FI121014B - Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä - Google Patents

Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä Download PDF

Info

Publication number
FI121014B
FI121014B FI962879A FI962879A FI121014B FI 121014 B FI121014 B FI 121014B FI 962879 A FI962879 A FI 962879A FI 962879 A FI962879 A FI 962879A FI 121014 B FI121014 B FI 121014B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sequence
zinc finger
dna
binding
nucleotide
Prior art date
Application number
FI962879A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI962879A0 (fi
FI962879A (fi
Inventor
Iii Carlos F Barbas
Joel M Gottesfeld
Peter E Wright
Original Assignee
Scripps Research Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Research Inst filed Critical Scripps Research Inst
Publication of FI962879A0 publication Critical patent/FI962879A0/fi
Publication of FI962879A publication Critical patent/FI962879A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121014B publication Critical patent/FI121014B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Description

Sinkki sormiprotei ini j ohdannai siä ja niiden menetelmiä Tämä hakemus on osittain jatkoa hakemukselle sarjanumero 08/312 604, joka on jätetty 28. syyskuuta 1994, ja 5 on osittain jatkoa hakemukselle sarjanumero 08/183 119, joka on jätetty 18. tammikuuta 1994.
Keksinnön tausta 1. Keksinnön alue Tämä keksintö koskee yleisesti geenien ilmentymisen 10 säätelyn aluetta ja erityisesti menetelmiä geenien ilmentymisen moduloimiseksi käyttämällä nu-kleotideihin sitoutuvista sinkkisormiproteiineista johdettuja polypeptidejä.
2. Aiheeseen liittyvän alan kuvaus
Transkription säätely saavutetaan pääasiassa prote-15 iinien sekvenssispesifisellä sitoutumisella DNA:han ja RNA:hän. Tunnetuista proteiiniaiheista, jotka ovat mukana DNA: n sekvenssispesifisessä tunnistamisessa, sinkkisormi-proteiini on ainutlaatuinen modulaarisen luonteensa suhteen. Tähän mennessä on identifioitu sinkkisormiproteiine-20 ja, jotka sisältävät 2-37 moduulia. Yli 200 proteiinissa, joista monet ovat transkriptiotekijöitä, on osoitettu olevan sinkkisormialueita. Sinkkisormet liittävät transkriptiotekijöitä kohdegeeneihinsä pääasiassa sitoutumalla DNA-emäsparien - "DNA-tikkaiden askelmien" - muodostamiin spe-25 sifisiin sekvensseihin.
Sinkkisormimoduulit ovat noin 30 aminohapon pitui sia aiheita, joita esiintyy monissa erilaisissa transkriptiota säätelevissä proteiineissa eukaryoottisissa organismeissa. Kuten nimi osoittaa, tämä nukleiinihappoon sitoutu-30 va proteiinialue on taipuneena sinkki-ionin ympärille.
Sinkkisormialue on ensimmäisen kerran tunnistettu Xenopusin oosyyttien transkriptiotekijästä TFIIIA [Miller et ai., EMBO 4 (1985) 1609 - 1614: Brown et ai., FEBS Lett. 186 (1985) 271 - 274] . Tämä proteiini koostuu seuraavan konsensus- 35 sekvenssin yhdeksästä epätäydellisestä toistosta: (Tyr, 2
Phe) -X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-4-His-X2-6 (SEQ ID NO: 1), jossa X on mikä tahansa aminohappo.
TFIIIA:n tavoin useimmissa sinkkisormiproteiineissa on konservatiivisia (evoluutiossa pitkään säilyneitä) kys-5 teiini- ja histidiiniryhmiä, jotka koordinoivat tetraedri-sesti sinkkiatomia kullakin sormialueella. Tämäntyyppisten (kaksi kysteiiniä ja kaksi histidiiniä sisältävien) yksit-, täisten sinkkisormipeptidien, kuten hiivaproteiinissa ADRl, ihmisen miessukupuoleen liittyvässä proteiinissa ZFY, HIV-10 tehostinproteiinissa ja Xenopus-proteiinissa Xfin esiintyvien peptidien, rakenne on selvitetty erotuskyvyltään hyvillä NMR-menetelmillä [Kochouyan et ai., Biochemistry 30 (1991) 3371 - 3386; Omichinski et ai., Biochemistry 29 (1990) 9324 - 0334; Lee et ai., Science 245 (1989) 635 -15 637] ja on ehdotettu yksityiskohtaisia malleja sinkkisormi- en ja DNA:n väliselle vuorovaikutukselle (Berg 1988; Berg 1990; Churchill et ai. 1990). Lisäksi hiiren välittömästä varhaisesta proteiinista zif268 (tunnetaan myös nimellä Krox-24) peräisin olevan, kolmisormisen polypeptidin ja 20 DNA:n muodostaman kompleksin rakenne on selvitetty röntgen-kristallografiällä [Pavletich ja Pabo, Science 252 (1991) 809 - 817]. Kukin sormi sisältää antiparalleelisen β-kään-nöksen, sormenpääalueen ja lyhyen amfipaattisen a-heliksin, joka zif268-sinkkisormien ollessa kyseessä sitoutuu DNA:n 25 suurempaan uurteeseen. Lisäksi konservatiiviset hydrofobiset aminohapot ja sinkin koordinoituminen kysteiini- ja histidiiniryhmillä stabiloivat yksittäisen sormialueen rakennetta.
Prototyyppisinkkisormiproteiini TFIIIA sisältää yh-30 deksän sinkkisormen ryhmän, joka sitoo 5S-RNA (kokoa 5S oleva RNA) -geenien sisällä olevan 43 ep:n sekvenssin, kun taas zif268-luokan (esimerkiksi Krox-20, Spl) säätelyprote-iinit sisältävät vain kolme sinkkisormea paljon suuremmassa polypeptidissä. zif268-:n kolmesta sinkkisormesta kukin tun-35 nistaa 3 ep:n osan 9 ep:n tunnistussekvenssistä. Suurin osa 3 zif268:n DNA-kosketuksista tapahtuu fosfaattien kanssa ja guaniiniryhmien kanssa yhdellä DNA-säikeellä DNA-kierteen suuremmassa uurteessa. Mekanismi, jolla TFIIIA sitoutuu DNA:han, on sen sijaan monimutkaisempi. Aminopäässä olevat 5 3 sinkkisormea tunnistavat 13 ep:n sekvenssin ja sitoutuvat suurempaan uurteeseen. Samoin kuin zif268:n kohdalla nämä sormet tulevat kosketukseen guaniiniryhmien kanssa pääasiassa yhdellä DNA-säikeellä. Toisin kuin zif268-luokan proteiinien yhteydessä TFiiiA:n sinkkisormet 4 ja 6 sitoutuvat 10 kumpikin pienempään uurteeseen tai sen poikki ja saattavat sormet 5 ja 7 - 9 takaisin kosketukseen suuremman uurteen kanssa [Clemens et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 10822 - 10826] .
zif268:n kiderakenne viittaa siihen, että a-15 kierteen pinnalla olevat määrätyt histidiiniryhmät (sinkkiä koordinoimattomat His-ryhmät) ja arginiiniryhmät osallistuvat DNA:n tunnistukseen. Tarkemmin määriteltynä varautuneet aminohapot, jotka ovat välittömästi α-kierteen edellä ja kierteen asemissa 2, 3 ja 6 (välittömästi ennen konserva-20 tiivistä histidiiniä), osallistuvat vetysidosten muodostukseen DNA:n guaniinien kanssa. Samoin kuin säätelyproteiinin Krox-20 sormi 2 ja Spl:n sormet 1 ja 3 sisältää TFlliAm sormi 2 histidiiini- ja arginiiniryhmiä näissä DNA:n kanssa kosketukseen menevissä asemissa; lisäksi kukin näistä sink-25 kisormista tunnistaa sekvenssin GGG minimaalisesti. Transkriptiotekijöiden Spl ja Krox-20:n välillä tehdyt sormen-vaihtokokeet ovat vahvistaneet 3 ep:n sinkkisormitunnistus-koodin tämän sinkkisormiproteiiniluokan yhteydessä [Nardel-li et ai., Nature 349 (1989) 175 - 178]. Mutageneesikokeet 30 ovat myös osoittaneet näiden aminohappojen merkityksen DNA-tunnistuksen spesifioinnissa. Olisi toivottavaa määrittää yksinkertainen koodi, joka spesifioi sinkkisormi-nukleo-tiditunnistuksen. Jos tällainen koodi pystyttäisiin avaamaan, voitaisiin suunnitella mihin tahansa valittuun DNA-35 sekvenssiin sitoutuvia sinkkisormipolypeptidejä. Mainitun- 4 laisen polypeptidin ja sen tunnistussekvenssin kompleksia voitaisiin hyödyntää tämän sekvenssin sisältävän geenin transkriptioaktiivisuuden moduloinnissa (ylös- tai alaspäin) .
5 On kuvattu myös KNArhan sitoutuvia sinkkisormipro- teiineja. Clemens et ai. [Science 260 (1993) 530] ovat havainneet, että TFIIIAin sormet 4-7 antavat 95 % 5S- rRNA:han sitoutuvan TFlllAm vapaasta energiasta, kun taas sormilla 1 - 3 on samanlainen vaikutus 5S-geenin promootto-10 rin sitoutumisessa. Kahden tunnetun 5S-RNA-sitoutumis-proteiinin, TFIIIA:n ja p43:n, vertaaminen paljastaa vähän muita homologioita kuin konsensus-sinkkiligandit (C ja H) , hydrofobiset aminohapot ja treoniini-tryptofaasi-treonii-nitriplettiaiheen sormessa 6.
15 Sinkkisormien suunnittelemiseksi uudelleen täytyy kehittää uusia selektiivisiä strategioita ja tarvitaan lisätietoja sekvenssispesifisen nukleotiditunnistuksen rakenteellisesta pohjasta. Nykyisten proteiiniteknisten saavutusten yhteydessä on hyödynnetty sekvenssi- ja/tai raken-20 neanalogiaan perustuvia suunnittelustrategioita. Vaikka mainitunlainen strategia saattaa riittää aiheiden siirtoon, se rajoittaa kykyä tuottaa uusia nukleotidisitoutumisaihei-ta, joita ei tunneta luonnossa. Sinkkisormien suunnittelu uudelleen hyödyntämällä analogiaan perustuvaa strategiaa, 25 on itse asiassa saavuttanut vain vaatimatonta menestystä [Desjarlais ja Berg, Proteins 12 (1992) 101].
Tämän seurauksena on olemassa tarvetta uusille strategioille spesifisiä tunnistuskohtia sisältävien muiden sinkkisormien samoin kuin uusien sinkkisormien suunnittele-30 miseksi geenien ilmentymisen tehostamista tai heikentämistä varten. Tämä keksintö täyttää tämän tarpeen.
5
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö liittyy eristettyyn nukleotideihin sitoutuvaan sinkkisormipolypeptidivarianttiin, joka käsittää vähintään kaksi sinkkisormimoduulia, jotka sitoutuvat 5 sellulaariseen nukleotidisekvenssiin ja moduloivat kyseisen sellulaarisen nukleotidisekvenssin toimintaa. Tämä variantti sitoutuu joko DNA:hän tai RNA:han ja voi tehostaa tai heikentää promoottorista tai rakennegeenin sisältä käsin tapahtuvaa transkriptiota. Sellulaarinen nukleotidisekvens-10 si voi olla sekvenssi, joka on solussa luonnostaan esiintyvä sekvenssi tai,., sellulaarinen virusperäinen nukleotidisek-venssi.
Keksintö liittyy myös farmaseuttiseen koostumukseen, joka käsittää terapeuttisesti vaikuttavan määrän nuk-15 leotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidijohdannaista tai terapeuttisesti vaikuttavan määrän nukleotidisekvens-siä, joka koodittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidi johdannaista, joka johdannainen sitoutuu sellulaariseen nukleotidisekvenssiin ja moduloi sellulaarisen 20 nukleotidisekvenssin toimintaa, yhdistettynä farmaseutti sesti hyväksyttävään kantajaan.
Keksintö liittyy menetelmään sellaisen sellulaarisen nukleotidisekvenssin inhiboimiseksi, joka käsittää sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen, joka menetelmä kä-25 sittää kyseisen aiheen saattamisen kosketukseen sellaisen nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormipolypeptidijohdannaisen kanssa, joka sitoutuu kyseiseen aiheeseen.
Keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän eristetyn nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormipolypeptidivariantin val-30 mistamiseksi, joka sitoutuu sellulaariseen ennaltamäärät- tyyn nukleotidisekvenssiin, joka menetelmä käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaiset vaiheet. Polypeptidivarianttia koodittava ilmentämiskirjasto on edullisesti faagikirjasto.
6
Keksintö liittyy myös menetelmään sellaisen kohteen hoitamiseksi, jolla on solujen proliferaatiohäiriö, joka häiriö liittyy sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheeseen liittyvän geeni-ilmentymisen modulaatioon, joka menetelmä 5 käsittää sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen saattamisen kosketukseen vaikuttavan määrän kanssa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidijohdannaista, joka sitoutuu sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheeseen ja moduloi geenin aktiivisuutta.
10 Keksintö liittyy lisäksi menetelmään solun jonkin nukleotidisekvenssin toimintaa moduloivan ja sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheeseen sitoutuvan proteiinin identifioimiseksi, joka käsittää sellaisten komponenttien inku-boinnin, jotka käsittävät otaksuttua moduloivaa proteiinia 15 koodittavan nukleotidisekvenssin, joka on kytketty toimin nallisesti ensimmäiseen indusoitavissa olevaan promoottoriin, ja raportointigeenin, joka on kytketty toiminnallisesti toiseen indusoitavissa olevaan promoottoriin ja sink-kisormi-nukleotidisitoutumisaiheeseen, joka inkubointi teh- 20 dään olosuhteissa, jotka mahdollistavat komponenttien vuorovaikutuksen; ja otaksutun moduloivan proteiinin raportointigeenin ilmentymiseen kohdistuvan vaikutuksen mittaamisen.
Piirustusten lyhyt kuvaus 25 Kuvio 1 esittää TFIIIA:n sinkkisormien ja 5S-KNA- geenin sisäisen promoottorin välisen vuorovaikutuksen mallia .
Kuvio 2A esittää TFIIIAm kolmen ensimmäisen amino-terminaalisen sinkkisormen aminohapposekvenssiä.
30 Kuvio 2B esittää zfl - 3:n pienimmän mahdollisen sitoutumiskohdan nukleotidisekvenssiä.
Kuvio 3 esittää geeliliikkuvuussiirtymämääritystä, joka koskee zfl - 3:n sitoutumista 23 ep:n 32P-leimattuun kaksisäikeiseen oligonukleotidiin.
7
Kuvio 4 esittää in vitro -transkriptiosta tehtyä autoradiogrammia, joka osoittaa, että zfl - 3 estää T7RNA-polymeraasin tekemän transkription.
Kuvio 5 osoittaa, että zfl - 3:n sitoutuminen tun-5 nistussekvenssiinsä estää transkription lähellä olevasta T7RNA-promoottorista käsin. Käyrä esittää zfl - 3:n geeli-liikkuvuussiirtymämäärityksessä sitomien DNA-molekyylien prosentuaalista osuutta (x-akseli) T7RNA-polymeraasitrans-kriptioon prosentuaalisen inhibition (y-akseli) funktiona. 10 Kuvio 6 on autoradiogrammi, joka osoittaa että zfl - 3 estää eukaryoottisen RNA-polymeraasi III -trans kription hedelmöitymättömistä Xenopusin munista peräisin olevassa in vitro -transkriptiojärjestelmässä.
Kuvio 7 esittää zif268:n pCornb 3.5:een kloonattujen 15 sinkkisormien nukleotidisekvenssiä ja pääteltyä aminohap posekvenssiä.
Kuvio 8 esittää zif268-proteiinin aminohapposekvenssiä ja faagivalikointiin käytettyä hiusneula-DNA:ta. A esittää kunkin sinkkisormen konservatiivisia osia. 20 B esittää hiusneula-DNA:ta, joka sisältää 9 ep:m konsensus- sitoutumis kohdan.
Kuvio 9 on taulukko, jossa luetellaan sonnien 1, 2 ja 3 kuusi satunnaistettua ryhmää.
Kuvio 10 esittää SDS-PAGE:a, joka on tehty Zif268-25 variantille Ai 4 ennen IPTG-induktiota (kaista 2); IPTG-induktion jälkeen (kaista 3); sytoplasmafraktiolle inkluu-siokappaleiden poistamisen jälkeen (kaista 4); sinkkisormi-peptidin sisältäville inkluusiokappaleille (kaista 5); ja mutantti-Zif268:lie (kaista 6). Kaistalla 1 on moolimassa-30 standardeja (kD).
Kuvio 11 on taulukko, jossa näkyy kunkin proteiinin kon, assosiaationopeus; k0ff, dissosiaationopeus; ja Ka, ta-sapainodissosiaatiovakio.
8
Kuvio 12 esittää villin tyypin ZiF268-proteiinin (WT) (□) ja sen variantin C7 (O) dissosiaationopeutta (-fcoff) pintaplasmoniresonanssissa tapahtuvien tosiaikaisten muutosten kautta mitattuna.
5 Kuviot 13A ja 13B esittävät Zif268-Jun:n nukleoti di- ja aminohapposekvenssiä (SEQ ID NO:t 33 ja 34).
Kuviot 14A ja 14B esittävät Zif268-Fos:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssiä (SEQ IDNOrt 35 ja 36).
Kuvio 15 esittää C7-sinkkisormen kolmisormisen kon-10 struktion nukleotidi- ja aminohapposekvenssiä (SEQ ID NO:t 41 ja 42).
Kuviot 16A ja 16b esittävät TGEKP-kytkijällä kytketyn Zif268-Zif268:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssiä (SEQ ID NO:t 43 ja 44).
15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö liittyy eristettyyn nukleotideihin sitoutuvaan sinkkisormipolypeptidivarianttiin, joka käsittää vähintään kaksi sinkkisormimoduulia, jotka sitoutuvat sellulaariseen nukleotidisekvenssiin ja moduloivat kyseisen 20 sellulaarisen nukleotidisekvenssin toimintaa. Polypeptidi- variantti voi tehostaa tai heikentää geenin transkriptiota ja sitoutua DNA:han tai RNA:han. Keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää terapeuttisesti vaikuttavan määrän nukleotideihin sitoutuvaa 25 sinkkisormipolypeptidijohdannaista tai terapeuttisesti vai kuttavan määrän nukleotidisekvenssiä, joka koodittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidijohdannaista, joka johdannainen sitoutuu sellulaariseen nukleotidisekvenssiin ja moduloi kyseisen sellulaarisen nukleotidisek-30 venssin toimintaa, yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyt tävään kantajaan. Keksintö tarjoaa käyttöön myös seulontamenetelmän nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormipolypeptidi variant in aikaansaamiseksi, joka sitoutuu solun tai viruksen nukleotidisekvenssiin.
9
Nukleotideihin sitoutuva "sinkkisormipolypeptidivariantti" tarkoittaa polypeptidiä, joka on sinkkisormiprote-iinin mutagenoitu tai rekoxnbinaation kautta tuotettu muoto. Variantti voi olla hybridi, joka sisältää esimerkiksi yh-5 destä proteiinista peräisin olevan yhden tai useamman sink-kisormialueen kytkettynä toisesta proteiinista peräisin olevaan yhteen tai useampaan sinkkisormialueeseen. Alueet voivat olla villiä tyyppiä tai mutagenoituja. Termin "johdannainen" piiriin kuulu villi tyypin sinkkisormiproteiinin 10 typistetty muoto, jossa sormien lukumäärä on pienempi kuin alunperin villin tyypin proteiinissa. Termin "johdannainen" piiriin kuuluvat myös sinkkisormipolypeptidivariantit. Esimerkkeihin nukleotideihin sitoutuvista sinkkisormipolypep-tideistä, joista voidaan tuottaa johdannainen tai variant-15 ti, kuuluvat TFIIIA ja zif268.
Tässä käytettynä "sinkkisormi-nukleotidisitoutumis-aihe" tarkoittaa mitä tahansa nukleotidisegmentin kaksi-tai kolmiulotteista osaa, johon nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidijohdannainen sitoutuu spesifisesti. 20 Tämän määritelmään piiriin kuuluvat nukleotidisekvenssit, joissa on yleensä korkeintaan viisi nukleotidia, samoin kuin DNA-kaksoiskierteen kolmiulotteiset aspektit, kuten suurempi ja pienempi uurre, heliksin taho yms. Aihe on tyypillisesti mikä tahansa sopivan pituinen sekvenssi, johon 25 sinkkisormipolypeptidi pystyy sitoutumaan. Kolmisorminen polypeptidi sitoutuu esimerkiksi aiheeseen, jossa on tyypillisesti non 9-14 emäsparia. Keksintö tarjoaa siksi käyttöön spesifisyydeltään millaisia tahansa nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormipolypeptidejä, ja sinkkisormisitoutu-30 misaihe voi olla mikä tahansa kokeellisesti suunniteltu sekvenssi tai sekvenssi, johon sinkkisormiproteiini sitoutuu. Aihe voi esiintyä missä tahansa DNA- tai RVA-sekvenssissä, mukaan luettuina säätelysekvenssit, eksonit, intronit tai mitkä tahansa koodittamattomat sekvenssit.
10 Tämän keksinnön käytännön toteutuksen yhteydessä ei ole välttämätöntä, että sinkkisormi-nukleotidisitoutumus-aihe tunnetaan, jotta saataisiin nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidivariantti. Vaikka sinkkisormiprote-5 iineja on tähän mennessä idetifioitu vain eukaryooteista, ajatellaan erityisesti olevan tämän keksinnön suoja-alan piirissä, että sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheita voidaan identifioida muusta kuin eukaryoottisesta DNA:sta tai RNA:sta, erityisesti bakteerien ja virusten luontaisista 10 promoottoreista, sitomalla niihin tämän keksinnön mukaisia geneettisesti muunnettuja eristettyjä konstruktioita, joissa on jäljellä sinkkisormen tunnetut rakenteelliset ominaisuudet, mutta jotka eroavat luonnossa esiintyvistä sink-kisormiproteiineista valmistusmenetelmänsä samoin kuin ami-15 nohapposekvenssiensä ja kolmiulotteisten rakenteidensa suhteen .
Tunnettujen villin tyypin sinkkisormiproteiinien tunnusmerkillinen rakenne koostuu 2-37 modulaarisesta tandemtoistosta, joista toistoista kukin muodostaa "sor-20 men", joka pitää sinkkiatomin tetraedrisesti koordinoituneena konservatiivisten kysteiinien muodostaman parin ja konservatiivisten histidiinien muodostaman parin avulla. Kukin sormi sisältää yleensä myös konservatiivisia hydrofobisia aminohappoja, jotka ovat sellaisessa vuorovaikutuk-25 sessa, että muodostuu hydrofobinen ydin, joka auttaa moduulia säilyttämään muotonsa.
Keksintöön liittyvä nukleotideihin sitoutuva sink-kisormipolypeptidivariantti käsittää vähintään kaksi sink-kisormimoduulia, jotka sitoutuvat sellulaariseen nukleoti-30 disekvenssiin ja moduloivat kyseisen sellulaarisen nukleotidi sekvenssin toimintaa. Termi "sellulaarinen nukleoti-disekvenssi" tarkoittaa nukleotidisekvenssiä, joka on läsnä solun sisällä. Sekvenssin ei välttämättä tarvitse olla solussa luontaisesti esiintyvä sekvenssi. Esimerkiksi retro-35 virusgenomia, joka on integroituneena isännän solun 11 DNA:hän, pidettäisiin "sellulaarisena nukleotidisekvenssi-nä" . Sellulaarinen nukleotidisekvenssi voi olla DNA tai RNA, sen piiriin kuuluvat sekä intronit että eksonit. Solu ja/tai sellulaarinen nukleotidisekvenssi voi olla proka-5 ryoottinen tai eukaryoottinen, mukaan luettuina hiivan, viruksen tai kasvin nukleotidisekvenssit.
Termi "moduloida" tarkoittaa jonkin toiminnon heikentämistä, tehostamista tai indusointia. Keksinnön mukainen nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidivariant-10 ti voi esimerkiksi moduloida promoottorisekvenssiä sitoutumalla promoottorissa olevaan aiheeseen ja tehostaa tai heikentää siten sellulaariseen promoottorinukleotidisekvens-siin toiminnallisesti kytketyn geenin transkriptiota. Modulaatio voi vaihtoehtoisesti sisältää geenin transkription 15 inhibition, jolloin nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipo- lypeptidivariantti sitoutuu rakennegeeniin, estää DNA-riip-puvaista RNA-polymeraasia tekemästä luentaa kyseisen geenin läpi ja inhiboi siten tämän geenin transkription. Rakenne-geeni voi olla esimerkiksi solun normaali geeni tai onko-2 0 geeni.
Geenin promoottorialue sisältää säätelyelementtejä, jotka sijaitsevat tyypillisesti 5'-suuntaan rakennegeenis-tä. Jos geeni on määrä aktivoida, transkriptiotekijöinä tunnetut proteiinit tarttuvat geenin promoottorialueeseen. 25 Tämä kokoonpano muistuttaa "käynnistyskytkintä"; se antaa entsyymille mahdollisuuden kopioida toinen geenisegmentti DNA:sta RNA:ksi. Useimmissa tapauksissa tuloksena oleva KNA-molekyyli toimii templaattina jonkin määrätyn proteiinin synteesissä; joskus itse RNA on lopputuote.
30 Promoottorialue voi olla solun normaali prmoottori tai esimerkiksi onkopromoottori. Onkopromoottori on yleensä virusperäinen promoottori. Retrovirusten pitkä terminaalinen toistojakso (LTR) on esimerkiksi promoottorialue, joka voi olla keksinnön mukaisen sitoutuvan sinkkisormipolypep-35 tidivariantin kohteena. Promoottorit, jotka ovat peräisin 12 lentivirusryhmän jäsenistä, joihin kuuluu sellaisia patogeenejä kuin ihmisen T-solulymfotrooppinen virus (HTLV) 1 ja 2 tai ihmisen immuunikatovirus (HIV) 1 tai 2, ovat esimerkkejä viruspromoottorialueista, jotka voivat olla kek-5 sinnön mukaisen sitoutuvan sinkkisormipolypeptidin tran-skriptionaalisen modulaation kohteena.
Tähän keksintöön liittyviin nukleotideihin sitoutuviin sinkkisormipolypeptidijohdannaisiin tai -variantteihin kuuluu polypeptidejä, jotka sitoutuvat sellulaariseen nuk-10 leotidisekvenssiin, kuten DNArhan, RNA:han tai kumpaankin. Nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidi, joka sitoutuu DNA:han, ja erityisesti DNA:han sitoutuvat sink-kisormialueet, voidaan identifioida helposti tutkimalla kahden sinkkisormialueen välissä olevaa "kytkijäaluetta". 15 Kytkijän aminohapposekvenssi TGEK(P) (SEQ ID NO: 32) on tyypillisesti osoitus sinkkisormialueista, jotka sitoutuvat DNA-sekvenssiin. Se, sitoutuuko jokin määrätty nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidi ensisijaisesti DNA:hän vai RNA:han, voidaan siksi määrittää tutkimalla kytkijän 2 0 aminohappoj a.
Keksintöön liittyy yhdessä suoritusmuodossa menetelmä sellulaarisen sellaisen nukleotidisekvenssin toiminnan inhiboimiseksi tai heikentämiseksi, joka käsittää sink-kisormi-nukleotidisitoutumisaiheen, joka menetelmä käsittää 25 sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen saattamisen kosketukseen vaikuttavan määrän kanssa kyseiseen aiheeseen sitoutuvaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidi-johdannaista. Kun sellulaarinen nukleotidisekvenssi on promoottori, menetelmä sisältää sinkkisormi-DNA-sitoutumis-30 aiheen sisältävän promoottorin transkriptionaalisen trans-aktivaation inhiboinnin. Termi "inhibointi" tarkoittaa esimerkiksi sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen sisältävään promoottoriin toiminnallisesti kytketyn rakennegeenin transkription aktivaatiotason alentamista. Nukleotideihin si- 13 toutuva sinkkisormipolypeptidijohdannainen voi lisäksi sitoutua rakennegeenissä tai RNA:ssa olevaan aiheeseen.
Termin "vaikuttava määrä" piiriin kuuluu määrä, joka johtaa aiemmin aktivoituneen promoottorin deaktivaati-5 oon, tai määrä, joka johtaa sinkkisormi-nukleotidisitou- tumisaiheen sisältävän promoottorin inaktivaatioon, tai määrä, joka estää rakennegeenin transkription tai RNA:n translaation. Tarvittava nukleotideihin sitoutuvan sink-kisormiperäisen polypeptidin määrä on määrä, joka tarvitaan 10 joko syrjäyttämään olemassa olevassa proteiini-polypeptidi- kompleksissa oleva luontainen nukleotideihin sitoutuva sinkkisormiproteiini tai kilpailemaan luontaisen nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormiproteiinin kanssa, niin että se muodostaa itse kompleksin promoottorin kanssa. Vastaa-15 vasti rakennegeenin tai RNA:n salpaamiseen tarvittava määrä on määrä, joka sitoutuu geeniin ja estää RNA-polymeraasia tekemästä luentaa kyseisen geenin läpi, tai vastaavasti määrä, joka estää translaation. Menetelmä toteutetaan edullisesti solusisäisesti. Inaktivoimalla toiminnallisesti 20 promoottori tai rakennegeeni heikennetään transkriptiota tai translaatiota. Vaikuttavan inhibointiproteiinimäärän vieminen kohteeseen proteiinin sitomiseksi sellulaariseen sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen sisältävään nukleotidi sekvenssi in tai "saattamiseksi kosketukseen" tämän 25 kanssa voidaan tehdä jollakin tässä kuvattavista mekanis meista, kuten retrovirusvektoreiden tai liposomien avulla, tai muilla, alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä.
Nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidijohdannainen johdetaan tai valmistetaan villin tyypin sink-30 kisormiproteiinista typistämällä tai laajentamalla tai vil listä tyypistä johdetun polypeptidin varianttina suunnatulla mutageneesilla tai näiden menettelyjen yhdistelmällä.
14
Termi "typistetty" tarkoittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormi-polypeptidijohdannaista, jossa sinkkisor-mien lukumäärä on pienempi kuin luontaisessa sitoutuvassa sinkkisormiproteiinissa esiintyvien sinkkisormien täysi lu-5 kumäärä tai josta on deletoitu epätoivottuja sekvenssejä. Luonnostaan yhdeksän sinkkisormea sisältävän nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormiproteiinin TFIIIA typistetty muoto voisi olla esimerkiksi polypeptidi, jossa on ainoastaan sinkkisormet 1-3. Laajentaminen tarkoittaa ylimääräisten 10 sinkkisormimoduulien lisäämistä sinkkisormipolypeptidiin.
TFIIIA voidaan laajentaa esimerkiksi 12-sormiseksi lisäämällä 3 sinkkisormialuetta. Typistetty nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidi voi lisäksi sisältää useammasta kun yhdestä villin tyypin polypeptidistä peräisin 15 olevia sinkkisormimoduuleja, jolloin tuloksena on nukleoti deihin sitoutuva "hybridisinkkisormipolypeptidi".
Termi "mutagenisoitu" tarkoittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiperäistä polypeptidiä, joka on saatu toteuttamalla mikä tahansa tunnetuista menetelmistä kyseis-20 tä proteiinia koodittavan DNA:n sattumanvaraisen tai suunnatun mutageneesin aikaansaamiseksi. TFIIIA:n ollessa kyseessä mutageneesi voidaan tehdä esimerkiksi yhdessä tai useammassa konsensus-sekvenssitoistossa olevien ei-konser-vatiivisten ryhmien korvaamiseksi. Typistettyjä nukleoti-25 deihin sitoutuvia sinkkisormiproteiineja voidaan myös muta- genisoida.
Esimerkkeihin tunnetuista nukleotideihin sitoutuvista sinkkisormiproteiineista, joita voidaan typistää, laajentaa ja/tai mutagenisoida sinkkisormi-nukleotidisitou-30 tumisaiheen sisältävän, sellulaarisen sekvenssin toiminnan inhiboimiseksi, kuuluvat TFIIIA ja zif268. Ammattimiehet tuntenevat muita nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormiproteiineja.
15
Keksintöön liittyy myös farmaseuttinen koostumus, joka käsittää terapeuttisesti vaikuttavan määrän nukleoti-deihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidijohdannaista tai terapeuttisesti vaikuttavan määrän nukleotidisekvenssiä, 5 joka koodittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidi johdannaista, joka johdannainen sitoutuu sellulaari-seen nukleotidisekvenssiin ja moduloi kyseisen sellulaari-sen nukleotidisekvenssin toimintaa, yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Farmaseuttiset koostumuk-10 set, joka sisältävät yhtä tai useampaa erilaista tässä kuvattua sinkkisormi-nukleotidisitoutumisjohdannaista, ovat käyttökelpoisia keksinnön mukaisissa hoitomenetelmissä.
Tässä käytettyinä termejä "farmaseuttisesti hyväksyttävä, "fysiologisesti siedettävissä oleva" ja niiden 15 kieliopillisia muunnoksia käytetään toistensa vastineina viitattaessa koostumuksiin, kantajiin, laimennusaineisin ja reagensseihin, ja ne tarkoittavat sitä, että materiaaleja voidaan antaa ihmiselle aiheuttamatta senasteisia epätoivottavia fysiologisia vaikutuksia, kuten pahoinvointia, 20 huimausta, vatsavaivoja yms., että ne estäisivät koostumuksen annon.
Aktiivisia aineosia liuotettuina tai dispergoituina sisältävän farmakologisen koostumuksen valmistus on alalla hyvin tunnettua. Mainitunlaisia koostumuksia valmistetaan 25 tyypillisesti steriileinä injektoitavina valmisteina, jotka ovat joko nestemäisiä, vesipitoisia tai vedettömiä, liuok sia tai suspensioita; voidaan kuitenkin valmistaa myös kiinteitä muotoja, jotka soveltuvat liuotettaviksi tai sus-pendoitaviksi nesteeseen ennen käyttöä. Valmiste voidaan 30 myös emulgoida.
Aktiivinen aineosa voidaan sekoittaa jatkeaineiden kanssa, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä ja aktiivisen aineosan kanssa yhteensopivia ja joita käytetään tässä kuvattaviin hoitomenetelmien kannalta sopivia määriä. 35 Soveltuvia jatkeaineita ovat esimerkiksi vesi, fysiologinen 16 suolaliuos, dekstroosi, glyseroli, etanoli tms. ja niiden yhdistelmät. Koostumus voi haluttaessa sisältää lisäksi pieniä määriä apuaineita, kuten kostutus- tai emulgointiai-neita, samoin kuin puskurointiaineita yms., jotka paranta-5 vat aktiivisen aineosan tehoa.
