FI79142B - Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. Download PDFInfo
- Publication number
- FI79142B FI79142B FI822773A FI822773A FI79142B FI 79142 B FI79142 B FI 79142B FI 822773 A FI822773 A FI 822773A FI 822773 A FI822773 A FI 822773A FI 79142 B FI79142 B FI 79142B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- reaction mixture
- process according
- insulin
- acid
- trypsin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
1 79142
Menetelmä meuliinijohdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään ihmisen insuliinin valmi s tamiseksi.
Ennestään tunnetaan erilaisia menetelmiä ihmisen insuliinin valmistamiseksi. Esimerkkejä tällaisista prosesseista ovat mm. uuttaminen ihmisen haimarauhasista, synteesi perustana olevista aminohapoista, geenimanipulaatio ja sian insuliinin muuntaminen ihmisen insuliiniksi, Eräät menetelmät sian insuliinin muuntamiseksi ihmisen insuliiniksi suoritetaan sian B30 des-oktapeptιdι-<B23-B-30)-insu1iinin ja eräät des(Ala >-insuliinin kautta.
B30 Tämä keksintö kohdistuu tarkemmin sanottuna sian des<Ala )- insuliinin muuntamiseen ihmisen insuliiniksi ihmisen insulii-B30 nin treoniini -johdannaisen kautta.
Sokeritaudin hoidossa on tavallisesti käytetty sian tai härän insuliinia sisältäviä insuliinivalmisteιta. Härän, sian ja ihmisen insuliinin aminohappokoostumuksessa on vähäisiä eroja, jolloin ero ihmisen ja sian insuliinin välillä rajoittuu yhteen ainoaan aminohappoon, sillä B30-aminohappo ihmisen insuliinissa on treoniini kun se taas sian insuliinissa on ala-niini .
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 80 101 966 on selostettu erästä menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi des-B30 (Ala )-insu1iinista, katso myös Nature 280 (1979), 412.
Mainitun patenttihakemuksen mukaan suoritetaan amidointi edullisesti väliaineessa, joka sisältää 0-65 %, edullisesti 40-60 % orgaanista liuotinta. Reaktiolämpötila on lisäksi o o edullisesti 20-40 C, jolloin 37 C:n lämpötilaa on käytetty kaikissa esimerkeissä. Kytkennän saanto määritettiin 3 esimerkin mukaan HPLC:llä (high pressure liquid chromatography) 2 79142 75, 80 ja noin 50 %:kaι, Julkaisun Nature mukaan oli saanto noin 73 %.
Erästä menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi des-B30 (Ala )-insullinista on vielä selostettu julkaisussa Pro ceedings of the 2nd International Insulin Symposium, Aachen, Saksan liittotasavalta, 1979. Tämän julkaisun mukaan suoritettiin amidointi seoksessa, joka sisälsi noin 60 % orgaanis- o ta liuotinta ja reaktio suoritettiin 38 C:ssa. Kytkennän saanto määritettiin HPLC:llä 67 %:ksi.
Erästä toista menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi B30 des-(Ala )-msulιinistä on lisäksi selostettu julkaisussa Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, Helsin-g«5r , Tanska, 1980. Mainitun julkaisun mukaan suoritettiin prosessi seoksessa, joka sisälsi suurin piirtein 60 % orgaanista liuotinta. Reaktiolämpötila oli kaikella todennäköisyy-o della 37 C. 30 min reaktioajan jälkeen oli saanto 85 %, mutta saanto aleni 70 %:iin 22 tunnin jälkeen.
Eräs syy alempaan saantoon tunnetuilla menetelmillä on ineu- liinitappio ei-toivuttujen sivureaktioiden johdosta, esim.
D0I-Thr(R )-OR :n muodostumisen johdosta, jossa DOI tarkoit- 1 2 taa sian des-oktapeptldi-<B23-B30)-ineu1iinia, ja R ja R tarkoittavat samaa kuin jäljempänä.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena oli aikaansaada menetelmä, jossa reaktiotuotteen saanto oli erittäin korkea, edullisesti korkeampi kuin 90 %.
Yllättäen on osoittautunut, että tällainen saanto voidaan saavuttaa käyttämällä paljon alempaa vesipitoisuutta reaktio-seoksessa kuin ennestään tunnetuissa menetelmissä, ja että lisäksi on edullista suorittaa prosessi huomattavasti alemmassa reaktiolämpötilassa kuin jo tunnetuissa menetelmissä.
