FI121013B - Transformoitu Gandida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla - Google Patents

Transformoitu Gandida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla Download PDF

Info

Publication number
FI121013B
FI121013B FI960331A FI960331A FI121013B FI 121013 B FI121013 B FI 121013B FI 960331 A FI960331 A FI 960331A FI 960331 A FI960331 A FI 960331A FI 121013 B FI121013 B FI 121013B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
dna
plasmid
fragment
candida utilis
Prior art date
Application number
FI960331A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI960331A0 (fi
FI960331A (fi
Inventor
Kenji Kondo
Susumu Kajiwara
Morihiko Misawa
Original Assignee
Kirin Brewery
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirin Brewery filed Critical Kirin Brewery
Publication of FI960331A0 publication Critical patent/FI960331A0/fi
Publication of FI960331A publication Critical patent/FI960331A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121013B publication Critical patent/FI121013B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

5
Transformoitu Candida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla
Keksinnön tausta Keksinnön ala
Keksintö liittyy Candida utiliksen transformaatio-järjestelmiin, joilla saadaan toistettavia tuloksia, ja 10 tarkemmin sanottuna Candida utilis -hiivan transformaatioon yhdistelmä-DNA:11a, ja heterologisten geenien ilmentämiseen tätä käyttäen aikaansaaduissa uusissa transformanteissa. Keksintö liittyy myös uusiin DNA-sek-vensseihin, joita voidaan käyttää selektiomarkkerigeenei-15 nä transformaatioon, ja uusiin DNA-sekvensseihin, joita voidaan käyttää promoottoreina tai terminaattoreina heterologisten geenien ilmentämiseen. Keksintö liittyy lisäksi menetelmiin, joilla heterologiset geenit saadaan liitettyä tehokkaasti hiivan kromosomeihin.
20
Keksintö liittyy lisäksi DNA-fragmentteihin, jotka sisältämiensä ominaisuuksien ansiosta kykenevät replikoitumaan autonomisesti sekä parantamaan transformaatiotehokkuutta Candida utiliksessa, menetelmiin sellaisten DNA-fragment-25 tien liittämiseksi kromosomiin, jotka eivät sisällä selektiomarkkerigeeniä, ja menetelmiin promoottori-aktiivisuutta sisältävien DNA-sekvenssien aikaansaamiseksi .
30 Tekniikan taso
Geenien muokkaustekniikan kehittyminen on tehnyt mahdolliseksi tuottaa suuria määriä käyttökelpoisia proteiineja mikro-organismien avulla. Tähän tarkoitukseen voidaan isäntinä käyttää vaikeuksitta prokaryootteja, kuten mui-35 den muassa Escherichia colia tai Bacillus subtilista, ja isäntänä käytetään useimmin E. colia. E. colissa tuotetut proteiinit päätyvät kuitenkin usein liukenemattomiin muotoihin, eivätkä ne kykene glykosyloitumaan erittymisen 2 jälkeen, joten nämä proteiinit eivät useista eri syistä ole tyydyttäviä. Lisäksi E. colin tuottamat pyrogeeniset toksiset tekijät on poistettava silloin, kun näin tuotettuja proteiineja on määrä käyttää lääkkeinä.
5 Käyttökelpoisten proteiinien tuottamiseen on näiden pro-karyoottisten systeemien käyttöä mielenkiintoisempaa käyttää isäntänä eukaryootteja, kuten hiivaa. Ensinnäkin Saccharomyces-suvun hiivojen tai Candida utilis -hiivan 10 tiedetään olevan hyvin turvallisia, koska Saccharomycestä on käytetty pitkään fermentaatiotuotteiden, kuten alkoholituotteiden, valmistamiseen ja Candida utilis -hiivaa on käytetty rehujen tuottoon. Lisäksi hiivaa voidaan kasvattaa tavallisesti käyttäen suurempaa solu-15 tiheyttä kuin mikä on asianlaita bakteerien kyseessä ollessa, sekä käyttämällä jatkuvaa kasvatusta. Hiiva erittää proteiineja mediumiin ja eritetty proteiini muokkautuu glykosyloitumalla. Proteiinien tuottoon kannattaa siten käyttää hiivaa, kun tällaisella modifikaatiolla on 20 merkitystä proteiinin biologiselle aktiivisuudelle.
Perusteellisimmin on tutkittu Saccharomyces-sukuun luokiteltuja hiivoja, joista on kertynyt geneettistä tietoa.
On tutkittu hiivojen käyttöä isäntinä useiden erilaisten 25 aineiden tuottamiseen. Saccharomyceksen lisäksi on vielä kehitetty joidenkin muiden hiivojen, kuten Pichia-, Hansenula-, Kluyveromyces- ja Candida-sukujen, trans-formaatiomenetelmiä, joiden hiivojen käyttöä isäntinä käyttökelpoisten aineiden tuottamiseen tutkitaan parhail-30 laan. Näistä on muun muassa Candida-sukuun luetuilla hii voilla ominaisuuksia, jotka ovat edullisia käytännön sovellutusten kannalta ja joita ei esiinny Saccharomyces-suvun hiivoilla, kuten laaja valikoima anabolisia hiili-lähteitä. Candida-suvun hiivaa odotetaan siten käytettä-35 vän käyttökelpoisten aineiden valmistamiseen yhdistelmä-DNA-menetelmillä.
3
Candida-suvun hiivoista kykenee Candida utilis käyttämään anabolisesta erinomaisesti hyväkseen pentooseja, kuten ksyloosia. Lisäksi toisin kuin Saccharomyces-suvun hiiva ei Candida utilis tuota aerobisissa olosuhteissa viljel-5 taessa etanolia, minkä johdosta sen kasvu ei inhiboidu.
Tästä syystä on mahdollista tuottaa soluja tehokkaasti viljelemällä Candida utilista jatkuvasti suuressa solu-tiheydessä. Siten Candida utilikseen on kiinnitetty huomiota proteiinilähteenä ja hiivaa on kerran tuotettu 10 teollisessa mittakaavassa käyttämällä lehtipuiden sokeri pitoista mahlaa tai suuria määriä pentooseja sisältävää sulfiittijätelientä. Yhdysvaltain FDA (Food and Drug Administration) on hyväksynyt hiivan, Candida utiliksen, samoin kuin Saccharomyces cerevisiaen että Saccharomyces 15 fragiliksen, hiivaksi, jota voidaan käyttää turvallisesti elintarvikelisäaineena. Candida utilista käytetään rehuina nykyäänkin monissa maissa, jotka ovat Saksa, Yhdysvallat, Taiwan ja Brasilia, joten sen turvallisuuden voidaan sanoa olevan varmistetun.
20
Sen lisäksi, että Candida utilista on käytetty mikrobi-proteiinina, sitä on käytetty laajalti teollisuudessa mikrobikantana pentoosien tai ksyloosin fermentoimiseen tai mikrobikantana etyyliasetaatin, L-glutamiinin, gluta-25 tionin, invertaasin tai näitä vastaavien materiaalien valmistamiseen.
Tähän mennessä ei ole kuitenkaan esitetty eikä osoitettu saatavan minkäänlaisia myönteisiä tuloksia käyttö-30 kelpoisen hiivan, Candida utiliksen, transformaatiosta. Transformaation arvellaan epäonnistuvan siitä syystä, että on erittäin hankalaa saada aikaan mutanttikantoja, joihin selektiomarkkeri, kuten asiaankuuluva ravinne-vaatimus, muodostettaisiin mutageneesikäsittelyllä käyt-35 tämällä tavanomaista mutageeniä, kuten nitrosoguanidiinia tai etyylimetaanisulfonihappoa. Tähän hankaluuteen voi olla syynä se, että Candida utilis on polyploidi, kuten 4 vähintään diploidi. Tähän johtopäätökseen voidaan myös tulla sillä perusteella, että vaikkakin muissa hiivoissa transformaatioon soveltuvina selektiomarkkereina usein käytettyjen Candida utiliksen geenien, kuten ADE1:n ja 5 LEU2:n, kloonauksesta on julkaistu tutkimusraportteja (Nishiya, et ai., japanilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu nro 66089/1992; Kobayashi, et ai., japanilainen patenttijulkaisu nro 42673/1989), niin ei ole kuvattu yhtään sellaista Candida utilis -isäntä-10 kantaa, jossa vastaava geeni sisältäisi mutaation. Tämä tarkoittaa sitä, että Candida utilikseen on miltei mahdotonta soveltaa tavanomaista menetelmää transformantin selektoimiseksi suoraan tuomalla isäntäkantaan tämän ravinnevaatimusta komplementoiva geeni, jota menetelmää 15 on käytetty useiden erilaisten hiivojen transformaatio-järjestelmän kehittämiseen.
Lisäksi Candida utiliksella on korkea ploidisuusaste eikä se kykene sporuloimaan, joten sen geneettisiä ominaisuuk-20 siä ei ole täysin selvitetty. Siten transformaatioon tar vittavat olosuhteet sekä vektorijärjestelmälle asetettavat ehdot ovat jääneet tuntemattomaksi, joten isäntä/ vektori-järjestelmän luomisen odotetaan olevan erittäin vaikeaa.
25
Ho, et ai. ovat kuvannet transformaatiota koskevia alustavia kokeita lääkeaineresistenssimarkkerin avulla Candida utiliksella (Ho, N.W.Y., Biotechnology and Bioengineering Symp. No. 14, 295 - 301, 1984). Tämä 30 tutkimusraportti on epätäydellinen, koska tässä julkaisussa ei ole kuvattu transformaatiokokeessa käytettyjä olosuhteita eikä koetuloksia, kuten lääkeaineresistentil-le transformantille suoritettua Southern-blottianalyysiä, jota tarvitaan transformaation varmistamiseksi.
35 Tästä syystä on vielä haluttua luoda toistettavia tuloksia tuottava transf ormaatioj ärj estelmä Candida ut Hik- 5 selle ja käyttökelpoisten aineiden tuotantotekniikka tätä järjestelmää käyttäen.
Keksinnön yhteenveto 5 Tässä keksinnössä on Candida utilis -hiivasta onnistuttu saamaan toistettavasti transformantteja sekä monipuolista informaatiota heterologisten geenien ilmentymisestä transformantissa. Tämä keksintö perustuu näille tiedoille.
10 Tämän keksinnön tavoitteena on siten saattaa käyttöön Candida utiliksen transformaatiojärjestelmä, jolla saadaan toistettavia tuloksia.
15 Tämän keksinnön toisena tavoitteena on saattaa käyttöön geenejä, jotka Candida utiliksen transformaatio-järjestelmässä ovat käyttökelpoisia selektiomarkkereina, kohdesekvensseinä plasmidin liittymiselle kromosomiin ja heterologisten geenien ilmentämiseen tarvittavina uusina 20 DNA-sekvensseinä, kuten promoottorina ja terminaattorina.
Vielä yksi tämän keksinnön tavoite on saattaa käyttöön vektorijärjestelmiä, joiden avulla on mahdollista ilmentää heterologisia geenejä Candida utiliksessa.
25
Vielä yksi tämän keksinnön tavoite on saattaa käyttöön isäntä/vektorijärjestelmä, johon voidaan pysyvästi liittää useita kappaleita heterologisia geenejä.
30 Vielä yksi tämän keksinnön tavoite on saattaa käyttöön menetelmä heterologisten geenien ilmentämiseksi Candida utiliksessa.
Tämän keksinnön tavoite on lisäksi saattaa käyttöön DNA-35 fragmentteja, jotka kykenevät replikoitumaan autonomisesti sekä toimimaan transformaatiotehokkuutta edistävällä tavalla, näitä fragmentteja sisältäviä plasmidi- 6 vektoreita, menetelmä DNA-fragmentin, joka ei sisällä selektiomarkkerigeeniä, liittämiseksi kromosomiin plasmidivektorin avulla, sekä menetelmä promoottori-aktiivisuutta sisältävien DNA-sekvenssien aikaansaamisek-5 si, ja tämän avulla saatuja promoottoriaktiivisuutta si sältäviä uusia DNA-sekvenssejä.
Tämän keksinnön mukaisia uusia DNA-sekvenssejä ovat Candida utiliksen ribosomaalista L41-proteiinia koodaava 10 geeni sekä sen promoottori- ja terminaattorisekvenssit; L41-sykloheksimidiresistenssigeeni; fosfoglyseraatti-kinaasi (PGK) -geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit ; glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAP) -geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit; 15 plasmamembraanin protoni-ATPaasi (PMA) -geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit; URA3-geeni ja sen promoottori- ja terminaattorisekvenssit; kaksi DNA-fragmenttia, jotka kykenevät replikoitumaan autonomisesti; promoottoriaktiivisuutta sisältävät sekvenssit; ja 20 Candida utiliksen rRNA-molekyylejä koodaavat ribo- somaalisen RNA:n geenit.
Vektori, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa Candida utiliksen transformaatiojärjestelmässä, sisältää 25 Candida utiliksen kromosomaalisen DNA:n suhteen homologi sen sekvenssin sekä selektiomarkkerigeenin, joka vektori on sellainen, että heterologinen geeni kykenee liittymään kromosomaaliseen DNA:hän homologisen rekombinaation avulla, tai sitten vektori sisältää Candida utiliksessa 30 autonomisesti replikoitumaan kykenevän DNA-sekvenssin sekä selektiomarkkerigeenin, joka vektori on sellainen, että Candida utiliksen transformaatio tapahtuu suurella frekvenssillä.
35 Lisäksi vektori, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa Candida utiliksen transformaatiojärjestelmässä, ei sisällä selektiomarkkerigeeniä mutta sisältää 7
Candida utiliksen kromosomaalisen DNA:n suhteen homologisen sekvenssin, joka vektori on sellainen, että heterologinen geeni kykenee integroitumaan kromosomaali-seen DNA:hän homologisen rekombinaation avulla. Tätä 5 plasmidia voidaan käyttää transformaatiossa yhdessä autonomisesti replikoitumaan kykenevän DNA-sekvenssin ja selektiomarkkerigeenin sisältävän plasmidin kanssa.
Selektiomarkkerigeeni, jota voidaan käyttää tämän keksin- 10 non mukaisessa Candida utiliksen transformaatiojärjestel- mässä, on lisäksi lääkeaineresistenssimarkkeri, joka voi toimia Candida utiliksessa, ja tämä on edullisesti syklo-heksimidiresistenssin antava L4l-geeni, G4i8-resistenssin antava geeni tai hygromysiini B -resistenssin antava gee-15 ni.
Lisäksi tämän keksinnön mukainen menetelmä heterologisten geenien ilmentämiseksi Candida utiliksessa sisältää sen, että Candida utilis transformoidaan tämän keksinnön mu-20 kaisella heterologisen geenin sisältävällä vektorilla, näin saatua transformanttia viljellään ja heterologisen geenin ilmentymistuote eristetään ja puhdistetaan viljelmästä .
25 Lisäksi tämän keksinnön mukainen Candida utilis - trans - formantti tarkoittaa transformanttia, joka on saatu yhdistämällä tämän keksinnön mukaisen uusi DNA-ryhmä, vektorijärjestelmät sekä muut näitä muistuttavat järjestelmät toiminnallisella tavalla toisiinsa.
30
Piirrosten lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on kuvaus restriktioentsyymikartasta, fosfo-glyseraattikinaasi (PGK) -geenin sisältävien plasmidien DNA -sekvenssin määrittämiseen käytetystä strategiasta ja 35 menetelmästä promoottori- ja terminaattorifragmenttien aikaansaamiseksi PCR:n avulla; 8 kuvio 2 on kuvaus PGK-terminaattorin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä; kuvio 3 on kuvaus PGK-promoottorin sisältävän DNA-frag-5 mentin DNA-sekvenssistä; kuvio 4 on kaavio ilmentämisvektoriplasmidien konstruoimisesta PGK-geenin promoottoria ja terminaattoria käyttäen; 10 kuvio 5 on kuvaus ribosomaalista DNA:ta sisältävien plas-midien restriktioentsyymikartoista; kuvio 6 on kuvaus ribosomaalisen DNA:n rakenteesta, DNA-15 sekvenssin määrittämiseen käytetystä strategiasta ja jatkokloonattujen plasmidien rakenteesta, jossa kuvio 6(a) on kuvaus plasmidien pCREl, pCRE2, pCRE3, pCRXl, pCRX2, pCRX3 ja pCRX4 rakenteista, ja kuvio 6(b) on kuvaus Candida utiliksen ribosomaalista DNA:ta sisältävän 20 noin 13,5 ke:n suuruisen DNA-fragmentin restriktio- entsyymikartasta; kuvio 7 on kuvaus URA3-geenin sisältävien plasmidien restriktioentsyymikartoista, ja siitä, miten nämä plasmi-25 dit kykenevät komplementoimaan Saccharomyces cerevisiaen ura3-mutaatiota; kuvio 8 on kuvaus URA3-geenin DNA-sekvenssin määrittämiseen käytettystä strategiasta ja tämän restriktio-30 entsyymikartasta; kuvio 9 on kuvaus URA3-geenin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä; 35 kuvio 10 on kuvaus URA3-geenin DNA-sekvenssin perusteella päätellystä aminohapposekvenssistä ja tätä koodaavan DNA:n DNA-sekvenssistä; 9 kuvio 11 on jatkoa kuvion 10 mukaiselle kuvaukselle, joka esittää URA3:n DNA-sekvenssistä pääteltyä aminohappo-sekvenssiä ja tätä koodaavaa DNA:n DNA-sekvenssiä; 5 kuvio 12 on kuvaus L41-geenin sisältävien plasmidien restriktioentsyymikartoista ja DNA-sekvenssin määrittämiseen käytetystä strategiasta; kuvio 13 on kuvaus L41-geenin sisältävän DNA-fragmentin 10 DNA-sekvenssistä; kuvio 14 on kuvaus L41-geenin DNA-sekvenssistä päätellystä aminohapposekvenssistä ja tätä koodaavan DNA:n DNA- sekvenssistä; 15 kuvio 15 on kuvaus plasmidien pLCBSlO ja pCLBS12 konstruktiosta ; kuvio 16 on kuvaus plasmidien pCLRE2, pCLRE3, pCLRXl ja 20 pCLRX2 konstruktiosta; kuvio 17 on kuvaus tuloksista, jotka on saatu tutkittaessa ATCC 9950:n elinkykyisten solujen ja transformanttien lukumäärän välistä suhdetta useissa erilaisissa elektro-25 poraatio-olosuhteissa; kuvio 18 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka koskevat pCLRE2-plasmidilla transformoidun ATCC 9950 -kannan DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia; 30 kuvio 19 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka koskevat pCLRE2-plasmidilla transformoitujen ATCC 9226, ATCC 9256 ja ATCC 9950 -kantojen DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia; 35 kuvio 20 on kuvaus plasmidien pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 ja pCLRE7 konstruktiosta; 10 kuvio 21 on kuvaus kuvio elektroforeesituloksista, jotka koskevat pCLRE4-, pCLRE5-, pCLRE6- ja pCLRE7-plasmideilla transformoitujen ATCC 9950 -kantojen DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia; 5 kuvio 22 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka koskevat pCLURAl-plasmidilla transformoidun ATCC 9950 -kannan DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia,· 10 kuvio 23 on kuvaus plasmidien PCLSTA1 ja PCLRSTA1 konstruktiosta ; kuvio 24 on kuvaus pCLRSTAl-plasmidilla transformoidun ATCC 9950 -kannan viljelmäsupernatantin SDS-polyakryyli-15 amidigeelielektroforeesituloksesta; kuvio 25 on kuvaus plasmidien pCLLACl ja pCLRLACl konstruktiosta ; 20 kuvio 26 on kuvaus plasmidien pCLAPHl ja pCLRAPHl konstruktiosta; kuvio 27 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka koskevat sellaisen pCLRAPHl-plasmidilla transformoidun ATCC 25 9950 -kannan DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia, joka on selektoitu käyttäen eri lääkeaineresistenssi-markkereita (CYHr: sykloheksimidiresistentti; G418r: G418-resistentti); 30 kuvio 28 on kuvaus plasmidien pCRE8, pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5 ja pCRAPHö konstruktiosta; kuvio 2 9 on kuvaus glyseraldehydi- 3 - fosfaattidehydro-genaasi (GAP) -geenin sisältävien plasmidien restriktio-35 entsyymikartoista, DNA-sekvenssin määrittämiseen käyte tystä strategiasta ja menetelmästä promoottori- ja terminaattorifragmenttien aikaansaamiseksi PCR:n avulla; 11 kuvio 30 on kuvaus GAP-geenin promoottorin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä; kuvio 31 on kuvaus GAP-geenin terminaattorin sisältävän 5 DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä; kuvio 32 on kuvaus GAP-geenin promoottorin ja terminaattorin sisältävien ilmentämisvektoriplasmidien konstruktiosta; 10 kuvio 33 on kuvaus plasmamembraanin protoni-ATPaasi (PMA) -geenin sisältävän plasmidin restriktioentsyymikartasta, DNA-sekvenssin määrittämiseen käytetystä strategiasta ja menetelmästä promoottori- ja terminaattorifragmenttien 15 aikaansaamiseksi PCR:n avulla; kuvio 34 on kuvaus PMA-geenin promoottorin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä; 20 kuvio 35 on kuvaus PMA-geenin terminaattorin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä; kuvio 36 on kuvaus PMA-geenin promoottorin ja terminaattorin sisältävien ilmentämisvektoriplasmidien konstruk-25 tiosta; kuvio 37 on kuvaus ARS:ää sisältävien DNA-fragmenttien kloonaukseen soveltuvan pGKAPH2-vektorin rakenteesta; 30 kuvio 38 on kuvaus ARS:ää sisältävien kuuden plasmidin insertio-DNA-fragmentin restriktioentsyymikartoista; kuvio 39 on kuvaus pCARS6-plasmidin insertio-DNA-fragmenttien ja pCARS6-plasmidin jatkokloonattuja DNA-frag-35 mentteja sisältävien neljän plasmidin restriktioentsyymi kartoista ; 12 kuvio 40 on kuvaus pCARS7-plasmidin insertio-DNA-frag-menttien ja pCARS7-plasmidin jatkokloonattuja DNA-fragmentteja sisältävien viiden plasmidin restriktioentsyymi-kartoista 5 kuvio 41 on kuvaus pCARS6-2-plasmidiin liitetyn DNA-frag-mentin DNA-sekvenssistä; kuvio 42 on jatkoa kuvion 41 mukaisille DNA-sekvensseil-10 le, joka kuvio kuvaa pCARS6-2-plasmidiin liitetyn DNA- fragmentin DNA-sekvenssiä; kuvio 43 on kuvaus pCARS7-6-plasmidiin liitetyn DNA-frag-mentin DNA-sekvenssistä; 15 kuvio 44 on jatkoa kuvion 43 mukaisille DNA-sekvensseil-le, joka kuvio kuvaa pCARS7-6-plasmidiin liitetyn DNA-fragmentin DNA-sekvenssiä; 20 kuvio 45 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka koske vat (1) pCARS6- tai pCARS7-plasmideilla transformoidun ATCC 9950 -kannan ja (2) pCLACl-plasmidilla transformoidun ATCC 9950 -kannan DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia; 25 kuvio 46 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka koskevat ATCC 9950, ATCC 9226, ATCC 9256, KP-2059 ja S288C-kantojen DNA:n Southern-blottianalyysin tuloksia, jotka on saatu käyttäen koettimina CUARSl:tä (1) ja CUARS2:ta 30 {(2) ja (3)}; kuvio 47 on kuvaus promoottorin pPCV2-kloonausvektorin konstruktiosta; 35 kuvio 48 on kuvaus sellaisen DNA-fragmentin DNA-sekvenssistä, joka sisältää pPCRV19-plasmidin promoottori-aktiivisuutta ; 13 kuvio 49 on kuvaus pGKHPTl-plasmidin konstruktiosta; ja kuvio 50 on kuvaus elektroforeesituloksista, jotka kuvaavat kotransformaatiomenetelmällä transformoitujen ATCC 5 9950 -kantojen DNA:n PCR-analyysin tuloksia.
Keksinnön yksityiskohtainen selitys Candida util is -hiiva
Niitä tiettyjä nimenomaisia Candida utilis -kantoja, joi-10 hin tämän keksinnön mukaista transformaatiojärjestelmää voidaan käyttää, ovat esimerkiksi ATCC 9256 (IFO 0626), ATCC 9226 (IFO 1086), ATCC 9950 (IFO 0988), IFO 0396, IFO 0619, IFO 0639 ja KP-2059P.
15 On myös raportoitu, että kromosomien elektroforeesitulok- set vaihtelevat eri Candida utilis -kannoilla ja niissä esiintyy kromosomien pituuspolymorfiaa [Stoltenburg, et ai., Curr. Genet. 22 (1992) 441 - 446]. Oli odotettua, että tämän keksinnön mukaisen transformaatiojärjestelmän 20 käyttö on rajoitettua tämän organismin polymorfian vuok si. Vaikkakin seuraavaksi kuvatuissa esimerkeissä käytetyissä kolmessa kannassa havaittiin kromosomipolymorfiaa, niin näissä kannoissa saatiin kuitenkin transformantteja, ja heterologisten geenien ilmentyminen niissä myös var-25 mistettiin. On odotettavissa, että tämän keksinnön mukaista transformaatiojärjestelmää voidaan käyttää alan ammattikokemuksen perusteella Candida utiliksen piirissä kokonaisuudessaan.
30 Transformaatioi äri estelmä
Organismien transformaatiojärjestelmän kehittämiseksi tarvitaan tavallisesti kolme elementtiä (a) selektiomark-kerigeeni transformattien selektointiin sekä menetelmä transformanttien selektoimiseksi, (b) autonomisesti rep- 35 likoituva DNA-sekvenssi (ARS), joka tarvitaan plasmidin pysymiseen episomina isäntäsolussa, tai sellainen asiaankuuluvan kromosomaalisen DNA:n homologinen sekvenssi, 14 jota vaaditaan plasmidin liittymiseksi tehokkaasti kromosomiin (tämä tarkoittaa plasmidi-DNA:n liittymiselle tarvittavan kohteen valmistamista), ja (c) menetelmä isäntäsolun tekemiseksi kykeneväiseksi ottamaan soluun 5 tuman ulkopuolista DNA:ta. Transformanttien aikaansaami seen vaaditaan kaikkia näitä kolmea elementtiä. Oli siten välttämätöntä tutkia ja kehittää kaikkia näitä elementtejä transformaatiojärjesteinään luomiseksi Candida utilik-selle, josta on saatu vain vähän geneettistä informaatio-10 ta.
(a) Selektiomarkkerigeenit ia transformanttien selektio Silloin kun mutaatiokäsittelyllä aikaansaatua auksotro-fista mutanttia voidaan käyttää isäntänä, voidaan aukso-15 trofiaa kömpiementoivaa geeniä käyttää selektiomarkkeri- geeninä transformanttien selektoimiseksi. Tässä tapauksessa on mahdollista selektoida transformantit suoraan minimimediumissa, jossa tätä ravinnetta ei esiinny. Candida utiliksen kyseessä ollessa oli kuitenkin mahdotonta 20 kehittää transformaatiojärjestelmää käyttäen auksotrofiaa komplementoivaa geeniä, koska oli hyvin vaikeaa saada aikaan mutanttikantaa, johon asiaankuuluva selektiomark-keri, kuten auksotrofinen markkeri, olisi lisätty.
25 Tässä keksinnössä havaittiin, että Candida utilis on herkkä lääkeaineille, kuten G418-antibiootille, hygromy-siini B:lie tai sykloheksimidille, ja on mahdollista estää kasvu lisäämällä näitä lääkeaineita mediumiin. Tässä keksinnössä on siten koetettu käyttää geeniä, joka antai-30 si resistenssin näitä lääkeaineita vastaan.
Käytettäessä muista organismeista peräisin olevaa geeniä, kuten G418-resistenssigeeniä (aminoglykosidifosfotransfe-raasigeeniä) tai hygromysiini B -resistenssigeeniä (hyg-35 romysiini B -fosfotransferaasigeeni), on geenin ilmen tymisen varmistamiseksi siten edullista käyttää Candida 15 utiliksessa toimivia transkripiton promoottori- ja termi-naattorisekvenssej ä.