Tähän keksintöön liittyvä terapeuttinen farmaseuttinen koostumus voi sisältää komponenttien farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin kuuluvat happoadditiosuolat (polypeptidin vapaiden 10 aminohappojen kanssa muodostetut), joita muodostetaan käyttämällä orgaanisia happoja, kuten esimerkiksi vetykloridi-tai fosforihappoa, tai sellaisia orgaanisia happoja kuin etikka-, viini-, manteli- yms. hapot. Voidaan myös valmistaa vapaiden karboksyyliryhmien kanssa muodostettuja suolo-15 ja epäorgaanisista emäksistä, kuten esimerkiksi natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- tai rauta(III)hydroksidista, ja sellaisista orgaanisista emäksistä kuin isopropyyliamiini, trimetyyliamiini, 2-etyyliaminoetanoli, histidiini, prokaiini yms.
20 Fysiologisesti siedettävissä olevat kantajat ovat alalla hyvin tunnettuja. Esimerkkejä nestemäisistä kantajista ovat steriilit vesipitoiset liuokset, jotka eivät sisällä muita materiaaleja kuin aktiivisia aineosia ja vettä tai jotka sisältävät puskuria, kuten natriumfosfaattia, 25 jonka pH-arvo on fysiologinen, fysiologista suolaliuosta tai kumpaakin, kuten fosfaattipuskuroitu fysiologinen suolaliuos. Vesipitoiset kantajat voivat vielä lisäksi sisältää yhtä tai useampaa puskurisuolaa samoin kuin sellaisia suoloja kuin natrium- ja kaliumkloridi, dekstroosia, pro-30 peeniglykolia, polyeteeniglykolia ja muita liuenneita aineosia.
j 17
Nestemäiset koostumukset voivat myös sisältää nestefaaseja veden lisäksi ja sen tilalla. Esimerkkejä mainitunlaisista muista nestefaaseista ovat glyseroli, kasviöljyt, kuten puuvillansiemenöljy, orgaaniset esterit, kuten 5 etyylioleaatti, ja vesi-öljyemulsiot.
Keksintöön liittyy nukleotidisekvenssi, joka koo-dittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidivarianttia. DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat keksinnön mukaisia nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormipolypeptidejä, 10 mukaan luettuna luontaiset, typistetyt ja laajennetut poly-peptidit, voidaan saada aikaan muutamin menetelmin. DNA voidaan esimerkiksi eristää käyttämällä alalla hyvin tunnettuja hybridisaatiomenettelyjä. Niihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, (1) koettimien hybridisoi-15 minen genomi- tai cDNA-kirjastöihin yhteisten nukleotidise-kvenssien detektoimiseksi; (2) ilmentämiskirjastojen vasta- aineseulonta yhteisten rakenteellisten osien detektoimiseksi; (3) syntetisointi polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Keksinnön mukaisia RNA-sekvenssejä voidaan saada aikaan 20 alalla tunnetuin menetelmin (katso esimerkiksi Current Protocols in Molecular Biology, toim. Ausubel et al., 1989).
Keksintöön liittyviä nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormiproteiineja koodittavia spesifisiä DNA-sekvenssejä voidaan kehittää (1) eristämällä kaksisäikeinen DNA-25 sekvenssi genomi-DNA.sta; (2) valmistamalla DNA-sekvenssi kemiallisesti kiinnostuksen kohteena olevaa polypeptidiä varten tarvittavien kodonien aikaansaamiseksi; (3) syntetisoimalla in vitro kaksisäikeinen DNA eukaryoottisesta luovuttajasolusta eristetyn mRNArn käänteistranskription 30 kautta. Viimeksi mainitussa tapauksessa muodostuu lopulta mRNA:11e komplementaarinen kaksisäikeinen DNA, jota kutsutaan yleisesti cDNA:ksi. Näistä kolmesta menetelmästä spesifisten DNA-sekvenssien kehittämiseksi käytettäviksi yh-distelmämenettelyissä on genomi-DNA:n eristäminen harvinai-35 sin. Tämä pätee erityisesti, kun on toivottavaa saada ai- 18 kaan nisäkäspolypeptidien ilmentyminen mikrobeissa, intro-nien läsnäolon vuoksi.
Sinkkisormiperäisten DNA:hän sitoutuvien polypepti-dien aikaansaannin ollessa kyseessä on DNA-sekvenssien syn-5 teesi usein valituksi tuleva menetelmä, kun tunnetaan halutun polypeptidin koko aminohapposekvenssi. Kun halutun po-lypeptidin koko aminohapposekvenssiä ei tunneta, ei DNA-sekvenssien suora synteesi ole mahdollista ja valittava menetelmä on cDNA-sekvenssien muodostus. Tavanomaisiin menet-10 telyihin kiinnostuksen kohteena olevien cDNA-sekvenssien eristämiseksi kuuluu sellaisten plasmidissa olevien cDNA-kirjastojen muodostaminen, jotka on johdettu käänteiskopi-oimalla mRNA:ta, jota esiintyy runsaasti luovuttajasoluis-sa, joissa geeni-ilmentymistaso on korkea. Kun tätä käyte-15 tään yhdistettynä polymeraasiketjureaktiotekniikkaan, voidaan kloonata jopa harvinaisia ilmentymistuotteita. Tapauksissa, joissa tunnetaan merkittäviä osia polypeptidin aminohapposekvenssistä, voidaan käyttää sellaisten leimattujen yksi- tai kaksisäikeisten DNA- tai RNA-koetinsekvenssien 20 muodostamista, joissa toistuu kohde-cDNA:ssa otaksuttavasti läsnä oleva sekvenssi, DNA-DNA-hybridisaatiomenettelyissä, jotka toteutetaan kloonatuille cDNA-kopioille, jotka on denaturoitu yksisäikeiseen muotoon [Jay et ai., Nucleic Acid Research 11 (1983) 2325].
25 Hybridisaatiomenettelyt ovat käyttökelpoisia yhdis- telmäkloonien seulonnassa käytettäessä leimattujen synteettisten oligonukleotidikoettimien seoksia, joissa kukin koetin on potentiaalisesti täydellinen komplementti jollekin määrätylle DNA-sekvenssilie hybridisaationäytteessä, joka 30 sisältää heterogeenisen denaturoitua kaksisäikeistä DNA:ta sisältävän seoksen. Mainitunlaisen seulonnan ollessa kyseessä hybridisaatio toteutetaan edullisesti joko yksi-säikeiselle DNA:Ile tai denaturoidulle kaksisäikeiselle DNA:lie. Hybridisaatio on erityisen käyttökelpoinen sel-35 laisten cDNA-kloonien detektoinnissa, jotka ovat peräisin 19 lähteistä, joissa on läsnä äärimmäisen pieni määrä kiinnostuksen kohteena olevaan polypeptidiin liittyviä mRNA-sekvenssejä. Käyttämällä ankaria hybridisaatio-olosuhteita, joiden tarkoituksena on välttää epäspesifinen sitoutuminen, 5 on mahdollista esimerkiksi tehdä mahdolliseksi määrätyn cDNA-kloonin autoradiografinen visualisointi hybridisoimalla kohde-DNA siihen seoksessa olevaan ainoaan koettimeen, joka on sen täydellinen komplementti [Wallace et ai., Nucleic Acid Research 9 (1981) 879; Maniatis et ai., Molecu-10 lar Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982] .
Nukleiinihappohybridisaatioon perustuvat seulonta-menettelyt antavat mahdollisuuden eristää mikä tahansa gee-nipolypeptidi mistä tahansa organismista sillä edellytyk-15 sellä, että saatavana on sopiva koetin. Oligonukleotidi-koettimia, jotka vastaavat osaa kyseistä proteiinia koodit-tavasta sekvenssistä, voidaan syntetisoida kemiallisesti. Tämä edellyttää, että tunnetaan lyhyitä oligopeptidikokoa olevia osia aminohapposekvenssistä. Proteiinia koodittava 20 DNA-sekvenssi voidaan päätellä geneettisestä koodista; koodin degeneraatio täytyy kuitenkin ottaa huomioon. On mahdollista toteuttaa sekalisäysreaktio, kun sekvenssi on degeneroitunut. Siinä käytetään denaturoidun kaksisäikeisen DNA:n heterogeenista seosta. Mainitunlaisen seulonnan ol-25 lessa kyseessä hybridisaatio tehdään edullisesti joko yk-sisäikeiselle DNA:lie tai denaturoidulle kaksisäikeiselle DNA:lie.
Koska keksintöön liittyvät DNA-sekvenssit koodattavat suurin piirtein koko nukleotideihin sitoutuvaa sink-30 kisormiproteiinia tai sen osaa, on rutiiniasia valmistaa, alikloonata ja ilmentää tästä tai vastaavista DNA-sekvens-seistä saatuja typistettyä polypeptidiä vastaavia DNA-fragmentteja. Käyttämällä tässä esitettyjä DNA-fragmentteja, jotka määrittelevät keksinnön mukaisia nukleotideihin si-35 toutuvia sinkkisormipolypeptidejä, on vaihtoehtoisesti mah- 20 dollista määrittää tunnetuin menetelmin DNA-sekvenssit, jotka koodattavat koko nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisor-miproteiinia. Mainitunlaisia menetelmiä kuvataan US-patent-tijulkaisuissa 4 394 443 ja 4 446 235, jotka mainitaan täs-5 sä viitteinä.
cDNA-ilmentämiskirjastosta, kuten lambda gtll:stä, voidaan etsiä epäsuorasti nukleotideihin sitoutuvaa sink-kisormiproteiinia tai sinkkisormijohdannaispolypeptidiä, jossa on vähintään yksi epitooppi, käyttämällä nukleotidei-10 hin sitoutuvalle sinkkisormiproteiinille spesifisiä vasta- aineita. Mainitunlaiset vasta-aineet voivat olla joko poly-klonaalista tai monoklonaalista alkuperää, ja niitä voidaan käyttää sellaisen ilmentymistuotteen detektointiin, joka on osoitus nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia 15 vastaavan cDNA:n läsnäolosta. Polypeptidijohdannaisten si toutuminen DNA-kohteisiin voidaan vaihtoehtoisesti määrittää sisällyttämällä radioaktiivisesti leimattua DNA:ta koh-dekohtaan ja testaamalla liikkuvuuden heikkeneminen elektroforeesissa verrattuna vapaaseen kohdekohtaan.
20 Yksi edullinen vektori käytettäväksi typistettyjen ja/tai mutagenisoitujen nukleotideihin sitoutuvien sink-kisormipolypeptidien identifiointiin on yhdistelmä-DNA (rDNA) -molekyyli, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa ja pystyy ilmentämään fuusiopolypeptidiä, joka 25 sisältää aminopäästä karboksyylipäähän edettäessä (1) pro- karyoottisen erityssignaalialueen, (2) heterologisen poly-peptidin ja (3) rihmallisen faagin kalvoankkurialueen. Tämä vektori sisältää DNA-ilmentymisen säätelysekvenssejä fuu-siopolypeptidin ilmentämiseksi, edullisesti prokaryoottisia 30 säätelysekvenssejä.
Rihmallisen faagin kalvoankkuri on edullisesti rihmallisen faagipartikkelin matriksiin liittymiskykyisen cpIII- tai cpVIII-peiteproteiinin alue, mitä kautta fuu-siopolypeptidi tulee sisällytetyksi faagin pinnalle.
21
Erityssignaali on proteiinin esipeptidialue, joka kohdentaa proteiinin gramnegatiivisten bakteerien periplas-makalvoon. Yksi edullinen erityssignaali on pelB-eritys-signaali. Lei et ai. [Nature 331 (1988) 543 - 546] kuvaavat 5 Erwinia carotovasta peräisin olevien kahden pelB-geeni-tuotevariantin erityssignaalialueen ennustettuja aminohap-posekvenssej ä.
pelB-proteiinin esisekvenssiä on käytetty aiemmin erityssignaalina fuusioproteiineille [Better et ai., 10 Science 240 (1988) 1041 - 1043; Sastry et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 5728 - 5732: Mullinax et ai.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 8095 - 8099]. Tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoisten muiden E. coli -pe-räisten erityssignaalipolypeptidialueiden aminohappose-15 kvenssejä esittää Oliver teoksessa Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 1, toim. F. C. Neidhard, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1987, s. 56 -69.
Edullisia kalvoankkureita vektoria varten on saata-20 vissa rihmallisista faageista M13, fl ja fd ja vastaavista rihmallisista faageista. Edullisia kalvoankkurialueita esiintyy geenin III ja geenin VIII koodittamissa peitepro-teiineissa. Rihmallisen faagin peiteproteiinin kalvoankku-rialue on peiteproteiinin karboksiterminaalisen alueen osa 25 ja sisältää hydrofobisten aminohapporyhmien alueen lipidi-kaksoiskerroskalvon läpäisemiseksi ja varautuneiden aminohapporyhmien alueen, joka esiintyy normaalisti kalvon syto-plasmapinnalla ja suuntautuu poispäin kalvosta. Faagissa fl geenin VIII koodittaman peiteproteiinin kalvon läpäisevä 30 alue käsittää ryhmät trp-26 - Lys-40 ja sytoplasmaalue käsittää 11 karboksiterminaalista ryhmää 41 - 52 [Ohkawa et ai., J. Biol. Chem. 256 (1981) 9951 - 9958], Niinpä yhden edullisen kalvoankkurialueen aminohapporyhmäsekvenssi on peräisin rihmallisen faagin M13 geenin VIII koodittamasta 35 peiteproteiinista (josta käytetään myös merkintää cpVIII
22 tai CP 8). Geenin VIII koodittamaa peiteproteiinia on läsnä kypsällä rihmallisella faagilla pääosassa faagipartikkelia, ja peiteproteiinikopioiden määrä on tyypillisesti noin 2 500 - 3 000.
5 Lisäksi yhden toisen edullisen kalvoankkurialueen aminohapporyhmäsekvenssi on peräisin rihmallisen faagin Ml3 geenin III koodittamasta peiteproteiinista (josta käytetään myös merkintää cpIII). Geenin III koodittamaa peiteproteiinia on läsnä kypsällä rihmallisella faagilla faagipartikke-10 Iin toisessa päässä, ja peiteproteiinikopioiden määrä on tyypillisesti noin 4 - 6. Rihmallisten faagipartikkelien rakennetta, niiden peiteproteiineja ja partikkelien kokoonpanoa kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavissa katsauksissa: Rached et ai., Microbiol. Rev. 50 (1986) 401 - 427; 15 Model et ai. teoksessa The Bacteriophages, voi 2, toim. R. Calendar, Plenum Publishing Co. 1988, s. 375 - 456.
DNA-ilmentymisen säätelysekvenssit käsittävät ryhmän DNA-ilmentymissignaaleja rakennegeenituotteen ilmentämiseksi ja sisältävät tunnetusti sekä 5'- että 3'- 20 elementtejä kytkettyinä toiminnallisesti sistroniin, niin että sistroni pystyy ilmentämään rakennegeenituotteen. 5'-säätelysekvenssit pitävät sisällään promoottorin transkription aloittamiseksi ja ribosominsitoutumiskohdan kytkettynä toiminnallisesti edellä olevan transloituvan DNA-sekvenssin 25 5'-päähän.
Korkeiden geeni-ilmentymistasojen saavuttamiseksi E. colissa on välttämätöntä käyttää suurten mRNA-määrien synnyttämiseen tarvittavien vahvojen promoottorien lisäksi ribosominsitoutumiskohtia sen takaamiseksi, että mRNA tulee 30 luetuksi tehokkaasti. E. colissa ribosominsitoutumiskohta sisältää aloituskodonin (AUG) ja 3 - 9 nukleotidin pituisen sekvenssin, joka sijaitsee 3-11 nukleotidin verran aloituskodonin edellä [Shine et ai., Nature 254 (1975) 34]. Tämä sekvenssi, AGGAGGU,· jota kutsutaan Shine-Dalgarno (SD) 35 -sekvenssiksi, on komplementaarinen E. colin 16S-rRNA:n 3'- 23 päälle. Ribosomin sitoutumiseen mRNA:han ja mRNA:n 3'-päässä olevaan sekvenssiin voivat vaikuttaa muutamat tekijät : (i) Komplementaarisuusaste SD-sekvenssin ja 16S-5 rRNA:n 3'-pään välillä.
(ii) SD-sekvenssin ja AUG:n välinen etäisyys ja mahdollisesti niiden välissä oleva RNA-sekvenssi [Roberts et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979a) 760; Roberts et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979b) 5596; Guar- 10 ente et ai., Science 209 (1980) 1428; Guarente et ai., Cell 20 (1980) 543]. Optimointi savutetaan mittaamalla geenien ilmentymistaso plasmideissa, joissa tätä etäisyyttä muutetaan systemaattisesti. Erilaisten mRNA:iden vertaaminen osoittaa, että tilastollisesti edullisia sekvenssejä esiin-15 tyy asemissa -20 - +13 (jolloin AUG:n A on asemassa 0) [Gold et ai., Annu. Rev. Microbiol. 35 (1981) 365]. Esisek-venssien on osoitettu vaikuttavan dramaattisesti translaatioon (Roberts et ai. 1979a, b, supra).
(iii) Kodonia AUG seuraava nukleotidisekvenssi, jo- 20 ka vaikuttaa ribosomin sitoutumiseen [Taniguchi et ai., J.
Mol. Biol. 118 (1978) 533].
3'-säätelysekvenssien alueella on vähintään yksi terminaatio (lopetus) -kodoni samassa kehyksessä heterolo-gisen fuusiopolypeptidin kanssa ja siihen toiminnallisesti 25 kytkettynä.
Käytettävä vektori sisältää edullisissa suoritusmuodoissa prokaryoottisen replikaatiolähteen eli repliko-nin, ts. DNA-sekvenssin, jolla on kyky ohjata itsenäistä replikaatiota ja pitää yllä yhdistelmä-DNA-molekyyli kro-30 mosomin ulkopuolella vektorilla transformoidussa proka- ryoottisessa isäntäsolussa, kuten bakteeri-isntäsolussa. Mainitunlaiset replikaatiolähteet ovat alalla hyvin tunnettuja. Edullisia replikaatiolähteitä ovat sellaiset, jotka ovat tehokkaita isäntäorganismissa. Yksi edullinen isän-35 täsolu on E. coli. Käytettäessä vektoria E. colissa yksi 24 edullinen replikaatiolähde on pBR322:ssa ja monissa muissa yleisissä plasmideissa esiintyvä ColEl. Edullinen on myös replikaatiolähde pl5A, joka esiintyy pACYC:ssä ja sen johdannaisissa. Replikoneja ColEl ja pl5A on käytetty laajasti 5 molekyylibiologiassa, niitä on saatavana erilaisissa plasmideissa, ja niitä kuvaavat ainakin Sambrook et ai. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. p., Cold Spring Harbor Laboratory 1989).
Replikonit ColEl ja pl5A ovat erityisen edullisia 10 käytettäviksi tämän keksinnön yhteydessä, koska kummallakin on kyky ohjata plasmidin replikaatiota E. colissa, samalla kun toisessa plasmidissa on läsnä toinen repiikoni samassa E. coli -solussa. ColEl ja pl5A ovat toisin sanoen häiritsemättömiä replikoneja, jotka mahdollistavat kahden plasmi-15 din ylläpidon samassa isännässä (katso esimerkiksi Sambrook et ai., supra, s. 1.3 - 1.4).
Suoritusmuodoissa, joissa on mukana prokaryoottinen replikoni, on lisäksi mukana myös geeni, jonka ilmentyminen antaa valikointiedun, kuten lääkeresistenssin, transfor-20 moidulle bakteeri-isännälle. Tyypillisiä bakteerien lääke-resistenssigeenejä ovat geenit, jotka antavat resistenssin ampisilliinille, tetrasykliinille, neomysiinille/ kanamy-siinille tai kloramfenikolille. Vektorit sisältävät tyypillisesti myös käteviä restriktiokohtia transloituvien DNA-25 sekvenssien insertointia varten. Esimerkkejä vektoreista ovat plasmidit pUC8, pUC9, pBR322 ja pBR329, joita myy Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) , ja pPL ja pKK223, joita myy Pharmacia (Piscataway, NJ) sekä pBS (Stratagene, La Jolla, CA).
30 Vektori käsittää ensimmäisen kasetin, joka sisältää edellä ja jäljessä olevia transloituvia DNA-sekvenssejä, jotka on kytketty toiminnallisesti nukleotidisekvenssillä, joka soveltuu suunnattuun ligatointiin insertti-DNA:n kanssa. Edellä oleva transloituva sekvenssi koodittaa tässä 35 määriteltyä erityssignaalia. Jäljessä oleva transloituva 25 sekvenssi koodittaa tässä määriteltyä rihmallisen faagin kalvoankkuria. Kasetti sisältää edullisesti DNA-ilmenty-misen säätelysekvenssejä, sinkkisormijohdannaispolypeptidin ilmentämiseksi, jota syntyy, kun transloituva insertti-DNA-5 sekvenssi (insertti-DNA) insertoidaan suunnatusti kasettiin suunnattuun ligaatioon soveltuvan nukleotidisekvenssin kautta. Rihmallisen faagin kalvoankkuri on edullisesti cpIII- tai cpVIII-peiteproteiinin alue, jolla on kyky sitoutua rihmallisen faagipartikkelin matriksiin ja sisällyt-10 tää siten fuusiopolypeptidi faagin pinnalle.
Sinkkisormijohdannaispolypeptidin ilmentämisvektori sisältää myös toisen kasetin toisen reseptoripolypeptidin ilmentämiseksi. Toinen kasetti sisältää toisen transloitu-van DNA-sekvenssin, joka koodittaa tässä määriteltyä eri-15 tyssignaalia, kytkettynä toiminnallisesti 3'-päästään suunnattuun ligaatioon soveltuvan nukleotidisekvenssin välityksellä vektorin jäljempänä olevaan DNA-sekvenssiin, joka sisältää tyypillisesti vähintään yhden lopetuskodonin kasetin lukukehyksessä. Toinen transloituva DNA-sekvenssi kytketään 20 toiminnallisesti 5'-päästään DNA-ilmentymisen säätelyse-kvensseihin, jotka muodostavat 5'-elementit. Toisella kasetilla on, transloituvan DNA-sekvenssin (insertti-DNA:n) in-sertoinnin jälkeen, kyky ilmentää toista fuusiopolypepti-diä, joka käsittää erityssignaalin reseptorin yhdessä in-25 sertti-DNA:n koodittaman polypeptidin kanssa. Toisen kasetin sekvenssit on deletoitu tämän keksinnön tarkoituksia varten.
Tässä käytettynä termi "vektori" tarkoittaa nukle-iinihappomolekyyliä, jolla on kyky kuljettaa eri geneettis-30 ten ympäristöjen välillä toista nukleiinihappoa, johon se on kytketty toiminnallisesti. Edullisia vektoreita ovat sellaiset, joilla on kyky replikoitua autonomisesti ja ilmentää niiden rakennegeenien tuotteita, joita on läsnä DNA-segmenteissä, joihin ne on kytketty toiminnallisesti. Siksi 26 vektorit sisältävät edullisesti edellä kuvattuja replikone-ja ja väliköintimarkkereita.
Käytettynä tässä DNA-sekvenssien tai -segmenttien suhteen ilmaus "toiminnallisesti kytketty" tarkoittaa, että 5 sekvenssit tai segmentit on liitetty kovalenttisesti, edullisesti tavanomaisin fosfodiesterisidoksin yksi- tai kak-sisäikeisessä muodossa olevan DNA:n yhteen säikeeseen. Sen vektorin valinta, johon tämän keksinnön mukainen transkrip-tioyksikkö eli kasetti kytketään toiminnallisesti, riippuu 10 alalla tunnetulla tavalla suoraan halutuista toiminnallisista ominaisuuksista, esimerkiksi vektorin replikaatiosta ja proteiini-ilmentymisestä, ja transformoitavasta isän-täsolusta; nämä ovat yhdistelmä-DNA-molekyylien konstruoinnin alalla luonnostaan esiintyviä rajoituksia.
15 Suunnattuun ligaatioon soveltuva nukleotidisekvens- si, ts. polykytkijä, on DNA-ilmentymisvektorin alue, joka (1) kytkee toiminnallisesti replikaatiota ja kuljetusta varten edellä ja jäljessä olevat transloituvat DNA-sekvenssit ja (2) tarjoaa kohdan tai keinon DNA-sekvenssin 20 ligatoimiseksi suunnatusti vektoriin. Suuntaava polykytkijä on tyypillisesti nukleotidisekvenssi, jonka sisällä on kaksi tai useampia restriktioendonukleaasitunnistussekvenssejä eli restriktiokohtia. Restriktiopilkonnassa nämä kaksi kohtaa antavat edullisesti tulokseksi yksisäikeiset päät, jot-25 ka eivät ole komplementaarisia ja mahdollistavat siten transloituvan DNA-sekvenssin suunnatun insertion kasettiin. Yhdessä suoritusmuodossa keinon suunnatun ligaation tekemiseksi tarjoavat nukelotidit, joita on läsnä edellä olevassa transloituvassa DNA-sekvenssissä, jäljessä olevassa trans-30 loituvassa DNA-sekvenssissä tai kummassakin. Yhdessä toisessa suoritusmuodossa suunnattuun ligaatioon soveltuva nukleotidisekvenssi käsittää nukleotidisekvenssin, jonka sisällä on useita suuntaavia kloonausvälineitä. Kun suunnattuun ligaatioon soveltuva nukleotidisekvenssi pitää si- 27 säilään lukuisia restriktiokohtia, sitä kutsutaan moninkertaiseksi kloonauskohdaksi.
Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa DNA-ilmenty-misvektori on suunniteltu kätevää käsittelyä ajatellen rih-5 mallisen faagipartikkelin muotoon, joka sisältää kapseloituna tämän keksinnön mukaisia nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormipolypeptidejä koodittavan DNA:n. Tässä suoritusmuodossa DNA-ilmentymisvektori sisältää lisäksi nukleoti-disekvenssin, joka pitää sisällään rihmallisen faagin rep-10 likaatiolähteen, niin että vektori voi asianmukaisen geneettisen komplementaation esiintyessä replikoitua rihmal-lisena faagina yksisäikeisessä replikoitavassa muodossa ja on pakattavissa rihmallisiin faagipartikkeleihin. Tämä piirre antaa tulokeksi DNA-ilmentymisvektorin kyvyn tulla 15 pakatuksi faagipartikkeleihin partikkelin, ja sen sisältämän vektorin, erottamiseksi myöhemmin muista faagipartikke-leista käyttämällä alalla hyvin tunnettua seulontamenetelmää .
Kuten on hyvin tunnettua, rihmallisen faagin repli-20 kaatiolähde on faagigenomin se osa, joka pitää sisällään kohdat replikaation aloitusta, replikaation lopetusta ja replikaation tuottaman replikatiivisen muodon pakkausta varten [katso esimerkiksi Rasched et ai., Microbiol. Rev. 50 (1986) 401 - 427; Horiuchi, J. Mol. Biol. 188 (1986) 25 215 - 223].
Yksi edullinen rihmallisen faagin replikaatiolähde käytettäväksi tämän keksinnön yhteydessä on M13-, Fl- tai fd-replikaatiolähde [Short et ai., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 7583 - 7600]. Edullisia DNA-ilmentymisvektoreita 30 ovat muunnetut ilmentymisvektorit pCOMB3 ja erityisesti pCOMB3.5.
Nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin tuotanto voidaan toteuttaa yhdellä tai useammalla oligonukleotidilla, jotka ovat aluk-35 keitä nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä 28 koodittavan genomisen polynukleotidin monistamiseksi. Näitä ainutlaatuisia oligonukleotidialukkeita voidaan tuottaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä kooditta-vaan polynukleotidiin rajoittuvien reuna-alueiden identifi-5 oinnin perusteella. Nämä oligonukleotidialukkeet käsittävät sekvenssejä, joilla on kyky hybridisoitua nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä koodittavan, vieressä olevan nukleotidisekvenssin ja sille komplementaaristen sekvenssien kanssa, ja niitä voidaan käyttää pistemutaati-10 oiden tuomiseen monistustuotteisiin.
Keksintöön liittyviin alukkeisiin kuuluvat oligo-nukleotidit, joilla on riittävä pituus ja sopiva sekvenssi, niin että ne käynnistävät spesifisesti polymeraation merkittävällä määrällä nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormi-15 polypeptidiä koodittavassa polynukleotädissä olevaa nukleiinihappoa. Tarkemmin määriteltynä termi "aluke" tarkoittaa tässä käytettynä sekvenssiä, joka käsittää vähintään kaksi, edullisesti enemmän kuin kolme, deoksiribonukleotidia tai ribonukleotidia ja joka sekvenssi pystyy käynnistämään sel-20 laisen alukkeenlaajennustuotteen synteesin, joka on oleellisesti komplementaarinen nukleotideihin sitoutuvaa sink-kisormiproteiinia vastaavalle säikeelle, mutta voi myös tuoda mutaatioita monistustuotteisiin valittuihin kohtiin.
Synteesiä edistäviin koe-olosuhteisiin kuuluvat nukleosidi-25 trifosfaattien ja polymeraation ja laajentumisen aikaansaavan aineen, kuten DNA-polymeraasin, läsnäolo ja sopiva puskuri, lämpötila ja pH. Aluke on edullisesti yksisäikeinen maksimitehon saavuttamiseksi monistuksessa, mutta se voi olla myös kaksisäikeinen. Jos aluke on kaksisäikeinen, se 30 käsitellään ensin kahden säikeen erottamiseksi toisistaan ennen käyttöään laajennustuotteiden valmistukseen. Aluke on edullisesti oligodeoksiribonukleotidi. Alukkeen tulee olla riittävän pitkä laajennustuotteiden synteesin alustamiseksi polymeroitumista ja nukleotidien laajentumista indusoivan 35 aineen läsnä ollessa. Alukkeen tarkka pituus riippuu monis- 29 ta tekijäistä, mukaan luettuina lämpötila, puskuri ja nuk-leotidikoostumus. Oligonukleotidialuke sisältää tyypillisesti vähintään 15 - 22 nukleotidia, vaikka se voi sisältää vähemmänkin nukleotideja. Kuten on alalla hyvin tunnettua, 5 voidaan vaihtoehtoisesti muuttaa nukleosiditrifosfaat- tiseosta mutaatioiden muodostumiseen vaikuttavalla tavalla, niin että saadaan kirjasto, jossa on cDNA:ita, jotka koo-dittavat otaksuttuja nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormi-polypeptidejä, jotka voidaan seuloa toiminnallisella määri-10 tyksellä, jolla tutkitaan sitoutumista sinkkisormi-nukleo-tidisitoutumisaiheeseen, kuten promoottorissa olevaan aiheeseen, johon tapahtuva sitoutuminen estää transkriptio-naalisen aktivaation.
Keksintöön liittyvät alukkeet suunnitellaan "oleel-15 lisesti" komplementaarisiksi monistettavan, nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia koodattavan polynukleoti-din kummankin säikeen jollekin segmentille. Tämä tarkoittaa, että alukkeiden tulee olla riittävän komplementaarisia hybridisoituakseen niitä vastaavien säikeiden kanssa olo-20 suhteissa, joissa polymeroitumisen ja nukleotidin laajentumisen aikaansaava aine pääsee toimimaan. Alukkeilla tulisi olla toisin sanoen riittävä kömpiementaarisuus reunustavien sekvenssien kanssa, jotta ne hybridisoituvat niiden kanssa ja mahdollistavat nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipro-25 teiinia koodattavan polynukleotidin monistuksen. Alukkeet ovat edullisesti tarkasti komplementaarisia reunustavalle sekvenssisäikeelle.
Keksintöön liittyviä oligonukleotidialukkeita käytetään monistusprosesissa, joka on entsymaattinen ketjure-30 aktio, joka tuottaa eksponentiaalisia määriä nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä suhteessa reaktiovaihei-den lukumäärään. Tyypillisesti toinen aluke on komplementaarinen nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia koodittavan polynukleotidin negatiiviselle (-) säikeelle ja 35 toinen positiiviselle (+) säikeelle. Alukkeiden pariuttami- 30 nen denaturoidun nukleiinihapon kanssa, jota seuraa laajennus käyttämällä entsyymiä, kuten DNA-polymeraasi I:n suurta fragmenttia (Klenow-fragmenttia) ja nukleotideja, johtaa uusiin syntetisoituihin (+)- ja (-)-säikeisiin, jotka si-5 sältävät nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia vastaavan sekvenssin. Koska nämä uudet syntetisoidut sekvenssit ovat myös alukkeita, toistuvat denaturointi-, aluk-keenpariutus- ja laajennussyklit johtavat alukkeen määrittelemän sekvenssin (ts. nukleotideihin sitoutuvaa sink-10 kisormiproteiinia vastaavan polynukleotidisekvenssin) eks ponentiaaliseen tuotantoon. Ketjureaktion tuote on erillinen nukleiinihappokaksoissäie, jonka päät vastaavat käytet- j tyjen spesifisten alukkeiden päitä. Ammattimiehet tuntene-vat muita monistusmenetelmiä, joita myös voidaan käyttää 15 kohteena olevan nukleiinihapon kopiolukumäärän suurentami seen. Niihin voivat kuulua esimerkiksi ligaatioaktivoitu transkriptio (LAT), ligaasiketjureaktio (LCR) ja säikeen-syrjäytysaktivaatio (SDA), vaikka PCR onkin edullinen menetelmä.
20 Keksintöön liittyviä oligonukleotidialukkeita voi daan valmistaa millä tahansa sopivalla menetelmällä, kuten tavanomaisilla fosfotriesteri- ja fosfodiesterimenetelmillä tai niiden automaatistetuilla suoritusmuodoilla. Yhdessä mainitunlaisessa automaatistetussa suoritusmuodossa käyte-25 tään lähtöaineina dietyylifosforiamidiitteja ja niitä voidaan syntetisoida Beaucagen et ai. kuvaamalla tavalla [Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859 - 1862] . Yhtä menetelmää oligonukleotidien syntetisoimiseksi muunnetulla kiinteällä alustalla kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 458 066. Yksi 30 monistusmenetelmä, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti, on US-patenttijulkaisuissa 4 683 202 ja 4 683 195 kuvattu polymeraasiketjureaktio (PCR). 1 31
Menetelmä rihmallisiin faageihin perustuvien kirjastojen hyödyntämiseksi peptidisekvenssien mutaatioiden aikaansaamiseksi esitetään Ladnerin et ai. nimissä olevassa US-patenttijulkaisussa 5 223 409, joka mainitaan tässä ko-5 konaisuudessaan viitteenä.