Il 3 79142
Yllä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnus- B3 0
omaista, että des(Ala )-insuliini tai sen suola tai kompleksi saatetaan reagoimaan L-treoniinijohdannaisen kanssa, jolla on yleinen kaava I
Thr(R2)-OR1 I
1 2 jossa R tarkoittaa karboksyylisuojaryhmää, ja R tarkoittaa vetyä tai hydroksyylisuojaryhmää, tai tämän suolan kanssa veden, veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja trypsiinin seoksessa, jossa veden määrä reaktioseoksessa on 30-10 %. Suositeltava reaktiolämpötila on noin 0°C:n ja huoneen lämpötilan välillä, so. noin 25-20°C.
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa B3 0 liuottamalla des(Ala )-insuliini, kaavan I L-treoniini-johdannainen ja trypsiini veden ja vähintään yhden veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen seokseen, mahdollisesti hapon läsnäollessa.
Ne orgaaniset liuottimet, jotka soveltuvat käytettäväksi tässä keksinnössä, ovat polaarisia liuottimia, jotka ovat veteen sekoittuvia ja edullisesti sellaisia, että ne kykenevät sisältämään korkeita insuliiniyhdisteiden ja treo-niiniesterin pitoisuuksia. Esimerkkejä tällaisista sopivista orgaanisista liuottimista ovat aproottiset liuottimet, kuten esimerkiksi Ν,Ν-dimetyyliformamidi, N,Ν-dimetyyliaset-amidi, N-metyylipyrrolidoni, heksametyylifosforitriamidi, dimetyylisulfoksidi, dioksaani, asetoni, tetrahydrofuraani, formamidi ja asetonitriili, ja proottiset liuottimet, kuten esimerkiksi etanoli, metanoli, 2-propanoli ja 1,2-etaanidioli. Liuotin vaikuttaa koko järjestelmään sellaisenaan ja ne olosuhteet, jotka soveltuvat yhdelle liuotinjär-jestelmälle korkeine amidointisaantoineen, eivät välttämättä sovellu toiselle liuottimelle. Parhaimmat saantotulokset on saatu aproottisilla liuottimilla ja aproottiset liuottimet ovat kaikkein edullisimmat esillä olevaa keksintöä suoritettaessa.
4 79142
Riippuen siitä mitä veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta käytetään, valitusta reaktiolämpötilasta ja hapon läsnäolosta reaktioseoksessa, tulee veden pitoisuuden reak-tioseoksessa olla pienempi kuin noin 30 % (tilavuus/tilavuus) , edullisesti pieneni kuin noin 25 % (tilavuus/tila-vuus) ja suurempi kuin noin 10 % (tilavuus/tilavuus), edullisesti suurempi kuin noin 15 % (tilavuus/tilavuus).
Eräs etu, kun pienennetään veden määrää reaktioseoksessa, on että sivutuotteiden muodostuminen tällöin vähenee.
Samoin lisäämällä hapon määrää reaktioseoksessa, on mahdollista vähentää sivutuotteiden muodostumista. Saannon kohoaminen on positiivisessa suhteessa alhaisen vesipitoisuuden kanssa reaktioseoksessa. Entsyymin denaturoinnin estämiseksi reaktioseoksessa, jossa on alhainen vesipitoisuus, tulee reaktiolämpötilan edullisesti olla huomattavasti alhaisempi kuin ne reaktiolämpötilat, joita tavallisesti käytetään trypsiinillä suoritetuissa peptidisvnteeseissä, nimittäin pienempi kuin noin 37°C.
Esillä olevan keksinnön soveltamisen kannalta ei ole olennaista, minkä tyyppistä trypsiiniä käytetään. Trvpsiini on hyvin karakterisoitu entsyymi, jota on kaupallisesti saatavana hyvin puhtaana, erityisesti häristä ja sioista. Lisäksi voidaan käyttää mikrobiologista tietä saatua trypsiiniä. Esillä olevan keksinnön sovellutuksen kannalta ei myöskään trypsiinin muoto, esimerkiksi kiteinen trypsiini (liukenematon muoto), immobilisoitu trypsiini tai edes trypsiini-johdannaiset (niin kauan kuin trypsiiniaktiviteetti säilyy) ole olennainen. Sanonta trypsiini käsittää tässä käytettynä kaikista lähteistä peräisin olevia trvpsiinejä ja kaikkia trypsiinimuotoja, joissa amidoiva aktiviteetti on säilynyt, mukaanluettuna proteaasit joilla on trypsiinintapainen spesifisyys, esimerkiksi Achromobacter lyticus-proteaasi, vertaa Agric. Biol. Chem. 4^2, 1443 .
