DK153569B - Enzymprodukt indeholdende en alfa-1,6-glucosidase og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

1 DK 153569 B

Den foreliggende opfindelse angår et enzymprodukt indeholdende en a-1,6-glucosidase og fremgangsmåde til fremstilling deraf.

I den forløbne ti års periode har den fuldt ud enzyma-5 tiske hydrolyse af stivelse til sirupper vundet udbredt og stadig stigende accept inden for den stivelsesbehandlende industri.

På verdensbasis skønnes den nuværende enzymatiske produktion af glucosesirup ud fra stivelse at være mere end 3 millioner tons (beregnet som tørstof) pr. år, sammenlignet med omkring 0,4 mil-10 lioner tons for ti år siden).

Den almindeligvis anvendte proces til enzym-enzym hydrolyse af stivelse omfatter forflydning efterfulgt af forsukring, idet førstnævnte katalyseres af a-amylase, såsom den ter-mostabile B. licheniformis α-amylase, f.eks. TERMAMYL®, som for-15 handles af NOVO INDUSTRI A/S, Danmark. Forsukringen til glucose (D-glucose) udføres i nærværelse af en glucoamylase, sædvanligvis hidhørende fra svampe, såsom AMG-150 L, der ligeledes fås fra ovennævnte firma. Producenten af glucosesirup har naturligvis som mål at opnå det højst mulige udbytte af glucose med det 20 lavest mulige forbrug af enzymer og af energi.

Den højst opnåelige glucosekoncentration i den konventionelle proces, som starter med en 30 - 40 vægtprocent stivelsessuspension og forsukring ved et tørstofindhold på 30%, er omkring 96 vægtprocent glucose (96 DX).. Der er i det væsentlige to 25 årsager til, at den konventionelle proces til stivelsesomdannelse ikke forløber nævneværdigt ud over denne grænse.

For det første udviser amylopectin (som udgør omkring 80% af flertallet af industrielt vigtige stivelsestyper, herunder majsstivelse) en struktur med forgrenede kæder, idet det 30 indeholder et betydeligt antal a-1,6-glycosidiske bindinger.

Medens amylopectin kun nedbrydes delvis af α-amylase, fordi a-amylase praktisk talt ikke besidder a-1,6-glucosidaseaktivitet, foregår der en betragtelig hydrolyse af de forgrenede oligo-saccharider, herunder "α-limit" dextriner, i det efterfølgende 35 forsukringstrin, som er katalyseret af glucoamylase, der også hydrolyserer a-1,6-glycosidiske bindinger. Imidlertid forløber

2 DK 153569B

sidstnævnte reaktion betydeligt langsommere end den tilsvarende hydrolyse af a-1,4-bindinger, hvilket hindrer den fuldstændige forsukring. Forsøg på at imødegå denne situation ved at tilsætte mere glucoamylase møder vanskeligheder af anden art (bortset fra 5 at indebære højere enzymomkostninger) i form af glucoamylasens evne til også at katalysere en polymerisation af glucose (den såkaldte tilbagereaktion).

Det kan i denne forbindelse nævnes, at en øgning af stivelsesomdannelsen fra ca. 96 DX til ca. 98 DX (hvilket for 10 visse anvendelser af glucose betragtes som en højst signifikant forbedring, idet indholdet, af ledsagestoffer, som ikke er glucose, derved reduceres med ca. 50%), kan opnås ved at anvende en relativt høj koncentration af glucoamylase i forbindelse med en fortynding af substratet til omkring 15% tørstof, se US-patent-15 skrift nr. 4.017.363. Imidlertid er den efterfølgende opkoncentrering af en sådan glucoseopløsning til den almindeligt anvendte højere tørstofkoncentration energikrævende.

Det er kendt teknik at anvende glucoamylase og et af-greningsenzym samtidigt for at opnå en signifikant øgning af 20 glucosekoncentrationen ud fra det rationale, at det er påvist, at afgreningsenzymer effektivt hydrolyserer specifikke typer af a-l,6-glycosidiske bindinger, der optræder i visse oligosaccha-rider med grenede kæder og i visse "α-limit" dextriner. I denne henseende refereres til US-patentskrift nr. 3.897.305, der be-25 skriver den samtidige brug af glucoamylase og Aerobacter aerogenes (Klebsiella pneumoniae) pullulanase, hvorved en signifikant stigning i DX på op til 2% kan opnås for sirupper, der indeholder mindst 30% tørstof. Lignende resultater er påvist for den kombinerede virkning af glucoamylase og et andet afgrenings-30 enzym, nemlig Pseudomonas amyloderamosa isoamylase, som beskrevet i britisk patentskrift nr. 2.074.167.

Imidlertid opnås i de første tilfælde praktisk talt ingen besparelse i glucoamylase, fordi K. pneumoniae pullulana-sens pH optimum bevirker, at forsukringen nødvendigvis må udfø-35 res ved et relativt højt pH (5,5 - 6), ved hvilket glucoamylase-aktiviteten er afgørende forringet.

3 DK 1S3569B

Dette problem møder man ikke med isoamylase, hvis pH optimum er meget tættere på glucoamylasens. Doseringen af sidstnævnte kan derved reduceres væsentligt (med ca. 50%), samtidig med at der opnås en tilvækst i DX værdien på 1 - 2%. Imidlertid 5 udgør de kendte afgreningsenzymers varmelabilitet en alvorlig ulempe, både for isoamylaseprocessen og for den kendte pullula-naseproces. Dette har bevirket, at hidtil har ingen forsukring i nærværelse af afgreningsenzym været teknisk mulig over ca. 55°C, hvorimod glucoamylase som sådan er tilstrækkelig stabil selv ved 10 60°C, ved hvilken temperatur risikoen for mikrobiel substratfor- urening er væsentligt reduceret i sammenligning med lavere temperaturer .