Keksinnön yhdessä suoritusmuodossa voidaan tehdä satunnaistettuja nukleotidisubstituutioita DNA:lie, joka koodittaa tunnetun sinkkisormiproteiinin yhtä tai useampaa sormea, sellaisen polypeptidijohdannaisen aikaansaamiseksi, 10 joka muuntaa geenin ilmentymistä sitouduttuaan kyseisen geenin sisältävän DNA:n johonkin kohtaan, kuten transkrip-tionsäätelyelementtiin. Sinkkisormen muodostavien aminohappojen muuntamisen lisäksi sinkkisormijohdannaispolypeptidin sisältämien sormien määrä voi olla suurempi tai pienempi 15 kuin sormien täysi määrä villin tyypin proteiinissa, josta se on johdettu.
Vaikka mutageneesin toteuttamiseen voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää suunnatun mutageneesin tekemiseksi, menetelmässä, jota käytetään muunnettavan sinkkisormiprote-20 iinisegmentin satunnaistamiseen, hyödynnetään edullisesti degeneroitujen oligonukleotidialukkeiden yhdistelmää, joka sisältää lukuisia triplettikodoneja, joilla on kaava NNS tai NNK (ja sen komplementti NNM) , joissa S on G tai C, K on G tai T, M on C tai A (NNK:n komplementti) ja N voi olla 25 A, C, G tai T. Degeneroitujen triplettikodonien lisäksi de generoidut oligonukleotidialukkeet sisältävät myös vähintään yhden segmentin, joka on suunniteltu hybridis oi tumaan DNA:han, joka koodittaa villin tyypin sinkkisormiproteiinia ainakin yhdestä päästä, ja niitä käytetään peräkkäisissä 30 sykleissä PCR-monistuksessa, joka tunnetaan alalla limit- täislaajennus-PCR:nä, niin että syntyy määrätty degeneroitu alue, joka on alukeyhdistelmässä olevien alukkeiden degen-roimattomien alueiden välissä.
32
Limittäis-PCR-menetelmät, jollaisia käytetään määrättyjen cDNA-alueiden satunnaistamiseen, ovat alalla hyvin tunnettuja, ja niitä valaistaan tarkemmin jäljempänä esimerkissä 3. Limittäis-PCR-reaktioiden degeneroidut tuotteet 5 yhdistetään ja puhdistetaan geelillä, edullisesti kokoeks- luusiokromatografiällä tai geelielektroforeesilla, ennen ligaatiota pintaesiintymisfaagi-ilmentymisvektoriin kirjaston muodostamiseksi myöhempää seulontaa varten, joka tehdään käyttämällä tunnettua tai otaksuttua sinkkisormi-10 nukleotidisitoutumisaihetta.
Degeneroituja alukkeita käytetään,,, peräkkäisissä sykleissä PCR-monistuksessa, joka tunnetaan alalla limit-täislaajennus-PCR:nä, niin että syntyy kirjasto, joka käsittää cDNA-sekvenssejä, jotka koodittavat otaksuttuja 15 DNA:han sitoutuvia sinkkisormijohdannaispolypeptidejä. Po- lypeptidijohdannaiset sisältävät tavallisesti degeneraatio-alueen, joka vastaa sormen DNA:hän sitoutuvaa aluetta (tavallisesti sormen päässä ja α-heliksialueella) ja jonka ympärillä on degeneroimattomia alueita, jotka vastaavat sor-20 men konservatiivisia alueita, jotka ovat välttämättömiä sormen kolmiulotteiden rakenteen ylläpitämiseksi.
Edellä mainittujen menettelyjen nukleiinihappoläh-tömateriaalina voidaan käyttää mitä tahansa, puhdistetussa tai puhdistamattomassa muodossa olevaa nukleiinihapponäy- I
25 tettä sillä edellytyksellä, että se sisältää tai sen epäillään sisältävän keksinnön mukaista nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiininia vastaavan spesifisen nukleiinihappo sekvenssin. Niinpä menetelmässä voidaan käyttää esimerkiksi DNA:ta tai RNA:ta, mukaan luettuna lähetti-RNA, ja 30 DNA tai RNA voi olla yksisäikeinen tai kaksisäikeinen. Siinä tapauksessa että templaattina on määrä käyttää RNA:ta, käytetään entsyymejä ja/tai olosuhteita, jotka ovat optimaalisia templaatin käänteiskopioimiseksi DNA:ksi. Lisäksi voidaan käyttää DNA-RNA-hybridiä, joka sisältää yhden säi-35 keen kumpaakin. Voidaan käyttää myös nukleiinihappojen 33 seosta tai nukleiinihappoja, joita on tuotettu aiemmassa monistusreaktiossa käyttämällä samoja tai eri alukkeita. Monistettava nukleiinihapposekvenssi, ts. nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia vastaava sekvenssi, voi 5 olla suuremman molekyylin osa tai esiintyä alunperin erillisenä molekyylinä, niin että kyseinen sekvenssi muodostaa koko nukleiinihapon. Monistettavan sekvenssin ei tarvitse olla alunperin läsnä puhtaassa muodossa; se voi olla monimutkaisen seoksen pieni osa, kuten ihmisen tai minkä tähän-10 sa organismin koko DNA:n sisältämä osa. DNA-lähteisiin kuuluvat esimerkiksi prokaryootit, eukaryoottit, virukset ja kasvit.
Kun näytteen kohdenukleiinihapposekvenssi sisältää kaksi säiettä, on välttämätöntä erottaa nukleiinihapon säi-15 keet, ennen kuin sitä voidaan käyttää templaattina. Säikeiden erotus voidaan toteuttaa joko erillisenä vaiheena tai samanaikaisesti alukkeenlaajennustuotteiden synteesin kanssa. Tämä säikeiden erotus voidaan toteuttaa käyttämällä erilaisia sopivia denaturointiolosuhteita, mukaan luettuina 20 fysikaaliset, kemialliset tai entsymaattiset keinot; kaikki mainitunlaiset keinot kuuluvat termin "denaturointi" piiriin. Yhdessä fysikaalisessa menetelmässä nukleiinihap-posäikeiden erottamiseksi nukleiinihappoa kuumennetaan, kunnes se denaturoituu. Tyypillisessä lämpödenaturoinnissa 25 voidaan käyttää suunnilleen alueella 80 - 105 °C olevia lämpötiloja noin 1-10 minuutin ajan. Säikeiden erottuminen voidaan indusoida myös helikaaseina tunnetun entsyymi-ryhmän entsyymillä tai entsyymillä RecA, jolla on heli-kaasiaktiivisuus ja jonka tiedetään denaturoivan DNA:ta ri-30 boATP:n läsnä ollessa. Helikaaseilla tehtävään nukleiini-happosäikeiden erottamiseen soveltuvia reaktio-olosuhteita kirvaa Kuhn Hoffman-Berking [CSH-Quantitative Biology 43 (1978) 63], ja katsaus menetelmiin RecA:n käyttämiseksi esitetään julkaisussa - C. Radding, Ann. Rev. Genetics 16 35 (1982) 405 - 437.
! 34
Jos monistettavan sekvenssin sisältävä nukleiinihappo on yksisäikeinen, sen komplementti syntetisoidaan lisäämällä yksi tai kaksi oligonukleotidialuketta. Jos käytetään yhtä aluketta, alukkeenlaajennustuote syntetisoidaan 5 alukkeen, polymeraation aikaansaavan aineen ja jäljempänä kuvattavien neljän nukleosiditrifosfaatin läsnä ollessa. Tuote on osittain komplementaarinen kyseiselle yksisäikei-selle nukleiinihapolle ja hybridisoituu yksisäikeisen nukleiinihapon kanssa, niin että muodostuu kaksoissäie, jossa 10 on eripituiset säikeet, jotka voidaan sitten erottaa yksittäisiksi säikeiksi, niin että syntyy kaksi erillisistä yksittäistä komplementaarista säiettä. Vaihtoehtoisesti yk-sisäikeiseen nukleiinihappoon voidaan lisätä kaksi aluketta ja toteuttaa reaktio kuvatulla tavalla.
15 Kun yhden tai useamman nukleiinihapon komplementaa riset säikeet on erotettu, erotetut säikeet ovat, riippumatta siitä onko nukleiinihappo alunperin ollut kaksi- vai yksisäikeinen, valmiita käytettäviksi templaattina lisänuk-leiinihapposäikeiden synteesiin. Tämä synteesi tehdään olo-20 suhteissa, jotka mahdollistavat alukkeiden hybridisoitumi-sen templaatteihin. Synteesi tapahtuu yleensä puskuroidussa vesipitoisessa liuoksessa, edullisesti pH:n 7 - 9, edullisimmin noin 8, vallitessa. Kahta oligonukleotidialuketta lisätään erotetut templaattisäikeet sisältävään puskuriliu-25 okseen edullisesti moolinen ylimäärä (genomisen nukleiinihapon ollessa kyseessä suhde aluke:templaatti on tavallisesti noin 108:1). On kuitenkin selvää, ettei komplementaarisen säikeen määrää ehkä tunneta, jos keksinnön mukaista menetelmää käytetään diagnostisiin sovelluksiin, niin 30 ettei alukkeen määrän suhdetta komplementaarisen säikeen määrään pystytä määrittämään varmuudella. Käytännössä lisättävää aluketta on kuitenkin yleensä moolinen ylimäärä komplementaarisen säikeen (templaatin) määrään nähden, kun monistettava sekvenssi on monimutkaisten pitkäketjuisten 35 nukleiinihapposäikeiden seoksessa. Suuri mooliylimäärä on edullinen prosessin tehon parantamiseksi.
Deoksiribonukleotiditrifosfaatteja dATP, dCTP, dGTP ja dTTP lisätään synteesiseokseen, joko erikseen tai yhdes-5 sä alukkeiden kanssa, riittäviä määriä ja tuloksena olevaa liuosta kuumennetaan suunnilleen lämpötilassa 90 - 100 °C noin 1-10 min, edullisesti 1-4 min. Tämän kuumennusjakson jälkeen liuoksen annetaan jäähtyä lämpötilaan, joka on edullinen alukkeiden hybridisaation kannalta. Jäähdytettyyn 10 seokseen lisätään sopivaa ainetta alukkeenlaajennusreaktion aikaansaamiseksi (tässä "polymeraation aikaansaava aine") ja reaktion annetaan tapahtua alalla tunnetuissa olosuhteissa. Polymeraation aikaansaava aine voidaan myös lisätä yhdessä muiden reagenssien kanssa, jos se on lämmönkestä-15 vää. Tämä synteesi (eli monistus) -reaktio voi tapahtua lämpötila-alueella, joka ulottuu huoneenlämpötilasta lämpötilaan, jonka yläpuolella polymeraation aikaansaava aine ei enää toimi. Reaktio tapahtuu kätevimmin huoneenlämpötilassa.
20 Polymeraation aikaansaava aine voi olla mikä tahan sa yhdiste tai järjestelmä, joka toimii alukkeenlaajennus-tuotteiden synteesin toteuttavalla tavalla, entsyymit mukaan luettuina. Tähän tarkoituksen soveltuviin entsyymeihin kuuluvat esimerkiksi E. coli -DNA-polymeraasi I, E. coli 25 -DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti, T4-DNA-polymeraasi, muut saatavilla olevat DNA-polymeraasit, polymeraasimuteii-nit, käänteistranskriptaasi ja muut entsyymit, mukaan luettuina lämmönkestävät entsyymit (ts. entsyymit, jotka toteuttavat alukkeenlaajennuksen jouduttuaan alttiiksi lämpö- { 30 tiloille, jotka ovat kyllin korkeita aiheuttaakseen denatu- j raation). Sopivat entsyymit helpottavat asianmukaisella tavalla nukleotidien yhdistymistä, niin että muodostuuu alukkeenlaaj ennus tuotteita, jotka ovat komplementaarisia kullekin nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia vastaa-35 valle nukleiinihapposäikeelle. Synteesi käynnistyy yleensä ;
M
36 kunkin alukkeen 3'-päästä ja etenee 5'-suuntaan pitkin templaattisäiettä, kunnes synteesi keskeytyy, jolloin tuloksena on eripituisia molekyylejä. Voi kuitenkin olla po-lymeraation aikaansaavia aineita, jotka käynnistävät syn-5 teesin 5'-päästä ja etenevät eri suuntaan käytettäessä samaa menettelyä edellä kuvatulla tavalla.
Uusi syntetisoitu nukleotideihin sitoutuvaa sink-kisormipolypeptidiä vastaava säie ja sille komplementaarinen nukleiinihapposäie muodostavat kaksisäikeisen molekyy-10 Iin edellä kuvatuissa hybridisaatio-olosuhteissa, ja tätä hybridiä käytetään prosessin myöhemmissä vaiheissa. Seuraa-vassa vaiheessa uusi syntetisoitu kaksisäikeinen molekyyli saatetaan denaturoivien olosuhteiden alaiseksi käyttämällä mitä tahansa edellä kuvatuista menettelyistä, niin että 15 saadaan yksisäikeisiä molekyylejä.
Edellä mainittu prosessi toistetaan yksisäikeisille molekyyleille. Polymeraation aikaansaavaa ainetta, nukleotideja ja alukkeita voidaan vielä lisätä tarvittaessa, jotta reaktio etenee edellä määritellyissä olosuhteissa. Syn-20 teesi käynnistyy jälleen kunkin oligonukleotidialukkeen toisesta päästä ja etenee templaatin yksittäisiä säikeitä pitkin, niin että syntyy lisää nukleiinihappoa. Tämä vaiheen jälkeen puolet laajennustuotteesta koostuu kahden alukkeen rajoittamasta spesifisestä nukleiinihapposekvens-25 sistä.
Denaturointi- ja laajennustuotesynteesivaiheita voidaan toistaa tarvittava määrä kertoja nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia vastaavan nukleiinihappose-kvenssin monistamiseksi detektoinnin vaatimassa määrin. 30 Tuotetun spesifisen nukleiinihapposekvenssin määrä kasvaa eksponentiaalisesti.
Keksinnön mukaisilla menetelmillä monistetut sekvenssit voidaan lisäksi tutkia, detektoida, kloonata, sek-ventoida yms. joko liuoksessa tai kiinteälle alustalle si-35 tömisen jälkeen millä tahansa menetelmällä, jota käytetään 37 tavallisesti jonkin määrätyn DNA-sekvenssin detektointiin, kuten PCR:llä, oligomeerirestriktiolla [Saiki et ai., Bio/Technology 3 (1985) 1008 - 1012], analysoimalla allee- lispesifisellä oligonukleotidi (ASO) -koettimella [Conner 5 et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 278], oligo-nukleotidiligaatiomäärityksillä (OLA) [Landegren et ai., Science 241 (1988) 1077] yms. Katsaus molekulaarisiin DNA-analyysimenetelmiin esitetään julkaisussa Landegren et ai., Science 242 (1988) 229 - 237. Keksinnön mukaisia uudenlai-10 siä DNA:han sitoutuvia sinkkisormijohdannaispolypeptidejä voidaan edullisesti eristää käyttämällä edellä kuvattuja menetelmiä, joiden yhteydessä alukkeet mahdollistavat nukleotidien muuntamisen, kuten substituution, niin että syntyy ainutlaatuisia sinkkisormia (katso esimerkit lisäyksi-15 tyiskohtien suhteen).
Tämän keksinnön yhteydessä voidaan nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä koodittavia nukleoti-disekvenssejä sijoittaa yhdistelmäilmentymisvektoriin. Termi "yhdistelmäilmentymisvektori" tarkoittaa plasmidia, vi-20 rusta tai muuta alalla tunnettua kuljetusvälinettä, jota on käsitelty insertoimalla eli sisällyttämällä siihen nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormijohdannaisproteiinia koodittavia geenisekvenssejä. Mainitunlaiset ilmentymisvektorit sisältävät promoottorisekvenssin, joka helpottaa inser-25 toidun geenisekvenssin tehokasta transkriptiota isännässä.
Ilmentymisvektori sisältää tyypillisesti replikaatiolähteen ja promoottorin samoin kuin spesifisiä geenejä, jotka mahdollistavat transformoitujen solujen fenotyyppivalikoinnin. Tämän keksinnön yhteydessä käytettäviksi soveltuviin vekto-30 reihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, bakteereissa tapahtuvaan ilmentämiseen tarkoitettu T7-pohjainen ilmentymisvektori [Rosenberg et ai., Gene 56 (1987) 125], nisäkässoluissa tapahtuvaan ilmentämiseen tarkoitettu pMSXND-ilmentymisvektori [Lee ja Nathans, J. Bio. Chem. 263 35 (1988) 3521] ja hyönteissoluissa tapahtuvaan ilmentämiseen 38 tarkoitetut baculoviruspohjäiset vektorit. DNA-segmentti voi olla vektorissa kytkettynä toiminnallisesti säätelyele-menttehin, esimerkiksi promoottoriin (esimerkiksi T7-pro- moottoriin, metallotioneiini I -promoottoriin tai polyed-5 riinipromoottoriin).
DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat keksinnön mukaisia uudenlaisia nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormipoly-peptidejä, voidaan ilmentää in vitro siirtämällä DNA sopivaan isäntäsoluun. "Isäntäsolut" ovat soluja, joissa vekto-10 ria voidaan lisätä ja ilmentää sen DNA:ta. Tämän termiin piiriin kuuluu myös kyseisen isäntäsolun mikä tahansa jälkeläinen. On selvää, että kaikki jälkeläiset eivät ehkä ole identtisiä kantasolun kanssa, sillä replikaation aikana saatta tapahtua mutaatioita. Mainitunlaiset jälkeläiset 15 katsotaan kuitenkin kuuluviksi termin "isäntäsolu" piiriin sitä käytettäessä. Menetelmät stabiilin siirron, toisin sanoen sellaisen siirron, jonka yhteydessä vieras DNA tulee jatkuvasti pidetyksi yllä isännässä, tekemiseksi ovat alalla tunnettuja.
20 Isäntäsolun transformointi yhdistelmä-DNA:11a voi daan toteuttaa tavanomaisin menetelmin, jollaiset ovat ammattimiesten hyvin tuntemia. Kun isäntä on prokaryootti, kuten E. coli, kompetentteja soluja, jotka pystyvät ottamaan vastaan DNA:ta, voidaan valmistaa soluista, jotka on 25 otettu talteen kasvun eksponentiaalisen vaiheen jälkeen ja käsitelty sitten CaCl2-menetelmällä alalla hyvin tunnetuin menettelyin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää MgCl2:a tai RbCl:a. Transformaatio voidaan toteuttaa myös isäntäsolu-protoplastin muodostamisen jälkeen tai elektroporaatiolla.
30 Kun isäntä on eukaryootti, voidaan käyttää sellai sia DNA-transfektiomenetelmiä kuin kalsiumfosfaattikera-saostumia, tavanomaisia mekaanisia menettelyjä, kuten mikroin jektointia, elektroporaatiota, liposomeihin suljetun plasmidin insertiota tai virusvektoreita.
39
Nukleotideja sitovaa sinkkisormijohdannaista koo-dittavan sekvenssin ilmentämiseen voidaan käyttää erilaisia isäntä-ilmentymisvektorijärjestelmiä. Niihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mikro-organismit, kuten 5 bakteerit, jotka on transformoitu yhdistelmäbakteriofagi- DNA-, -plasmidi-DNA- tai -kosmidi-DNA-iImentymisvekto-reilla, jotka sisältävät nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormi johdannaispolypeptidiä koodittavan sekvenssin; hiivat, jotka on transformoitu yhdistelmähiivailmentymisvekto-10 reillä, jotka sisältävät nukleotideihin sitoutuvaa sink- kisormipolypeptidiä koodittavan sekvenssin; kasvisolujär-jestelmät, jotka on infektoitu yhdistelmävirusilmentymis-vektoreilla (esimerkiksi kukkakaalin mosaiikkivirus, CaMV; tupakan mosaiikkivirus, TMVj tai transformoitu yhdistelmä-15 plasmidi-ilmentymisvektoreilla (esimerkiksi Ti-plasmidil- la), jotka sisältävät DNA:han sitoutuvaa sinkkisormijohdannaista koodittavan sekvenssin; hyönteissolujärjestelmät, jotka on infektoitu yhdistelmävirusilmentymisvektoreilla (esimerkiksi baculovirus), jotka sisältävät nukleotideihin | 20 sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä koodittavan sekvenssin; tai eläinsolujärjestelmät, jotka on infektoitu yhdistelmä-virusilmentymisvektoreilla (esimerkiksi retrovirukset, adenovirus, lehmänrokkovirus), jotka sisältävät nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormijohdannaista koodittavan sek-25 venssin, tai transformoidut eläinsolujärjestelmät, jotka on käsitelty stabiilisti ilmentäviksi. Tapauksissa, joissa glykosylaatio saattaa olla tärkeää, voidaan käyttää ilmen-tymisjärjestelmiä, joita saavat aikaan muuntumisia translaation yhteydessä tai jälkeen, esimerkiksi nisäkäs-, hyön-30 teis-, hiiva- tai kasvi-ilmentymisjärjestelmiä.
Käytettävän isäntä-vektorijärjestelmän mukaan il-mentymisvektorissa voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista sopivista transkriptio- ja translaatioelementeistä, mukaan luettuina konstitutiiviset ja indusoitavissa olevat pro-35 moottorit, transkriptiota tehostavat elementit, transkrip- 40 tioterminaattorit jne. [katso esimerkiksi Bitter et ai.,
Methods in Enzymology 153 (1987) 516 - 544] . Esimerkiksi tehtäessä kloonaus bakteerijärjestelmiin voidaan käyttää indusoitavissa olevia promootteja, kuten bakteriofagi λ:η 5 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-hybridipromoottori) yms.
Tehtäessä kloonaus nisäkässolujärjestelmiin voidaan käyttää promoottoreja, jotka ovat peräisin nisäkässolugenomista (esimerkiksi metallotioneiinipromoottori) tai nisäkäsviruk-sista (esimerkiksi rteroviruksen pitkä terminaalinen tois-10 to; adenoviruksen myöhäinen promoottori; lehmänrokkoviruk-sen 7.5K-promoottori). Myös yhdistelmä-DNA- tai synteesimenetelmin tuotettuja promoottoreja voidaan käyttää saamaan aikaan insertoidun, nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormi-polypeptidiä koodittavan sekvenssin transkriptio.
15 Bakteerijärjestelmiin voidaan valita edullisesti joukko ilmentymisvektoreita ilmennetyn nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormijohdannaispolypeptidin aiotun käyttötarkoituksen mukaan. Kun on esimerkiksi määrä tuottaa suuria määriä proteiinia, voivat toivottavia olla vektorit, 20 jotka ohjaavat ilmentymistä siten, että syntyy suuria määriä fuusioproteiinituotteita, jotka on helppo puhdistaa.
Vektorit, jotka on käsitelty sisältämään pilkkoutumiskohta proteiinin talteenoton helpottamiseksi, ovat edullisia. Mainitunlaisiin vektoreihin kuuluvat, mainittuihin kuiten-25 kaan rajoittumatta, E. coli -iImentymisvektori pUR278 [Rut-her et ai., Embo J. 2 (1983) 1791], jonka yhteydessä nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia koodittava sekvenssi voidaan ligatoida vektoriin samaan kehykseen lac Z -kooditusalueen kanssa, niin että syntyy sinkkisormi -30 lac Z -hybridiproteiini; pIN-vektorit [Inouye ja Inouye,
Nucleic Acids Res. 13 (1985) 3101 - 3109; Van Heeke ja
Schuster, J. Biol. Chem. 264 (1989) 5503 - 5509] yms.
Hiivoissa voidaan käyttää joukkoa vektoreita, jotka sisältävät konstitutiivisia tai indusoitavissa olevia pro-35 moottoreja. Katsauksen saamiseksi katso Current Protocols 5 41 in Molecular Biology, vol. 2, toim. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience 1988, luku 13; Grant et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, Methods In Enzymology (toim. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, 5 N.Y. ) 153 (1987) 516 - 544; Glover, DNA Cloning, voi. II, IRL Press, Wash., D.C. 1986, luku 3; Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods In Enzymology (toim. Berger ja Kimmel, Acad. Press, N.Y.) 152 (1986) 673 - 684; The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, voi I ja II, 10 toim. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press 1982. Konstitutiivista hiivapromoottoria, kuten ADH tai LEU2, tai indusoitavissa olevaa promoottoria, kuten GAL, voidaan käyttää (R. Rothstein, Cloning in Yeast teoksessa DNA Cloning, voi. II, A Practical Approach, toim. D. M. Glover, IRL 15 Press, Wash., D.C. 1986, luku 3). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää vektoreita, jotka edistävät vieraiden DNA-sekvens- .
sien integroitumista hiivan kromosomiin.
Tapauksissa, joissa käytetään kasvi-iImentyrnis-vektoreita, voi nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipoly-20 peptidiä koodittavan sekvenssin ilmentymistä ohjata mikä tahansa joukosta promoottoreja. Esimerkiksi viruspromootto-reja, kuten CaMV:n 35S-RNA- ja 19S-RNA-promoottoreja [Bris-son et al., Nature 310 (1984) 511 - 514] tai TMV:n peite-proteiinipromoottoria [Takamatsu et al., EMBO J. 6 (1987) 25 307 - 311], voidaan käyttää; vaihtoehtoisesti voidaan käyt tää kasvipromoottoreja, kuten RUBISCOn pientä alayksikköä [Coruzzi et al., EMBO J. 3 (1984) 1671 - 1680; Broglie et al., Science 224 (1984) 838 - 843], tai lämpösokkipromoot-toreja, esimerkiksi soijapavun hspl7.5-E:tä tai hspl7.3-30 B:tä [Gurley, et ai., Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 559 - 565].
Näitä rakenteita voidaan viedä kasvisoluihin käyttämällä Ti-plasmideja, Ri-plasmideja, kasvivirusvektoreita, suoraa DNA-transformaatiota, mikroinjektointia, elektroporaatiota jne. Mainitunlaisia menetelmiä koskevien katsausten suhteen 35 katso, Weissbach ja Weissbach, Methods for Plant Molecular 42
Biology, osa VIII, Academic Press, NY 1988, s. 421 - 463;
Grierson ja Corey, Plant Molecular Biology, 2. p., Blackie,
Lontoo 1988, kappaleet 7-9.
Yksi vaihtoehtoinen järjestelmä, jota voidaan käyt-5 tää keksinnön mukaisen proteiinin ilmentämiseen, on hyön-teisjärjestelmä. Yhdessä mainitunlaisessa järjestelmässä käytetään Autographa californican tuman polyedroosivirusta (AcNPV) vektorina vieraiden geenien ilmentämiseen. Kyseinen virus kasvaa Spodoptera frugiperda -soluissa. Nukleotidei-10 hin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä koodittava sekvenssi voidaan kloonata viruksen ei-välttämättömille alueille (Spodoptera frugiperda·. esimerkiksi polyedriinigeeni) ja sijoittaa AcNPV-promoottorin (esimerkiksi polyedriinipro-moottorin) säätelyn alaiseksi. Nukleotideihin sitoutuvaa 15 sinkkisormipolypeptidiä koodittavan sekvenssin onnistunut insertio johtaa polyedriinigeenin inaktivaatioon ja sisään sulkeutumattoman yhdistelmäviruksen (ts. viruksen, jolta puuttuu polyedriinigeenin koodittaman proteiinipeite) syntymiseen. Näitä yhdistelmäviruksia käytetään sitten sel-20 laisten solujen infektointiin, joissa insertoitu geeni ilmentyy. [Katso esimerkiksi Smith et ai., J. Biol. 46 (1983) 584; Smith, US-patenttijulkaisu 4 215 051].
Eukrayoottijärjestelmät, edullisesti nisäkäsilmen-tymisjärjestelmät, mahdollistavat ilmentyneiden nisäkäspro-25 teiinien asianmukaisten translaationjälkeisten muuntumisten tapahtumisen. Siksi eukaryoottisolut, kuten nisäkässolut, joilla on solukoneisto primaaritranskriptin asianmukaisen prosessoinnin, glykosylaation, fosforylaation ja edullisesti geenituotteen erittymisen toteuttamiseksi, ovat edulli-30 siä isäntäsoluja nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormijoh- dannaispolypeptidin ilmentymisen kannalta. Mainitunlaisiin isäntäsolulinjoihin voivat kuulua, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, -293 ja W138.
i 43
Nisäkässolujärjestelmiä, jotka hyödyntävät yhdiste lmävi ruksi a tai viruselementtejä ilmentymisen ohjaamisessa, voidaan muodostaa. Käytettäessä esimerkiksi adenovi-rusilmentymisvektoreita voidaan sinkkisormijohdannaispoly-5 peptidiä koodittava sekvenssi ligatoida adenoviruksen tran-skription-translaationsäätelykompleksiin, esimerkiksi myöhäiseen promoottoriin ja kolmiosaiseen esisekvenssiin. Tämä kimeerinen geeni voidaan sitten insertoida adenovirus-genomiin in vitro tai in vivo -rekombinaatiolla. Insertoin-10 ti virusgenomin ei-välttämättömälle alueelle (esimerkiksi alueelle El tai E3) johtaa yhdistelmävirukseen, joka on elinkykyinen ja pystyy ilmentämään sinkkisormipolypeptidiä infektoiduissa isännissä [katso esimerkiksi Logan ja Shenk,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 3655 - 3659], Vaihto-15 ehtoisesti voidaan käyttää lehmänrokkoviruksen 7.5K- promoottoria [katso esimerkiksi Mackett et ai., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 79 (1982) 7415 - 7419; Mackett et ai., J.
Virol. 49 (1984) 857 - 864; Panicali et ai., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 79 (1982) 4927 - 4931]. Erityisen kiintoisia 20 ovat naudan papilloomavirukseen perustuvat vektorit, joilla on kyky replikoitua kromosomin ulkopuolisina elementteinä [Sarver et ai., Mol. Cell. Biol. 1 (1981) 486]. Pian tämän DNA:n hiiren soluihin tulemisen jälkeen plasmidi replikoi-tuu noin 100 - 200 kopioksi solua kohden. Insertoidun 25 cDNA: n transkriptio ei vaadi plasmidin integroi tiimistä isännän kromosomiin ja antaa siten tulokseksi korkean il- f mentymistason. Näitä vektoreita voidaan käyttää stabiiliin ilmentämiseen sisällyttämällä plasmidiin valikointimarkke-ri, kuten neo-geeni. Retrovirusgenomia voidaan vaihtoehtoi-30 sesti muuntaa käytettäväksi vektorina, joka voidaan viedä isäntäsoluihin ja jolla on kyky ohjata nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia vastaavan geenin ilmentymistä isäntäsoluissa [Cone ja Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 81 (1984) 6349 - 6353]. Korkea ilmentymistaso voidaan 35 saavuttaa myös käyttämällä indusoitavissa olevia promootto- 44 re ja, mukaan luettuina metallotioneiini HA -promoottori ja lämpösokkipromoottorit, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta .
Yhdistelmäproteiinien tuottamiseksi pitkäaikaisesti 5 hyvällä saannolla ovat stabiilit ilmentymisvektorit edullisia. Virusten replikaatiolähteitä sisältävien ilmentymis-vektoreiden sijasta isäntäsolut voidaan transformoida cDNA:lla, jota säätelevät sopivat ilmentymisensäätelyele-mentit (esimerkiksi promoottori, tehostin, sekvenssit, 10 transkriptioterminaattorit, polyadenylaatiokohdat jne.), ja valikointimarkkerilla. Yhdistelmäplasmidissa oleva välikö in timarkkeri antaa resistenssin valikointia varten ja antaa soluille mahdollisuuden integroida plasmidi pysyvästi kromosomeihinsa ja kasvaa pesäkkeiksi, jotka puolestaan 15 voidaan kloonata ja lisätä solulinjoiksi. Käsiteltyjen solujen voidaan vieraan DNA:n tuomisen jälkeen esimerkiksi antaa kasvaa 1-2 vuorokautta rikastetussa alustassa ja siirtyä sitten selektiiviseen alustaan. Voidaan käyttää joukkoa valikointijärjestelmiä, mukaan luettuina, mainit-20 tuihin kuitenkaan rajoittumatta, herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasia [Wigler et ai., Cell 11 (1977) 223], hy-poksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasia [Szybalska ja Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48 (1962) 2026] ja adeniinifosforibosyylitransferaasia [Lowy et ai., Cell 22 25 (1980) 817] koodittavat geenit, joita voidaan käyttää tk'-, hgprt"- ja vastaavasti aprt~-soluissa. Valikoinnin pohjana j
voidaan käyttää myös antimetaboliittiresistenssin antavia geenejä, esimerkiksi geeniä dhfr, joka antaa resistenssin metotreksaatille [Wigler et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 30 77 (1980) 3567; O'Hare et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA
78 (1981) 1527]; gpt, joka antaa resistenssin mykofenoli- hapolle [Mulligan ja Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2072; neo, joka antaa resistenssin aminoglykosidi G-418:lle [Colberre-Garapin et ai., J. Mol. Biol. 150 (1981) 35 1] , ja hygro, joka antaa resistenssin hygromysiinille [San- 45 terre et al., Gene 30 (1984) 147], Viime aikoina on kuvattu muita väliköintigeenejä, nimittäin trpBitä, joka antaa soluille mahdollisuuden hyödyntää indolia tryptofäänin sijasta; hisDrtä, joka antaa soluille mahdollisuuden hyödyntää 5 histinolia histidiinin sijasta [Hartman ja Mulligan, Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 804], ja ODC:tä (orni- tiinidekarboksylaasi), joka antaa resistenssin ornitiinide-karboksylaasi-inhibiittorille, 2-(difluorimetyyli)-DL-orni-tiinille (DFMO) (McConlogue, L. teoksessa Current Com-10 munications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Labo ratory 1987) .
Keksinnön mukaisesti aikaansaadun mikrobeissa ilmennetyn proteiinin tai sen fragmenttien eristys ja puhdistus voidaan tehdä tavanomaisin keinoin, mukaan luettuina 15 preparatiivinen kromtografia ja immunologiset erotukset, joissa käytetään monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita. Tämän keksinnön yhteydessä käyttöön tarjottavat vasta-aineet ovat immuunireaktiivisia keksinnön mukaisen nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormiproteiinin kanssa.
20 Käyttöön tarjotaan vasta-aine, joka koostuu olennaisilta osiltaan yhdistetyistä monoklonaalisistä vasta-aineista, joiden epitooppispesifisyydet ovat erilaisia, samoin kuin erillistä monoklonaalista vasta-ainetta käsittäviä valmisteita. Monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan proteii-25 nin antigeenipitoisista fragmenteista alalla hyvin tunne tuin menetelmin [Kohler et ai., Nature 256 (1975) 495; Current Protocols in Molecular Biology, toim. Ausubel et al. |
1989]. I
Tämä keksintö liittyy myös geeniterapian solujen 30 sellaisten proliferaatiohäiriöiden hoitamiseksi, jotka liittyvät sellulaariseen nukleotidisekvenssiin, joka sisältää sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen. Mainitunlaisella terapialla saavutettaisiin hoitovaikutus viemällä proli-feraatiohäiriöstä kärsivien eläinten soluihin nukleotidei-35 hin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä vastaava polynukle- 46 otidi. Nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia koo-dittavan polynukleotidin anto voidaan saada aikaan käyttämällä esimerkiksi yhdistelmäilmentymisvektoria, kuten ki-meeristä virusta tai kolloididispersiojärjestelmää.
