FI84863C - Semikvantitativ eller kvalitativ immunometrisk testmetod och reagensfoerpackning. - Google Patents

Description

1 84863

Semikvantitatiivinen tai kvalitatiivinen immunomääritysmenetelmä ja reagenssipakkaus

Semikvantitativ eller kvalitativ immunometrisk testmetod och reagens förpackning

Keksinnön kohteena on semikvantitatiivinen tai kvalitatiivinen immunomääritysmenetelmä, jossa vasta-aineella tai antigeenillä päällystetyssä putkessa tai kuopassa suoritettavan immunologisen reaktion detektiossa käytetään hyväksi reaktiossa syntyvää värillistä lopputuotetta. Keksinnön kohteena ovat myös rea-genssipakkaukset, jotka soveltuvat keksinnön mukaisen määrityksen suorittamiseksi.

Immunometrisissä määrityksissä käytetään hyväksi määritettävälle antigeenille tai vasta-aineelle, eli analyytille spesifisiä vasta-aineita. Monoklonaalinen vasta-aine on yhden ainoan solun ja siitä peräisin olevan identtisen solulinjan tuottamaa homogeenista vasta-ainetta. Se tunnistaa antigeenistä vain yhden tietyn kohdan eli epitoopin, sen affiniteetti, proteiinikemiallinen puhtaus, isoelektrinen piste ja immuno-globuliinialaluokka voidaan määrittää. Polyklonaaliseen vasta-aineeseen verrattuna sen tärkein etu on ehdoton ja muuttumaton spesifisyys, rajaton saatavuus ja homogeenisuus. Immunometriset määritykset ovat yleistyneet monoklonaalisten vasta-aineiden yleistymisen myötä.

Immunometrinen määritys on mahdollinen, jos antigeenissä on vähintään kaksi epitooppia riittävän kaukana toisistaan. Näytteessä oleva määritettävä antigeeni tarttuu spesifisellä vasta-aineella päällystettyyn pintaan (muoviputki, pallo tai mikrotiitterilevy). Liuokseen lisätään joko yhtä aikaa näytteen kanssa tai pesujen jälkeen toista vasta-ainetta (tai samaa monoklonaalista vasta-ainetta, jos antigeenissä on repetitiivisiä epitooppeja), joka on leimattu jollakin tavalla. Leimattu vasta-aine tarttuu vain näytteessä olleisiin anti geeneihin, jotka ovat tarttuneet immobilisoituihin spesifisiin vasta-aineisiin. Jos leima on radioaktiivinen, 2 84863 kyseessä on immunoradiometrinen (IRMA) määritys, jos leima on entsyymi, on kyseessä immunoentsymometrinen (IEMA) määritys, jos leima on fluoresoiva, on kyseessä immunofluorometrinen (IFMA) määritys ja jos leima on luminoiva, kyseessä on immuno-luminometrinen (ILMA) määritys. Vastaavasti määrityksen lopuksi mitattava signaali on radioaktiivisuus, joka mitataan gamma- tai nestetuikelaskijalla, entsyymin substraatin valoa absorboiva (värillinen) tuote, joka mitataan fotometrillä, fluoresenssi, joka mitataan fluorometrillä, tai luminesenssi, joka mitataan luminometrillä.

Fluoresenssi ja luminesenssi voi olla peräisin suoraan leimatusta vasta-aineesta tai fluoresoivasta tai luminoivasta substraatista, jota mitataan läpinäkymättömissä kuopissa entsyymillä leimatun vasta-aineen kvantitoimiseksi. Tällaiset fluoresoivat substraatit herkistävät vastaavaa entsyymi-immunometristä määritystä jopa usealla kertaluvulla.

Nämä periaatteet ovat hyvin tunnettuja ja kirjallisuutta on alalta runsaasti saatavilla (ks. esim. Practical Immunoassay. The State of the Art. Toim. Wilfrid R. Butt, Marcel Dekker Inc., 1984, New York; Hemmilä, I., Dakubu, S. , Mukkala, V.-M. , Siitari, H., Lövgren, T., (1983), Europium as a label in time- resolved immunofluorometric assays, Anal. Biochem. 137: 335; ja Shalev, A., Greenberg, G. H. , McAlpine, P. J. , (1980),

Detection of „ ottograms of antigen by a high sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay (HS-ELISA) using a fluoro-genic substrate, J. Immunol. Methods, 38:125).

