAsnSerGlnTyrttetAsnTrhLeuAspSerGlyAsnAlaGlyPro CysSerSerThrGluG1yAsnPro$erAsrtl)el.euAlaAsr»AsnProAsnThrHIsV4lYelPheSerAsnIleArgTrpG1yAspI1e GlySerThrThrAsnSerThr...............SerSerThrThrSerSerSerProSerCy sThrG I nThrHt sTrpG lyGI nCy s GlyGlylleGIyTyrSerGlyCysLysThrCysThrSerGlyThrThrCysGlnTyrSerAsnAspTyrTyrSerGInCyiLeuxxx tai olennaisesti samanlaista aminohapposekvenssiä, jolla on endoglukanaasi II:n entsymaattinen aktiivisuus. 1 Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa endoglukanaasi II:n aktiivisuutta ja että sillä on seuraava nukleotidisekvenssi: 26 867 45 CCCCCCTATCTTAGTCCTTCTTGTTGTCCCAAA ATGGCGCCCTCAGTTACACTGCCGTTGACCACGGCCATCCTGGCNATTGCCCGGCTCGTCGCCGCCCAGCAACCGGGtÄCtAGCACCCCC GAGGTCCATCCCAAGTTGACAACCTACAAGTGTACAAAGTCCGGGGGGTGCGTGGCCCAGGACACCTCGGTGGTCCTTGACTGGAACTAC CGCTGGATGCACGACGCAAACTACAACTCGTGCACCGTCACCGGCGGCGTCAACACCACGCTCTGCCCTGACGAGGCGACCTGTGGCAAG AACTGCTTCATCCAG6GCGTCGACTACGCCGCCTCGGGCGTCACGACCTCGGGCAGCAGCCTCACCATGAACCAGTACATGCCCAGCAGC tctggcggctacagcagcgtctctcctcggctgtatctcctggactctgacggtgagtacgtgatgctgaagctcaacggccaggagctg AGCTTCGACrr.TCGÄCtTCTCTGCTCTGCCGTGTGGAGAGAACGGCTCGCTCTACCTGTCTCAGATGGACGAGAACGGGGGCGCCAACCAG TATAACACGGCCGGTGCCAACTACGGGAGCGGCTACTGCGATGCTCAGTGCCCCGTCCAGACATGGAGGAACGGCACCCTCAACACTAGC CACCAGGGCCAGGGCTTCTGCTGCAACGAGATGGATATCCTGGAGGGCAACTCGÄGbGCGAATGCCTTGACCCCTCACTCTTGCACGGCC ACGGCCTGCGACTCTGCCGGTTGCGGCTTCAACCCCTATGGCAGCGGCTACAAAAGCTACTACGGCCCCGGAGATACCGTTGACACCTCC aacaccttcaccatcatcacccagttcaacacggacaacggcicgccctcgggcaaccttgtgagcatcacccgcaagtaccagxxxxxx GTCGACATCCCCAGCGCCCAGCCCGGCGGCGACACCATCTCGTCCTGCCCGTCCGCCTCAGCCTACGGCGGCCTCGCCACCATGGGCAAG GCCCTGAGCAGCGGCATGGTGCTCGTGTTCAGCArTTGGAACGACAACAGCCAGTACATGAACTGGCTCGACAGCGGCAACGCCGGCCCC TGCAGCAGCACCGAGGGCAACCCATCCAACATCCTGGCCAACAACCCCAACACGCACGTCGTCTTCTCCAACATCCGCTGGGGAGACATT GGGTCTACTACGAACTCGACT....x......x..GAGCTCGACGACTTCGAGCAGCCCGAGCTGCACGCAGACTCACTGGGGGCAGTGC ggtggcattgggtacagcgggtgcaagacgtgcacgtcgggcactacgtgccagtatagcaacgactactactcgcaatgcctttagagc GTTGACTTGCCTCTGGTCTGTCCAGACGGGGGCACGATAGAATGCGGGCACGCAGGGAGCfCGTAGACATTGGGCTTAATATATAAGACA tgctatgttgtatctacattagcaaatgacaaacaaatgaaaaagaacttatcaagc tai olennaisesti samanlainen nukleotidisekvenssi, joka koo-daa aminohapposekvenssiä, jolla on endoglukanaasi II:n ent-symaattinen aktiivisuus.
  7. 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että DNA on Trichoderina reeseistä peräisin oleva mRNA:n cDNA-kopio, joka koodaa endoglukanaasi II:ta.
  8. 8. Signaalisekvenssi, tunnettu siitä, että se aikaansaa proteiinimateriaalin erittymisen solun ulkopuolelle ja että se on Trichoderma reeseistä peräisin oleva endoglukanaasi II -entsyymin signaalisekvenssi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: MetAlaProSerValThrLeuProLeuThrThrAlalleLeuAlalleÄlaArgLeuValAlaÄlaGln 27 86745
  9. 9. Rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 tai 5-7 mukaisen DNA-sekvenssin tai patenttivaatimuksen 4 tai 8 mukaisen signaalisekvenssin mainitun plasmidin ollessa kykenevä replikoituinaan ja ilmentymään hiivassa.
  10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että patenttivaatimusten 1-3 mukainen DNA-sekvenssi on liitetty plasmidiin pMA 91.
  11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että mainittu plasmidi on pMP 29, jolla on kuvassa 8 esitetty restriktiokartta.