Vanskeligheder af lignende art som de hidtil beskrevne er kendt for omdannelsen af stivelse til høj-maltosesirup ved 15 hjælp af β-amylaser. Ligesom α-amylaser er β-amylaser kun i stand til at nedbryde amylopectin delvist, idet hydrolysen standser, når den nærmer sig et 1,6-a-grenpunkt. Ved at kombinere β-amylasens og afgreningsenzymets virkninger, sidstnævnte i form af pullanase eller isoamylase, er det, som vist i britisk 20 patentskrift nr. 1.144.950 og US patentskrift nr. 3.677.896, muligt at opnå en væsentlig øgning af maltoseindholdet. Imidlertid gælder også her, at. forsukringstemperaturer over 55°C ikke er anvendelig på grund af afgreningsenzymernes varmelabilitet, hvorved risikoen for bakteriel forurening er væsentligt øget.

25 Det er kendt, at Bacillusarter kan danne pullulan- hydrolyserende enzymer (a-1,6-glucosidaser), jfr. Progress in Industrial Microbiology _15 (1979) p. 87 et seq. og Journ.Applied Bacteriology _46 (1979) p. 291 et seq. Ingen af de i disse publikationer beskrevne Bacillusarter danner imidlertid en a-l,6-glu-30 cosidase, som er stabil under almindeligt anvendte betingelser for forsukring med glucoamylase, f.eks. 60°C, pH 4,5-5,0 og 30 vægtprocent tørstof. De fra U.S. patentskrift 4.011.139 kendte thermophile Bacillusstammer har vist sig at danne a-1,6-glucosidaser med pH-optimum over 5,5 og med stærkt faldende aktivitet i 35 pH-området 4,5-5,0.

4 DK 153569B

Formålet med nærværende opfindelse er at eliminere de hidtil kendte afgreningsenzymers mangler ved at tilvejebringe et nyt afgreningsenzym, hvis temperaturstabilitet er sammenlignelig med glucoamylasens, og som ydermere har et pH optimum i nærheden 5 af det tilsvarende for glucoamylase.

Opfindelsen beror på den overraskende iagttagelse, at et. nyt afgreningsenzym af pullulanasetypen med sådanne egenskaber produceres af nyligt opdagede mikroorganismer. Disse mikroorganismer er af Bacillus slægten og tilhører den senere i be-10 skrivelsen definerede taxonomiske gruppe.

Enzymproduktet ifølge opfindelsen indeholdende en a-1,6-glucosidase er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte.

Afgreningsenzym-produktet kan foreligge i fast eller 15 flydende form og vil almindeligvis have en aktivitet i området fra 10 - 350.000 pullulanase enheder/g (som defineret i det efterfølgende).

I en foretrukken udførelsesform har afgreningsenzym-produktet en aktivitet i området fra 100 - 15.000 pullulanase 20 enheder/g.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det ovennævnte enzymprodukt indeholdende en a-1,6-glucosidase som er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 anførte.

25 Ved anvendelsen af nævnte enzymprodukter er tørstof indholdet i stivelseshydrolysatet. mindst 30 vægtprocent, og stivelseshydrolysatets forsukring udføres i pH området fra 3,5 til 5,5 ved en temperatur i området fra 55°C til 65°C, fortrinsvis ikke over 63°C. De foretrukne doseringer af glucoamylase og 30 3-amylase ligger i området fra henholdsvis 0,05 til 0,5 AG enhe der og fra 0,005 til 0,3 3-amylase enheder, idet den foretrukne dosering af afgreningsenzymet ligger i området fra 0,005 til 5 pullulanase enheder (som defineret i det efterfølgende) pr. g tørstof i stivelseshydrolysatet.

35 I det. følgende beskrives opfindelsens enkelte aspekter i detaljer.

5 DK 153569B

Isoleringen af de ovenfor nævnte mikroorganismer udføres på følgende måde:

De til fremstilling af afgreningsenzymet ifølge opfindelsen nødvendige mikroorganismer udvalgtes på grundlag af deres 5 evne til vækst på et basalt medium fremstillet ved aseptisk sammenblanding af lige volumendele tryptoneopløsning (1%) og en saltopløsning med følgende sammensætning: salt procent (NH4)2 S04 0,04 10 MgS04, 7H20 0,1

CaCl2, 2H20 0,05 KH2P04 0,6, idet saltopløsningens pH indstilledes på 3 med svovlsyre (10 N) forud for varmesterilisation. Det således fremstillede basale 15 medium havde pH 4,8 - 5,2.

Agarsubstrater fremstilledes ud fra det basale medium med et indhold af pullulan eller amylopectin på 0,5%, med eller uden gærekstrakt (1%). Inkubering udførtes ved 30°C - 37°C. Pullanaseaktivitet påvistes som klaringszoner efter fældning af 20 pullulan ved overhældning af agarpladerne med acetone. Afgrening af amylopectin påvistes som hydrolysezoner, der udviste en stærkt blå farve med jod-kaliumjodid reagens.

Prøver af de således isolerede Bacillus-stammer og to mutanter heraf blev deponeret hos The National Collection of 25 Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Skotland og tildelt de i den efterfølgende tabel I angivne referencenumre .

6 DK 153569B

NCIB nr. Dato for deponering Oprindelse 11607 8. september 1980 jord fra zoologisk have,

Penang, Malaysia 11610 8. september 1980 jord indsamlet i Rio de 5 Janeiro 11611 8. september 1980 samme 11636 17. februar 1981 jord fra citrus plantage,

Jamaica 11637 17. februar 1981 samme 10 11638 17. februar 1981 mutant af NCIB 11607 11639 17. februar 1981 jord indsamlet i Hillerød,

Danmark 11647 7. april 1981 mutant af NCIB 11607

Taxonomi; 15 De nyopdagede mikroorganismer er aerobe, stavformede bakterier, der danner endosporer. De-tilhører derfor slægten Bacillus.

Deres egenskaber er ikke overensstemmende med egenskaberne af nogen af de anerkendte arter af slægten Bacillus, såle-20 des som disse er beskrevet i Bergeys Manual (8‘. udgave, Williams og Wilkins, Baltimore, 1974) eller i monografien The Genus Bacillus af Gordon, Heynes og Pang, Agriculture Handbook No.