5 Termi "solujen proliferaatiohäiriö" tarkoittaa pa hanlaatuisia samoin kuin ei-pahanlaatuisia solupopulaatioita, jotka usein näyttävät eroavan muodoltaan ympäröivästä kudoksesta. Solujen proliferaatiohäiriö voi olla transkrip-tiohäiriö, joka johtaa geenin ilmentymistason kasvuun tai 10 laskuun. Häiriön syy voi olla solu- tai virusperäinen. Geeniterapiaa, jossa käytetään nukleotideihin sitoutuvaa sinkki s ormipolypep ti di ä, voidaan käyttää viruksen indusoiman solujen proliferaatiohäiriön hoitamiseen esimerkiksi ihmisessä samoin kuin kasvissa. Hoito voi olla profylaktista, 15 esimerkiksi kasvisolun tekemiseksi resistentiksi virukselle, tai terapeuttista solussa jo esiintyvän infektion lievittämiseksi estämällä virustuotteiden syntyminen.
Polynukleotidi, joka koodittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä, on käyttökelpoinen eri-20 laisten elinjärjestelmien, kuten esimerkiksi keuhkojen, rintojen, imukudoksen, maha-suolikanavan ja virtsa- ja sukupuolielinten, pahanlaatuisten kasvainten samoin kuin adenokarsinoomien hoidossa, joihin kuuluu sellaisia pahanlaatuisia kasvaimia kuin useimmat paksusuolisyövät, munu-25 aissolukarsinooma, eturauhassyöpä, ei-pienisoluinen keuhko- karsinooma, ohutsuolisyöpä ja ruokatorvisyöpää. Polynukleotidi, joka koodittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä, on käyttökelpoinen myös muiden kuin pahanlaatuisten solujen proliferaatioon liittyvien sairauksien, 30 kuten psoriasiksen, tavallisen rakkulaihottuman, Behcetin oireiston ja lipidihistiosytoosin, hoidossa. Pohjimmiltaan minkä tahansa häiriön, joka liittyy etiologisesti promoottorin, rakennegeenin tai RNA:n sisältävän sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen aktivaatioon, ajateltaisiin ole-35 van vastaanottavainen hoidolle polynukleotidilla, joka koo- 47 dittaa nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidijohdannaista tai -varianttia.
Erilaisiin virusvektoreihin, joita voidaan käyttää geeniterapiaan tässä esitetyllä tavalla, kuuluvat adenovi-5 rus, herpesvirus, lehmänrokkovirus tai, edullisesti, RNA-virus, kuten retrovirus. Retrovirusvektori on edullisesti hiiren tai linnun retroviruksen johdannainen. Esimerkkeihin retrovirusvektoreista, joihin voidaan insertoida yksi vieras geeni, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, 10 Moloneyn hiiren leukemiavirus (MoMuLV), Harveyn hiiren sar-koomavirus (HaMuSVj, hiiren rintasyöpävirus (MuMTV) ja Rou-sin sarkoomavirus (RSV). Joukko muita retrovirusvektoreita pystyy sisällyttämään useita geenejä. Kaikki nämä vektorit pystyvät siirtämään tai sisällyttämään valikointimarkkeri-15 geenin, niin että voidaan identifioida ja synnyttää soluja, joille on tapahtunut transduktio. Insertoimalla esimerkiksi kiinnostuksen kohteena oleva DNA:hän sitoutuvaa sinkkisor-mipolypeptidiä vastaava sekvenssi virusvektoriin yhdessä toisen geenin kanssa, joka koodittaa jollakin määrätyllä 20 kohdesolulla olevan reseptorin ligandia, tehdään vektorista kohdespesifinen. Retrovirusvektoreista voidaan tehdä koh-despesifisiä insertoimalla niihin esimerkiksi jotakin proteiinia koodittava polynukleotidi. Edullinen kohdennus toteutetaan käyttämällä vasta-ainetta retovirusvektorin koh-25 dentamiseen. Ammattimiehet tuntevat tai pystyvät ilman tarpeettomia kokeiluja helposti toteamaan spesifisiä polynuk-leotidisekvenssejä, joita voidaan insertoida retroviruksen genomiin, niin että mahdollistetaan nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia vastaavan polynukleotidin sisäl-30 tävän retrovirusvektorin kohdespesifinen anto.
Koska yhdistelmäretrovirukset ovat defektiivisiä, ne tarvitsevat apua tuottaakseen infektoivia vektoripartik-keleja. Tätä apua voidaan antaa esimerkiksi käyttämällä auttajasolulinjoja, jotka sisältävät plasmideja, jotka koo-35 dittavat retroviruksen kaikkia rakennegeenejä LTR:ssä ole- 48 vien säätelysekvenssien ohjauksen alaisina. Plasmideista puuttuu nukleotidisekvenssi, joka tekee pakkausmekanismin kykeneväksi tunnistamaan KNA-transkriptin kapselointia varten. Auttajasolulinjoihin, joissa on pakkaussignaalidelee-5 tioita, kuuluvat esimerkiksi ψ2 , PA317 ja PA12, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta. Nämä solulinjat tuottavat tyhjiä virioneja, sillä genomi ei tule pakatuksi. Jos ret-rovirusvektori viedään soluihin, joissa pakkaussignaali on intakti mutta rakennegeenit korvattu muilla, kiinnostuksen 10 kohteena olevilla geeneillä, vektori voidaan pakata ja tuottaa vektorivirioni. Tällä menetelmällä tuotettuja vek-torivirioneja voidaan sitten käyttää kudossolulinjan, kuten NIH 3T3 -solujen, infektointiin ja tuottaa suuria määriä kimeerisiä retrovirusvirioneja.
15 Toinen DNA:hän sitoutuvia sinkkisormijohdannaispo- lypeptidejä koodittavia polynukleotideja soluihin kohdennetusti vievä järjestelmä on kolloididispersiojärjestelmä. Kolloididispersiojärjestelmiin kuuluu makromolekyylikomp-lekseja, nanokapseleita, mikrohelmiä, helmiä ja lipidipoh-20 jäisiä järjestelmiä, öljy vedessä -emulsiot, misellit, mi-selliseokset ja liposomit mukaan luettuina. Tämän keksinnön mukainen edullinen kolloidijärjestelmä on liposomi. Liposomit ovat keinotekoisia kalvorakkuloita, jotka ovat käyttökelpoisia soluunvientivälineinä in vitro ja in vivo. 25 On osoitettu, että suuret unilamellaariset rakkulat (LUV; large unilamellar vesicles), joiden koko on alueella 0,2 -4,0 pm, pystyvät kapseloimaan olennaisen prosenttiosuuden suuria makromolekyylejä sisältävää vesipitoista puskuria. RNA:ta, DNA:ta ja intakteja virioneja voidaan kapseloida 30 vesipitoiseen sisäosaan ja viedä soluihin biologisesti aktiivisessa muodossa [Fraley et ai., Trends Biochem. Sei. 6 (1981) 77] . Liposomeja on käytetty polynukleotidien viemiseen nisäkässolujen lisäksi kasvi-, hiiva- ja baktee-risoluihin. Jotta liposomi olisi tehokas geeninsiirtoväli-35 ne, sillä tulisi olla seuraavat ominaisuudet: (1) kiinnos- 49 tuksen kohteena olevien geenien tehokas kapselointi heikentämättä niiden biologista aktiivisuutta; (2) ensisijainen ja olennainen sitoutuminen kohdesoluun muihin kuin koh-desoluihin verrattuna; (3) rakkulan vesipitoisen sisällön 5 tehokas vieminen kohdesolun sytoplasmaan; (4) geneettisen informaation tarkka ja tehokas ilmentäminen [Mannino et ai., Biotechniques 6 (1988) 682].
Liposomin koostumus on yleensä fosfolipidien, erityisesti faasimuutoslämpötilaltaan korkeiden fosfolipidien, 10 yhdistelmä tavallisesti steroidien, erityisesti kolesterolin, kanssa. Muitakin fosfolipidejä tai lipidejä voidaan käyttää. Liposomien fysikaaliset ominaisuudet riippuvat j pH:sta, ionivahvuudesta ja divalenttisten kationien läsnäolosta.
15 Esimerkkeihin liposomien valmistuksessa käyttökel poisista lipideistä kuuluvat fosfatidyyliyhdisteet, kuten fosfatidyyliglyseroli, fosfatidyylikoliini, fosfatidyy-liseriini, fosfatidyylietanoliamiini, sfingolipidit, sereb-rosidit ja gangliosidit. Erityisen käyttökelpoisia ovat 2 0 diasyylifosfatidyyliglyserolit, joissa lipidiryhmittymä si sältää 14 - 18 hiiliatomia, erityisesti 16 - 18 hiiliatomia, ja on tyydyttynyt. Valaisevia esimerkkejä fosfolipi-deistä ovat munan fosfatidyylikoliini, dipalmitoyylifosfa-tidyylikoliini ja distearoyylifosfatidyylikoliini.
25 Liposomien kohdentumista on luokiteltu anatomisten ja mekanismitekijoiden perusteella. Anatominen luokitus perustuu selektiivisyystasoon, esimerkkinä elinspesifiset, soluspesifiset ja organellispesifiset liposomit. Mekanismin suhteen kohdentuminen voidaan erottaa sen mukaan, onko se 30 passiivista vai aktiivista. Passiivisessa kohdentumisessa hyödynnetään liposomien luonnollista taipumusta jakautua retikuloendoteelijärjestelmän (RES) soluihin sinusoidisia hiussuonia sisältävissä elimissä. Aktiiviseen kohdentumiseen sen sijaan liittyy liposomin muuntuminen spesifiseen 35 ligandiin, kuten monoklonaaliseen vasta-aineeseen, soke- 50 riin, glykolipidiin tai proteiiniin, kytkeytymisen kautta tai liposomin koostumuksen tai koon muuttaminen, jotta saavutetaan kohdentuminen muihin elimiin ja solutyyppeihin kuin luonnossa esiintyviin sijoittumiskohtiin.
5 Kohdennetun soluunvientijärjestelmän pintaa voidaan muuntaa eri tavoin. Liposomeihin perustuvan kohdennetun soluunvienti jär j es telmän ollessa kyseessä liposomin lipidi-kaksoiskerrokseen voidaan sisällyttää lipidiryhmiä kohden-nusligandin pitämiseksi stabiilisti liposomikaksoiskerrok-10 seen liittyneenä. Erilaisia kytkentäryhmiä voidaan käyttää lipidiketjujen liittämiseen kohdennusligandiin.
Kohdennetun soluunvientijärjestelmän pintaan sidottavat yhdisteet ovat yleisesti ottaen ligandeja ja reseptoreja, jotka antavat kohdennetulle soluunvientijärjestelmäl-15 le mahdollisuuden löytää halutut solut ja "etsiytyä" niihin. Ligandi voi olla mikä tahansa kiinnostuksen kohteena oleva yhdiste, joka sitoutuu toiseen yhdisteeseen, kuten reseptoriin.
Pintakalvoproteiineja, jotka sitoutuvat spesifisiin 20 efektorimolekyyleihin, kutsutaan yleisesti reseptoreiksi. Tämän keksinnön yhteydessä edullisia reseptoreja ovat vasta-aineet. Vasta-aineita voidaan käyttää kohdentamaan li-posomeja solun pinnan spesifisiin ligandeihin. Esimerkiksi tiettyjä antigeenejä, joita esiintyy spesifisesti kasvain-25 soluilla ja joita kutsutaan kasvaimeen liittyviksi antigeeneiksi (TAA; tumor-associated antigen), voidaan hyödyntää vasta-ainetta ja nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipro-teiinia sisältävien liposomien kohdentamiseksi suoraan pahanlaatuiseen kasvaimeen. Koska nukleotideihin sitoutuvaa 30 sinkkisormiproteiinia koodittavan geenin tuote voi olla toiminnaltaan umpimähkäinen solutyypin suhteen, kohdennettu soluunvientijärjestelmä tarjoaa merkittävän parannuksen epäspesifisten liposomien sattumanvaraiseen injektointiin nähden. On olemassa joukko menettelyjä, joita voidaan käyt-35 tää joko polyklonaalisten tai monoklonaalisten vasta- 51 aineiden sitomiseen kovalenttisesti liposomin kaksoisker-rokseen. Vasta-ainekohdennetut liposomit voivat sisältää monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita tai niiden fragmentteja, kuten Fab- tai F(ab' ^-fragmentteja, kun-5 hän ne sitoutuvat tehokkaasti kohdesolujen antigeeniseen epitooppiin. Liposomeja voidaan kohdentaa myös soluihin, joilla esiintyy reseptoreja hormoneille tai muille seerumi-tekijöille .
Yhdessä toisessa suoritusmuodossa keksintö tarjoaa 10 käyttöön menetelmän sellulaariseen nukleotidisekvenssiin sitoutuvan, eristetyn nukleotideihin sitoutuvan sinkkisor-mipolypeptidivariantin aikaansaamiseksi, joka käsittää ensimmäisenä vaiheena nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormi-polypeptidin niiden aminohappojen identifioinnin, jotka si-15 toutuvat sellulaariseen ensimmäiseen nukleotidisekvenssiin ja moduloivat kyseisen nukleotidisekvenssin toimintaa. Toiseksi luodaan kyseistä polypeptidivarianttia koodittava il-mentämiskirjasto, jossa ensimmäisessä vaiheessa identifioidut aminohapot on korvattu satunnaistetusti. Kolmanneksi 20 kirjasto saatetaan ilmentymään sopivassa isäntäsolussa, mikä lienee ilmeistä ammattimiehille, ja lopuksi eristetään klooni, joka tuottaa polypeptidivarianttia, joka sitoutuu sellulaariseen toiseen nukleotidisekvenssiin ja moduloi tämän toisen nukleotidisekvenssin toimintaa. Myös edellä ku-25 vatulla menetelmällä tuotettu nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidivariantti kuuluu keksinnön piiriin.
Kirjastona käytetään edullisesti tämän selityksen esimerkissä kuvatun kaltaista faagipintailmentymisjärjes-telmää. Faagikirjasto käsitellään pelkistävällä reagenssil-30 la, kuten ditiotreitolilla, mikä mahdollistaa ilmentymis-tuotteen asianmukaisen laskostumisen faagin pinnalle. Kirjasto muodostetaan polypeptidisekvensseistä, jotka koodit-tavat nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiva-rianttia ja jotka on' satunnaistettu, edullisesti PCRrllä 35 käyttämällä alukkeita, jotka sisältävät degeneroituja trip- 52 lettikodoneja sekvenssin niissä asemissa, jotka vastaavat menetelmän ensimmäisessä vaiheessa määritettyjä aminohappoja. Degeneroiduilla triplettikodoneilla on kaava NWS tai NNK, jossa S on G tai C, K on G tai T ja N on riippumatto-5 masti A, C, G tai T.
Sellulaarisen nukleotidisekvenssin toiminnan modulaatio sisältää sellulaariseen nukleotidisekvenssiin toiminnallisesti kytketyn geenin transkription tehostamisen tai heikentämisen, erityisesti nukleotidisekvenssin ollessa 10 promoottori. Modulaation piiriin kuuluu myös rakennegeenis-sä tai viruksen DNA- tai KNA-sekvenssissä olevan nukleotidisekvenssin transkription heikentäminen. Myös lähetti-RNA:n translaation esto kuuluu modulaation piiriin.
Keksintö liittyy lisäksi menetelmään solujen proli-15 feraatiohäiriön hoitamiseksi viemällä ex vivo soluun yhdistelmä! Imen tyrni svektori, joka käsittää nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormipolypeptidiä koodittavan polynukleotidin, sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheen käsittävän nukleotidisekvenssin toiminnan moduloimiseksi solussa. Solujen pro-20 liferaatiohäiriöiden piiriin kuuluvat edellä kuvatun kaltaiset häiriöt, jotka liittyvät tyypillisesti geenin vähentyneeseen tai lisääntyneeseen transkriptioon. Keksintöön liittyvä menetelmä tarjoaa käyttöön tekniikan mainitunlaisen geeni-ilmentymisen moduloimiseksi, tapahtuipa se sitten 25 promoottori-, rakennegeeni- tai RNA-tasolla. Menetelmä sisältää kudosnäytteen ottamisen häiriöstä kärsivästä kohteesta, hematopoieettisten tai muiden solujen eristämisen kudosnäytteestä ja eristettyjen solujen saattamisen kosketukseen yhdistelmäilmentymisvektorin kanssa, joka sisältää 30 nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia koodittavaa DNA:ta ja mahdollisesti kohdespesifisen geenin. Solut voidaan mahdollisesti käsitellä kasvutekijällä, kuten esimerkiksi interleukiini-2:11a, solujen kasvun stimuloimiseksi ennen solujen viemistä- takaisin kohteeseen. Vietyinä takai-35 sin kohteeseen solut kohdentuvat spesifisesti siihen solu- 53 populaatioon, josta ne on alunperin eristetty. Tällä tavalla voidaan käyttää nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormipo-lypeptidin transrepressioaktiivisuutta solujen epätoivottavan proliferaation inhibointiin tai heikentämiseen kohtees-5 sa. Sellulaarisen nukleotidisekvenssin modulaatio tarkoittaa tietyissä tapauksissa sellulaariseen nukleotidisekvenssiin toiminnallisesti kytketyn geenin transkription heikentämistä tai tehostamista. Kohde on edullisesti ihminen.
Yhdistelmäretrovirusvektoreiden yksi vaihtoehtoinen 10 käyttötapa käsittää polypeptidisekvenssien viemisen isäntään virusta sisältäviä soluja sisältävien ihosiirteiden avulla. Vieraiden geenien pitkäaikainen ilmentyminen istutteissa, joissa käytetään fibroblastiperäisiä soluja, voidaan saavuttaa, jos transkription ohjaamiseen käytetään 15 vahvaa "kotitalousgeenipromoottoria". Esimerkiksi dihydro-folaattireduktaasi (DHFR) -geenin promoottoria voidaan käyttää. Solut, kuten fibroblastit, voidaan infektoida vi-rioneilla, jotka sisältävät retriviruskonstruktion, joka sisältää kiinnostuksen kohteen olevan geenin, esimerkiksi 20 typistettyä ja/tai mutagenisoitua nukleotideihin sitoutuvaa sinkkisormiproteiinia koodittavan geenin, yhdessä spesifisen kohdentumisen mahdollistavan geenin, kuten kasvaimeen liittyvää antigeeniä (TAA) vastaavan geenin, ja vahvan promoottorin kanssa. Infektoidut solut voidaan upottaa kolla-25 geenimatriksiin, joka voidaan siirtää vastaanottajan ihon sidekudokseen. Kun retrovirus proliferoituu ja karkaa mat-riksista, se infektoi kohdesolupopulaation spesifisesti. Tällä tavalla siirto johtaa siihen, että soluissa, joissa esiintyy solujen proliferaatiohäiriö, syntyy lisääntyneitä 30 määriä nukleotideihin sitoutuvaa transrepressirvistä sink-kisormipolypeptidiä.
Tämän keksinnön mukaisia uudenlaisia nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormiproteiineja, jotka moduloivat transkription aktivaatiota-tai translaatiota joko promoottori-, 35 rakennegeeni- tai RNA-tasolla, voitaisiin käyttää myös kas- 54 vilajeissa. Voitaisiin esimerkiksi tuottaa siirtogeenisiä kasveja sillä tavalla, että kasvi on resistentti määrätyille bakteeri- tai viruspatogeeneille. Menetelmät nukleiinihappojen siirtämiseksi kasveihin ja ilmentämiseksi niissä 5 ovat alalla hyvin tunnettuja. (Katso esimerkiksi Hiatt et ai., US-patenttijulkaisu 5 202 422, joka mainitaan tässä viitteenä.)
Yhdessä lisäsuoritusmuodossa keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän sellaisen nukleotideihin sitoutuvasta sink-10 kisormipolypept idistä johdetun moduloivan polypeptidin identifioimiseksi, joka sitoutuu kiinnostuksen kohteena olevaan sinkkisormi-nukleotidisitoutumisaiheeseen, joka menetelmä käsittää sellaisten komponenttien inkuboinnin, jotka käsittävät otaksuttua moduloivaa proteiinia koodittavan 15 nukleotidisekvenssin, joka on kytketty toiminnallisesti ensimmäiseen indusoitavissa olevaan promoottoriin, ja rapor-tointigeenin, joka on kytketty toiminnallisesti toiseen indusoitavissa olevaan promoottoriin ja sinkkisormi-nukleo-tidisitoutumisaiheeseen, joka inkubointi tehdään olosuh-20 teissä, jotka mahdollistavat komponenttien vuorovaikutuksen, ja otaksutun moduloivan proteiinin raportointigeenin ilmentymiseen kohdistuvan vaikutuksen mittaamisen.
55
Termillä "modulointi" tarkoitetaan sinkkisormi-nuk-leotidisitoutumisaiheen sisältävästä promoottorista käsin tapahtuvan ilmentymisen estoa tai heikentämistä promoottorin ollessa yliaktivoitunut tai mainitunlaisesta promoot-5 torista käsin tapahtuvan ilmentymisen auttamista tai tehostamista tämän ollessa aliaktivoitunut. Ensimmäinen indusoitavissa oleva proteiini, kuten arabinoosipromoottori, kytketään toiminnallisesti otaksuttua moduloivaa polypep-tidiä koodittavaan nukleotidisekvenssiin. Toinen indusoi-10 tavissa oleva promoottori, kuten laktoosipromoottori, kytketään toiminnallisesti sinkkisormijohdannais-DNA-sitoutu-misaiheeseen, jota seuraa raportointigeeni, kuten B-galak-tosidaasigeeni. Komponenttien inkubointi voi tapahtua in vitro tai in vivo. In vivo -inkuboinnissa voidaan käyttää 15 prokaryoottisia tai eukaryoottisia järjestelmiä, kuten E. coli tai vastaavasti COS-soluja. Olosuhteisiin, jotka mahdollistavat määrityksen etenemisen, kuuluu inkubointi ensimmäistä ja toista promoottoria aktivoivien aineiden, kuten arabinoosin ja vastaavasti laktoosin, läsnä ollessa, 20 jolloin mahdollistetaan otaksuttua trans-moduloivaa proteiinia koodattavan nukleotidisekvenssin ilmentyminen. Se sitoutuuko otaksuttu moduloiva proteiini sinkkisormi-nuk-leotidisitoutumisaiheeseen, joka on kytketty toiminnallisesti toiseen indusoitavissa olevaan promoottoriin ja vai-25 kuttaa sen aktiivisuuteen, mitataan raportointigeenin ilmentymisen kautta. Jos raportointigeeni olisi esimerkiksi β-galaktosidaasigeeni, sinisten tai valkoisten pesäkkeiden esiintyminen osoittaisi, tehostaako vai vastaavasti inhiboiko otaksuttu moduloiva proteiini geenin ilmentymistä 30 promoottorista käsin. Muut promoottorin toiminnan määrittämiseen yleisesti käytetyt määritykset, mukaan luettuna kloramfenikoliasetyylitransferääsi (CAT) -määritys, lienevät ammattimiehille tuttuja. Sekä prokaryootti- että euka-ryoottijärjestelmiä voidaan käyttää.
56
Keksintö on käyttökelpoinen uudenlaisen nukleoti-deihin sitoutuvan sinkkisormipolypeptidijohdannaisen tai -variantin ja kyseistä polypeptidiä koodittavan nukleoti-disekvenssin tunnistamisessa. Menetelmään liittyy villin 5 tyypin sinkkisormiproteiinin sormien muuntaminen, niin että ne tunnistavat nukleotidisekvenssin, joko DNA- tai RNA- sekvenssin, joka on muu kuin kyseisen proteiinin alunperin tunnistama sekvenssi. Voi esimerkiksi olla toivottavaa muuntaa tunnettua sinkkisormiproteiinia, niin että 10 syntyy uusi nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidi, joka tunnistaa ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) promoottorialueen (LTR), sitoutuu siihen ja inaktivoi sen. Kun proteiini on identifioitu, tuotetaan proteiini typistetty muoto, joka heikentää kyseisen kohdan normaalisti 15 aktivoimaa transkriptiota. HIV:ssa kohteena oleva kohta promoottorissa olevan sinkkisormi-nukleotidisitoutumisai-heen ollessa kyseessä on CTG-TTG-TGT. Mutagenisoidaan esimerkiksi zif268:n kolme sormea esimerkeissä kuvattavalla tavalla. Nämä sormet mutagenisoidaan itsenäisesti (yksi-20 telien) samassa proteiinissa tai itsenäisesti eli "paloittain) kolmessa eri zif268-molekyylissä ja ligatoidaan uudelleen mutagenisoinnin jälkeen. Vaikka toinen näistä kahdesta menetelmästä on edullinen, vaihtoehtoinen menetelmä mahdollistaisi kolmen sormen samanaikaisen mutagenisoin-25 nin. Mutageneesin jälkeen konstruoidaan faagiesiintymis-kirjasto ja selulotaan se sopivilla oligonukleotideilla, jotka sisältävät kiinnostuksen kohteena olevan sitoutumiskohdan. Jos sormet on mutagenisoitu itsenäisesti samassa proteiinissa, konstruoidaan peräkkäisiä kirjastoja ja teh-30 dään seulonta kunkin kirjaston konstruoinnin jälkeen. Esimerkiksi ZIF268:n ollessa kyseessä konstruoidaan sormi 3 -kirjasto ja seulotaan se sormi 3:lie spesifisellä oligo-nukleotidilla; tästä seulonnastaa saadut positiiviset kloonit otetaan talteen ja niitä hyödynnetään sormi 2 57 -kirjaston tekemisessä (käyttämällä sormi 3 -kirjasto-DNA:ta templaattina); tehdään seulonta sormi 32 -spesifisellä oligonukleotidilla; otetaan talteen DNA positiivisista klooneista ja käytetään sitä templaattina sormi 1 5 -kirjaston konstruoinnissa; lopuksi tehdään 3 uutta sormea sisältävän proteiinin valikointi sormi 321 -spesifisellä oligonukleotidilla. Tämä menetelmä johtaa uuden DNA:hän sitoutuvan sinkkisormijohdannaisproteiinin identifiointiin, joka tunnistaa HIV-promoottorin, sitoutuu siihen ja 10 vähentää siitä käsin tapahtuvaa transkriptiota. Uuden proteiinin eri sormien typistäminen, mutatointi tai laajentaminen tämän jälkeen antaisi tulokseksi proteiinin, joka heikentää HIV-promoottorista lähtevää transkriptiota.
Tämä keksintö valaisee esimerkeissä 7-13 edellä 15 kuvattua Zif268:n muuntamista. Niinpä keksintö tarjoaa yhtenä suoritusmuotonaan käyttöön uudenlaisen nukleotidei-hin sitoutuvan sinkkisormipolypeptidivariantin, joka käsittää vähintään kaksi sinkkisormimoduulia, jotka sitoutuvat HIV-sekvenssiin, ja moduloi kyseisen HIV-sekvenssin, 20 esimerkiksi HIV-promoottorisekvenssin, toimintaa.
Uudenlaisten nukleotideihin sitoutuvien sinkkisor-miproteiinien identifiointi antaa mahdollisuuden moduloida geenin ilmentymistä, joka lähtee promoottoreista, joihin nämä proteiinit sitoutuvat. Kun solujen proliferaatiohäi-25 riö liittyy esimerkiksi sinkkisormi-nukleotidisitoutumis- aiheen sisältävän promoottorin yliaktivaatioon, voidaan mainitunlaisia suppressiivisia reagensseja viedä soluun antisense-polynukleotidisekvenssinä tai sitoutuvana vasta-aineena vaihtoehtona nukleotideihin sitoutuvan sinkkisor-30 miproteiinijohdannaisen lisäämiselle. Vaitoehtoisesti, kun solujen proliferaatiohäiriö liittyy kyseisen promoottorin aliaktivaatioon, voidaan soluun viedä sense-polynukleoti-disekvenssi (koodittava DNA-säie) tai nukleotideihin sitoutuva sinkkisormipolypeptidi.
58
Primaarisen aminohapposekvenssin vähäiset muutokset voivat johtaa proteiineihin, joilla on olennaisesti vastaava aktiivisuus kuin tässä kuvatulla sitoutuvalla sink-kisormijohdannaisproteiinilla. Mainitunlaiset muutokset 5 voivat olla tahallisia, kuten suunnattu mutageneesi, tai spontaaneja. Kaikki näiden muutosten seurauksena syntyvät proteiinit sisällytetään keksinnön piiriin, kunhan on olemassa nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormiproteiinin aktiivisuus .
10 Yhdessä toisessa suoritusmuodossa keksinnön mukai sia sinkkisormiproteiineja voidaan käsitellä tunnistamaan laajennettuja kohdesekvenssejä ja sitoutumaan niihin. Voidaan esimerkiksi fuusioida sinkkisormiproteiineja, jotka sisältävät noin 2-20 sinkkisormea alueelta Zif(2) -15 Zif(20), edullisesti noin 2-12 sinkkisormea, Jun/Fos- proteiinien, bZIP-proteiiniperheen prototyyppijäsenten [O'Shea et ai., Science 254 (1991) 539], leusiinivetoket-jualueisiin. Sinkkisormiproteiineja voidaan fuusioida vaihtoehtoisesti muihin proteiineihin, joilla on kyky muo-20 dostaa heterodimeerejä ja jotka sisältävät dimeraatio- alueita. Mainitunlaiset proteiinit lienevät ammattimiesten tuntemia.
Jun/Fos-leusiinivetoketjuja kuvataan asian valaisemiseksi, ja ne suosivat heterodimeerien muodostumista ja 25 mahdollistavat 12 - 72 emäsparin tunnistamisen. Jun/Fos tarkoittaa tästedes näiden proteiinien leusiinivetoketju-alueita. Sinkkisormiproteiineja fuusioidaan alueeseen Jun ja riippumattomasti alueeseen Fos menetelmillä, joita käytetään alalla yleisesti proteiinien kytkemiseen. Kun Zif-30 Jun- ja Zif-Fos-konstruktiot (SEQ ID N0:t 33, 34 ja vastaavasti 35, 36) on puhdistettu, proteiinit sekoitetaan, ja ne muodostavat spontaanisti Zif-Jun/Zif-Fos-heterodi-meerin. Vaihtoehtoisesti näitä proteiineja koodittavien geenien rinnakkaisilmentäminen johtaa Zif-Jun/Zif-Fos-he-35 terodimeerien muodostumiseen in vivo. Heterodimeerin fuu- 59 siointi N-terminaalisen tumasijoittumissignaalin kanssa mahdollistaa ilmentymisen kohdentamisen tumaan [Calderon et ai., Cell 41 (1982) 499]. Myös aktivaatioalueita voidaan sisällyttää toiseen tai kumpaankin leusiinivetoketju-5 fuusiokonstruktioon transkriptioaktivaattorien tuottamiseksi [Sadowski et ai., Gene 118 (1992) 137]. Nämä dimee-riset konstruktiot mahdollistavat sitten transkription spesifisen aktivaation tai repression. Nämä heterodimeeri-set Zif-konstruktiot ovat edullisia, sillä ne mahdollista-10 vat palindromisekvessien (jos sekä alueella Jun että alueella Fos olevat sormet tunnistavat saman DNA- tai RNA-sekvenssin) tai laajennettujen asymmetristen sekvenssien (jos alueilla Jun ja Fos olevat sormet tunnistavat eri DNA-tai RNA-sekvenssit) tunnistamisen. Esimerkiksi palindro-15 misekvenssin 5' - GGC CCA CGC ( N 1 GCG TGG GCG - 3' 3' - GCG GGT GCG IN JxCGC ACC CGC - 5' (SEQ ID NO:37) 20 tunnistaa Jun-dimeeri Zif268-Fos/Zif268 (x on mikä tahansa luku). Alakohtien välisen etäisyyden määräävät kohta, jossa Zif fuusioituu Jun- tai Fos-vetoketjualueiden kanssa, ja Zif:n ja vetoketjualueiden välisen kytkijän pituus.
Alakohtien välinen etäisyys määritetään sitoutumiskohtava-25 likointimenetelmällä, kuten on ammattimiehille tuttua [Thiesen et ai., Nucleic Acids Research 18 (1990) 3203]. Esimerkkinä laajennetun asymmetrisen sekvenssin tunnistamisesta on Zif (C7)6-Jun/Zif-268-Fos-dimeeri. Tämä proteiini koostuu 6 C7-tyypin sormesta (esimerkki 11), jotka on kyt-30 ketty Jun-alueeseen, ja kolmesta Zif268:sta, jotka on kytketty Fos-alueeseen, ja se tunnistaa seuraavan laajennetun sekvenssin: ! 5' - CGC CGC CGC CGC CGC CGC N 1 GCG TGG GCG - 3? 1 35 3' - GCG GCG GCG GCG GCG GCG N I xCGC ACC CGC - 5’ (SEQ ID NO: 38).
60 DNA:n tai RNA:n hapettava tai hydrolyyttinen pilkkominen metallikelaattikomplekseilla voidaan tehdä ammattimiesten tuntemin menetelmin. Yhdessä toisessa suoritusmuodossa kelatoivien ryhmien liittämistä Zif-proteiineihin 5 helpotetaan edullisesti sisällyttämällä kysteiini (Cys) -ryhmä proteiinin alussa olevan metioniinin (Met) ja ensimmäisen tyrosiinin (Tyr) väliin. Cys alkyloidaan sitten ammattimiesten tuntemilla kelaationmuodostajilla, esimerkiksi EDTA-johdannaisilla, Sigmanin kuvaamalla tavalla 10 [Biochemistry 29 (1990) 9097]. Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä sekvenssistä Gly-Gly-His viimeiset aminoterminaali-set ryhmät, sillä kyseisistä ryhmistä koostuvan aminopään on kuvattu kelatoivan Cu2+:a [Mack et ai., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 7572]. Edullisiin metalli-ioneihin kuulu-15 vat Cu2+, Ce3+ [Takasaki ja Chin, J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 1121], Zn2+, Cd2+, Pb2+, Fe2+, [Schnaith et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994) 569], Fe3+, Niz+, Ni3+, La3+, Eu3+ [Hall et ai., Chemitry and Biology 1 (1994) 185], Gd3+, Tb3+, Lu3+, Mnz+ ja Mg2+. Kelatoitujen metallien avulla teh-20 tävä pilkkominen toteutetaan yleensä hapetteiden, kuten 02:n tai vetyperoksidin (H202), ja pelkisteiden, kuten tio-lien ja askorbaatin, läsnä ollessa. Pilkkoutumiskohta ja -säie (+- tai --kohta) määritetään empiirisesti [Mack et ai., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 7572], ja se riippuu 25 Cys:n sijainnista Met:n ja ensimmäistä sormea edeltävän Tyr:n välissä. Proteiinissa Met(AA)Tyr- (Zif )1-12 kelaatista tulee Met-iAAj^Cys-kelaatti-iAAj^-Tyr-iZiF)!.^, jossa AA = mikä tahansa aminohappo ja x on aminohappojen lukumäärä. Dimeeriset zif-konstruktiot, jotka ovat tyyppiä Zif-30 Jun/Zif-Fos, ovat edullisia pilkkomisen tekemiseksi kahdessa kohdassa kohdeoligonukleotidissa tai yhdessä pitkän kohteen kohdassa. Kun halutaan pilkkoa kaksisäikeinen ketju, sekä Jun- että Fos-pitoiset proteiinit leimataan ke-laatinmuodostajilla ja pilkkominen tehdään ammattimiesten 35 tuntemin menetelmin. Tässä tapauksessa syntyy portaittai- 61 nen kaksisäikeinen leikkauskohta, joka vastaa restriktio-entsyymeillä aikaansaatavaa.