5 79142
Esimerkkeinä aktiivisista trypsiinijohdannaisista voidaan mainita asetyloitu trypsiini, sukkinyloitu trypsiini, glutaarialdehydillä käsitelty trypsiini ja immobilisoidut trypsiinijohdannaiset.
Mikäli käytetään immobiloisoitua trypsiiniä, suspendoi-daan tämä väliaineeseen.
Sopivan puskurijärjestelmän aikaansaamiseksi voidaan lisätä orgaanisia tai epäorgaanisia happoja kuten suolahappoa, muurahaishappoa, etikkahappoa, propionihappoa tai voihappoa ja/tai emäksiä kuten pyridiiniä, TRIS, N-metyy-limorfoliinia ja N-etyylimorfoliinia. Orgaanisia happoja suositaan. Reaktio voidaan kuitenkin suorittaa ilman tällaisia lisäyksiä. Lisätty happomäärä on tavallisesti pienempi kuin noin 10 ekvivalenttia kaavan I L-treoniinijohdannaisen ekvivalenttia kohti. Hapon määrä on edullisesti 0,5-5 ekvivalenttia kaavan I L-treoniinijohdannaisen ekvivalenttia kohti. Voidaan lisätä ioneja,jotka stabiloivat trypsiinin, kuten kalsiumioneja.
Menetelmä voidaan suorittaa lämpötilassa, joka on 37°C:n ja reaktioseoksen jäätymispisteen välillä. Riittävän reaktionopeuden aikaansaamiseksi suoritetaan entsymaattiset reaktiot trypsiinillä tavallisesti 37°C:ssa. Trypsiinin in-aktivoitumisen välttämiseksi on kuitenkin edullista suorittaa esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilan alapuolella. Käytännössä suositaan reaktiolämpötiloja, jotka ovat yli noin 0°C.
Reaktiolämpötilasta, trypsiinin lisätystä määrästä ja muista reaktio-olosuhteista riippuen, on reaktioaika tavallise-ti muutaman tunnin ja muutaman päivän välillä.
Veden ja liuottimen välinen suhde, hapon ja emäksen välinen suhde ja reaktioaika säätelevät suuressa määrin trypsiinin 6 79142 vaikutusta sen amidointivaikutuksen edistämiseksi ja tryp-siinin katalysoimien sivureaktioiden vaimentamiseksi. Vähentämällä veden pitoisuutta reaktioseoksessa saavutetaan kumpikin, mutta tällöin lisätään myös sitä nopeutta, jolla trypsiini denaturoituu irreversiibelisti. Trypsiinin denaturoitumista voidaan - ainakin osittain - ehkäistä alentamalla reaktiolämpötilaa. Reaktiolämpötilan alentaminen alentaa myös amidointinopeutta, mutta tämän alenemista voidaan korvata pidentämällä reaktioaikaa.
B 3 0
Trypsiinin ja des(Ala )-insuliinin painosuhde reaktio-seoksessa on tavallisesti yli noin 1:200, edullisesti yli noin 1:50 ja alle noin 1:1.
Amidoinnin tuloksena olevat ihmisen insuliinin treoniini-B 3 0
-johdannaiset, voidaan esittää yleisellä kaavalla II
(Thr(R2)-OR1)B30-h-In II
B 3 0 jossa h-In tarkoittaa ihmisen des(Thr )-insuliiniosaa, 1 2 jossa R ja R tarkoittavat samaa kuin yllä.
Käyttökelpoisia kaavan I L-treoniinijohdannaisia ovat sellaiset, joissa R1 on karboksyvlisuojaryhmä, joka voidaan B3 0 poistaa ihmisen insuliinin treoniini -esteristä (kaava II) olosuhteissa, jotka eivät aikaansaa olennaista palautumatonta muutosta insuliinimolekvylissä. Esimerkkeinä tällaisista karboksyylisuojaryhmistä mainittakoon alempi al-kyyli, esimerkiksi metyyli, etyyli ja tert-butyyli, subs-tituoitu bentsyvli, kuten p-metoksibentsyvli ja 2,4,6-tri- metyylibentsyyli ja difenyylimetyyli, ja ryhmät, joilla on 3 3 yleinen kaava -Ci^CHjSC^R , jossa R tarkoittaa alempaa alkyyliä, kuten metyyliä, etyyliä, propyyliä ja n-butyvliä.
2
Sopivia hydroksyylisuojaryhmiä R ovat sellaiset, jotka B 3 0 voidaan poistaa ihmisen insuliinin treoniini -johdannaisista (kaava II) olosuhteissa, jotka eivät aikaansaa olen- 11 7 79142 naista palautumatonta muutosta insuliinin molekyylissä.