Fluoresenssia tai luminesenssia mitattaessa käytetään valkoisia tai mustia putkia tai mikrotiitterilevyjä ja erikoislait-teilla mitataan joko suoraan liuoksen fluoresenssi tai esimerkiksi reflektanssia. Kaikki tällaiset laitteet ovat eri-koislaitteita ja tarkoitettuja kvantitatiiviseen testiin.

Vastaavasti entsyymin substraatin värillinen tuote mitataan liuoksen absorbanssina läpinäkyvillä mikrotiitterilevyillä tai li 3 84863 putkilla. Absorbanssin mittaamiseksi käytetään fotometrisiä laitteita, jotka ovat myös tarkoitettuja kvantitatiiviseen testiin. Värillisen liuoksen kvantitointi visuaalisesti on vaikeata, koska kirkas läpinäkyvä seinämä on tehty kyvetiksi ja päästää valon hyvin läpi, niinkuin pitääkin, jos liuoksesta halutaan mitata absorbanssi.

Markkinoilla on myös valkoisiin suodattimiin perustuvia testejä, joissa antigeeni tarttuu valkoiselle suodattimelle sidottuun vasta-aineeseen, siihen lisätään toista vasta-ainetta, joka on leimattu entsyymillä, suoritetaan pesu ja lisätään substraattia, joka reaktiossa saostuu valkoiselle suodattimelle. Syntynyt täplä voidaan kvantitoida mittaamalla reflek-tanssi siihen soveltuvalla laitteella.

On lisäksi olemassa testejä, joissa käytetään värillistä vasta-ainetta tai värillisiä latex-partikkeleita, jotka kulkeutuvat valkoisella suodattimena tai suodattimen läpi ja pysähtyvät vasta-ainetta sisältävään kohtaan, mikäli näyte on sisältänyt antigeeniä. Tällaisen testin tulos on luettavissa visuaalisesti.

Immunometrisen testin kvantitatiiviseksi lukemiseksi tarvitaan kuitenkin yleensä erikoisia!tteita. Silti on olemassa lukuisia testejä, joiesa tuloksen tarkka kvantitatiivinen määritys erikoislaitteella ei ole olennainen, vaan koetulokseksi riittäisi semikvantitatiivinen tai jopa kvalitatiivinen määritys. Erityisen tarpeellista olisi saada aikaan nopea ja helppo semikvantitatiivinen määritys, jota voitaisiin käyttää laboratorioissa tai jopa kotioloissa, missä ei ole käytettävissä tavanomaisten menetelmien vaatimaa erikoislaitteistoa.

Näin ollen keksinnön mukaisesti on kehitetty oheisten patenttivaatimusten määrittelemä immunomääritysmenetelmä sekä reagenssipakkaus sen soveltamiseksi.

4 84863

Keksinnön kohteena on siten semikvantitatiivinen tai kvalitatiivinen immunomääritysmenetelmä, jossa immunologinen reaktio suoritetaan vasta-aineella tai antigeenillä tai näitä sitovalla aineella päällystetyssä putkessa tai kuopassa, jossa reaktiossa käytetty leimattu vasta-aine sitoutuu määritettävään analyyttiin ja reaktiossa syntyvän lopputuotteen suhteellinen pitoisuus määritetään liuoksesta. Tälle määritykselle on tunnusomaista, että määrityksessä käytettävät päällystetyt putket, kuoppalevyt tai mikrotiitterilevyt ovat vaaleita ja läpinäkymättömiä, edullisesti valkoisia, ja että reaktion detektointi suoritetaan visuaalisesti liuoksen näkyvällä aallonpituudella absorboivasta lopputuotteesta.

Keksinnön mukaan on yllättäen todettu, että jos absorbanssin mittaamiseksi tavanomaisesti käytetty testi suoritetaan läpinäkyvän kyvetin sijasta läpinäkymättömässä, edulliset! valkoisessa putkessa tai valkoisella mikrotiitterilevyllä, liuoksen värin intensiteetin arvionti on mahdollinen ilman erikois-mittauslaitteita visuaalisesti.