427, US Department of Agriculture, 1973. Nærværende opfindere klassificerer dem derfor som en ny taxonomisk gruppe, som de har 25 tildelt navnet Bacillus acidopullulyticus.

Denne nye taxonomiske gruppe har følgende diagnose:

7 DK 153569B

Morphologi:

Vegetative celler: Stave med en diameter på 0,6 - 1 micron.

Opsvulmede, protoplast-lignende 5 celler iagttages ofte og synes at være stabile i adskillige timer under submers gæring.

Sporer: Cylindriske til elipsoide, centrale til subterminale. Sporangia ikke 10 opsvulmede. I fasekontrast-mikro- skopi er det vanskeligt, at skelne sporerne fra "unstainable globules", som kan være til stede i protoplasmaet.

15 I modsætning°til disse "globules" farves sporerne med malakitgrønt.

Biokemiske reaktioner:

Gram reaktion positiv

Catalase positiv 20 Aerob vækst positiv

Anaerob vækst negativ Vækst ved 50°C negativ Vækst ved 30°C - 37°C god Vækst i 3,5% NaCl negativ 25 Vækst ved pH 4,8 - 5,2 i basalt medium (se ovenfor) indeholdende pullulan som karbonkilde god Æggeblomme reaktion negativ 30 Syredannelse ud fra:

Glucose positiv

Mannitol positiv

s DK 153569B

Reduktion af nitrat til nitrit positiv

Forbrug af citrat negativ

Forbrug af propionat negativ 5 Sønderdeling af tyrosin negativ

Produktion af stivelsesaf-grenende pullulanase, som er aktiv ved 60°C i pH-området. 3,5 til 5,5 positiv 10 VP reaktion variabel

Hydrolyse af kasein variabel

Syredannelse fra:

Xylose variabel

Arabinose variabel.

15 De nye, afgreningsenzym-producerende stammers morfolo-

O

gi viser, at de tilhører den morfologiske gruppe I af slægten Bacillus.

En typekultur for denne nye taxonomiske gruppe er NCIB 11607. Andre repræsentative stammer for gruppen er NCIB 11610, 20 11611, 11636, 11637 og 11639.

Bestemmelse af pullulanaseaktivitet

En pullulanase enhed (PU) defineres som den mængde enzym, der under standardbetingelser (temperatur 60°C og pH 5,0) hydrolyserer pullulan med en hastighed svarende til dannelsen 25 pr. minut af et antal reducerende grupper, der ækvivalerer med 1 μπιοί glucose.

En opløsning (1 ml) af 4 vægtprocent pullulan (fra Sigma Chemical Co.) i acetatpuffer (0,1 M, pH 5) forvarmes i 10 minutter til 60°C, hvorefter der tilsættes en opløsning (1 ml) 30 af enzymet opløst i afioniseret vand i en koncentration svarende til 0,04 - 0,15 PU pr. ml. Reaktionen stoppes efter 30 minutter ved tilsætning af carbonatpuffer, pH 10 (3 ml af 0,5 M opløs-

9 DK 153569B

ning). Koncentrationen af frigjorte reducerende grupper bestemmes derefter ved hjælp af Somogyi-Nelson metoden (J.Biol.Chem.

153 (1944) 375-80; Ibid. 160 (1945), 61-68).

Fremstilling af afgreningsenzym-produktet 5 En afgreningsenzym-dannende Bacillusstamme propageres sædvanligvis på et fast substrat, før den dyrkes under aerobe betingelser i et passende dyrkningsmedium. Begge medier indeholder kilder for assimilerbart. carbon (f.eks. glucose for flydende og amylopectin for faste medier), et basalt saltmedium (se oven- 10 for) bestående af f.eks. ammoniumsulfat som nitrogenkilde samt vækstfremmende næringsstoffer, såsom gærekstrakt og/eller majsstøbevand (flydende medium) eller tryptone (fast substrat). Dyrkningen udføres i det typiske tilfælde ved let forhøjet temperatur, almindeligvis i området fra 30 - 35°C og ved pH under 15 6, fortrinsvis i området fra 5,0 - 6,0, idet opretholdelse af tilnærmelsesvis konstant pH ved hjælp af automatiske hjælpemidler foretrækkes. Enzymet udskilles i mediet.

Den resulterende fermenteringsvæske, der sædvanligvis indeholder fra omkring 0,1 til omkring 50 PU pr. ml, befries for 20 bakterieceller og cellerester tillige med andre faste stoffer, f.eks. ved centrifugering. Den enzymholdige supernatant kan yderligere klares, f.eks. ved filtrering eller centrifugering, hvorefter den eventuelt koncentreres, f.eks. ved ultrafiltrering eller i en fordamper under reduceret tryk. Det. resulterende kon-25 centrat kan, om ønsket, omdannes til tørstof, f.eks. ved lyophi-lisering eler spraytørring. Det resulterende rå enzymprodukt udviser typisk en aktivitet i området fra 100 - 15.000 PU pr. g.

10 DK 153569B

Renfremstilling af afgreningsenzym

Afgreningsenzymet. ifølge opfindelsen kan oprenses fra et råt enzymprodukt, såsom det. koncentrat, der fås i det efterfølgende eksempel 2, f.eks. ved en kombination af cation- og 5 anionbytterkromatografi.

En kolonne af CM-Sepharose CL-6B blev ækvilibreret. med en fosfat-citrat puffer (0,05 M Na2HPO^ titreret med 0,05 M citronsyre til pH 4,5). Enzymkoncentratet fortyndedes med vand til opnåelsen af samme ledningsevne som ækvilibreringspufferen, 10 og dets pH blev indstillet på 4,5. Prøven anbragtes derefter på kolonnen, hvorved enzymet blev fuldstændig adsorberet. Eluering udførtes med den samme puffer, lineært blandet i en gradient-mixer med en 0,05 M opløsning af Na^PO^ til frembringelse af en gradient i pH. Fraktionerne analyseredes for pullulanaseaktivi-15 tet efter den ovenfor beskrevne metode og for proteinindhold efter Lowry-metoden (J.Biol.Chem. 193 (1951) 256), og fraktioner, der udviste enzymaktivitet, sammenblandedes.

