FI79345C - Enzymprodukt innehaollande en -1,6-glukosidas och foerfarande foer framstaellning av denna. - Google Patents

Description

1 79345 α-1,6-glukosidaasin sisältävä entsyymituote ja menetelmä sen valmistamiseksi Tämä keksintö käsittelee entsyymejä, joiden avulla voidaan muuttaa tärkkelys entsymaattisesti sokereiksi. Tarkemmin sanottuna kyseessä oleva keksintö koskee uutta haaroittumista poistavaa entsyymiä, joka pystyy hydrolysoimaan a-1,6-glykosidi-sidoksia amylopektiinissä ja pullulaanissa. Tämä uusi entsyymi voidaan luokitella pullulanaasi-tyyppiä olevaksi haaroittumista poistavaksi entsyymiksi. Keksintö koskee myös menetelmää uuden haaroittumista poistavan entsyymin valmistamiseksi ja sen käyttöä muuttamaan tärkkelystä dekstroosia ja/tai maltoosia sisältäviksi tärkkelyshydro-lysaateiksi, kuten dekstroosi- ja maltoosisiirapeiksi.

Viimeisen vuosikymmenen aikana on täys-entsymaattinen tärkkelyksen hydrolyysi siirapeiksi saavuttanut yhä lisääntyvää käyttöä tärkkelystä jalostavassa teollisuudessa. Koko maailman laajuisesti arvioidaan nykyisen dekstroosi-siirappival-mistuksen entsymaattisesti tärkkelyksestä ylittävän 3 miljoonaa tonnia (laskettuna kuiva-aineesta) vuosittain verrattuna noin 0,4 miljoonaan tonniin kymmenen vuotta sitten.

Tärkkelyksen entsyymi-entsyyni-hvdrolyysissä tavallisesti sovellettava menetelmä käsittää peräkkäisinä vaiheina nes-teyttämisen ja sokeriksi muuttamisen, joista edellistä katalysoidaan α-amylaasin avulla, kuten lämpöstabiilin B.

(S) licheniformis α-amylaasin avulla, kuten esimerkiksi Termamyl, jota toimittaa Novo Industri A/S, Tanska, ja sokeroituminen dekstroosiksi (D-glukoosi) suoritetaan siten, että mukana on glukoamylaasia, joka on tavallisesti peräisin sienistä, kuten AMG-150 L, jota saadaan myös edellä mainitusta yhtiöstä. Dekstroosi-siirapin valmistaja pyrkii luonnollisesti saamaan mahdollisimman suuren dekstroosi-tuotoksen pienimmällä mahdollisella entsyymien ja energian kulutuksella.

Korkein dekstroositaso, johon voidaan päästä konventionaan- 2 79345 sen menetelmän avulla lähdettäessä 30-40-painoprosenttises-ta tärkkelyssuspensiosta ja sokeroiminen 30-prosenttisella kuiva-ainepitoisuudella (D.S.), on noin 96 paino-% dekstroo-sia (96 DX). Syyt, minkä vuoksi konventionaalinen tärkkelyksen muuttamisprosessi ei etene merkittävästi tämän rajan yli, ovat pääasiallisesti kahta laatua.

Ensiksi, amylopektiinillä (joka muodostaa noin 80 % useimmista teollisuudelle tärkeistä tärkkelyksistä, joihin kuuluu esimerkiksi maissi), on haarautunut ketjun rakenne, niin että se sisältää huomattavan määrän a-1,6-glykosidi-sidok-sia. a-amylaasi hajottaa vain osittain amylopektiiniä, sillä a-amylaasi on käytännöllisesti katsoen ilman a-1,6-glukosidaasi-vaikutusta, joten haarautuneiden oligosakkaridien, joihin kuuluvat α-rajadekstriinit, pääasiallinen hyd-rolyysi tapahtuu vasta seuraavassa sokeroitumisvaiheessa, jota katalysoi glukoamylaasi, joka hydrolysoi myös a-1,6-glykosidi-sidoksia. Jälkimmäinen reaktio kuitenkin edistyy huomattavasti hitaammin kuin vastaava a-1,4-sidosten hydro-lyysi, mikä estää täydellisen sokeroitumisen. Yritykset parantaa tilannetta lisäämällä enemmän glukoamylaasia törmäävät toiseen jarruttavaan tekijään (paitsi korkeampia ent-syymikustannuksia), nimittäin glukoamylaasin kykyyn katalysoida myös dektroosi-polymeroitumista (ns. palautuva reaktio) .

Sivumennen on mainittava, että tärkkelyksen muuttumisen lisääntyminen noin 96 DX:stä noin 98 DX:ään (jota pidetään joissakin dekstroosin käyttötavoissa erittäin merkittävänä parannuksena), ja jonka seurauksena on ei-dekstroosi-konta-minanttien pitoisuuden väheneminen noin 50 prosentilla, voidaan saavuttaa käyttämällä suhteellisen korkeata gluko-amylaasi-tasoa sekä laimentamalla substraatti noin 15 %:iin D.S., kts. US-patenttia n:o 4 017 363. Mutta tämän jälkeen tapahtuva tällaisen dekstroosiliuoksen konsentroiminen tavanmukaisiin korkeampiin kuiva-ainepitoisuuksiin on energiaa kuluttavaa.

3 79345

Aikaisemmassa tekniikassa on ehdotettu glukoamylaasin ja haaroittumista poistavan entsyymin käyttämistä simultaani-sesti, jotta aikaansaataisiin huomattava dekstroositason kohoaminen, sillä perusteella, että haaroittumista poistavien entsyymien on osoitettu hydrolysoivan tehokkaasti spesifisiä a-1,6-glykosidisidoksia, joita esiintyy haarautuneen ketjun omaavissa oligosakkarideissa, ja joissakin alfa-rajadekstriineissä. Tämän suhteen viitataan US-patent-tiin n:o 3 897 305, joka tekee selkoa glukoamylaasin ja Aerobacter aerogenes (Klebsiella pneumoniae) pullulanaasin yhteiskäytöstä, jolloin saadaan aikaan huomattavaa, jopa 2 %:n lisäystä DX:ssä siirapeilla, jotka sisältävät ainakin 30 % D.S. Samanlaisia tuloksia on osoitettu glukoamylaasin ja muiden haaroittumista poistavien entsyymien, kuten esimerkiksi Pseudomonas amyloderamosa isoamylaasin yhteisvaikutuksesta, kuten on selostettu brittiläisessä patenttihakemuksessa n:o 8107287.

Mutta ensiksikään ei saavuteta lähes lainkaan glukoamylaasin säästöä, koska K. pneumoniae pullulanaasin pH-optimi tekee välttämättömäksi suorittaa sokeroituminen suhteellisen korkealla pH-arvolla (5,5-6), jolloin glukoamylaasin tehokkuus vähenee merkittävästi.

Sama probleema tulee vastaan isoamylaasin suhteen, jonka pH-optimi on paljon lähempänä glukoamylaasin vastaavaa, jolloin jälkimmäisen annostusta voidaan huomattavasti pienentää (noin 50 %:lla), samalla kun saavutetaan 1-2 %:n lisäys DX-arvossa. Mutta isoamylaasi-menetelmän vakava haitta (joka on tosiasiassa myös tunnetussa pullulanaasi-menetel-mässäkin) on alalla hyvin tunnettu haaroittumista poistavien entsyymien labiilisuus kuumuudessa. Tämä on merkinnyt sitä, että tähän asti ei ole ollut teknisesti mahdollista toteuttaa sokeroitumista haaroittumista poistavien entsyymien mukana ollessa yläpuolella 55°C, kun taas glukoamylaa-si itsessään on riittävän stabiili vielä yläpuolella 60°C, 4 79345 jossa lämpötilassa substraattien riski kontaminoitua mikrobeista on huomattavasti pienempi verrattuna alempiin lämpötiloihin.