Joissakin Candida-suvun hiivoissa, kuten Candida albican-5 sissa, on joidenkin kodonien translaation kuvattu tapah tuvan eri tavoin kuin muissa organismeissa [Ohama, et ai., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 4039 - 4045]. Siten se-lektiomarkkerigeeninä käytetyn heterologisen geenin translaatio proteiiniksi ei mahdollisesti aina tapahdu 10 niin, että tämä olisi toiminnallinen isännässä. Toisaalta on kuvattu se erittäin mielenkiintoinen tosiseikka, että sykloheksimidiherkkyyden määrää ribosomaalisen L41-proteiinin 56. asemassa oleva aminohapporyhmä [Kawai, et ai., J. Bacteriol. 174 (1992) 254 - 262], 15 Tässä keksinnössä on siten hankittu käyttöön sykloheksi-midille herkän Candida utiliksen L41-proteiinia vastaava geeni, tämä geeni on muunnettu sykloheksimidiresistenssi-geeniksi kohdemutageneesimenetelmällä ja sitä on käytetty 20 selektiomarkkerigeeninä. Koska tämä geeni oli peräisin isännästä, niin sitä käytettiin suoraan omien promoottori- ja terminaattorisekvenssiensä kanssa ilmentymisen aikaansaamiseksi. Tästä syystä tämä sovellutusmuoto on erittäin edullinen siinä mielessä, että geenin voidaan 25 varmuudella odottaa ilmentyvän.
Tämän keksinnön mukaisessa Candida utiliksen transformaa-tiojärjestelmässä selektiomarkkerina käytettävä lääkeaine-resistenssigeeni onkin edullisesti L41-sykloheksimidi-30 resistenssigeeni. L4l-geenin sekä promoottori- että ter- minaattorisekvenssit sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 13 (SEKVENSSI ID NO:5) ja DNA-sekvenssistä päätelty aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 14 (SEKVENSSI ID NO:6). L41-sykloheksimidiresis-35 tenssigeenin sekvenssi on kuviossa 13 esitetyn sekvenssin mukainen, jossa 1644. nukleotidi C on muunnettu A:ksi, ja 16 kuviossa 14 esitetyn sekvenssin 56. aminohappo, Pro, on muutettu Giniksi.
Lisäksi toinen edullinen lääkeaineresistenssigeenimarkke-5 ri, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa transformaatiojärjestelmässä, on G418-antibiootille resistenssin antava aminoglykosidifosfotransferaasi (APT) -geeni. Aminoglykosidifosfotransferaasi (APT) -geeneinä tunnetaan tällä alalla kaksi APT-geeniä, jotka ovat pe-10 räisin transposonista Tn903 ja transposonista Tn5, ja
tässä keksinnössä voidaan käyttää jompaa kumpaa näistä kahdesta geenistä. Tämän keksinnön mukaisessa trans-formaatiojärjestelmässä on myös mahdollista käyttää E. colista peräisin olevaa hygromysiini B - fosfotransfe-15 raasigeeniä, joka antaa resistenssin hygromysiini B
-antibiootille. Heterologisten geenien, kuten G418-re-sistenssigeenin tai hygromysiiniresistenssigeenin, kyseessä ollessa liitetään näiden ilmentämiseksi geneettisesti Candida utiliksessa toimintakykyinen transkrip-20 tion promoottori heterologisen geenin 5'-puolelle vasta- suuntaan ja vastaavanlainen terminaattori edullisesti tämän 3'-puolelle myötäsuuntaan.
Transkription promoottori- ja terminaattorisekvenssit 25 ovat edullisesti peräisin Candida utiliksen geenistä.
Candida utiliksessa on mahdollista käyttää tuonnempana kuvattuja fosfoglyseraattikinaasi (PGK) -geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssejä, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAP) -geenin promoottori- ja 3 0 terminaattorisekvenssejä ja plasmamembraanin protoni- ATPaasi (PMA) -geenin promoottori- ja terminaattori-sekvenssejä. On myös mahdollista käyttää promoottori-aktiivisuutta sisältäviä DNA-sekvenssejä, jotka on saatu tuonnempana kuvatun promoottorien kloonaukseen soveltuvan 35 vektorin avulla.
17
Lisäksi muita promoottori- ja terminaattorisekvenssejä, joita voidaan käyttää edellä kuvatussa järjestelmässä, ovat niiden Candida utiliksessa olevien geenien promoottori- ja terminaattorisekvenssit, jotka ovat homologisia 5 Saccharomyces-suvun hiivan sisältämien tunnettujen gee nien, kuten ADH:n, ENO:n, GAL:n ja SUC:n suhteen.
Lisäksi bakteereista peräisin olevia lääkeaineresistenssi-geenejä, joita voidaan käyttää transformanttien 10 selektiomarkkereina, ovat edellä kuvattujen G418-resis- tenssigeenin ja hygromysiini B -fosfotransferaasigeenin lisäksi antibioottiresistenssigeenit, kuten kloramfeni-koliasetyylitransferaasigeeni (kloramfenikoliresistenssi) [Hadfield, C., et ai., Gene 45 (1986) 149 - 158], blasti-15 sidiinideaminaasi (blastisidiiniresistenssi) [Izumi, M., et ai., Exp. Cell. Res. 197 (1991) 229 - 233] ja fleo-mysiiniresistenssigeeni [Wenzel, T.J., et ai., Yeast 8 (1992) 667 - 668]. Lisäksi voidaan käyttää tunnettuja lääkeaineresistenssigeenejä, kuten dihydrofolaattireduk-20 taasigeeniä (metotreksaattiresistenssi) [Miyajima, A., et ai., Mol. Cell Biol. 4 (1984) 407 - 414], metyylisulfo-meturoniresistenssigeeni, joka on hiivasta peräisin oleva dominantti geeni [Casye, G.P., et ai., J. Inst. Brew. 94 (1988) 93 - 97], CUPl-geeni (kupariresistenssi) [Hender-25 son, R.C.A., et ai., Current Genet. 9 (1985) 133 - 138] ja CYH2-geeni (sykloheksimidiresistenssi) [Delgado, M., et ai., EBC Congress 23 (1991) 281 - 288]. Kun markkeri-geeni on peräisin heterologisesta organismista, kuten bakteereista, tai transposonista, on edullista käyttää 30 edellä kuvattuja Candida utiliksessa toimivia promoot tori- ja terminaattorisekvenssejä.
(b) Plasmidi-DNA:n liittymiskohteiden selvittäminen Koska tämän keksinnön mukaan on edellä olevan kuvauksen 35 mukaisesti selvitetty käytettävissä olevia selektio- markkereita, kuten L41-sykloheksimidiresistenssigeeniä, on odotettavissa, että edellä kuvattujen sekvenssien 18 lisäksi voidaan kohdesekvensseinä käyttää useita Candida utiliksesta peräisin olevia sekvenssejä.
Tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaisesti on 5 havaittu, että ribosomaalista RNA:ta koodaavaa geeniä (rDNA), URA3-geeniä, L41-geeniä ja PGK-geeniä voidaan käyttää edullisesti asiaankuuluvina kromosomaalisinä DNA-fragmentteina, joita vaaditaan plasmidin liittämiseksi kromosomiin.
10
Mitä rRNA-geeniin tulee, niin sen on kuvattu esiintyvän sellaisina satana tai tätä useampana kappaleena rDNA:ta, jotka sijaitsevat peräkkäin Saccharomyces cerevisiaen kromosomissa ja toistuvassa yksikössä esiintyy autonomi-15 sesti replikoituva sekvenssi (ARS) [Saffer & Miller, JR.,
Molec, Cell. Biol. 6 (1986) 1148 - 1157]. On myös esitetty, että integratiivisen transformaation frekvenssiä voidaan lisätä käyttämällä plasmidin liittymisen kohteena rDNA-aluetta [Lopes, et ai., Gene 79 (1989) 199 - 206] .
20 Tässä keksinnössä on havaittu, että Candida utiliksessa esiintyy toistuvassa muodossa olevaa rDNA:ta. On siten todistusaineistoa sille, että Candida utiliksen rDNA:ta voidaan käyttää kohdesekvenssinä suurella frekvenssillä 25 tapahtuvaan integroitumiseen ja rDNA:ta käytettiinkin hyväksi Candida utiliksen transformaatiojärjestelmän rekombinaatiokohteena.
On tehty se mielenkiintoinen havainto, että kun Candida 30 utilis -hiiva transformoitiin tuonnempana kuvatuilla tä män keksinnön mukaisilla vektorijärjestelmillä, jotka hakeutuivat Candida utiliksen kromosomiin kohteinaan rRNA-geeni, URA3-geeni, L41-geeni tai PKG-geeni, niin DNA-fragmentti liittyi kromosomiin ja jäi hiivaan pysy-35 västi. On siten mahdollista välttyä heterologisen geenin pysymättömyysongelmalta, joka johtuu heterologisen geenin 19 esiintymisestä solussa autonomisesti replikoituvana ekstrakromosomomaalisena plasmidina.
Transformantteihin liittyneiden DNA-fragmenttien liitty-5 mistapaa koskevassa intensiivisessä tutkimuksessa havaittiin DNA-fragmenttien liittyvän Candida utiliksen kromosomiin pääasiassa homologisen rekombinaation avulla. Tämä tarkoittaa sitä, että isännän kromosomaalisen kohde-sekvenssin suhteen homologisen DNA-sekvenssin sisältävä 10 DNA-molekyyli voi liittyä mihin tahansa kromosomaaliseen kohteeseen.
Yksityiskohtaisemmin tarkasteltuna on mahdollista liittää DNA-fragmentti mihin tahansa Candida utiliksen kromosomin 15 kohdesekvenssiin silloin, kun DNA-fragmentin sisältävä vektori pilkotaan lineaariseksi plasmidi-DNA:ksi sellaisessa DNA-sekvenssissä olevan asiaankuuluvan restriktio-kohdan kohdalta, joka on homologinen kohdesekvenssin suhteen. Kun selektiomarkkerina käytetään L41-sykioheksimi-20 diresistenssigeeniä, niin tässä tapauksessa selektoidaan samalla tehokkaasti transformantteja, joissa kromosomiin on liittynyt useita plasmidimolekyylejä, kuten tuonnempana olevasta kuvauksesta käy ilmi.
25 On myös mahdollista käyttää lineaarista DNA-fragmenttia, joka on sellaisessa muodossa, että selektiomarkkeri sisältyy kromosomaalisen sekvenssin suhteen homologiseen DNA-sekvenssiin.
30 DNA-fragmentti liitetään tämän keksinnön tämän sovel- lutusmuodon mukaisessa transformaatiossa kromosomiin ja se korvaa kromosomissa olevan homologisen geenin. Liitetyn DNA-fragmentin suhteen vastasuuntaan ja myötäsuuntaan ei siten muodostu kohdesekvenssin toistuvia sekvenssejä. 35 Liittyneen DNA:n odotetaan olevan hyvin stabiili.
20
Lisäksi tästä keksinnöstä on saatu todistusaineistoa siitä, että URA3-geeniä, L41-geeniä ja PKG-geeniä, joita solua kohti on ainoastaan kaksi kappaletta, sekä monia muita geenejä voidaan käyttää DNA-fragmentin liittämis-5 kohteina. Hiiva sisältää haploidista genomia kohti yleen sä sata kappaletta tai tätä suuremman määrän toistuvia DNA-yksiköitä, jotka sisältävät 18S-, 5,8S-, 25S- ja 5S-rRNA-geenejä [Schweizer, E., et ai., J. Mol. Biol. 40 (1969) 261 - 277]. Tästä syystä rDNA:n käyttö rekombinaa-10 tion kohdesekvenssinä on muiden geenisekvenssien käyttöä edullisempaa siinä mielessä, että (1) transformaatio-frekvenssin odotetaan lisääntyvän, ja (2) liittymisen aikaansaama kohdesekvenssin muutos on niin pieni, että se voidaan jättää huomiotta. Tässä keksinnössä on osoitettu, 15 että rRNA-geenit esiintyvät myös Candida utiliksessa toistuvasti toisiinsa peräkkäin kytkeytyneenä noin 13,5 ke:n suuruisessa toistuvassa DNA-sekvenssiyksikössä (tämä on kuvattu yksityiskohdittain tuonnempana), ja että transformaatiofrekvenssi lisääntyy 10 - noin 50-kertai-20 sesti käyttämällä rekombinaation kohdesekvenssinä rDNA- sekvenssiä verrattuna L41-geenin tapaukseen, jossa kohteena esiintyy kaksi kappaletta geeniä solua kohti. On myös osoitettu, että rDNA-lokuksessa olevien DNA-frag-menttien stabiilisuus on hyvä ja rDNA-sekvenssi on erin-25 omainen liittämiskohde.
rDNA-sekvenssin käyttö kohdesekvenssinä DNA-fragmentin liittämiseen on tässä keksinnössä vaikuttanut trans-formaatiofrekvenssiä lisäävästi ja myötävaikuttanut tär-30 keällä tavalla haettaessa oikeita transformaatio-olo suhteita tutkituista hiivan käsittelyolosuhteista. On kuitenkin tehty se mielenkiintoinen havainto, että kun joitakin näitä rDNA-alueita käytetään transformaatio-kohteina, niin transformaatiofrekvenssi pienenee voimak-35 kaasti. Tämä merkitsee sitä, että kaikkia rDNA-fragmentteja ei aina voida käyttää kohteena, johon plasmidit liittyvät tehokkaasti.
21
Vielä yhden tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaisesti voidaan useita integroituneita plasmideja sisältäviä transformantteja saada tehokkaasti käyttämällä selektiomarkkerina L41-sykloheksimidiresistenssigeeniä.
5 Syyn tähän katsotaan olevan seuraava. Niiden ribosomi- molekyylien osuus, joissa endogeenisten sykloheksimidille herkkien L41-proteiinien tilalle on tullut vastaavia resistenttejä proteiineja ja joiden toimintaa sykloheksi-midi ei inhiboi, lisääntyy ainoastaan silloin, kun kromo-10 somiin on liittynyt lukumäärältään useita L41-sykloheksi-midiresistenssigeenejä sisältäviä DNA-fragmentteja.
Transformantin katsotaan siten voivan kasvaa sykloheksi-midiä sisältävässä mediumissa. Kohtana, joihin fragmentteja tultaisiin liitämään, voidaan tässä tapauksessa 15 käyttää periaatteessa jompaa kumpaa Candida utiliksen kromosomista peräisin olevaa sekvenssiä, kuten URA3 -geenilokusta tai L41-geenilokusta, tai muita näitä vastaavia lokuksia. Oli myös mielenkiintoista osoittaa, että käyttämällä muun muassa rRNA-geenilokusta liittymisen 20 kohdesekvenssinä oli DNA-fragmenteilla suurempi liittymis taipumus muihin kohdesekvensseinä käytettyihin geeni-lokuksiin verrattuna.
(c) Transformaatiomenetelmä 25 Transformaatiomenetelmänä, joka tekee isäntäsolusta kykenevän ottamaan sisäänsä helposti solun ulkopuolista DNA:ta, voidaan käyttää tavanomaisia Saccharomyces cere-visiaen transformaatiomenetelmiä, kuten protoplastimene-telmää, litiumasetaattimenetelmää, elektroporaatiota ja 30 näiden modifikaatioita. Vaikka protoplastimenetelmää käy tetään laajalti, sen käyttö on melko monimutkaista ja se aiheuttaa usein transformoitumattornien taustapesäkkeiden ongelman selektoitaessa transformantteja lääkeaineresis-tenssin perusteella.
Tässä keksinnössä on Candida utiliksen transformaatioko-keissa käytetty litiumasetaattimenetelmää ja elektropo- 35 22 raatiota käyttäen plasmidia L41-sykloheksimidiresistens-sigeenin ja edellä kuvatun rDNA-fragmentin yhdistelmänä, ja siinä on löydetty olosuhteet, joissa transformantteja voidaan saada aikaan toistettavasti.
5
Transformaatio suoritetaan edullisesti elektroporaation avulla. Solut kasvatetaan logaritmiseen vaiheeseen, minkä jälkeen ne pestään ja suspendoidaan 1 M sorbitoliin. Elektroporaatiota käytetään olosuhteissa, jossa aika-10 vakiona (aikana, joka kuluu jännitteen pienentymiseen noin 37 %:iin maksimista), käytetään noin 10 - 20 millisekuntia ja elinkykyisten solujen määrä pulssin jälkeen on noin 10 - 40 %. Esimerkiksi tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaan on osoitettu, että edellä kuvattu 15 aikavakion arvo ja elinkykyisten solujen määrä saavutet tiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 600 - 1000 Ω ja jännite 3,75 - 5 kV/cm, ja saatujen transformanttien määrä 1 /xg:n suuruista DNA-määrää kohti oli noin 500 - 1400.
20
Havaittiin myös edulliseksi lisätä elektroporaation jälkeen soluliuokseen 1 M sorbitolia sisältävää YDP-mediumia ja viljellä viljelmää ravistellen. On myös havaittu, että joissakin tapauksissa ei saada lainkaan pesäkkeitä, jos 25 solut levitetään suoraan sykloheksimidiä sisältävälle selektiomaljalle. Asianmukainen viljelyaika on noin 4 -6 tuntia ja jos soluja viljellään kauemmin, niin trans-formattien kasvua ei voida sen vähäisyyden vuoksi jättää huomiotta. Tämän keksinnön mukaisessa transformaatiossa 30 on lisäksi edullista parantaa transformaatiofrekvenssiä lisäämällä kantaja-DNA:ta, kuten lohen maidin DNA:ta saatettaessa DNA ja solut kosketukseen keskenään, tai lisäämällä polyetyleeniglykolia .
35 Litiumasetaattimenetelmää [Ito, et ai., J. Bacteriol. 153 (1983) 163 - 168] on käytetty laajalti Saccharomyces-suvun hiivan transformaatiossa sen yksinkertaisuuden ja 23 helppouden johdosta. On myös kuvattu sen useita erilaisia modifikaatioita. Tässä keksinnössä on varmistettu, että Candida utilis voidaan transformoida näillä menetelmillä. Erityisesti on edullista transformoida Candida utilis 5 modifioidulla litiummenetelmällä, jossa lisätään etanolia [Soni, et ai., Current Genet. 24 (1993) 455 - 459]. On myös mahdollista määrittää Candida utiliksen transformaation optimiolosuhteet litiumasetaattimenetelmää käytettäessä ja parantaa transformaatiofrekvenssiä käyttämällä 10 erilaisia olosuhteita, kuten soluja talteenotettaessa käytettyjä solutiheyksiä, litiumkonsentraatioita, poly-etyleeniglykolityyppejä ja konsentraatioita ja kantaja-DNA-tyyppejä, muotoja ja määriä. Näitä menetelmiä odotetaan käytettävän alan ammattikokemuksen perusteella, 15 koska (a) tämän keksinnön mukaiset selektiomarkkerigeenit ja (b) liittämisen kohdealueet on tässä määritelty.
Tässä keksinnössä koetettiin lisäksi suorittaa transformaatio plasmideilla, joihin oli yhdistetty kahdeksan 20 Candida utiliksesta peräisin olevaa ja Saccharomyces cerevisiaessa toimivaa ARS-sekvenssiä sekä Saccharomyces cerevisiaessa toimiva G418-resistenssigeenin ilmentämis-yksikkö, mutta ei saatu aikaan transformantteja. Tämän tuloksen johdosta voidaan Ho, et al.’:n (Ho, N.W.Y., et 25 ai., edellä), kuvaaman Candida utiliksen transformaation toistettavuus asettaa kyseenalaiseksi.
Ilmentämisvektoriiäriestelmät ja heterolooisten geenien ilmentäminen 30 Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön ilmen- tämisjärjestelmiä, joita voidaan käyttää Candida utiliksen transformaatioon.
Tämän keksinnön sovellutusmuoto on plasmidi-DNA, joka si-35 sältää Candida utiliksen kromosomaalisen DNA:n suhteen homologisen sekvenssin (tästä on käytetty tuonnempana nimitystä “homologinen DNA-sekvenssi”), joka tekee mah- 24 elolliseksi plasmidi-DNA:n liittämisen kromosomiin tässä kohdassa tapahtuvan homologisen rekombinaation avulla, ja selektiomarkkerin transformanttien selektoimiseksi.
5 Homologinen DNA-sekvenssi sisältää edullisesti rRNA-gee-nin, URA3-geenin, L41-geenin, PGK-geenin, GAP-geenin ja PMA-geenin, jotka ovat edullisesti peräisin Candida utilises en kromosomaalisesta DNA:sta. Heterologinen geeni on mahdollista liittää haluttuun kohtaan kromosomia käytet-10 tävien sekvenssien mukaan. Plasmidia käytetään lineaarisessa muodossa pilkkomalla tämä asiaankuuluvasta restrik-tiokohdasta, joka sijaitsee plasmidimolekyylin homologisen DNA-sekvenssin alueella. Tämä johtaa siihen, että plasmidi-DNA-fragmentti liittyy Candida utiliksen kromo-15 somiin homologisen rekombinaation avulla.
Tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaisesti markkerigeenin ja heterologisen geenin sisältävä DNA-sekvenssi liitetään plasmidiin lisäksi siten, että se jää 20 kummastakin päästään plasmidi-DNA:ssa olevan homologisen DNA-sekvenssin väliin. Tässä sovellutusmuodossa plasmidi-DNA pilkotaan homologisesta DNA-sekvenssistä restriktio-entsyymillä sellaisen DNA-fragmentin aikaansaamiseksi, joka sisältää markkerigeenin, heterologisen geenin ja 25 fragmentin molemmissa päissä olevan homologisen DNA-sek- venssin. Näin saatu DNA-fragmentti voi myös liittyä Candida utiliksen kromosomaaliseen DNA:hän homologisen rekombinaation avulla.
30 Vaikkakaan DNA-fragmentin liittymistä koskeva sovellutus-muoto ei ole mitenkään erityisesti rajoitettu, kunhan vain tämä liittyy Candida utiliksen kromosomiin, on ilmaisulla “näin saatu DNA-fragmentti liittyy Candida utiliksen kromosomiin homologisen rekombinaation avulla” 35 tässä keksinnössä merkitys, joka sisältää vähintään kaksi seuraavanlaista sovellutusmuotoa. Tämä termi tarkoittaa siten jompaa kumpaa merkityksistä, jotka ovat (1) sovel- 25 lutusmuoto, joka koskee liittymistä kromosomaaliseen DNA:han siten, että Candida utiliksen kromosomin DNA-sek-venssin ja pilkottuun osaan “liitetyn” DNA-fragmentin molemmissa päissä olevien homologisten DNA-sekvenssin 5 osien välillä tapahtuu homologinen rekombinaatio; ja (2) sovellutusmuoto, joka koskee liittymistä kromosomaaliseen DNA:hän “korvaamalla” osa Candida utiliksen kromosomista plasmidi-DNA-fragmentilla Candida utiliksen kromosomin DNA-sekvenssin ja plasmidi-DNA-fragmentin molemmissa 10 päissä esiintyvien homologisten DNA-sekvenssien välillä tapahtuneen homologisen rekombinaation avulla. Kohdan (2) mukaisessa sovellutusmuodossa liittyneen DNA-fragmentin odotetaan jäävän kromosomiin pysyvästi, koska kumpaankaan näin liitettyyn päähän ei muodostu kohdesekvenssin tois-15 tuvia sekvenssejä.
On myös edullista käyttää selektiomarkkerigeeninä edellä kuvattua lääkeaineresistenssimarkkeria ja edullisempi lääkeaineresistenssimarkkeri sisältää sykloheksimidi-20 resistenssin antavan geenin, kuten L41-sykloheksimidi- resistenssigeenin, G418-antibioottiresistenssin antavan geenin, kuten bakteerien transposonista Tn903 peräisin olevan APT-geenin, ja hygromysiini B -antibioottiresis-tenssigeenin. Kun selektiomarkkerigeeni on peräisin mik-25 ro-organismeista, on se ilmentymisen varmistamiseksi edullista ligatoida Candida utiliksessa toimivaan promoottoriin .
Vielä yhden tämän keksinnön sovellutusmuodon mukainen 30 vektori on plasmidi-DNA, joka sisältää Candida utiliksen kromosomaalisen DNA:n suhteen homologisen sekvenssin (homologisen DNA-sekvenssin), jonka avulla on mahdollista liittää plasmidi-DNA kromosomiin tässä osassa tapahtuvan homologisen rekombinaation välityksellä mutta joka ei si-35 säilä transformanttien selektioon tarkoitettua selektio- markkeria. Plasmidia käytetään lineaarisessa muodossa pilkkomalla se plasmidimolekyylin homologisen DNA-sek- 26 venssin alueella olevasta asiaankuuluvasta restriktiokoh-dasta.
Tämän sovellutusmuodon mukaisessa plasmidissa voi plas-5 midi olla konstruoitu siten, että heterologisen geenin sisältävä DNA-sekvenssi on liitetty molemmista päistään homologisten DNA-sekvenssien väliin. DNA-fragmentti, jonka molemmissa päissä esiintyy homologisia DNA-sekvenssejä, saadaan aikaan pilkkomalla plasmidi-DNA homologisen 10 DNA-sekvenssin kohdalta restriktioentsyymillä. DNA-fragmentti voidaan myös liittää Candida utiliksen kromosomaa-liseen DNA:hän homologisen rekombinaation avulla.
DNA-fragmentti liittyy lineaarisessa muodossa Candida 15 utiliksen kromosomiin homologisen rekombinaation avulla samalla tavoin kuin markkerigeenin sisältävän plasmidi-DNA: n kyseessä ollessa. Tämän sovellutusmuodon mukaisen plasmidin kyseessä ollessa liittyneen DNA-fragmentin odotetaan jäävän kromosomiin pysyvästi edellä kuvatun 20 sovellutusmuodon (2) mukaan tapahtuneen liittymisen väli tyksellä .
Homologinen DNA-sekvenssi sisältää edullisesti rRNA-gee-nin, URA3-geenin, L41-geenin, PGK-geenin, GAP-geenin ja 25 PMA-geenin. Nämä geenit ovat edullisesti peräisin Candida utiliksen kromosomaalisesta DNA:sta. On myös mahdollista liittää vieras DNA-fragmentti haluttuun asemaan kromosomissa sen mukaan, mitä sekvenssiä käytetään.
30 Vektoria käytetään samanaikaisesti transformaatiossa plasmidin kanssa, jossa on tuonnempana kuvattavaa autonomisesti replikoituvaa sekvenssiä sisältävä DNA-sekvenssi sekä selektiomarkkerigeeni. Autonomisesti replikoitu-van plasmidin esiintymisen perusteella selektoiduille 35 transformanteille on mahdollista suorittaa sekundäärinen selektio sellaisen kannan esille poimimiseksi, jossa kromosomiin on liittynyt DNA-fragmentti, joka ei sisällä 27 selektiomarkkeria. Selektoidun kannan sisältämä plasmidi voidaan saada poistettua solusta viljelemällä solua selektoimattomissa olosuhteissa. Tulokseksi voidaan saada kanta, jossa ainoastaan kromosomissa oleva liitetty DNA-5 fragmentti on jäljellä. Tällä menetelmällä on mahdollista saada kasvamaan esimerkiksi kanta, jossa on jäljellä ainoastaan heterologinen geeni ja jossa ei esiinny muita ylimääräisiä sekvenssejä, kuten mikro-organismeista peräisin olevaa lääkeaineresistenssigeeniä.
10
Lisäksi plasmidia, jossa on autonomisesti replikoituvan sekvenssin ja selektiomarkkerigeenin sisältävä DNA-sekvenssi, voidaan käyttää vektorina Candida utilis -hiivan transformaatioon. Solut menettävät helposti plasmidinsa, 15 kun niitä viljellään selektoimattomissa olosuhteissa mutta pysyvyyttä voimistava DNA-fragmentti voidaan saada käyttöön tuonnempana kuvattavalla tavalla, joten tätä plasmidia voidaan käyttää vektorina yhdessä DNA-fragmentin kanssa.
20 Tämän keksinnön mukainen vektori voidaan liittää hetero-logiseen geeniin heterologisen geenin sisältävän vektorin muodostamiseksi. Heterologinen geeni voidaan liittää pysyvästi Candida utiliksen kromosomiin transformoimalla 25 Candida utilis tällä vektorilla. Näin saatua transfor- manttia voidaan viljellä asiaankuuluvassa mediumissa sellaisen viljelytuotteen aikaansaamiseksi, josta heterologisen geenin ilmentymistuote eristetään ja puhdistetaan ilmentymistuotteelle soveltuvalla menetelmällä. Tämä mer-30 kitsee sitä, että heterologista geeniä voidaan ilmentää Candida utiliksessa. Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä heterologisen geenin ilmentämiseksi Candida utiliksessa. Tässä yhteydessä termi heterologinen geeni tarkoittaa yleensä geeniä tai tämän osana olevaa DNA:ta, 35 jota ei alunperin esiinny isäntänä käytettävän Candida utiliksen kromosomissa.