En kolonne af DEAE-Sepharose CL-6B ækvilibreredes med fosfat-citrat, puffer (0,01 M titreret. med 0,01 M citron- 20 syre ved pH 6,5). De s amme nblande de fraktioner blev fortyndet.

til samme ledningsevne som ækvilibrerings-pufferen, justeret til pH 6,5 og derefter anbragt på kolonnen. Det fuldstændigt adsor-berede enzym blev elueret med den samme puffer blandet med fosfat-citrat puffer (0,15 M Na2HPO^ titreret til pH 5,6 med 0,15 M 25 citronsyre) hvilket gav en lineær gradient i pufferkoncentration. Fraktioner blev opsamlet og analyseret som ovenfor. Peak-fraktioner udviste en specifik aktivitet på omkring 350.000 PU pr. g.

I natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelectroforese 30 (S.G. Braun et al., J.Virology vol. 1Ό (1972), 221) udviste ind holdet af fraktionerne med den højeste aktivitet et. enkelt proteinbånd svarende til en molekylvægt på omkring 100.000 Dalton. Proteinet har et pi på 5,0 bestemt ved isoelektrisk fokusering på LKB Amfolin plader (udført efter de af LKB Produkter AB, 35 Sverige givne instruktioner).

11 DK 153569B

Enzymkemiske egenskaber

Sammenhængen mellem aktiviteten af afgreningsenzymet ifølge opfindelsen og pH-værdien i området 3,5 - 5,5 ved forskellige temperaturer blev bestemt efter den ovenfor beskrevne 5 metode til bestemmelse af pullulanaseaktivitet under anvendelse af en reaktionsblanding, hvis pH og temperatur blev indstillet på forudbestemte værdier. Figur 1 viser den relative aktivitet afsat mod pH ved henholdsvis 55°C, 60°C og 65°C.

Til bestemmelse af termostabiliteten af enzymet i 10 glucosesirup (ca. 30% tørstof) fortyndedes en opløsning af enzymproduktet, fremstillet i henhold til det efterfølgende eksempel 1 i afioniseret vand, til frembringelse af en opløsning indeholdende 3 PU pr. ml. Delvolumen (1 ml) af denne opløsning blandedes med 1 ml af 0,1 M citrat-fosfat, puffer og glucose (0,8 15 g) .

Efter 3 dages inkubation af prøverne ved 50°C og 60°C bestemtes restaktiviteten ved måling af amylopectinspaltnings-aktiviteten. En sammenligningstest udførtes med Pseudomonas iso-amylase (Hayashibara Biochemical Laboratories, Japan, indehol-20 dende 500.000 isoamylaseenheder (IA pr. g.) fortyndet til 300 IA pr. ml. Resultaterne er vist. i den efterfølgende tabel II.

12 DK 153569B

Tabel IX

Restaktivitet efter 3 dage ___%_

Temperatur pH efter inkubering Afgreningsenzym Isoamy- 5 °C ifølge opfindel- lase _____sen_______ 50 4,5 109 75 4,9 100 68 10 _______ 60 4'9 89 1 5,2 85 3 15 Måling af amylopectinspaltningsaktivitet: Hydrolyse af a-1,6-bindingerne i amylopectin medfører en øgning af farvein-tensiteten (målt ved 610 nm) af det blåfarvede jodamylopectin-kompleks. Denne øgning afhænger af mængden af hydrolyserede a- 1,6-bindinger.

20 Enzymopløsningen (1 ml), fortyndet med afioniseret vand til en koncentration svarende til 1 - 2 PU og 20 - 40 ΙΔ pr. ml for henholdsvis afgreningsenzym og isoamylase, blandes med acetatpuffer (1 ml af 0,5 M, pH 4,5) og en 1% opløsning (5 ml) af amylopectin (CPC, SNOWFLAKE 04201 stivelse). Blandingen 25 inkuberes i 30 minutter ved 50°C. Et delvolumen (0,5 ml) blandes med 15 ml 0,02 N og 0,5 ml jodopløsning (0,01 M jod i 0,2% kaliumiodid).

Efter henstand i 15 minutter ved stuetemperatur sammenlignes den optiske tæthed ved 610 nm med den optiske tæthed 30 af en blindprøve, udført med varme-inaktiveret enzym.

13 DK 153569B

Immunologiske egenskaber

Monospecifikt antiserum fremstilledes ved immunisering af kaniner med oprenset afgreningsenzym efter den af N.H.

Axelsen et al., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoreses 5 (Oslo 1973) chap. 23, beskrevne metode. Afgreningsenzym blev fremstillet ved dyrkning af stammen NCIB 11638 (jfr. det efterfølgende eksempel 1) og oprenset som ovenfor beskrevet.

Immunogenet (0,5 ml af en opløsnng indeholdende 18 PU pr. ml, svarende til 0,15 mg protein), blandet med Freunds 10 adjuvans (0,5 ml), blev injiceret subkutant på kaniner hver anden uge. Antiserum blev udvundet efter en immuniseringsperiode på i alt 8 uger, og ud fra dette fremstilledes immunoglobulin som beskrevet af N.H. Axelsen et. al., se ovenfor.

To prøver af afgreningsenzym-råproduktet hidhørende 15 fra den samme stamme (NCIB 11638), f.eks. som fremstillet i henhold til det efterfølgende eksempel 1, (hver prøve indeholdende 10 PU pr. ml) blev udsat for krydset immunoelektroforese som beskrevet af samme forfattere (kap. 3). Første dimension: 1 procent agarose i TRIS-borsyre puffer (0,2 mM, pH 8,6); elektrofo-20 rese ved 15°C og 8 volt pr. cm i 2 timer. Anden dimension: Samme agarosegel som ovenfor indeholdende immunoglobulinet (100 μΐ); elektroforese ved 15°C og 1 volt pr. cm i 16 timer.