Edellä selostetun kaltaisia haittoja on myös muutettaessa tärkkelystä runsaasti maltoosipitoiseksi siirapiksi g-amy-laasien avulla. Kuten a-amylaasit pystyvät g-amylaasit hajottamaan vain osittain amylopektiiniä, niin että sen hydro-lyysi pysähtyy, kun 1,6-a-haara on saavutettu. Kun yhdistetään g-amylaasin ja haaroittumista poistavan entsyymin vaikutukset, kuten esimerkiksi pullulanaasin tai isoamylaasin, voidaan saada huomattavaa lisäystä maltoosipitoisuudessa, kuten on selostettu brittiläisessä patentissa n:o 1 144 950 ja US-patentissa n:o 3 677 896. Mutta tällöinkään eivät sokeroitumislämpötilat yläpuolella 55°C ole mahdollisia haaroittumista poistavien entsyymien lämpölabiilisuuden vuoksi, jolloin bakteerisaastumisen riski siis lisääntyy huomattavasti.

Kyseessä olevan keksinnön kohteena on voittaa haaroittumista poistavien entsyymien tähän asti tunnetut puutteet hankkimalla aivan uusi haaroittumista poistava entsyymi, jonka lämpöstabiilisuus on verrattavissa glukoamylaasin vastaavaan ja jonka pH-optimi on lisäksi lähes sama kuin glukoamylaasin.

Keksintö perustuu siihen yllättävään keksintöön, että pul-lulanaasi-tyyppiä olevaa uutta haaroittumista poistavaa entsyymiä jolla on tällaiset ominaisuudet valmistaa vasta keksitty mikro-organismi, Bacillus-sukuun kuuluva, taksonomisesta ryhmästä, joka tullaan seuraavassa määrittelemään tarkemmin.

Kyseessä olevan keksinnön ensimmäisen aspektin mukaisesti kyseessä on siis uusi haaroittumista poistava entsyymi-aine, jonka sisältämä haaroittumista poistava entsyymi on pullulanaasi-tyyppiä ja jolla on seuraavat tyypilliset fysikaaliset ominaisuudet:

II

5 79345 a) sitä saadaan käymisliuoksesta, joka muodostuu viljel-täessä sopivassa ravinneväliaineessa taksonomisen ryhmän kantaa, jolle on annettu nimi Bacillus acidopullulyticus, b) sillä on sellaisia entsyymin kemiallisia ominaisuuksia, jotka ovat olennaisesti identtisiä, ja immunologisia ominaisuuksia, jotka ovat identtisiä tai osittain identtisiä haarautumista poistavan entsyymin vastaavien kanssa, joka entsyymi on johdettu Bacillus-kannasta NCIB 11607, c) sen vaikutusoptimi, mitattuna inkuboitaessa 30 min ajan asetaattipuskurissa (0,05 M) pH-arvolla 4-5 on vähintään noin 60°C, d) sen pH-optimi on välillä 3,5-5,5 mitattuna inkuboitaessa 30 min ajan asetaattipuskurissa (0,05 M) noin 60°C:ssa, ja e) sen jäännösaktiivisuus 72 h kuluttua lämpötilassa 60°C mitattuna dektroosiliuoksessa (30 % D.S. painosta) pH-arvolla 5 on ainakin 50 %.

Haaroittumista poistava entsyymiaine voi olla kiinteässä tai nestemäisessä muodossa ja sen aktiivisuus on tavallisesti noin 10-350 000 pullulanaasi-yksikköä/g (kuten seuraavassa tullaan määrittelemään tarkemmin).

Kyseessä olevan keksinnön parhaana pidetyssä toteutusmuodossa on haaroittumista poistavan entsyymiaineen aktiivisuus noin 100-15 000 pullulanaasiyksikköä/g.

Kyseessä olevan keksinnön toisena aspektina on menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa haaroittumista poistavaa entsyymiainetta, joka muodostuu haaroittumista poistavasta entsyymistä, jonka aktiivisuus on noin 60°C:ssa tai sen yläpuolella, pH-optimi pH-alueella 3,5-5,5 ja hyvä lämpö-stabiilisuus 60°C:ssa, ja menetelmä käsittää sen, että sopivassa ravinneväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpi-lähteet ja epäorgaanisia suoloja, viljellään haaroittumista 6 79345 poistavaa entsyymiä valmistavaa Bacillus-kantaa, joka kuuluu taksonomiseen ryhmään, jolle on annettu nimi Bacillus acidopullulyticus, jonka jälkeen seuraa mainitun haaroittumista poistavan entsyymiaineen talteenotto konventionaalisin keinoin.

Tämän keksinnön parhaana pidetyssä toteutusmuodossa haaroittumista poistavan entsyymiaineen valmistamiseksi valitaan Bacillus acidopullulyticus-kanta ryhmästä, johon kuuluvat NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11638 ja NCIB 11647. Kaikkein parhaina pidetyt kannat ovat NCIB 11538 ja NCIB 11647.

Erään toisen suositun toteutusmuodon mukaan Bacillus acidopullulyticus-kanta on NCIB 11611.

Erään toisen suositun toteutusmuodon mukaan Bacillus acidopullulyticus-kanta on NCIB 11636.

Erään toisen suositun toteutusmuodon mukaan Bacillus acidopullulyticus-kanta on NCIB 11637.

Erään toisen suositun toteutusmuodon mukaan Bacillus acidopullulyticus-kanta on NCIB 11639.

Vielä erään aspektin mukaan tämä keksintö tarjoaa menetelmän, jonka avulla voidaan muuttaa tärkkelys siirapeiksi, jotka sisältävät dekstroosia ja/tai maltoosia, jossa menetelmässä suoritetaan sokeroituminen, jota edeltää valinnanvaraisesti, mutta kuitenkin edullisimmin nesteyttämisvaihe, jolloin muodostuu tärkkelyshydrolysaattia siten, että mukana on entsyymisysteemi, joka muodostuu tehokkaista määristä uutta haaroittumista poistavaa entsyymiä, joka on määritelty edellä, ja sokeroitumista edistävää entsyymiä, joka valitaan ryhmästä glukoamylaasi ja β-amylaasi.

Tämän keksinnön mukaisen haaroittumista poistavan entsyymin

II

7 79345 parhaana pidetyssä käyttötavassa on tärkkelyshydrolysaatin kuiva-ainepitoisuus ainakin 30 paino-%, ja sen sokeroituminen suoritetaan pH-alueella 3,5-5,5 ja lämpötilavälillä 55°C-65°C ja edullisimmin ei yli 63°C:ssa. Parhaana pidetyt glukoamylaasin ja β-amylaasin annokset ovat vastaavasti välillä 0,05-0,5 AG-yksikköä ja välillä 0,005-0,3 β-amylaa-si-yksikköä, ja haaroittumista poistavan entsyymin parhaana pidetty annos on välillä 0,005-5 pullulanaasi-yksikköä (kuten seuraavassa tullaan määrittelemään) g kohti kuiva-ainetta tärkkelyshydrolysaatissa.