28
Heterologinen geeni yhdistetään edullisesti säätely-alueeseen, joka säätelee heterologisen geenin ilmentymistä itsenäisesti tai joka ilmentyy transformaatio-tapahtuman vaurioittamassa geenissä olevan säätelyalueen 5 ohjaamana. Näiden sekvenssien on toimittava Candida uti luksessa ja näitä ovat edullisesti esimerkiksi tuonnempana kuvattavan tämän keksinnön mukainen PKG-geenin, GAP-geenin ja PMA-geenin promoottorisekvenssi ja terminaattorisekvenssi sekä sellaiset DNA-sekvenssit, 10 joissa on promoottoriaktiivisuutta, joka saadaan käyttä mällä tuonnempana kuvatun promoottorin kloonaukseen soveltuvaa vektoria.
Kuten tuonnempana kuvattavista esimerkeistä käy ilmi, on 15 heterologisia geenejä, kuten glukoamylaasigeeniä, amino- glykosidifosfotransferaasigeeniä, jö-galaktosidaasigeeniä ja hygromysiini B -fosfotransferaasigeeniä, ilmennetty suotuisin tuloksin tämän keksinnön mukaisen fosfo-glyseraattikinaasigeenin promoottorisekvenssin ja 20 terminaattorisekvenssin avulla. Glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasigeenin promoottori- ja termi -naattorisekvenssien avulla sekä plasmamembraanin protoni-ATPaasi -geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssien avulla on myös ilmennetty suotuisin tuloksin amino-25 glykosidifosfotransferaasigeeniä. Näistä heterologisista proteiineista on glukoamylaasi erittyvä proteiini ja aminoglykosidif osf otransf erääsi ja jÖ-galaktosidaasi ovat solunsisäisiä entsyymejä. Tämä tarkoittaa sitä, että Candida utiliksessa voidaan tuottaa heterologista pro-30 teiinia, joka on joko solunsisäinen tai erittyvä proteii ni. Lisäksi glukoamylaasin erittyminen ja ilmentyminen tapahtui myös voimakkaasti, joten voidaan sanoa, että Candida utilis on erinomainen isäntä heterologisen proteiinin tuottamiseksi suurina määrinä.
Joissakin Candida-suvun hiivoissa, kuten Candida malto-sassa tai C. albicansissa, on osan kodonien translaatios- 35 29 ta lisäksi kuvattu tapahtuvan muissa organismeissa tapahtuvasta translaatiosta poikkeavalla tavalla [Ohama, et ai., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 4039 - 4045]. Tämän katsotaan olevan syynä siihen, miksi E. colista peräisin 5 olevan β-galaktosidaasigeenin ilmentymistuote, jota on ilmennetty isäntänä käytetyssä Candida maltosassa, ei ole aktiivinen. Kuten tuonnempana kuvattavista esimerkeistä käy ilmi, säilyttää Candida utiliksessa tuotettu E. colista peräisin olevan jS-galaktosidaasigeenin tuote 10 aktiivisuutensa. Tämä osoittaa Candida utiliksen tunnistavan kodonit normaalilla tavalla ja Candida utiliksen olevan edullinen isäntä heterologisen polypeptidin tuotannossa .
15 On myös mahdollista modifioida Candida utiliksen ominaisuuksia ilmentämällä Candida utiliksessa heterologista geeniä. Siten tämän keksinnön mukaisesti saadaan käyttöön menetelmä uuden Candida utilis -kannan aikaansaamiseksi. On esimerkiksi mahdollista parantaa sen fermentaatio-omi-20 naisuuksia sen teollisen käyttökelpoisuuden parantamiseksi. Erityisesti Candida utilis -kanta, jota on modifioitu siten, että se ilmentää glukoamylaasigeeniä, kykenee pilkkomaan tärkkelystä, toisin sanoen sen hiililähde-valikoimaa on laajennettu.
25
Lisäksi tämän keksinnön mukaista vektoria voidaan käyttää muiden solujen kuin Candida utiliksen transformaatiossa. Kun isäntänä käytetään jotakin muuta solua kuin Candida utilista, niin valitaan edullisesti transformaatio-30 käyttöön soveltuva DNA-fragmentti. Tämä DNA-fragmentti sisältää esimerkiksi E. colin kyseessä ollessa bakteeri-plasmidin, kuten pBluescript’in tai pUC19:n DNA:ta. Tämä DNA-fragmentti sisältää esimerkiksi Saccharomyces-sukuun kuuluvan hiivan kyseessä ollessa hiiva-E. coli -sukkula-35 vektorin, kuten YEpl3:n tai Ycp50 [Methods in Enzymology 194 (1991) 195 - 230, Academic Press].
30
Menetelmä Candida utilis -hiivassa autonomisesti replikoi tumaan kykenevien DNA-sekvenssien kloonaamiseksi Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan lisäksi käyttöön menetelmä sellaisen DNA-sekvenssin kloonaamiseksi, joka 5 kykenee replikoitumaan autonomisesti Candida utiliksessa.
Käytetty DNA, joka voi olla peräisin mistä tahansa organismista, on edullisesti peräisin Candida utiliksesta. Tähän menetelmään soveltuvana vektorina voidaan käyttää vektoria, joka sisältää lääkeaineresistenssimarkkeri-10 geenin. Edullisia esimerkkejä ovat vektori, joka sisältää APT-geenin, joka on G4l8-resistenssigeeni ja joka ilmentyy Candida utiliksessa toiminnallisen promoottorin ja terminaattorin avulla. Yksityiskohtaisemmin tarkasteltuna käytetään PGK-geenin promoottorin avulla ilmentyvän APT-15 geenin sisältävää plasmidia vektorina Candida utilis -hiivan genomisen DNA-kirjaston valmistamiseksi ja Candida utilis transformoidaan kirjaston DNA:11a. G418-resis-tenssin perusteella valitusta transformoidusta hiivasta eristetään kokonais-DNA. E. coli transformoidaan tällä 20 DNA:11a, jotta transformoidussa hiivassa ekstra- kromosomaalisena tekijänä oleva plasmidi-DNA voidaan saada talteen. Eristetään autonomisesti replikoituvan sekvenssin (ARS) muodossa olevia toiminnallisia sekvenssejä, jotka ovat peräisin plasmidi-DNA:hän liitetystä Candida 25 utiliksesta peräisin olevasta kromosomaalisesta DNA-frag- mentista.
Tässä keksinnössä on tehty se yllättävä havainto, että kun vektorina käytetään plasmidia, joka sisältää lääke-30 aineresistenssimarkkerina L41-sykloheksimidiresistenssi- geenin, niin kyettiin kloonaamaan mikä tahansa autonomisesti replikoitumaan kykenevä DNA-sekvenssi. Toisin sanoen vaikka tätä plasmidia käytettiin Candida utilis -hiivan genomisen DNA-kirjaston valmistamiseen ja Candida 35 utilis transformoitiin kirjaston DNA:11a, ei saatu yhtään sykloheksimidiresistenttiä transformanttia. Tämä merkitsee sitä, että Candida utiliksen ARS :11a on se ominai- 31 suus, että sitä sisältävän plasmidin kappalemäärä solua kohti jää pieneksi, joten transformanttia ei voida selek-toida edes tämän ollessa yhdistettynä L41-sykloheksimidi-resistenssigeeniin, joita tarvitaan transformantin selek-5 tioon useita kappaleita. Tähän on saatu lisävahvistusta siitä, ettei transformanttia saatu edes silloinkaan, kun Candida utilis transformoitiin näin saadun ARS:n ja L41-sykloheksimidiresistenssigeenin sisältävällä plasmidilla. Kuten tuonnempana olevista esimerkeistä ilmenee, on kloo-10 natun ARS:n sisältävän DNA-sekvenssin ominaisuuksia huolellisesti analysoimalla osoitettu, että ARS:ää sisältävää plasmidia on ainoastaan noin yksi kappale Candida utilis -hiivan solua kohti. Näin kloonatulla ARS :11a on lisäksi se ominaisuus, että sitä sisältävä plasmidi on 15 pysymätön. Kun Candida utilis -hiivaa viljeltiin noin 2,5 - 3,5 solusukupolvea ei-selektoivissa olosuhteissa, niin plasmidia sisältävien solujen määrä pieneni 20 -30 %:iin solujen kokonaislukumäärästä.
20 Menetelmä sellaisten DNA-sekvenssien kloonaamiseksi.
joilla on promoottoriaktiivisuutta Candida utiliksessa Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä sellaisten DNA-sekvenssien kloonaamiseksi, joilla on transkription promoottoriaktiivisuutta Candida utiliksessa, käyttämällä 25 edellä olevaa autonomisesti replikoitumaan kykenevää DNA- sekvenssiä. Tähän soveltuvana vektorina voidaan käyttää vektoria, joka autonomisesti replikoitumaan kykenevän DNA-sekvenssin lisäksi sisältää lääkeaineresistenssi-geenin, jossa ei ole transkription promoottorisekvenssiä. 30 Voidaan edullisesti käyttää sellaisen APT-geenin sisäl tävää vektoria, joka on G418-resistenssigeeni. Käytetty DNA voi olla peräisin mistä tahansa organismista, mutta se on edullisesti peräsin Candida utiliksesta. Lisäksi DNA on muunnettava pieniksi molekyyleiksi kirjaston val-35 mistamiseksi käyttämällä entsyymikäsittelyä restriktio-entsyymeillä tai DNaasilla tai käyttämällä mekaanista leikkausvoimaa, joka on saatu ultraäänikäsittelyllä.
32
Kromosomaalisen DNA:n osittaiseen pilkkomiseen käytetään edullisesti kolmen sellaisen restriktioentsyymin, Alul:n, HaeIII:n ja Rsal:n, yhdistelmää, jotka tunnistavat pituudeltaan neljän nukleotidin sekvenssin ja tuottavat tasai-5 set päät. Tämä yhdistelmä lisää kirjastoon kloonautuvien kromosomialueiden määrää.
Tarkemmin sanottuna Candida utilis -hiivan genominen DNA-kirjasto valmistetaan tavanomaisella menetelmällä, jossa 10 edellä kuvatuilla restriktioentsyymeillä pilkotun DNA:n noin 0,8 - 1,8 ke:n suuruiset fragmentit liitetään sellaisen APT-geenin 5'-puolelle, josta promoottorisekvenssi puuttuu. Tämän jälkeen Candida utilis transformoidaan kirjaston DNA:11a. Sellaisella plasmidilla transformoitu 15 hiiva, jossa promoottoriaktiivisuutta sisältävä DNA- sekvenssi on kloonautunut välittömästi APT-geenin edelle, tulee G418:lie resistentiksi. Siten G418-resistentistä transformantista eristetään kokonais-DNA E. colin trans-formoimiseksi ja promoottoriaktiivisuutta sisältävä DNA-20 sekvenssi voidaan kloonata tehokkaasti. Tässä tapauksessa voidaan eristää transkriptioaktiivisuudeltaan voimistuneita promoottorisekvenssejä nostamalla maljan sisältämän G418:n konsentraatiota tai selektoimalla kanta, joka muodostaa maljalla suhteellisen suuria pesäkkeitä. Tämän 25 keksinnön mukainen menetelmä on edullinen voimakkaasti aktiivisen promoottorisekvenssin esille saamiseksi, koska ARS:ää sisältävän plasmidin kappalelukumäärä Candida uti-liksessa pysyy edellä kuvatulla tavalla noin yhtenä solua kohti.
30
Menetelmä muiden Candida utiliksen toiminnallisten geenien eristämiseksi
Lisäksi tämän keksinnön mukaisesta menetelmästä sellaisen DNA:n eristämiseksi, jolla on promoottoriaktiivisuutta 35 Candida utiliksessa, saadaan myös käyttöön menetelmä sellaisten DNA-sekvenssien eristämiseksi, joilla on ARS:ää sisältävän plasmidin pysyvyyttä lisäävä vaikutus. Candida 33 utiliksessa olevan ARS :ää sisältävän plasmidin sovellutusmuodolle on tunnusmerkillistä heikko pysyvyys ja kun soluja viljellään 3-4 solusukupolvea, niin ei-selektoivissa olosuhteissa plasmidin säilyttäneiden solu-5 jen lukumäärä pienenee 20 - 30 %:iin solujen kokonais määrästä. Tästä syystä kanta, jossa lääkeaineresistenssi-geenin sisältävä ARS-plasmidi on jäljellä, muodostaa se-lektoivaa lääkeainetta sisältävällä maljalla hieman pienempiä pesäkkeitä kuin kromosomiin liittyneen lääkeaine-10 resistenssigeenin sisältävä kanta huolimatta siitä, että kappalelukumäärä solua kohti on sama. Suhteellisen suuria pesäkkeitä muodostavia kantoja valikoitiin tässä keksinnössä voimakkaasti aktiivisten promoottorisekvenssien esiin poimimiseksi, joten jotkin promoottoriaktiivisuutta 15 sisältävistä eristetyistä DNA-molekyyleistä, joita on kuvattu tuonnempana esitettävissä esimerkeissä, sisältävät toimintoja, jotka voivat parantaa plasmidin pysyvyyttä. Lisäksi alan ammattikokemuksen perusteella voidaan odottaa, että tämän transformaatiojärjestelmän käytöllä 20 on mahdollista saada DNA-sekvenssejä, joissa on useita erilaisia toimintoja, kuten esimerkiksi sentromeeri-sekvenssi.
Menetelmä sellaisen transformantin aikaansaamiseksi, ios-2 5 ta puuttuu lääkeaineresistenssimarkkericreeni Käyttämällä tämän keksinnön mukaista autonomisesti replikoituinaan kykenevää DNA-sekvenssiä saadaan tästä keksinnöstä käyttöön vielä yksi menetelmä sellaisen transformant in aikaansaamiseksi, josta puuttuu lääkeaine-30 resistenssimarkkerigeeni. Tarkemmin sanottuna trans- formantti, josta lääkeaineresistenssimarkkerigeeni puuttuu, voidaan saada aikaan käyttämällä seuraavaa menetelmää. Ensimmäiseksi plasmidi-DNA, jossa ei ole selektio-markkerigeeniä transformantin selektoimiseksi ja joka 35 sisältää kromosomaalisen DNA:n suhteen homologisen sekvenssin (homologisen DNA-sekvenssin), pilkotaan lineaariseen muotoon tässä homologisessa DNA-sekvenssissä olevan 34 asiaankuuluvan restriktioentsyymikohdan kohdalta. Tämä lineaarinen plasmidi-DNA voidaan siten liittää Candida utiliksen kromosomin homologiseen DNA-sekvenssiin. Lineaarista plasmidi-DNA:ta käytetään plasmidin kanssa, 5 joka sisältää ARS:ää sisältävän sekvenssin ja selektio- markkerigeenin hiivassa tapahtuvaa transformaatiota varten. Transformanteista, jotka on selektoitu sen perusteella, että ARS:n sisältäviä plasmideja on siirtynyt soluun, selektoidaan sekundäärisellä selektiolla kloone-10 ja, joissa transformaatioon käytetty DNA-fragmentti on samalla liittynyt kromosomiin, tutkimalla DNA-fragmentissa olevien heterologisten geenien ilmentymistä tai varmistamalla DNA-fragmentin liittyminen PCR- tai Southern-analyysillä. Lisäksi valitussa kannassa oleva autonomi-15 sesti replikoituva plasmidi voidaan poistaa vaikeuksitta viljelemällä soluja olosuhteissa, joissa ei käytetä selektiota. On siten mahdollista saada aikaan kanta, jossa ei esiinny selektiomarkkerigeeniä ja jossa ainoastaan kromosomiin liittynyt DNA-fragmentti on säilynyt.
20
Candida utiliksen kromosomin kohdemutageneesi Vielä yhden tämän keksinnön sovellutusmuodon mukaisesti siitä saadaan käyttöön Candida utiliksen kromosomin kohdemutageneesi. Tässä menetelmässä käytetään kromoso-25 maalisen kohdegeenin korvaavana geeninä geenien fragmen-tointikasettia, jossa kohdegeeniin, jonka on määrä menettää toimintakykynsä, on liitetty selektiomarkkerigeeni. Kasetti sisältää lineaarisen DNA-rakenteen, joka sisältää molemmissa päissään kromosomaalisen kohdegeenin suhteen 30 homologisia DNA-sekvenssejä (homologinen DNA-sekvenssi) ja vähintään yhden näiden välissä sijaitsevan selektio-markkerigeenin. On tärkeää, että se DNA-fragmentti, joka voidaan liittää, on samassa suunnassa kuin mitä se on kromosomissa. Kun hiiva transformoidaan tällä kasetilla, 35 niin markkerigeeni ja kasetin molemmissa päissä olevat DNA-sekvenssit voidaan siirtää isäntään ja ne liittyvät tähän. Kohdegeeni menettää transformaation johdosta 35 integroitumiskohdassa yhtenäisyytensä ja muodostuu ominaisuuksiltaan uusi hiivakanta. Selektiomarkkerigeeni on edullisesti lääkeaineresistenssigeeni ja trans-formantit, joiden geenit ovat vaurioituneet, voidaan 5 valita resistenssin perusteella tätä lääkeainetta kohtaan. Geeni, joka voi olla tämän geenien modifioinnin kohteena, on edullisesti Candida utiliksen kromosomista peräisin oleva geeni. Näitä ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta erityisesti URA3-, ADE1-, ADE2- tai HIS-10 geeni.
Esimerkiksi Candida utiliksen URA3-geeni katkaistaan sen toiminnan estämiseksi selektiomarkkerigeenillä, kuten L41-sykloheksimidiresistenssigeenillä, jota sitten käyte-15 tään transformaatioon. Näin saadun sykloheksimidille re sistentin transformantin kromosomissa on kaksi URA3-geeniä, joista geeneistä toinen on vaurioitunut. Lisäksi kanta, jossa molemmat URA3-geenit ovat vaurioituneet, saadaan transformoimalla toisen URA3-geenin suhteen vau-20 rioitettu kanta toisen selektiomarkkerigeenin, kuten G418-resistenssigeenin, katkaisemalla URA3-geeni-fragmentilla. URA3-variantin tiedetään tulevan resistentiksi 5-fluoriorotihapolle (5-FOA), joka on urasiilin biosynteettisessä reaktiotiessä olevan välituotteen tok-25 sinen analogi. Käyttämällä sellaisen kannan geeni- substituutiota, jossa toinen URA-geeneistä on vaurioitettu, on siten mahdollista saada aikaan (5-FOA-resistentti-nä kantana) ura3-mutantti (tämä sisältää molemmat URA3-geenit toimintakykynsä menettäneinä). ura3-mutantilla on 30 mahdollista saada aikaan transformantti käyttäen URA3- geeniä selektiomarkkerigeeninä, joka ei ole lääkeaine-resistenssigeenimarkkeri. Lisäksi näin saadulla aukso-trofisella mutantilla on se etu, että siihen ei pitäisi kohdistua sellaisista sekundäärisistä mutaatioista johtu-35 via vaikutuksia, joita muihin geenilokuksiin voi syntyä kemiallista mutageneesimenetelmää käyttäen.
36 L41-creeni Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön Candida utiliksen ribosomaalinen L41-proteiini, sitä koodaava geeni sekä sen promoottori- ja terminaattorisekvenssit.
5 Tämän keksinnön mukaisen Candida utiliksen L41-proteiinin aminohapposekvenssi on kuviossa 14 kuvatun sekvenssin (SEKVENSSI ID NO:6) mukainen. Siten tämän keksinnön mukainen L41-geeni koodaa kuviossa 14 kuvattua aminohappo-10 sekvenssiä. Lisäksi kuviossa 13 on esitetty tämän geenin sekä sen promoottori- ja terminaattorisekvenssit sisältävä spesifinen DNA-sekvenssi (SEKVENSSI ID NO:5).
Lisäksi tästä keksinnöstä saadaan käyttöön sellainen mu-15 tatoitu L41-geeni, joka koodaa L41-sykloheksimidi- resistenssiproteiinia, jossa 56. aminohapporyhmä on muuntunut proliinista glutamiiniksi. L41-sykloheksimidi-resistenssigeeniä voidaan edellä olevan kuvauksen mukaisesti käyttää ei ainoastaan Candida utiliksen trans-20 formaatioon soveltuvana selektiomarkkerigeeninä vaan myös muiden hiivojen, kuten Saccharomyces-suvun hiivojen, transformaatioon soveltuvana selektiomarkkerigeeninä. Lisäksi on tarpeetonta mainita, että tämän geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssejä voidaan myös käyt-25 tää heterologisten geenien ilmentämisessä.
PGK-creeni Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön PGK-geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit.
30
Erityisiä esimerkkejä promoottorisekvenssistä ovat kuviossa 3 esitetyn DNA-sekvenssin (SEKVENSSI ID NO:2) mukaiset nukleotidit 946 - 1346 sekä sen osittaiset sekvenssit, joissa promoottoriaktiivisuus on säilynyt.
Erityisiä esimerkkejä terminaattorisekvenssistä ovat edullisesti kuviossa 2 esitetty DNA-sekvenssi (SEKVENSSI
35 37 ID NO:1) ja sen osittaiset sekvenssit, joissa terrainaattoriaktiivisuus on säilynyt.
Ilmentämisvektori, jota voidaan käyttää Candida utilik-5 sessa, voidaan saada liittämällä promoottori- ja terminaattorisekvenssit asiaankuuluvaan plasmidi-vektoriin. Esimerkkejä plasmidivektorista ovat tunnetut E. colin plasmidit, kuten pBluescript ja pUC19, sekä hii-va-E. coli -sukkulaplasmidi, joka sisältää selektio-10 markkerigeenin, kuten L41-sykloheksimidiresistenssi- geenin, ja tarvittaessa kromosomaalisen kohdegeenin suhteen homologisen DNA-sekvenssin. On odotettua, että alan ammattikokemuksen perusteella näitä sekvenssejä voidaan käyttää promoottorina ja terminaattorina muissa isäntä-15 soluissa, erityisesti jossakin Saccharomyces-suvun hii vassa .
PGK-geeni on glykolyyttisessa reaktiotiessä olevaa entsyymiä koodaava geeni ja se ilmentyy voimakkaasti yhdessä 20 glykolyyttisen reaktiotien muita entsyymejä koodaavien geenien kanssa Candida utiliksessa. Siten on odotettua, että sillä on voimakas promoottori. Tuonnempana kuvattavissa esimerkeissä käy ilmi, että tätä promoottoria voidaan käyttää hyödyksi jonkin heterologisen geenin, kuten 25 glukoamylaasigeenin, aminoglykosidifosfotransferaasi- geenin tai /3-galaktosidaasigeenin, ilmentämisessä valmistettuja ilmentämisvektoreita käyttäen.
Lisäksi alan ammattikokemuksen perusteella on ilmeistä, 30 että mikäli tämän keksinnön mukaisiin PGK-geenin promoot tori- ja terminaattorisekvensseihin liitetyn geenin ilmentymistaso ei pienene, niin ilmentämisvektoria voidaan miniaturisoida poistamalla osa näistä sekvensseistä.
35 GAP-geeni Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön GAP-geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit.
38
Erityisiä esimerkkejä promoottorisekvenssistä ovat edullisesti kuviossa 30 esitetty DNA-sekvenssi (SEKVENSSI ID NO:7) ja sen osittaiset sekvenssit, joissa promoottori-aktiivisuus on säilynyt.
5
Erityisiä esimerkkejä terminaattorisekvenssistä ovat edullisesti kuviossa 31 esitetty DNA-sekvenssi (SEKVENSSI ID NO:8) ja sen osittaiset sekvenssit, joissa terminaattoriaktiivisuus on säilynyt.
10
Ilmentämisvektori, jota voidaan käyttää Candida utili-ksessa, voidaan saada liittämällä promoottori- ja termi-naattorisekvenssit asiaankuuluvaan plasmidivektoriin. Esimerkkejä plasmidivektorista ovat tunnetut E. colin 15 plasmidit, kuten pBluescript ja pUC19, sekä hiiva-I?. coli -sukkulaplasmidi, joka sisältää selektiomarkkerigeenin, kuten L41-sykloheksimidiresistenssigeenin, ja tarvittaessa voidaan käyttää kromosomaalisen kohdegeenin suhteen homologista DNA-sekvenssiä. On odotettua, että alan 20 ammattikokemuksen perusteella näitä sekvenssejä voidaan käyttää promoottorina ja terminaattorina muissa isäntä-soluissa, erityisesti jossakin Saccharomyces-suvun hiivassa.
25 GAP-geeni on glykolyyttisessa reaktiotiessä olevaa ent syymiä koodaava geeni ja se ilmentyy voimakkaasti yhdessä glykolyyttisen reaktiotien muita entsyymejä koodaavien geenien kanssa Candida utiliksessa. Siten on odotettua, että sillä on voimakas promoottori. Tuonnempana kuvatta-30 vissa esimerkeissä käy ilmi, että tätä promoottoria voidaan käyttää hyödyksi jonkin heterologisen geenin, kuten aminoglykosidifosfotransferaasigeenin, ilmentämisessä valmistettua ilmentämisvektoria käyttäen.
35 Lisäksi alan ammattikokemuksen perusteella on ilmeistä, että mikäli tämän keksinnön mukaisiin GAP-geenin promoottori- ja terminaattorisekvensseihin liitetyn geenin 39 iImentyrnistaso ei pienene, niin ilraentämisvektoria voidaan miniaturisoida poistamalla osa näistä sekvensseistä.
PMA-geeni 5 Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön PMA- geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit.
Erityisiä esimerkkejä promoottorisekvenssistä ovat edullisesti kuviossa 34 esitetty DNA-sekvenssi (SEKVENSSI ID 10 NO:9) ja sen osittaiset sekvenssit, joissa promoottori-aktiivisuus on säilynyt.
Erityisiä esimerkkejä terminaattorisekvenssistä ovat edullisesti kuviossa 35 esitetty DNA-sekvenssi (SEKVENSSI 15 ID NO:10) ja sen osittaiset sekvenssit, joissa terminaattoriaktiivisuus on säilynyt.
Ilmentämisvektori, jota voidaan käyttää Candida utilik-sessa, voidaan saada liittämällä promoottori- ja 20 terminaattorisekvenssit asiaankuuluvaan plasmidi- vektoriin. Esimerkkejä plasmidivektorista ovat tunnetut E. colin plasmidit, kuten pBluescript ja pUC19, sekä hii-va-E. coli -sukkulaplasmidi, joka sisältää selektio-markkerigeenin, kuten L41-sykloheksimidiresistenssi-25 geenin, ja tarvittaessa voidaan käyttää kromosomaalisen kohdegeenin suhteen homologista DNA-sekvenssiä. On odotettua, että alan amaattikokemuksen perusteella näitä sekvenssejä voidaan käyttää promoottorina ja terminaatto-rina muissa isäntäsoluissa, erityisesti jossakin 30 Saccharomyces-suvun hiivassa.
PMA-geeni on plasmamembraarientsyymiä koodaava geeni, ja sen tiedetään Saccharomyces-hiivassa olevan primäärinen proteiini, joka muodostaa noin 10 % plasmamembraani-35 proteiineista. PMA-geenillä odotetaan siten olevan voi makas promoottori. Tuonnempana kuvattavissa esimerkeissä käy ilmi, että tätä promoottoria voidaan käyttää hyödyksi 40 jonkin heterologisen geenin, kuten aminoglykosidifosfo-transferaasigeenin, ilmentämisessä valmistettua ilmentämisvektoria käyttäen.
5 Lisäksi alan ammattikokemuksen perusteella on ilmeistä, että mikäli tämän keksinnön mukaisiin PMA-geenin promoottori- ja terminaattorisekvensseihin liitetyn geenin ilmentymistaso ei pienene, niin ilmentämisvektoria voidaan miniaturisoida poistamalla osa näistä sekvensseistä.
10
Promoottoriaktiivisuuksia sisältävät DNA-sekvenssit Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön promoottoriaktiivisuuksia sisältäviä DNA-sekvenssejä.