Keksintöä sovelletaan erityisesti entsyymi-immunologiseen määritykseen käyttämällä valkoisia putkia, kuoppalevyjä tai mikrotiitterilevyjä tai näiden osia, jotka on päällystetty määritettävälle analyytille spesifisellä aineella. Jos ana-lyytti on antigeeni, päällystävänä aineena toimii vasta-aine, edullisesti monoklonaalinen vasta-aine, ja vastaavasti jos määritettävä analyytti on vasta-aine, päällystävä aine on antigeeni. On myös mahdollista päällystää putket tai kuopat aineella, johon vasta-aine tai antigeeni ensin sitoutuu. Tällaisia aineita ovat esimerkiksi biotiini- ja avidiini-systeemi, niin että jompikumpi on putken seinämässä ja toinen liitettynä haluttuun, päällysteenä toimivaan vasta-aineeseen tai antigeeniin, joka lisätään putkeen testin yhteydessä tai ennen sitä. Visuaalisen detektoinnin lopputuotteena käytetään edullisesti spesifiseen vasta-aineeseen konjugoidun piparjuuri peroksidaasin (HRP) peroksidireaktion hapettamaa värillistä liuosta.

li 5 84863

Esimerkiksi hapettuneesta 2, 2' -atsinodi[3-etyylibentsotiat-solin-6-sulfonaatti]- eli ABTS-liuoksesta (käytettäessä per-oksidaasileimaa määrityksessä) valkoisessa läpinäkymättömässä kuopassa pystytään erottamaan absorbanssit noin 0,04 ja noin 0,06 toisistaan, kun taas kirkkaassa putkessa tai levyllä tarvitaan noin 0,30 absorbanssi, jotta visuaalisesti liuos pystyttäisiin erottamaan 0,04:stä.

Keksinnön mukaisessa määrityksessä käytetty läpinäkymätön putki tai mikrotiitterilevy estää tavanomaisen absorbanssi-mittauksen suorittamisen. Absorbanssi voidaan kuitenkin hieman vääristettynä mitata, mikäli osa liuosta siirretään tavanomaiseen läpinäkyvään kyvettiin tai kahden rinnakkaismäärityksen liuokset yhdistetään ja tästä puolet kvantitoidaan kyvetissä.

Keksinnön mukaisessa reagenssipakkauksessa käytetään vasta-aineella, antigeenillä tai näitä sitovalla aineella päällystettyä läpinäkymätöntä, edullisesti valkoista putkea, kuoppa-levyä tai mikrotiitterilevyä tai sen liuskaa, nk. "strippi-levyä", ja reagensseja, jotka saavat aikaan näkyvän valon aallonpituudella absorboivaa lopputuotetta sisältävää liuosta. Entsyymi-immunometrisessä määrityksessä reagenssina käytetään määritettävälle analyytille spesifistä, leimattua vasta-ainetta sekä leiman visualisointiin tarvittavaa reagenssia. Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa immunologinen testi, jossa vasta-aineen leima suoraan tuottaa värillisen reaktion ilman entsyymin välitystä.

Olennaista keksinnössä on, että testattavan näytteen sisältämän analyytin vaikutuksesta saadaan aikaan näkyvän valon aallonpituudella absorboivaa lopputuotetta sisältävä liuos siten, että analyyttipitoisuus voidaan detektoida kuopassa olevasta liuoksesta suoraan visuaalisesti kuopan pinnan vaaleata taustaa vasten ilman mitään erikoislaitteita.

6 84863

Keksinnön mukaisella reagenssipakkauksella on siten mahdollista suorittaa pikatesti, jonka tulos on visuaalisesti arvioitavissa.

Täten siis esimerkiksi fluoresenssimäärityksiin tarkoitettu valkoinen mikrotiitterilevy (esim. Dynatech Microfluor) päällystetään mono- tai polyklonaalisella vasta-aineella samalla tavalla kuin vastaava tavanomainen kirkas optisesti luettava mikrotiitterilevy (esim Nunc Maxisorp) ja suoritetaan IEMA-testi entsyymileimattua vasta-ainetta käyttäen, esim. HRP (piparjuuriperoksidaasi) tai AFOS (alkaalinen fosfataasi) konjugoiduilla vasta-aineilla. Substraattireaktio voidaan haluttaessa pysäyttää ja testin tulos eli näytteen sisältämä analyyttipitoisuus voidaan arvioida visuaalisesti vertaamalla näytteen substraatin tummuusastetta samassa määrityksessä tehtyihin standardeihin.

Standardeina käytetään edullisesti vastaavien reagenssien liuoksia, joiden pitoisuudet esimerkiksi raskaustestiä varten ovat +- tyyppiä, ja vastavasti bakteeri-infektion detektoimi-seksi muodostuvat sarjasta liuoksia, joiden pitoisuudet nousevat nollasta oletettuun huippuarvoon.