Kun on tehty mutageneesi ja valikoitu Fis268-prote-iinivariantit, joissa sormen 1 spesifisyyttä tai affini-5 teettia on muunnettu, voidaan konstruoida useita sormiko-pioita sisältäviä proteiineja käyttämällä TGEKP-kytkijä-sekvenssiä alalla tunnetuin menetelmin. Esimerkiksi C7-sormi voidaan konstruoida seuraavan kaavan mukaisesti: 10 MKLLEPYACPVESCDRRFSKSADLKRHIRHTGEKP- (YACPVESCDRRFSKSADLKHIRIHTGEKP x X1 (SEQ ID NO: 39), jossa viimeisen kytkijän sekvenssi on muutoskohteena, sillä se on päässä eikä osallistu kahden sormen kytkemiseen 15 toisiinsa. Tämä proteiini sitoutuu suunniteltuun kohdesek-venssiin GCG-GCG-GCG (SEQ ID NO: 32) oligonukleotidihius-neulassa CCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-GCC-CCC GAG G (SEQ ID NO: 40) affiniteetilla 9 nM, jota voidaan verrata affiniteettiin 300 nM, joka saadaan oligonukleotidille, 20 jossa on kooditettuna sekvenssi GCG-TGG-GCG (määritettynä pintaplasmoniresonanssitutkimuksin). Käytettävien sormien ei tarvitse olla identtisiä, ja niitä voidaan sekoittaa ja sovittaa yhteen, niin että saadaan proteiineja, jotka tunnistavat toivotun kohdesekvenssin. Niitä voidaan hyödyntää 25 myös leusiinivetoketjujen (esimerkiksi Fos/Jun) tai muiden heterodimeerien yhteydessä laajennetun sekvenssin tunnistavien proteiinien tuottamiseksi.
Sormen 1 polymeerien tuottamisen lisäksi voidaan fuusioida koko kolmisorminen Zif268 ja sen muunnettuja 30 versioita käyttämällä konsensus-kytkijää TGEKP laajennettuja tunnistuskohtia sisältävien proteiinien tuottamiseksi. Voidaan tuottaa esimerkiksi proteiini Zif268-Zif268, jossa luonnossa esiintyvä proteiini on fuusioitu itsensä kanssa käyttämällä TGEKP-kytkijää. Tämä proteiini sitoutuu 35 sekvenssiin GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCG. Niinpä sekvenssejä, 62 joissa on tehty muuntamisia Zif268:n tai muiden alalla tunnettujen sinkkisormiproteiinien kolmessa sormessa, voidaan fuusioida yhteen laajennettuja sekvenssejä tunnistavan proteiinin muodostamiseksi. Näitä uusia sinkkiproteii-5 neja voidaan käyttää haluttaessa myös yhdessä leusiinivetoketjujen kanssa.
Kun keksintö on nyt kuvattu kokonaisuudessaan, ammattimiehelle lienee ilmeistä, että voidaan tehdä erilaisia muutoksia ja muunnoksia poikkeamatta keksinnön henges-10 tä tai suoja-alasta.
Esimerkkejä
Yhdistelmäpolypeptidi, joka sisältää kolme yhdeksästä TFIIIA-sinkkisormesta [Clemens et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 10822], on muodostettu tekemällä 15 polymeraasiketjureaktio (PCR) -monistus TFIIIA-cDNA:sta ja ilmennys E. collssa. Yhdistelmäproteiini, josta käytetään merkintää zfl-3, puhdistettiin ioninvaihtokromatografiällä ja sen sitoutumiskohta 5S-geenin kanssa määritettiin yhdistämällä DNaasi I -jäljitys ja sitominen synteettisiin 20 oligonukleotideihin [Liao et ai., J. Mol. Biol. 223 (1992) 857] . Esimerkeissä esitetään kokeita, jotka osoittavat, että tämän polypeptidin sitoutuminen tunnistussekvenssiin-sä, joka on sijoitettu lähelle aktiivista RNA-polymeraasi-promoottoria, pystyy inhiboimaan kyseisen promoottorin 25 aktiivisuuden in vitro. Mainitunlaisen testausjärjestelmän aikaansaamiseksi kloonattiin 26 ep:n oligonukleotidi, joka sisälsi 13 ep:n pituisen zfl-3-tunnistussekvenssin, plas-midin pUC19 polykytkijäalueelle lähelle T7-RNA-polymeraa-sin promoottorisekvenssiä. Yhdistelmä-zfl-3-valmisteemme 30 DNA-sitoutumisaktiivisuus määritettiin geeliliikkuvuus- siirtymäanalyysillä käyttämällä kyseisen sitoutumiskohdan sisältävää oligonukleotidia. Lisäksi tehtiin in vitro -transkriptio T7-RNA-polymeraasilla siten, että zf1-3-po-lypeptidiä oli läsnä samat määrät kuin DNA-sitoutumistit-35 rauksessa tai sen poissa ollessa. Kukin DNA-molekyyli, 63 johon zfl-3 sitoutuu, muuttuu inaktiiviseksi transkriptiossa. Näissä esimerkeissä on siten tuotettu sinkkisormi-polypeptidi, joka estää täysin promoottorin aktiivisuuden sitoutumalla lähellä olevaan kohdesekvenssiin.
5 Esimerkki 1
Sinkkisormiproteiinien sekvenssispesifinen geeni-kohdennus A. zi£268:n kiderakenteen perusteella on selvää, että spesifiset histidiiniryhmät (sinkkiä koordinoimatto-10 mat His-ryhmät) ja arginiiniryhmät, jotka sijaitsevat α-kierteen pinnalla, sormen päässä, ja kierteen asemissa 2, 3 ja 6 (välittömästi ennen konservatiivista histidii-niä), osallistuvat vetysidosten muodostamiseen DNA-guanii-niryhmien kanssa. Kun sinkkisormikompleksien rakenteiden 15 lukumäärä jatkaa kasvuaan, on todennäköistä, että eri aminohapot ja asemat saattavat osallistua emässpesifiseen tunnistukseen. Kuvio 2 (kuva A) esittää TFIIIArn kolmen aminoterminaalisen sormen sekvenssiä; näissä asemissa olevat emäksiset aminohapot on alleviivattu. Samoin kuin sää-20 telyproteiinin zif268 (Krox-20) sormi 2 ja Spl:n sormet 1 ja 3, TFIIIArn sormi 2 sisältää histidiini- ja arginiini-ryhmiä näissä DNA-kontaktiasemissa; lisäksi kukin näistä sinkkisormista tunnistaa minimaalisesti 5S-geenipromootto-rissa olevan sekvenssin GGG (kuvio 2, kuva B).
25 Yhdistelmäpolypeptidi, joka sisältää nämä kolme TFIIIA-sinkkisormea, on muodostettu tekemällä polymeraasiketjureaktio (PCR) -monistus TFIIIA-cDNA:sta ja ilmennys E. colissa (Clemens et ai., supra). Suunniteltin koe sen määrittämiseksi, estääkö tämän polypeptidin sitoutuminen 30 tunnistussekvenssiinsä, joka on sijoitettu lähelle aktiivista RNA-polymeraasipromoottoria, kyseisen promoottorin aktiivisuuden In vitro. Seuraavat kokeet tehtiin mainitunlaisen testausjärjestelmän aikaansaamiseksi. Kloonattiin 23 ep:n oligonukleotidi (Liao et ai., 1992, supra), joka 35 sisäksi 13 eprn zf1-3-tunnistussekvenssin, plasmidin ; 64 pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) polykytkijä-alueelle, lähelle T7-RNA-polymeraasipromoottorisekvenss±ä. Kantaplasmidi pilkottiin restriktioentsyymillä EcoRV ja vasikan suoliston alkalisella fosfataasilla tehdyn defos-5 forylaation jälkeen insertoitiin fosforyloity 23 ep:n oli-gonukleotidi ligatoimalla T4-DNA-ligaasin avulla. Ligaa-tiotuotetta käytettiin DH5a E. coll -solujen transformoin-tiin. Kloonit, joissa oli 23 ep:n inserttejä, identifioitiin miniprep-DNA:n restriktiopilkonnalla. Kloonauksen 10 onnistuminen varmistettiin myös DNA-sekvenssianalyysillä.
Yhdistelmä zf 1-3-valmisteen DNA-sitoutumisaktiivisuus määritettiin myös geeliliikkuvuussiirtymäanalyysillä käyttämällä radioaktiivisesti leimattua 56 ep:n EcoRI-XhoI-res-triktiofragmenttia, joka on peräisin zf1-3-sitoutumiskoh-15 dan sisältävästä kartiosta, ja radioaktiivisesti leimattua 23 ep:n oligonukleotidia. Geelisiirtymämääritykset tehtiin kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Liao et ai., supra;
Fried et ai., Nucl. Acids Res. 9 (1981) 6505]. Viimeksi mainitun analyysin tulos esitetään kuviossa 3. Sitoutumis-20 reaktioseokset (20 μΐ) sisälsivät myös 1 pg leimaamatonta plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi saman 23 ep:n sekvenssin.
Kaistoilla 2-12 näkyviin reaktioseoksiin on sisällytetty myös merkityt määrät zfl-3:a. Kun näytteitä oli inkuboitu 30 min ympäristön lämpötilassa, niille tehtiin elektrofo-25 reesi 6-%:isella denaturoimattomalla polyakryyliamidigee- lillä Tris-boraattipuskurissa (88 mmol/1, pH 8,3). Kussakin reaktiossa käytettiin hyvin pieni määrä radioaktiivisesti leimattua oligonukleotidia ja vakiomäärä (1 pg) plasmidi-DNA:ta, joka sisältää zfl-3-sitoutumiskohdan.
30 Kaistoilla 2-12 näkyvät reaktioseokset sisälsivät kasvavia määriä zf1-3-polypeptidiä. Kuvio esittää geelin auto-radiogrammia. Tulokset osoittavat, että zfl-3:n sitoutuminen radioaktiivisesti leimattuun DNA:hän aiheutti liikkuvuuden heikkenemisen elektroforeesissa. zfl-3:n sitomien 35 radioaktiivisesti leimattujen DNA-molekyylien prosentuaa- 65 linen osuus heijastaa myös sitoutuneiden leimaamattomien plasmidi-DNA-molekyylien prosentuaalista osuutta.
Tehtiin in vitro -transkriptiokokeita T7-RNA-poly-meraasilla zf1-3-polypeptidin ollessa läsnä samoina määri-5 nä kuin DNA-sitoutumistitrauksessa tai sen poissa ollessa ja zf1-3-sitoutumiskohdan sisältävän plasmidi-DNA:n määrien ollessa samat. Kukin reaktioseos sisälsi 25 pl:n tilavuudessa 1 pg PvuII-pilkottua pBluescriptSK+-DNA:ta, joka sisälsi 23 ep:n zfl-3-sitoutumiskohdan insertoituna 10 vektorin EcoRV-kohtaan, 40 yksikköä Rnasiinia, 0,6 mmol/1 ATP+UTP+CTP-seosta, 20 pmmol/l GTPrtä ja 10 pCi a-32P-GTP:tä ja 10 yksikköä T7-RNA-polymeraasia (Stratagene). Reaktiopuskurin toimitti Stratagene. Kun oli inkuboitu 1 tunti lämpötilassa 37 °C, transkriptiotuotteet puhdistet-15 tiin fenoliuutolla, konsentroitiin etanolisaostuksella ja analysoitiin denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä. T7-transkriptiota seurattiin radioaktiivisten nukleotidien sisällytyksellä (etummaisena kulkevaan) run-off-transkrip-tiin. Kuvio 4 esittää saatujen transkriptiotuotteiden de-20 naturoivalla polyakryyliamidigeelillä tehdyn analyysin autoradiogrammia. Tässä kokeessa plasmidi-DNA pilkottiin restriktioentsyymillä PvuII, ja run-off-transkriptin odotettu pituus oli 245 emästä, zf1-3-polypeptidin lisääminen reaktioon heikensi T7-RNA-polymeraasin vaikutuksesta ta-25 pahtuvaa transkriptiota.
Kuvio 5 on käyrä, joka kuvaa zfl-3:n geeliliikku-vuussiirtymämäärityksessä sitomien DNA-molekyylien prosentuaalista osuutta (x-akseli) samojen zf1-3-määrien aikaansaaman T7-RNA-polymeraasitranskription prosentuaalisen 30 eston (y-akseli) funktiona. Huomaa, että kukin piste vastaa näissä kahdessa määrityksessä käytettyjä identtisiä zf1-3-määriä. Näiden kahden dataryhmän kääntäen yksikäsitteinen vastaavuus on kiistämätön. T7-transkriptiota seurattiin sisällyttämällä radioaktiivisia nukleotideja run-35 off-transkriptiin. Transkriptio määritettiin kvantitatii- i 66 visesti geelielektroforeesilla, autoradiografialla ja den-sitometrialla. Geeliliikkuvuussiirtymämääritykset tehtiin kvantitatiivisesti samalla tavalla. Kukin zfl-3:n sitoma DNA-molekyyli muuttuu inaktiiviseksi transkriptiossa.
5 Sinkkisormipolypeptidi on siksi tässä kokeessa estänyt täysin promoottoriaktiivisuuden sitoutumalla lähellä olevaan kohdesekvenssiin.
B. Koska edellinen koe tehtiin käyttämällä proka-ryoottista RNA-polymeraasia, seuraava koe tehtiin sen mää-10 rittämiseksi, pystyykö sinkkisormipolypeptidi zfl-3 estämään myös eukaryoottisen RNA-polymeraasin aktiivisuuden. Tämän testaamiseksi käytettiin transkriptiouutetta, joka oli valmistettu hedelmöitymättömistä Xenopus-sammakon munista [Hartl et ai., J. Cell Biol. 120 (1993) 613] ja Xe-15 nopus-sammakon 5S-RNA-geenitemplaatista. Nämä uutteet ovat hyvin aktiivisia RNA-polymeraasi III:n vaikutuksesta tapahtuvan 5S-RNA- ja tRNA-transkription suhteen. Testitemp-laattina käytettiin 5S-RNA-geeniä, joka sisältää luonnostaan TFIIIA- ja zf1-3-sitoutumiskohdat. Kukin reaktioseos 20 sisälsi 10 μΐ munahomogenaatista suurella nopeudella saatua supernatanttia, 9 ng TFIIIA:ta, nukleosoditrifosfaat-teja (ATP, UTP, CTP) pitoisuutena 0,6 mmol/1 ja 10 pCi a-32P-GTP:tä ja 20 pmol/l GTP:tä reaktiotilavuuden ollessa 25 μΐ. Kaikki reaktioseokset sisälsivät 180 ng plasmidi-25 DNA:ta, joka sisältää Xenopus-sammakon somaattisen tyypin 5S-RNA-geenin yhden kopion, ja kaistoilla 2 ja 3 näkyvät reaktioseokset sisälsivät myös 300 ng Xenopus-sammakon tRNAmet-geenin sisältävää plasmidia. Ennen Xenopus-samma-konmunauutteen ja TFIIIA:n lisäämistä kaistoilla 2 ja 3 30 näkyviin reaktioseoksiin lisättiin 0,2 ja vastaavasti 0,4 pg zfl-3:a. Kaistalla 2 näkyvässä kokeessa käytetty zfl-3-määrä riitti sitomaan kaiken 5S-geenin sisältävän DNA:n erillisessä sitomisreaktiossa. Kun oli inkuboitu 15 min, jotta mahdollistettiin zfl-3:n sitoutuminen tun-35 nistuskohtaansa, lisättiin muut reaktiokomponentit. Kun 67 oli inkuboitu 2 tuntia, transkriptiotuotteet puhdistettiin fenoliuutolla, konsentroitiin etanolisaostuksella ja analysoitiin denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä. Autora-diogrammi esitetään kuviossa 6. Kuvio 6 esittää myös tu-5 loksen, joka saatiin kontrolloidussa reaktiossa lisäämättä sinkkisormiproteiinia (kaista 1). Kaistat 2 ja 3 sisälsivät vertailua varten myös tRNA-geenitemplaattia, josta puuttuu TFIIIA- ja zf1-3-sitoutumiskohta. zfl-3 heikensi 5S-RNA-transkriptiota, kun taas tRNA-transkriptio säilyi 10 muuttumattomana. Nämä tulokset osoittavat, että zfl-3 estää eukaryoottisen RNA-polymeraasi III -transkriptiokomp-leksin muodostumisen ja että tämä ilmiö on spesifinen DNA-molekyyleille, joissa on sitoutumiskohta TFIIIA;sta johdetulle yhdistelmäsinkkisormiproteiinille.
15 Kolmiulotteisia liuosrakenteita on määritetty pro teiinille, joka sisältää TFIIIA:n kolme ensimmäistä sink-kisormea, käyttämällä 2-, 3- ja 4-ulotteisia NMR-menetel-miä. Tämän tekemiseksi proteiini tuotettiin E. colissa, eristettiin siitä puhtaana ja leimattiin yhtenäisesti 20 13C:lla ja 15N:lla. NMR-rakenne osoittaam että yksittäisen sinkkisormet laskostuvat kanoniseksi sormirakenteeksi, jossa on pieni β-levy pakkautuneena vasten a-kierrettä. Sormet eivät ole liuoksessa täysin itsenäisiä, vaan on olemassa merkkejä niiden välisistä heikoista vuorovaiku-25 tuksista. Käyttämällä samanlaisia menetelmiä määritetään kolmiulotteinen rakenne kompleksille, jonka muodostavat zfl-3 ja 13 ep:n oligonukleotidi, joka vastaa sen spesifistä sitoutumiskohtaa 5S-RNA-geenillä, ja käytetään sitä antamaan olennaista tietoa TFlllA-sinkkisormien sekvenssi-30 spesifisen nukleotiditunnistuksen molekulaarisesta pohjas ta. Tätä tietoa käytetään puolestaan suunniteltaessa uusia nukleotideihin sitoutuvia sinkkisormijohdannaisproteiineja ennalta valittujen kohdegeenien säätelemiseksi. Samanlaisia NMR-menetelmiä voidaan soveltaa suunniteltujen sinkki-35 sormiproteiinien ja niiden kohdegeenien välille muodostu- 68 vien kompleksien tarkkojen rakenteiden määrittämiseen osana rakennepohjaista lähestymistapaa kohdegeeniselektiivyy-den parantamiseksi ja sitoutumisaffiniteetin suurentamiseksi .
5 Esimerkki 2
Uudenlaisten nukleotideihin sitoutuvien sinkkisor-miproteiinien eristäminen
Suurten sinkkisormivarianttikirjastojen lajittele-miseksi nopeasti käytettiin faagipintaesiintymisjärjestel-10 mää, joka on alunprin kehitetty vasta-ainekirjastoja varten [Barbas et ai., METHODS 2 (1991) 119]. Tämän tekemiseksi on plasmidia pComb3 muunnettu sinkkisormivalikointiin sopivaksi. Vasta-aineen kevyen ketjun promoottori ja kloonaussekvenssit on poistettu, jolloin on saatu uusi 15 vektori pComb3.5. Kolmisormista zif268-proteiinia on muunnettu PCR:llä ja insertoitu se pComb3.5:een. Sinkkisormet esiintyvät toimivasti faagilla määritettynä kiinteäfaasi-määrityksillä, jotka osoittavat, että faagi sitoo DNA:ta sekvenssistä riippuvalla tavalla. On tehty suunnattu muta-20 geneesi Nsil-kohdan insertoimiseksi sormien 1 ja 2 väliin, jotta helpotetaan kirjaston konstruoimista. Lisäksi zif268 on toimiva fuusioituna dekapeptidipäätesekvenssiin, joka mahdollistaa sen sitomisen kätevää seurantaa varten. Alku-kirjasto on konstruoitu käyttämällä limittäis-PCR:ää 25 [Barbas et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4457] sellaisten sormi 3 -varianttien luomiseksi, joissa tunnistukseen osallistuvia α-kierteen aminoterminaalisella puolella olevia 6:ta ryhmää on muutettu NNK-seostusstrategiaa käyttämällä degeneraation aikaansaamiseksi. Tämä kolmas 30 sormi sitoutui alunperin 3 ep:n GCG-alakohtaan. Valikointi, joka perustui sitoutumiseen alakohtaan A AA, paljasti valituissa sekvensseissä esiintyvän konsensus-mallin.
zif268:n sisältävää plasmidia pZif89 [Pavletich et ai., Science 252 (1991) 809] käytettiin zif268-DNA:n läh-35 teenä sinkkisormien muuntamiseen. Lyhyesti esitettynä 69 pZif89 kloonattiin plasmidiin pComb3.5, kun oli tehty PCR-monistus käyttämällä seuraavia alukkeita: ZF: 5'-ATG AAA CTG CTC GAG CCC TAT GCT TGC CCT GTC GAG-3' 5 (SEQUENCE ID NO. 2) zr: 5' -GAG GAG GAG GAG ACT AGT GTC CTT CTG TCT TAA ATG GAT TTT GGT-3' (SEQUENCE ID NO. 3).
10 PCR-reaktio toteutettiin 100 pl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi 1 pg oligonukleotidialukkeita ZF ja ZR ja dNTP:itä (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) kutakin, 1,5 mmol/1 MgCla Taq-polymeraasia (5 yksikköä), 10 ng templaattia pZif89 ja 10 μΐ lOxPCR-puskuria (Perkin-Elmer Corp.). To-15 teutettiin 30 PCR-monistussykliä Perkin-Elmer Cetus 9600 Gene Amp PCR System -lämpösyklilaitteella. Monistussykli koostui denaturoinnista (94 °C, 1 min), pariuttamisesta (54 °C, 1 min) ja sen jälkeen laajennuksesta (72 “C, 2 min). Tuloksena olevat PCR-monistustuotteet puhdistet-20 tiin geelillä jäljempänä kuvattavalla tavalla, pilkottiin XhoI:llä ja Spe I:llä ja ligatoitiin pComb3.5:een. pComb3.5 on pComb3:n variantti [Barbas et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 7978], josta on poistettu kevyttä ketjua vastaava alue, sen IacZ-promoottori mukaan luettu-25 na. Lyhyesti esitettynä pComb3 pilkottiin Nhel:llä, Kle- now-käsiteltiin, pilkottiin Xbal:llä ja ligatoitiin uudelleen, jolloin muodostui pComb3.5. Ammattimiehet tuntenevat muita samankaltaisia vektoreita, joita voitaisiin käyttää pComb3.5:n tilalla, kuten SurfZap™ (Stratagene, La Jolla, 30 CA).
Fagemidiä pComb3.5, joka sisälsi zif268:n, käytettiin sitten PCR-monistuksissa tässä kuvatulla tavalla nuk-leotidisubstituutioiden aiheuttamiseen zif268:n sinkkisor-missa uudenlaisten sinkkisormien tuottamiseksi, jotka si-35 toutuvat spesifisiin tunnistussekvensseihin ja tehostavat 70 tai heikentävät transkriptiota sitouduttuaan määrättyyn promoottorisekvenssiin.
Menetelmissä sellaisten uudenlaisten sinkkisormien valmistamiseksi, joilla on määrätty sekvenssintunnistus-5 spesifisyys ja kyky säädellä geenien ilmentymistä, käytettiin seuraavia vaiheita: 1. Ensimmäinen sinkkisormi (esimerkiksi zif268:n sinkkisormi 3) satunnaistettiin ensin käyttämällä limit-täis-PCR:ää; 10 2. limittäis-PCR:llä saadut monistustuotteet, jotka sisälsivät satunnaistettuja sinkkisormia, ligatoitiin takaisin pComb3.5:een, niin että muodostui satunnaistettu kirjasto; 3. kun bakteriofagin peiteproteiini IIIreen ankku-15 roitunut sinkkisormi oli ilmennetty kirjastosta käsin, pintaproteiinia ilmentävä faagi tutkittiin käyttämällä spesifisiä sinkkisormitunnistussekvenssejä, mikä johti muutamien spesifisten satunnaistettujen sinkkisormien valikoitumiseen; 20 4. sekvenssispesifisten sinkkisormien valikoinnin jälkeen sekventoitiin vastaavat fagemidit ja johdettiin sen perusteella aminohapposekvenssi.
Esimerkki 3
Satunnaistettujen sinkkisormien valmistus 25 Edellä kuvatussa pComb3.5:ssä olevan zif268:n sink kisormien satunnaistamiseksi tehtiin kaksi erillistä PCR-monistusta kullekin sormelle tässä kuvatulla tavalla, mitä seurasi kolmas, limittäinen PCR-monistus, joka johti kahden edellisen monistustuotteen pariutumiseen, mitä seurasi 30 kolmas monistus. Templaatin pComb3.5 zif268:n sinkkisormen nukleotidisekvenssi esitetään kuviossa 7 ja sekvenssilis-tauksessa SEQUENCE ID NO. 4. Sinkkisormessa 3 satunnaistetut nukleotidiasemat alkoivat nukleotidiasemasta 217 ja päättyivät asemaan 237, seriini pois luettuna. Temp-35 laatin zif268-sekvenssi kooditti kyseisessä kohdassa kah- 71 deksaa kokonaista sormen 3 aminohapposekvenssiä. Tämä pComb3.5:ssä oleva sormen 3 aminohapposekvenssi, jota oli määrä muuntaa, oli Arg-Ser-Asp-Glu-Arg-Lys-Arg-His (SEQUENCE ID NO. 5). Alleviivatut aminohapot edustavat 5 satunnaistettuja aminohappoja.
Oligonukleotidiseosta, joka sisälsi degeneroituneita oligonukleotidialuekkeita, joista käytetään merkintöjä BZF3 ja ZF36K, ja degeneroitumattomia alukkeita R3N ja FTX3, joilla on jäljempänä kuvattavat nukleotidikaavat 10 (syntetisoija Operon Technologies, Alameda, CA), käytet tiin pComb3.5:ssä olevan zif268:n sinkkisormen 3 satunnaistamiseen. Satunnaistettujen nukleotidien tuomiseen käytetyt kuusi triplettikodonia sisälsivät toistuvan sekvenssin NNM (NNK:n komplementti), jossa M voi olla G tai C 15 ja N voi olla A, C, G tai T.
Ensimmäinen PCR-monistus johti pComb3.5-fagemidi-vektorikloonissa olevan sinkkisormi 3 -fragmentin 5'-alueen monistumiseen. Tämän alueen monistamiseksi käytettiin seuraavia alukepareja. 5'-oligonukleotidialuke, FTX3, jon-20 ka nukleotidisekvenssi on 5' -GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G-3' (SEQUENCE ID NO. 6), hybridisoitui sormen 3 kooditta-mattomaan säikeeseen, joka vastaa zif268:n 5'-aluetta (vektorisekvenssi mukaan luettuna) ja sisältää se kaksi ensimäistä nukleotidia. 3'-oligonukleotidialuke, BZF3, 25 jonka nukleotidisekvenssi on 5'-GGC AAA CTT CCT CCC ACA
AAT-3' (SEQUENCE ID NO. 7), hybridisoitui sormen 3 koodattavaan säikeeseen alkaen nukleotidista 216 ja päättyen nukleotidiin 196.
PCR-reaktio toteutettiin 100 pl:ssa reaktioseosta, 30 joka sisälsi 1 pg kumpaakin oligonukleotidialuketta FTX3 ja BZF3, 200 mmol/1 dNTP:itä (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) kutakin, 1,5 mmol/1 MgCl2 Taq-polymeraasia (5 yksikköä; Per-kin-Elmer Corp., Norwalk, CT), 10 ng templaattia pComb3,5 zif268 ja 10 μΐ kaupallista lOxPCR-puskuria (Perkin-Elmer 35 Corp.). Toteutettiin 30 PCR-monistussykliä Perkin-Elmer 72
Cetus 9600 Gene Amp PCR System -lämpösyklilaitteella. Mo-nistussykli koostui denaturoinnista (94 °C, 30 s), pariut-tamisesta (50 °C, 30 s) ja sen jälkeen laajennuksesta (72 °C, 1 min). Riittävien moni s tus tuo temäär ien saamiseksi 5 toteutettiin 30 identtistä PCR-reaktiota.
Tuloksena olevat PCR-monistustuotteet puhdistettiin sitten l,5-%:isella agaroosigeelillä käyttämällä tavanomaisia elektroeluutiomenetelmiä, joita kuvataan teoksessa Molecular Cloning; A Laboratory Manual, toim. Sambrook et 10 al., Cold Spring Harbor, NY 1989. Lyhyesti esitettynä pilkotun PCR-monistetun sinkkisormialueen geelielektroforee-sin jälkeen leikattiin irti geelialue, joka sisälsi ennalta määrättyä kokoa olevat DNA-fragmentit, ja tehtiin elek-troeluutio dialyysikalvoon, etanolisaostus ja suspendointi 15 uudelleen puskuriin, joka sisälsi 10 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5, ja 1 mmol/1 EDTAa, loppupitoisuudeksi 50 ng/ml.
Ensimmäisen reaktion tuloksena olevia puhdistettuja PCR-monistustuotteita käytettiin sitten limittäislaajen-nus-PCR-reaktiossa yhdessä toisen PCR^reaktion tuotteiden 20 kanssa, joita molemia kuvataan jäljempänä, näiden kahden tuotteen yhdistämiseksi rekonstruoiduksi zif268:ksi, joka sisältää satunnaistettuja sinkkisormia.
Toinen PCR-reaktio johti edellä mainittujen tuotteiden kanssa limittyvän ja sormen 3 3'-päätä pidentävän 25 zif268:n sormen 3 3'-pään monistumiseen. Tämä alueen monistamiseen sormen 3 koodittaman 8 aminohapporyhmän sekvenssin satunnaistamiseksi käytettiin seuraavia alukepare-ja. 5'-pään koodittavien oligonukleotidialukkeiden seoksesta käytettiin merkintää ZF36K, ja sillä oli seuraavan 30 kaavan mukainen nukleotidisekvenssi: 5'-ATT TGT GGG AGG
AAG TTT GCC NNK AGT NNK NNK NNK NNK NNK CAT ACC AAA ATC CAT TTA-3' (SEQUENCE ID NO. 8) (nukleotidit 196 - 255). 3'-pään koodittamaton aluke, R3B, hybridisoitui koodattavaan säikeeseen geenin III (gill) 3'-päässä, jonka sek-35 venssi oli 5'-TTG ATA TTC ACA AAC GAA TGG-3' (SEQUENCE ID
73 NO. 9). Näiden alukeseoksen kahden pään välistä aluetta edustaa degeneroitunut NNK-15-meeri. Toinen PCR-reaktio tehtiin toiselle annokselle pComb3.5-templaattia 100 pl:ssa edellä kuvattua reaktioseosta, joka sisälsi 5 1 pg kutakin kuvatun kaltaista oligonukleotidialuketta.
Tuloksena olevat PCR--tuotteet koodittivat sekalaista populaatiota satunnaistettuja zif268-sormen 3 alueita, joiden pituus oli 8 aminohapporyhmää. Tuotteet puhdistettiin sitten geelillä edellä kuvatulla tavalla.
10 Näiden kahden PCR-monitustuotteen pariutusreaktion tekemiseksi sekoitettiin ensimmäisestä ja toisesta PCR-reaktiosta saatuja geelillä puhdistettuja tuotteita (1 pg kumpaakin) ja fuusioitiin ne alukkeiden poissa ollessa 35 PCR-syklillä edellä kuvatulla tavalla. Tuloksena olevaa 15 fuusiotuotetta monistettiin sitten käyttämällä ZTX3- ja R3B-oligonukleotidialukkeita (1 pg kumpaakin) alukeparina viimeisessä PCR-reaktiossa täydellisen zif268-fragmentin muodostamiseksi limittäislaajennuksella. Limittäis-PCR-monistus toteutettiin edellä muiden PdR-monistusten yhtey-20 dessä kuvatulla tavalla.
Riittävien monistustuotemäärien saamiseksi toteutettiin 30 identtistä limittäis-PCR-reaktiota. Tuloksena olevien fragmenttien suunta oli 5':stä 3':een ja niissä oli satunnaistettu 6:ta aminohapporyhmää koodittava sormi 25 3. Kussakin 30 reaktiotuotteesta olevat satunnaistetut zof268-monistustuotteet, joiden pituus oli noin 450 emäs-paria (ep), yhdistettiin ensin, puhdistettiin sitten geelillä edellä kuvatulla tavalla ja pilkottiin XhoI:llä ja Spel:llä ennen ligatointia uudelleen pintaesiintymisfage-30 midi-ilmentymisvektoriin pComb3.5 kirjaston muodostamiseksi seulottavaksi sitten sinkkisormitunnistussekvenssioli-gomeereillä spesifisen sinkkisormen valikoimiseksi. Ilmen-tymisvektorikirjastojen luomisessa käytetty ligaatiomenet-tely ja sen jälkeen tehty zif268-satunnaistettujen 74 pComb3.5-kloonien ilmentäminen toteutettiin jäljempänä esimerkissä 4 kuvattavalla tavalla.