2
Esimerkkeinä tällaisista ryhmistä (R ) voidaan mainita tert-butyyli.
Alemmat alkyyliryhmät sisältävät vähemmän kuin 7 hiiliatomia, edullisesti alle 5 hiiliatomia.
Wunsch on julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Voi. XV/1, editor: Eugen Muller, Georg
Thieme Verlag Stuttgart, 1974, selostanut muita tavanomaisesti käytettyjä suojaryhmiä.
Hoppe-Seyler on julkaisussa Z. Physiol. Chem. 359, (1978), B 3 0 799 selostanut menetelmää des(Ala )-insuliinin valmistamiseksi .
Eräät kaavan I L-treoniinijohdannaiset ovat tunnettuja yhdisteitä ja muita L-treoniinijohdannaisia voidaan valmis-. . taa analogisesti tunnettujen yhdisteiden valmistuksen kans- ' s a.
Kaavan I L-treoniinijohdannaiset voivat olla näiden vapai-ta emäksiä tai sopivia orgaanisia tai epäorgaanisia suoloja, edullisesti asetaatteja, propionaatteja, butyraatteja tai vetyhalideja, kuten vetyklorideja.
B3 q
On toivottavaa käyttää reagensseja, so. des(Ala )-insuliinia ja L-treoniinijohdannaisia, joilla on kaava I, suurina pitoisuuksina. Kaavan I L-treoniinijohdannaisen ja B3 0 des(Ala )-insuliinin moolisuhde on edullisesti yli noin 5:1.
On toivottavaa, että kaavan I L-treoniinijohdannaisten pitoisuus reaktioseoksessa ylittää 0,1 moolia.
T. . , . . . . . .B3 0
Ihmisen insuliini saadaan ihmisen insuliinin creonuni 8 79142 johdannaisista (kaava II) poistamalla suojaryhmä I< ja 2 mahdollinen suojaryhmä R sinänsä tunnetuilla menetelmillä tai analogisesti sinänsä tunnettujen menetelmien kanssa. Siinä tapauksessa että R1 on metyyli, etyyli tai ryhmä 3.3 -C^CF^SC^R , ]ossa R tarkoittaa samaa kuin yllä, voidaan mainittu suojaryhmä poistaa lievissä emäksisissä olosuhteissa vesipitoisessa väliaineessa, edullisesti pH-arvossa, joka on välillä noin 8 ja noin 12, esimerkiksi noin 9,5. Emäksenä voidaan käyttää ammoniakkia, trietyyli-amiinia, dikarbonaatti/karbonaattipuskuria tai alkalimetal-lihydroksideja kuten natriumhvdroksidia. Siinä tapauksessa että R^ on tert-butyyli, substituoitu bentsyyli kuten p-metoksibentsyyli tai 2,4,6-trimetyylibentsvyli tai di-fenyylimetyvli, voidaan mainittu ryhmä poistaa happohydro-lyysillä, edullisesti trifluorietikkahapolla. Trifluori-etikkahappo voi olla vedetön tai sisältää hieman vettä, tai se voi olla laimennettu orgaanisella liuottimena ku- 2 ten dikloorimetaanilla. Siinä tapauksessa, entä R on tert-butyyli, voidaan mainittu ryhmä poistaa happohydro-lyysillä, kuten yllä.
B 3 0
Edullisia kaavan II ihmisen insuliinin treeniini -joh- 2 .....
dannaisia ovat yhdisteet, joissa R on vety, ja näitä voidaan valmistaa kaavan I L-treoniinijohdannaisista, joissa _ 2 R on vety.
B3 0
Esimerkkinä des(Ala )-insuliinin kompleksista tai suolasta voidaan mainita sinkkikompleksi tai sinkkisuola.
Jos reaktio-olosuhteet valitaan yllä mainitun selityksen mukaisesti ja jos alla olevissa esimerkeissä annetut reaktio-olosuhteet otetaan huomioon, on mahdollista saada ihmisen insuliinin treoniini^^-johdannaisten (kaava II) saanto, joka on suurempi kuin 90 % tai vieläkin suurempi kuin 95 %.
Il 9 79142
Eräs edullinen menetelmä ihmisen insuliinin valmistami-
B 3 O
seksi ihmisen insuliinin treoniini -johdannaista on seuraava: 1) Jos trypsiiniaktiviteettia on jäljellä amidoinnin jälkeen, poistetaan tämä edullisesti, esimerkiksi olosuhteissa, joissa trypsiini on inaktiivinen, esimerkiksi hap-pamessa väliaineessa pH-arvossa alle 3. Trypsiini voidaan poistaa molekyylipainon perusteella suoritetulla erotuksella, esimerkiksi geelisuodattamalla "Sephadei® G-50"-geelillä tai "Bio-ge ]^}?-30 "-geelillä etikkahapos sa , katso edellä mainittu Nature 280.