Den ene plade gav en enkelt top af immunoprecipitat ved farvning med Coomassie Brilliant Blue. Den anden plade an-25 vendtes til påvisning af enzymet ved hjælp af en overlejringsteknik. Pladen blev. dækket med en gel indeholdende pullulan og agarose (1% af hver) i maleatpuffer (0,1 M, pH 5). Efter inkube-ring i to timer ved 50°C udfældedes den uomdannede pullulan med acetone, hvorved der fremkaldtes en klaringszone som tegn på 30 pullulanhydrolyse. Sammenligning af de to elektroforetogrammer viste, at klaringszonen og det farvede immunoprecipitat var sammenfaldende, hvilket viser, at det mod afgreningsenzymet fra stammen NCIB 11638 opdyrkede immunoglobulin er monospecifikt.

14 DK 1S3569B

De immunologiske egenskaber af afgreningsenzymet hidrørende fra hver af de øvrige deponerede stammer blev sammenlignet med de tilsvarende egenskaber af enzymet fra NCIB 11638 ved krydset immunoelektroforese, hvorved det ovenfor fremstillede 5 immunoglobulin anvendtes som antiserumreference. De således fremstillede immunogrammer demonstrerede identitet eller partiel identitet med hensyn til immunokemiske egenskaber for alle de undersøgte prøver af afgreningsenzym. Med hensyn til betydningen af udtrykkene "immunokemisk identitet" og "partiel immunokemisk 10 identitet" henvises til den ovenfor citerede monografi af N.H. Axelsen et al., henholdsvis kapitlerne 10 og 11.

De efterfølgende eksempler viser udførelsesformer for den heri beskrevne opfindelse. Navnene Snow Flake, PLURONIC,

Globe og Biozyme er registrerede varemærker.

15 Eksempel 1

Fremstilling af afgreningsenzym-produkt ved hjælp af Bacillus acidopullulyticus stammen NCIB 11638

Stammen NCIB 11638 (som er en mutant af NCIB 11607) blev propageret på skråagar i 2 dage ved 37°C. Agarmediet frem-20 stilledes ud fra det basale medium (side 9) ved tilsætning af amylopectin (0,5% Snow Flake waxy starch CPC) og 2% Bacto-agar (Difco).

Cellerne suspenderedes i sterilt vand og overførtes til et 2 liter laboratorie-fermenteringsapparat (Eschweiler, 25 Kiel, Vesttyskland) indeholdende 1 liter af følgende medium:

15 DK 153569 B

Gærekstrakt 0,2 procent majsstøbevand (50% tørstof) 1,0

MgSC>4 . 7H20 0,025 - 5 K2HP04 0,5 (NH4)2S04 0,125 -

CaCl2 . 2H20 0,025 - PLURONIC L 61 0,1 - opløst i ledningsvand 10 pH indstilledes på 5,5 før autoklavering ved 130°C i 30 minutter. Glucose autoklaveredes separat og blev tilsat til en slutkoncentration på 1%.

Under dyrkningen blev pH holdt på 5,5 ± 0,2 ved tilsætning af svovlsyre (2% opløsning). Temperaturen blev holdt på 15 30,0 ± 0,1°C og beluftningshastigheden på 650 ml pr. minut (± 10%) .

Efter dyrkning i 22 timer påbegyndtes substratudbytning med en fortyndingshastighed på 0,03 h . Efter yderligere 36 timer opnåedes "steady state" fermenteringsbetingelser ved en 20 celletæthed på omkring 4 g celletørstof pr. liter (svarende til optisk tæthed - 8 ved 450 nm). Pullulanaseaktiviteten var 7,5 PU pr. ml.

I løbet af 6 dages fermentering under "steady state" betingelser opsamledes 4000 ml kulturvæske i en afkølet behol-25 der. Cellerne blev fjernet ved centrifugering i 30 minutter ved 2300 rpm, og supernatanten, indeholdende 5,1 PU pr. ml, blev koncentreret ved ultrafiltrering gennem en G-600 membran under anvendelse af standard Sartorius laboratorieudstyr. Rumfanget af dette koncentrat. (800 ml) reduceredes yderligere i en Biichi 30 rotationsfordamper ved 45°C. Det endelige koncentrat (76 ml) blev nedfrosset og lyophiliseret, hvorved der opnåedes et tørt, pulverformet produkt (6,8 g) med en aktivitet på 1150 PU pr. g.

16 DK 153569B

Eksempel 2

Fremstilling af afgreningsenzym-produkt fra stammen Bacillus acidopullulyticus NCIB 11647

Fermentering udførtes i et pilot fermenteringsapparat 5 af rustfrit stål (totalrumfang 550 liter, 70 cm diameter) forsynet med to 6-bladede turbineomrørere med 24 cm diameter, og med tilbehør til kontinuert fermentering, -indbefattet udstyr til opretholdelse af konstant pH og temperatur. Fermenteringsapparatet blev fyldt op med 300 liter af et medium med følgende sammensæt-10 ning:

Sojamel 25 g

Majsstøbevand (50% tørstof) 5

Kartoffelstivelse 8,3 KH2P04 1,7 15 (NH4)2S04 1,0

Bakterieamylase BAN 120 L 0,013 ml

Skumdæmpningsmiddel PLURONIC L 61 0,233 -

Ledningsvand ad 1 liter 20 Mediets pH blev indstillet på 5,8 med natriumhydroxid- — -opløsning. Stivelsen blev forflydet ved gradvis hævning af temperaturen fra 60°C til 90°C i løbet af 50 minutter med påfølgende sterilisation ved 121°C i 60 minutter.