  12. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että patenttivaatimusten 5-7 mukainen DNA-sekvenssi on liitetty plasmidiin pMA 91.
  13. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että plasmidi on pMP 311, jolla on kuvassa 9 esitetty restriktiokartta.
  14. 14. Rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että sellobiohydrolaasi I:tä koodaava kromosomaalinen geeni on liitetty plasmidin p3030 Pst I:n restriktioentsyymillä avattuun kohtaan ja että plasmidi on YEpNP03, jolla on kuvassa 4 esitetty restriktiokartta.
  15. 15. Rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että sellobiohydrolaasi I:tä koodaava cDNA-sekvenssi on liitetty plasmidin pMA 91 Bgl II:n restriktioentsyymillä avattuun kohtaan ja että plasmidi on pMP 11, jolla on kuvassa 7 esitetty restriktiokartta.
  16. 16. Patenttivaatimusten 9-15 mukainen rekombinantti DNA-plasmidi, tunnettu siitä, että mainittu plasmidi on kykenevä replikoituinaan ja ilmentymään suvussa Saccharomy-ces. 28 b 6 7 4 5
  17. 17. Hiivakanta, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 9-16 mukaisen rekombinant-ti DNA-plasmidin.
  18. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen hiivakanta, tunnettu siitä, että mainittu hiivakanta on suvun Saccha-romyces jäsen.
  19. 19. Patenttivaatimusten 17 ja 18 mukainen hiivakanta, tunnettu siitä, että mainittu hiivakanta on: S. cerevisiae VTT-RC-84001 (NCYC R 128), plasmidi YEpNP03, S. cerevisiae VTT-RC-84011 , plasmidi pMPll, S. cerevisiae VTT-RC-84012 , plasmidi pMP29, S. cerevisiae VTT-RC-84013 , plasmidi pMP311.
  20. 20. Menetelmä patenttivaatimuksen 9, 14 tai 15 mukaisen rekombinantti DNA-plasmidin rakentamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 tai 5-7 mukaisen DNA-sekvenssin tai patenttivaatimuksen 4 tai 8 mukaisen signaalisekvenssin liittämisen plasmidiin, joka kykenee replikoituinaan ja ilmentymään hiivassa tai sellobiohydrolaasi I:tä koodaavan kromosomaalisen geenin liittämisen plasmidiin p3030 tai sellobiohydrolaasi I:tä koodaavan cDNA-sekvenssin liittämisen plasmidiin pMA 91.
  21. 21. Menetelmä patenttivaatimuksen 17 mukaisen hiivakannan rakentamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä käsittää hiivakannan transformoimisen yhdellä tai useammalla patenttivaatimuksen 9-16 mukaisella rekombinantti DNA-plasmidilla.
  22. 22. Menetelmä homeperäisten sellulaasientsyymien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä käsittää patenttivaatimuksen 17 mukaisten hiivakantojen viljelemisen olosuhteissa, joissa kannat tuottavat näitä entsyymejä, ja entsyymien talteenottamisen. 29 86745 Patervtkrav
FI864110A 1984-04-13 1986-10-10 Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa FI86745C (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI864110A FI86745C (fi) 1984-04-13 1986-10-10 Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI841500 1984-04-13
FI841500A FI841500A0 (fi) 1984-04-13 1984-04-13 Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
PCT/FI1985/000039 WO1985004672A1 (en) 1984-04-13 1985-04-12 Yeast strains producing cellulolytic enzymes and methods and means for constructing them
FI8500039 1985-04-12
FI864110A FI86745C (fi) 1984-04-13 1986-10-10 Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa
FI864110 1986-10-10