Nukleotidisubstituutioita voidaan tehdä myös muille sinkkisormille. zif268:ssa voidaan esimerkiksi sormia 1 ja 5 2 myös muuntaa, niin että voidaan identifioida muita si toutumiskohtia. Sinkkisormen 2 muuntamiseksi käytetään alukkeita FTX3 (edellä kuvatun kaltainen) ja ZFnsi-B, 5’CAT GCA TAT TCG ACA CTG GAA-3' (SEQUENCE ID NO. 10) (nukleotidit 100 - 120) ensimmäisessä PCR-reaktiossa ja 10 R3B (edellä kuvatun kaltainen) ja ZF2r6F (5'-CAG TGT CGA ATA TGC ATG CGT AAC TTC (NNK) 6 ACC ACC CAC ATC CGC ACC CAC-3') (SEQUENCE ID NO. 11) (nukleotidit 103 - 168) toisessa reaktiossa. Sinkkisormen 1 muuntamiseksi käytetään RTX3:a (edellä) ja ZFI6rb:tä (5'-CTG GCC TGT GTG GAT GCG GAT ATG 15 (MNN)g CGA MNN AGA AAA GCG GCG ATC GCA GGA-3 ' ) (SEQUENCE ID NO. 12) (nukleotidit 28 - 93) ensimmäisessä reaktiossa ja ZFIF:ää (5'-CAT ATC CGC ATC CAC ACA GGC CAG-3’) (SEQUENCE ID NO. 13) (nukleotidit 70 - 93) ja R3B:tä (edellä) toisessa reaktiossa. Limittäisreaktiossa käytetään FTX3:a ja 20 R3B:tä edellä sormen 3 yhteydessä kuvatulla tavalla. Kutakin sormea muunnetaan edullisesti erikseen ja peräkkäin yhdessä proteiinimolekyylissä eikä kaikkia kolmea samassa reaktiossa. zif268:n sormen 1 nukleotidimuunnosten piiriin kuuluisivat alleviivatut aminohapot R S D E L T R 25 H (SEQUENCE ID NO. 14), joita koodittavat nukleotidit 49 -72. zif268:n sormen 2 nukleotidimuunnosten piiriin kuuluisivat S R S D H L (SEQUENCE ID NO. 15), joita koodittavat nukleotidit 130 - 147. (Katso kuvio 7).
Esimerkki 4 30 Fagemidilla esiintyvien, satunnaistettuja sinkki- sormia sisältävien sekvenssien valmistus zif268-sekvenssejä sisältävä fagemidi pComb3.5 on fagemidi-iImentyrnisvektori, joka saa aikaan faagilla esiintyvien ankkuroituneiden proteiinien ilmentymisen, 35 kuten edellä on kuvattu. Alkuperäinen iImentyrnisvektori 75 pComb3.5 suunniteltiin mahdollistamaan ilmentyneiden vas-ta-aineproteiinien ankkuroituminen bakteriofagin peitepro-teiini 3:lie kombinaatio-Fab-kirjastojen kloonaamiseksi. XhoI- ja Spel-kohdat muodostettiin kokonaisten PCR-monis-5 tettujen raskasta ketjua (Fd) vastaavien sekvenssien kloonaamista varten, jotka sekvenssit koostuivat kehyksellä 1 alkavasta ja kehyksen 4 läpi ulottuvasta alueesta. Rihmal-lisen fagin geeni III koodittaa tätä 406-ryhmäistä pienempää faagipeiteproteiinia, cpIII:a (cp3), joka ilmentyy en-10 nen puristumista faagin kokoonpanoprosessissa bakteerikal-volle ja kerääntyy sisemmälle kalvolle, joka suuntautuu E. colin periplasmaa kohden.
Tässä järjestelmässä ensimmäinen sistroni koodittaa periplasmaerityssignaalia (pelB-esijakso), joka on kytkey-15 tynyt toiminnallisesti fuusioproteiiniin zif268-cpIII.
pelB-esijakson läsnäolo helpottaa satunnaistetun sinkki-sormen sisältävän fuusioproteiinin eritystä bakteerin sytoplasmasta periplasmatilaan.
Tämän prosessin kautta zif268-cpIII:n vietiin peri-20 plasmatilaan pelB-esijakson avulla, joka poistettiin sitten. Satunnaistettu sinkkisormi ankkuroitiin kalvoon cpIII-kalvoankkurialueen avulla. Tämä fagemidivektori, josta käytetään merkintää pComb3.5, mahdollisti sinkkisor-miproteiinin esiintymisen pinnalla. XhoI- ja Spel-kohtien 25 läsnäolo mahdollisti satunnaistettujen zof268-PCR-tuottei- den XhoI-Spel-pilkkomistuotteiden insertoinnin vektoriin pComb3.5. Niinpä esimerkissä 3 valmistetun mutagenisoidun zif268-nukleotidisekvenssin ligaatio johti koko PCR-monis-tetusta sormesta 3 koostuvan zif268-fragmentin ligatoitu-30 miseen kehyksen sisään. Ilmentymisvektorissa pComb3.5 olevat kloonauskohdat olivat yhteensopivia hiiren ja ihmisen PCR-alukkeiden kanssa, joita kuvaavat Huse et ai. [Science 246 (1989) 1275 - 1281] ja Persson et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 2432 - 2436]. pelB:n, ilmentyneen 76 proteiinin periplasmatilaan ohjaavan esisekvenssin, nuk-leotidisekvenssiä ovat kuvanneet Huse et ai., supra.
Vektori sisälsi myös ribosomisitoutumiskohdan, jollaista kuvaavat Shine et ai. [Nature 254 (1975) 34].
5 ColEl- ja Fl-lähteitä ja beeta-laktamaasigeenin sisältävän fagemidivektorin pBluescript sekvenssiä ovat aiemmin kuvanneet Short et ai. [Nuo. Acids Res. 16 (1988) 7583 -7600], ja koko sekvenssin GenBank-saantinumero on 52330. Lisärestriktiokohtia Sali, Accl, Hindi, Clal, Hindlll, 10 EcoRV, PstI ja Smal, jotka sijoitettiin tyhjän vektorin XhoI- ja Spel-kohtien väliin, johdettiin pBluescriptin 51 emäsparia käsittävästä täytefragmentista Shortin et ai.
(supra) kuvaamalla tavalla. Nukleotidisekvenssi, joka koo-dittaa taipuisaa 5 aminohapporyhmästä koostuvaa "liekasek-15 venssiä" (tether sequence), jolta puuttuu järjestynyt sekundaari rakenne, sijoitettiin Fab- ja cp3-nukleotidialuei-den väliin, niin että vuorovaikutus minimoitui ilmentyneessä fuusioproteiinissa.
Tuloksena oleva kombinaatiovektori pComb3.5 koostui 20 siten DNA-molekyylistä, jossa oli kasetti fuusioproteiinin zif268/cp3 ilmentämiseksi. Tämä vektori sisälsi myös nuk-leotidiryhmäsekvenssit, jotka vastasivat seuraavia toiminnallisesti kytkeytyneitä elementtejä suunnassa 5' -»3' lueteltuina: LacZ-promoottori-operaattorisekvensseistä 25 koostuva kasetti; Notl-restriktiokohta; ribosominsitoutu-miskohta; pelB-esijakso; välijaksoalue; kloonausalue, jota rajoittavat 5'-XhoI- ja 3'-Spel-restriktiokohdat; lieka-sekvenssi; bakterofagi-cp3:a koodittavat sekvenssit, joita seuraa lopetuskodoni. Nhel-restriktiokohta, joka sijaitsi 30 alkuperäisten kahden kasetin (raskasta ja kevyttä ketjua vastaavien) välissä; toinen IacZ-promoottori-operaattori-sekvenssi, jota seurasi ilmentymistä säätelevä ribosomin-sitoutumiskohta; pelB-esijakso; välialue; kloonausalue, jota rajoittivat 5'-SacI- ja 3'-Xbal-restriktiokohdat ja 35 jota seurasivat ilmentymistä säätelevät lopetussekvenssit 1
S
£ 77 ja toinen Notl-restriktiokohta, deletoitiin pCom3:sta pComb3.5:n muodostamiseksi. Ammattimiehet tuntenevat vastaavia vektoreita, joita voitaisiin käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä, kuten SurfZap™-vektori (Stratagene, 5 La Jolla, CA).
Edellä kuvatussa ilmentymisvektorissa zif268/cp3 fuusioproteiinisekvenssi on sijoitettuna lac-promoottori-operaattorisekvenssin säätelyn alaiseksi, ja pelB-esisek-venssit ohjaavat proteiinin periplasmatilaan sijoittumaan 10 toimivalla tavalla kalvolle. Faagin F1 geenienvälisen alueen sisällytys vektoriin mahdollistaa yksisäikeisen fage-midin pakkaamisen auttajafaagin avulla. Auttajafaagisuper-infektoinnin käyttö mahdollisti kahden cp3-muodon ilmentymisen. Tämän seurauksena faagin normaalia morfogeneesiä 15 häiritsi Fd/cp3-fuusiotuotteen ja auttajafaagin luontaisen cp3:n välinen kilpailu sisällytyksestä virioniin. Tuloksena oleva pakattu fagemidi sisälsi luontaisen cp3:n, joka on välttämätön infektoinnin kannalta, ja kooditettua fuu-sioproteiinia, joka on esillä valikointia varten. Fagemi-20 dilähestymistapa teki välttämättömäksi fuusion C-terminaa- lisen alueen kanssa, koska fuusio infektoivan N-terminaalisen alueen kanssa tekisi isäntäsolusta resistentin in-fektoinnille.
Edellä kuvattu pComb3 ja -3.5-ilmentymisvektori 25 muodostaa perusrakenteen esiintymisfagemidi-ilmentymisvek- torille, jota käytetään tämän keksinnön yhteydessä satunnaistettujen sinkkisormiproteiinien tuotantoon.
Esimerkki 5
Fagemidikirjaston konstruointi 30 Satunnaistettuja sinkkisormia edustavan ilmentyneen proteiinin aikaansaamiseksi konstruoitiin fagemidikirjas-toja. Kirjastoilla saatiin aikaan sellaisten yhdistelmämo-lekyylien pinta-ilmentyminen, joissa sinkkisormet oli satunnaistettu esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
78
Fagemidikirjastojen valmistamiseksi esimerkissä 3 valmistettujen PCR-tuotteiden ilmentämistä varten PCR-tuotteet pilkottiin ensin XhoI:llä ja Spel:llä ja ligatoi-tiin erikseen samalla tavalla pilkotun alkuperäisen (ts.
5 satunnaistamattoman) pComb3.5-fagemidi-ilmentymisvektorin kanssa. Vektorissa pComb3.5 oli läsnä ZhoI- ja Spel-kohtia edellä kuvatulla tavalla. Ligaatio johti zif268 toiminnalliseen kytkeytymiseen vektoriin sijoittuneena 5'-suuntaan cp3-geenistä. Koska monistustuotteet insertoitiin temp-10 laatti-pComb3.5-ilmentymisvektoriin, joka sisälsi alunpe rin raskaan ketjun vaihtelevaa aluetta vastaavat sekvenssit, vain raskaan ketjun alueen kloonauskohta tuli korvatuksi ja loppuosa ilmentymisvektorista pComb3.5 jäi muuttumattomaksi. Yhdistelmäklooneista käsin tehdyn ilmennyk-15 sen jälkeen ilmentyneet proteiinit sisälsivät satunnaiste tun sinkkisormen.
Fagemidikirjastoja kunkin tämän keksinnön mukaisen satunnaistetun sinkkisormen ilmentämiseksi valmistettiin seuraavalla menettelyllä. Renkaaksi suljettujen, PCR-tuo-20 teinsertin sisältävien vektoreiden muodostamiseksi sekoi tettiin 640 ng pilkottuja PCR-tuotteita 2 pg:n kanssa li-nearisoitua pComb3.5-fagemidivektoria ja annettiin ligaa-tion edetä yön yli huoneenlämpötilassa käyttämällä 10 yksikköä BRL:n (Gathersburg, MB) ligaasia BRL:n ligaasipus-25 kurissa reaktiotilavuuden ollessa 150 μΐ. Tehtiin viisi erillistä ligaatioreaktiota satunnaistettuja sinkkisormia sisältävän faagikirjaston koon suurentamiseksi. Ligaatio-reaktioiden jälkeen renkaaksi suljettu DNA saostettiin käsittelemällä 2 tuntia lämpötilassa -20 °C seoksella, 30 joka sisäksi 2 μΐ glykogeeniliuosta (20 mg/ml), 15 μΐ nat-riumasetaattiliuosta (3 mol/1, pH 5,2) ja 300 μΐ etanolia.
DNA pelletoitiin sitten mikrosentrifugoimalla 15 min lämpötilassa 15 °C. DNA-pelletti pestiin kylmällä 70-%:isella etanolilla ja kuivattiin alipaineessa. Pelletti suspendoi-35 tiin uudelleen 10 pl:aan vettä ja sillä transformoitiin 79 elektroporaatiomenetelmällä 300 μΐ E. colx XLl-Blue -soluja faagikirjaston muodostamiseksi.
Transformaation jälkeen faagit indusoitiin mutage-noitua sormi 3:a ilmentävän faagin eristämiseksi jäljempä-5 nä kuvattavalla tavalla myöhempää seulontaa varten, joka tehtiin hiusneulaoligonukleotidilla, jolla oli seuraava sekvenssi (SEQUENCE ID NO. 16):
ΝΗ-,-CGT-AAA-TGG-GCG-CCC - T 10 T
T
GCA-TTT-ACC-CGC-GGG - T
Lihavoitu jakso osoittaa uuden sinkkisormen 3 si-15 toutumiskohdan (aiemmin GCG), alleviivattu sekvenssi edustaa sormen 2 kohtaa ja kaksoisalleviivaus sormen 1 sitoutumiskohtaa.
Transformoitua E. colia viljeltiin 3 ml:ssa SOC-alustaa (SOC valmistettiin sekoittamalla 20 g Bacto-tryp-20 töniä, 5 g hiivauutetta ja 0,5 g NaCl:a 1 litraan vettä, säätämällä pH arvoon 7,5 ja sekoittamalla joukkoon 20 ml glukoosia juuri ennen käyttöä zif268-cpIII:n ilmentymisen indusoimiseksi), sekoitettiin ja viljelmää ravisteltiin kierrostaajuudella 220 min'1 1 tunti lämpötilassa 37 °C. 25 Tämän inkuboinnin jälkeen joukkoon sekoitettin 10 ml SB-alustaa (SB valmistettiin sekoittamalla 30 g tryptonia, 20 g hiivauutetta ja 10 g Mops-puskuria litraa kohden ja säätämällä pH arvoon 7), joka sisälsi 20 pg/ml karbenisil-liiniä ja 10 pg/ml tetrasykliiniä, ja seosta ravisteltiin 30 vielä tunti kierrostaajuudella 300 min-1. Tuloksena oleva seos sekoitettiin 100 ml:aan SB-alustaa, joka sisälsi 50 yg/ml karbenisilliiniä ja 10 pg/ml tetrasykliiniä, ja ravisteltiin 1 tunti, minkä jälkeen joukkoon sekoitettiin auttajafaagi VCSM13 [1012 pfu (pesäkkeenmuodostusyksikköä)] 35 ja seosta ravisteltiin vielä 2 tuntia lämpötilassa 37 °C. Tämän jälkeen joukkoon sekoitettiin 70 pg/ml kanamysiiniä, 80 sekoitettiin ja annettiin seistä yön yli lämpötilassa 30 °C. Tämä alempi lämpötila johti zif268:n parempaan ilmentymiseen faagin pinnalla. Supernatantti selkeytettiin sentrifugoimalla (15 min kierrostaajuudella 4000 min'1 5 JAlO-roottorissa lämpötilassa 4 °C). Faagit saostettiin seoksella, joka sisälsi 4 % (massa/tilavuus) polyeteeni-glykoli 8 000:ta ja 3 % (massa/tilavuus) NaClra, ja pidettiin jäähauteessa 30 min, minkä jälkeen tehtiin sentrifu-gointi (20 min kierrostaajuudella 9 000 min'1 JA10-rootto-10 rissa lämpötilassa 4 °C). Faagipelletit suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan puskuria (5 mmol/1 DTT:a, 10 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,56, 90 mmol/1 KCl:a, 90 mmol/1 ZnCl2:a, 1 mmol/1 MgCl:a) ja mikrosentrifugoitiin 3 min jäännösten pelletoimiseksi, siirrettiin uusiin putkiin ja varastoi-15 tiin lämpötilassa -20 °C myöhempää, jäljempänä kuvattavalla tavalla tehtävää seulontatutkimusta varten. DTT:a lisättiin polypeptidin laskostamiseksi uudelleen faagin pinnalle.
Pesäkkeenmuodostusyksikkö (cfu) -tiitterin määrit-20 tämiseksi faagit (pakatut fagemidit) laimennettiin SB:llä ja käytettiin 1 μΐ seosta infektoimaan 50 μΐ tuoreita (Aod60o = 1) E. coli XLl-Blue -soluja, joita oli kasvatettu 10 μg/ml tetrasykliiniä sisältävässä SB:ssä. Faagit ja solut pidettiin 15 min huoneenlämpötilassa ja siirrostet-25 tiin sitten suoraan LB-karbenisilliinimaljoille. Satunnaistettu sinkkisormi 3 -kirjasto koostui yhteensä 5·107 pfu:sta.
Faagikirj aston moninkertainen seulonta
Faagikirjasto seulottiin käyttämällä edellä kuvatun 30 kaltaista hiusneulaoligonukleotidia, joka sisälsi muutetun sitoutumiskohdan, päällystetyillä mikromaljoilla uudenlaisten sinkkisormien valikoimiseksi.
Käytetty seulontamenettely, joka koostui muutamista tunnistus- ja replikaatiosykleistä, oli muunnos Parmleyn 35 ja Smithin alunperin kuvaamasta menettelystä [Parmley et 81 al., Gene (1988) 305 - 318; Barbas, et ai., 1991, supra~\. Tehtiin viisi seulontasykliä sekvenssispesifisesti sitoutuvien kloonien rikastamiseksi. Tätä menettelyä varten mikromaljan (Costar 3690) neljä syvennystä päällystettiin 5 kuivaamalla yön yli lämpötilassa 37 °C yhdessä 1 pg:n kanssa oligonukleotidia tai oligonukleotidi sidottiin kova-lenttisesti BSA:iin EDC/NHS-aktivaation avulla maljan päällystämiseksi [360 pg asetyloitua BSA:a (Boehringer Mannheim), 577 pg oligonukleotidia, 4 mmol/1 NHS:ää ja 10 10 mmol/1 EDC:tä yhdistettiin kokonaistilavuuden ollessa 1,8 ml ja inkuboitiin yön yli huoneenlämpötilassa). Maljat päällystettiin käyttämällä 50 pl seosta maljaa kohden ja niitä inkuboitiin lämpötilassa 4 °C yön yli. Syvennykset pestiin kahdesti vedellä ja suojattiin täyttämällä syven-15 nys kokonaan liuoksella, joka sisälsi 3 % (massa/tilavuus) BSA:a PBSrssa, ja pitämällä maljaa 1 tunti lämpötilassa 37 °C. Kun suojausliuos oli ravisteltu pois, laitettiin kuhunkin syvennykseen 50 pl edellä valmistettua faagisus-pensiota (tyypillisesti 1012 pfu) ja maljaa pidettiin 2 20 tuntia lämpötilassa 37 °C.
Faagit poistettiin ja malja pestiin kerran vedellä. Kukin syvennys pestiin sitten 10 kertaa TBS-Tween-liuok-sella (10 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,5, 130 mmol/1 NaCl:a, 0,5 % Tween 20:tä) tunnin aikana huoneenlämpötilassa; pesu 25 koostui pipetoinnista ylös ja alas syvennyksen pesemiseksi antaen syvennyksen olla aivan täynnä TBS-Tween-liuosta pesujen välissä. Malja pestiin vielä kerran tislatulla vedellä ja tarttuvat faagit eluoitiin lisäämällä 50 pl eluutiopuskuria (0,1 mol/1 HCl:a, pH säädetty arvoon 2,2 30 kiinteällä glysiinillä, 1 mg/ml BSA:a) kuhunkin syvennyk seen, minkä jälkeen maljaa pidettiin huoneenlämpötilassa 10 min. Eluutiopuskuria pipetoitiin ylös ja alas muutaman kerran, puskuri poistettiin ja tehtiin neutralointi käyttämällä 3 pl Tris-emäsliuosta (2 mol/1) 50 pl:aa kohden 35 käytettyä eluutiopuskuria.
82
Eluoiduilla faageilla infektoitiin 2 ml tuoreita (OD600 = 1 ) E. coll XLl-Blue -soluja käsittelemällä 15 min huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen joukkoon sekoitettiin 10 ml SB:tä, joka sisälsi 20 pg/ml karbenisilliiniä 5 10 pg/ml tetrasykliiniä. Viljelmästä poistettiin siirros- tusta varten annoksia (20, 10 ja 1/10 μΐ) maljalta eluoi-tuneiden faagien (pakattujen fagemidien) lukumäärän määrittämiseksi. Viljelmää ravisteltiin 1 tunti lämpötilassa 37 °C, minkä jälkeen se lisättiin 100 ml:aan SB-alustaa, 10 joka sisälsi 50 pg/ml karbenisilliiniä ja 10 pg/ml tetrasykliiniä, ja ravisteltiin 1 tunti. Sitten lisättiin aut-tajafaagi VCSM13 (1012 pfu) ja viljelmää ravisteltiin vielä 2 tuntia. Tämän jälkeen lisättiin 70 pg/ml kanamysiiniä ja viljelmää inkuboitiin yön yli lämpötilassa 37 °C. Faagien 15 preparointi ja jatkoseulonta toistettiin edellä kuvatulla tavalla.
Kunkin seulontasyklin jälkeen määritettiin prosentuaalinen faagisaanto, jolloin saanto (%) = (eluoituneiden faagien lukumäärä/käytettyjen faagien lukumäärä)·100. Al-20 kuperäiseksi faagipanossuhteeksi määritettiin selektiivi sillä maljoilla tehdyllä titrauksella noin 1011 cfu kussakin seulontasyklissä. Lopullinen faagituotossuhde määritettiin infektoimalla 2 ml logaritmisessa vaiheessa olevia ZLl-Blue-soluja edellä kuvatulla tavalla ja siirrostamalla 25 annoksia selektiivisille maljoille. Tällä menettelyllä valittiin Fab-kirjastosta klooneja käyttämällä perusteena niiden kykyä sitoutua uuteen oligomeeriseen sitoutumissek-venssiin. Valituissa klooneissa oli satunnaistettuja sink-kisormi 3 -alueita.
30 Satunnaistettu sinkkisormi 3 -kirjaston peräkkäis- seulonnassa saatiin tulokseksi 5 sitoutuvaa sekvenssiä, jotka tunnistivat uuden sormi 3 -kohdan. Luontainen kohta GCG muutettiin AAArksi ja seuraavien taulukossa 1 esitettävien sekvenssien todettiin sitoutuvan AAA:han.
35 83
Taulukko 1 Sitoutuva sekvenssi SEQUENCE ID NO. 17 RSD ERK RH1
SEQUENCE ID NO. 18 WSI PVL LH
5 SEQUENCE ID NO. 19 WSL LPV LH
SEQUENCE ID NO. 20 FSF LLP LH
SEQUENCE ID NO. 21 LST WRG WH
SEQUENCE ID NO. 22 TSI QLP YH
10 XRSD ERK RH on luontainen sormen 3 sitoutuva sekvenssi.
Esimerkki 6
Rinnakkaistransformaatiomääritys promoottorin sink-kisormiaktivaation identifioimiseksi 15 Muodostettujen uusien sinkkisormien toiminnallisten ominaisuuksien määrittämiseksi on kehitetty E. coli -pohjainen in vivo -järjestelmä. Tässä järjestelmässä hyödynnetään kahta plasmdisia, joissa on yhteensopivat repliko-nit colEl ja pl5. Sinkkisormen sytoplasmailmentymisen saa 20 aikaan arabinaasipromoottori colEl-plasmidissa. pl5-repli- koneja sisältävä plasmidi sisältää sinkkisormisitoutumis-kohdan repressorisitoutumiskohdan tilalla plasmidissa, joka ilmentää β-galaktosidaasin fragmenttia a. Sinkkisormen sitoutuminen tähän kohtaan toisessa plasmidissa kat-25 kaisee β-galaktosidaasituotannon, ja siten uusien sinkki-sormien toiminta voidaan arvioida tässä in vivo -määrityksessä käyttämällä kätevää sini-valkovalikointia. Esimerkiksi arabinoosian ja laktoosin läsnä ollessa sinkkisormi-geeni ilmentyy, proteiinituote sitoutuu sinkkisormisitou-30 tumiskohtaan ja heikentää laktoosipromoottorin toimintaa.
Siksi β-galaktosidaasia ei synny, ja läsnä on valkoisia pesäkkeitä. Tämä järjestelmä, joka on restriktiokohtien suhteen yhteensopiva pComb3.5:n kanssa, helpottaa uusien sormien nopeaa karakterisointia. Lisäksi tätä lähestymis-35 tapaa voitaisiin laajentaa siten, että se mahdollistaa 84 uudenlaisten transkriptiota säätelevien sekvenssien valikoinnin.
Yksi toinen menetelmä villin tyypin nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormiproteiinin mutagenisoimiseksi on 5 segmenttien siirtely käyttämällä PCR-tekniikkaa, joka mahdollistaa geenisegmenttien siirtelyn geenikokoelmien välillä. Geenit sisältävät edullisesti rajoitettuja homolo-gia-alueita ja vähintään 15 peräkkäisen emäsparin verran identtistä sekvenssiä. Vektorin pComb3.5 sinkkisormigeeni-10 kokoelmia käytetään templaatteina PVR-menetelmässä. Toteutetaan 4 PCR-sykliä esimerkiksi denaturoimalla 1 min lämpötilassa 94 °C ja pariuttamalla 15 s lämpötilassa 50 °C. Erillisissä kokeissa PCR toteutetaan käsittelemällä 1 min 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa; 1 min 94 °C:ssa, 1 min 15 50 °C:ssa; 1 min 94 °C:ssa, 15 s 50 °C:ssa ja 1 s 72 °C:ssa. Kaikissa kokeissa käytetään samaa templaattia (10 ng seosta). Koe toteutetaan siten, että kaikissa olosuhteissa toteutetaan kaksi reaktiosarjaa. Kussakin sarjassa on vain ylä- tai alasäiealuke, mikä johtaa eripi-20 tuisten yksisäikeisten DNA:iden syntymiseen. Esimerkiksi alukkeita FTX3, ZFIF ja FZF3 voidaan käyttää erillisessä sarjassa antamaan yksisäikeisiä tuotteita. Näiden reaktioiden tuotteet yhdistetään sitten, lisätään uusia 5'- ja 3’-terminaalisia alukkeita (esimerkiksi FTX3 ja R3B) ja 25 seos käsitellään 35 PCR-lisäsyklillä, 1 min 94 °C:ssa, 15 s 50 °C:ssa ja 1 min 30 s 72 °C:ssa. Tuloksena oleva seos voidaan sitten kloonata XhoI-Spel-pilkonnalla. Uudet siirrellyt sinkkisormet voidaan valikoida edellä kuvatulla tavalla seulomalla missä tahansa "geenipakkauksessa" esil-30 lä olevat sinkkisormet optimaalisten sinkkisormikokoelmien valikoimiseksi. Tätä menetelmää voidaan soveltaa mihin tahansa geenikokoelmaan, jossa geenit sisältävät vähintään 15 peräkkäisen emäsparin verran identtistä sekvenssiä. Alukkeita voidaan myös seostaa rajallisessa määrin edellä 35 NNK-esimerkissä kuvatulla tavalla mutaatioiden tuomiseksi 85 alukkeen sitoutumisalueille. Reaktioaikoja voidaan vaihdella templaatin pituuden ja käytettyjen alukkeiden lukumäärän mukaan.
Esimerkki 7 5 Zif268:n spesifisyyden modifiointi
Reagenssit, kannat ja vektorit
Restriktioendonukleaasit hankittiin New England Biolabsilta tai Boehringer Mannheimilta. T4-DNA-ligaasi oli CIBCO BRL:n tuote. Tag-polymeraasin ja Vent-polymeraa-10 si ostettiin Promegalta. Heparin-Sepharose CL-6B -alusta oli Pharmacialta. Oligonukleotidit toimitti Operon Technologies (Alameda, CA), tai ne valmistettiin laboratoriossa Gene Assembler Plus -laitteistolla (Pharmacia LKB). pZif268 oli lahja tohtoreilta Pavletich ja Pabo [Pavletich 15 et ai.. Science 252 (1991) 809 - 817]. Escherichia coli BL21(DE3)pLysS ja plasmidi pET3 oli Novagenilta, Escherichia coli XLl-Blue, faagi VCSM13, fagemidivektori pComb3 ja pAraHA ovat kirjallisuudessa kuvattujen kaltaisia [Barbas III et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 20 7978 - 7982; Barbas III et ai., Methods: A Companion to
Methods in Enzymology 2 (1991) 119 - 124].
Plasmidin konstruointi
Villin tyypin sinkkisormiproteiineja koodittavia geenejä sijoitettiin Salmonella typhimurium araB -promoot-25 torin säätelyn alaiseksi insertoimalla DNA-fragmentti, jota oli monistettu polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja joka sisälsi pzif89:n (Pavletich, supra) villin tyypin Zif268-geenin ja useita lisättyjä restriktiokohtia (Zhol/Sacl ja Xbal/Spel). Tuloksena olevaa plasmidivekto-30 ria käytettiin sitten valikoitujen sinkkisormigeenien ali-kloonaamiseen immuuniseulontamääritystä varten. Tässä vektorissa sinkkisormiproteiini ilmentyy fuusiotuotteena, jonka C-päässä on hemagglutiniinidekapeptidi, joka voidaan detektoida monoklonaalisella anti-dekapeptidivasta-aineel-35 la (kuvio 8A) [Field et ai., Mol. & Cell. Biol. 8 (1988) 86 2159 - 2165]. Zif268-proteiini on järjestetty riveittäin kunkin sinkkisormen konservatiivisten osien näyttämiseksi.
Kunkin sormisekvenssin kuusi alleviivattua aminohapporyh-mää satunnaistettiin konstruoitaessa kirjastoja. Zif268-5 proteiinin C-terminaalinen pää fuusioitiin dekapeptidipää-teryhmän sisältävän fragmentin kanssa. Fuusiokohta osoitetaan nuolella.
Fagemidiä pComb3 muunnettiin pilkkomalla Nhel:llä ja Zbal:llä vasta-aineen kevyttä ketjua vastaavan fragmen-10 tin poistamiseksi, täydennettiin Klenow-fragmentilla ja runko ligatoitiin itsensä kanssa, jolloin tuloksena oli plasmidi pComb3.5. Zif268-PCR-fragmentti insertoitiin pComb3.5:een edellä kuvatulla tavalla. Taustaongelmien poistamiseksi kirjaston konstruoinnissa korvattiin villin 15 tyypin Zif268 1,1 ke:n toimimattomalla täytefragmentilla käyttämällä Sacl:ä ja Xbalrä. Tuloksena oleva plasmidi pilkottiin Sacl:llä ja Xbal:llä täytefragmentin poistamiseksi, pComb3.5-runko puhdistettiin geelillä, ja se toimi vektorina kirjaston konstruoinnissa.
20 Slnkkisormikirjastot
Konstruoitiin kolme sinkkisormikirjastoa PCR-limit-täislaajennuksella käyttämällä edellä esimerkissä 3 kuvattuja olosuhteita. Lyhyesti esitettynä sormi 1 -kirjaston yhteydessä käytettiin alukepareja A (5’-GTC CAT AAG ATT 25 AGO GGA TCC-3' ) (SEQ. ID NO: 29) ja Zfl6rb (SEQ. ID NO: 12), (jossa N on A, T, G tai C ja M on A tai C) ja B (5'-GTG AGC GAG GAA GCG GAA GAG-3') (SEQ. ID NO: 30) ja Zflf (SEQ. ID NO: 13) Zif268-geenifragmenttien monistamiseen käyttämällä plasmidia pAra-Zif268 templaattina. Sekoitet-30 tiin yhtä suuret moolimäärät kahta PCR-fragmenttia ja seosta käytettiin templaatteina limittäislaajennuksessa. Yhdistelmäfragmentteja monistettiin sitten PCR:llä käyttämällä alukkeita A ja B ja saatu tuote pilkottiin Sacl:llä ja Xbal:llä ja puhdistettiin geelillä. Kussakin ligaatio-35 reaktiossa ligatoitiin 280 ng pilkottua fragmenttia i 87 1,8 pg:n kanssa pComb3.5-vektoria yön yli huoneenlämpötilassa. Toteutettiin 12 reaktiota ja DNA saostettiin etanolilla ja siirrettiin elektroporaatiolla E. coli XLl-Blue -soluihin. Sormi 2 ja 3 -kirjastot konstruoitiin samalla 5 tavalla, paitsi että sormi 1 -kirjaston konstruoinnissa käytetyt PCR-alukkeet Zflörb ja ZF1F korvattiin alukkeilla Zfnsi-B (SEQ. ID NO: 10) ja ZF2r6F (SEQ. ID NO: 11) (jossa K on G tai T) sormi 2 -kirjaston ollessa kyseessä ja alukkeilla BZF3 (SEQ. ID NO: 7) ja ZF36K (SEQ. ID NO: 8) sormi 10 3 -kirjaston ollessa kyseessä. Kirjastoissa oli satunnais tettuina 6 aminohapporyhmää, jotka vastaavat sormen 1 ja 3 α-kierteen asemia -1, 2, 3, 4, 5 ja 6 ja sormen 2 asemia -2, -1, 1, 2, 3 ja 4 (kuvio 8A).
Sinkkisormien valikointi in vitro ' 15 Sinkkisormien valikointiin käytettiin 34 nukleoti dia sisältävää hiusneula-DNA:ta, joka sisälsi joko konsensus- tai muunnetun Zif268-sitoutumiskohdan (kuvio 8). Konsensus-sitoutumiskohdasta käytetään merkintää Z268N (5'-CCT GCG TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CGG AGG-3') (SEQ. ID 20 NO: 31). Muunnettu kohta on sormen 1 ollessa kyseessä TGT ( 5 ' -CCT GCG TGG TGT CCC TTTT GGG ACA CAA CGC AGG-3' ), sormen ollessa kyseessä TTG (5'-CCT GCG TTG GCG CCC TTTT GGG CGC CAA CGC AGG-3') ja sormen 3 ollessa kyseessä CTG (5'-CCT TGG GCG CCC TTTT GGG CGC CCA CAQ AGG-3'). Oligo- 25 nukleotidi syntetisoitiin siten, että sen 5'-päässä oli primaarinen n-heksyyliaminoryhmä. Valmistettiin DNA-BSA-konjugaatti sekoittamalla 30 pmol/l DNA:ta ja 3 pmol/l asetyloitua BSA:a liuoksessa, joka sisälsi 100 mmol/1 l-( 3-dimetyyliaminopropyyli) -3-etyylikarbodi-imidihydro-30 kloridia (EDCI) ja 40 mmol/1 N-hydroksisukkinimidiä (NHS), 5 tuntia tai yön yli huoneenlämpötilassa. Laitettiin 1012 pesäkkeenmuodostusyksikköä Zif268-faagia 50 pl:ssa sinkki-puskuria (10 mmol/1 Tris-Cl:a, pH 7,5, 90 mmol/1 KCl:a, 1 mmol/1 MgCl2:a, 90 pmol/l ZnCl2:a ja 5 mmol/1 DTT:a), 35 joka sisälsi 1 % BSA:a, mikromaljan syvennykseen, joka oli 88 esipäällystetty 4,9 ygrlla DNA-BSA-konjugaattia 25 plrssa PBS-puskuria (10 mmol/1 kaliumfosfaattia, 160 mmol/1 NaCl:a, pH 7,4) syvennystä kohden. Kun oli inkuboitu 2 tuntia lämpötilassa 37 °C, faagit poistettiin ja malja 5 pestiin kerran TBS-puskurilla (50 mmol/1 Tris-Cl:a ja 150 mmol/1 NaClra, pH 7,5), joka sisälsi 0,5 % Tweeniä, ensimmäisen valikointisyklin yhteydessä. Malja pestiin 5 kertaa syklin 2 yhteydessä ja 10 kertaa muiden syklien yhteydessä. Sitoutuneet faagit uutettiin eluutiopuskurilla 10 [0,1 mol/1 HCl:a, pH 2,2 (säädetty glysiinillä), 1 mg/ml BSA:a] ja käytettiin E. coli XLl-Blue -solujen infektoin-tiin faagien tuottamiseksi myöhempää valikointia varten.