Kulturen af stamme NCIB 11647, som var dyrket i 4 dage 25 i en Fernbachkolbe på det samme agarnæringssubstrat som i eksempel '1, anvendtes til podning af 300 liter medium. Gæringen udførtes ved 29°C - 31°C ved en omrøringshastighed på 100 rpm og en beluftningshastighed på 150 standard liter pr. minut ved et tryk på 0,5 bar. Kontinuert tilsætning af et sterilt medium til 30 kulturen påbegyndtes 33 1/2 time efter podningen med en hastighed på 15 liter pr. time. Mediet havde samme sammensætning som ovenfor beskrevet og fremstilledes på samme måde. På det tids-

17 DK 153569 B

punkt, da volumenet var tiltaget til 375 liter, påbegyndtes den automatiske aftapning af kulturvæske. Ca. 30 timer efter podningen iagttoges kraftig vækst, både bedømt ved mikroskopi og ved tiltagende udvikling af CC>2.

5 Opsamling af kulturvæske påbegyndtes, da kulturen var 73 timer gammel. Afgreningsenzym-aktiviteten var da steget til over 10 PU pr. ml. I perioden fra 115 timer til 210 timer opretholdtes tilnærmelsesvis "steady state" ved en enzymkoncentration svarende til mellem 50 og 76 PU pr. ml ved et pH i fermente-10 ringsvæsken på mellem 5,4 og 5,9.

Alle efterfølgende operationer udførtes ved pH 5,5 til 5,7. De i løbet af 110 timer opsamlede 1650 liter fermenterings- 2 væske filtreredes på et vacuumtromlefilter (2,5 m ) coated med diatomé jord som filterhjælp. Filtratet blev koncentreret, og be- 15 friet for lavmolekylære forbindelser ved ultrafiltrering på et 2 DDS 7 m modul (DDS, København, Danmark) udstyret med en celluloseacetat membran, type 600. Det opnåede koncentrat (70 liter) indeholdt 9,4% tørstof.

Yderligere koncentrering til et volumen på 21 liter 20 udførtes i en roterende vacuuminddamper. Yderligere trykfiltrering under anvendelse af samme filterhjælp som ovenfor gav et enzymkoncentrat (15,5 kg, indeholdende 28,8% tørstof) med en aktivitet. på 1500 PU pr. g.

Eksempel 3 25 Fremstilling af afgreningsenzym-produkt fra stammerne Bacillus acidopullulyticus NCIB 11610, NCIB 11636 og NCIB 11637

Propagering af stammerne og fermenteringerne udførtes på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Maltose (0,5%) anvendtes i stedet for glucose som carbonkilde. Gennemsnitsværdi for 30 fermenteringernes øvrige parametre vil fremgå af den efterfølgende tabel I.

/

18 DK 153569 B

Tabel I

NCIB NCIB NCIB

__11610 11636 11637

Fortyndingshastighed, 5 h"1 0,07 0,057 0,06

Optisk tæthed ved 450 nm 9,2 8,3 9,1 10 Tørvægt af bakterier, g/liter 5,4 4,9 3,8

Afgreningsenzymaktivi- t.et, PU/ml 0,80 0,25 0,11 15

Kulturvæskerne opsamledes og afgreningsenzymprodukter-ne blev udvundet i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1. Detaljer angående oparbejdelsen vil fremgå af den følgende tabel II.

20 Tabel II

Stamme Kultur- Supernatant__Lyofiliseret produkt NCIB nr. væske ml ml PU/ml g PU/g 11610 5316 5110 0,37 7,5 69,2 25 11636 1497 1405 0,08 4,4 14,4 11637 4856 4790 0,04 6,0 12,2

Eksempel 4

19 DK 153569 B

Fremstilling af afgreningsenzym-produkt fra stamme Bacillus acidopullulyticus NCIB 11639

Propagering, inkubering og fermentering af stamme NCIB 5 11639 udførtes som beskrevet i eksempel 1. Fermenteringsmediet havde følgende sammensætning: *) Sojamelekstrakt 2,0 procent

Majsstøbevand 0,5

MgS04, 7H20 . 0,025 - 10 k2hpo 0,1 (NH4)2S04 0,05 -

Amylase-forflydet stivelse (Dextrose equiv. 11) 0,5 - PLURONIC L 61 0,1 15 opløst i ledningsvand *) Ekstraktion af sojamel ved pH 4,5 og 50°C i 4 timer. Uopløst. stof fjernes ved centrifugering.

pH indstilledes på 4,0, hvorefter der autoklaveredes ved 130°C i 60 minutter.

20 pH blev under dyrkning holdt på 5,6 ± 0,1 ved tilsæt ning af natriumhydroxid opløsning (2%). Temperaturen var 30,0 ± 0,1°C og beluftningshastigheden 320 ml pr. minut ved en omrøringshastighed på 530 - 565 rpm. Fermenteringen udførtes kontinuert ved en fortyndingshastighed på 0,03 til 0,05 h ^ i 186 25 timer, hvorefter opsamling af overløbende kulturvæske påbegynd tes.. Kulturvæsken (5100 ml, 0,47 PU/ml) opsamledes derefter over tøris i en periode på 97 timer under følgende betingelser:

20 DK 153569B

Fortyndingshastighed -0,049 ± 0,008 h ^

Optisk tæthed (450 nm) 10,6 ±1,1

Celletæthed 2,9 ±1,5 g/1

Afgreningsenzymaktivitet 0,5 ± 0,1 PU/ml 5 Cellerne blev fjernet på den i eksempel 1 beskrevne måde. Supernatanten filtreredes på et Whatman GFA glasfilter (11 cm) og blev derefter koncentreret til 200 ml på et Amicon DC 2 "hollow fibre" modul forsynet med en H1P10 membran. Uklarhed fjernedes på GFA filteret og filtratet koncentreredes yderligere 10 på Amicon modulet under anvendelse af en 202-DDS 600 membran (DDS, København, Danmark). Det således opnåede koncentrat (30 ml) havde en aktivitet på 65 PU/ml. Koncentratet opbevaredes i dybfrossen tilstand.

Eksempel 5 15 100 kg majsstivelse (Globe 03430, CPC) blev opslemmet i ledningsvand indeholdende 100 ppm Ca++, hvorefter der fyldtes op til 225 liter. pH blev indstillet på 6,3, og 135 g TERMAMYL 60 L (NOVO Industri A/S, Danmark) blev tilsat.