Entsyymi-immunologisessa testissä lopputuloksena putken tai kuopan seinämään on tarttunut vasta-aine-entsyymikonjugaattia, joka detektoidaan substraattiliuoksella, jonka tummuus (absor-banssi) on alkuperäisessä näytteessä olevan analyyttimäärän funktio. Tämä menetelmä on sovellettavissa periaatteessa kaikkiin pikatesteihin, joissa reaktion tulos luetaan visuaalisesti. Esimerkkejä tällaisista testeistä ovat raskaustesti (HCG-määritys), ovulaatiotesti (LH-määritys), TSH-määritys vastasyntyneiden kilpirauhashormoniseulontaan, C-reaktiivisen proteiinin määritys (CRP-testi) bakteeri-infektion osoittamiseen tai poissulkemiseen, mikrobitestit, esimerkiksi sukupuoliteitse tarttuvien tautien osoittamiseksi, vasta-ainetestit esimerkiksi virus- tai bakteeri-infektioiden osoittamiseksi.

7 84863

Parhaiten visuaalisesti luettavia värejä ovat sinivivahteiset värit. Tällöin HRP-entsyymin peroksidireaktion tuotteena hapettuviksi substraateiksi sopivat esimerkiksi sininen 3, 3' , 5, 5' -tetrametyylibentsidiini (TMB), vihreä 2, 2' -atsino- di(3-etyylibentsotiatsolin-6-sulfonaatti] (ABTS), alkaalisen fosfataasin substraatiksi sininen indoksyylifosfaatti. Myös orto-fenyleenidiamiinin (OPD) aiheuttaman punaruskean värin tummuusasteet näkyvät hyvin valkoista taustaa vasten. Muutkin värit ja/tai värierot näkyvät selvemmin valkoisessa kuopassa tai putkessa.

TMB: n sininen väri muuttuu reaktion lopettamiseen käytetyn vahvan hapon vaikutuksesta keltaiseksi. Keltaisen värin intensiteetti on kuopan valkoista taustaa vasten vaikeasti arvioitavissa. Sen sijaan myös keltainen väri voidaan detektoida visuaalisesti esimerkiksi vaalean sinisestä kuopasta. Pikatestissä reaktiota ei kuitenkaan välttämättä lopeteta lainkaan, ja tällöin TMB: n muodostamasta sinisestä väristä voidaan valkoisesta putkesta saada visuaalisesti hyvä semikvantita-tiivinen tulos.

Immunologisessa testissä voidaan värillinen reaktio eräissä tapauksissa saada aikaan myös ilman entsyymin välitystä. Tällöin vasta-aineen leima sinänsä tuottaa värillisen lopputuotteen, joka on visuaalisesti detektoitavissa. Keksinnön mukainen määritysmenetelmä voidaan suorittaa myös tällaisilla reagensseilla.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä sitä kuitenkaan millään tavalla rajoittamatta.

β 84863

Esimerkki 1: Raskaustesti Päällystettiin valkoisia polystyreenimikrotiitterilevyjä puskuriin laimennetulla HCG-vasta-aineella (5008, Medix Biochemi-ca) ja annosteltiin tätä liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annettiin levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa.

Seuraavana päivänä levyt pestiin 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitettiin 0.5% BSA (naudan seerumialbumiini) -liuoksella. Varastointia varten levyt kuivattiin lämpimässä ilmavirrassa ja pakattiin ilmatiiviisiin laminaattipusseihin. Tällä tavalla päällystettyjä levyjä voitiin käyttää euoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1. Pipetoitiin 50 μΐ 1: 40 laimennettua anti-HCG-leimaa (5503-HRP-leima, Medix Biochemica).

2. Pipetoitiin 50 μΐ näytettä tai standardia (0 ja 50 IU HCG/1 asianomaisiin kuoppiin.

3. Annettiin inkuboitua 5 min huoneen lämpötilassa.

4. Pestiin kuopat 3 kertaa vedellä.

5. Pipetoitiin 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta (Kirkegaard-Perry, 1-component ABTS, Cat. no. 50-66-00) joka kuoppaan.