Vielä eräässä suositussa tavassa on sokeroimisentsyymi glukoamylaasi, jolloin tärkkelys muutetaan siirapiksi, jossa on korkea dekstroosipitoisuus.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Mikro-organismit

Eristäminen: keksinnön mukaista haaroittumista poistavaa entsyymiä valmistavat mikro-organismit valitaan niiden kyvyn mukaan kasvaa perusliuoksessa, joka valmistetaan aseptisesta seoksesta, joka sisältää yhtä suuret tilavuudet tryptoniliuosta (1 %) ja suolaliuosta, jolla on seuraava koostumus:

Suola Prosenttia (NH4)2S04 0,04

MgS04, 7H20 0,1

CaCl2, 2H20 0,05 KH2P04 0,6 ja suolaliuoksen pH säädetään arvoon 3 rikkihapon avulla (10 N) ennen steriloimista kuumentamalla. Lopullisen pe-rusliuoksen pH oli 4,8-5,2.

Valmistettiin agar-substraatteja perusliuoksesta, joka sisälsi pullulaania tai amylopektiiniä (0,5 %) joko hiiva-uutteen kanssa (1 %) tai ilman sitä. Inkubointi suoritettiin 8 79345 lämpötilassa 30°C-37°C. Pullulanaasin vaikutus havaittiin kirkastuvina alueina, joissa pullulaani oli saostettu peittämällä agarlevyt asetonilla. Amylopektiinin haarautunei-suuden poistuminen havaittiin hydrolyysialueina, jotka tulivat voimakkaan sinisiksi käytettäessä jodi-kaliumjodi-reagenssia.

Valittiin useita mikrobi-isolaatteja luonnon lähteistä, erityisesti maaperänäytteistä edellä olevan seulontamenetelmän perusteella ja kun niille suoritettiin lisätestejä, jotka selostetaan jäljempänä voitiin osoittaa, että ne valmistivat keksinnön mukaista entsyymiä. Tällaisten viljelyjen esimerkkejä ja niiden mutantteja tallennettiin kokoelmaan National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Skotlanti, ja niille annettiin hakunumerot, jotka on ilmoitettu seuraavassa taulukossa I.

Taulukko I

NCIB n:o Tallentamispäivämäärä Alkuperä 11607 8. syyskuuta 1980 Eläintarhan multaa,

Penang, Malesia 11610 8. syyskuuta 1980 Rio de Janeirosta kerät tyä multaa 11611 8. syyskuuta 1980 samaa 11636 17. helmikuuta 1981 Sitruunaviljelmän multaa,

Jamaika 11637 17. helmikuuta 1981 samaa 11638 17. helmikuuta 1981 NCIB 11607:n mutantti 11639 17. helmikuuta 1981 Hillerodista, Tanska, kerättyä multaa 11647 17. huhtikuuta 1981 NCIB 11607:n mutantti

Taksonomia

Keksinnön mukaiset vasta keksityt mikro-organismit ovat aerobisia, sauvanmuotoisia ja endosporeja muodostavia bak- il 9 79345 teereja. Sen vuoksi ne kuuluvat sukuun Bacillus.

Niiden ominaisuudet eivät täsmää mihinkään tunnettuun Ba-cillus-suvun lajiin kuten on selostettu Bergey’s Manual (VIIth Edition, Williams and Wilkins, Baltimore, 1974) tai erikoistutkimus: The Genus Bacillus, tekijät Gordon, Heynes ja Pang, Agriculture Handbook n:o 427, U.S. Department of Agriculture, 1973. Keksijät luokittelevat ne sen vuoksi uudeksi taksonomiseksi ryhmäksi, jolle on annettu nimi Bacillus acidopullulyticus.

Tämän uuden taksonomisen ryhmän diagnoosi on seuraava:

Morfologia:

Vegetatiiviset solut: sauvoja, joiden diametri on 0,6-1 ^um.

Havaitaan usein paisuneita soluja, luonteeltaan protoplas-teja, jotka näyttävät olevan stabiileja useita tunteja ollessaan upotettuina inkuboinnissa

Itiöt:

Lieriömäisistä ellipsideihin, sentraalisista subterminaali-siin, itiöpesäkkeet eivät paisuneita. Faasi-kontrasti mikroskopiassa ovat itiöt vaikeasti erotettavissa värjäytymät-tömistä globuleista, joita saattaa olla läsnä protoplasmassa.

Päinvastoin kuin nämä globulit itiöt värjäytyvät malakiit-tivihreällä.

Biokemialliset reaktiot:

Gram-reaktio positiivinen

Katalaasi positiivinen

Aerobinen kasvu positiivinen

Anaerobinen kasvu negatiivinen

Kasvu 50°C:ssa negatiivinen

Kasvu 30°C-37°C:ssa hyvä 10 79345

Biokemialliset reaktiot; (jatkoa)

Kasvu 3,5-prosenttisessa NaCl:ssa negatiivinen

Kasvu pH-arvolla 4,8-5,2 perusliuok- sessa (katso edellä), joka sisältää hyvä pullulalaania hiililähteenä

Munankeltuaisreaktio negatiivinen

Happoa: glukoosista positiivinen mannitolista positiivinen

Nitraatin pelkistyminen nitriitiksi positiivinen

Sitraatin käyttäminen negatiivinen

Propionaatin käyttäminen negatiivinen

Tyrosiinin hajoaminen negatiivinen

Pullulanaasin muodostaminen, joka poistaa tärkkelyksen haaroittumista ja vaikuttaa 60°C:ssa pH-alueella positiivinen 3,5-5,5: VP-reaktio vaihteleva

Kaseiinin hydrolyysi vaihteleva

Happoa: ksyloosista vaihteleva arabinoosista vaihteleva

Uutta haaroittumista poistavaa entsyymiä valmistavien kantojen morfologia osoittaa, että ne kuuluvat Bacillus-suvun morfologiseen ryhmään. I.

Eräs uuden taksonomisen ryhmän viljelytyyppi on NCIB 11607.

Muita ryhmän edustajia ovat kannat NCIB 11610, 11611, 11636, 11637 ja 11639.

Useiden Bacillus-lajien tiedetään valmistavan pullulaania hydrolysoivia entsyymejä /Progress in Industrial Microbiology, osa 15 (1979) ja Morgan, F.J., Adams, K.R., ja Priest, F.G.: J. Appi. Bacteriol. 4^j, sivu 291 (1979]_/. Kuitenkaan

II

n 79345 mikään tunnetuista Bacillus-lajeista ei valmista pullula- naasia, joka säilyttää tehonsa 60°C:ssa ja pH-arvolla alle 5,0.

Kyseessä olevan keksinnön lisäaspektin mukaisesti keksintö tarjoaa biologisesti puhtaan bakteeriviljelyn, joka bakteeri kuuluu uuteen taksonomiseen Bacillus acidopullulyticuksen ryhmään, kuten edellä on määritelty.

Pullulanaasivaikutuksen määrääminen

Yksi pullulanaasiyksikkö (PU) määritellään entsyymin määränä, joka standardiolosuhteissa (lämpötila 60°C ja pH 5,0) hydrolysoi pullulaania nopeudella, joka vastaa pelkistävien ryhmien syntymistä, joka on ekvivalentti 1 ^umoolin kanssa glukoosia/min.