DNA-sekvenssit eristetään käyttämällä vektoria, joka si-15 sältää autonomisesti replikoituvan DNA-sekvenssin ja lääkeaineresistenssimarkkerigeenin, joka ei sisällä transkription promoottorisekvenssiä. Erityisiä esimerkkejä promoottoriaktiivisuutta sisältävästä DNA-sekvenssistä ovat edullisesti kuviossa 48 esitetty DNA-sek-20 venssi (SEKVENSSI ID NO:13) ja tämän osittainen sekvenssi, jossa promoottoriaktiivisuutta on jäljellä. Lisäksi kuten tuonnempana olevissa esimerkeissä on kuvattu, saatiin kuvion 48 mukaisen DNA-sekvenssin lisäksi aikaan kahdeksan promoottoriaktiivisuutta sisältävää DNA-sek-25 venssiä. Promoottoriaktiivisuuksia sisältäviä DNA-sek venssejä voidaan myös eristää korvaamalla lääkeaine-resistenssigeeni, jossa ei ole transkription promoottorisekvenssiä, muilla geeneillä, kuten hygromysiini B -resistenssigeenillä. Lisäksi promoottori, jossa 30 transkriptioaktiivisuus indusoituu tietyissä nimen omaisissa olosuhteissa, on myös mahdollista saada aikaan muuttamalla selektio-olosuhteita, kuten transformanttien selektioon käytettävässä maljassa olevia sokereita, tai mediumin muuta koostumusta. Nämä ovat tämän patentti-35 selityksen kuvaukseen tutustumisen jälkeen alan ammatti kokemuksen perusteella ilmeisiä.
41
Ilmentämisvektori, jota voidaan käyttää Candida utilik-sessa, voidaan saada aikaan liittämällä promoottori- ja terminaattorisekvenssit asiaankuuluvaan plasmidi-vektoriin. Esimerkkejä plasmidivektorista ovat tunnetut 5 E. colin plasmidit, kuten pBluescript ja pUC19, sekä hii- va-E. coli -sukkulaplasmidi, joka sisältää selektio-markkerigeenin, kuten L4l-sykloheksimidiresistenssi-geenin, ja tarvittaessa voidaan käyttää kromosomaalisen kohdegeenin suhteen homologista DNA-sekvenssiä. On odo-10 tettua, että alan amaattikokemuksen perusteella näitä sekvenssejä voidaan käyttää promoottorina ja terminaatto-rina muissa isäntäsoluissa, erityisesti jossakin Saccharomyces-suvun hiivassa.
15 Tuonnempana kuvattavissa esimerkeissä on osoitettu, että tätä promoottoria voidaan käyttää hyväksi heterologisen geenin, kuten aminoglykosidifosfotransferaasigeenin, ilmentämisessä käyttämällä valmistettua ilmentämis-vektoria.
20
Lisäksi alan ammattikokemuksen perusteella on ilmeistä, että mikäli tämän keksinnön mukaiseen promoottori-sekvenssiin liitetyn geenin ilmentymistaso ei pienene, niin ilmentämisvektoria voidaan miniaturisoida poistamal-25 la osa tästä sekvenssistä.
rRNA-geeni Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön noin 13,5 ke:n suuruinen Candida utiliksen rRNA-geenit sisäl-30 tävä DNA-fragmentti sekä DNA-sekvenssi, joka sisältää tämän fragmentin toistuvassa muodossa.
Tätä noin 13,5 ke:n suuruista fragmenttia esittää kuviossa 6(b) esitetty restriktioentsyymikartta. 18S-, 5,8S- ja 35 25S-rRNA-geenien asemat DNA-sekvenssissä on esitetty ku viossa 6 (b) .
42 DNA-fragmentti saadaan liitettyä tehokkaasti kromosomiin suurina kappalemäärinä käyttämällä kohdesekvenssinä osaa rRNA-geenien aluetta. Keksinnössä konstruoitiin plasmide-ja, jotka sisälsivät neljä sellaista fragmenttia, jotka 5 oli saatu aikaan jakamalla 13,5 ke:n suuruinen DNA-fragmentti neljään osaan ja joita käytettiin transformaatioon. Oli mielenkiintoista tehdä se havainto, että näin saadut transformaatiofrekvenssit olivat erilaiset sen mukaan, mitä alueista käytettiin liittymisen kohde-10 sekvenssinä. Kun transformaatiofrekvenssi oli pieni käytettäessä plasmidia pCLRE5, joka sisältää 2,4 ke:n suuruisen 18S-rRNA-geenin sisältävän EcoRI-fragmentin, niin transformaatiofrekvenssit olivat korkeita käytettäessä plasmidia pCLRE4, joka sisältää 3,5 ke:n 15 suuruisen EcoRI-fragmentin, jossa on osa 18S-rRNA-geenin 3'-puoleista osaa, 5,8S-rRNA-geeni ja osa 25S-rRNA-geenin 5'-puoleista osaa, käytettäessä plasmidia pCLRE6, joka sisältää 3 ke:n suuruisen 25S-rRNA-geenin sisältävän EcoRI-fragmentin, sekä käytettäessä plasmidia pCLRE7, 20 joka sisältää 4,7 ke:n suuruisen EcoRI-fragmentin, jossa on osa 18S-rRNA-geenin 5'-puoleista osaa.
URA3-geeni Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön Candida 25 utiliksen URA3-geeni, joka komplementoi Saccharomyces cerevisiae -hiivan ura3-mutaatiota. Geeniä voidaan käyttää edellä kuvatulla tavalla DNA-fragmentin liittymis-kohteena ja sitä voidaan myös käyttää ura3-mutantin valmistamisessa vaurioittamalla kromosomaalista URA3-geeniä. 30 Isäntänä käytetty ura3-mutantti tekee mahdolliseksi saada aikaan transformantin käyttämällä selektiomarkkerigeeninä URA3-geeniä, joka ei ole lääkeaineresistenssimarkkeri-geeni. Lisäksi on ilmeistä, että tämän geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssejä voidaan myös käyttää 35 heterologisen geenin ilmentämiseen.
43 URA3-geeni koodaa kuvioissa 10 ja 11 esitettyä aminohapposekvenssiä (SEKVENSSI ID NO:4). URA3-geeniksi katsotaan geeni, joka sisältää kuviossa 9 esitetyn DNA-sekvenssin (SEKVENSSI ID NO:3) tai sellaisen osittaisen 5 sekvenssin, jossa Saccharomyces cerevisiae -hiivan ura3-mutaatiota komplementoiva ominaisuus on säilynyt.
Autonomisesti reolikoituva DNA-sekvenssi (ARS) Tämän keksinnön mukaisesti siitä saadaan käyttöön auto-10 nomisesti replikoituvia DNA-sekvenssejä, jotka voivat saada tämän DNA-sekvenssin sisältävän vektorin jäämään episomaaliseksi plasmidiksi Candida utilikseen ja parantaa isännän transformaatiofrekvenssiä. DNA-fragmentti voidaan saada mistä tahansa organismista ja edullisesti 15 Candida utiliksesta. Erityisiä esimerkkejä ARS-sekvens- sistä ovat edullisesti kuvioissa 41 ja 42 esitetyt DNA-sekvenssit (SEKVENSSI ID NO:11) ja kuvioissa 43 ja 44 esitetyt sekvenssit (SEKVENSSI ID NO:12), ja näiden autonomisesti replikoitavat osittaiset sekvenssit. Tuonnempa-20 na olevista esimerkeistä käy ilmi, että pienentyneestä transformaatiofrekvenssistä huolimatta on myös mahdollista transformoida Candida utilis -hiiva plasmideilla, joiden DNA-fragmentteja on lyhennetty.
25 Vektori, joka voi esiintyä plasmidina Candida utilikses-sa, saadaan käyttöön käyttämällä ARSrää ja asiaankuuluvaa selektiomarkkerigeeniä. Lisäksi tätä vektoria käyttäen eristetään promoottoriaktiivisuuksia sisältäviä DNA-sekvenssejä sekä muita toimintoja sisältäviä DNA-sekvensse-30 jä. On myös mahdollista valmistaa transformoitu hiiva, jonka kromosomiin on saatu jäämään pelkästään heterologi-sen geenin sisältävä DNA-fragmentti, jossa ei ole selektiomarkkerigeeniä, käyttämällä transformanttien selektoimiseksi ARS:n ja asiaankuuluvan markkerigeenin 35 sisältävää plasmidia sekä Candida utiliksen kromosomaali-sen DNA:n suhteen homologisen sekvenssin (homologinen 44 DNA-sekvenssi) sisältävää plasmidia, jossa ei ole selektiomarkkerigeeniä.
Esimerkit 5 Tätä keksintöä kuvataan lisäksi erityisesti käyttäen seu-raavia esimerkkejä mutta se ei rajoitu näihin esimerkkeihin .
Tässä patenttiselityksessä geenien restriktioentsyymi-10 kartoissa olevat restriktioentsyymikohdat on esitetty seuraavasti.
Aa; Aatu, Af; AF1II, AI; AflUI, Ap; Apal, B; BamHI, Bg; Bglll, C; Clal, E; EcoRI, RV; EcoRV, H; Hindlll, Hp; 15 Hpal, K; Kpnl, P; PstI, Pv; PvuII, S; Sali, Se; Spel, Sm;
Smal, Sc; SacI, Sell; SacII, Sp; SphI, X; Xbal ja Xh;
XhoI.
Seuraavissa esimerkeissä käytetyt menetelmät ovat: 20 1) Deleetiomutaatiokäsittely käyttämällä ExoIII-nukleaa-sia ia muna-pavun nukleaasia ia DNA-sekvenssin määritys Kun plasmidi (10 μg) oli pilkottu asiaankuuluvalla restriktioentsyymillä, se uutettiin fenolin ja kloro-25 formin seoksella ja saostettiin etanolilla DNA:n talteen- ottamiseksi. DNA liuotettiin 100 μl:aan seosta, joka sisälsi ExoIII-puskuriliuosta (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanoli) sekä 180 yksikköä ExoIII-nukleaasia, ja seosta inkuboitiin 30 37 °C:ssa. Seoksesta otettiin joka minuutti 10 μ1:η suu ruinen näyte ja kaksi näytettä yhdistettiin keskenään ja siirrettiin jäissä jäähdytettyyn koeputkeen, johon oli pipetoitu 20 μΐ MB-puskuria (40 mM Na-asetaatti, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl2, 10 % glyseroli, pH 4,5). Kun näin saa-35 tua viittä putkea oli inkuboitu 65 °C:ssa 10 minuuttia entsyymin inaktivoimiseksi, niin seokseen lisättiin 5 yksikköä mung-pavun nukleaasia ja sen annettiin reagoida 45 37 °C:ssa 30 minuuttia. Reaktion jälkeen koottiin agaroosigeelielektroforeesia käyttäen talteen viisi DNA-fragmenttia, jotka sisälsivät eriasteisia deleetioita. Näin talteenotetut DNA-fragmentit käsiteltiin Klenow-ent-5 syymillä tasaisten päiden aikaansaamiseksi, ne ligatoi-tiin 16 °C:ssa yön yli ja niitä käytettiin E. colin transformaatioon.
Näin saaduissa plasmideissa olevat insertiofragmentit 10 sekvensoitiin käyttäen fluorescent primer cycle (fluoresoivilla alukkeilla suoritettava PCR-menetelmäsekven-sointi) -sekvensointireagenssipakkausta (Applied Bio-systems, K.K.) ja DNA-sekvenssi määritettiin automaattisella DNA:n sekvensointilaitteella.
15 2) Hybridisaatio
Agaroosigeelielektroforeesin jälkeen DNA siirrettiin Southern-hybridisaatiota varten tarkoitetun suodattimen valmistamiseksi emäksisissä olosuhteissa Hibond N + -suo-20 dattimelle (Amersham) valmistajalta saadun ohjeen mukaisesti .
Suodatin, jolle DNA oli kiinnitetty, esihybridisoitiin kahden tunnin ajan 65 °C:ssa hybridisaatioliuoksessa (6 x 25 SSC, 5 x Denhardt'in liuosta, 0,2 % SDS, 20 μ$/τχι1 lohen maidin DNA:ta). Hybridisaatioliuokseen lisättiin koetin-DNA, joka oli varustettu leimalla käyttäen Megaprime DNA labelling -järjestelmiä ja [o'-32?] dCTP: tä (110 TBq/mmol) ja hybridisaatio suoritettiin 65 °C:ssa 16 tunnin ajan.
30 Suodatin pestiin hybridisaation jälkeen 65 °C:ssa 2 tun nin ajan 1 x SSC:llä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää, ja sille suoritettiin sitten autoradiografia signaalien havaitsemiseksi .
35 3) Mediumin koostumus
Hiivan viljelyyn käytetyn YPD-mediumin koostumus on 1 % hiivauutetta, 2 % bacto-peptonia ja 2 % glukoosia. Mal- 46 joihin käytettyyn mediumiin lisättiin agaria, jonka määrä oli 2 %. SD-mediumin koostumus on 0,67 % hiivan typpi-perusravinnetta, jossa ei ole aminohappoja, ja 2 % glukoosia. Mediumiin lisättiin aminohappoja käytetyn hiivan 5 ravintovaatimusten mukaan. Maljoihin käytettyyn mediumiin lisättiin agaria, jonka määrä oli 2 %.
4) Entsyymikäsittely DNA:n käsittelyt entsyymeillä, kuten reaktio restriktio-10 entsyymien kanssa sekä käsittelyt K1enow-entsyymillä ja T4-DNA-ligaasilla, suoritettiin valmistajien suosittelemissa olosuhteissa tai menetelmien mukaan, jotka on kuvattu teoksessa Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook, et ai., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) .
15
Esimerkki 1: Candida utiliksen kromosomaalisen DNA:n valmistus
Candida utiliksen kromosomaalinen DNA eristettiin seuraa-valla menetelmällä. Candida utilis ATCC 9950 -kanta ym-20 pättiin 30 ml:aan YPD-mediumia ja sitä viljeltiin 30 °C:ssa varhaiseen stationaarivaiheeseen. Solut koottiin sentrifugoimalla, pestiin steriloidulla vedellä ja koottiin uudelleen talteen sentrifugoimalla. Kun solut oli suspendoitu 3 ml:aan Zymolyase-puskuria (0,9 M sorbi-25 toli, 0,1 M EDTA, 50 mM DTT, pH 7,5) seokseen lisättiin 200 μΐ 0,9 M sorbitolia, joka sisälsi Zymolyase 100T:tä, jonka konsentraatio oli 25 mg/ml, ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa ravistellen. Kun protoplastien muodostuminen oli varmistettu tarkastelemalla seosta mikroskoopilla, 30 koottiin protoplastit talteen sentrifugoimalla. Kun seokseen oli ensin lisätty 3 ml hajotuspuskuria (50 mM Tris-HC1, 50 mM EDTA, pH 8,0), suspendoitiin protoplastit varovasti ja riittävän hyvin puskuriin, minkä jälkeen seokseen lisättiin 0,3 ml 10-%:ista SDS:ää ja sitä inkuboi-35 tiin 65 °C:ssa yön yli. Tämän jälkeen seokseen lisättiin 1 ml 5 M kaliumasetaattiliuosta ja seoksen annettiin jäädä paikoilleen jäiden päälle 1 tunnin ajaksi. Saostumat 47 poistettiin sitten sentrifugoimalla, seokseen lisättiin 4 ml kylmää etanolia ja se sentrifugoitiin DNA:n saosta-miseksi. Saostuma pestiin 50-%:isella etanolilla, kuivattiin, liuotettiin 3 ml:aan RNaasi A -puskuria (10 mM 5 Tris-HCl, 1 mM EDTA, 50 ^g/ml RNaasi A, pH 7,5) ja sitä inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Seokseen lisättiin lopuksi 3 ml 2-propanolia ja se sentrifugoitiin supernatantin poistamiseksi. Näin saadut saostumat pestiin 50-%:isella 2-propanolilla ja kuivattiin. Saostuma 10 liuotettiin 0,5 mitään TE-puskuria ja sitä käytettiin Candida utiliksen kromosomaalisen DNA:n näytteenä.
Esimerkki 2: Fosfoqlyseraattikinaasi (PGK) -geenin kloonaus 15 Kun Candida utiliksen kromosomaalinen DNA oli pilkottu osittain Sau3AI-restriktioentsyymillä, niin pilkottu seos pipetoitiin kerrokseksi 10 - 50-%:isen sakkaroositiheys-gradientin päälle, joka sisälsi 0,8 M NaCl:ää, 20 mM Tris-HCl:ää, 10 mM EDTA:a (pH 8,0), ja tälle suoritettiin 20 DNA-fragmenttien fraktioimiseksi 14 tunnin sentrifugointi 120 000 x g:n voimalla. Näistä fragmenteista peräisin oleva 10 - 20 ke:n suuruinen kromosomaalinen DNA-frag-mentti ligatoitiin yön yli defosforyloituun DASHTMII-λ-faagivektoriin (Stratagene Cloning Systems), joka oli 25 pilkottu BamHItlla, ja käsiteltiin sitten sen pakkaami seksi in vitro -olosuhteissa Candida utiliksen genomisen DNA-kirjaston konstruoimiseksi.
Candida utiliksen PGK-geeni kloonattiin käyttäen koetti-30 mena toisesta organismista peräisin olevaa tunnettua PGK-geeniä. Tarkemmin sanottuna suodattimet, joille oli adsorboitu noin 20 000 edellä kuvatusta DNA-kirjastosta peräisin olevaa faagi-DNA-plakkia, valmistettiin teoksessa Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook, et ai., Cold 35 Spring Harbor Laboratory Press (1989), kuvatun menetelmän mukaisesti. Tämän jälkeen Saccharomyces cerevisiaen PGK-geenin sisältävä DNA-fragmentti irrotettiin 2 ke:n suu- 48 ruisena Clal-fragmenttina PGK-geenin sisältävästä plasmi-dista pST2 [Yamano, et al., Journal of Biotechnology 32 (1994) 165 - 171]. Tämä fragmentti varustettiin tämän jälkeen 32P-leimalla ja sitä käytettiin koettimena hybri-5 disointiin. Tuloksena kloonautui neljä positiivista plakkia. Faagi-DNA-molekyylit, jotka oli valmistettu kustakin näistä plakista, pilkottiin useilla erilaisilla restriktioentsyymeillä ja seoksille suoritettiin Sout-hern-blottianalyysi käyttäen samaa koetinta kuin mitä 10 edellä oli käytetty. Tuloksena eristettiin koettimeen hybridisoituva 2,6 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti ja 2,5 ke:n suuruinen Sali-fragmentti.
Esimerkki 3: PGK-geenin sisältävän fragmentin DNA-sek-15 venssin määritys ia rakennecreenin ia säätelyalueiden luonnehtiminen Näin eristetty 2,6 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti liitettiin Bluescript IISK+ -plasmidivektorin EcoRI-kohtaan sellaisten plasmidien pPGKEl ja pPGKE2 konstruoimiseksi, 20 joiden insertiofragmentit suuntautuvat päinvastaisiin suuntiin vektoriin nähden. 2,6 ke:n suuruinen Sali-fragmentti liitettiin myös Bluescript IISK+ -vektorin Sali-kohtaan sellaisten plasmidien pPGKSl ja pPGKS2 valmistamiseksi, joiden insertiofragmentit suuntautuvat vastak-25 kaisiin suuntiin vektoriin nähden (kuvio 1).
Plasmideista pPGKEl ja pPGKE2 saatiin useita erilaisia deleetiomutaatioita valmistamalla deleetiomutantteja restriktioentsyymikohtien, kuten Hindlll-, Kpnl- tai 30 Sali-kohtien, kohdalta, tai valmistamalla deleetio- mutantti käyttämällä ExoIII-nukleaasia ja mung-pavun nuk-leaasia, ja 2530 ep:n suuruisen EcoRI-fragmentin DNA-sek-venssi määritettiin.
35 Analysoimalla aluetta, jossa rakennegeenin odotettiin esiintyvän, havaittiin 1248 ep:n suuruinen avoin luku-kehys. Homologia Saccharomyces cerevisiaen PGK-geenin 49 suhteen tutkittiin käyttämällä avoimen lukukehyksen DNA-sekvenssistä pääteltyä aminohapposekvenssiä. Nämä sekvenssit olivat keskenään 86,8-%:isesti homologisia, joten eristetyn geenin pääteltiin olevan Candida utiliksen PGK-5 geeni.
EcoRI-fragmentti sisälsi geenin ilmentymisen säätely-alueina ATG-aloituskodonista vastasuuntaan olevan 401 ep:n suuruisen fragmentin ja TAA-lopetuskodonista 10 myötäsuuntaan olevan 880 ep:n suuruisen fragmentin. TAA- lopetuskodonia seuraavan nukleotidin ja EcoRI-kohdan välissä sijaitsevan 880 ep:n suuruisen fragmentin DNA-sekvenssi, joka voi sisältää transkription terminaattorin, on esitetty kuviossa 2. Lisäksi plasmideista pPGKSl ja 15 pPGKS2 valmistettiin deleetiomutaatioita sisältäviä plas- mideja valmistamalla deleetiomutantteja ExoIII-nukleaa- silla ja mung-pavun nukleaasilla HindiII-kohdan ja EcoRI-kohdan välisen DNA-sekvenssin määrittämiseksi (kuvio 1). HindiII-kohdan ja välittömästi aloituskodonia edeltävän 20 nukleotidin välisen 1346 ep:n suuruisen fragmentin sekvenssi, joka voi sisältää transkription promoottorin, on esitetty kuviossa 3.
Esimerkki 4: PGK-oeenin promoottorin ia terminaattorin 25 sisältävien ilmentämisvektoreiden konstruktio
Heterologisen geenin ilmentämiseksi Candida utiliksessa tarvitaan Candida utiliksessa toimiva geenien ilmentämis-koneisto, toisin sanoen transkription promoottori ja transkription terminaattori. Näin ollen valmistettiin 30 ilmentämisvektoriplasmideja, jotka sisältävät Candida utiliksen PGK-geenin promoottorin ja terminaattorin välissä sijaitsevan monikäyttöisen kloonauskohdan (multi-cloning site) .
35 Ensimmäiseksi valmistettiin promoottoria tai terminaatto- ria sisältävät fragmentit käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR).
50 Käyttämällä plasmidia PGKS1 templaattina valmistettiin promoottoriksi fragmentti, joka ulottui aloituskodonista 2,3 ke vastasuuntaan sijaitsevasta Sali-kohdasta välittömästi aloituskodonia ATG edeltävään nukleotidiin. Aluk-5 keet syntetoitiin käyttäen seuraavia sekvenssejä, joihin promoottorifragmentin 3'-päässä olevaa aloituskodonia välittömästi edeltävään kohtaan oli muodostettu Xbal-koh-ta.
10 5'-GGTCGACATATCGTGGTAAGCGCCTTGTCA-3' (SEKVENSSI ID NO:14) 5'-TTCTAGACTTTATCCGCCAGTATGTTAGTC-3' (SEKVENSSI ID NO:15) Käyttäen templaattina plasmidia PGKE1 valmistettiin lisäksi terminaattoriksi fragmentti, joka ulottui lopetus-15 kodonia seuraavasta nukleotidistä 800 ep myötäsuuntaan olevaan EcoRI-kohtaan. Syntetisoitiin seuraavat sekvenssit sisältävät alukkeet, joihin välittömästi terminaat-torifragmentin 5'-päässä olevan lopetuskodonin jälkeen valmistettiin Kpnl-kohta.
20
5'-GGGTACCTAACTGCAAGCTACTTTGTAATTAAC-3' (SEKVENS SI ID
NO:16) 5'-GGAATTCAACATGAATGACACGACGAAGGT-3' (SEKVENS SI ID NO:17) 25 PCR-menetelmää käytettiin kolmenkymmenen syklin ajan käyttäen Pfu-DNA-polymeraasia (Stratagene Cloning Systems) ja tämän mukana tulevaa puskuria.
PCR-menetelmällä syntetisoidut promoottori- ja termi-30 naattorifragmentit pilkottiin Sali :11a ja Xbal:lla tai Kpnl:lla ja EcoRI:11a, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Fragmentit liitettiin peräkkäin pUC19:ssa olevaan SaiI-Xbal-kohtaan ja Kpnl-EcoRI-kohtaan plasmidin pGKPTl (kuvio 4) konstruoimiseksi. Kun plasmidin ter-35 minaattorin 3'-päässä oleva EcoRI-kohta oli käsitelty
Klenow-entsyymillä tasaisen pään muodostamiseksi ja liga-toitu Notl-kytkijöihin (5'-AGCGGCCGCT-3': SEKVENSSI ID
51 NO :18), valmistettiin 0,9 ke:n suuruinen Pstl-Notl-fragmentti pilkkomalla plasmidi Pstl:lla. Tämä fragmentti ja plasmidista pPGKSl pilkottu 1,2 ke:n suuruinen Hindlll-Pstl-fragmentti liitettiin pBluescript SK-:n HindIII-koh-5 dan ja NotI-kohdan väliin plasmidin pPGKPT2 konstruoimi seksi. pPGKPT2 pilkottiin lisäksi BglII:lla, käsiteltiin Klenow-entsyymillä ja muodostettiin uudelleen renkaaksi terminaattorifragmentissa olevan Bglll-kohdan poistamiseksi ja plasmidin pPGKPT3 konstruoimiseksi. Kun 10 pPGKPT3:n Hindlll-kohta oli tämän jälkeen käsitelty
Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi, niin fragmentti ligatoitiin Notl-kytkijöihin (5'-AGCGGCCGCT-3', SEKVENSSI IDN0:18) plasmidin pPGKPT4 konstruoimiseksi. Plasmidi pPGKPT4 pilkottiin osittain 15 Kpnl:lla ja promoottorin nähden vastasuuntaan sijaitseva
Kpnl-kohta deletoitiin plasmidin pPGKPTS (kuvio 4) konstruoimiseksi .
Esimerkki 5: rDNA:n eristäminen 20 400 ng:n suuruinen erä Candida utilis ATCC 9950:n genomi- sen DNA:n Sau3AI:lla osittain pilkottuja DNA-fragmentteja, jotka olivat kooltaan 5 - 10 ke ja jotka oli saatu esimerkissä 2 kuvatulla sakkaroositiheysgradienttisentri-fugoinnilla, ja 200 ng BamHI:lla pilkottua ja defosfory-25 loitua vektoriplasmidia pBR322 ligatoitiin yön yli T4- DNA-ligaasilla. E. coli DH5 transformoitiin tällä DNA-liuoksella Candida utiliksen genomisen DNA-kirjaston konstruoimiseksi.
52
Saccharomyces cerevisiae S288C:n [o?, suc2, mal, gal2, CUP1] genomisen DNA:n kirjastosta käyttäen koettimena 32P-leimalla varustettua oligomeeriä, joka vastaa nukleotideistä 4-42 koostuvaa fragmenttia 5,8S-rRNA-geenin 5 5'-päässä (Sone, et ai., japanilainen patenttijulkaisu nro 14 865/1994) .
Saatiin yli 200 positiivista kloonia. Seitsemästä kloonista peräisin olevista plasmideista pCRl, pCR4, pCR5, 10 pCR6, pCR7, pCR8 ja pCR9 valmistettiin restriktio- entsyymikartat ja ne kohdistettiin vertailua varten toistensa suhteen. Restriktioentsyymikartat olivat molemmissa päissä yhtäpitävät (kuvio 5). Tämän perusteella on havaittu, että Candida utiliksen rRNA-geenin sisältävällä 15 alueella on noin 13 ke:n suuruinen toistuva rakenne.
Näistä plasmideista peräisin olevat fragmentit, jotka oli irrotettu pilkkomalla EcoRIrlla tai Xbalrlla, jatko-kloonattiin pBluescript SK-reen plasmidien pCREl, pCRE2, 20 pCRE3, pCRXl, pCRX2, pCRX3 ja pCRX4 [kuvio 6(a)] konst ruoimiseksi. Lisäksi nämä plasmidit pilkottiin useilla erilaisilla restriktioentsyymeillä ja ne muutettiin takaisin rengasmaisiksi useiden erilaisten deleetio-plasmidien aikaansaamiseksi. Näiden plasmidien insertio-25 fragmenttien sekvenssit määritettiin ja kuviossa on nuo lilla esitetty DNA-sekvenssin määritetykseen käytetyt alueet. DNA-sekvenssien analyysistä kävi ilmi, että niissä esiintyi alueita, joilla on voimakasta homologiaa 18S-, 5,8S- ja 25S-rRNA-geenien suhteen. Siten näiden 30 kolmen rRNA-geenin sijainti ja transkription suunta saa tiin määritettyä [kuvio 6(b)].
Esimerkki 6: Qroditiini-5'- fosfaattidekarboksylaasigeenin (URA3-geenin) kloonaus 35 100 ng:n suuruinen erä Candida util is ATCC 9950:n genomi sen DNA:n Sau3AI:11a osittain pilkottuja DNA-fragmentteja, jotka olivat kooltaan 5 - 10 ke ja jotka oli saatu 53 esimerkissä 2 kuvatulla sakkaroositiheysgradienttisentri-fugoinnilla, sekä 100 ng BamHI:lla pilkottua ja de-fosforyloitua vektoriplasmidia YEpl3 [Methods Enzymol.