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI864110A FI864110A (fi) 1986-10-10
FI864110A0 FI864110A0 (fi) 1986-10-10
FI86745B FI86745B (fi) 1992-06-30
FI86745C true FI86745C (fi) 1992-10-12

Family

ID=8518918

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI841500A FI841500A0 (fi) 1984-04-13 1984-04-13 Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
FI864110A FI86745C (fi) 1984-04-13 1986-10-10 Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI841500A FI841500A0 (fi) 1984-04-13 1984-04-13 Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.

Country Status (8)

Country Link
US (3) US4894338A (fi)
EP (2) EP0214971B1 (fi)
AT (1) ATE121132T1 (fi)
CA (1) CA1305931C (fi)
DE (1) DE3588008T2 (fi)
DK (1) DK580385D0 (fi)
FI (2) FI841500A0 (fi)
WO (1) WO1985004672A1 (fi)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5320960A (en) * 1992-04-03 1994-06-14 Genencor International, Inc. Method of preparing solution enriched in xylanase using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt
US5472864A (en) * 1984-04-19 1995-12-05 Genencor International, Inc. Method of preparing solution enriched in EG III using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
US5610034A (en) * 1987-04-29 1997-03-11 Alko Group Ltd. Immunoglobulin production by trichoderma
JP2728531B2 (ja) * 1988-03-24 1998-03-18 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ セルラーゼ調製品
US5648263A (en) * 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
US5688290A (en) * 1989-10-19 1997-11-18 Genencor International, Inc. Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes
US5866382A (en) 1990-04-06 1999-02-02 Xyrofin Oy Xylose utilization by recombinant yeasts
US5168064A (en) * 1990-04-20 1992-12-01 The Regents Of The University Of California Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants
NL9001388A (nl) * 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
US5328841A (en) * 1990-10-05 1994-07-12 Genencor International, Inc. Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol
US5654193A (en) * 1990-10-05 1997-08-05 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton containing fabrics with cellulase
US5525507A (en) * 1990-10-05 1996-06-11 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton-containing fabric with cellulase composition containing endoglucanase component and which is free of all CBH I component
WO1992006221A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-16 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
WO1992006183A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-16 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
ES2170748T3 (es) * 1990-10-05 2002-08-16 Genencor Int Procedimientos para el tratamiento de tejidos que contienen algodon con celulasa.
US5650322A (en) * 1990-10-05 1997-07-22 Genencor International, Inc. Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
US5475101A (en) * 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
US5246853A (en) * 1990-10-05 1993-09-21 Genencor International, Inc. Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I
CA2093422C (en) * 1990-10-05 2001-04-03 DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LOW CBH I CONTENT CELLULASE COMPOSITIONS
US5443750A (en) * 1991-01-16 1995-08-22 The Procter & Gamble Company Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
US5863783A (en) * 1991-03-27 1999-01-26 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
CA2107208A1 (en) 1991-03-29 1992-09-30 Kathleen A. Clarkson Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
US6512166B1 (en) 1991-06-17 2003-01-28 Cornell Research Foundation, Inc. Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound
JPH07506404A (ja) * 1992-05-01 1995-07-13 ジェネンコア　インターナショナル　インコーポレーテッド 綿含有織物をｃｂｈ　ｉが多いセルラーゼで処理する方法
FI92500C (fi) * 1993-03-03 1994-11-25 Valtion Teknillinen Menetelmä mekaanisen massan valmistamiseksi
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US7005128B1 (en) 1993-12-17 2006-02-28 Genencor International, Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it
US6268196B1 (en) 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US5912157A (en) * 1994-03-08 1999-06-15 Novo Nordisk A/S Alkaline cellulases
DE69534513T2 (de) * 1994-03-08 2006-07-27 Novozymes A/S Neuartige alkalische zellulasen
US7816129B2 (en) 1994-07-29 2010-10-19 Ab Enzymes Gmbh Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi
US6184019B1 (en) 1995-10-17 2001-02-06 Röhm Enzyme Finland OY Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6723549B2 (en) 1995-10-17 2004-04-20 Ab Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
AU7626196A (en) * 1995-11-27 1997-06-19 Unilever N.V. Enzymatic detergent compositions
US6127160A (en) * 1996-03-14 2000-10-03 Japan As Represented By Director General Of Agency Of Industrial Science And Technology Protein having cellulase activities and process for producing the same
US7465571B1 (en) 1996-05-22 2008-12-16 Verenium Corporation Endoglucanases
US5789228A (en) * 1996-05-22 1998-08-04 Diversa Corporation Endoglucanases
ATE299941T1 (de) 1996-09-12 2005-08-15 Syngenta Participations Ag Cellulolytische enzyme-exprimierende transgene pflanzen
US5981835A (en) * 1996-10-17 1999-11-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes
FI964691A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammasaettning foer behandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
FI964692A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammansaettning foer bioefterbehandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
US6001595A (en) * 1996-11-29 1999-12-14 Rohm Enzyme GmbH Promoters and uses thereof
US6818803B1 (en) 1997-06-26 2004-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes
CA2298885A1 (en) 1997-07-31 1999-02-11 Dsm N.V. Cellulose degrading enzymes of aspergillus
DE69827712T3 (de) * 1997-07-31 2009-07-09 Dsm Ip Assets B.V. Zusammensetzung für Brotverbesserung
US6222028B1 (en) 1999-10-15 2001-04-24 Academia Sinica Polynucleotides encoding cellulase enzymes from Piromyces rhizinflata
US6428996B1 (en) 1999-10-27 2002-08-06 Academia Sinica Cellulase enzymes
ES2266265T3 (es) * 2000-09-25 2007-03-01 Iogen Energy Corporation Metodo para la produccion de glucosa con una mezcla de celulosa que comprende una celulosa modificada.
AR036370A1 (es) 2001-08-27 2004-09-01 Syngenta Participations Ag Plantas con auto-procesamiento y partes de las mismas
WO2005096804A2 (en) * 2004-03-08 2005-10-20 Syngenta Participations Ag Self-processing plants and plant parts
US8012721B2 (en) * 2002-03-15 2011-09-06 Iogen Energy Corporation Method for glucose production using endoglucanase core protein for improved recovery and reuse of enzyme
US7348168B2 (en) * 2002-12-20 2008-03-25 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase II activity and polynucleotides encoding same
ATE447013T1 (de) * 2005-04-27 2009-11-15 Novozymes Inc Polypeptide mit endoglucanase-aktivtät und dafür codierende polynukleotide
AR065544A1 (es) * 2007-01-30 2009-06-17 Verenium Corp Enzimas para el tratamiento de lignocelulosicos acidos nucleicos que las codifican y metodos para prepararlas y usarlas
MX337942B (es) * 2011-01-26 2016-03-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de endoglucanasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
CN103620028B (zh) * 2011-01-26 2017-05-03 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2013016207A2 (en) * 2011-07-22 2013-01-31 California Institute Of Technology Stable fungal cel6 enzyme variants
US8778639B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US8771993B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanse activity and polynucleotides encoding same
FR3022558B1 (fr) * 2014-06-20 2019-01-25 Proteus Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
CN113322190B (zh) * 2021-06-24 2023-07-18 西北农林科技大学 里氏木霉与酿酒酵母混合发酵白酒糟生产单细胞蛋白的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4165974A (en) * 1973-03-16 1979-08-28 Goodwin George I Mold lubricant and method
US4275163A (en) * 1978-11-20 1981-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Cellulase-producing microorganism
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4394443A (en) * 1980-12-18 1983-07-19 Yale University Method for cloning genes
DK368882A (da) * 1981-08-25 1983-02-26 Alan John Kingsman Expessions vektorer
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
FR2529569B1 (fr) * 1982-07-02 1985-07-05 Pasteur Institut Microorganismes, notamment e. coli, transformes par une sequence d'adn originaire de c. thermocellum, compositions a activite cellulolytique issues de ces micro-organismes et procede pour les obtenir
CA1338400C (en) * 1983-08-31 1996-06-18 David H. Gelfand Recombinant fungal cellulases
US4794175A (en) * 1983-12-20 1988-12-27 Cetus Corporation Glucoamylase CDNA
WO1986000892A1 (en) * 1984-08-01 1986-02-13 Rudolf Biber New compounds having an immunizing activity