Pullulaanin (jota toimittaa Sigma Chemical Co.) 4-painopro-senttista liuosta (1 ml) asetaattipuskurissa (0,1 M, pH 5) esikuumennetaan 10 min ajan 60°C:ssa, jonka jälkeen lisätään entsyymin liuos (1 ml) liuotettuna deionisoituun veteen konsentraation vastatessa 0,04-0,15 PU/ml. Reaktio pysäytetään 30 min kuluttua lisäämällä karbonaattipuskuria, pH 10 (3 ml, 0,5 M). Vapautuneiden pelkistävien ryhmien konsentraatio määrätään sitten Somogyi-Nelson-menetelmän mukaan /J. Biol. Chem. 153 (1944) 375-380; sama 160 (1945) 61-687-

Haaroittumista poistavan entsyymiaineen valmistaminen Bacillus-kanta, joka pystyy valmistamaan kyseessä olevan keksinnön mukaista haaroittumista poistavaa entsyymiä, pannaan tavallisesti lisääntymään kiinteässä substraatissa ennen kuin sitä viljellään aerobisissa olosuhteissa jossakin sopivassa käymisliuoksessa. Molemmat väliaineet sisältävät assimiloituvia hiililähteitä (esimerkiksi glukoosia nestemäisessä ja amylopektiiniä kiinteässä väliaineessa), perussuola-liuoksen (kts. edellä), joka sisältää esimerkiksi ammonium- i2 79345 sulfaattia typpilähteenä yhdessä kasvua edistävien ravinteiden kanssa, joita ovat hiivauute ja/tai maissin liotus-neste (nestemäinen väliaine) tai tryptonia (kiinteä substraatti) . Käyminen suoritetaan tyypillisesti hieman kohotetussa lämpötilassa, tavallisesti lämpötilavälillä 30°C-35°C ja pH-arvolla alle 6, etupäässä välillä 5,0-6,0 ja se pidetään mieluimmin suunnilleen vakiona automaattiväli-nein. Entsyymi erittyy väliaineeseen.

Muodostuva käymisliuos, joka tavallisesti sisältää noin 0,1-50 PU/ml, voidaan vapauttaa bakteerisoluista, niiden jätteistä yhdessä muiden kiinteiden aineiden kanssa, esimerkiksi sentrifugoimalla. Supernatantti, joka sisältää entsyymin, voidaan vielä kirkastaa lisää esimerkiksi suodattamalla tai sentrifugoimalla, ja konsentroida sen jälkeen mikäli halutaan esimerkiksi ultrasuodattamalla tai haihdu-tinlaitteessa vähennetyssä paineessa, jolloin saadaan konsentraattia, joka, mikäli halutaan voidaan kuivata, esimerkiksi lyofilisoimalla tai spray-kuivaamalla. Tyypillisesti on saadulla raa'alla entsyymiaineella aktiivisuus 100-15 000 PU/g.

Haaroittumista poistavan entsyymin puhdistaminen Kyseessä olevan keksinnön mukainen haaroittumista poistava entsyymi voidaan puhdistaa raa'asta entsyymiaineesta, kuten esimerkiksi jäljessä esimerkissä 2 saatu konsentraatti, esimerkiksi yhdistämällä kationi- ja anioninvaihto-kromatogra-f ia.

CM-Sepharose CL-pylväs tasapainotettiin fosfaatti-sitraatti-puskurilla (0,05 M Ν32ΗΡ0^, joka oli titrattu 0,05 M sitruunahapolla pH-arvoon 4,5). Entsyymikonsentraatti laimennettiin vedellä samaan johtokykyyn kuin tasapainottava puskuri ja sen jälkeen säädettiin pH arvoon 4,5. Näyte pantiin sitten pylvääseen, jolloin entsyymi adsorboitui täydelleen. Eluoin-ti suoritettiin samalla puskurilla, joka oli lineaarisesti li 13 79345 sekoitettu gradienttisekoittimessa 0,05 M liuoksen kanssa ä, niin että saatiin gradientti pH:ssa. Fraktiot analysoitiin pullulanaasin aktiivisuuden suhteen menetelmän avulla, joka on selostettu edellä ja proteiinipitoisuuden suhteen Lowry'n menetelmän avulla /J. Biol. Chem. 193 (1951) 2567 ja ne fraktiot, jotka osoittivat entsyymiaktii-visuutta, yhdistettiin.

DEAE-Sepharose CL-6B pylväs tasapainotettiin fosfaatti-sitraatti-puskurin avulla (0,01 M NaHPO^, joka oli titrattu 0,01 M sitruunahapolla pH-arvoon 6,5). Yhdistetyt fraktiot laimennettiin samaan johtokykyyn kuin tasapainottava puskuri, säädettiin pH-arvoon 6,5 ja pantiin sen jälkeen pylvääseen. Täydellisesti adsorboitunut entsyymi eluoitiin samalla puskurilla, johon oli sekoitettu fosfaatti-sitraatti-puskuria (0,15 M Na2HP04, joka on titrattu pH-arvoon 6,5 käyttäen 0,15 M sitruunahappoa), jolloin saatiin lineaarinen gradientti puskurikonsentraatiossa. Fraktiot koottiin ja analysoitiin kuten edellä. Piikki-fraktioilla oli ominaisak-tiivisuus noin 350 000 PU/g.

Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi-geelielektro-foreesissa /S.G. Braun et ai., J. Virology osa 10 (1972) 2217 korkeimman aktiivisuuden omaavilla fraktioilla oli yksinkertainen proteiininauha, joka vastasi molekyylipainol-taan noin 100 000 Daltonia. Proteiinilla on pl 5,0, joka määritettiin isoelektrisella tarkennuksella "LKB amfoliini PAG"-levyillä (ohjeiden mukaan, jotka on antanut LKB-Pro-dukter AB, Ruotsi).

Entsyymin kemialliset ominaisuudet

Keksinnön mukaisen haaroittumista poistavan entsyymin aktiivisuuden riippuvaisuus pH-arvosta välillä 3,5-5,5 eri lämpötilatasoilla määrättiin edellä selostetun menetelmän avulla, jolla määrätään pullulanaasin vaikutus, käyttäen reaktioseosta, jonka pH ja lämpötila säädettiin edeltä I4 79345 määrätyille arvoille. Viitataan mukana olevaan piirustukseen, joka valaisee graafisesti suhteellista aktiivisuutta eri pH-arvoilla lämpötiloissa 55°C, 60°C ja 65°C.

Entsyymin lämpöstabiilisuuden määräämistä varten glukoosi-siirapissa (noin 30 % D.S.) liuotettiin entsyymiaineen liuos joka oli valmistettu kuten seuraavassa esimerkissä 1, de-ionisoituun veteen, jolloin saatiin liuos, joka sisälsi 3 PU/ml. Pieniä tasamääriä (1 ml) tätä liuosta sekoitettiin 1 ml:n kanssa 0,1 M sitraattipuskuria ja glukoosia (0,8 g).

Kun oli inkuboitu näytteitä 3 vrk 50°C:ssa ja 60°C;ssa, määrättiin jäännösaktiivisuus kokeen avulla, jolla määrätään amylopektiinin haaroittumista poistava vaikutus. Suoritettiin vertailukoe Pseudomonas isoamylaasin kanssa /Hayashibara Biochemical Laboratories, Japani, joka sisälsi 500 000 isoamylaasi-yksikköä (IA)/%/, ja joka oli laimennettu 300 IA:an/ml.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa II.