194 (1991) 195 - 230], ligatoitiin yön yli T4-DNA-ligaa-5 silla. E. coli DH5 transformoitiin tällä DNA-liuoksella
Candida utiliksen genomisen DNA-kirjaston konstruoimiseksi. Kun plasmidiseos oli ensin uutettu transformanteista, niin Saccharomyces cerevisiae YPH 500 (ahis3, trpl, leu2, ade2, lys2, ura3) (Stratagene Cloning Systems), joka on 10 ura3-kanta, transformoitiin plasmidi-DNA-seoksella ja transformantit, jotka eivät vaatineet urasiilia kasvaakseen, selektoitiin minimimediumilla. S. cerevisiaen transformaatio suoritettiin noudattaen litiummenetelmää, joka on kuvattu sivuilla 122 - 123 teoksessa Methods in 15 Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990).
Tällä menetelmällä saatiin 10 jug:sta DNA: ta viisi Ura+-kantaa. Kustakin näistä transformanteista valmistettiin 20 plasmidi-DNA noudattaen menetelmää, joka on kuvattu teoksessa Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990). E. coli transformoitiin tällä DNA:11a ja valmistettiin plasmidi-DNA. YEpl3:n BamHI-25 kohdassa olevasta plasmidista pCURA3-3, joka sisälsi 6,1 ke:n suuruisen insertiosekvenssin, ja YEpl3:n BamHI-kohdassa olevasta plasmidista plasmidista pCURA3-5, joka sisälsi 8,1 ke:n suuruisen insertiosekvenssin, konstruoitiin restriktioentsyymikartat.
30
Esimerkki 7: URA3-creenialueen luonnehtiminen ia DNA-sek-venssin määritys URA3-geenialueen luonnehtimiseksi pilkottiin plasmidista pCURA3-5 5 ke:n suuruinen plasmideille pCURA3-3 ja 35 pCURA3-5 yhteisen alueen sisältävä EcoRI- fragmentti, ja tämä ligatoitiin plasmidin pRS314 (Stratagene Cloning Systems) EcoRI-kohtaan plasmidin pURAEl valmistamiseksi 54 (kuvio 7). YPH 500 -kanta transformoitiin tällä plasmi-dilla litiummenetelmää käyttäen. Tulokseksi saatiin suurella frekvenssillä URA+-transformantteja. Tämä merkitsee sitä, että URA3-geeni esiintyy 5 ke:n suuruisessa 5 EcoRI-fragmentissa ja yksi kappale tätä geeniä voi komp- lementoida Saccharomyces cerevisiaen ura3-mutaatiota.
Plasmidi pURAEl pilkottiin lisäksi XhoI:lla tai Pstlrlla ja muutettiin uudelleen rengasmaiseen muotoon T4-ligaasi-10 reaktiolla plasmidien pURAElAXho- ja pURAElAPst muodosta miseksi .
Lisäksi plasmidista pURAEl irrotettu 3,5 ke:n suuruinen EcoRI-Clal-fragmentti ja 2,3 ke:n suuruinen Hindlll-frag-15 mentti liitettiin pRS314:n EcoRI- ja Clal-kohtiin tai
Hindlll-kohtaan, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna, plasmidien pURAECl ja pURAHl valmistamiseksi (kuvio 7).
YPH500-kanta transformoitiin edellä kuvatuilla viidellä 20 plasmidilla käyttäen litiummenetelmää ura3~-mutaation komplementoituvuuden tutkimiseksi ja siten sen tutkimiseksi, sisälsivätkö nämä fragmentit mahdollisesti URA3-geenin. Tulokset osoittivat, että URA3-geeni sijaitsee EcoRI:n ja HindIII:n välissä sijaitsevalla 2,3 ke:n suu-25 ruisella alueella.
Lisäksi pBluescript SK'-plasmidin HindiII-kohtaan liga-toitiin plasmidin pURAH2 valmistamiseksi 2,3 ke:n suuruinen URA3-geenin sisältävä fragmentti. Käyttämällä 30 insertiofragmentin molemmista päistä ExoIII-nukleaasin ja mung-pavun nukleaasin avulla tehtyä deleetiomutaatiota valmistettiin deleetiomutaation sisältäviä plasmideja ja DNA:n sekvenssi määritettiin. Kuviossa 8 on esitetty DNA-sekvenssin avulla selvitetty restriktioentsyymikartta 35 sekä sekvensointistrategia. Näin saatu 2330 ep:n suurui nen DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 9 ja 267 amino- 55 happoryhmää sisältävän polypeptidin päätelty aminohapposekvenssi on esitetty kuvioissa 10 ja 11.
Polypeptidin aminohapposekvenssiä verrattiin muiden hii-5 vojen URA3-proteiinin aminohapposekvenssiin, jossa esiintyi voimakasta homologiaa, esimerkiksi 73,4 % Saccharo-myces cerevisiaen suhteen, 76,3 % Kluyveromyces lactiksen suhteen ja 75,1 % Candida albicansin suhteen.
10 Esimerkki 8: L41-geenin kloonaus ia L41-geeniä sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssin määritys Noudattaen sivuilla 12, 21 - 23 teoksessa Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook, et ai., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) kuvattua menetelmää valmistet-15 tiin esimerkissä 5 valmistetun kirjaston noin 30 000 pe säkettä vastaavat suodattimet ja niiden seulonta suoritettiin käyttäen koettimena 1,1 ke:n suuruista 32P-lei-malla varustettua XbaI-Sau3AI-fragmenttia, joka sisälsi Candida maltosan L41-geenin, RIM-C:n [Kawai, et ai., J.
20 Bacteriol. 174 (1992) 254 - 262], Näin menetellen saatiin viisi positiivista kloonia. Konstruoitiin näiden kolmen kloonin, PCL41-l:n, PCL41-2:n ja PCL41-5:n, restriktioentsyymikartat, joita verrattiin 25 toisiinsa. Nämä kloonit sisältävät 4 ke:n suuruisen yh teisen EcoRI-fragmentin (kuvio 12). Näiden plasmidi-DNA-molekyylien Southern-hybridisaatioanalyysistä kävi ilmi, että 4 ke:n suuruisen EcoRI-fragmentin sisältämässä 1,4 ke:n suuruisessa Clal-Pstl-fragmentissa on alue, jol-30 la on homologiaa Candida maltosan L41-geenin suhteen.
Tämä 4 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti liitettiin pBlue-script SKhn EcoRI-kohtaan plasmidien pCLEl ja pCLE2 valmistamiseksi, joissa fragmentit on liitetty päin-35 vastaiseen suuntaan toisiinsa nähden. BamHI-kohdasta
Sacl-kohtaan ulottuvan 2086 ep:n suuruisen DNA-sekvenssin määrittämiseksi (kuvio 13) tehtiin näistä kahdesta plas- 56 midista useita erilaisia deleetiomutaatioita sisältäviä plasmideja valmistamalla deleetiomutantit HindIII:lla, XhoI:lla tai Clalrlla, joilla on katkaisukohta EcoRI-fragmentissa, tai valmistamalla deleetiomutantit käyttä-5 mällä ExoIII-nukleaasia ja mung-pavun nukleaasia.
Southern-analyysistä kävi ilmi, että alueella, jossa L41:n rakennegeenin on päätelty esiintyvän, sijaitsee 318 ep:n suuruinen avoin lukukehys, jonka keskeyttää 10 367 ep:n suuruinen introni (kuviot 12 ja 14). 5'- ja 3'- päissä ja 3'-terminaalisen pään läheisyydessä alueella, jonka pääteltiin olevan intronin, havaittiin introneissa yleinen sekvenssi GTATGT--TACTAAC--AG. Lisäksi nämä sekvenssit sijaitsevat välittömästi aloituskodonin jälkeen, 15 samoin kuin on asianlaita niiden muiden hiivojen kuuden L41-geenin kyseessä ollessa, jotka on kuvattu julkaisuissa Kawai, et ai., J. Bacteriol. 174 (1992) 254 - 262; Pozo, et ai., Eur. J. Biochem. 213 (1993) 849 - 857. Candida utiliksen L41-polypeptidin pääteltyä aminohappo-20 sekvenssiä verrattiin muiden hiivojen L41-proteiinien aminohapposekvensseihin, ja näissä osoittautui esiintyvän voimakkaasti homologisia piirteitä, esimerkiksi 93,4 % Saccharomyces cerevisiaen L41:n suhteen, 89,6 % Candida tropicaliksen L41:n suhteen ja 85,8 % Candida maltosan 25 L41:n suhteen.
Esimerkki 9: L41-sykloheksimidiresistenssigeenin valmistus kohdemutacreneesiä käyttäen
Sykloheksimidille resistentin hiivan L41-proteiinin ase-30 massa 56 oleva aminohappo on glutamiini, kun taas syklo heksimidille herkän hiivan L41-proteiinin vastaavassa asemassa oleva aminohappo on proliini. Hiivan syklo-heksimidiherkkyyden on raportoitu määräytyvän tämän L41-proteiinin aminohapporyhmän perusteella [Kawai, et ai., 35 J. Bacteriol. 174 (1992) 254 - 262]. Lisäksi sykloheksimidille herkän Candida utiliksen L41-proteiinin asemassa 56 oleva aminohappo oli proliini, kuten on myös 57 asianlaita sykloheksimidille herkän Saccharomyces cerevisiaen aminohapon kyseessä ollessa. L41-geenin asemassa 56 olevaa proliinia koodaava kodoni muutettiin kohdemutageneesin avulla glutamiinikodoniksi tämän geenin 5 koodaaman L41-proteiinin muuntamiseksi sykloheksimidille resistentiksi proteiiniksi, jota käytettiin transformaation selektiomarkkerina.
Ensimmäiseksi liitettiin plasmidista pCLEl saatu 2,1 kem 10 suuruinen BamHI-SacI-fragmentti pUC18:n BamHI- ja Sacl- kohtien väliin plasmidin pCLBSl valmistamiseksi (kuvio 15) .
Lisäksi pBluescript SK":n Smal- ja XhoI-kohtien väliin 15 liitettiin 0,6 ke:n suuruinen fragmentti, joka oli saatu aikaan pilkkomalla pCLEl-plasmidi AflII:lla, käsittelemällä tätä K1enow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi ja pilkkomalla tämä vielä XhoI:11a. Tässä plasmi-dissa Aflll-kohta muodostuu uudelleen, kun 0,6 ke:n suu-20 ruisen fragmentin tasoitettu Aflll-pää ja vektorin Smal- pää on ligatoitu yhteen. pCLXAl:sta valmistettiin yksi-juosteista DNA:ta auttajafaagia käyttäen ja mutatoitu plasmidi valmistettiin käyttäen synteettistä oligonukleo-tidia 5'-TTG TGG AAA ACT TGC TTG GTT TGA-3' ja Sculptor 25 In Vitro Mutagenesis -reagenssipakkausta (Amersham). Näin saadun ehdokkaana olevan plasmidin sisältämän 0,6 ke:n suuruisen insertiofragmentin DNA-sekvenssi määritettiin ja saatiin plasmidi pCLAX20, jossa DNA-sekvenssi ei ollut mutatoitunut muuten kuin siten, että 56. proliini-kodoni 30 CCA oli mutatoitunut glutamiinikodoniksi CAA.
0,6 ke:n suuruinen insertiofragmentti irrotettiin pCLAX20:sta Clal-Aflii-fragmenttina ja se ligatoitiin mutatoidun L41-geenin sisältävän plasmidin pCLBSlO konst-35 ruoimiseksi 4,4 ke:n suuruiseen fragmenttiin, joka oli saatu pilkkomalla pCLBSl-plasmidi Call :11a ja Aflii :11a.
58
Plasmidi pCLBSlO pilkottiin BamHI:lla ja Sphl:lla, käsiteltiin T4-DNA-polymeraasilla tasaisten päiden aikaansaamiseksi ja siihen liitettiin Notl-kytkijät (5'-AGCGGCCGCT-3') plasmidin pCLBS12 (kuvio 15) valmista-5 miseksi.
Tutkittiin sitä, antaako näin saatu mutatoitu L41-geeni hiivalle sykloheksimidiresistenssin vai ei. 2,1 ke:n suuruinen BamHI-SacI-fragmentti, joka sisälsi plasmidista 10 pCLBSlO saadun mutatoidun L41-geenin, liitettiin YEp-vek- torin YEpl3K [Sone, et ai., Appi. Environ. Microbiol. 54 (1988) 38 - 42] BamHI- ja Sacl-kohtien väliin plasmidin pYECLIO valmistamiseksi. Toisaalta YEpl3K:hon kloonattiin kontrollina käytettävän plasmidin pYECLl valmistamiseksi 15 2,1 ke:n suuruinen BamHI-Sacl-fragmentti, joka sisälsi pCLBSl:stä saadun villityyppisen L41-geenin.
Saccharomyces-hiivakanta YPH 500 transformoitiin näillä plasmideilla sivuilla 122 - 123 teoksessa Methods in 20 Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990) kuvattua litiumasetaattimenetelmää noudattaen. Trans- formantteina selektoitiin kantoja, jotka eivät vaatineet leusiinia. Näitä transformantteja kasvatettiin syklo- 25 heksimidiä sisältävällä YPD-maljalla. Tämän tuloksena kasvoi sykloheksimidiä sisältävällä YPD-maljalla kanta, jossa pYECLIO oli säilynyt. Tästä poiketen kanta, jossa pYECLl oli säilynyt, ei kasvanut sykloheksimidiä sisältävällä YPD-maljalla. Tämä osoitti siten sen, että näin 30 valmistettu mutatoitu L41-geeni antoi resistenssin syklo- heksimidille herkälle hiivalle.
Esimerkki 10: Transformaatioon tarkoitettujen plasmidien konstruktio ia Candida utiliksessa suoritettavan trans -35 formaation olosuhteiden määrittäminen
Candida utilis ATCC 9950 -kantaa yritettiin ensin transformoida sellaisen G418-resistenssigeenin [aminoglyko- 59 sidifosfotransferaasi (APT) -geenin] ilmentämiskasetin sisältävillä plasmideilla, jonka oli osoitettu toimivan Saccharomyces cerevisiaessa. Ilmentämiskasetti valmistettiin ligatoimalla 1,1 ke:n suuruinen G418-resistenssi-5 geeni, joka oli irrotettu pUC4K-plasmidista (Pharmacia) XhoI-Pstl-fragmenttina ja muutettu päistään tasoitettuun muotoon, Yamano, et al.’:n julkaisussa J. Biotechnol. 32 (1994) 165 - 171 kuvaamien glyseraldehydi-3 - fosfaattide-hydrogenaasigeenin 1,0 ke:n suuruisen promoottorialueen 10 ja fosfoglyseraatikinaasigeenin 0,4 ke:n suuruisen termi- naattorialueen väliin. Jotkin käytetyistä plasmideista olivat esimerkiksi (1) plasmidi, jossa edellä oleva kasetti oli ligatoitu YEp-vektorina käytettyyn YEpl3K:hon; (2) DNA-kirjasto, jossa esimerkissä 2 kuvatun Candida 15 utills ATCC 9950 -kannan Sau3AI:lla osittain pilkotut kromosomaalisen DNA:n fragmentit (5 - 10 ke) oli liitetty edellä olevaa ilmentämiskasettia käyttäen konstruoidun plasmidin pGPDAPHl BamHI-kohtaan, joka DNA-kirjasto oli ligatoitu pBluescript SK'-plasmidiin, ja (3) kahdeksan 20 pGPDAPHl-plasmidia, jotka sisältävät Saccharomyces cerevisiaessa toimivia ARS-sekvenssejä. Kohdassa (3) olevat plasmidit oli eristetty hiivapesäkkeistä, jotka oli saatu transformoimalla Saccharomyces cerevisiae YPH 500 -kanta kohdassa (2) olevalla kirjastolla. Candida utilis 25 ATCC 9950 -kanta transformoitiin näillä plasmideilla tai kirjaston DNA:11a käyttäen elektroporaatiota, jossa käytettiin useita erilaisia resistanssin ja jännitteen yhdistelmiä, tai käyttämällä litiumasetaattimenetelmää. Ei saatu kuitenkaan yhtään G418:lle resistenttiä pesäkettä. 30
Seuraavana vaiheena liitettiin esimerkissä 9 kuvatussa plasmidissa pCLBSlO (kuvio 15) olevaan EcoRI-kohtaan ja Xbal-kohtaan neljä rDNA-fragmenttia, jotka oli irrotettu EcoRI:lla tai Xbal:11a esimerkissä 5 kuvatuista plasmi-35 deista pCRE2, pCRE3, pCRXl ja pCRX2 (kuvio 6), plasmidien pCLRE2, pCLRE3, pCLRXl ja pCLRX2 konstruoimiseksi.
60
Candida utills ATCC 9950 -kanta transformoitiin neljällä plasmidilla, jotka sisälsivät selektiomarkkerina syklo-heksimidiresistenssigeenin, ja DNA-kirjastolla, joka oli valmistettu liittämällä Candida utilis ATCC 9950 -kannan 5 kromosomaalisen DNA:n Sau3AI:lla osittain pilkottuja DNA-fragmentteja (5 - 10 ke) plasmidissa pCLBSlO olevaan BamHI-kohtaan, useita erilaisia resistanssin ja jännitteen yhdistelmiä käyttäen suoritetulla elektroporaatiolla sekä litiumasetaattimenetelmällä. Käytettäessä näitä 10 plasmideja rengasmaisessa muodossa ei kuitenkaan saatu yhtään transformanttia. Tämän transformaatiokokeen aikana havaittiin ilmaantuvan pseudoresistentteja pesäkkeitä, joissa resistenssi sykloheksimidiä kohtaan tai resistenssiä G418:aa kohtaan oli heikkoa. Pseudoresistentit pesäk-15 keet tarkoittavat niitä pesäkkeitä, joita havaitaan usein selektoitaessa transformantteja antibioottimaljalla, johon on lisätty antibiootteja, kuten G418:aa tai sykloheksimidiä, ja joihin ilmaantuu spontaania resistenttiyt-tä katsomatta siihen, esiintyykö näissä transformanteissa 20 selektiomarkkerin resistenssigeeniä.
Tässä kokeessa kävi ilmi, että kun sykloheksimidiä käytettiin transformanttien selektioon, niin pseudoresis-tenttien pesäkkeiden esiintymisen estyi sillä, että mal-25 jän sykloheksimidikonsentraatio säädettiin arvoon 40 μg/ml ja maljaa inkuboitiin 28 °C:n lämpötilassa eikä 30 °C:ssa. Siten transformaatiokokeet suoritettiin käyttäen pCLRE2:ta, pCLRXl:ta ja pCLRX2:ta, jotka oli pilkottu BglII:lla, EcoRV:llä ja BglII:lla, mainitussa järjes-30 tyksessä ilmoitettuna, plasmidi-DNA:n rDNA-alueella ole vien restriktioentsyymien katkaisukohtien kohdalta, minkä tarkoituksena oli edistää DNA:n liittymistä kromosomiin. Tämän tuloksena onnistuttiin BglII:lla pilkottuja plasmideja pCLRE2 ja pCLRX2 käyttämällä saamaan aikaan syklo-35 heksimidille resistenttejä klooneja olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 /xF, resistanssi 600 Ω ja jännite 5 kV/cm. Nämä resistentit kannat ovat silmin nähden suu- 61 rempia kuin ne pienet pseudoresistentit kannat, joita saatiin vain toisinaan kontrollikokeessa, johon ei lisätty lainkaan plasmidi-DNA:ta, ja näiden resistenttien kantojen osoitettiin esimerkissä 12 esitetyn Southern-ana-5 lyysin tuloksen perusteella olevan transformantteja.
Transformaation optimiolosuhteiden selvittämiseksi suoritettiin Bglllrlla pilkottua pCLRE2-plasmidia käyttäen elektroporaatiokokeita olosuhteissa, joissa kapasitanssi 10 pidettiin 25 μΈ-.η vakioarvossa useilla erilaisilla resistanssin ja jännitteen yhdistelmillä. Tulokset on esitetty kuviossa 17, jossa on esitetty elinkykyisten solujen määrä sekä tällä tavoin saatujen sykloheksimidiresistenttien transformanttien lukumäärä elektroporaation jälkeen.
15 Näiden tulosten perusteella saatiin selville, että transformantteja saadaan suurella frekvenssillä, joka on noin 500 - 1400 solua 1 ,tg:n suuruista DNA-määrää kohti, olosuhteissa, joissa kapasitanssi on 25 μΈ, resistenssi 600, 20 800 tai 1000 Ω ja jännite 3,75 tai 5 kV/cm. Elinkykyisten solujen määrän havaittiin elektroporaation jälkeen olevan näissä olosuhteissa noin 10 - 40 %. Elinkykyisten solujen määrä oli 40 % tai tätä pienempi joissakin olosuhteissa, joissa resistanssi oli 200 tai 400 Ω, mutta tällöin ei 25 syntynyt suuria transformaatiofrekvenssejä. Resistanssin ollessa 200 tai 400 Ω oli aikavakio (se aika, joka tarvittiin jännitteen pienenemiseen 37 %:iin maksimiarvostaan) likimäärin 10 millisekuntia tai tätä pienempi. Lisäksi olosuhteissa, joissa resistanssi oli 600, 800 tai 30 1000 Ω ja elinkykyisten solujen määrä elektroporaation jälkeen noin 10 - 40 %, oli aikavakio noin 10 - 20 millisekuntia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että suuren transformaatiofrekvenssin aikaansaamiselle on tärkeää suorittaa elektroporaatio soluille siten, että elin-35 kykyisten solujen määrä elektroporation jälkeen on noin 10 - 40 % ja aikavakio on likimäärin 10 millisekuntia tai tätä suurempi.
62
Lisäksi on edullista, että soluja sisältävään liuokseen lisätään 1 M sorbitolia sisältävää YPD-mediumia ja että soluja viljellään elektroporaation jälkeen ravistellen. Jos solut levitettiin suoraan sykloheksimidiä sisältäväl-5 le selektiomaljalle niitä viljelemättä, niin ei saatu lainkaan pesäkkeitä.
Lisäksi tutkittiin elävien solujen lukumäärän ja trans-formanttien lukumäärän muutoksia ajan funktiona ja opti-10 maalisen viljelyajan määrittämiseksi tutkittiin näiden lukumäärien lisääntymisnopeuksia.
Tämän perusteella saatiin selville, että transformanttien lukumäärä kohosi elävien solujen lukumäärää nopeammin 15 kuuden tunnin viljelyn aikana, mutta elävien solujen lukumäärä tai transformanttien lukumäärä lisääntyi samassa suhteessa kuuden tunnin viljelyn jälkeen. Tästä kävi ilmi, että kuuden tunnin viljelyaika oli optimaalinen.
20 Vakiomenetelmä Candida utilis ATCC 9950 -kannan transfor-moimiseksi elektroporaation avulla on kuvattu esimerkissä 11 .
Esimerkki 11: Menetelmä Candida utilis ATCC 9950 -kannan 25 transformoimiseksi elektroporaation avulla YPD-maljalla kasvanutta pesäkettä viljellään ensin ravistellen 5 ml:ssa nestemäistä YPD-mediumia 30 °C:ssa noin kahdeksan tunnin ajan ja sitä käytetään sitten ymppinä 200 ml:aan nestemäistä YPD-mediumia solukonsentraatiossa, 30 joka on OD600 = 0,0024, ja soluja viljellään ravistellen 30 °C:ssa noin 16 tuntia. Kun solut ovat kasvaneet logaritmiseen kasvuvaiheeseen (OD600 = 2,5), ne kootaan talteen sentrifugoimalla 1400 x g:n voimalla viiden minuutin ajan. Solut pestään kerran 100 ml :11a jääkylmää steriloi-35 tua vettä, kerran 40 ml :11a jääkylmää steriloitua vettä ja kerran 40 ml:11a jääkylmää 1 M sorbitolia. Nämä solut suspendoidaan ensin 10 ml:aan 1 M sorbitolia ja ne siir- 63 retään sitten steriloituun polypropeenista valmistettuun koeputkeen ja sentrifugoidaan uudelleen 1100 x g:n voimalla 5 minuutin ajan. Solut suspendoidaan supernatantin poistamisen jälkeen jääkylmään 1 M sorbitoliin siten, 5 että lopullisen soluja sisältävän liuoksen tilavuudeksi saadaan 2,5 ml.
Elektroporaatiotransformaatiokoe suoritetaan Gene Pulser (Bio-rad) -laitetta käyttäen. 50 μΐ soluliuosta yhdiste-10 tään ensin 5 μΐ:aan DNA-näytettä ja seos pipetoidaan sitten 0,2 cm:n suuruiseen kertakäyttöiseen kyvettiin ja kyvettiin johdetaan jännitepulssi asiaankuuluvissa olosuhteissa. Kyvettiin lisätään elektroporaation jälkeen 1 ml jäissä jäähdytettyä YPD-mediumia, joka sisältää 1 M 15 sorbitolia, ja seos pipetoidaan steriloituun poly propeenista valmistettuun koeputkeen ja tätä viljellään ravistellen 30 °C:ssa noin 6 tunnin ajan. Viljelyn jälkeen soluseos levitetään YPD-selektiomediumin pinnalle, joka sisältää 40 pig/ml sykloheksimidiä, ja sitä pidetään 20 transformattipesäkkeiden aikaansaamiseksi 28 °C:ssa 3 tai 4 päivää.
Esimerkki 12: Plasmidi-DNA:n havaitseminen transforman-teista Southern-analyysin avulla 25 Esimerkissä 10 saaduista sykloheksimidille resistenteistä pesäkkeistä tutkittiin seitsemän kantaa käyttämällä Southern-blottimenetelmää sen tutkimiseksi, oliko plasmi-di-DNA säilynyt näissä klooneissa vai ei. Kromosomaalinen DNA valmistettiin sivuilla 131 - 132 teoksessa Methods in 30 Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, kuvatun menetelmän mukaisesti. Näin valmistettu DNA pilkottiin EcoRV:lla tai Sali :11a ja hybridisoitiin koettimena (kuvio 18) käytettyyn L41-geenin sisältävään 1,8 ke:n suu-35 ruiseen BamHI-HindiII-fragmenttiin (kuvio 12), joka oli varustettu 32P-leimalla.
64
Tuloksena oli, että kun DNA oli pilkottu EcoRV:llä, niin endogeenisestä L41-geenistä peräisin olevan 5 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi havaittiin yli 20 ke:n suuruinen vyöhyke. EcoRV pilkkoo rDNA-lokuksesta mutta ei pilko 5 pCLRE2-plasmidia. Yli 20 ke:n suuruisen vyöhykkeen ha vaitsemisen katsottiin siten johtuvan plasmidin liittymisestä kromosomiin. Esimerkissä 15 suoritettu Southern-analyysi osoitti, että yhdessä Candida utilis -solussa on kaksi kappaletta L41-geeniä. Densitometritutkimuksen tu-10 losta tarkasteltaessa kävi ilmi, että liittyneen plasmi- di-DNA:n kappalemäärä oli noin 6 (kanava 7) - 15 kappaletta (kanava 2).
Sali pilkkoo taas pCLRE2-plasmidin yhdestä asemasta. Kun 15 kromosomaalinen DNA pilkottiin Sällillä, havaittiin endo geenisestä L41-geenistä peräisin olevan 7,5 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi plasmidin pCLRE2 pituutta vastaava 8,5 ke:n suuruinen vyöhyke. 8,5 ke:n suuruisen vyöhykkeen katsottiin muodostuneen Sällillä pilkkoutuneista vierek-20 käin sijaitsevista plasmideista, jollainen sijoittuminen johtui monien plasmidien liittymisestä kromosomiin peräkkäin .
Lisäksi kun 10:lie tai useammalle sykloheksimidi-25 resistentille kannalle suoritettiin Southern-analyysi, niin saatiin varmistettua, että kaikki nämä kloonit sisälsivät plasmidi-DNA:ta. Esimerkissä 10 olevassa trans-formaatiokokeessa aikaansaatujen sykloheksimidiresistent-tien kantojen osoitettiin olevan transformantteja.
30
Esimerkki 13: Muiden Candida utilis -kantojen transformaatio
Candida utiliksella on raportoitu esiintyvän kuntakohtaisia eroja kromosomien elektroforeesituloksissa sekä 35 kromosomien pituuspolymorfiaa [Stoltenburg, et ai., Curr. Genet. 22 (1992) 441 - 446], Koska geneettisten ominaisuuksien tai transformaatiofrekvenssin odotettiin käytet- 65 tyjen kantojen mukaan olevan erilaiset, tutkittiin esimerkissä 11 kuvattua elektroporaatiolla suoritettua transformaatiota ATCC 9950 -kannan lisäksi myös ATCC 9226 ja ATCC 9256 -kannoilla.