Immuunitutkimus
Viiden tai kuuden seulontasyklin jälkeen valikoidut 15 sinkkisormimutanttigeenit alikloonattiin pAraHA-vektoriin käyttämällä ZhoI- ja Spel-restriktiokohtia. Tyypillisesti tutkittiin kerrallaan 20 kloonia. Solut kasvatettiin lämpötilassa 37 °C myöhäiseen logaritmiseen vaiheeseen (OD600 0,8 - 1) 6 ml:ssa SB-alustaa (Barbas III, et ai., supra), 20 joka sisälsi 30 pg/ml kloramfenikolia. Sinkkisormiproteii- nien ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 1 % arabinoosia. Solut otettiin talteen 3-12 tunnin kuluttua indusoinnis-ta. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 600 pl:aan sink-kipuskuria, joka sisälsi 0,5 mmol/1 fenyylimetyylisulfo-25 nyylifluoridia (PMSF). Solujen lyysi tehtiin kuudella jää-dytys-sulatussyklillä ja supernatantti selkeytettiin sent-rifugoimalla 5 min kiihtyvyydellä 12 000·g. Laitettiin 50 μ1:η annos solusupernatanttia mikromaljan syvennykseen, joka oli esipäällystetty 1,1 pgrlla DNA-BSA-konjugaattia. 30 Kun oli inkuboitu 1 tunti lämpötilassa 37 °C, malja pestiin 10 kertaa tislatulla vedellä ja lisättiin maljalle alkalisen fosfataasin kanssa konjugoitua anti-dekapeptidi-vasta-ainetta. Kun oli inkuboitu 30 min lämpötilassa 37 °C, malja pestiin 10 kertaa ja lisättiin p-nitrofenyy- 89 lifosfaattia. Maljalle tehtiin sitten luenta automaattisella mikromaljalukulaitteella aallonpituudella 405 nm.
Sinkkisormiproteiinien y1i-ilmentäminen ja puhdistus 5 Sinkkisormiproteiineja ylituotettiin käyttämällä pET-ilmentämisjärjestelmää [Studier et ai., Methods in Enzymol. 185 (1990) 60 - 89). Zif268-geeni vietiin PCR:n jälkeen Ndel:llä ja BamHI:llä pilkottuun vektoriin pET3a. Zif268-geeni korvattiin sitten 680 ep:n toimimattomalla 10 täytefragmentilla. Tuloksena olevaa, täytefragmentin sisältävää pET-plasmidia käytettiin muiden sinkkisormigee-nien kloonaamiseen korvaamalla täytefragmentti sinkkisor-migeeneillä käyttämällä Spel- ja XhoI-kohtia. Sinkkisormi-geenejä koodattavat pET-plasmidit vietiin kemiallisella 15 transformaatiolla BL21(DE3)pLysS:ään. Solut kasvatettiin logaritmisen vaiheen keskialueelle (OD600 0,4 - 0,6) SB-alustassa, joka sisälsi 50 pg/ml karbenisilliiniä ja 30 pg/ml kloramfenikolia. Proteiinien ilmentyminen indusoitiin lisäämällä alustaan 0,7 mmol/1 IPTG:tä. Solut 20 otettiin talteen 500 ml:n viljelmästä tyypillisesti 3 tunnin kuluttua indusoinnista. Solupelletit suspendoitiin uudelleen sinkkipuskuriin, joka sisälsi 1 mmol/1 PMSF:ää, ja solujen lyysi saatiin aikaan äänikäsittelemällä 5 min lämpötilassa 0 °C. Kun oli lisätty 6 mmol/1 MgCl2:a, solu-25 lysaattia inkuboitiin 20 min jäähauteessa yhdessä DNaasin (10 pg/ml) kanssa. Inkluusiokappaleet, jotka sisälsivät sinkkisormiproteiinia, otettiin talteen sentrifugoimalla 30 min kiihtyvyydellä 25 000·g ja suspendoitiin uudelleen ja liuotettiin 10 ml:aan sinkkipuskuria, joka sisälsi 30 6 mol/1 ureaa ja 0,5 mmol/1 PMSF:ää, sekoittaen varovasti 3-13 tuntia lämpötilassa 4 °C. Uute selkeytettiin sentrifugoimalla 30 min kiihtyvyydellä 30 000·g ja suodatettiin 0,2 μπκη proteiinia heikosti sitovan suodattimen läpi. Kokonaisproteiiniuute syötettiin Heparin-Sepharose 35 -FPLC-kolonniin (1,6 x 4,5 cm), joka oli tasapainotettu 90 sinkkipuskurilla. Proteiinit eluoitiin NaCl-gradientilla 0 - 0,7 mol/1. Sinkkisormiproteiinia sisältävät fraktiot identifioitiin SDS~PAGE:lla ja yhdistettiin. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttämällä 5 standardina BSA:a (fraktio V) [Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976) 248 - 254]. Puhdistetun proteiinin saanto oli 7 -19 mg/1 soluviljelmää. Proteiinin homogeenisuusaste oli yli 90 % SDS-PAGE:n perusteella.
Kineettinen analyysi 10 Zif268-peptidien ja niiden DNA-kohteiden välisten vuorovaikutusten kineettiset vakiot määritettiin pinta-plasmoniresonanssiin perustuvalla analyysillä käyttämällä BIAcore-laitetta (Pharmacia) [Malmqvist, Curr. Opinion in Immuno. 5 (1993) 282 - 286]. Anturilastun pintaa aktivoi-15 tiin 15 min ADCI:n ja NHS:n seoksella. Sitten injektoitiin 40 μΐ liuosta, joka sisälsi 200 pg/ml affiniteettipuhdis-tettua streptavidiinia (Pierce) natriumasetaattiliuoksessa (10 mmol/1, pH 4,5), nopeudella 5 μΐ/min. Lastulle immobi-lisoitiin tyypillisesti 5 000 - 6 000 resonanssiyksikköä 20 streptavidiinia. Ylimääräiset esteriryhmät inaktivoitiin 30 μΐ:11a etanoliamiiniliuosta (1 mol/1). Oligonukleotidit immobilisoitiin lastulle injektoimalla 40 μΐ seosta, joka sisälsi 50 pg/ml biotinyloituja oligonukleotideja natrium-kloridiliuoksessa (0,3 mol/1). Tavallisesti immobilisoi-25 tiin 1 500 - 3 000 resonanssiyksikköä oligomeerejä. Asso-siaationopeus (kon) määritettiin tutkimalla proteiinin si-toutumisnopeutta pintaan 5 eri proteiinipitoisuudella, jotka olivat alueella 10 - 200 pg/ml, sinkkipuskurissa. Dissosiaationopeus (koff) määritettiin suurentamalla vir-30 tausnopeus arvoon 20 μΐ/min assosiaatiovaiheen jälkeen. koff-arvo on kolmen mittauksen keskiarvo. kon ja koff laskettiin käyttämällä BiacoreR-kinetiikkamääritysohjelmistoa. Tasapainodissosiaatiovakiot pääteltiin nopeusvakioista.
91
Esimerkki 9
Muunnettujen sinkkisormien esiintyminen fagemidillä
Kirjaston suunnittelu ja valikointi
Zif268-proteiinin esiintyminen faagilla saavutet-5 tiin muuntamalla fagemidiesiintymisjärjestelmää pComb3 esimerkeissä 2-6 kuvatulla tavalla. pzif89:stä peräisin oleva Zif268-sekvenssi tehtiin PCR:llä sopivaksi insertoi-tavaksi pComb3.5:n XhoI- ja Spel-kohtien väliin. Kuten kuvattiin edellä esimerkissä 4, insertointi näihin kohtiin 10 johtaa Zif268:n fuusioitumiseen rihmallisen faagin peite-proteiinia III (pIII) vastaavan geenin karboksiterminaali-sen segmentin kanssa. Käytettiin yhtä seulontakoetta, jossa inkuboidaan faagia, jolla esiintyy sinkkisormiproteii-ni, mikromaljan syvennykselle immobilisoidun kohde-DNA:n 15 kanssa, minkä jälkeen tehdään pesu, eluointi ja eluoidun faagin titraus, faagin pinnalla esiintyvän proteiinin toiminnallisten ominaisuuksien tutkimiseen.
Vertailukokeissa tutkittiin faagia, jolla Zif268 esiintyy, seulontakokeessa sen sitomiseksi kohdesekvens-20 siin, jossa on konsensus-sitoutumiskohta, tai TFIIIAm kolmen ensimäisen sormen sitoutumiskohta. Nämä kokeet osoittivat, että faagi, jolla Zif268 esiintyy, sitoutui asianmukaiseen kohde-DNA-sekvenssiin 9-kertaisesti TFIIA-sekvenssiin tai BSA:han nähden ja että sormikompleksin 25 sekvenssispesifinen sitoutuminen säilyy faagilla esittämisen aikana. Faagin sitoutumisen heikkeneminen neljäsosaksi havaittiin, kun sitomispuskuriin ei sisällytetty Zn2+:a eikä DTT:tä. Kaksi raporttia vahvistaa sen, että Zif268 voidaan saattaa esiintymään faagin pinnalla [Rebar et ai., 30 Science 263 (1994) 671 - 673; Jamieson et ai., Biochem. 33 (1994) 5689 - 5695].
Saatettiin vastaavassa kokeessa TFIIIArn kolme ensimmäistä sormea esiintymään faagin pinnalla ja myös niiden osoitettiin säilyttävän spesifinen sitoutumisaktiivi-35 suutensa. DNA:n immobilisaatiota helpotettiin suunnittele- 92 maila stabiili hiusneulasekvenssi, jossa esiintyy sormien kaksisäikeinen DNA-kohde yhdessä oligonukleotidissa, joka on aminoleimattu (kuvio 8B) [Antao et ai., Nucleic Acids Research 19 (1991) 5901 - 5905]. Hiusneula-DNA:ta, joka 5 sisältää villin tyypin Zif268:n 9 ep:n konsensus-sitoutumiskohdan (5'-GCGTGGGCG-3', ympyröity), käytettiin faagil-la esiintyvien sinkkisormiproteiinien affiniteettivali-kointiin. Affiniteettivalikointia varten korvattiin lisäksi villin tyypin Zif268:n 3 ep:n alakohdat konsensus-HIV-10 1-DNA-sekvenssin 3 ep:n alakohdilla (laatikoitu).
Aminokytkijä mahdollisti hiusneulasekvenssin kova-lenttisen kytkemisen asetyloituun BSAriin, joka immobili-soitiin sitten valikointikokeita varten adsorboimalla po-lystyreenimikrosyvennyksille. Biotinyloidut hiusneulasek-15 venssit toimivat yhtä hyvin valikoinnin yhteydessä strept-avidiinilla päällystetylle maljalle immobilisoinnin jälkeen.
Konstruoitiin itsenäisesti kirjastot Zif268:n kustakin kolmesta sormesta käyttämällä aiemmin kuvattua li-20 mittäis-PCR-mutageneesistrategiaa [Barbas III et ai.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4457 - 4461; esimerkit 2 - 6]. Satunnaistaminen rajoittui kuuteen asemaan rutiininomaisesti konstruoitavissa olevien kirjastojen kokorajoitusten vuoksi [Barbas III, Curr. Opinion in Bio-25 tech. 4 (1993) 526 - 530], DNA:n sinkkisormitunnistuksessa proteiini asettuu antiparalleelisesti DNA;n suurempaan uurteeseen, ts. aminoterminaalinen alue osallistuu 3'-kontakteihin kohdesekvenssin kanssa, kun taas karboksitermi-naalinen alue osallistuu 5'-kontakteihin (kuvio 8B). Kon-30 taktit säilyvät määrätyssä sormi-DNA-alakohtakompleksissa antiparalleelisina, kun Zif268:n sormessa 1 Arg:n guanidi-niumryhmät muodostavat kierteen asemissa -1 ja 6 vetysi-doksen kohdesekvenssin GCG 3'- ja vastaavasti 5'-guaniinin kanssa. Kierteen aseman 3 sivuketjun kontakti tripletti-35 alakohdan keskimmäisen emäksen kanssa havaitaan Zif268:n 1 93 sormessa 1, GLI:n sormissa 4 ja 5 ja TTL:n sormissa 1 ja 2. Sinkkisormi-DNA-kompleksien kolmen raportoidun kiderakenteen puitteissa suora emäskontakti on havaittu ryhmien -1 - 6 sivuketjujen välillä, ryhmää 4 lukuun ottamatta 5 [Pavletich, supra; Pavletich, Science 261 (1993) 1701 -1707: Fairall et ai., Nature 366 (1993) 483 - 487].
Näiden havaintojen perusteella satunnaistettiin ryhmät, jotka vastasivat kierteen asemia -1, 2, 3, 4, 5 ja 6, sormi 1 ja 3 -kirjastoissa. Aseman 1 Ser säilytettiin 10 näissä kokeissa, sillä se on hyvin säilynyt ryhmä tässä asemassa sinkkisormisekvensseissä yleisesti ottaen ja täysin säilynyt Zif268:ssa [Jacobs, EMBO J. 11 (1992) 4507 -4517]. Sormi 2 -kirjastossa satunnaistettiin kierteen asemat -2, -1, 1, 2, 3 ja 4 tarkoituksena kartoittaa erilais-15 ta mutageneesistrategiaa, jossa tutkitaan asemaa -2, sillä sekä Zif268- että GLI-rakenteet osoittavat tämän aseman olevan mukana fosfaattikontakteissa ja sillä on konteksti-vaikutus tämän alueen muihin osiin. Ryhmät 5 ja 6 pidettiin muuttumattomina, sillä kohdesekvenssissä TTG oli jäl-20 jellä villin tyypin TGG-kohdan 5'-tymidiini. Ligatoidun DNA vieminen sisään elektroporaatiolla johti sellaisten kirjastojen muodostumiseen, jotka koostuivat 2·109, 6·108 ja 7·108 itsenäisestä transformantista sormikirjastojen 1, 2 ja vastaavasti 3 ollessa kyseessä. Kukin kirjasto johtaa 25 mutegenisoidun sormen esiintymiseen villin tyypin sekvens sien kahden jäljellä olevan sormen yhteydessä.
Esimerkki 10
Valikoitujen sormien sekvenssianalyysi
Jotta saataisiin tutkituksi sinkkisormien muuntami-30 sen mahdollisuuksia määrättyjen kohteiden sitomisessa ja geeniterapiassa, valittiin kohdesekvenssiksi HIV-1-geno-missa oleva konservatiivinen sekvenssi. HIV-1 HXB2 -kloonin 5'-esisekvenssi asemissa 106 - 121 suhteessa transkription aloituskohtaan edustaa yhtä HIV-l-genomien kon-35 servatiivisista alueista [Yu et ai., Proc. Natl. Acad.
3 94
Sei. USA 90 (1993) 6340 - 6344; Myers et ai., 1992]. Näiden kokeiden yhteydessä kohteena oli 9 emäsparin alue, 113 - 121, joka esitetään kuviossa 8B.
Kun oli tehty valikointi luontaisten konsensus- tai 5 HIV-l-kohdesekvenssien sitomisen perusteella, toimivat sinkkisormet identifioitiin nopeasti immuunimäärityksellä. Valittujen proteiinien ilmentyminen pAtaHA-johdannaisessa johti mutantti-Zif268-proteiinien fuusioitumiseen monoklo-naalisen vasta-aineen tunnistaman päätepeptidisekvenssin 10 kanssa (kuvio 8B). Sitoutuminen määritettiin ELISAlla käyttämällä epäpuhtaita solulysaatteja. Spesifisyys voidaan määrittää myös kvantitatiivisesti tällä menetelmällä, joka on herkkä vähintään nelinkertaisille affiniteetti-eroille. Kustakin valikoinnista sekventoitiin muutamia 15 positiivisia klooneja, ja ne esitetään kuviossa 9. Sormien 1 ja 3 kuusi satunnaistettua ryhmää ovat asemissa -1, 2, 3, 4, 5 ja 6 α-kierrealueella ja sormen 2 yhteydessä asemissa -2, -1, 1, 2, 3 ja 4 (kuvio 9). Kolme nukleotidia tarkoittavat kunkin sormen affiniteettivalikointiin käy-20 tettyä sitoutumiskohtaa. Yksityiskohtaisesti tutkitut proteiinit osoitetaan kloonimerkinnällä.
Sormelle 1 tehty valikointi konsensus-sitoutumiskohdalla GCG osoitti vahvan valikoitumisen asemassa -1 olevan Lys:n ja asemassa 6 olevan Arg:n suhteen. Kovariaa-25 tiota asemien -1 ja 2 välillä havaitaan kolmessa kloonissa, jotka sisältävät ryhmän Lys ja vastaavasti Cys näissä asemissa. Klooni C7 rikastui valikoinnissa ensisijaisesti sen perusteella, että se esiintyi 3:ssa 12 sekventoidusta kloonista. HIV-l-kohdesekvenssillä tällä alueella, TGT, 30 tehty valikointi paljasti sekvenssien moninaisuuden; valikoitumista tapahtui asemassa -1 olevien ryhmien suhteen, joissa oli vetysidoksen muodostavia sivuketjuja, ja vaatimatonta valikoitumista asemassa 3 olevan Gin:n suhteen.
Sormelle 2 tehty valikointi käyttämällä konsensus-alakoh-35 taa TGG osoitti valikoitumisen asemassa -1 olevan aromaat- 95 tisen ryhmän suhteen, kun taas valikointi HIV-1-kohden-TTGrllä osoitti valikoitumista tässä asemassa olevan emäksisen ryhmän suhteen. Ryhmän Ser suosiminen asemassa 3 saattaa olla merkitsevää tymidiinin tunnistuksessa. Tymii-5 nin kontakti Ser:n kanssa on havaittu GLI- ja TTK-raken-teissa (Pavletich, supra; Fairallet ai., supra). Taulukossa on havaittavisa muita vaatimattomia valikoitumisia kon-sensusryhmien suhteen. Valikoinnit tehtiin käyttämällä E. Colin supE-kantaa, mikä johti amber-kodonin TAG luentaan 10 Gln:ksi translaation aikana. Kuviossa 9 esitetyistä 51 sekvenssistä 14 kloonissa oli yksi amber-kodoni. Yhdessäkään kloonissa ei ollut useampia kuin yksi amber-kodoni. Valikoituminen amber-lopetuskodonin suppression suhteen supE-kannoissa on havaittu muissa DNA-sitoutumisproteiini-15 kirjastoissa, ja se parantaa todennäköisesti kirjaston laatua, sillä tätä kodonia käytetään usein kontaktiryhmänä DNA-sitoutumisproteiineissa (Huang et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1991) 3969 - 3973]. Havaitaan myös valikoitumista vapaita kysteiinejä sisältävien sormien suh-20 teen, ja se heijastaa todennäköisesti koemenettelyä. Faa-geja inkuboitiin puskurissa, joka sisälsi Zn2+:a ja DTT:a, asianmukaisesti laskostuneita sormia sisältävien faagien lukumäärän maksimoimiseksi. Vapaiden kysteiinien vastaista valikoitumista, joka johtuu otaksuttavasti aggregaatiosta 25 tai väärästä laskostumisesta, on havaittu aiemmin muiden proteiinien faagiesiintymiskirjastoissa [Lowman et ai., J. Mol. Biol. 234 (1993) 564 - 578].
Jatkokarakterisoinnin tekemiseksi saavutettiin sinkkisormiproteiinien voimakas ilmentyminen käyttämällä 30 T7-promoottoria (kuvio 10) (Studier et ai., supra). Kuvi ossa 10 proteiinit on erotettu 15-%:isella SDS-PAGE:lla ja värjätty Coomassie-sinellä. Kaista 1: moolimassastandardit (kDa). Kaista 2: solu-uute ennen IPTG-induktiota. Kaista 3: solu-uute IPTG-induktion jälkeen. Kaista 4: sytoplasma-35 fraktio inkluusiokappaleiden sentrifugointipoiston jäi- 96 keen. Kaista 5: sinkkisorraipeptidiä sisältävät inkluusio-kappaleet. Kaista 6: Heparin-Sepharose-FPLC:llä puhdistettu Zif268-mutanttipeptidi. Kloonit CIO, F8 ja G3 sisälsivät kukin amber-kodonin, joka muutettiin CAG:ksi Gin:n 5 koodittamiseksi ennen ilmentämistä tässä järjestelmässä.
Esimerkki 11
Affiniteetin ja spesifisyyden karakterisointi Käsityksen saamiseksi muuttuneen spesifisyyden tai affiniteetin mekanismista määritettiin sitoutumiskinetiik-10 ka käyttämällä hyväksi pintaplasmoniresonanssin (SPR) tosiaikaisia muutoksia (Malmqvist, supra). 11 proteiinin kineettiset vaktio ja lasketut tasapainodissosiaatiovakiot esitetään kuviossa 11. Kukin tutkittu sinkkisormiproteiini osoitetaan kloonimerkinnällä (sekvenssin suhteen katso 15 kuvio 9). Kunkin sormen valikointiin käytetty kohde-DNA-kohta osoitetaan lihavoinnilla. Villin tyypin proteiinin konsensus-sitoutumiskohta osoitetaan samoin lihavoinnilla. Hiusneulamuodossa olematon kaksisäikeinen DNA (alleviivattu) valmistettiin pariuttamalla kaksi yksisäikeistä 20 DNA: ta. Kullekin proteiinille esitetään kon, assosiaationo-peus; koff, dissosiaationopeus, ja Kd, tasapainodissosiaa-tiovakio.
Zif268:lle lasketut tasapainodissosiaatiovakiot sen sitoutuessa konsensus-sekvenssiinsä, joka on mallin mukai-25 sen hiusneulan tai lineaarisen, tetratymidiinisilmukatto-man kaksoissäikeen muodossa, ovat käytännöllisesti katsoen samat, mikä viittaa siihen, että proteiinin tunnistaman kaksoissäiesekvenssin konformaatio ei häiriinny hiusneu-lakonformaatiossa. Arvo 6,5 nM, joka saatiin konsensus-30 sekvenssiinsä sitoutuvalle Zfi268:lle, on alueella 0,5 -6 nM, joka on ilmoitettu saadun käytettäessä elektroforee-siliikkuvuussiirtymämäärityksiä tälle proteiinille sen sitoutuessa pituudeltaan ja sekvenssiltään erilaisissa oligonukleotideissa olevaan konsensus-sekvenssiinsä 35 (Pavletich, supra; Rebar, supra; Jamieson et a!., supra).
97
Spesifisyyden mitaksi määritettiin kunkin proteiinin affiniteetti sitoutumisessa luontaiseen konsensus-sekvenssiin ja mutanttisekvenssiin, jossa yksi sormialakohta oli muutettu. Kuvio 11 esittää villin tyypin Zif268-prote-5 iinin (WT) ja sen variantin C7 dissosiaationopeuden (koff) määrittämistä pintaplasmoniresonanssin tosiaikaisten muutosten kautta. Laitteen vaste, r, on verrannollinen [pro-teiini-DNA] -kompleksiin. Koska dr/dt = Jcoffr, kun [proteiini] = 0, koff = ln(rtl/rtn)/( tn-tj, jossa rtn on vaste het-10 kellä tn. Kuviossa esitetään kullekin proteiinille tehdyn yhden kokeen tulokset. Tehtiin kolme koetta kuviossa 11 esitettyjen arvojen saamiseksi. Kloonin C7 affiniteetti on 13-kertainen villin tyypin sekvenssin GCG sitomisen suhteen. Pääsyynä tähän affiniteetin paranemiseen on komplek-15 sin dissosiaationnopeuden lasku viidesosaan (kuvio 12). C7-proteiinin spesifisyys paranee 9-kertaiseksi myös HIV-1-kohdesekvenssin suhteen. Tämä tulos viittaa siihen, että kompleksissa tapahtuu enemmän tai parantuneita kosketuksia. Proteiinilla C9 tehdyt tutkimukset osoittavat paran-20 tuneen spesifisyyden erilaisen mekanismin. Tässä tapauksessa C9:n kokonaisaffiniteetti GCG-kohdan suhteen on sama kuin Zif268:n, mutta spesifisyys paranee 3-kertaiseksi Zif268:aan nähden sitoutumisessa TGT-kohdekohtaan tämän kompleksin poistumisnopeuden kasvun vuoksi. Proteiinien F8 25 ja F15 karakterisointi osoittaa, että sormen 1 kolme emäs-paria käsittävä tunnistusalakohta voidaan muuttaa kokonaan TGTiksi ja valikoida uusia tähän kohtaan sitoutuvia sormia.
Sormen 2 alueella muunnettujen ja alakohtaan TTG 30 tapahtuvan sitoutumisen perusteella valikoitujen proteiinien karakterisointi paljastaa, että tämän sormen spesifisyys on muunnosaltis. Proteiinit G4 ja G6 sitoutuvat tämän uuden alakohdan sisältävään oligonukleotidiin affiniteetilla, joka on vastaava kuin konsensus-kohteeseensa sitou-35 tuvalla Zif268:lla. Näiden proteiinien spesifisyyden si- | 98 toutumisvalikointiin käytetyn kohteen suhteen osoittaa noin 4-kertainen affiniteetti tämän oligonukleotidin suhteen verrattuna luontaiseen sitoutumiskohtaan, joka on erilainen yhden emäsparin osalta. Tämä selektiivisyystaso 5 on samanlainen kuin sormi 1 -mutantin yhteydessä raportoitu (Jamieson et ai., supra). Sormen 3 suhteen muunnettu proteiini A14 valittiin sitomaan luontainen sormi 3 -alakohta, ja se sitoo tämän kohdan affiniteetilla, joka on vain puolet Zif268:n vastaavasta arvosta. Huomaa, että 10 proteiini A14 eroaa sekvenssiltään radikaalisti luontaisesta proteiinista tunnistusalakohdan suhteen. Sekvens-sispesifisyyden saivat 10:ssä karakterisoiduista 11 proteiinista aikaan erot kompleksin stabiiliudessa. Vain yhden proteiinin, G6:n, spesifisyys saavutettiin dramaattisella 15 assosiaationopeuden muutoksella. Tutkittaessa assosiaatio- j nopeuden muuttumista proteiinin varauksen muuttumisen funktiona ei paljastunut korrelaatiota.
Esimerkki 12
Dimeerinen sinkkisormikonstruktio 20 Keksinnön mukaisia sinkkisormiproteiineja voidaan käsitellä laajennettuja kohdesekvenssejä tunnistaviksi ja niihin sitoutuviksi. Voidaan esimerkiksi fuusioida noin 2-12 sinkkisormea, Zif(2) - Zif(12), sisältäviä sinkkisormiproteiineja Jun/Fos-proteiinien, proteiiniperheen 25 bZIP prototyyppijäsenten, leusiinivetoketjualueisiin [O'Shea et ai., Science 254 (1991) 539]. Sinkkisormiproteiineja voidaan vaihtoehtoisesti fuusioida muihin proteiineihin, joilla on kyky muodostaa heterodimeerejä ja jotka sisältävät dimerisaatioalueita. Mainitunlaiset proteiinit 30 lienevät tuttuja ammattimiehille.
Jun/Fos-leusiinivetoketjut suosivat heterodimeerien muodostumista ja mahdollistavat 12 - 72 emäsparin tunnistamisen. Jun/Fos tarkoittaa tästedes näiden proteiinien leusiinivetoketjualueita. Sinkkisormiproteiineja fuusioi-35 daan alueeseen Jun ja riippumattomasti alueeseen Fos mene- 99 telmillä, joita käytetään alalla yleisesti proteiinien kytkemiseen. Kun Zif-Jun- ja Zif-Fos-konstruktiot (kuvio 13 ja vastaavasti 14) on puhdistettu, proteiinit sekoitetaan, ja ne muodostavat spontaanisti Zif-Jun/Zif-Fos-hete-5 rodimeerin. Vaihtoehtoisesti näitä proteiineja koodattavien geenien rinnakkaisilmentäminen johtaa Zif-Jun/Zif-Fos-heterodimeerien muodostumiseen in vivo. Fuusiointi N-terminaalisen tumasijoittumissignaalin kanssa mahdollistaa ilmentymisen kohdentamisen tumaan [Calderon et ai., 10 Cell 41 (1982) 499]. Myös aktivaatioalueita voidaan sisällyttää toiseen tai kumpaankin leusiinivetoketjufuusio-konstruktioon transkriptioaktivaattorien tuottamiseksi [Sadowski et ai., Gene 118 (1992) 137]. Nämä dimeeriset konstruktiot mahdollistavat sitten transkription spesifi-15 sen aktivaation tai repression. Nämä heterodimeeriset Zif-konstruktiot ovat edullisia, sillä ne mahdollistavat palindromisekvessien (jos sekä alueella Jun että alueella Fos olevat sormet tunnistavat saman DNA- tai RNA-sekvens-sin) tai laajennettujen asymmetristen sekvenssien (jos 20 alueilla Jun ja Fos olevat sormet tunnistavat eri DNA- tai RNA-sekvenssit) tunnistamisen. Esimerkiksi palindromisek-venssin 5' - GGC CCA CGC | N 1 GCG TGG GCG - 3' 25 3' - GCG GGT GCG IN I xCGC ACC CGC - 5' (SEQ ID NO:37) tunnistaa Jun-dimeeri Zif268-Fos/Zif268 (x on mikä tahansa luku). Alakohtien välisen etäisyyden määräävät kohta, jossa Zif fuusioituu Jun- tai Fos-vetoketjualueiden kanssa, 30 ja Zif:n ja vetoketjualueiden välisen kytkijän pituus. Alakohtien välinen etäisyys määritetään sitoutumiskohtava-likointimenetelmällä, kuten on ammattimiehille tuttua [Thiesen et ai., Nucleic Acids Research 18 (1990) 3203]. Esimerkkinä laajennetun asymmetrisen sekvenssin tunnista-35 misesta on Zif (C7 )6-Jun/Zif-268-Fos-dimeeri. Tämä proteiini 100 koostuu 6 C7-tyypin sormesta (esimerkki 11), jotka on kytketty Jun-alueeseen, ja kolmesta Zif268:sta, jotka on kytketty Fos-alueeseen, ja se tunnistaa seuraavan laajennetun sekvenssin: 5 5' - CGC CGC CGC CGC CGC CGC f N 1 GCG TGG GCG - 3' 3 ' - GCG GCG GCG GCG GCG GCG l N J x CGC ACC CGC - 5 ' (SEQ ID NO: 38).
10 Esimerkki 13
Moni sormi sten proteiinien konstruointi hyödyntämäl -lä Zi£268:n ensimmäisen sormen toistoja
Kun on mutagenisoitu ja valikoitu Zif268-proteiinin variantteja, joissa on muunnettu sormen 1 spesifisyyttä 15 tai affiniteettia (katso esimerkki 7), voidaan konstruoida useita sormikopioita sisältäviä proteiineja käyttämällä TGEKP-kytkijäsekvenssiä alalla tunnetuin menetelmin. Esimerkiksi C7-sormi voidaan konstruoida seuraavan kaavan mukaisesti: 20 MKLLEPYACPVESCDRRFSKSADLKRHIRHTGEKP-(YACPVESCDRRFSKSADLKHIRIHTGEKP) 1_11, jossa viimeisen kytkijän sekvenssi on muutoskohteena, sil-25 lä se on päässä eikä osallistu kahden sormen kytkemiseen toisiinsa. Kuviossa 15 esitetään yksi esimerkki kolmisormisesta C7-konstruktiosta. Tämä proteiini sitoutuu suunniteltuun kohdesekvenssiin GCG-GCG-GCG (SEQ ID NO: 32) oli-gonukleotidihiusneulassa CCT-CGC-CGC-CGC-GGG-TTT-TCC-CGC-30 GCC-CCC GAG G affiniteetilla 9 nM, jota voidaan verrata affiniteettiin 300 nM, joka saadaan oligonukleotidille, jossa on kooditettuna sekvenssi GCG-TGG-GCG (määritettynä pintaplasmoniresonanssitutkimuksin). On konstruoitu proteiineja, jotka sisältävät 2-12 C7-sormikopiota, ja niiden 35 on osoitettu olevan spesifisiä ennustettujen kohteidensa il 101 suhteen ELISAlla määritettynä (katso esimerkiksi esimerkki 7). Käytettävien sormien ei tarvitse olla identtisiä, ja niitä voidaan sekoittaa ja sovittaa yhteen, niin että saadaan proteiineja, jotka tunnistavat toivotun kohdesekvens-5 sin. Niitä voidaan hyödyntää myös leusiinivetoketjujen (esimerkiksi Fos/Jun) yhteydessä laajennetun sekvenssin tunnistavien proteiinien tuottamiseksi.
Sormen 1 polymeerien tuottamisen lisäksi voidaan fuusioida koko kolmisorminen Zif268 ja sen muunnettuja 10 versioita käyttämällä konsensus-kytkijää TGEKP laajennettuja tunnistuskohtia sisältävien proteiinien tuottamiseksi. Kuviossa 16 esitetään esimerkiksi proteiinin Zif268-Zif268 sekvenssi, jossa luonnossa esiintyvä proteiini on fuusioitu itsensä kanssa käyttämällä TGEKP-kytkijää. Tämä 15 proteiini sitoutuu ELlSA-määrityksen mukaan sekvenssiin GCG-TGG-GCG-GCG-TGG-GCG. Niinpä sekvenssejä, joissa on tehty muuntamisia Zif268:n kolmessa sormessa, voidaan fuusioida yhteen laajennettuja sekvenssejä tunnistavan proteiinin muodostamiseksi. Näitä uusia sinkkiproteiineja voi-20 daan käyttää haluttaessa myös yhdessä leusiinivetoketjujen kanssa, kuten kuvataan esimerkissä 12.