B 3 0 2) Epäpuhtaudet kuten reagoituina ton des (Ala )-insuliini voidaan poistaa anioni- ja/tai kationinvaihtokromatogra- fiällä.
3) Tämän jälkeen lohkaistaan ihmisen insuliinin treonii- B3 0 ni -johdannainen (kaava II) ja ihmisen insuliini erotetaan, esimerkiksi kiteytetään sinänsä tunnetulla tavalla.
Tällä tavoin voidaan aikaansaada ihmisen insuliinia, jolla on hyväksyttävä farmaseuttinen puhtaus ja ihmisen insuliini voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen.
Käytetyt lyhenteet ovat yhtäpitäviä niiden sääntöjen kanssa, jotka IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature on hyväksynyt (1974) , katso Collected Tentative Rules IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975.
Ihmisen insuliinijohdannaiSten ja ihmisen insuliinin valmistusmenetelmiä selostetaan alla olevissa esimerkeissä.
Esimerkit kuvaavat muutamia edullisia suoritusmuotoja esillä olevan keksinnön mukaisesta menetelmästä.
10 79 1 42
Esimerkki 1
B3 O
10 mg sian des(Ala )-insuliinia liuotettiin 100 yul:aan 10 M etikkahappoa- 50 ^ul:aan tätä liuosta lisättiin 100 ^,ul 2 M Thr-OMe (Me tarkoittaa metyyliä) N,N-dimetyyliaset-amidissa, 60 ,ul Ν,Ν-dimetyyliasetamidia, 15 ^ul vettä ja 10 ^ul trypsiinin liuosta (8 % paino/tilavuus) 0,05 M kalsiumkloridissa. Inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa 24 h saos-tettiin tuote 8 ml:lla asetonia, erotettiin sentrifugoi- malla, pestiin 8 ml:11a asetonia, erotettiin sentrifugoi- B 3 0 maila ja kuivattiin tyhjössä. (Thr-OMe) -h-In-saanto määritettiin HPLCillä.
Tuote liuotettiin 2 mlraan 1 M etikkahappoa ja 100 ,ul liuosta lisättiin 4 x 200 mm:n "Nucleosil®5 C^g-kolonnil- le" vastavirta-HPLC:tä varten käyttäen 0,2 M anmoniumsul- faattipuskuria säädettynä pH-arvolle 3,5 ja jossa oli 26,8 % (tilavuus/tilavuus) asetoninitriiliä eluenttina.
B3 0
Virtausnopeudella 1 ml/min eluoitui des(Ala )-insuliini B 3 0 18 min jälkeen ja (Thr-OMe) -h-In 24 min jälkeen. Reak- B23 tion sivutuotteet, nimittäin (Thr-OMe) -des-heptapepti-di-(B24-B30)-insuliini eluoitui 7 minuutin jälkeen. Proteiinien havaitseminen ja määrä määritettiin ekstinktiolla arvossa 280 nm. Analyysillä saatiin seuraava yhdisteiden jakautuminen:
pOO
(Thr-OMe) -h-In: 97,1 % B 3 0 des(Ala )-insuliini: 2,5 % (Thr-OMe) B^-des-heptapeptidi (B24-B30)-insuliini : 0,4 %
Esimerkit 2-16
Alla olevat esimerkit 2-16 taulukossa 1 suoritettiin analogisesti esimerkin 1 kanssa, jolloin reaktioparametria muutettiin, kuten taulukossa on esitetty. Kaikissa esimerkeissä lisättiin kuitenkin 10 ^,ul 8 S:sta trypsiiniä vesi-liuoksessa, 100 ^,ul orgaanista liuotinta, joka sisälsi kaavan I treoniinijohdannaista sekä 50 ,ul etikkahappoa, jossa oli 20 % des(Ala )-insuliinia. Kaavan I treoniini- u 79142 johdannaisen moolisuus orgaanisessa liuottimessa ja etikka-hapon moolisuus ilmenevät taulukosta 1. Reaktioaika oli 24 h. Taulukossa 1 on käytetty seuraavia lyhenteitä: HOAc on etikkahappo, DMAA on Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, DMF on Ν,Ν-dimetyyliformamidi, DMSO on dimetyylisulfoksidi, NMP on N-metyylipyrrolidoni ja THF on tetrahydro-furaani.