Taulukko II

Jäännösaktiivisuus 3 vrk;n jälkeen Lämpötila, pH inkuboin- Kyseisen keksinnön Isoamylaasi °C nin jälkeen mukainen haaroittu mista poistava _ entsyymi_ _ 50 4,5 109 75 _4^9_100_68_ 60 4'9 89 1 5,2 85 3

Amylopektiinin haaroittumista poistavan vaikutuksen mit-tauskoe:

Amylopektiinin a-1,6-sidosten hydrolyysi aiheuttaa värin voimakkuuden lisääntymisen (mitattu aallonpituudella 610 nm) sinisessä jodi-amylopektiinikompleksissa. Tämä lisääntymi- 11 15 79345 nen on riippuvainen hydrolysoitujen α-1,6-sidoksien määrästä.

Entsyymiliuos (1 ml) laimennetaan deionisoituun veteen konsentraatioon, joka vastaa 1-2 PU ja 20-40 IA/ml vastaavasti haaroittumista poistavalle entsyymille ja isoamylaa-sille ja se sekoitetaan asetaattipuskurin (1 ml 0,5 M, pH 4,5) ja amylopektiinin 1-prosenttisen liuoksen kanssa (5 ml) (CPC, Snowflake 04201 tärkkelys). Seosta inkuboi-daan 30 min 50°C:ssa. Yksi osa (0,5 ml) sekoitetaan 15 ml:n kanssa 0,02 N H2SO4 ja 0,5 ml:n kanssa jodiliuosta (0,01 M jodia 0,2-prosenttisessa kaliumjodisissa).

15 min kuluttua huoneenlämmössä verrataan optista tiheyttä aallonpituudella 610 nm sokean kokeen kanssa, jossa on kuumassa inaktivoitua entsyymiä.

Immunologiset ominaisuudet

Synnytettiin monospesifistä antiseerumia immunisoimalla kaneja puhdistetun haaroittumista poistavan entsyymin kanssa menetelmän mukaan, jonka on selostanut N.H. Axelsen et ai., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Oslo 1973) luku 23. Haaroittumista poistavaa entsyymiä valmistettiin viljelemällä kantaa NCIB 11638 (vertaa jäljessä olevaa esimerkkiä 1) ja puhdistettiin kuten edellä on selostettu.

Immunogeeni (0,5 ml liuosta, joka sisälsi 18 PU/ml ja vastasi 0,15 mg proteiinia/ml), sekoitettiin Freund1 in lisäaineen kanssa (0,5 ml) ja ruiskutettiin subkutaanisesti kaneihin joka toinen viikko. Antiseerumia saatiin koko im-munisaatiovaiheen jälkeen, joka kesti 8 viikkoa ja immuno-globuliinia valmistettiin siitä kuten on selostanut N.H. Axelsen et ai., edellä.

Kaksi näytettä puhdistamatonta haaroittumista poistavaa 16 79345 entsyymiä sisältävää ainetta, joka oli peräisin samasta kannasta (NCIB 11638), esimerkiksi jäljessä tulevan esimerkin 1 mukaisesti, (kumpikin näyte sisälsi 10 PU/ml), joutui risti-immunoelektroforeesiin samojen tekijöiden selostuksen mukaisesti (luku 3). Ensimmäinen dimensio: 1 % agaroosia TRIS-boorihappo-puskurissa (20 mM, pH 8,6); elektroforeesi 15°C:ssa, 8 volttia/cm 2 h ajan. Toinen dimensio: sama agaroosigeeli kuin yllä, joka sisälsi immuno-globuliinia (100 ^ul); elektroforeesi 15°C:ssa, 1 voltti/cm 16 h ajan.

Yksi levy, joka oli värjätty Coomassie Brilliant Blue-vä-rillä, antoi yksinkertaisen immunosakan piikin. Toista levyä käytettiin entsyymin havaitsemiseen yläkerros-tekniikan avulla. Levy peitettiin geelillä, joka sisälsi pullulaania ja agaroosia (1 % kumpaakin) maleaattipuskurissa (0,1 M, pH 5). Inkuboitiin 2 h ajan 50°C:ssa, jonka jälkeen jäännös-pullulaani saostettiin asetonilla, jolloin tuli näkyviin kirkastuva alue, joka ilmaisi pullulaanin hydrolyysin. Molempien elektroferogrammien vertailu osoitti, että kirkastuva alue ja värjätty immunosakka olivat päällekkäiset, mikä osoitti immunoglobuliinin monospesifisyyttä, joka oli valmistettu kannan NICB 11638:n muodostamaa haaroittumista poistavaa entsyymiä vastaan.

Immunologisia ominaisuuksia haaroittumista poistavassa entsyymissä, joka oli peräisin kustakin talletetusta muusta kannasta, verrattiin NCIB 11638:sta peräisin olevan entsyymin vastaaviin risti-immunoelektroforeesin avulla käyttäen edellä valmistettua immunoglobuliinia vertailuantiseerumia. Näin saadut immunogrammit osoittivat identtisyyttä tai osittaista identtisyyttä kaikkien tutkittujen haaroittumista poistavien entsyymien lajien immunokemiallisten ominaisuuksien kanssa. Termien "immunokemiallinen identtisyys" ja "osittainen immunokemiallinen identtisyys" suhteen viita

II

17 79345 taan edellä siteerattuun erikoistutkimukseen, N.H. Axelsen et ai., luvut 10 ja 11.

Seuraavat esimerkit on esitetty valaisevina tämän keksinnön toteutusmuotoina.

Esimerkki 1

Haaroittumista poistavan entsyymiaineen valmistaminen kannasta NCIB 11638

Kantaa NCIB 11638 (joka on NCIB 11607:n mutantti) kasvatettiin agarvinopinnoilla 2 vrk ajan 37°C:ssa. Agar-väliaine oli valmistettu perusväliaineesta (vrt. sivut 7-8) lisäämällä amylopektiiniä (0,5 % Snow Flake vahamaista tärkkelystä CPC) ja 2 % Bacto-agaria (Difco).

Solut suspendoitiin steriiliin veteen ja siirrettiin 2 l:n vetoiseen laboratorio-käymisastiaan (Eschweiler, Kiel, Länsi-Saksa), joka sisälsi 1 litran seuraavaa seosta:

Hiivauutetta 0,2 %

Maissin liotusnestettä (50 % kuiva-ainetta) 1,0 " . . MgS04*7H20 0,025 K2HP04 0,05 (NH4)2S04 0,125

CaCl2-2H20 0,025 "

Pluronic L 61 0,1 " liuotettuna vesijohtoveteen pH säädettiin arvoon 5,5 ennen autoklaaviin panoa 30 min ajaksi lämpötilaan 130°C. Glukoosia pidettiin autoklaavissa erillään ja sitä lisättiin lopulliseen konsentraatioon 1 %:iin asti.

Viljelyn aikana pH pidettiin arvossa 5,5 + 0,2 lisäämällä rikkihappoa (2-prosenttinen liuos). Lämpötila oli 30,0+0,1° C ja ilman johtamisnopeus 650 ml/min (+ 10 %).

is 79345

Kun viljely oli kestänyt 22 h, aloitettiin substraatin vaihto laimennusnopeudella 0,03 h Seuraavien 36 h kuluttua oli saavutettu vakio-olosuhteet käymiselle soluti-heyden ollessa noin 4 g kuivia soluja/litra (mikä vastasi absorptiota 8 aallonpituudella 450 nm). Pullulanaasi-vaiku-tusteho oli 7,5 PU/ml. 6 vrk:n aikana jatkui käyminen vakio-olosuhteissa ja tällöin kerättiin 4000 ml viljelynestettä jäähdytettyyn pulloon. Solut poistettiin sentrifugoimalla 30 min ajan kiertonopeudella 2300 kierr/min ja päällä kelluva osa, joka sisälsi 5,1 PU/ml, konsentroitiin ultrasuodat-tamalla G-600 kalvon läpi käyttäen standardimallisia labo-ratoriovarusteita (joita toimittaa Sartcrius). Tämän konsentraatin volyymi (800 ml) pienennettiin vielä Bilchi'n pyörivässä haihdutinlaitteessa 45°C:ssa. Näin saatu lopullinen konsentraatti (76 ml) pakastettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin kuivaa jauhemaista ainetta (6,8 g), jonka aktiivisuus oli 1150 PU/g.