6. Annettiin inkuboitua 5 minuuttia huoneen lämpötilassa.

7. Lopetettiin reaktio lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa.

8. Tarkasteltiin visuaalisesti näytteiden tummuutta verrattuna standardeihin ja arvioitiin niiden HCG-pitoisuus. Standardipistettä 50 IU HCG/1 tummempi väri tarkoittaa positiivista näytettä, väritön liuos negatiivista ja hieman väril- li 9 84863 linen liuos tarkoittaa todennäköisesti alkanutta raskautta, mutta testi on syytä uusia viikon kuluttua, jolloin tuloksen olisi oltava > 50 IU HCG/1 positiiviselle näytteelle.

Esimerkki 2: CRP-testi Päällystettiin valkoisia polystyreenimikrotiitterilevyjä laimennetulla CRP-vasta-aineella (6405, Medix Biochemica) ja annosteltiin liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annettiin levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa. Seuraavana päivänä levyt pestiin 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitettiin 0,5% BSA-liuoksella. Varastointia varten levyt kuivattiin lämpimässä ilmavirrassa ja pakattiin ilmatiiviisiin laminaattipussei-hin. Tällä tavalla päällystettyjä levyjä voitiin käyttää suoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1. Pipetoitiin 80 μΐ 1: 5 laimennettua anti-CRP-leimaa (6405-HRP-leima, Medix Biochemica).

2. Pipetoitiin 20 μΐ näytettä tai standardia (0,20, 40, 80 mg/1 CRP) 3. Annettiin inkuboitua 5 minuuttia huoneen lämpötilassa.

4. Pestiin kuopat 5 kertaa tislatulla vedellä.

5. Pipetoitiin 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta joka kuoppaan.

6. Annettiin inkuboitua 5 minuuttia huoneen lämpötilassa.

7. Lopetettiin reaktio lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa.

8. Tarkasteltiin visuaalisesti näytekuoppien substraatti-liuoksen tummuutta ja verrattiin standardikuoppien tummuuteen. Jos näyteliuos on tummempi kuin standardi 80 mg/1 on kyseessä 10 84863 todennäköisesti voimakas bakteeri-infektio, välillä 40-80 mg/1 todennäköisesti selvä bakteeri-infektio, 20-40 mg/1 todennäköisesti lievä bakteeri-infektio ja < 20 mg/1 on todennäköisesti normaalilöydös.

Esimerkki 3: LH-ovulaatiotesti Päällystettiin valkoisia polystyreenimikrotiitterilevyjä laimennetulla LH-vasta-aineella (5302, Medix Biochemica) ja annosteltiin liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annettiin levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa.

Seuraavana päivänä levyt pestiin 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitettiin 0. 5% BSA-liuoksella. Varastointia varten levyt kuivattiin lämpimässä ilmavirrassa ja pakattiin ilmatiiviisiin laminaattipusseihin. Tällä tavalla päällystet tyjä levyjä voitiin käyttää suoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1. Pipetoitiin 75 μΐ 1: 25 laimennettua anti-LH-leimaa (5301-HRP-leima, Medix Biochemica).

2. Pipetoitiin 25 μΐ standardeja, joiden LH-pitoisuus oli 0, 10 ja 20 U/l tai määritettävää näytettä.

3. 30 minuutin kuluttua kuopat pestiin 5 kertaa tislatulla vedellä.

4. Lisättiin 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta.

5. 15 minuutin kuluttua reaktio lopetettiin lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa.

8. Tarkasteltiin visuaalisesti näytekuoppien substraatti-liuoksen tummuutta ja verrattiin standardikuoppien tummuuteen. Jos näyteliuos on tummempi kuin standardi 20 IU LH/1 on Π 84863 kyseessä todennäköinen ovulaatiohuippu, välillä 10-20 IU LH/1 on kyse todennäköisesti nousevasta tai laskevasta ovulaatiohuipusta, alle 10 IU/1 ei todennäköisesti ole ovulaatiota.

Esimerkki 4: TSH-testi neonataaliseulontaan Päällystettiin valkoisia polystyreenimikrotiitterilevyjä laimennetulla TSH-vasta-aineella (5403, Medix Biochemica) ja annosteltiin liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annettiin levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa.