Syntetisoitaessa (Thr-OBut)B30-h-In, vertaa esimerkki 15, suoritettiin eluointi käyttäen gradienttia asetonitrii-lissä, joka oli 26,8 % - 40 % (tilavuus/tilavuus).
i2 7 9 1 42
•H
:rd C tn :nj 3> ιτ5 :r£3 c tn S to tn
H -H (U
λ; o tn
3 4J M
r-H Ή O
3 -8" 9) dP ΟΟΓΟΟΟΟΟΟΟΟΓ'^ΗΓ'ΟΟ 4-1 tn O w Γ4Γ4γΗΓ\ΙΓΜΓΜΓ4ΓΝΓν1ΓΜ(-ΜΓΝ|ΓΝ(ΝΓΜ 4-1 (U -h
01 > 4-J
w c I
ib 01 Q)
J C M
tN "C
Cc- ffiCCKKSCffiKEKEnKEdKK C
CQ
4-1 4-1 , (ΐ)Φα)Φ(υ<ιιω(ΐ)(υαια)ΦΦ^3 x sssssssassassm m o 4-1
c r^r^nr^r^r-r-^vxjr^GO^or^rH
to ca° tnoitjit^t^t^tjitjitjic^cotj'cr'^tj' to
CO
8* C t^im'i-^J’fNLriM'On^rCNCNCNtNCNCN
.§ ,—j C\J r—I (N i—I I—I I—I i—t (N r—I r—I
'J -P 1 I-1 O ^ LO LO O LO LO LO LO LO t-O LO LO LO LT) Lfl 33 i—I i—i I—t i—I i—I r—i i—I i—I i—I i—I i—I i—I r-4
At
C
Tl CC
% SS
^ S -u m
OOLDOOOOOOOOLnOOO
tjb 5 "tn Cl -H -H
0 »ή'—*
e I
• · -H
0 rH C/3 ^QCSoooooooooo-^^^roo
e ^ 1-1 *—t >—t l—I i-1 I—I i—I i-1 I—I i-1 I-1 I—I
1 tn 1 C e •h jd _ P h 'o e tn
C-CCU-HStAirMCMrMrNjCNjrNjrMrsitNCNOMCNCsirNJ O O in H (D -i—i -H Q
>4 -A C 8
P e e E I -S
£ £ -g <c < < oo <c < < < σι e 3 rfCChfefctntn&.ft^^hfi^ M -H -h sssssssssssssss
OCrH QQQQQQQQZSQQQQQ
*2 fi e* .¾ (Nn^in^hcoo^OHrNjro^iniö
(/) «Η ·~I I—I i-H ·—I I—I I—I I—I
W M
i3 791 42
Esimerkit 17 - 34 Nämä esimerkit suoritettiin analogisesti esimerkkien 1-16 kanssa sillä poikkeuksella, että reaktioaika oli 4 h. Kussakin esimerkissä oli saanto sama kuin esimerkeissä 1 - 16 .
Esimerkkien 1 - 16 ja esimerkkien 17 -34 vertailusta ilmenee,että saatiin sama saanto ja että tämä mm. erottaa uuden menetelmän ennestään tunnetuista menetelmistä, joita on selostettu julkaisussa Proceedings of the 16th European Peptide Symposium, katso yllä. Tämän seurauksena on riippuvuus ajasta eliminoitu.
Esimerkki 35 B3 0 250 mg kiteistä (Thr-OMe) -h-In suspendoitiin 25 mlraan vettä ja liuotettiin lisäämällä 1 N natriumhydroksidi-liuosta pH-arvoon 10,0. pH-arvo pidettiin vakiona arvossa 10,0 24 h 25°C:ssa. Muodostunut ihmisen insuliini kiteytettiin lisäämällä 2 g natriumkloridia, 350 mg natriumase-taattitrihydraattia ja 2,5 mg sinkkiasetaattidihydraattia, minkä jälkeen lisättiin 1 N suolahappoa, jotta saatiin pH-arvoksi 5,52. 24 tunnin seisomisen jälkeen 4°C:ssa erotettiin romboedriset kiteet sentrifugoimalla, pestiin 3 ml :11a vettä, erotettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin tyhjössä. Saanto: 220 mg ihmisen insuliinia.