Esimerkki 2

Haaroittumista poistavaa entsyymiä sisältävän aineen valmistaminen kannasta NCIB 11647 Käyminen suoritettiin ruostumatonta terästä olevassa labo-ratoriokäymislaitteessa (kokonaiskapasiteetti 550 1, dia-metri 70 cm), joka oli varustettu kahdella 6-siipisellä, 24 cm läpimittaisella turbiinisekoittimella ja varusteilla, jotka tarvitaan jatkuvaa käymistä varten, sekä laitteilla vakio-pH:n ja -lämpötilan ylläpitämistä varten. Käymislai-te panostettiin väliaineella (300 1), jolla oli seuraava kokoomus:

Soijapapujauhoa 25 g

Maissin liotusnestettä (50% kuiva-ainetta) 5 "

Perunatärkkelystä 8,3 " KH2P04 1,7 " (nh4)2so4 1,0 ”

Bakteeriamylaasia BAN 120 L 0,013 ml

Vaahtoamista ehkäisevää ainetta Pluronic L61 0,233 " Vesijohtovettä ad 1 litra ti i9 79345 Väliaineen pH säädettiin arvoon 5,8 natriumhydroksidiliuok-sella. Tärkkelys nesteytettiin nostamalla lämpötila vähitellen 60°C:sta 90°C:een 50 min kuluessa, jota seurasi steriloiminen 121°C:ssa 60 min ajan.

Kanta NCIB 11647:n viljelyä, jota oli kasvatettu 4 vrk Fernbach-viljelypullossa samassa agar-ravinnesubstraatissa kuin esimerkissä 1, käytettiin inkuboimaan 300 1 väliainetta. Inkubointi suoritettiin lämpötilassa 29°C-31°C, sekoittajan nopeudella 100 kierr/min ja ilman johtamisnopeu-della 150 standardilitraa/min paineessa 0,5 baaria. 33 h kuluttua inkuboimisesta alettiin syöttää steriiliä väliainetta, jonka koostumus oli sama kuin edellä ja joka oli valmistettu samalla tavalla, jatkuvana viljelyyn nopeudella 15 1/h. Kun oli saavutettu volyymi 375 1, aloitettiin automaattinen viljelynesteen poisveto. Noin 30 h inkuboimisen jälkeen havaittiin voimakasta kasvua mikroskoopilla ja CC^n lisääntynyttä kehittymistä.

Viljelynesteen talteenotto alkoi viljelyn ollessa 73 h ikäinen. Haaroittumista poistavan entsyymin aktiivisuus oli silloin noussut yli 10 PU:ksi/ml. Aikavälillä 115 h:sta 210 h:in pidettiin yllä lähes vakiotilaa entsyymikonsentraa-tiossa, joka vastasi 50-76 PU/ml, ja liuoksen pH vaihteli välillä 5,4-5,9.

Kaikki seuraavat operaatiot suoritettiin pH-arvolla 5,5-5,7.

Käymisliuosta kerättiin 110 h aikana (1650 1) ja se suoda- . 2 tettiin pyörivässä vakuumisuodattimessa (2,5 m ), joka oli päällystetty piimaalla suodatuksen edistämiseksi. Suodos konsentroitiin ja se vapautettiin alhaisen molekyylipainon omaavista yhdisteistä ultrasuodattamalla käyttäen DDS 2 (7 m ) moduulia (jota toimittaa DDS, Kööpenhamina, Tanska) ja joka oli varustettu selluloosa-asetaattimembraanilla, tyyppiä 600. Lopullinen konsentraatti (70 1) sisälsi 9,4 % kuiva-ainetta.

20 7 9 3 4 5

Konsentroitiin vielä (21 litran volyymiin) ja se suoritettiin pyörivässä vakuumihaihdutinlaitteessa. Kun vielä pai-nesuodatettiin käyttäen samaa suodatinapulaitetta kuin edellä, saatiin entsyymikonsentraattia (15,5 kg, joka sisälsi 28,8 % kuiva-ainetta), jonka aktiivisuus oli 1500 PU/g.

Esimerkki 3

Haaroittumista poistavan entsyymin valmistaminen kannoista NCIB 11610. NCIB 11636 ja NCIB 11637,

Kantojen kasvatukset ja fermentoinnit suoritettiin samalla tavalla kuin on selostettu esimerkissä 1. Käytettiin maltoosia (0,5 %) glukoosin asemesta hiililähteenä. Käymisen muiden parametrien keskiarvot käyvät ilmi seuraavasta taulukosta 1.

Taulukko 1

NCIB NCIB NCIB

11610 11636 11637

Laimennusnopeus, h 1 0,07 0,057 0,06

Absorptio aallonpituudella 450 nm 9,2 8,3 9,1

Bakteerien kuivapaino, g/1 5,4 4,9 3,8

Haaroittumista poistavan entsyymin aktiivisuus, PU/ml 0,80 0,25 0,11

Viljelyliuokset kerättiin ja haaroittumista poistavan entsyymin sisältävät aineet kerättiin pääasiallisesti siten kuin on selostettu esimerkissä 1. Työn suorituksen yksityiskohdat käyvät ilmi seuraavasta taulukosta 2.

Taulukko 2

Kanta Viljely- Päällä kelluva osa Lyofilisoitu aine NCIB n:o neste ml ml PU/ml _g ?U/q 11610 5316 5110 0,37 7,5 69,2 11636 1497 1405 0,08 4,4 14,4 11637 4856 4790 0,04 6,0 12,2

Esimerkki 4

Haaroittumista poistavan entsyymin valmistaminen kannasta NCIB 11639

II

21 79345

Kannan NCIB 11639 kasvatus, inkubointi ja käyminen suoritettiin kuten on selostettu esimerkissä 1.

Käymisväliaineella oli seuraava koostumus: χ \

Soijapapujauheuutetta 2,0 %

Maissin liotusnestettä 0,5 "

MgS04, 7H20 0,025 " k2hpo4 0,1 (NH4)2S04 0,05 "

Amylaasilla nesteytettyä tärkkelystä (Dekstroosi-ekvivalentti 11) 0,5 "

Pluronic L 61 liuotettuna vesijohtoveteen 0,1 " xSoijapapujauheen liukenevaa osaa uutettiin pH-arvolla 4,5 ja lämpötilassa 50°C 4 h ajan. Liukenematon aine poistettiin sentrifugoimalla.

pH säädettiin arvoon 4,0 ennen autoklaaviin panoa 130°C:een 60 min ajaksi.