Seuraavana päivänä levyt pestiin 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitettiin 0. 5% BSA-liuoksella. Varastointia varten levyt kuivattiin lämpimässä ilmavirrassa ja pakattiin ilmatiiviisiin laminaattipusseihin. Tällä tavalla päällystettyjä levyjä voitiin käyttää suoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1. Pipetoitiin kuhunkin kuoppaan 25 μΐ (1:25) anti-HCG-leimaa (5503-HRP-leima, Medix Biochemica) 2. Pipetoitiin 50 μΐ näytettä tai standardia asianomaisiin kuoppiin.

3. Inkuboitiin 10 min huoneen lämpötilassa.

4. Pestiin kuopat 3 kertaa vedellä.

5. Pipetoitiin 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta.

6. Inkuboitiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa.

7. Lopetettiin reaktio lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa.

i2 8 4 8 63 8. Tarkasteltiin visuaalisesti näytekuoppien substraatti-liuoksen tummuutta ja verrattiin standardikuoppien tummuuteen. Jos näyteliuos on tummempi kuin standardi 50 mIU TSH/1 on todennäköisesti kyseessä hypotyreoosi, jos näyteliuos on vaaleampi kuin 50 mIU/Ι TSH-standardi, kyseessä on todennäköisesti normaalilöydös.

Esimerkki 5: Haiman amylaasitesti Päällystettiin valkoisia polystyreenimikrotiitterilevyjä laimennetulla pankreasamylaasi-vasta-aineella (6103, Medix Bio-chemica) ja annosteltiin liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annettiin levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa.

Seuraavana päivänä levyt pestiin 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitettiin 0. 5% BSA-liuoksella. Varastointia varten levyt kuivattiin lämpimässä ilmavirrassa ja pakattiin ilmatiiviisiin laminaattipusseihin. Tällä tavalla päällystettyjä levyjä voitiin käyttää suoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1. Levyn kuoppiin pipetoitiin 75 μΐ 1: 40 laimennettua anti-pankreasamylaasi-leimaa (6105-HRP-leima, Medix Biochemica).

2. Lisättiin asianomaisiin kuoppiin 25 μΐ standardeja 0 ja 250 nq/l tai näytettä.

3. 5 minuutin kuluttua kuopat pestiin 5 kertaa tislatulla vedellä.

4. Lisättiin 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta.

5. 5 minuutin kuluttua reaktio lopetettiin lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa.

l! 13 84 863 6. Tarkasteltiin visuaalisesti näytekuoppien substraatti-liuoksen tummuutta ja verrattiin standardikuoppien tummuuteen. Jos näyteliuos on tummempi kuin standardi 250 ug/l on kyseessä todennäköinen akuutti pankreatiitti ja < 250 yg/l on todennäköisesti normaalilöydös.

Esimerkki 6: Mikrobitesti Päällystetään valkoisia polystyreenimikrotiitterilevyjä laimennetulla Chlamydia-vasta-aineella ja annostellaan liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annetaan levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa.

Seuraavana päivänä levyt pestään 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitetään 0.5% BSA-liuoksella. Varastointia varten levyt kuivataan lämpimässä ilmavirrassa ja pakataan ilmatiiviisiin laminaattipusseihin. Tällä tavalla päällystettyjä levyjä voidaan käyttää suoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1· Pipetoidaan 80 μΐ 1:50 laimennettua Chlamydia vasta-ainetta, joka on konjugoitu HRP: hen.

2. Pipetoidaan 20 μΐ näytettä, negatiivista ja positiivista kontrollinäytettä asianomaisiin kuoppiin.

3. Annetaan inkuboitua 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.

4. Pestään kuopat 3 kertaa vedellä.

5. Pipetoidaan 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta joka kuoppaan.

6. Annetaan inkuboitua 10 minuuttia huoneen lämpötilassa.

7. Lopetetaan reaktio lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa.

i4 84863 8. Tarkastellaan visuaalisesti näytekuoppien substraatti-liuoksen tummuutta ja verrataan standardikuoppien tummuuteen. Jos näyteliuos on tummempi kuin positiivinen kontrolli on kyseessä todennäköisesti Chlamydia-infektio ja jos näyteliuos on yhtä vaalea kuin negatiivinen kontrolli, kyseessä on todennäköisesti normaalilöydös. Jos näyteliuos on tummempi kuin negatiivinen kontrolli, mutta vaaleampi kuin positiivinen kontrolli, kyse on mahdollisesta Chlamydia-infektiosta.

Esimerkki 7 Mikrobivasta-ainetesti Päällystettiin polystyreenimikrotiitterilevyjä laimennetulla bakteeriantigeeniliuoksella ja annosteltiin liuosta 150 μΐ/kuoppa. Annettiin levyn seistä yli yön huoneen lämpötilassa.