Claims (10)
1. Menetelmä ihmisen insuliinin tai ihmisen insuliinin B30 treoniini -johdannaisten tai näiden suolojen tai komplek- B30 sien valmietamisekeι saattamalla sian des<Ala )-insuliini tai sen suola tai kompleksi reagoimaan L-treoniinijohdannaisen kanssa, jolla on yleinen kaava I 2 1 Thr(R )-OR I 1. jossa R tarkoittaa karboksyylisuojaryhmää ja R tarkoittaa vetyä tai hydroksyylisuojaryhmää, tai sen suolan kanssa veden, veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja trypsiinin seoksessa, tunnettu siitä, että reaktloseoksen vesipitoisuus on 30-10 % (tilavuus/ti1avuus), reaktio lämpötila on pienempi o kuin 37 C ja että happoa on läsnä, minkä jälkeen saadun johdannaisen suojaryhma lohkaistaan ihmisen insuliinin muodoeta-miseks i .
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I L-treoniinijohdannaisen pitoisuus reak-tioseoksessa on yli 0,1 moolia, reaktiolämpötila on reaktio-seoksen jäätymispisteen yläpuolella ja reaktioseoksessa on korkeintaan 10 ekvivalenttia happoa kaavan I L-treoniinijohdannaisen ekvivalenttia kohti.
3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiolämpötila on huoneen läm- o pötilan alapuolella ja yli 0 C.
4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktioseoksen vesipitoisuus on alle 25 % ja yli 15 % (tilavuus/tilavuus).
5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veteen sekoittuva orgaaninen liuotin on asetoni, tetrahydrofuraani, N,N-dimetyy1iformamidi, li ΐ5 79142 N, N-dimetyyliaeetamidi, N-metyy1ipyrro 1idoni, asetonitrii1ι tai DMSO.
6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happo on etikkahappo,
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapon määrä reaktioseoksessa on O, 5-5 ekvivalenttia kaavan I L-treonnnijohdannaisen ekviva-1entt ia koht i.
8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- B30 telmä, tunnettu siitä, että trypsiinin ja des<Ala )-insu-liinin painosuhde reaktioseoksessa on yli 1:200, edullisesti yli 1:50 ja alle 1:1.
9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- telmä, tunnettu siitä, että R on metyyli tai tert-butyy-li .
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lohkaisu suoritetaan vesipitoisessa väliaineessa emäksen läsnäollessa, edullisesti pH-arvossa 8-12, tai happo-hydrolyysillä.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK353781A DK353781A (da) | 1981-08-10 | 1981-08-10 | Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater |
DK353781 | 1981-08-10 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI822773A0 FI822773A0 (fi) | 1982-08-09 |
FI822773L FI822773L (fi) | 1983-02-11 |
FI79142B true FI79142B (fi) | 1989-07-31 |
FI79142C FI79142C (fi) | 1989-11-10 |
Family
ID=8124014
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI822773A FI79142C (fi) | 1981-08-10 | 1982-08-09 | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4489159A (fi) |
JP (1) | JPS5836399A (fi) |
AT (1) | AT374683B (fi) |
AU (1) | AU549066B2 (fi) |
BE (1) | BE894070A (fi) |
CA (1) | CA1174973A (fi) |
CH (1) | CH661746A5 (fi) |
DE (1) | DE3229674A1 (fi) |
DK (1) | DK353781A (fi) |
ES (1) | ES514845A0 (fi) |
FI (1) | FI79142C (fi) |
FR (1) | FR2511036B1 (fi) |
GB (1) | GB2105342B (fi) |
GR (1) | GR77999B (fi) |
IE (1) | IE53712B1 (fi) |
IT (1) | IT1152492B (fi) |
LU (1) | LU84327A1 (fi) |
NL (1) | NL182964C (fi) |
NO (1) | NO157506C (fi) |
SE (1) | SE451073B (fi) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5776693A (en) * | 1990-06-08 | 1998-07-07 | Institut Pasteur | Specific detection of the mycobacterium tuberculosis |
WO1999021573A1 (en) | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Eli Lilly And Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
US6531448B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Insoluble compositions for controlling blood glucose |
US20080096800A1 (en) * | 2004-03-12 | 2008-04-24 | Biodel, Inc. | Rapid mucosal gel or film insulin compositions |
US20080090753A1 (en) | 2004-03-12 | 2008-04-17 | Biodel, Inc. | Rapid Acting Injectable Insulin Compositions |
US20080085298A1 (en) * | 2004-03-12 | 2008-04-10 | Biodel, Inc. | Rapid Mucosal Gel or Film Insulin Compositions |
US7713929B2 (en) * | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
US8084420B2 (en) | 2005-09-29 | 2011-12-27 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
CA2649109A1 (en) | 2006-04-12 | 2007-10-25 | Biodel, Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
US9060927B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-23 | Biodel Inc. | Insulin formulations for rapid uptake |