5
Elektroporaatio suoritettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μ¥, resistanssi 1000 Ω ja jännite 2,5 -6,25 kV/cm. Plasmidi-DNA:na käytettiin 2 jitg Bglllrlla pilkottua pCLRE2:ta.
10
Tulokset on esitetty taulukossa 1. Vaikkakin frekvenssi oli kantojen mukaan erilainen, saatiin kaikissa kannoissa aikaan sykloheksimidiresistenttejä pesäkkeitä.
15 Taulukko 1: Transformaatio plasmidilla pCLRE2 Jännite-olo- Transformanttien lukumäärä 2 pg:n suhteet DNA-määrää kohti (kV/cm) ATCC 9226 ATCC 9256 20 _ _ _ 2,50 22 0 3,75 145 8 5,00 128 18 6,25 94 7 25
Yhteensä kahdeksasta sykloheksimidiresistentistä kannasta, toisin sanoen neljästä ATCC 9226:sta peräisin olevasta kannasta ja neljästä ATCC 9256:sta peräisin olevasta kannasta, sekä kahdesta kontrolleina käytetystä ATCC 30 9950:stä peräisin olevasta sykloheksimidiresistentistä kannasta valmistettiin kromosomaaliset DNA-molekyylit ja nämä pilkottiin Bglll:11a. Suoritettiin DNA:n Southern-analyysi käyttäen koettimena L41-geenin sisältävää 1,8 ke:n suuruista BamHI-Hindlll-fragmenttia, joka oli 35 varustettu 32P-leimalla (kuvio 12).
66
Tulokset on esitetty kuviossa 19. Sen 5,4 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi, joka oli peräisin näiden kaikkien kantojen kromosomissa olevasta endogeenisesta L41-geenis-tä, havaittiin plasmidi-DNA:sta peräisin oleva vyöhyke.
5 Tämä merkitsee sitä, että nämä resistentit kannat ovat transformantteja, joissa plasmidi-DNA on säilynyt.
Joissakin ATCC 9226 ja ATCC 9256 -kannoista peräisin olevissa transformanteissa havaittiin sen 8,4 ke:n suuruisen 10 vyöhykkeen lisäksi, jonka suuruus vastasi plasmidi-DNA:n kokoa, suuremman suhteellisen moolimassan kohdalla sijaitsevia vyöhykkeitä (kanavat 2 - 4 ja 7). Tämä merkitsee sitä, että silloin kun plasmidissa oleva rDNA-sek-venssi ei ole identtinen kromosomissa olevan liittymisen 15 kohteena olevan rDNA-sekvenssin suhteen, niin kromosomiin liittyneen plasmidi-DNA-molekyylin päissä oleva Bglll-kohta on joskus deletoitunut.
Southern-analyysillä on esimerkissä 15 osoitettu, että 20 L41-geenin kappalelukumäärä yhtä Candida utilis -solua kohti on kaksi. Integroituneen plasmidin kappalelukumäärä laskettiin vertaamalla vyöhykkeiden voimakkuuksia olettaen, että 5,4 ke:n kokoinen vyöhyke vastaa kahta kappaletta L41-geeniä. Vyöhykkeiden tiheydet määritettiin 25 Imaging Analyzer BAS 2000 -laitteella (Fuji Film).
Tämän tuloksena laskettiin plasmidin pCLRE2 kappaleluku-määrän olevan ATCC 9256 -kannassa alueella 7 (kanava 1) - 25 kappaletta (kanava 3) ja ATCC 9226 -kannassa alueella 30 3 (kanava 5) - 11 kappaletta (kanava 6). Toisaalta kappalelukumäärien laskettiin ATCC 9950 -kannassa olevan 11 kappaletta (kanavat 9 ja 10).
Nämä tulokset merkitsevät, että ATCC 9226 ja ATCC 9256 35 -kannoissa sekä ATCC 9950 -kannassa voidaan transformant-teja saada aikaan käyttämällä L41-sykloheksimidi- 67 resistenssigeeniä ja että samalla integroituu useita plasmidej a.
Esimerkki 14: Candida utiliksen transformaatio litium-5 asetaattimenetelmällä ia tästä modifioidulla menetelmällä Litiumasetaattimenetelmää [Ito, et ai., J. Bacteriol. 153 (1983) 163 - 168] on käytetty laajalti Saccharomyces-su-kuun kuuluvien hiivojen transformaatioon, koska se on yksinkertainen ja helppokäyttöinen. Siten Candida utilis 10 ATCC 9950 -kantaa yritettiin transformoida Bglllrlla lineaariseksi pilkotulla pCLRE2-plasmidilla litium-asetaattimenetelmän mukaisesti ja modifioidun litium-asetaattimenetelmän mukaisesti, jossa lisätään etanolia tai DMSO:ta [Soni, et ai., Current Cenet. 24 (1993) 455 -15 459]. Modifioidussa litiumasetaattimenetelmässä solu- suspensioon lisättiin 10 minuuttia lämpöshokin aloituksen jälkeen sellainen määrä etanolia, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tuli 10 %, ja seosta inkuboitiin vielä 10 minuuttia. Solususpensioon lisättiin myös poly-20 etyleeniglykoliliuoksen ohella sellainen määrä DMSO:ta, että sen lopulliseksi konsentraatioksi tuli 10 %. Solut suspendoitiin ensin YPD-liuokseen ja niitä viljeltiin 30 °C:ssa 4 tuntia, ne levitettiin sykloheksimidiä sisältävälle selektiomaljalle ja niitä inkuboitiin 28 °C:n 25 lämpötilassa 6 päivää.
Modifioidulla litiumasetaattimenetelmällä, jossa seokseen lisättiin etanoli-DNA:ta ja jossa käytettiin 2 μg:n suuruista plasmidi-DNA:n DNA-määrä, saatiin tulokseksi viisi 30 sykloheksimidiresistenttien kantojen kloonia. Kahdesta kloonista valmistetusta kromosomaalisesta DNAista suoritettiin Southern-analyysi esimerkissä 13 kuvattua menetelmää noudattaen. Analyysissä havaittiin plasmidista peräisin olevia vyöhykkeitä ja näiden kloonien osoitet-35 tiin olevan transformantteja. Tämä tulos merkitsee sitä, että litiumasetaatilla käsitelty Candida utilis kykenee 68 myös integroimaan DNA:ta, vaikkakin transformaatio-frekvenssi on elektroporaatioon verrattuna melko pieni.
Koe suoritettiin Soni, et al.’:n kuvaaman menetelmän mu-5 kaisesti, mutta on myös mahdollista parantaa trans-formaatiofrekvenssiä tutkimalla käsittelyolosuhteita yksityiskohtaisemmin.
Esimerkki 15: Transformaatio käyttäen kohteena toista 10 rDNA-aluetta 1) Plasmidien konstruktio pCLRE4 ja pCLRE5 konstruoitiin liittämällä pCRE2:sta (kuvio 6) saatu 3,5 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti ja pCRE3:sta (kuvio 6) saatu 2,4 ke:n suuruinen EcoRI-frag-15 mentti esimerkissä 9 kuvatun plasmidin pCLBS12 (kuvio 15)
EcoRI-kohtaan, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
Lisäksi pCREl:stä, johon oli kloonattu 7,5 ke:n suuruinen rDNA:ta sisältävä EcoRI-fragmentti (kuvio 6), irrotetut 2 0 3 ke:n suuruinen EcoRI-Xbal- fragmentti sekä 4,5 ke:n suu ruinen EcoRI-Xbal-fragmentti ligatoitiin pBluescript SK":n EcoRI- ja Xbal-kohtien väliin, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Kunkin plasmidin Xbal-kohta muunnettiin EcoRI-kohdaksi liittämällä EcoRI-kytkijät 25 (5'CCAAGCTTGG3') plasmidien pCRE6 ja pCRE7 konstruoimi seksi. Plasmideista pCRE6 ja pCRE7 irrotetut 3 ke:n ja 4,5 ke:n suuruiset EcoRI-fragmentit liitettiin mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna plasmidin pCLBS12 EcoRI-kohtaan näitä vastaavien plasmidien pCLRE6 ja pCLRE7 konst-30 ruoimiseksi.
Plasmidien pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 ja pCLRE7 rakenteet on esitetty kuviossa 20. 1 2) Transformaatio
Kukin valmistetuista plasmideista pCLRE4, pCLRES, pCLRE6 ja pCLRE7 pilkottiin restriktioentsyymillä lineaariseksi 69 DNA:ksi. ATCC 9950 -kanta transformoitiin 1 ^„g:lla DNA: ta esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä. Transformaatiot suoritettiin suorittamalla elektroporaa-tio olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, jännite 5 5 kV/cm ja resistanssi 800 Ω, ja viljelemällä soluja elektroporaation jälkeen 18 tunnin ajan. Käytettiin restriktioentsyymejä, jotka kykenivät pilkkomaan rDNA-fragmenteissa olevista katkaisukohdista. Toisin sanoen plasmidi pCLRE4 pilkottiin Bglllrlla, pCLRE5 BamHI:lla 10 tai xbal:llä, pCLRE6 BamHI:llä ja pCLRE7 Apal:llä tai
EcoRV:llä, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Plasmidi pCLRE4 pilkottiin myös L41-geenissä olevasta Clal-kohdasta sen transformaatiotrekvenssien eron tutkimiseksi, joka johtuu käytetyistä erilaisista integraation 15 kohdegeeneistä.
Koe tehtiin kaksi kertaa. Tulokset on esitetty taulukossa 2 .
20 Taulukko 2: Transformaatio plasmideilla pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 ja pCLRE7
Transformanttien lukumäärä 1 μg:n DNA-määrää kohti
Plasmidi Ensimmäinen Toinen pCLRE4 (Bglll) 786 593 25 pCLRE4 (Clal) 87 11 pCLRE5 (BamHI) 0 0 pCLRE5 (Xbal) 1 18 pCLRE6 (BamHI) 301 775 pCLRE7 (Apal) 409 754 30 pCLRE7 (EcoRV) 577 640 70
Kun plasmidit pCLRE4, pCLRE5, pCLRE6 ja pCLRE7 oli pilkottu rDNA-fragmentista, saatiin suuri transformaatio-frekvenssi ja kaikilla näillä plasmideilla saatiin 1 μg:n suuruista DNA-määrää kohti useita satoja transformantte-5 ja. Toisaalta kun plasmidi pCLRE5 pilkottiin joko
BamHI:llä tai Xbal:lla, niin transformaatiofrekvenssi oli hyvin pieni verrattuna niihin tapauksiin, joissa käytettiin muita plasmideja. Tämä merkitsee sitä, että transformaatiof rekvenssi on jopa rDNA-alueellakin hyvin eri-10 lainen transformaatiokohteina käytettyjen fragmenttien mukaan.
Lisäksi kun plasmidi pCLRE4 pilkottiin L41-geenissä olevasta Clal-kohdasta, niin saatu transformaatiofrekvenssi 15 oli noin 1/10 - 1/50 siitä, mitä se oli käytettäessä pilkkomista rDNA:ssa olevasta BglII-kohdasta. Lisäksi tuonnempana kuvattu Southern-analyysi viittaa siihen, että plasmidimolekyyli liittyi L41-geenilokukseen silloin, kun se oli pilkottu Clal-kohdasta, ja rDNA-lokuk-20 seen silloin, kun se oli pilkottu Bglll-kohdasta, maini tussa järjestyksessä ilmoitettuna.
Näistä tuloksista kävi ilmi, että suuri transformaatio-frekvenssi on saavutettavissa käyttämällä kohteena 25 rDNA:ta, jota on kromosomissa useita kappaleita.
3) Southern-analvvsi
Valmistettiin sykloheksimidiresistenttejä kantoja käyttämällä pCLRE4:ää, joka oli pilkottu BglII:lla tai 30 Clalrlla, pCLRE5:ttä, joka oli pilkottu Xbal:llä, pCLRE6:tta, joka oli pilkottu BamHIrllä, ja pCLRE7:ää, joka oli pilkottu Apal:llä. Kunkin näiden plasmidin kyseessä ollessa saatiin neljä kantaa. Näistä valmistettiin kromosomaaliset DNA-molekyylit. Valmistetut DNA-näytteet 35 pilkottiin BglII:lla tai käyttämällä Bglll:ta ja Notlrtä ja niille suoritettiin Southern-analyysi käyttäen koettimena L41-geenin (kuvio 12) sisältävää 32P-leimalla varus- 71 tettua 1,8 ke:n suuruista BamHI-HindIII-fragmenttia (kuvio 21) .
Sen kannan kyseessä ollessa, johon plasmidi pCLRE4 oli 5 liittynyt, havaittiin BglII:lla suoritetulla pilkkomisella endogeenisestä L41-geenistä peräisin olevan 5,4 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi 8,4 ke:n suuruinen vyöhyke, joka oli samansuuruinen kuin plasmidi-DNA, joka oli valmistettu pilkkomalla plasmidi-DNA-molekyylissä olevasta 10 Bglll-kohdasta [kuvio 21(1), kanavat 1 - 8]. Lisäksi sen kannan kyseessä ollessa, johon Clal:lla pilkottu plasmidi oli liittynyt, havaittiin näiden kahden juuri kuvatun vyöhykkeen lisäksi 7,4 ke:n ja 6,4 ke:n suuruiset vyöhykkeet (kanavat 1 - 4). Nämä kaksi vyöhykettä muodostuivat 15 siitä, että plasmidimolekyyleissä oli; liittyneiden plasmidimolekyylien molemmissa päissä olevat Bglll-kohdat ja nämä olivat syntyneet plasmidien liittymisestä yhteen kromosomaalisista L41-geenilokuksista; ja L41-geenissä olevat Bglll-kohdat. Tämä merkitsi sitä, että plasmidi-20 molekyylit ovat liittyneet L41-geenilokukseen homologisen rekombinaation avulla. Tulokset merkitsivät sitä, että plasmidimolekyylit olivat liittyneet L41-geenilokukseen silloin, kun plasmidi oli pilkottu Clal-kohdasta, ja rDNA-lokukseen silloin, kun plasmidi oli pilkottu Bglll-25 kohdasta, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Tästä käy ilmi se, että plasmidin liittämiseen tarkoitetut asemat voidaan valita käytetyn katkaisukohdan mukaan. Lisäksi koska kanavissa 1-4 olevien 5,4 ke:n, 7,4 ke:n ja 6,4 ke:n suuruisten vyöhykkeiden tiheydet ovat miltei 30 samansuuruiset, niin tämä osoitti L41-geeniä olevan kro mosomissa kaksi kappaletta.
Kannoissa, joihin plasmidit pCLRE5, pCLRE6 ja pCLRE7 oli liitetty pilkkomalla nämä Bglll:11a ja NotI:lla, havait-35 tiin endogeenisestä L41-geenistä peräisin olevan 5,4 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi joitakin kromosomiin liittyneistä plasmideista peräisin olevia vyöhykkeitä [kuvio 72 21(2)]. Näiden joukossa havaittiin plasmidien kokoa vastaavia vyöhykkeitä, toisin sanoen pCLRE5:ttä vastaava 7.3 ke:n suuruinen vyöhyke (kanavat 1-4), pCLRE6:tta vastaava 8,0 ke:n suuruinen vyöhyke (kanavat 5 - 8) ja 5 pCLRE7:ää vastaava 9,4 ke:n suuruinen vyöhyke (kanavat 9 - 12). Nämä vyöhykkeet muodostuvat toinen toistensa vieressä sijaitsevista plasmideista, jotka ovat liittyneet peräkkäin silloin, kun plasmidit on pilkottu NotI:llä, jolla näissä plasmideissa on ainoastaan yksi 10 katkaisukohta. Lisäksi havaittiin myös pCLRE5:ssä oleva 7 ke:n suuruinen vyöhyke (kanavat 1-4), pCLRE6:ssä oleva 6,9 ke:n suuruinen vyöhyke (kanavat 5 - 8) ja pCLRE7:ssä oleva 11 ke:n suuruinen vyöhyke (kanavat 9 - 12). Nämä koot ovat samansuuruiset kuin niiden fragment-15 tien pituudet, jotka ulottuvat rDNA-lokuksessa olevasta
Bglll-kohdasta niihin plasmidi-DNA-molekyyleissä oleviin NotI-kohtiin, jotka on saatu käyttämällä pilkkomista Bglii :n ja NotI:n seoksella silloin, kun plasmidi-DNA-molekyylit ovat liittyneet rDNA-lokukseen homologisen 20 rekombinaation avulla. Tämä merkitsee sitä, että plasmi- di-DNA-molekyylit ovat liittyneet kromosomissa oleviin katkaisukohtiin homologisen rekombinaation avulla.
Liittyneiden plasmidien kappalelukumäärät määritettiin 25 vertaamalla vyöhykkeiden tiheyksiä olettaen, että 5.4 ke:n suuruiset vyöhykkeet kuviossa 21(1) olevissa kanavissa 1-4 vastaavat yhtä kappaletta L41-geeniä, ja että 5,4 ke:n suuruiset vyöhykkeet kanavissa 5-8 kuviossa 21(1) ja kanavissa 1-12 kuviossa 21(2) vastaavat 30 kahta kappaletta L41-geeniä. Vyöhykkeiden tiheys määritettiin Imaging Analyzer BAS200 -laitteella (Fuji Film).
Kävi selville, että pCLRE4-plasmidia oli L4l-geeni-lokukseen liittynyt kolmesta kappaleesta (kanava 4) vii-35 teen kappaleeseen (kanavat 1 ja 3) ja rDNA-lokukseen kahdesta kappaleesta (kanava 8) kahdeksaan kappaleeseen (kanava 5). Tästä tuloksesta havaittiin, että menetelmällä 73 selektoituu helposti kantoja, joissa plasmidi-DNA-mole-kyylit ovat liittyneet rDNA-lokukseen melko suurina kappalemäärinä. Tähän viittaa myös se tosiseikka, että esimerkin 12 mukaisissa kannoissa, joissa pCLRE2-plasmidi 5 on liittynyt rDNA-lokukseen, olivat liittyneen plasmidi-DNA:n kappalemäärät 6-15, kun taas esimerkin 16 mukaisessa kannassa, jossa pCLRE2-plasmidi oli liittynyt URA3-geenilokukseen, oli liittyneen plasmidi-DNA:n lukumäärä noin 3 - 4.
10 Kävi myös Seville, että plasmidia pCLRE5 oli liittynyt kolmesta kappaleesta [kuvio 21(2), kanava 4] viiteen kappaleeseen (kanava 2), plasmidia pCLRE6 kolmesta kappaleesta (kanava 8) kuuteen kappaleeseen (kanavat 5 ja 6) 15 ja plasmidia pCLRE7 kolmesta kappaleesta (kanava 12) vii teen kappaleeseen (kanava 9), mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
Esimerkki 16: Plasmidin liittyminen URA3-geenilokukseen 20 Plasmidi pCLURAl konstruoitiin liittämällä URA3-geenin (kuvio 7) sisältävä 5 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti plasmidin pCLBS12 (kuvio 15) EcoRI-kohtaan. Tämä plasmidi katkaistiin URA3-geenilokuksessa olevasta Pstl-kohdasta. ATCC 9950 -kanta transformoitiin tällä plasmidilla esi-25 merkissä 11 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä.
Elektroporaatio suoritettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μF, resistanssi 800 Ω ja jännite 5 kV/cm. Näin tämän menetelmän avulla saatiin 1 μg:n suuruista DNA-määrää kohti 40 sykloheksimidiresistenttiä pesäkettä. 30 Näin saatuihin sykloheksimidiresistentteihin kantoihin kuuluvista neljästä kloonista valmistettiin kromosomaali-set DNA-molekyylit. Näin valmistettu DNA pilkottiin BglII:lla tai Sall:n ja NotI:n seoksella ja tälle suori -35 tettiin Southern-analyysi. Koettimina, jotka ennen niiden käyttöä oli varustettu 32P-leimalla, käytettiin Bglll:11a pilkotun DNA:n kyseessä ollessa L41-geenin sisältävää 74 1,8 ke:n suuruista BamHI-Hindlll-fragmenttia (tämä on esitetty kuviossa 12) ja Sallin ja Notlrn seoksella pilkotun DNA:n kyseessä ollessa URA3-geenin sisältävää 2,3 kein suuruista HindIII-EcoRI-fragmenttia (tämä on 5 esitetty kuviossa 8).
Tulokset on esitetty kuviossa 22. Kun URA3-geeniä käytettiin Sallin ja Notlin seoksella pilkotun DNAin koettimena, niin lähtökannan ATCC 9950 kyseessä ollessa havait-10 tiin 13 kein suuruinen vyöhyke, joka oli peräisin endo- geenisesta URA3-geenistä [kuvio 22(1), kanava 1]. Toisaalta resistentin kannan kyseessä ollessa havaittiin 13 ke m suuruisen vyöhykkeen lisäksi sellainen 10 ke m suuruinen vyöhyke, joka oli muodostunut siitä, että useat 15 peräkkäin liittyneet plasmidit olivat pilkkoutuneet
Notlilla, sekä 8,4 kem ja 14 kein suuruiset vyöhykkeet, jotka olivat muodostuneet plasmidien liittymisestä toiseen kromosomissa olevista URA3-geeneistä (kanavat 2 - 5). Nämä kaksi vyöhykettä muodostuivat sen perusteella, 20 että integroituneiden plasmidimolekyylien molemmissa päissä oli plasmidimolekyylien sisältämät Notl-kohdat; ja sen perusteella, että URA3-geenialueella esiintyi Sali-kohta. Tämä merkitsi sitä, että plasmidimolekyylit olivat liittyneet URA3-geenilokukseen homologisen rekombinaation 25 avulla.
Lisäksi endogeenisistä URA3-geenistä peräisin oleva 13 kein suuruinen vyöhyke ja kromosomiin liittyneistä plasmidimolekyyleistä peräisin olevat 8,4 kein ja 14 kein 30 suuruiset vyöhykkeet ovat transformanteissa tiheydeltään lähes samansuuruiset. Tästä kävi selville, että URA3-geenien kappalelukumäärä on L41-geenin tavoin kaksi kappaletta solua kohti ja että transformanteissa oleva yksi kappale on vaurioitunut plasmidien liittymisen johdosta. 35 Vertaamalla näitä neljää vyöhykettä (14 ke, 13 ke, 10 ke ja 8,4 ke) kävi myös ilmi, että liittyneiden plasmidien 75 lukumäärä oli kolme kappaletta (kanavat 3 ja 5) tai neljä kappaletta (kanavat 2 ja 4).
Kun BglII:lla pilkotun DNA:n koettimena käytettiin L41-5 geeniä, havaittiin lähtökannassa ATCC 9950 endogeenisestä L41-geenistä peräisin oleva 5,4 ke:n suuruinen vyöhyke.
5,4 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi resistenteissä kannoissa havaittiin 10 ke:n suuruinen vyöhyke, joka oli samansuuruinen kuin plasmidi-DNA. (kanavat 2 - 5).
10
Esimerkki 17: Heterologisen geenin, crlukoamylaasigeenin, ilmentäminen Candida utiliksessa (1) Glukoamylaasicreenin (STA1-geenin) ilmentämiseen tar-15 koitettujen olasmidien konstruointi STAl-geenin ilmentämiseen tarkoitettu plasmidi konstruoitiin kuviossa 23 kuvattua menetelmää noudattaen.
STAl-geeni kloonattiin ensin Saccharomyces dlastaticus 20 5106-9A:n (leu2, arg4, STA1) (Yamashita ja Fukui, Agric.
Biol. Chem. 47 2689 - 2692) genomisesta DNA-kirjastosta seuraavan menetelmän mukaisesti. Kromosomaalinen DNA valmistettiin 5106-9A-solusta, pilkottiin osittain Sau3AI:lla ja sille suoritettiin agaroosigeelielektro-25 foreesi noin 20 - 30 ke:n suuruisten DNA-fragmenttien valmistamiseksi. DNA-fragmentit ja λ-faagivektori EMBL3, joka oli ensin pilkottu BamHI:lla ja tämän jälkeen de-fosforyloitu (Stratagene Cloning Systems), ligatoitiin T4-ligaasilla. Ligatoitu seos pakattiin in vitro -olo-30 suhteissa käyttäen Gigapackll Gold Packaging Extract -reagenssipakkausta (Stratagene Cloning Systems) kromoso-maalisen DNA:n genomisen DNA-kirjaston konstruoimiseksi.
Kaksi oligonukleotidia: 35 5'ACCACTATTACCACTACGGTTTGCTCTACA3' (SEKVENSSI ID NO: 19) ja 5'GACACATCTCTGACGAGCATGACTTGGTTG3' (SEKVENSSI ID NO: 20) , 76 jotka oli syntetoitu STAl-geenin kuvatun DNA-sekvenssin perusteella [Yamashita, et ai., J. Bacteriol. 161 (1985) 567 - 573], varustettiin päistään 32P-leimalla T4-kinaa-silla ja niitä käytettiin koettimina noin 20 000 genomi-5 sen DNA-kirjaston plakin seulontaan. Tuloksena saatiin klooni, joka antoi positiivisen tuloksen kumpaakin näitä kahta koetinta vastaan tutkittuna.
STAl-geeniä sisältävästä faagikloonista kloonattiin STA1-10 geenin sisältävä 4 ke:n suuruinen Bglll-Hpal-fragmentti pUC19:n BamHI- ja Hindlll-kohtien väliin plasmidin pUSTAl (kuvio 23) valmistamiseksi.
Lisäksi plasmidi pUSTAl pilkottiin käyttämällä 5 ep ATG-15 aloituskodoniin nähden myötäsuuntaan esiintyvää Stul-koh taa ja siihen ligatoitiin seuraava Xbal-kohdan ja aloituskodonin sisältävä synteettinen adapteri (SEKVENSSI ID NO:21): 5'-CTAGATGGTAGG-3' 20 3'-TACCATCC-5'.
Pilkkomalla plasmidi sitten osittain Sali :11a saatiin STA-geeni 2,7 ke:n suuruisena Xbal-Sall-fragmenttina.
pUC12 pilkottiin lisäksi Pstl:lla ja HindIII:lla, käsi-25 teltiin T4-DNA-polymeraasilla ja molekyyliin ligatoitiin
Bglll-kytkijäsekvenssit plasmidin pUC12BglII konstruoimiseksi. STAl-geenin sisältävä 2,7 ke:n suuruinen Xbal-SalII-fragmentti liitettiin pUC12BglII-plasmidin Xbal:n ja Salli:n väliin plasmidin pUSTA2 konstruoimiseksi.
30 2,7 ke:n suuruinen Xbal-Bglll-fragmentti irrotettiin plasmidista STA2 ja liitettiin pPGKPT4-ilmentämisvektorin Xbal- ja BamHI-kohtien väliin plasmidin pGKSTAl konstruoimiseksi .
35
Plasmidista pGKSTAl irrotettiin lisäksi 4,9 ke:n suuruinen Notl-fragmentti, joka sisälsi PGK-geenin promootto- 77 rin, STAl-geenin ja PGK-geenin terminaattorin. Fragmentti liitettiin plasmidin pCLBS12 NotI-kohtaan plasmidin pCLSTAl konstruoimiseksi ja plasmidin pCLRE4 Notl-kohtaan plasmidin pCLRSTAl konstruoimiseksi, mainitussa järjes-5 tyksessä ilmoitettuna.
(2) Candida utiliksen transformaatio ia glukoamylaasin ilmentäminen ATCC 9950, ATTC 9226 ja ATCC 9256 -kannat transformoitiin 10 BglII:lla pilkotulla plasmidilla pCLRSTAl esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä. Menetelmää käytettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 /xF, resistanssi 1000 Ω ja jännite 3,75 kV/cm tai 6,25 kV/cm.
15 Kummastakin kannasta saatiin sykloheksimidiresistenttejä pesäkkeitä, vaikkakin frekvenssit olivat kantojen mukaan erilaiset.