Also Published As

Publication number Publication date
EP0312121A3 (en) 1989-12-13
WO1985004672A1 (en) 1985-10-24
DE3588008D1 (de) 1995-05-18
FI841500A0 (fi) 1984-04-13
FI86745B (fi) 1992-06-30
EP0214971A1 (en) 1987-03-25
US4894338A (en) 1990-01-16
DK580385A (da) 1985-12-13
DK580385D0 (da) 1985-12-13
DE3588008T2 (de) 1995-10-12
FI864110A (fi) 1986-10-10
EP0312121A2 (en) 1989-04-19
US5393670A (en) 1995-02-28
CA1305931C (en) 1992-08-04
EP0214971B1 (en) 1995-04-12
FI864110A0 (fi) 1986-10-10
US5529919A (en) 1996-06-25
ATE121132T1 (de) 1995-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86745C (fi) Jaeststammar som producerar cellulolytiska enzymer och foerfarande och medel foer uppbyggande av dessa
Teeri et al. The molecular cloning of the major cellulase gene from Trichoderma reesei
EP0292609B1 (en) Process and signal sequence for the extracellular production of proteinaceous material
EP3421597B1 (en) Chrysosporium lucknowense protein production system
CA2097180C (en) Saccharification of cellulose by cloning and amplification of the .beta.-glucosidase gene of trichoderma reesei
JP2769305B2 (ja) トリコダーマにおいてタンパク質生成物を産生するための方法
US8497115B2 (en) Methods for producing secreted polypeptides
JPH08507695A (ja) Ｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの精製及び分子クローニング
Piontek et al. Two novel gene expression systems based on the yeasts Schwanniomyces occidentalis and Pichia stipitis
KR20020093932A (ko) 사상균 크리소스포리움 분야에서의 발현 조절 서열 및발현 생성물
EP3224356B1 (en) Methods for recombinant expression of beta-glucosidase gene
Wey et al. Molecular cloning and sequence analysis of the cellobiohydrolase I gene from Trichoderma koningii G-39
Kimura et al. Molecular cloning of xylanase gene xynG1 from Aspergillus oryzae KBN 616, a shoyu koji mold, and analysis of its expression
Moreau et al. Secretion of a Cryptococcus albidus xylanase in Saccharomyces cerevisiae
Minamiguchi et al. Secretive expression of the Aspergillus aculeatus cellulase (FI-CMCase) by Saccharomyces cerevisiae
WO1994000578A1 (en) Recombinant cellulases
Zhang et al. Construction of recombinant industrial Saccharomyces cerevisiae strain with bglS gene insertion into PEP4 locus by homologous recombination
Esteban et al. Cloning and characterization of the EXG1 gene from the yeast Yarrowia lipolytica
WO2019234294A1 (en) Beta glucosidase with high glucose tolerance, high thermal stability and broad ph activity spectrum
Kunze et al. Expression in yeast of a Bacillus alpha-amylase gene by the ADH1 promoter
Hatano et al. Expression of the carboxymethylcellulase gene, CMC1, from Cryptococcus flavus in Saccharomyces cerevisiae
Lee et al. Molecular Cloning and Expression of the Trichoderma harzianum C4 Endo-${\beta}-1$, 4-Xylanase Gene in Saccharomyces cerevisiae
US5766915A (en) Yeast strains producing cellulolytic enzymes and methods and means for constructing them
WO2019234295A1 (en) Beta glucosidase with high glucose tolerance, high thermal stability and broad ph activity spectrum
JP2003047471A (ja) 異種タンパク質の分泌生産に優れた改変酵母およびその酵母を用いた異種タンパク質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: R!HM ENZYME FINLAND OY

FG Patent granted

Owner name: ROEHM ENZYME FINLAND OY

MA Patent expired