US20120123089A1 (en) * | 2009-07-09 | 2012-05-17 | Biocon Limited | Preparative non-linear gradient based chromatographic method and purified products thereof |
WO2011090971A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders |
US10052364B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders |
MY177247A (en) | 2013-12-23 | 2020-09-10 | Biocon Biologics Ltd | Method of production of human insulin methyl ester |
JPWO2018147393A1 (ja) * | 2017-02-10 | 2019-11-21 | 三菱ケミカル株式会社 | ヒトインスリン精製用分離剤及びヒトインスリンの精製方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
US3903068A (en) * | 1972-12-26 | 1975-09-02 | Us Health Education & Welfare | Facile synthesis of human insulin by modification of porcine insulin |
JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
JPS55138392A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
JPS55138393A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
DK146482C (da) * | 1979-04-13 | 1986-10-06 | Shionogi & Co | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin |
US4343898A (en) * | 1980-02-11 | 1982-08-10 | Novo Industri A/S | Process for preparing esters of human insulin |
DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
-
1981
- 1981-08-10 DK DK353781A patent/DK353781A/da unknown
-
1982
- 1982-08-09 LU LU84327A patent/LU84327A1/de unknown
- 1982-08-09 IE IE1911/82A patent/IE53712B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-08-09 CA CA000408994A patent/CA1174973A/en not_active Expired
- 1982-08-09 DE DE19823229674 patent/DE3229674A1/de active Granted
- 1982-08-09 ES ES514845A patent/ES514845A0/es active Granted
- 1982-08-09 BE BE6/47694A patent/BE894070A/fr not_active IP Right Cessation
- 1982-08-09 US US06/406,571 patent/US4489159A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-08-09 FR FR8213868A patent/FR2511036B1/fr not_active Expired
- 1982-08-09 NO NO822704A patent/NO157506C/no unknown
- 1982-08-09 AT AT0303582A patent/AT374683B/de active
- 1982-08-09 SE SE8204627A patent/SE451073B/sv not_active IP Right Cessation
- 1982-08-09 CH CH4775/82A patent/CH661746A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-08-09 IT IT22784/82A patent/IT1152492B/it active
- 1982-08-09 AU AU86974/82A patent/AU549066B2/en not_active Ceased
- 1982-08-09 GR GR68986A patent/GR77999B/el unknown
- 1982-08-09 GB GB08222914A patent/GB2105342B/en not_active Expired
- 1982-08-09 NL NLAANVRAGE8203137,A patent/NL182964C/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-08-09 FI FI822773A patent/FI79142C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-08-10 JP JP57138095A patent/JPS5836399A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI79142B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
AU651196B2 (en) | Amidinophenylalanine derivatives, a process for the preparation thereof, use thereof and agents containing these as anticoagulants | |
US6414114B2 (en) | Disulfides and thiol compounds | |
JPH02174797A (ja) | ペプチド誘導体およびその用途 | |
US5382679A (en) | Process for the preparation of glutathione S-acyl derivatives, compounds obtained from said process and an intermediate useful for the preparation thereof | |
FI77876B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
EP0480061B1 (en) | Hepatic disorder inhibitor | |
PL210437B1 (pl) | Sposób wytwarzania związków insuliny | |
FI78119B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
DK149615B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin, hvori pheb1 eventuelt er fraspaltet, og som eventuelt baerer beskyttelsesgrupper | |
US5095004A (en) | Fluorine containing atrial natriuretic peptides | |
US5166394A (en) | Coupling reagent for peptide synthesis | |
CN113667007B (zh) | 一种索马鲁肽侧链的液相制备方法 | |
JPS6026099B2 (ja) | ペプチド、その酸附加塩およびその製造法 | |
US4387049A (en) | Adamantyl containing peptides | |
US5371185A (en) | 1-amino thiorcyl benzimidazoyl-2-one compounds | |
US4448972A (en) | Adamantyl containing intermediates | |
GB2078755A (en) | Oxytocin analogs and method for preparation thereof | |
DK149314B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threonin-b30-derivater af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf | |
KR920000694B1 (ko) | 디펩타이드유도체의 제조방법 | |
US6346610B1 (en) | Process for preparing antifungal V-28-3M | |
Marzoni et al. | A convenient, large scale synthesis of N-Cbz-(S-phenyl)-L-cysteine | |
EP0079362A1 (en) | A process for the preparation of insulin derivatives | |
KR20040092058A (ko) | 에르도스테인의 제조방법 | |
KR20010024156A (ko) | 칼시토닌의 제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: NOVO INDUSTRI A/S |