Suspensionen pumpedes kontinuerligt igennem en jet-20 koger (Hydro-Termal Corp. Milwaukee), hvor den ved direkte dampinjektion blev hævet til 105°C og holdt på denne temperatur i 5 minutter. Den forflydede stivelsesopslemning blev lynafkølet og pumpet over i en forsukringstank, hvor den henstod i ca. 1 time ved 95°C.

25 Til standsning af reaktionen indstilledes pH af den forflydede stivelse på 4,0 ved 75°C, hvorefter hele portionen uden rensning blev spraytørret. DE af den spraytørrede malto-dextrin var 6.

Der fremstilledes substrater til forsukring ved genop-30 løsning af passende mængder af denne maltodextrin i afioniseret vand til opnåelse af ca. 30% tørstof. Der udtoges derefter delrumfang af dette substrat, som ophededes til 60°C, idet pH ind-

21 DK 153569 B

stilledes på 4,8. Varierende mængder af afgreningsenzym fra Bacillus acidopullulyticus stammen NCIB 11647 tilsattes derefter sammen med glucoamylase (Amyloglucosidase NOVO 150, 150 AG enheder/ml). Prøveudtagning fra disse reaktionsblandinger blev 5 foretaget med forudbestemte tidsintervaller, hvorefter glucose-indholdet i hver prøve bestemtes ved HPLC. Følgende resultater opnåedes:

Afgreningsenzym Glucoamylase Reaktions- Glucose 10 PU enheder/g tørstof AG enheder/g tid tørstof h pH % 0 (kontrol) 0,225 72 4,1 95,8 15 0,225 96 4,1 95,9 0 (kontrol) 0,113 72 4,6 93,3 0,113 96 4,3 94,4 0,01 0,150 96 4,3 96,1 20 0,1 0,113 96 4,4 95,9 0,5 0,113 96 -4,4 96,7 1.0 0,113 72 ; -4,6 97,0 2.0 0,113 72 4,7 97,3 4.0 0,113 72 4,7 97,4 25_____

Resultaterne viser, at det samme glucoseniveau kan opnås med den halve dosering af glucoamylase i forhold til kontrollen, når en dosering af afgreningsenzym på 0,1 PU/g tørstof anvendes sammen med glucoamylase. Hvis doseringen af afgrenings-30 enzym øges, øges ligeledes det maximalt opnåelige glucoseniveau.

Eksempel 6 *

22 DK 153569 B

Delrumfang af det ifølge eksempel 5 fremstillede substrat blev opvarmet til 55°C eller 60°C og pH indstillet på 4,9. Der tilsattes glucoamylase i en mængde svarende til 0,113 AG en-5 heder/g tørstof og afgreningsenzym fra Bacillus acidopullulyti-cus stammen NCIB 11647 svarende til 1,2 PU/g tørstof. Prøver af reaktionsblandingen blev analyseret som beskrevet i eksempel 5. Følgende resultater opnåedes:

Temperatur Reaktionstid Glucose 10 °C__h__% 24 84,5 48 96,5 55 72 97,1 96 97,3 15 24 90,0 48 96,8 60 72 97,0 96 97,3 20 |____

Disse resultater bekræfter, at afgreningsenzymet er tilstrækkelig varmestabilt til anvendelse ved 60°C.

Eksempel 7

Et substrat af spraytørret maltodextrin med DE 5 frem-25 stilledes efter den i eksempel 5 beskrevne metode.

23 DK 153569B

Delvolumen af dette substrat blev opvarmet til 60 °C, 62,5°C of 65°C, idet pH indstilledes på 4,9. Der tilsattes glu-coamylase svarende til 0,113 AG enheder og afgreningsenzym fra Bacillus acidopullulyticus stammen NCIB 11647 svarende til 1 PU 5 enhed, begge beregnet pr. g tørstof. Der udførtes også kontrolforsøg med forsukring, hvor der tilsattes en mængde glucoamylase svarende til 0,225 AG enheder/g tørstof, men intet afgreningsenzym.

Prøver af reaktionsblandingerne blev analyseret som 10 angivet, i eksempel 5. Tørstofindholdet i disse forsukringsforsøg var 31%.

24 DK 153569B

Afgrenings- Glucoamylase Reaktionsenzym PU enheder pr. Temperatur tid Glucose enheder pr. g tørstof °C h % gram tørstof 5 ' 24 92,1 0 0,225 60 48 95,3 72 96,0 96 96,0 10_____ 24 88,9 1 0,113 60 48 96,1 72 96,7 15 96 97,0 24 92 1 0 0,225 62,5 48 95*1 20 72 95,8 96 96,1 24 89 3 25 1 0,113 62,5 48 95*9 72 96,8 96 97,0 30 24 91,4 0 0,225 65 48 94,1 72 95,2 96 95,4 35 24 82 9 1 0,113 65 48 89,*9 72 92,8 . 96 93,6 40 [il

Disse resultater viser, at forsukring med afgrenings-enzym og glucoamylase kan udføres ved 60 - 62,5°C. Ved 65°C opnås dårligere resultater, hvilket kan skyldes glucoamylasens instabilitet ved denne temperatur.

Eksempel 8

25 DK 153569B

Delvolumen af det i henhold til eksempel 5 fremstillede substrat blev opvarmet til 60°C> hvorefter.pH indstilledes på.

4,5 og 4,8. Der tilsattes en mængde glucoamylase svarende til 5 0,113 AG enheder og afgreningsenzym fra Bacillus acidopullulyti- cus stammen NCIB 11647 svarende til 1 PU enhed, begge beregnet pr. g tørstof. Prøver af reaktionsblandingerne blev analyseret som i eksempel 5, hvorved følgende resultater opnåedes:

Reaktionstid Glucose 10 pH h % 24 89,6 48 96,6 15 4,5 72 96,8 96 96,9 24 89,0 48 ' 96,5 20 4,8 72 96,8 96 97,0

Tallene viser, at sammenlignelige resultater opnås ved forsukring ved pH 4,5 og ved 4,8.