Seuraavana päivänä levyt pestiin 3 kertaa ja jäljellä olevat sitoutumispaikat peitettiin 0. 5% BSA-liuoksella. Varastointia varten levyt kuivattiin lämpimässä ilmavirrassa ja pakattiin ilmatiiviisiin laminaattipusseihin. Tällä tavalla päällystettyjä levyjä voitiin käyttää suoraan testin suorittamiseen.

Testin suoritus: 1. Pipetoitiin 20 μΐ bakteerivasta-ainetta sisältävää potilas- näytettä sarj alaimennoksina 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 ja 1:100000 tai negatiivista (puskuri)kontrollia asianomaisiin kuoppiin.

2. Lisättiin 80 μΐ määrityspuskuria kaikkiin kuoppiin.

3. Annettiin inkuboitua 1 tunti huoneen lämpötilassa.

4. Pestiin kuopat 5 kertaa pesupuskurilla.

5. Pipetoitiin 100 μΐ 1:2000 laimennettua Rabbit anti-human immunoglobulin-HRP leimaa (Dako P212, peroxidase conjugated I: 15 84863 rabbit immunoglobulins to human IgA, IgG, IgM, kappa, lamda) joka kuoppaan.

6. Annettiin inkuboitua 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.

7. Pestiin kuopat 5 kertaa pesupuskurilla.

8. Pipetoitiin 100 μΐ ABTS-substraattiliuosta joka kuoppaan.

9. Annettiin inkuboitua 10 min huoneen lämpötilassa.

10. Lopetettiin reaktio lisäämällä 50 μΐ 4% oksaalihappoa kaikkiin kuoppiin.

11. Verrattiin visuaalisesti potilasnäytelaimennosten antamaa väriä negatiiviseen kontrolliin. Asteittain laimennoksen mukaan vaalenevasta väristä voitiin päätellä vasta-ainetiit-terin olevan esim. välillä 1: 100 ja 1: 1000, eli potilasnäyte oli silloin todennäköisesti sisältänyt ao. antigeenille spesifisiä vasta-aineita.

Esimerkki 8: Vertailuesimerkki hapettuneesta ABTS-liuoksesta valkoisella levyllä verrattuna läpinäkyvällä levyllä mitattuun absorbanssiin

Tehtiin CRP-testi esimerkin 2 mukaisesti kahdella rinnakkaisella läpinäkyvällä mikrotiitterilevyllä. Kun reaktio oli lopetettu, yhdistettiin kahden rinnakkaisen kuopan sisältämät substraattiliuokset (300 μΐ) ja tästä siirrettiin 150 μΐ valkoiselle mikrotiitterilevylle. Mitattiin jäljelle jääneiden liuosten absorbanssit, tarkasteltiin visuaalisesti sekä valkoisilla mikrotiitterilevyillä että läpinäkyvillä mikrotiit-terilevyillä olevia liuoksia ja arvioitiin niiden tummuusaste.

ie 84863

Tulokset:

Visuaalinen arvio levyllä Standardipiste Absorbanssi Läpinäkyvä Valkoinen 0 mg/1 0,060 20 mg/1 0, 120 - ± 40 mg/1 0,202 - + 80 mg/1 0,368 + ++

Esimerkki 9: Vertailuesimerkki erivahvuisista ABTS-liuoksista

Tehtiin sarja tummuudeltaan erivahvuisista ABTS-liuoksista, joita pipetoitiin 150 μΐ valkoiselle levylle. Samoista liuoksista otettiin 100 μΐ absorbanssimittausta varten läpinäkyville levyille.

Tulokset:

Absorbanssi Visuaalinen arvio 0,044 0,043 0, 476 + + 0, 077 ± 0, 060 ± 0,043 0, 042 ϊ 0, 275 + 0, 058 ± 0, 058 t 0, 056 ± 0, 160 ♦ Näistä lukemista voitiin päätellä, että silmällä pystytään erottamaan absorbanssit 0, 043-0, 044 ja 0, 056-0, 060 toisistaan, kun mitattu tilavuus on 100 μΐ.