Viljelyn aikana pH pidettiin arvossa 5,6 + 0,1 lisäämällä natriumhydroksidiliuosta (2 %). Lämpötila oli 30,0 + 0,1°C ja ilman johtamisnopeus 320 1/min sekoitusnopeudella 530-565 kierr/min. Käymistä jatkettiin laimennusnopeudella 0,03-0,05 h~* 186 h ajan, jolloin ylivaluvan viljelynesteen kerääminen aloitettiin. Viljelynestettä (5100 ml, 0,47 PU/ml) kerättiin kuivan jään päälle vielä 97 h ajan seuraa-vissa olosuhteissa:

Laimennusnopeus 0,049 + 0,008 h ^ OD450 10,6 + 1,1

Solutiheys 2,9 +1,5 g/1

Haaroittumista poistavan 0,5 +0,1 PU/ml entsyymin aktiivisuus

Solut poistettiin kuten on selostettu esimerkissä 1. Päällä kelluva osa suodatettiin Whatman GFA lasisuodattimella (11 cm) ja konsentroitiin sitten 200 ml:aan Amicon DC 2 22 79345 ontelokuitumoduulilla, joka oli varustettu H1P10 membraanil-la. Sameus poistettiin GFA-suodattimella ja suodos konsentroitiin vielä Amicon-moduuli11a käyttäen 202-DDS 600 membraania (DDS, Kööpenhamina, Tanska), jolloin saatiin lopullinen konsentraatti (30 ml), jonka vaikutusteho oli 65 PU/ml. Konsentraatti varastoitiin syväjäähdytettynä.

Esimerkki 5 100 kg maissitärkkelystä (Globe® 03430, CPC) sekoitettiin lietteeksi vesijohtoveteen, joka sisälsi 100 miljoonasosaa Ca++ ja volyymi säädettiin 225 litraksi. pH säädettiin arvoon 6,3 ja lisättiin 135 g Termamyl® 60 L (NOVO Industri A/S, Tanska).

Tätä suspensiota pumpattiin jatkuvana suihkukeitinlaitteen läpi (Hydro-Thermal Corp. Milwaukee), jossa sitä kuumennettiin 105°C:een suoran höyrysuihkun avulla ja pidettiin 105°C:ssa 5 min ajan. Nesteytetty tärkkelyssupensio jäähdytettiin äkkiä ja pumpattiin sokeroitumistankkiin, jossa sitä pidettiin noin 1 h lämpötilassa 95°C.

Nesteytetyn tärkkelyksen pH säädettiin 4,0:ksi 95°C;ssa reaktion pysäyttämiseksi ja panos suihkekuivattiin ilman puhdistamista. Suihkekuivatun maltodekstriinin DE oli 6.

Valmistettiin substraatteja sokeroitumista varten liuottamalla uudelleen sopivia määriä tätä maltodekstriiniä deioni-soituun veteen niin että DE oli noin 30 %. Pieniä eriä tätä substraattia otettiin sitten ja kuumennettiin 60°C:een ja pH säädettiin 4,8:ksi. Lisättiin sitten erilaisia määriä haaroittumista poistavaa entsyymiä yhdessä glukoamylaasin kanssa (Amyloglukosidaasi Novo 150, 150 AG-yksikköä/ml). Reaktioseoksista otettiin näytteet määrätyin aikavälein ja dekstroosi-prosentti kussakin näytteessä määrättiin HPLC:n avulla. Seuraavat tulokset saatiin:

II

23 79345

Haaroittumista Glukoamy- Reaktio- pH % poistava laasi aika Dekstroosi entsyymi AG-yksikköä/ (h) PU-yksikköä/g g D.S.

D.S._ _ ___ 0 (kontrolli) 0,225 72 4,1 95,8 0,225 96 4,1 95,9 0 (kontrolli) 0,113 72 4,6 93,3 0,113 96 4,3 94,4 0,01 0,150 96 4,3 96,1 0,1 0,113 96 4,4 95,9 0,5 0,113 96 4,4 96,7 1.0 0,113 72 4,6 97,0 2.0 0,113 72 4,7 97,3 4.0 0,113 72 4,7 97,4 Nämä tulokset osoittavat, että kun haaroittumista poistavaa entsyymiä käytetään yhdessä glukoamylaasin kanssa, voidaan sama dekstroositaso saavuttaa puolella glukoamylaasi-annoksella, mitä on käytetty kontrollikokeessa, kun käytetään haaroittumista poistavaa entsyymiä annos 0,1 PU/g D.S.

Jos haaroittumista poistavan entsyymin annosta lisätään, lisääntyy myös maksimaalinen saatavissa oleva dekstroositaso.

Esimerkki 6

Tasamääriä substraattia, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 5, kuumennettiin 55° tai 60°C:een ja pH säädettiin arvoon 4,9. Lisättiin glukoamylaasia määrä, joka vastasi 0,113 AG/g D.S. ja haaroittumista poistavaa entsyymiä määrä, joka vastasi 1,2 PU/g D.S. Reaktioseoksesta otettiin näytteitä ja analysoitiin kuten esimerkissä 5.

Saatiin seuraavat tulokset: 24 7 9 3 4 5 Lämpötila, Reaktioaika Dekstroosi °C (h) % 24 84,5 48 96,5 55 72 97,1 96 97,3 24 90,0 48 96,8 60 72 97,0 96 97,3 Nämä tulokset vahvistavat, että haaroittumista poistava entsyymi on riittävän lämpöstabiili käytettäväksi lämpötilassa 60°C.

Esimerkki 7

Spray-kuivattua maltodekstriini-substraattia, jonka DE on 5, valmistettiin menetelmän mukaan, joka on selostettu esimerkissä 5.

Tasamäärä tätä substraattia kuumennettiin 60°, 62,5° ja 65°C;een ja pH säädettiin arvoon 4,9. Lisättiin glukoamylaa-sia määrä, joka vastasi 0,113 AG/g D.S. ja haaroittumista poistavaa entsyymiä määrä, joka vastasi 1 PU/g D.S. Suoritettiin myös kontrollisokeroimiskokeita, joihin lisättiin glukoamylaasia määrä, joka vastasi 0,225 AG/g D.S., mutta ilman haaroittumista poistavaa entsyymiä.

Reaktioseoksista otettiin näytteet ja analysoitiin kuten esimerkissä 5. Kuiva-ainepitoisuus (D.S*.) sokeroitumisen aikana oli 31 %.

Il 25 79345

Haaroittumis- Glukoamy- Lämpö- Reaktio- Dekstroosi ta poistava laasi tila aika ^ entsyymi AG/g D.S. o (h) PU/g D.S. _ ^ _ _ 24 92,1 n n an 48 95,3 0 0,225 60 η2 96,0 96 96,0 24 88,9 , 48 96,1 1 0,113 60 72 96,7 96 97,0 24 92,1 n n an a 48 95,1 0 0,225 62,5 72 g 96 96*1 24 89,3 1 n n -a k 48 95,9 1 0,113 62,5 72 96^8 96 97,0 24 91,4 n n n n a aa 48 94,1 0 0,225 65 ?2 95,2 96 95,4 24 82,9 1 0 113 65 48 89,9 J. υ,ιυ 03 72 92,8 96 93,6

Tulokset osoittavat, että sokeroituminen haaroittumista poistavan entsyymin ja glukoamylaasin kanssa voidaan suorittaa lämpötilassa 60°-62,5°C. Lämpötilassa 65°C ovat tulokset huonommat, mikä johtunee glukoamylaasin epästabii-lisuudesta siinä lämpötilassa.

Esimerkki 8

Tasamääriä substraattia, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 5, kuumennettiin 60°C:een ja pH säädettiin arvoon 26 79345 4,5 ja 4,8. Lisättiin glukoamylaasia määrä, joka vastasi 0,113 AG/g D.S. ja haaroittumista poistavaa entsyymiä määrä, joka vastasi 1 PU/g D.S. Reaktioseoksista otettiin näytteet ja analysoitiin kuten esimerkissä 5. Saatiin seu-raavat tulokset: pH Reaktioaika (h) % Dekstroosi 24 89,6 A C 48 96,6 72 96,8 96 96,9 24 89,0 4 o 48 96,5 4,0 72 96,8 96 97,0 Nämä tulokset osoittavat, että samanlaisia tuloksia voidaan saada, kun sokeroidaan pH-arvolla 4,5 ja 4,8.