Glukoamylaasiaktiivisuus tutkittiin kunkin transformantin 20 kahdesta kannasta maljalla, joka sisälsi substraattina tärkkelystä [3 % Soluble starch (Katayama), 2 % poly-peptonia, 1 % hiivauutetta, 3,3 x 10'3 % bromikresoli-punaa, 2 % bacto-agaria]. Tuloksena havaittiin kaikkien kolmesta kannasta peräisin olevien transformanttien ky-25 seessä ollessa pesäkkeiden ympärillä erittyneestä gluko- amylaasista johtuvat kirkkaat alueet. Tämä varmisti siten geenin ilmentyneen. Lisäksi ATCC 9950 -kanta transformoitiin AflII:lla pilkotulla plasmidilla pCLSTAl. Tutkittaessa tarkemmin L41-geenilokukseen liittyneen gluko-30 amylaasigeenin ilmentymistä havaittiin pesäkkeiden ympä rille myös muodostuneen kirkkaita alueita.
Lisäksi määritettiin näiden transformanttien glukoamy-laasiaktiivisuudet. Soluja viljeltiin yön yli nestemäi-35 sessä YPD-mediumissa ja supernatanttia käytettiin puh-distamattomana entsyymiliuoksena. Reaktio suoritettiin 50 °C:ssa 20 minuutin ajan 500 /xl: n tilavuudessa reaktio- 78 liuosta, joka sisälsi 400 μΐ puhdistamatonta entsyymi-liuosta, 0,5 % liukoista tärkkelystä ja 100 mM natrium-asetaattia (pH 5,0). Reaktion jälkeen entsyymi inaktivoi-tiin lämpökäsittelyllä 100 °C:ssa viiden minuutin ajan ja 5 muodostunut glukoosikonsentraatio määritettiin kaupalli sesti saatavilla olevalla reagenssipakkauksella [Glucose B-Test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)].
Glukoamylaasiaktiivisuus määriteltiin yhdeksi yksiköksi, 10 kun reaktio-olosuhteissa eristetyn glukoosin määrä oli 100 //g. Aktiivisuusarvot 1 ml:ssa viljelmäsupernatanttia on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3: Plasmideilla pCLSTAl tai pCLRSTAl transfor-15 moitujen Candida utilis -hiivojen glukoamylaasiaktiivi- suudet
Glukoamylaasiaktiivisuus (yksikköä/ml)
Plasmidi ATCC 9256 ATCC 92 66 ATCC 9950 pCLRSTAl (Bglll) 11,3 7,9 8,3 20 pCLRSTAl (Bglll) 10,5 6,6 8,5 pCLSTAl (Aflii) - - 7,6 pCLSTAl (Aflii) - - 8,8 -DNA 0,0 0,0 0,0
Aktiivisuudet määritettiin kahdesta toisistaan riippumat-25 tomasti transformoidusta kannasta.
-: ei määritetty.
ATCC 9950-, -9226- ja -9256-kannoissa glukoamylaasi-proteiinin signaalisekvenssi osoittautui tulevan tunnis-30 tetuksi ja entsyymi erittyi mediumiin, vaikka gluko amylaasi on Saccharomyces diastaticuksesta peräisin oleva heterologinen proteiini.
79
Lisäksi kahta ATCC 9950 -kantaa, jotka oli transformoitu käyttäen BglII:lla pilkottua plasmidia pCLSTAl tai Aflii:11a pilkottua plasmidia pCLSTAl, viljeltiin nestemäisessä YPD-mediumissa, joka sisälsi 40 μ-g/ml syklo-5 heksimidiä ja 5 % glukoosia, 30 °C:ssa neljän päivän ajan. 10 /.tl: n erälle vilj elymediumia suoritettiin 4 -20 % SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi viljelmässä esiintyvien proteiinien analysoimiseksi (kuvio 24). Geeli värjättiin Coomassiesinellä. Kontrolliksi analysoitiin 10 sellaisen kannan viljelymedium, joka oli transformoitu
BglII:lla pilkotulla plasmidilla pCLRE2 (kanava 1). Kummassakin viljelmässä havaittiin glukoamylaasia vastaava noin 100 kDa:n suuruinen proteiini ja proteiinin määrän arvioitiin värjäytyneiden vyöhykkeiden tiheyksien perus -15 teella olevan noin 2-5 μg. Tämä merkitsee sitä, että glukoamylaasigeeni on ilmentynyt voimakkaasti ja että sen tuote on erittynyt mediumiin. Siten on ilmeistä, että Candida utilista voidaan käyttää asiaankuuluvana isäntä/-vektorijärjestelmänä erittyvien proteiinien tuottamisek-20 si.
Esimerkki 18: Heterogenisen creenin. (IacZ-aeenin) ilmentäminen Candida utiliksessa 25 (1) lacZ-geeniä ilmentävien plasmidien konstruktio
IacZ-geenin ilmentämiseen tarkoitetut plasmidit konstruoitiin kuviossa 25 kuvattua menetelmää noudattaen.
Ensimmäiseksi irrotettiin plasmidista pMC1871 (Pharmacia) 30 /3-galaktosidaasia koodaava IacZ-geeni 3,1 ke:n suuruisena
BamHI-fragmenttina. Fragmentti ligatoitiin YEpl3K-plasmi-din [Sone, et ai., Appi. Environ. Microbiol. 54 (1988) 38 - 42] Bglll-kohtaan sellaisen plasmidin pZ4 selektoi-miseksi, jossa geenin 5'-puolella on Hindlll-kohta.
35 ATG-aloituskodonin sisältävä IacZ-geeni irrotettiin plasmidista 3,1 ke:n suuruisena Hindlll-XhoI-fragmenttina.
80
Fragmentti ligatoitiin sitten pBluescript SK':ssa olevien Hindlll- ja Xhol-kohtien väliin plasmidin pLACZl konstruoimiseksi .
5 Tämä plasmidi pilkottiin Hindlllm ja Xbal:n seoksella, sitä käsiteltiin K1enow-entsyymillä ja tehtiin uudestaan rengasmaiseksi plasmidin pLACZ2 konstruoimiseksi.
Lisäksi IacZ-geeni irrotettiin plasmidista 3,1 ke:n suu-10 ruisena Xbal-Kpnl-fragmenttina ja se ligatoitiin plasmi-dissa pPGKPT5 (kuvio 4) olevien Xbal- ja Kpnl-kohtien väliin plasmidin pGKLACl konstruoimiseksi.
Lisäksi plasmidista pGKLACl irrotettiin 5,4 ke:n suurui-15 nen NotI- fragmentti, joka sisälsi PGK-geenin promoottorin, IacZ-geenin ja PGK-geenin terminaattorin, ja tämä liitettiin plasmidin pCLBS12 Notl-kohtaan ja plasmidin pCLRE4 Notl-kohtaan plasmidien pCLLACl ja pCLRLACl konstruoimiseksi, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
20 (2) Candida utiliksen transformaatio ia β-galaktosidaasi-aktiivisuuden varmistaminen ATCC 9950 -kanta transformoitiin BglII:lla pilkotulla pCLRLACl-plasmidilla tai Afllltlla pilkotulla pCLLACl-25 plasmidilla käyttäen esimerkissä 11 kuvattua elektro-poraatiota. Kumpaakin transformoitua kahta ATCC 9950 -kantaa viljeltiin logaritmiseen kasvuvaiheeseen asti (OD600 = noin 2 - 3) 5 ml:ssa nestemäistä YPD-mediumia 6 tunnin ajan. /3-galaktosidaasiaktiivisuus määritettiin 30 sivuilla 155 - 159 teoksessa Methods in Yeast Genetics -A Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990), kuvatun menetelmän mukaisesti. Yksityiskohdittain mainittuna sen jälkeen kun talteenotetut solut oli suspendoitu 1 ml:aan Z-35 puskuria, niihin lisättiin 3 pisaraa kloroformia ja 2 pisaraa 0,1-%:ista SDS:ää, ja seosta pyörresekoitettiin 10 sekunnin ajan. Kun seosta oli inkuboitu 28 °C:ssa 81 5 minuuttia, siihen lisättiin 0,2 ml ONPG-liuosta ja seosta inkuboitiin vielä 10 minuuttia. Tämän jälkeen seokseen lisättiin reaktion pysäyttämiseksi 0,5 ml Na9C03-liuosta. Kun OD42o oli määritetty, laskettiin j8-ga-5 laktosidaasiaktiivisuus yhtälöstä. β-galaktosidaasi- aktiivisuus on määritelty yhdeksi yksiköksi, kun muodostuneen orto-nitrofenolin määrä on 1 nmol 28 °C:ssa yhdessä minuutissa. Saadut solujen aktiivisuudet OD600-yksikköä kohti on esitetty taulukossa 4.
10
Taulukko 4: Plasmideilla pCLLACl tai pCLRLACl transformoitujen ATCC 9950 -kantojen /3-galaktosidaasiaktiivi-suudet /3-galakt os idaasi-aktiivisuus
Plasmidi (yksikköä/OD600) 15 _ _ pCLLACl (Aflii) 6,4 pCLLACl (Aflii) 6,7 pCLRLACl (Bglll) 6,8 pCLRLACl (Bglll) 7,0 20 -DNA 0,1 Tämän tuloksen perusteella oli varmistettu, että molemmissa plasmideilla pCLRLACl tai pCLLACl transformoiduissa ATCC 9950 -kannoissa esiintyi aktiivisuutta, mikä merkit-25 si sitä, että E. colista peräisin oleva IacZ-geeni ilmen tyi ja aktiivista j6-galaktosidaasia muodostui Candida utiliksessa. On tunnettua, että joissakin Candida-suvun hiivoissa, kuten Candida maltosassa tai C. albicansissa, tapahtuu leusiinikodonin CUG translaatio seriiniksi 30 [Ohama, et ai., Nucl. Acids Res. 21 (1993) 4039 - 4045], joten näissä ei tapahdu E. colista peräisin olevan lacZ-geenin translaatiota aktiiviseksi /3 - galakt osidaasiksi [Sugiyuama, et ai., Yeast 11 (1995) 43 - 52]. Tässä esi- 82 merkissä Candida utiliksessa muodostuu aktiivista β-ga-laktosidaasia ja esimerkissä 17 on osoitettu, että gluko-amylaasia muodostuu suuri määrä. Candida utilista arvellaan siten voitavan käyttää isäntänä heterologisten gee-5 nien ilmentämiseksi.
Esimerkki 19: Heterolocrisen geenin (APT-geenin) ilmentäminen Candida utiliksessa 10 (1) APT-geenin ilmentämiseen käytettävien plasmidien konstruktio APT-geenin ilmentämiseen soveltuvat plasmidit konstruoitiin kuviossa 26 kuvatun menetelmän mukaisesti.
15 Ensimmäiseksi irrotettiin plasmidista pUC4K (Pharmacia) transposonista Tn903 peräisin oleva aminoglykosidifosfo-transferaasin (APT-geenin) sisältävä 1,1 ke:n suuruinen XhoI-PstI- fragmentti ja tämä liitettiin pUC19:n Sall:n ja PstI:n väliin plasmidin pAPHl konstruoimiseksi.
20
Kun pAPHl-plasmidi oli pilkottu PstI:11a ja käsitelty T4-DNA-polymeraasilla tasaisten päiden muodostamiseksi, liitettiin BglII-kytkijät (5'CAGATCTG3') plasmidin pAPH2 muodostamiseksi.
25
Lisäksi APT-geeni irrotettiin plasmidista pAPH2 1,1 ke:n suuruisena XbaI-BglII-fragmenttina ja se liitettiin ilmentämisvektorin pPGKPT4 (kuvio 4) Xbal- ja BamHI-kohtien väliin plasmidin pGKAPHl konstruoimiseksi.
30
Lisäksi plasmidista pGKAPHl irrotettiin 3,3 ke:n suuruinen PGK-geenin promoottorin, APT-geenin ja PGK-terminaat-torin sisältävä NotI-fragmentti. Tämä fragmentti liitettiin sitten plasmidien pCLBS12 ja pCLRE4 Notl-kohtaan 35 plasmidien pCLAPHl ja pCLRAPHl konstruoimiseksi, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
83 (2) Candida utiliksen transformaatio ia G418~resistenssin varmistaminen ATCC 9950-, ATCC 9226- ja ATCC 9256 -kannat transformoitiin BglII:lla pilkotulla plasmidilla pCLRAPHl esimerkis-5 sä 11 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä. Menetelmää käytettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 1000 Ω ja jännite 3,75 kV/cm tai 6,25 kV/cm.
Tuloksena saatiin kaikilla kannoilla sykloheksimidille 10 resistenttejä pesäkkeitä, vaikkakin frekvenssit olivat kantojen mukaan erilaiset. Kunkin transformantin kahdesta kannasta tutkittiin solujen kasvu YPD-maljoilla, jotka sisälsivät useita erilaisia G418-konsentraatioita. Saadun tuloksen mukaan saatiin kaikkien Candida utiliksen kolmen 15 kannan transformanttien kasvu varmistettua, mikä merkitsee sitä, että APT-geeni oli ilmentynyt näissä kaikissa transformanteissa.
L41-geenilokukseen liittyneiden geenien ilmentymisen tut-20 kimiseksi transformoitiin lisäksi ATCC 9950 -kanta
Af1II:11a pilkotulla plasmidilla pCLAPHl. Saatu tulos varmisti tämän kannan transformanttien kasvavan ja se myös varmisti L41-geenilokukseen liittyneen APT-geenin ilmentyvän.
25 (3) Liittyneen plasmidin stabiilisuus
Liittyneen plasmidi-DNA:n stabiilisuus tutkittiin seuraa-valla menetelmällä kahdesta ATCC 9950 -kannasta, jotka oli transformoitu kummallakin kahdesta plasmidista, jois-30 ta toinen oli BglII:lla pilkottu plasmidi pCLRAPHl ja toinen AflII:lla pilkottu plasmidi pCLAPHl. Transformant-teja viljeltiin ensin stationaariseen vaiheeseen asti 5 ml: ssa nestemäistä YPD-mediumia, joka sisälsi 40 μ$/να1 sykloheksimidiä. Solusukupolvien lukumäärä tällä ajan-35 kohdalla otettiin nollaksi. Tämän jälkeen 5 μ1:η erä soluviljelmää ympättiin 5 ml:aan nestemäistä YPD-mediumia ja sitä viljeltiin stationaarivaiheeseen asti. Solusuku- 84 polvien lukumäärän tällä ajankohdalla otaksuttiin olevan 10. Samat vaiheet toistettiin solujen viljelemiseksi kahdenteenkymmenenteen solusukupolveen asti. Plasmidien pysyvyys laskettiin levittämällä laimennettua solu-5 suspensiota YPD-maljalle ja YPD-maljalle, joka sisälsi 40 yg/ml sykloheksimidiä, viljelemällä maljaa 30 °C:ssa kaksi päivää ja laskemalla pesäkkeet.
Tulokset on esitetty taulukossa 5.
10
Taulukko 5: ATCC 9950:n kromosomiin liittyneen plasmidi-DNA:n stabiilisuus
Plasmidinsa säilyttäneiden solujen Plasmidi osuus (%) 15 pCLRAPHl (Bglll) 91,3 pCLRAPHl (Bglll) 87,8 pCLAPHl (Aflii) 99,5 pCLAPHl (Aflii) 98,6 20 Tämän tuloksen perusteella saatiin varmuus siitä, että rDNA-lokukseen ja L41-geenilokukseen liittyneet DNA-frag-mentit ovat stabiileja.
Esimerkki 20: Candida utilis -transformanttien selektio 25 käyttäen selektiomarkkerina G418-resistenssiä
Plasmidi pCLRAPHl sisältää transformanttien selektio-markkereina mutatoidun L41-geenin, joka antaa resistenssin sykloheksimidiä vastaan, ja APT-geenin, joka antaa resistenssin G418:aa vastaan. Koska APT-geenin on varmis-30 tettu ilmentyvän PGK-geenin promoottorin avulla, koetet tiin selektoida transformantteja suoraan sen perusteella, että ne olivat resistenttejä G418:aa vastaan.
85
Plasmidi pCLRAPHl pilkottiin BglII:lla lineaarisen plas-midin muodostamiseksi. ATCC 9950 -kanta transformoitiin linearisoidulla plasmidilla esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaatiolla. Menetelmää käytettiin olosuhteissa, 5 joissa kapasitanssi oli 25 , resistanssi 1000 Ω ja jän nite 5 kV/cm tai 6,25 kV/cm. Soluja viljeltiin 1 M sorbitolia sisältävässä YPD-mediumissa ja ne levitettiin sykloheksimidiä sisältävälle YPD-maljalle ja YPD-maljal-le, joka sisälsi 150 yg/ml G418:aa.
10
Tulokset on esitetty taulukossa 6.
Taulukko 6: Plasmidia pCLRAPHl käyttäen valmistettujen ATCC 9950-transformanttien selektio käyttämällä eri 15 lääkeaineresistenssimarkkereita G418 Sykloheksimidi
Plasmidi 1000 Ω 800 Ω 1000 Ω 800 Ω pCLRAPHl (Bglll) 100 111 7 18 -DNA 0 0 - 20 * transformanttien määrä 0,1 μg:n suuruista DNA-erää kohti; * G418:n ja sykloheksimidin konsentraatiot säädettiin arvoihin 150 μg/ml ja 40 μg/ml, mainitussa järjestyksessä 25 ilmoitettuna.
-: ei määritetty Tämä tulos osoittaa, että G418:n resistenssin perusteella selektoitujen pesäkkeiden lukumäärä on 10-kertainen 30 sykloheksimidiresistenssin perusteella selektoitujen pesäkkeiden määrään verrattuna.
Kromosomaalinen DNA valmistettiin neljästä pesäkkeestä, jotka oli selektoitu sen perusteella, että ne olivat 35 resistenttejä G418:aa vastaan, ja neljästä pesäkkeestä, 86 jotka oli selektoitu sen perusteella, että ne olivat resistenttejä sykloheksimidiä vastaan. Näin valmistettu DNA pilkottiin BglII:n ja NotI:n seoksella ja sille suoritettiin Southern-analyysi käyttäen koettimena L4l-gee-5 nin sisältävää 32P-leimalla varustettua 1,8 ke:n suuruista BamHI-Hindlll-fragmenttia (kuvio 27). Tuloksena havaittiin endogeenisestä L41-geenistä peräisin olevan 5,4 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi plasmidista peräisin oleva 4,4 ke:n suuruinen vyöhyke. Vyöhykkeiden tihey-10 det määritettiin Imaging Analyzer BAS 2000 (Fuji Film) -laitteella. Liittyneen plasmidin kappalelukumäärät laskettiin vertaamalla plasmidista peräisin olevaa vyöhykettä endogeenisestä L41-geenistä (2 kappaletta solua kohti) peräisin olevaan vyöhykkeeseen. Nämä tulokset osoittivat, 15 että kannoissa, jotka oli selektoitu sykloheksimidi- resistenssin perusteella, olivat plasmidien lukumäärät neljästä (kanava 2) seitsemään kappaleeseen (kanava 5). Laskettiin myös, että kaikissa neljässä G418-resistenssin perusteella selektoidussa kannassa plasmidia on yksi kap-20 pale (kanavat 6 - 9). Nämä tulokset merkitsevät sitä, että voidaan helposti saada kantoja, joihin on liittynyt useita plasmideja, kun taas transformaatiotrekvenssi tulee pieneksi silloin kun mutatoitua L41-geeniä on käytetty markkerina transformanttien selektointiin.
25
Lisäksi plasmidi pGKAPHl pilkottiin NotI:lla ja jaettiin kahteen fragmenttiin. Plasmidi jaettiin toisin sanoen PGK-geenin promoottorin, APT-geenin ja PGK-geenin termi-naattorin sisältävään fragmenttiin ja vektorifragment-30 tiin. ATCC 9950 -kanta transformoitiin näillä fragmen teilla. Elektroporaatio suoritettiin soluille olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 piF, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm tai 6,25 kV/cm. Kun transformantit selek-toitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 200 μ$/τα1 G418:aa, 35 niin 1 /zg:n suuruista DNA-määrää kohti saatiin 156 trans-formanttia. Tämä merkitsee sitä, että Candida utilis -hiivassa havaitaan myös geenien korvautumiseen perustu- 87 vaa transformaatiota sen geenien insertioon perustuvan transformaation lisäksi, jossa käytetään Bglllrlla pilkkomalla linearisoitua pCLRAPHl-plasmidia. Geenien korvaamisen avulla tapahtuva transformaatio osoittautui myös 5 tapahtuvan tehokkaasti, koska transformaatiofrekvenssi oli suhteellisen suuri.
Esimerkki 21: PGK-geenin promoottorin typistäminen ia minimaalisen toiminnallisen alueen tunnistaminen 10 Esimerkeissä 17 - 20 käytettyä PGK-geenin promoottoria yritettiin typistää promoottorin toiminnallisen minimi-alueen tunnistamiseksi.
Käyttämällä hyväksi esimerkissä 19 kuvatun pGKAPHl-plas-15 midin PGK-geenin promoottorifragmentissa esiintyviä restriktioentsyymikohtia hankittiin ensin käyttöön viisi fragmenttia, jotka sisälsivät eripituisia PGK-geenin promoottoreita, APT-geenin sekä PGK-geenin terminaattorin. Toisin sanoen plasmidi pGKAPHl pilkottiin Notlrlla, 20 Sacl:lla, EcoRI:n ja Sacl:n seoksella tai Pstl:n sekä
Sacl:n seoksella neljän fragmentin valmistamiseksi. Plasmidi pGKAPHl pilkottiin Sphl:lla ja käsiteltiin T4-DNA-polymeraasilla tasaisten päiden muodostamiseksi. Näihin lisättiin BamHI-kytkijät (5'CCGGATCCGG3' : SEKVENSSI ID 25 NO:22) ja plasmidi pilkottiin BamHI:lla ja Notlrlla vielä yhden fragmentin aikaansaamiseksi.
Niistä 0,7 kem ja 5,8 kem suuruisista fragmenteista, jotka oli saatu pilkkomalla esimerkissä 5 kuvattu pCRE2-30 plasmidi Hindlllrlla, tehtiin 5,8 ke:n suuruinen fragmentti ligatoimalla se uudelleen rengasmaiseksi plasmidin pCRE8 (kuvio 28) muodostamiseksi. Plasmidi pCRE8 pilkottiin Notlrllä, BamHIm ja Notlrn seoksella, Saclrllä, EcoRIm ja Sacl m seoksella tai Pstlm sekä Sacl m seok-35 sella ja ligatoitiin edellä kuvattuihin fragmentteihin plasmidien pCRAPH2, pCRAPH3, pCRAPH4, pCRAPH5 ja pCRAPH6 (kuvio 28) muodostamiseksi. Kunkin näiden plasmidien si 88 sältämä PGK-geenin promoottorifragmentti oli sellainen, että sen pituus pCRAPH2:ssa oli 1,35 ke, pCRAPH3:ssa 0,83 ke, pCRAPH4:ssä 0,46 ke, pCRAPH5:SSä 0,40 ke ja pCRAPHG:ssa 0,16 ke.
5
Kun kukin näin konstruoiduista plasmideista pCRAPH2, -3, -4, -5 ja -6 oli linearisoitu pilkkomalla ne BglII:llä, niin niitä käytettiin ATCC 9950 -kannan transformaatioon esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä.
10 Menetelmää käytettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μ¥, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm.
Transformantit selektoitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 200 jLig/ml G418:aa. Käytettäessä plasmideja pCRAPH2, 15 pCRAPH3, pCRAPH4 ja pCRAPH5 saatiin kullakin plasmidilla 1 μg:n suuruista DNA-erää kohti noin 300 transformanttia. CRAPH6-plasmidilla ei kuitenkaan saatu yhtään trans -formanttia. Tämä merkitsee sitä, että fragmentti, joka sisältää alueen, joka ulottuu PGK-geenin ATG-aloitus-20 kodonia välittömästi edeltävästä nukleotidistä PstI-kohtaan, joka sijaitsee 169 ep 5'-päähän päin vastasuuntaan, ei toimi transkription promoottorina, mutta fragmentti, joka sisältää alueen, joka ulottuu kohdalla 401 ep vasta-suuntaan sijaitsevaan EcoRI-kohtaan asti ja vielä tätäkin 25 pidemmälle, toimii transkription promoottorina. Tästä syystä kuviossa 3 esitetyssä 1346 ep:n suuruisessa PGK-geenipromoottorin sisältävässä sekvenssissä sisältää 401 epm suuruinen sekvenssi promoottorin toimintaan tarpeellisen sekvenssin, joka ulottuu 946:nnen nukleotidin 30 kohdalla olevasta EcoRI-kohdasta välittömästi ATG:n edellä sijaitsevaan 1346:nteen nukleotidiin.
89
Esimerkki 22: Glyseraldehvdi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAP) -geenin kloonaus ia GAP-geenin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssin sekvensointi
Candida utiliksessa olevan glyseraldehydi-3-fosfaattide-5 hydrogenaasi (GAP) -geenin kloonaus suoritettiin hybridi -saatiomenetelmällä käyttäen DNA-kirjastona esimerkissä 2 konstruoitua Candida utiliksen genomista DNA-kirjastoa ja käyttäen koettimena muiden organismien tunnettua GAP-gee-niä. Suodattimet, joille oli adsorboitu noin 20 000 plak-10 kia edellä kuvatun kirjaston faagi-DNA:ta, valmistettiin sivuilla 2, 95 - 121 teoksessa Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) kuvattua menetelmää noudattaen. Toisaalta noin 1 ke:n suuruinen AsuII-Aflii-fragmentti irrotettiin pUC18-plasmidin joh-15 dannaisesta, jossa on 2,1 ke-.n suuruinen Saccharomyces cerevisiaen GAP-geenin sisältävä HindIII-fragmentti [Yamano, et ai., Journal of Biotechnology 32 (1994) 165 -171], miltei kokonaisen GAP-geenin sisältävänä fragmenttina. Tämä fragmentti varustettiin 32P-leimalla ja hybri-20 disaatio suoritettiin käyttäen koettimena leimalla varus tettua fragmenttia. Eristettiin kolme positiivista plakkia. Yhdestä näistä plakista valmistettu faagi-DNA jatko-kloonattiin ja faagi-DNA:n sisältämä 6,5 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti eristettiin. Tämä fragmentti liitettiin 25 tämän jälkeen pBluescript IISK+ -plasmidivektorin EcoRI- kohtaan plasmidien pGAPl ja -2 (kuviot 29) konstruoimiseksi .
Eristetty 6,5 ke:n suuruinen EcoRI-fragmentti pilkottiin 30 Hindlll-, Clal-, Smal- tai Spel-restriktioentsyymeillä, joita käytettiin yksinään tai yhdistelminä, ja tulokseksi saaduille fragmenteille suoritettiin Southern-hybridisaa-tio käyttäen koettimena Saccharomyces cerevisiaen GAP-geeniä. Voimakasta hybridisaatiota havaittiin 3,8 ke:n 35 suuruisella Hindlll-Spel-fragmentilla. 3,8 ke:n suuruinen HindiII-Spel-fragmentti liitettiin pBluescript IISK+ tai pBluescript IIKS+-plasmidivektorien Hindlll-Spel-kohtien 90 väliin, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Käyttäen ΕχοΙII:a ja mung-pavun nukleaasia valmistettiin deleetio-mutantit näiden plasmidien restriktioentsyymikohtien, kuten Hindlll, Clal tai Smal, kohdalta useita erilaisia 5 deleetiomutaatioita sisältävien plasmidien valmistamisek si ja 3749 ep:n suuruisen HindIII-SpeI-fragmentin sekvenssi määritettiin (kuvio 29).
Analysoitaessa odotettua rakennegeenialuetta havaittiin 10 1005 ep:n suuruinen avoin lukukehys. Tästä kehyksestä päätellyn geenituotteen aminohapposekvenssistä tutkittiin homologia Saccharomyces cerevisiaen GAP-geenituotteen suhteen. Nämä sekvenssit osoittautuivat olevan keskenään 79,6-%:isesti homologisia, joten eristetyn geenin päätel-15 tiin olevan Candida utiliksen GAP-geeni. Fragmentti si sältää lisäksi säätelyalueena aloituskodonista katsottuna vastasuuntaan sijaitsevan 975 ep:n mittaisen sekvenssin ja lopetuskodonista myötäsuuntaan olevan 1769 ep:n mittaisen sekvenssin. Kuviossa 30 on esitetty HindiII-koh-20 dasta välittömästi aloituskodonin eteen ulottuva 975 ep:n suuruinen sekvenssi, jonka otaksutaan sisältävän transkription promoottorin. Lisäksi kuviossa 31 on esitetty välittömästi TAA-lopetuskodonista Af1III-kohtaan ulottuva 802 ep:n mittainen sekvenssi, jonka otaksutaan sisältävän 25 transkription terminaattorin.