: 102
Sekvenssillsta (X) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE
(ii) TITLE OF INVENTION: ZINC FINGER PROTEIN DERIVATIVES AND 5 METHODS THEREFOR
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 31 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS : (A) ADDRESSEE: Spensley Horn Jubas & Lubitz 10 (B) STREET: 1880 Century Park East, Suite 500 (C) CITY: Los Angeles (D) STATE: California
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 90067 15 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 20 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: PCT/US95/ (B) FILING DATE: 18-JAN-1995 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: 25 (A) NAME: Haile, Lisa A., Ph.D.
(B) REGISTRATION NUMBER: 38,347 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: FD-4083 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 619-455-5100 30 (B) TELEFAX: 619-455-5110' (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:1: 103 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 25 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single 5 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..25 10 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Where Tyr appears, Tyr can also be Phe" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l:
Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 15 10 15 15 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 base pairs 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE:
25 (B) CLONE: ZF
(ix) FEATURE:
(A) NA^E/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..36 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: 30 ATGAAACTGC TCGAGCCCTA TGCTTGCCCT GTCGAG 36 104 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 45 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 5 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: ZR
10 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..45 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: GAGGAGGAGG AGACTAGTGT CCTTCTGTCT TAAATGGATT TTGGT 45 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 273 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 20 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) ' (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: zif268Xho-Spe (ix) FEATURE:
25 (A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..273 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: ..................... - ..... - - - m 105 CTC GAG CCC TAT GCT TGC CCT GTC GAG TCC TGC GAT CGC CGC TTT TCT 4 8 Leu Glu Pro Tyr Ala Cys Pro Vai Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser 15 10 15 CGC TCG GAT GAG CTT ACC CGC CAT ATC CGC ATC CAC ACA GGC CAG AAG 9S 5 Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gin Lys 20 25 30 CCC TTC CAG TGT CGA ATA TGC ATG CGT AAC TTC AGT CGT AGT GAC CAC 144 Pro Phe Gin Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His 35 40 45 10 CTT ACC ACC CAC ATC CGC ACC CAC ACA GGC GAG AAG CCT TTT GCC TGT 192
Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys 50 55 50 GAC ATT TGT GGG AGG AAG TTT GCC AGG AGT GAT GAA CGC AAG AGG CAT 240 Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His 15 65 70 75 80 ACC AAA ATC CAT TTA AGA CAG AAG GAC ACT AGT 273
Thr Lys Ile His Leu Arg Gin Lys Asp Thr Ser 85 90 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: 20 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 91 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein I
25 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
Leu Glu Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser 15 10 15
Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg He His Thr Gly Gin Lys 20 25 30 30 Pro Phe Gin Cys Arg He Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His 35 40 45 106
Leu Thr Thr His lie Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys 50 55 60
Asp lie Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His 65 70 75 80 5 Thr Lys lie His Leu Arg Gin Lys Asp Thr Ser 85 90 (2) INFORMATION.FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs 10 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE: 15 (B) CLONE: FTX3 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..22 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: 20 GCAATTAACC CTCACTAAAG GG 22 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 1 25 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: BZF3 107 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..21 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: 5 GGCAAACTTC CTCCCACAAA T 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 60 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 10 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: ZF36K
15 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..60 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO : 8 : ATTTGTGGGA GGAAGTTTGC CNNKAGTNNK NNKNNKNNKN NKCATACCAA AATCCATTTA 60 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 25 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 108 (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: R3B
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
5 (B) LOCATION: 1..21 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: TTGATATTCA CAAACGAATG G 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 10 (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 15 (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: ZFNsi-B
(ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS (B> LOCATION: 1..21 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :10: CATGCATATT CGACACTGGA A 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs 25 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 109 (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: ZF2r6F
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
5 (B) LOCATION: 1..66 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:ll: CAGTGTCGAA TATGCATGCG TAACTTCNNK NNKNNKNNKN NKNNKACCAC CCACATCCGC 60 ACCCAC 66 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: 10 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: AFI6rb (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
20 (B) LOCATION: 1..66 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: CTGGCCTGTG TGGATGCGGA TATGMNNMNN MNNMNNMNNC GAMNNAGAAA AGCGGCGATC 60 GCAGGA 66 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: 25 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 110 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: ZFIF
5 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..24 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: CATATCCGCA TCCACACAGG CCAG 24 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single 15 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :14:
Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 25 (A) LENGTH: 6 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear .......... . g 111 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..6 5 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :15:
Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 10 (A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 15 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..34 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :16: CGTAAATGGG CGCCCTTTTG GGCGCCCATT TACG 34 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single 25 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 112 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: 5 Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids 10 (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 15 (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
Trp Ser lie Pro Val Leu Leu His 1 5 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single .
25 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 113 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :19:
Trp Ser Leu Leu Pro Val Leu His 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :20: 5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20: 15 Phe Ser Phe Leu Leu Pro Leu His 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids 20 (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 25 (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: .
114
Leu Ser Thr Trp Arg Gly Trp His 1 5 ¢2} INFORMATION FOR SEQ ID NO :22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 5 (A) LENGTH: 8 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 10 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:
Thr Ser lie Gin Leu Pro Tyr His 15 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 61 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 20 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
25 . (B) LOCATION: 1..61 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23: TGATCTCAGA AGCCAAGCAG GGTCGGGCCT GGTTAGTACT TGGATGGGAG ACCGCCTGGG 60 A 61 115 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 amino acids (B) TYPE: amino acid 5 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide 10 (B) LOCATION: 1..26 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :24:
Tyr lie Cys Ser Phe Ala Asp Cys Gly Ala Ala Tyr Asn Lys Asn Trp 15 10 15
Lys Leu Gin Ala His Leu Cys Lys His Thr 15 20 25 , (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 amino acids (B) TYPE: amino acid 20 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide 25 (B) LOCATION: 1..26 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:
Phe Pro Cys Lys Glu Glu Gly Cys Glu Lys Gly Phe Thr Ser Leu His 15 10 15 116
His Leu Thr Arg His Ser Leu Thr His Thr 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 5 (A) LENGTH: 26 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 10 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..26 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:
Phe Thr Cys Asp Ser Asp Gly Cys Asp Leu Arg Phe Thr Thr Lys Ala 15 1 5 10 15
Asn Met Lys Lys His Phe Asn Arg Phe His 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 20 (A) LENGTH: 13 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 25 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..13 • (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :27: 117 TGGATGGGAG ACC 13 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 8 amino acids 5 (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 10 (A) NAME/KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..8 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:
Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His 1 5 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 20 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..21 25 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29: GTCCATAAGA TTAGCGGATC C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 118 (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..21 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30: 10 GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA G 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 15 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
20 (B) LOCATION: 1..34 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ'ID NO:31: CCTGCGTGGG CGCCCTTTTG GGCGCCCACG CAGG 34 119
Vaikka keksintöä on kuvattu viitaten tällä hetkellä edulliseen suoritusmuotoon, tulisi ymmärtää, että voidaan tehdä erilaisia modifikaatioita poikkeamatta keksinnön hengestä. Niinpä keksintöä rajoittavat ainoastaan seuraa-5 vat patenttivaatimukset.

Claims (7)

120
1. Menetelmä eristetyn nukleotideihin sitoutuvan sinkkisormipolypeptidivariantin aikaansaamiseksi, joka si- 5 toutuu sellulaariseen ennaltamäärättyyn nukleotidisekvens-siin, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää sen, että a) identifioidaan tunnetun sinkkisormi-nukleotidia sitovan polypeptidin sinkkisormissa olevat aminohapot, jotka sitoutuvat ensimmäiseen sellulaariseen nukleotidisek- 10 venssiin, jolloin polypeptidi käsittää vähintään kaksi tunnetuin sinkkisormi-nukleotidia sitovan polypeptidin sinkki-sormimodulia, jolloin jokaisen modulin aminohapposekvenssi, joka sitoutuu ennaltamäärättyyn nukleotidisekvenssiin, käsittää kaksi kysteiiniä ja kaksi histidiiniä, jolloin mo- 15 lemmat kysteiinit ovat aminoproksimaalisesti molempiin his-tidiineihin; b) muodostetaan ekspressiokirjasto, joka koodaa po- lypeptidejä, jotka sisältävät ainakin yhden edellä olevassa vaiheessa a) identifioidun aminohapon satunnaistetun subs- 20 tituution ainakin yhdessä sormista; c) saatetaan kirjasto ilmentymään sopivassa isäntä- solussa; d) eristetään klooni, joka tuottaa polypeptidivari-anttia, joka sitoutuu ennaltamäärättyyn nukleotidisekvens- 25 siin, jolloin saadaan sinkkisormi nukleotidia sitova poly peptidi variantti, joka sitoutuu nukleotidisekvenssiin solussa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kirjasto ilmennetään faagipintailmenty- 30 misjärjestelmässä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että faagi-ilmentymisjärjestelmä sisältää pelkistävää reagenssia, joka mahdollistaa ilmentymistuotteiden laskostumisen faagin pinnalle. 121
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pelkistävä reagenssi on ditiotreitoli.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kirjasto satunnaistetaan PCR:llä käyttä- 5 mällä alukkeita, jotka sisältävät degeneroituja tripletti- kodoneja määritettyjä aminohappoja vastaavissa sekvenssin kohdissa.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sellulaarinen nukleotidisek- 10 venssi on DNA.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sellulaarinen nukleotidisek-vens s i on RNA. 122
FI962879A 1994-01-18 1996-07-17 Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä FI121014B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18311994A 1994-01-18 1994-01-18
US18311994 1994-01-18
US31260494A 1994-09-28 1994-09-28
US31260494 1994-09-28
US9500829 1995-01-18
PCT/US1995/000829 WO1995019431A1 (en) 1994-01-18 1995-01-18 Zinc finger protein derivatives and methods therefor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI962879A0 FI962879A0 (fi) 1996-07-17
FI962879A FI962879A (fi) 1996-09-17
FI121014B true FI121014B (fi) 2010-06-15

Family

ID=26878774

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI962879A FI121014B (fi) 1994-01-18 1996-07-17 Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä
FI20105336A FI122725B (fi) 1994-01-18 2010-03-31 Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20105336A FI122725B (fi) 1994-01-18 2010-03-31 Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0770129B1 (fi)
JP (1) JP4012243B2 (fi)
AT (1) ATE310812T1 (fi)
AU (1) AU704601B2 (fi)
CA (2) CA2681922C (fi)
DE (1) DE69534629D1 (fi)
FI (2) FI121014B (fi)
NO (1) NO325015B1 (fi)
WO (1) WO1995019431A1 (fi)

Families Citing this family (278)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA2105300C (en) 1991-03-01 2008-12-23 Robert C. Ladner Process for the development of binding mini-proteins
US6140466A (en) * 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
AU698152B2 (en) 1994-08-20 1998-10-22 Gendaq Limited Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA
GB9824544D0 (en) * 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) * 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5919912A (en) * 1995-08-04 1999-07-06 University Of Ottawa Mammalian IAP antibodies and diagnostic kits
US6156535A (en) 1995-08-04 2000-12-05 University Of Ottawa Mammalian IAP gene family, primers, probes, and detection methods
GB9601108D0 (en) 1996-01-19 1996-03-20 Univ Ottawa Neuronal apoptosis inhibitor protein (NAIP)
US6133437A (en) * 1997-02-13 2000-10-17 Apoptogen, Inc. Modulation of IAPs for the treatment of proliferative diseases
EP0840617B1 (en) 1996-04-26 2008-06-18 University Of Ottawa Use of naip or iap for the treatment and prevention of neuronal disease
US5925566A (en) * 1996-06-06 1999-07-20 University Of Massachusetts Non-activated receptor complex proteins and uses thereof
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
AU2007201586B2 (en) * 1997-05-27 2010-12-23 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU2002300619B2 (en) * 1997-05-27 2007-04-26 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
WO1999021991A1 (en) * 1997-10-29 1999-05-06 Shanghai Second Medical University Bmzf12: a zinc finger gene cloned from bone marrow
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
CA2321938C (en) 1998-03-02 2009-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6977154B1 (en) 1998-03-17 2005-12-20 Gendaq Limited Nucleic acid binding proteins
US6140081A (en) * 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
IL150069A0 (en) 1999-12-06 2002-12-01 Sangamo Biosciences Inc Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US7151201B2 (en) 2000-01-21 2006-12-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
AU2693501A (en) 2000-01-24 2001-07-31 Gendaq Ltd Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
WO2001053478A2 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Gendaq Limited Methods for regulating transcription in plants by introduction of engireed zinc finger polypeptides
US6689558B2 (en) 2000-02-08 2004-02-10 Sangamo Biosciences, Inc. Cells for drug discovery
US6610489B2 (en) 2000-04-28 2003-08-26 Sangamo Biosciences, Inc. Pharmacogenomics and identification of drug targets by reconstruction of signal transduction pathways based on sequences of accessible regions
US7923542B2 (en) 2000-04-28 2011-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Libraries of regulatory sequences, methods of making and using same
WO2001083819A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for designing exogenous regulatory molecules
US7217509B2 (en) 2000-04-28 2007-05-15 Sangamo Biosciences, Inc. Databases of regulatory sequences; methods of making and using same
AU2001252428A1 (en) * 2000-05-08 2001-11-20 Gendaq Limited Nucleic acid binding polypeptides
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
WO2002008286A2 (en) * 2000-07-21 2002-01-31 Syngenta Participations Ag Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US20030082561A1 (en) * 2000-07-21 2003-05-01 Takashi Sera Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US6673917B1 (en) 2000-09-28 2004-01-06 University Of Ottawa Antisense IAP nucleic acids and uses thereof
AU2002228841C1 (en) 2000-12-07 2006-11-23 Sangamo Biosciences, Inc Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7273923B2 (en) 2001-01-22 2007-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US7067617B2 (en) 2001-02-21 2006-06-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
NZ527476A (en) * 2001-02-21 2006-06-30 Novartis Ag Zinc finger binding domains for nucleotide sequence ANN
WO2003027247A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
IL164228A0 (en) 2002-03-27 2005-12-18 Aegera Therapeutics Inc Antisense iap nucleobase oligomers and uses thereof
EP1529112A2 (en) 2002-08-07 2005-05-11 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
EP1576178A4 (en) 2002-12-26 2008-03-05 Syngenta Participations Ag POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH CELL PROLIFERATION AND USES THEREOF
ATE514781T1 (de) 2003-04-15 2011-07-15 Basf Plant Science Gmbh Nukleinsäuresequenzen, die für proteine in zusammenhang mit abiotischer stressreaktion kodieren, sowie pflanzenzellen und pflanzen mit erhöhter umweltstressverträglichkeit
US20120196370A1 (en) 2010-12-03 2012-08-02 Fyodor Urnov Methods and compositions for targeted genomic deletion
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
ES2808687T3 (es) 2003-08-08 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para escisión dirigida y recombinación
WO2005028630A2 (en) 2003-09-19 2005-03-31 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression
US8012944B2 (en) 2003-10-30 2011-09-06 Pharmascience Inc. Method for treating cancer using IAP antisense oligomer and chemotherapeutic agent
WO2005100393A1 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating cardiac contractility
US20060063231A1 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
AU2005286428B2 (en) 2004-09-24 2012-08-23 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
EP1645633B1 (en) 2004-10-05 2011-09-21 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP2163634A1 (en) 2004-12-08 2010-03-17 SunGene GmbH Expression cassettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
CN101142317A (zh) 2005-01-14 2008-03-12 圭尔夫大学 氮调节的糖感应基因和蛋白质及其调节
CN101155922A (zh) 2005-02-09 2008-04-02 巴斯福植物科学有限公司 在单子叶植物中调控表达的表达盒
CA2598307C (en) 2005-02-26 2014-12-30 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1869075B1 (en) 2005-02-28 2012-04-11 Sangamo BioSciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
JP2009502170A (ja) 2005-07-26 2009-01-29 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 外来核酸配列の標的化された組込み及び発現
EP1915452A2 (en) 2005-08-12 2008-04-30 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences encoding proteins associated with abiotic stress response and plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
US8222028B2 (en) 2005-09-08 2012-07-17 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
JP2009520463A (ja) 2005-11-28 2009-05-28 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｔｎｎのための亜鉛フィンガー結合ドメイン
EP2343376A3 (en) 2006-03-24 2011-11-23 BASF Plant Science GmbH Proteins associated with abiotic stress response and homologs
JP5266210B2 (ja) 2006-05-25 2013-08-21 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変開裂ハーフドメイン
EP2447279B1 (en) 2006-05-25 2014-04-09 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
US9428756B2 (en) 2006-08-11 2016-08-30 Dow Agrosciences Llc Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
CN101589148B (zh) 2006-10-13 2014-07-02 巴斯福植物科学有限公司 产量提高的植物
WO2008060510A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
HUE029238T2 (en) 2006-12-14 2017-02-28 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
EP2074219B1 (en) 2007-02-16 2013-11-20 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
ATE489465T1 (de) 2007-04-26 2010-12-15 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
AU2008252996B2 (en) 2007-05-22 2014-01-30 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production
WO2008142167A2 (en) 2007-05-23 2008-11-27 Syngenta Participations Ag Polynucleotide markers
EP2171052B1 (en) 2007-07-12 2014-08-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (fut 8) gene expression
CN103695459A (zh) 2007-09-18 2014-04-02 巴斯夫植物科学有限公司 产量提高的植物
CN101939435A (zh) 2007-09-21 2011-01-05 巴斯夫植物科学有限公司 具有增加的产量的植物
US20110014616A1 (en) 2009-06-30 2011-01-20 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
EP2188384B1 (en) 2007-09-27 2015-07-15 Sangamo BioSciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US11235026B2 (en) 2007-09-27 2022-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
WO2009042164A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
WO2009054985A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
CA2704271C (en) 2007-12-03 2016-07-19 Syngenta Participations Ag Engineering enzymatically susceptible phytases
BRPI0821748A2 (pt) 2007-12-19 2019-09-24 Basf Plant Science Gmbh método para produzir uma planta com rendimento aumentado, molécula isolada de ácido nucleico, construção de ácido nucleico, vetor, processo para produzir um polipeptídeo, polipeptídeo, anticorpo, núcleo de célula de planta, célula de planta, tecido de planta, material de propagação, semente, pólen, progênie, ou uma parte de planta, ou uma planta com rendimento aumento, processo para a indentificação de um composto, método para a produção de uma composição agrícola, composição, polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico, uso dos ácidos nucléicos, e, método para a indentificação de uma planta com um rendimento aumentado
CA2716180A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield
ES2459880T3 (es) 2008-04-14 2014-05-12 Sangamo Biosciences, Inc. Construcciones donantes lineales para integración dirigida
AU2009260888B2 (en) 2008-05-28 2014-09-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
US8597912B2 (en) 2008-06-10 2013-12-03 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for generation of Bax-and Bak-deficient cell lines
WO2010020654A2 (en) 2008-08-19 2010-02-25 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof
KR20160015400A (ko) 2008-08-22 2016-02-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
US20110195843A1 (en) 2008-09-23 2011-08-11 Basf Plant Science Gmbh Plants with Increased Yield (LT)
CN102264907A (zh) 2008-10-23 2011-11-30 巴斯夫植物科学有限公司 产量增加的植物(nue)
AR073969A1 (es) 2008-10-23 2010-12-15 Basf Plant Science Gmbh Un metodo para producir una celula transgenca con mayor contenido de acido gamma aminobutirico ( gaba)
AU2009311697B2 (en) 2008-10-29 2014-12-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression
WO2010065123A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
CA2747124C (en) 2008-12-17 2018-09-04 Dow Agrosciences Llc Targeted integration into the zp15 locus
JP5827132B2 (ja) 2009-02-04 2015-12-02 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ニューロパチーを治療するための方法および組成物
EP2408921B1 (en) 2009-03-20 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
WO2010117464A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
MX2012000928A (es) 2009-07-23 2012-03-29 Basf Plant Science Co Gmbh Plantas con produccion aumentada.
JP5866283B2 (ja) 2009-07-28 2016-02-17 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド トリヌクレオチド反復疾患を治療するための方法および組成物
KR102262704B1 (ko) 2009-08-11 2021-06-09 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체
UA109418C2 (uk) 2009-10-22 2015-08-25 Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
WO2011061656A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Basf Plant Science Company Gmbh Plants with increased yield
WO2011090804A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Dow Agrosciences Llc Targeted genomic alteration
WO2011097036A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
EP2534163B1 (en) 2010-02-09 2015-11-04 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
JP5952263B2 (ja) 2010-04-26 2016-07-13 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ジンクフィンガーヌクレアーゼを使ったｒｏｓａ遺伝子座のゲノム編集
WO2011139349A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
CN103025344B (zh) 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
CN102985153B (zh) 2010-06-16 2015-02-11 日东电工株式会社 防水透气过滤器及其用途
JP6050230B2 (ja) 2010-07-21 2016-12-21 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｌａ遺伝子座の修飾のための方法及び組成物
US9566352B2 (en) 2010-09-27 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inhibiting viral entry into cells
ES2562421T3 (es) 2010-10-12 2016-03-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Métodos y composiciones para tratar la hemofilia B
US9267123B2 (en) 2011-01-05 2016-02-23 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene correction
CA2828196A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Basf Plant Science Company Gmbh Promoters for regulating expression in plants
CA2841541C (en) 2011-07-25 2019-11-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
SG10201811736QA (en) 2011-09-21 2019-02-27 Sangamo Therapeutics Inc Methods and compositions for regulation of transgene expression
EP2768950B1 (en) 2011-10-20 2018-03-07 University of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
WO2013063315A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
JP6144691B2 (ja) 2011-11-16 2017-06-07 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 修飾されたｄｎａ結合タンパク質およびその使用
EP2820159B1 (en) 2012-02-29 2019-10-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
KR102091298B1 (ko) 2012-05-02 2020-03-19 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 말산 탈수소효소의 표적화된 변형
JP6559063B2 (ja) 2012-05-07 2019-08-14 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物
US20150184166A1 (en) 2012-06-15 2015-07-02 Uinversity of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
EP2872154B1 (en) 2012-07-11 2017-05-31 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
EP3444342B1 (en) 2012-07-11 2020-05-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
KR102474010B1 (ko) 2012-08-29 2022-12-02 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US9914930B2 (en) 2012-09-07 2018-03-13 Dow Agrosciences Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
JP6401704B2 (ja) 2012-10-10 2018-10-10 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞を修飾する化合物およびその使用
AU2013355327A1 (en) 2012-12-05 2015-06-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
RU2015128052A (ru) 2012-12-13 2017-01-19 Дау Агросайенсиз Ллс Точный таргетинг генов в отношении конкретного локуса кукурузы
JP6491113B2 (ja) 2013-02-25 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物
CA2906970C (en) 2013-03-21 2021-05-18 Ospedale San Raffaele Srl Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
EP2981166B1 (en) 2013-04-05 2020-09-09 Dow AgroSciences LLC Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
JP6588438B2 (ja) 2013-08-28 2019-10-09 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物
CA2926078C (en) 2013-10-17 2021-11-16 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
CN105899665B (zh) 2013-10-17 2019-10-22 桑格摩生物科学股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物
EP3066202B1 (en) 2013-11-04 2021-03-03 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
TWI721478B (zh) 2013-11-04 2021-03-11 美商陶氏農業科學公司 最適玉米基因座（二）
TWI659103B (zh) 2013-11-04 2019-05-11 陶氏農業科學公司 最適大豆基因座（二）
EP3065540B1 (en) 2013-11-04 2021-12-15 Corteva Agriscience LLC Optimal maize loci
US10369201B2 (en) 2013-11-11 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating Huntington's disease
SI3068881T1 (sl) 2013-11-13 2019-05-31 Children's Medical Center Corporation Z nukleazo posredovano uravnavanje izražanja genov
JP6535684B2 (ja) 2013-12-09 2019-06-26 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ゲノム操作のための方法および組成物
CA2939942A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
WO2015143046A2 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
WO2015171932A1 (en) 2014-05-08 2015-11-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
US9970001B2 (en) 2014-06-05 2018-05-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CA2954201A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
EP3169778B1 (en) 2014-07-14 2023-10-25 Washington State University Nanos knock-out that ablates germline cells
US11278572B2 (en) 2014-07-18 2022-03-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reducing CXCR4 expression and/or function to enhance engraftment of hematopoietic stem cells
WO2016014794A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
US9757420B2 (en) 2014-07-25 2017-09-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene editing for HIV gene therapy
WO2016019144A2 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
EP3878948A1 (en) 2014-09-16 2021-09-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering and correction in hematopoietic stem cells
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
EP3247366A4 (en) 2015-01-21 2018-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
AR103649A1 (es) 2015-02-11 2017-05-24 Basf Se Hidroxifenilpiruvato dioxigenasas resistentes a herbicidas
WO2016161446A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
SG10202112057QA (en) 2015-05-12 2021-12-30 Sangamo Therapeutics Inc Nuclease-mediated regulation of gene expression
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
CA2991301A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP4361279A2 (en) 2015-08-06 2024-05-01 The Curators of the University of Missouri Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes
EP3352776A4 (en) 2015-09-23 2019-03-13 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT REPRESSORS AND USES THEREOF
CA3004349A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
US11352631B2 (en) 2015-12-18 2022-06-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the T cell receptor
IL297018A (en) 2015-12-18 2022-12-01 Sangamo Therapeutics Inc Directed cleavage of cell mhc receptor
SG11201805680SA (en) 2016-01-15 2018-07-30 Sangamo Therapeutics Inc Methods and compositions for the treatment of neurologic disease
JP7012650B2 (ja) 2016-02-02 2022-01-28 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物
WO2017165655A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for enhancing the efficiency of gene editing
WO2018013840A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, compositions and kits for increasing genome editing efficiency
CA3031818A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Case Western Reserve University Compounds and methods of promoting myelination
US11193136B2 (en) 2016-08-09 2021-12-07 Vib Vzw Cellulose synthase inhibitors and mutant plants
BR112019003327A2 (pt) 2016-08-24 2019-07-02 Sangamo Therapeutics Inc nucleases manipuladas de alvo específico
IL264639B2 (en) 2016-08-24 2024-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of globulin gene expression using transgenic nucleases with zinc neurites
US10960085B2 (en) 2016-09-07 2021-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
EP3519433A1 (en) 2016-10-03 2019-08-07 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
DK3757120T3 (da) 2016-10-04 2022-07-25 Prec Biosciences Inc Co-stimulerende domæner til anvendelse i genetisk modificerede celler
CN110022904B (zh) 2016-10-20 2024-04-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗法布里病的方法和组合物
AU2017347928A1 (en) 2016-10-31 2019-05-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
AU2017367722B2 (en) 2016-12-01 2024-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof
CA3046199A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Case Western Reserve University Methods and compositions for enhancing functional myelin production
SG11201906948UA (en) 2017-04-20 2019-08-27 Univ Oregon Health & Science Human gene correction
AU2018261366A1 (en) 2017-05-03 2019-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CTFR) gene
CA3062698A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Precision Biosciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding an engineered antigen receptor and an inhibitory nucleic acid molecule and methods of use thereof
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
US11053484B2 (en) 2017-06-30 2021-07-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified T cells comprising a modified intron in the T cell receptor alpha gene
SG11202002728VA (en) 2017-10-03 2020-04-29 Juno Therapeutics Inc Hpv-specific binding molecules
US20200239544A1 (en) 2017-10-03 2020-07-30 Precision Biosciences, Inc. Modified epidermal growth factor receptor peptides for use in genetically-modified cells
WO2019089913A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a
SG11202004003YA (en) 2017-11-09 2020-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Genetic modification of cytokine inducible sh2-containing protein (cish) gene
IL276080B2 (en) 2018-01-17 2023-10-01 Vertex Pharma DNA-PK suppressor compounds, UTP-containing preparations and their uses
WO2019143675A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
KR20200110687A (ko) 2018-01-17 2020-09-24 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 퀴녹살리논 화합물, 조성물, 방법 및 키트
AU2019218118A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
PE20201345A1 (es) 2018-04-05 2020-11-25 Juno Therapeutics Inc Receptores de celulas t, y celulas disenadas que expresan los mismos
EP3775238A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
CA3095084A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Juno Therapeutics, Inc. T cells expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
CN112313246A (zh) 2018-04-18 2021-02-02 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于调节亨廷顿蛋白(htt)的锌指蛋白组合物
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
CA3109592A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
CN113015741A (zh) 2018-09-18 2021-06-22 桑格摩生物治疗股份有限公司 程序性细胞死亡1(pd1)特异性核酸酶
EP3898661A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Precision BioSciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
AU2020205717A1 (en) 2019-01-11 2021-08-12 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CN112805026A (zh) 2019-02-06 2021-05-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗i型黏多糖贮积症的方法
SG11202110776TA (en) 2019-04-02 2021-10-28 Sangamo Therapeutics Inc Methods for the treatment of beta-thalassemia
CA3135799A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir)
WO2020206231A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Precision Biosciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
TW202104249A (zh) 2019-04-23 2021-02-01 美商聖加莫治療股份有限公司 染色體9開放讀框72基因表現之調節子及其用途
BR112021021200A2 (pt) 2019-05-01 2021-12-21 Juno Therapeutics Inc Células expressando um receptor quimérico de um locus cd247 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos
BR112021021075A2 (pt) 2019-05-01 2021-12-14 Editas Medicine Inc Células que expressam um receptor recombinante de um locus de tgfbr2 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos
US20220273715A1 (en) 2019-07-25 2022-09-01 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
JP2022544825A (ja) 2019-08-20 2022-10-21 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． 細胞免疫療法のためのリンパ球枯渇投与レジメン
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US20230002459A1 (en) 2019-10-02 2023-01-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc Finger Protein Transcription Factors for Treatment of Prion Disease
EP4041754A1 (en) 2019-10-02 2022-08-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein transcription factors for repressing alpha-synuclein expression
WO2021087305A1 (en) 2019-10-30 2021-05-06 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
EP4051787A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Gin recombinase variants
US20230036065A1 (en) 2019-12-06 2023-02-02 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
AU2021209699A1 (en) 2020-01-22 2022-07-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger protein transcription factors for repressing tau expression
WO2021158915A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Precision Biosciences, Inc. Recombinant adeno-associated virus compositions and methods for producing and using the same
US20230263121A1 (en) 2020-03-31 2023-08-24 Elo Life Systems Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits
AU2021268253A1 (en) 2020-05-06 2022-12-08 Cellectis S.A. Methods for targeted insertion of exogenous sequences in cellular genomes
JP2023525510A (ja) 2020-05-06 2023-06-16 セレクティス ソシエテ アノニム 治療用タンパク質の送達のために細胞を遺伝子改変する方法
US20230183664A1 (en) 2020-05-11 2023-06-15 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
KR20230022868A (ko) 2020-05-13 2023-02-16 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법
EP4171616A1 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Juno Therapeutics GmbH Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
AU2021308681A1 (en) 2020-07-16 2023-03-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022035793A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
US20220064596A1 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
CN116261594A (zh) 2020-09-25 2023-06-13 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核碱基编辑的锌指融合蛋白
CA3197644A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger protein transcription factors for repressing alpha-synuclein expression
US20230365995A1 (en) 2020-10-07 2023-11-16 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
MX2023004761A (es) 2020-10-23 2023-07-17 Elo Life Systems Inc Metodos para producir plantas de vainilla con mejor sabor y produccion agronomica.
US20230398148A1 (en) 2020-11-04 2023-12-14 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
EP4243609A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 Pig Improvement Company UK Limited Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes
WO2022165111A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Precision Biosciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
US20240141311A1 (en) 2021-04-22 2024-05-02 North Carolina State University Compositions and methods for generating male sterile plants
WO2023064872A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Precision Biosciences, Inc. Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors
CA3235185A1 (en) 2021-10-19 2023-04-27 Cassandra GORSUCH Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
WO2023122722A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger fusion proteins for nucleobase editing
WO2023131616A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Vib Vzw Means and methods to increase abiotic stress tolerance in plants
WO2023131637A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Vib Vzw Improved silage grasses
WO2023144199A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Vib Vzw Plants having reduced levels of bitter taste metabolites
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US4990607A (en) * 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
US5243041A (en) * 1991-08-22 1993-09-07 Fernandez Pol Jose A DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin
US5302519A (en) * 1991-09-09 1994-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of producing a Mad polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
AU704601B2 (en) 1999-04-29
EP0770129A4 (en) 1999-02-03
FI122725B (fi) 2012-06-15
NO325015B1 (no) 2008-01-14
AU1686595A (en) 1995-08-01
FI20105336A (fi) 2010-03-31
NO962991D0 (no) 1996-07-17
FI962879A0 (fi) 1996-07-17
EP0770129A1 (en) 1997-05-02
EP0770129B1 (en) 2005-11-23
DE69534629D1 (de) 2005-12-29
ATE310812T1 (de) 2005-12-15
JPH09508019A (ja) 1997-08-19
CA2681922C (en) 2012-05-15
CA2681922A1 (en) 1995-07-20
WO1995019431A1 (en) 1995-07-20
CA2181548A1 (en) 1995-07-20
FI962879A (fi) 1996-09-17
NO962991L (no) 1996-09-18
CA2181548C (en) 2009-11-03
JP4012243B2 (ja) 2007-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121014B (fi) Sinkkisormiproteiinijohdannaisia ja niiden menetelmiä
US6242568B1 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP0988377B1 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP0781331B1 (en) Improvements in or relating to binding proteins for recognition of dna
CA2246378C (en) Isolation and use of sh3 binding peptides
JPH08506487A (ja) 全合成親和性試薬
Chen et al. Only one of the two DNA-bound orientations of AP-1 found in solution cooperates with NFATp
AU2005265150A1 (en) C-MET kinase binding proteins
JP2007259856A (ja) ＳｒｃＳＨ３結合性ペプチドとその分離法と利用法
JP2006526999A (ja) 伝達可能なｄｎａ−結合タンパク質
EP3355907A1 (en) Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
US5986055A (en) CDK2 interactions
JP2002541818A (ja) 高感度ファージ提示生体分子検出
US20050084885A1 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU6774887A (en) Human placenta angiogenic factor capable of stimulating capillary endothelial cell protease synthesis, dna synthesis and migration
JP4927546B2 (ja) ヘプタペプチドパターン及び細胞透過ドメインを含む相互作用ポリペプチド
Haffey et al. Site-specific cleavage of a fusion protein by renin
AU2007201586B2 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
Rondot et al. Epitopes fused to F-pilin are incorporated into functional recombinant pili
AU2002300619B2 (en) Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2412187A1 (en) Assay for identifying modulators of borrelia telomere resolvase
WO2002016610A1 (fr) Nouveau gene de la protease
JPH08506013A (ja) 白血球由来成長因子

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 121014

Country of ref document: FI

MA Patent expired