I;

Claims (10)

1. Semikvantitatiivinen tai kvalitatiivinen immunomääritys-menetelmä, jossa immunologinen reaktio suoritetaan vasta-aineella, antigeenillä tai näitä sitovalla aineella päällystetyssä putkessa tai kuopassa, jossa reaktiossa käytetty leimattu vasta-aine sitoutuu määritettävään analyyttiin ja reaktiossa syntyvän lopputuotteen pitoisuus määritetään liuoksesta, tunnettu siitä, että määrityksessä käytetään vaaleita ja läpinäkymättömiä, edullisesti valkoisia putkia tai kuoppia, joiden päällysteessä on mono- tai polyklonaalista vasta-ainetta tai antigeeniä, ja että immunologisen reaktion detektointi suoritetaan visuaalisesti putkessa tai kuopassa olevan liuoksen näkyvällä aallonpituudella absorboivasta lopputuotteesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi-immunologisessa määrityksessä käytetään valkoisia putkia, kuoppalevyjä tai mikrotiitterilevyjä tai näiden osia, joiden päällysteessä on määritettävälle analyy-tille spesifistä vasta-ainetta tai spesifistä vasta-ainetta sitovaa ainetta ja että visuaalisen detektoinnin lopputuote on HRP-peroksidireaktion hapettama värillinen ABTS-, TMB- tai OPD-liuos.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritettava testi on raskaustesti (HCG-määritys), ovulaatiotesti (LH-määritys), TSH-määritys vastasyntyneiden kilpirauhashormoniseulontaan, C-reaktiivisen proteiinin määritys (CRP-testi) bakteeri-infektion osoittamiseen tai poissulkemiseen, mikrobitesti tai vasta-ainetesti virus-tai bakteeri-infektion osoittamiseksi.

4. Reagenssipakkaus immunologista testiä varten, jossa pakkauksessa on vasta-aineella, antigeenillä tai näitä sitovalla aineella päällystetty putki, kuoppalevy tai mikrotiitterilevy tai sen osa sekä immunologisen reaktion vaatimat reagenssit, tunnettu siitä, ie 84863 - että pakkauksen sisältämät putket tai kuopat ovat vaaleita ja läpinäkymättömiä, edullisesti valkoisia, ja - että pakkaus sisältää määritettävälle analyytille spesifistä, leimattua vasta-ainetta sisältävää reagenssia sekä tarvittaessa leiman visualisoivaa reagenssia, jolloin reagens-sit on valittu siten, että testattavan näytteen sisältämän analyytin vaikutuksesta saadaan aikaan näkyvän valon aallonpituudella absorboivaa lopputuotetta sisältävä liuos.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että reagenssiliuoksen väri-intensiteetti on riippuvainen määritettävän analyytin pitoisuudesta näytteessä ja että pakkaus sisältää semikvantitatiivisen määrityksen vaatimat standardit.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että pakkaus sisältää entsyymi-immunologisen reaktion spesifistä leimattua vasta-ainetta ja leiman visualisoivaa reagenssia sekä edullisesti reaktion lopetus-reagenssia.

7. Patenttivaatimuksen 4, 5 tai 6 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että pakkaus sisältää valkoisen mikro-tiitterilevyn tai sen osan, joka on päällystetty määritettävälle analyytille spesifisellä vasta-aineella tai antigeenillä.

8. Patenttivaatimuksen 4, 5 tai 6 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että pakkauksen sisältämä kuoppa tai kuopat on päällystetty aineella, joka kykenee sitomaan määritettävälle analyytille spesifistä vasta-ainetta tai antigeeniä, jolloin pakkaus edullisesti sisältää myös päällystävään aineeseen sitoutuvaa spesifistä vasta-ainetta tai antigeeniä.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 4...8 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että leimattu reagenssi on suoritettavalle testille spesifistä, HRP-leimattua vasta-ainetta ja visuaalisesti detektoitavan lopputuotteen aikaan- i 19 84863 saava reagenssi on ABTS-, TMB- tai OPD-liuosta.

10. Patenttivaatimuksen 7 tai 9 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että kuopat on päällystetty spesifisellä vasta-aineella, joka on valittu seuraavista: HCG-vasta-aine raskaustestiä varten, CRP-vasta-aine CRP-testiä varten, LH-vasta-aine LH-ovulaatiotestiä varten, TSH-vasta-aine kilpirauhashormonin neonataaliseulontaa varten, pankreasamylaasi-vasta-aine haiman amylaasitestiä varten ja Chlamydia-vasta-aine Chlamydia-infektiotestiä varten. 20 8 4 863