25 Eksempel 9

Et substrat med 35% tørstof (DE 6) blev fremstillet ved at opløse maltodextrin, fremstillet som beskrevet i eksempel 5, i afioniseret vand. Delrumfang af dette substrat opvarmedes til 60°C, hvorefter pH indstilledes på 4,3 og 4,8.

26 DK 153569 B

Der tilsattes glucoamylase svarende til 0,113 AG en-heder/g tørstof og en mængde oprenset afgreningsenzym fra Bacillus ae idopul lulyt. icus stammen NCIB 11647 (120 PU/mg protein) svarende til 1 PU enhed pr, g tørstof. Prøver af reak-5 tionsblandingerne blev analyseret som beskrevet i eksempel 5, hvorved følgende resultater opnåedes:

Reaktionstid Glucose _h__pH__% 10 0 4,3 24 4,3 89,2 48 4,2 96,1 72 4,2 96,2 15 0 4,8 24 4,5 88,4 48 4,5 96,0 72 4,4 96,2 20 Resultaterne viser, at glucoseniveauer af samme stør relsesorden opnås, uanset om forsukringen påbegyndes ved pH 4,3 eller 4,8.

Eksempel 10

Substrater med forskelligt tørstofindhold fremstille- 25 des ved opløsning af 100 g af det i eksempel 5 fremstillede mal-todextrin (DE 6) i varierende mængder af afioniseret vand, hvorefter opløsningerne indstilledes på pH 4,6 ved 60°C. Der tilsattes 0,113 AG enheder og 1 PU enhed af afgreningsenzymet fra

27 DK 153569 B

Bacillus acidopullulyticus stammen NCIB 11647, begge beregnet pr. g tørstof. Prøver af reaktionsblandingerne analyseredes som beskrevet i eksempel 5, hvorved følgende resultater opnåedes: Tørstof Max. glucose- "·» 5 %_ indhold % 25 97,7 30 97,2 35 96,3 10 40 94,9 45 . 93,0 I en forsukring, udført som kontrol uden afgrenings-enzym, var det maximalt opnåelige glucoseindhold 96,3 i nærvæ-15 relse af 0,225 AG enheder glucoamylase pr. g tørstof, idet substratkoncentrationen var 30%, temperaturen 60°C, og pH 4,5. Dette viser, at forsukringen kan udføres ved et højere tørstofindhold, til opnåelse af det samme glucoseniveau, når der anvendes afgreningsenzym. Dette medfører, at energiforbruget til inddamp-20 ning formindskes betydeligt.

/

Eksempel 11

Spraytørret maltodextrin med DE 5,0 fremstilledes ifølge den i eksempel 5 beskrevne fremgangsmåde.

Substrater til forsukring fremstilledes ved genopløs-25 ning af passende mængder af denne maltodextrin i afioniseret vand, således at tørstofindholdet blev ca. 30%. Delrumfang af dette substrat opvarmedes til 60°C, hvorefter pH indstilledes på 5,0.

28 DK 153669 B

Der tilsattes 600 g/ton tørstof af β-amylase (Biozyme Μ II - Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Japan, indeholdende 33,4 β-amylaseenheder pr. g) og varierende mængder af af-greningsenzym fra Bacillus acidopullulyticus stammen NCIB 11647.

5 Maltoseindholdet bestemtes ved HPLC på prøver udtaget af reaktionsblandingen efter 72 timer. Der opnåedes følgende resultater:

Afgreningsenzym Glucose Maltose PU/g tørstof__%__% 10 0 (kontrol) 0,3 58,7 0,1 0,2 63,0 0,5 0,4 71,8 1 0,4 75,8 15 2 0,5 78,4 4 0,4 79,6

Resultaterne viser, at væsentligt højere maltose-niveauer kan opnås, når afgreningsenzymet anvendes sammen med 20 β-amylase.

Eksempel 12

En opslemning fremstilledes af 114 g tapioca stivelse i 886 ml afioniseret vand, tilsat 0,5 g calciumchlorid. Opslem-ningen blev varmebehandlet ved ca. 100°C og derefter afkølet til 25 50°C. pH indstilledes.på 5,7, og der tilsattes 0,56 g Biozyme M

II og en mængde af afgreningsenzym fra Bacillus acidopullulyticus stammen NCIB 11647 svarende til 2 PU/g tørstof. pH blev holdt konstant på 5,5. Prøver af reaktionsblandingen blev analyseret ved HPLC.

29 DK 153569B

Reaktionstid Glucose Maltose h %__% 24 0,5 77,4 5 48 0,6 84,4 ............ " 1 1 1 ' 1 .......... " · .....-...I \

Tabellen viser, at afgreningsenzymet kan anvendes sammen med β-amylase til fremstilling af sirupper med særligt højt maltoseindhold.

Claims (2)

30 DK 153569 B

1. Enzymprodukt indeholdende en a-1,6-glucosidase, kendetegnet ved, at a-1,6-glucosidasen er identisk med den a- 1,6-glucosidase,. der dannes ved dyrkning af en af Bacillus 5 acidopullulyticus stammerne NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11611, NCIB 11636, NCIB 11637, NCIB 11638, NCIB 11647 eller NCIB 11639 i et egnet næringsmedium, og at dens aktivitetsoptimum, målt ved inkubering i 30 minutter i acetatpuffer (0,05 M) ved pH 4-5, er mindst ca. 60°C, dets pH-optimum, bestemt ved inkubering i 30 10 minutter i acetatpuffer (0,05 M ved ca. 60°C), ligger i området fra 3,5 til 5,5, og det udviser en restaktivitet på mindst 50% efter 72 timer ved 60°C og pH 5, målt i en glucoseopløsning med 30 vægtprocent tørstof.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af enzymproduktet 15 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en af Bacillus acidopullulyticus stammerne NCIB 11607, NCIB 11610, NCIB 11611, NCIB 11636, NCIB 11637, NCIB 11638, NCIB 11647 eller NCIB 11639 dyrkes i et egnet næringsmedium indeholdende karbon- og nitrogenkilde og uorganiske salte, efterfulgt af udvinding af enzymproduktet.