Esimerkki 9

Valmistettiin 35 % D.S. (DE 6) substraattia liuottamalla annos maltodekstriiniä, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 5, deionisoituun veteen. Otettiin tasamääriä tätä substraattia ja kuumennettiin 60°C:een ja pH säädettiin arvoon 4,3 ja 4,8.

Lisättiin glukoamylaasia määrä, joka vastasi 0,113 AG/g D.S. ja puhdistettua haaroittumista poistavaa entsyymiä määrä (120 PU/mg proteiinia), joka vastasi 1 PU/g D.S. Reaktio-seoksista otettiin näytteet ja analysoitiin kuten esimerkissä 5. Saatiin seuraavat tulokset:

Reaktioaika (h) pH % Dekstroosi 0 4,3 24 4,3 89,2 48 4,2 96,1 72 4,2 96,2 0 4,8 24 4,5 88,4 48 4,5 96,0 72 4,4 96,2

II

Nämä tulokset osoittavat, että samanlaisia dekstroositaso- ja voidaan saada, kun sokeroiminen aletaan pH-arvolla 4,3 tai 4,8.

27 79345

Esimerkki 10

Valmistettiin substraatteja, joiden kiinteän aineen pitoisuudet olivat erilaisia liuottamalla 100 g DE 6 maltodekstriiniä esimerkistä 5 eri suuruisiin määriin deionisoi-tua vettä ja säädettiin pH-arvot 4,6reen lämpötilassa 60°C. Lisättiin 0,113 AG/g D.S. glukoamylaasia ja 1 PU/g D.S. haaroittumista poistavaa entsyymiä. Reaktioseoksista tehtiin näytteet ja analysoitiin kuten esimerkissä 5. Saatiin seuraavat tulokset: D.S. Maksimaalinen dekstroosi % 25 97,7 30 97,2 35 96,3 40 94,9 45 93,0

Kun suoritettiin sokeroiminen kontrolliksi ilman haaroittumista poistavaa entsyymiä, oli 96,3 maksimaalinen dekstroosi, joka voitiin saavuttaa tämän substraatin kanssa 60°C:ssa, pH 4,5 ja 0,225 AG yksikköä/g D.S. glukoamylaasia ja 30 % D.S. Tämä merkitsee sitä, että sokeroiminen voidaan suorittaa korkeammilla kiinteän aineen tasoilla, kun käytetään haaroittumista poistavaa entsyymiä saavuttamaan sama dekstroo-si-taso, niin että energian kulutus haihduttamiseen on huomattavasti pienempi.

Esimerkki 11

Valmistettiin vielä erä spray-kuivattua maltodekstriiniä, jonka DE oli 5,0 menetelmän mukaan, joka on selostettu esimerkissä 5.

Sokeroimissubstraatteja valmistettiin liuottamalla uudelleen sopivia määriä tätä maltodekstriiniä deionisoituun veteen ja tehtiin ne noin 30-prosenttisiksi. Tasamääriä tätä 28 7 9 3 4 5 substraattia kuumennettiin sitten 60°C:een ja pH säädettiin arvoon 5,0.

600 g/t D.S. β-amylaasia (Biozyme M II - Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Japani, joka sisälsi 33,4 β-amylaa-siyksikköä/g) ja eri suuruisia määriä haaroittumista poistavaa entsyymiä lisättiin ja otettiin reaktioseoksista näytteitä 72 h jälkeen. Maltoosi-prosentti määrättiin HPLCrn avulla. Saatiin seuraavia tuloksia:

Haaroittumista poista- % % va entsyymi (PU/g D.S.)_ Dekstroosi Maltoosi 0 (kontrolli) 0,3 53,7 0,1 0,2 63,0 0,5 0,4 71,8 1 0,4 75,8 2 0,5 78,4 4 0,4 79,6 Nämä tulokset osoittavat, että kun käytetään haaroittumista poistavaa entsyymiä β-amylaasin kanssa, voidaan saada huomattavasti korkeampia maltoosi-tasoja.

Esimerkki 12 114 g Tapioca-tärkkelystä sekoitettiin lietteeksi 886 ml:aan deionisoitua vettä, johon oli lisätty 0,5 g kalsiumklori-dia. Lietettä keitettiin kuumentamalla noin 100°C:een ja jäähdytettiin sitten 50°C:een. pH säädettiin arvoon 5,7 ja lisättiin 0,56 Biozyme M II:ta ja haaroittumista poistavaa entsyymiä määrä, joka vastaa 2 PU/g D.S. pH pidettiin vakiona 5,5. Reaktioseoksesta otettiin näytteitä ja analysoitiin HPLC:n avulla.

Reaktioaika (h) % Dekstroosi % Maltoosi 24 0,5 77,4 48 0,6 84,4 Tämä osoittaa, että haaroittumista poistavaa entsyymiä voidaan käyttää yhdessä 8-amylaasin kanssa valmistamaan erittäin runsaasti maltoosia sisältävää siirappia.

Claims (3)

29 79345

1. Entsyymituote, joka sisältää a-1,6-glukosidaasin, tunnettu siitä, että a-l,6-glukosidaasi saadaan viljelemällä Bacillus-kantaa NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11611, NCIB 11636, NCIB 11637, NCIB 11638, NCIB 11647, NCIB 11639 tai NCIB 11777 sopivassa ravinnevällaineessa, ja että sen lämpö-tilaoptimi mitattuna inkuboitaessa 30 minuutin ajan asetaat-tipuskurissa (0,05 M) pH-arvossa 4-5 on vähintään noin 60°C, sen pH-optimi määritettynä 30 minuutin ajan asetaattipusku-rissa (0,05 M) noin 60°C:ssa on alueella 3,5-5,5, ja sen jäännösaktiivisuus on vähintään 50 % 72 tunnin jälkeen 60°:ssa ja pH:ssa 5, mitattuna glukoosiliuoksessa, jossa on 30 paino-% kuiva-ainetta.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen entsyymin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että jotain Bacillus-kan-noista NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11611, NCIB 11636, NCIB 11637, NCIB 11638, NCIB 11647, NCIB 11639 tai NCIB 11777 viljellään sopivassa ravinneväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteen ja epäorgaanisia suoloja, minkä jälkeen entsyymituote otetaan talteen.

3. Menetelmä tärkkelyksen muuttamiseksi glukoosia ja/tai maltoosia sisältäviksi siirapeiksi, tunnettu siitä, että tärkkelyksen tai ainakin 30 paino-% kuivia, kiinteitä aineita sisältävän tärkkelyshydrolysaatin sokeroiminen suoritetaan patenttivaatimuksen 1 mukaisen a-1,6-glukosi-daasin 0,005-5:n pullulanaasiyksikön ja sokeroimisentsyy-min, joka on joko glukoamylaasi tai β-amylaasi, läsnäollessa pH-alueella 3,5-5,5 ja lämpötilavälillä 55-65°C, jolloin glukoamylaasin ja β-amylaasin annokset ovat vastaavasti 0,05-0,5 AG-yksikköä ja 0,005-0,3 β-amylaasiyksikköä/g kuivia, kiinteitä aineita.