Esimerkki 23: GAP-geenin promoottorin ja terminaattorin sisältävien ilmentämisvektorien konstruktio Candida utiliksen GAP-geenin säätelyalueilta hankittiin 30 PCR-menetelmää käyttäen käyttöön DNA-fragmentit, jotka sisälsivät joko promoottorin tai terminaattorin (kuvio 29) .
Promoottorin kyseessä ollessa saatiin plasmidia pGAPl 35 templaattina käyttäen fragmentti, joka ulottuu Hindlll- kohdasta välittömästi ATG-aloituskodonin eteen. Alukkeina käytettiin kahta sekvenssiä: 91
5'-CCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3' (SEKVENS SI ID
NO :2 3) j a 5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3' (SEKVENSSI ID NO :24) .
5 Promoottorista syntetoitiin sellainen, että se sisälsi välittömästi aloituskodonin edessä 3'-puolella myötä-suuntaan olevan Xbal-kohdan.
Terminaattoriksi saatiin lisäksi pGAPl-plasmidia temp-10 laattina käyttäen käyttöön fragmentti, joka ulottui välittömästi lopetuskodonin jälkeen olevasta kohdasta Spel-kohtaan. Alukkeina käytettiin sekvenssejä: 5'-GGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGGG-3' (SEKVENSSI ID NO:25) ja
15 5 ' -GGACTAGTGAGATGACTCTAGGCATCTTCT-3' (SEKVENS SI ID
NO:26).
Terminaattorista syntetoitiin sellainen, että se sisälsi välittömästi lopetuskodonin jälkeen 5'-puolella olevan BamHI-kohdan.
20 PCR-menetelmää käytettiin 30 syklin verran käyttämällä Pfu-DNA-polymeraasia (Stratagene). Promoottorifragmentti, joka oli syntetoitu PCR-menetelmällä, pilkottiin HindIII:lla ja Xbal:11a, liitettiin pUCl9-vektorin 25 Hindlll- ja Xbal-kohtien väliin plasmidin pUGpro (kuvio 32) konstruoimiseksi. Toisaalta terminaattorifragmentti pilkottiin lopetuskodonin suhteen noin 0,8 ke:n verran myötäsuuntaan olevasta Afllll-kohdasta, käsiteltiin Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi ja 30 pilkottiin BamHI:11a. Näin aikaansaatu 0,8 ke:n suuruinen fragmentti liitettiin pUC19-vektorin BamHI- ja Smal-koh-tien väliin plasmidin pUGter (kuvio 32) konstruoimiseksi.
Plasmidin pUGter GAP:n terminaattorin myötäsuuntaan ole-35 vassa päässä oleva EcoRI-kohta käsiteltiin ensin Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi, minkä jälkeen eristettiin NotI-kytkijät (5'AGCGGCCGCT3', SEKVENSSI
92 ID NO :18) plasmidin pUGterN konstruoimiseksi. Lisäksi plasmidista pUGpro irrotettiin HindIII:lla ja Xbal:lla 0,95 ke:n suuruinen GAP:n promoottoritragmentti ja se liitettiin pUGterNrn Hindlll- ja Xbal-kohtien väliin 5 ilmentämisplasmidin pGAPPTl konstruoimiseksi. Lisäksi promoottoriin nähden vastasuuntaan olevassa päässä oleva Hindlll-kohta käsiteltiin Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi ja ligatoitiin NotI-kytkijöihin (5'AGCGGCCGCT3', SEKVENSSI ID NO:18) plasmidin pGAPPT2 10 (kuvio 32) konstruoimiseksi.
Sen varmistamiseksi, että näin konstruoitu ilmentämis-plasmidi pGAPPT2 toimii käytännössä Candida utiliksessa, liitettiin Xbalrlla ja Bglllrlla esimerkissä 19 kuvatusta 15 pAPH2-plasmidista irrotettu 1,1 ke:n suuruinen APT-geeni- fragmentti plasmidin pGAPPT2 Xbal- ja BamHI-kohtien väliin pGAPAPHl-plasmidin (kuvio 32) konstruoimiseksi.
Näin konstruoitu plasmidi pGAPAPHl pilkottiin ensin 20 NotI:11a ja sitä käytettiin sitten ATCC 9950 -kannan transformaatioon elektroporaation avulla käyttämällä menetelmää olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm. Transformantit selektoitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 200 jug/ml 25 G418:aa. Noin 40 transformanttia saatiin 0,1 μg:lla DNA:ta. Tämä merkitsi sitä, että GAP-geenin promoottori ja terminaattori olivat aktiiviset.
Esimerkki 24: Plasmamembraanin protoni-ATPaasi (PMA) 30 -geenin kloonaus ia PMA-geenin sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssin sekvensointi
Candida utiliksessa olevan plasmamembraanin protoni-ATPaasi (PMA) -geenin kloonaus suoritettiin hybridi-sointimenetelmällä käyttäen esimerkissä 2 konstruoitua 35 Candida utiliksen genomista DNA-kirjastoa ja koettimena osaa muiden organismien tunnetusta PMA-geenistä. Suodattimet, joille oli adsorboitu noin 20 000 plakkia edellä 93 olevaa geenikirjastoa, valmistettiin sivuilla 2, 95 - 121 teoksessa Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) kuvattua menetelmää noudattaen. Noin 1 ke:n suuruinen alue, joka vastasi aluetta +1 -5 +1027 (aloituskodonin ATG:n A:sta käytetään numeroa +1) PMAl:n rakennegeenin 5'-päästä, monistettiin PCR-menetel-mällä käyttäen Saccharomyces cerevisiaen PMAl-geenin DNA-sekvenssin perusteella [Serrano, et ai., Nature 319 (1986) 689 - 693] syntetoitua kahta aluketta: 10 5'-ATGACTGATACATCATCCTCTTCATC-3' (SEKVENSSI ID NO:27) ja 5'-TAACGACAGCTGGCAAACCGACTGGGAC-3' (SEKVENSSI ID NO: 2 8),
ja käyttämällä templaattina Saccharomyces cerevisiae AH22 -kannan kromosomaalista DNA:ta. Kromosomaalinen DNA valmistettiin käyttäen menetelmää, joka on kuvattu sivuilla 15 126 - 127 teoksessa Methods in Yeast Genetics - A
Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1990). Saatu frag- . , , 'XO . . ...
mentti varustettiin P-leimalla ja hybridisaatio suoritettiin käyttäen koettimena leimalla varustettua frag-20 menttia. Tulokseksi saatiin neljä positiivista plakkia.
Yhden näiden neljän positiivisen plakin faagi-DNA:n kyseessä ollessa pilkottiin insertio-DNA Xbal:lla neljän Xbal-fragmentin eristämiseksi, joiden suuruudet olivat 10 ke, 4 ke, 2,8 ke ja 2,6 ke.
25
Kun nämä neljä eristettyä fragmenttia hybridisoitiin seulontaan käytettävällä koettimella, joka sisälsi noin 1 ke:n suuruisen fragmentin Saccharomyces cerevisiaen PMAl-geeniä, niin koetin hybridisoitui 2,6 ke:n suurui-30 seen Xbal-fragmenttiin. Fragmentti liitettiin pBluescript IISK+-plasmidivektorin Xbal-kohtaan plasmidien pPMAFl ja pPAMF2 valmistamiseksi, jotka on liitetty toisiinsa nähden päinvastaiseen suuntaan (kuvio 33). 1 Näistä plasmideista valmistettiin deleetiomutantteja restriktioentsyymikohtien, kuten BamHI-, Clal- tai EcoRI-kohtien, kohdalta, ja kyseisistä plasmideista valmistet- 94 tiin deleetiomutantteja eksonukleaasi III :11a ja mung-pawn nukleaasilla useita erilaisia deleetiomutaatioita sisältävien plasmidien valmistamiseksi ja noin 1 ke:n suuruisten DNA-sekvenssien määrittämiseksi molemmista 5 päistä käsin (kuvio 33). Kun odotettu rakennegeenialue analysoitiin, havaittiin 352 ep:n suuruinen avoin luku-kehys, jossa esiintyi noin 50-%:ista homologiaa Saccharo-myces cerevisiaen PMAl:n rakennegeenin 5'-terminaalisen alueen suhteen ja joka sijaitsi noin 1 ke:n suuruisessa 10 sekvenssissä, joka sisälsi Xbal-kohdasta kuviossa 33 vasemmalla puolella olevaan EcoRV-kohtaan ulottuvan alueen. Noin 0,8 ke:n suuruisessa sekvenssissä, joka sisälsi alueen, joka ulottui toisella puolella olevasta Xbal-koh-dasta molekyylin sisälle päin ja johon sisältyi BamHI-15 kohta, havaittiin 754 ep:n suuruinen avoin lukukehys, jossa esiintyi 70-%:ista homologiaa sellaista aluetta kohtaan, joka ulottui Saccharomyces cerevisiaen PMAl-gee-nissä kohdasta +1292 kohtaan +2046 (aloituskodonin ATG:sta käytetään numeroa +1). Tästä tuloksesta päätel-20 tiin, että eristetty geeni on Candida utiliksen PMA-gee- ni. Lisäksi 2,6 ke:n suuruinen Xbal-fragmentti sisälsi 599 ep:n suuruisen sekvenssin ATG-aloituskodonista vasta-suuntaan. Kuviossa 34 on esitetty tämän 599 ep:n suuruisen fragmentin sekvenssi, jonka odotetaan sisältävän 25 transkription promoottorin.
Transkription terminaattorin kyseessä ollessa jatko-kloonattiin samasta faagi-DNA:sta Xbal:11a irrotetut jäljellä olevat 3 fragmenttia (10 ke, 4 ke ja 2,8 ke) ja 30 niiden DNA-sekvenssit määritettiin molemmista terminaali sista puolista käsin sen homologian tutkimiseksi, mikä niillä on Saccharomyces cerevisiaen PMAl-geenin 3'-puoleista aluetta kohtaan. Tuloksista kävi ilmi, että alue, jolla on suurta homologiaa PMAl-geenin 3'-puoleisen pään 35 suhteen, esiintyy 2,8 ke:n suuruisen Xbal-fragmentin toi sella puolella. Xbal-fragmentti liitettiin pBluescript IISK+-plasmidivektorin Xbal-kohtaan plasmidien PMAL1 ja 95 PMAL2 valmistamiseksi, joissa fragmentti oli liitetty päinvastaiseen suuntaan toisiinsa nähden (kuvio 33). Näistä plasmideista valmistettiin sellaisia useita erilaisia deleetiomutaatioita sisältäviä plasmideja pilkko-5 maila ne Kpnlilla tai käyttämällä eksonukleaasi III:a ja mung-pavun nukleaasia, joista määritettiin 1,9 ke:n suuruisen DNA:n sekvenssi, joka ulottui Xbal-kohdasta Kpnl-kohtaan (kuvio 33). Tämä DNA-sekvenssi sisälsi 717 ep:n suuruisen avoimen lukukehyksen, joka on noin 82-%:isesti 10 homologinen Saccharomyces cerevisiaen PMA1-geenin aluetta kohtaan, joka ulottuu +2041:sta +2757:ään (ATG-aloitus-kodonin A:sta käytetään numeroa +1) ja 188 ep:n suuruista sekvenssiä kohtaan, joka sijaitsee TAA-lopetuskodonista myötäsuuntaan. Kuviossa 35 on esitetty välittömästi TAA-15 lopetuskodonia seuraavasta kohdasta Kpnl-kohtaan ulottuva 1188 ep:n suuruinen sekvenssi, jonka odotetaan sisältävän transkription terminaattorin.
Esimerkki 25: PMA-creenin promoottorin ia terminaattorin 20 sisältävän ilmentämisvektorin konstruktio
Ensimmäiseksi hankittiin PCR-menetelmällä käyttöön Candida utiliksen PMA-geenin säätelyalueelta peräisin olevat DNA-fragmentit, jotka sisältävät promoottorin tai terminaattorin (kuvio 33).
25
Promoottorin kyseessä ollessa saatiin fragmentti, joka ulottuu Xbal-kohdasta 20 ep myötäsuuntaan olevasta kohdasta välittömästi ATG-aloituskodonia edeltävään kohtaan, käyttämällä templaattina pPMAFl-plasmidia. Alukkeina käy-30 tettiin kahta DNA-sekvenssiä:
5'-GGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGA-3' (SEKVENSSI ID
NO:2 9) ja
5'-TTCTAGACTATATCAATGGTTAGTATCACGTG- 3' (SEKVENSSI ID
NO:30).
35 Promoottori syntetoitiin siten, että vastasuunnassa ole vaan 5'-päähän tuli NotI-kohta ja 3'-puolella myötä- 96 suuntaan sijaitsevan aloituskodonin eteen tuli tätä välittömästi edeltävä Xbal-kohta.
Terminaattorin kyseessä ollessa saatiin fragmentti, joka 5 ulottui välittömästi TAA-lopetuskodonin jälkeen sijaitse vasta kohdasta 403 ep lopetuskodonista myötäsuuntaan käyttäen templaattina plasmidia pMALl. Alukkeina käytettiin DNA-sekvenssejä: 5'-CCGGTACCTAAGCCGCTAATACCCC-3' (SEKVENSSI ID NO: 31) ja 10 5'-GGGCGGCCGCACTCGCTGATCGAAA-3' (SEKVENSSI ID NO:32).
Terminaattori syntetoitiin siten, että Kpnl-kohta tuli vastasuuntaan 5'-puolella välittömästi lopetuskodonin jälkeen ja NotI-kohta tuli 3'-puoleiseen päähän.
15 PCR-menetelmää käytettiin 30 syklin verran käyttäen Pfu- DNA-polymeraasia (Stratagene). PCR-menetelmällä syntetoi-tu promoottorifragmentti pilkottiin NotI:11a ja Xbal:11a, liitettiin pBluescript II SK+-vektorin NotI- ja Xbal-koh-tien väliin plasmidin pBMpro konstruoimiseksi. Toisaalta 20 terminaattorifragmentti liitettiin pBluescript II SK+:n
Kpnl- ja NotI-kohtien väliin plasmidin pBMter konstruoimiseksi. pBMter-plasmidista saatu 0,4 ke:n suuruinen Knpl-NotI-fragmentti liitettiin sellaisessa plasmidissa pUC19N olevien Kpnl- ja Notl-kohtien väliin, joka oli 25 konstruoitu käsittelemällä pUC19-plasmidin EcoRI-kohta
Klenow-entsyymillä ja ligatoimalla tähän NotI-kytkijät (5' AGCGGCCGCT 3', SEKVENSSI ID N0:18), plasmidin pUMter (kuvio 36) konstruoimiseksi.
30 0,4 ke:n suuruinen terminaattorifragmentti, joka oli saa tu pilkkomalla pUMter-plasmidi Xbal:11a ja NotI:11a, ja 0,65 ke:n suuruinen promoottorifragmentti, joka oli saatu pilkkomalla pBMpro-plasmidi NotI:11a ja Xbal:11a, liga-toitiin 2,9 ke:n suuruiseen fragmenttiin, joka oli saatu 35 pilkkomalla esimerkissä 4 konstruoitu pPGKPTS-plasmidi NotI:11a, plasmidin pMAPHl (kuvio 1) konstruoimiseksi.
97
Sen varmistamiseksi, että näin konstruoitu ilmentämis-plasmidi pMAPHl toimii käytännössä Candida utiliksessa, liitettiin esimerkissä 19 kuvatusta pAPH2-plasmidista Xbalrlla ja BglII:lla irrotettu 1,1 ke:n suuruinen APT-5 geenitragmentti plasmidin pMAPHl Xbal- ja BamHI-kohtien väliin plasmidin pMAAPHl (kuvio 36) konstruoimiseksi.
Näin konstruoitu pMAAPHl-plasmidi pilkottiin ensin NotI:11a ja tätä käytettiin sitten ATCC 9950 -kannan 10 transformaatioon elektroporaation avulla käyttämällä menetelmää olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm.
Transformantit selektoitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 15 200 μg/ml G418:aa. Käyttämällä 0,1 μg DNA:ta saatiin noin 40 transformanttia. Tämä merkitsee sitä, että GAP-geenin promoottori ja terminaattori olivat aktiiviset.
Esimerkki 26: Autonomisesti replikoituvia sekvenssejä 2 0 (ARS) sisältävien DNA-fracrmenttien kloonaus
Esimerkissä 19 konstruoidusta pGKAPHl-plasmidista irrotettiin PGK-geenin promoottorin ja PGK-geenin terminaat-torin sisältävä 3,3 ke:n suuruinen NotI-fragmentti, joka liitettiin pBluescript II SK~-plasmidin (Stratagene) 25 NotI-kohtaan plasmidin pGKAPH2 (kuvio 37) konstruoimisek si. Tämän jälkeen 200 ng BamHI:lla pilkottua ja de-fosforyloitua plasmidia pGKAPH2 ja 200 ng esimerkissä 2 saatuja Candida utiliksen ATCC 9950 -kannan genomisen DNA:n osittaisesti Sau3AI:lla pilkottuja 3-7 ke:n 30 suuruisia fragmentteja ligatoitiin T4-DNA-ligaasilla. E.
coli DH5 transformoitiin tällä DNA-liuoksella ja plasmidi-DNA-seokset eristettiin genomisesta DNA-kirjastosta saatujen noin 30 000 transformantin joukosta. ATCC 9950 -kanta transformoitiin 3 μg:lla DNA:ta, joka 35 oli valmistettu kirjastosta esimerkissä 4 kuvatulla elektroporaatiolla neljänlaisissa olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 800 Ω tai 1000 Ω ja 98 jännite 3,75 kV/cm tai 5 kV/cm. Näin saatiin seitsemän sykloheksimidiresistenttiä pesäkettä. Näitä resistenttejä kantoja viljeltiin YPD-mediumissa, joka sisälsi 400 μ§/ναΙ G418:aa. Soluista valmistettiin kokonais-DNA E. coli 5 DH5:n transformoimiseksi. Hiivan kromosomaalinen DNA valmistettiin menetelmän mukaan, joka on kuvattu sivuilla 131 - 132 teoksessa Methods in Yeast Genetics - A Laboratory Course Manual - Rose, M.D., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Kun seitsemän plasmi-10 din (pCARSl, pCARS4, pCARS5, pCARS6, pCARS7, pCARS8 ja pCARSlO) DNA:t, jotka oli otettu talteen E. colista, pilkottiin useilla erilaisilla restriktioentsyymeillä, niin kävi ilmi, että jokainen näistä plasmidi-DNA-molekyyleis-tä sisälsi 5 - 7 ke:n suuruiset insertiosekvenssit. Li-15 säksi silloin kun ATCC 9950 -kanta oli transformoitu plasmidi-DNA:11a elektroporaatiomenetelmällä, saatiin kaikista näistä plasmidi-DNA-molekyyleistä G418-resis-tenttejä transformantteja. Tämä tulos varmisti sen, että DNA-sekvenssit, joilla on kyky replikoitua autonomisesti, 20 oli kloonattu näihin plasmideihin. Analyysillä, jossa käytettiin pilkkomista useilla erilaisilla restriktio-entsyymeilla, osoitettiin, että näistä plasmideista pCARS7 ja pCARS8 sisältävät saman insertiosekvenssin.
Nämä tulokset merkitsevät sitä, että tässä esimerkissä 25 oli kloonattu kuusi DNA-fragmenttia, jotka kykenevät rep- likoitumaan autonomisesti Candida utilis -hiivassa.
Lisäksi valmistettiin Candida utilis -hiivan genominen DNA-kirjasto käyttämällä vektorina esimerkissä 9 kuvattua 30 plasmidia pCLBSlO (kuvio 15). Candida utilis -hiiva transformoitiin tällä kirjastolla yhdessä plasmidiin pGAPH2 konstruoidun kirjaston kanssa. Ei saatu kuitenkaan yhtään sykloheksimidille resistenttiä transformanttia. Tämä merkitsee sitä, että Candida utiliksen ARS:n ominai-35 suutena on sitä sisältävän plasmidin pieni kappaleluku-määrä solua kohti, eikä transformanttia voida selektoida käytettäessä ARS:ää L41-sykloheksimidiresistenssigeenin 99 yhteydessä, joka vaatii transformantin selektointiin useita kappaleita geeniä.
Esimerkki 27: Autonomisesti replikoituvia sekvenssejä 5 (ARS) sisältävien DNA- f ragmenttien typistäminen
Suoritettiin yksityiskohtaisia jatkotutkimuksia kolmesta plasmidista (pCARS5, pCARS6 ja pCARS7), jotka kuuluivat niihin seitsemään plasmidiin, joihin esimerkissä 26 oli kloonattu autonomisesti replikoituva DNA-sekvenssi ja 10 joilla Candida utilis -hiiva oli suotuisin tuloksin transformoitu.
Näillä kolmella plasmidilla tutkittiin hiivan trans-formaatiofrekvenssiä käyttämällä kontrollina esimerkissä 15 19 valmistettua kromosomiin liittyneen plasmidin, pCLRAPHl:n, BglII:lla pilkottua DNA:ta. ATCC 9950 -kanta transformoitiin 0,1 ^g:lla DNArta elektroporaatio-menetelmällä käyttämällä menetelmää olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 1000 Ω ja jännite 20 5 kV/cm. Seosta viljeltiin elektroporaation jälkeen nel jän tunnin ajan. Tulos on esitetty taulukossa 7.
Taulukko 7. Transformaatiofrekvenssit useita erilaisia ARS-plasmideja käyttäen 25 Plasmidi Pesäkkeiden lukumäärä pCARS5 16450 pCARS6 9500 pCARS7 4700 30 pCLRAPHl 400
Huomautus 1) : Transformanttien lukumäärä 1 /ig:n suuruista plasmidi-DNA-erää kohti.
Huomautus 2): pCLRAPHl oli pilkottu BglII:lla ennen käyt-35 töä.
100 Tämä merkitsee sitä, että käyttämällä ARS:ää sisältäviä plasmideja saadaan transformaatiofrekvenssi, joka on noin 10 - 40 kertaa suurempi kuin se transformaatiofrekvenssi, joka saadaan DNA:n liittymisestä rDNA-kohteeseen.
5 Nämä plasmidit pCARS5, pCARS6 ja pCARS7 pilkottiin lisäksi NotI:lla ja ne tehtiin uudelleen rengasmaisiksi T4-DNA-ligaasilla plasmidien pCARS50, pCARSGO ja pCARS70 konstruoimiseksi, joista oli deletoitu 3,3:n Notl-frag-10 mentti, joka sisälsi PGK-geenin promoottorin, APT-geenin ja PGK-geenin terminaattorin. Näistä kolmesta uudesta plasmidista tutkittiin niiden insertiosekvenssien pituus pilkkomalla useilla erilaisilla restriktioentsyymeillä. Kaikkien näiden plasmidien insertiosekvenssit olivat noin 15 5 - 6 ke:n suuruiset, joten autonomisen replikaatiokyvyn sisältävät alueet olivat edelleen typistyneet. Kukin näistä plasmideista pCARS50, pCARS60 ja pCARS70 pilkottiin osittain Sau3AI:lla 1 - 3,5 ke:n suuruisten fragmenttien talteensaamiseksi, jotka ligatoitiin T4-DNA-li-20 gaasilla BamHI:lla pilkottuun ja defosforyloituun pGRAPH2-plasmidiin. E. coli DH5 transformoitiin kullakin näillä kolmella DNA-liuoksella ja plasmidi-DNA-seoksia eristettiin 2500 - 6000 transformantista DNA-kirjastojen valmistamiseksi. ATCC 9950 -kanta transformoitiin G418-25 resistenttien transformanttien aikaansaamiseksi uudelleen 5 μg:n erillä DNA:ta esimerkissä 11 kuvatulla elektro-poraatiomenetelmällä.
Näin saadut G418-resistentit pesäkkeet olivat kooltaan 30 erisuuruisia ja kustakin näistä kolmesta kirjastosta peräisin olevaa viittä transformanttia, jotka olivat muodostaneet suhteellisen suuren pesäkkeen, jatkoviljeltiin YPD-mediumissa, joka sisälsi 200 μg/ml G418:aa. Näin saaduista soluista valmistettiin kokonais-DNA-preparaatit ja 35 E. coli DH5 transformoitiin tällä DNA:11a. Joillakin G418-resistenteillä kannoilla ei saatu E. colin transformanttia. Lisäksi silloin kun ATCC 9950 -kanta oli 101 transformoitu uudelleen näillä plasmideilla, jotka oli saatu talteen esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaatiol-la, olivat jotkin näistä plasmideista jääneet ulkopuolelle, koska niissä esiintyi erittäin pieni trans-5 formaatiofrekvenssi verrattuna alkuperäisiin plasmideihin pCARS5, pCARS6 ja pCARS7. Lopuksi kustakin plasmidista pCARS50, pCARS60 ja pCARS70 saatiin plasmidi, joka sisältää typistetyn DNA-fragmentin ja jonka transformaatio-frekvenssi vastaa lähtöplasmidin transformaatio-10 frekvenssiä. pCARS50:sta peräisin olevasta plasmidista käytettiin nimitystä pCARS5-2, pCARS60:sta peräisin olevasta pCARS6-2 ja pCARS70:stä peräisin olevasta pCARS7-2, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Niiden kromoso-maalisten DNA-fragmenttien restriktioentsyymikartat, jot-15 ka sisältävät näin aikaansaaduissa kuudessa plasmidissa olevat autonomisesti replikoituvat sekvenssit, on esitetty kuviossa 38.
Pidemmälle typistettyjä DNA-fragmentteja sisältäviä plas-20 mideja konstruoitiin kolmesta plasmidista, pCARS5-2, pCARS6-2 ja pCARS7-2, joilla kromosomaalisen DNA:n fragmentit on typistetty, näiden transformaatiofrekvenssien tutkimiseksi. Kun tällä menetelmällä konstruoitujen joidenkin plasmidien osittaiset DNA-sekvenssit määritettiin, 25 niin noin 700 ep:n suuruinen alue kuviossa 38 esitetyssä pCARS5:ssa olevan Bglll-kohdan vasemmalla puolella osoittautui olevan noin 90-%:isesti tai tätä enemmän homologinen noin 700 ep:n suuruista aluetta kohtaan, joka sijaitsi pCARS6-2:n EcoRI-kohdan vasemmalla puolella. Tämä tu-30 los viittasi siihen, että pCARS5:n ja pCARS6:n insertio- DNA-fragmentit, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna, ovat peräisin homologisista kromosomeista tai kertautuvista sekvensseistä vaikka niiden restriktioentsyymikartat ovatkin erilaiset. pCARS6:n ja pCARS7:n insertio-35 DNA-fragmentista suoritettiin tästä syystä seuraava analyysi. pCARS6:ssa olevasta autonomisesti replikoituvasta sekvenssistä käytettiin nimitystä CUARS1 ja pCARS7:ssä 102 olevasta autonomisesti replikoitavasta sekvenssistä käytettiin nimitystä CUARS2, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna .
5 Esimerkki 28: pCARS6:een ia pCARS7:een liitettyjen DNA-fraomenttien typistäminen ia transformaatiofrekvenssi sekä plasmidin stabiilisuus (1) pCARS6:een liitetyn DNA-fragmentin typistäminen ia 10 transformaatiofrekvenssi
Sau3AI:lla osittain pilkottuun pCARS6-2-plasmidiin kloonatun DNA-fragmentin suuruus oli noin 1,9 ke. Siten konstruoitiin 3 plasmidia, jotka sisälsivät osia pCARSö-2:een liitetystä fragmentista, jotta autonomisesti repli-15 koituvia aluetta olisi kyetty vielä edelleen rajoittamaan. Nämä plasmidit konstruoitiin käyttäen seuraavaa menetelmää.
APT-geenin ilmentämiskasetin sisältävä 3,3 ke:n suuruinen 20 NotI-fragmentti poistettiin pCARS6-2:sta pCARS6-20:n konstruoimiseksi. Plasmidi pCARS6-20 pilkottiin AflII:lla ja Xbal:lla, käsiteltiin Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi ja muodostettiin uudelleen renkaaksi T4-DNA-ligaasilla plasmidin pCARS6-210 konstruoi-25 miseksi. Plasmidi ligatoitiin 2,3 ke:n suuruiseen APT- geenin ilmentämiskasetin sisältävään Notl-fragmenttiin, joka sisälsi plasmidista pGKAPH3 irrotetun typistetyn PGK-geenin promoottorin, plasmidin pCARS6-12 konstruoimiseksi. Plasmidi pGKAPH3 konstruoitiin käsittelemällä esi-30 merkissä 9 konstruoidun pGKAPHl-plasmidin promoottori- fragmentissa olevaa EcoRI-kohtaa Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi, joihin liitettiin Notl-kytkijät (5'AGCGGCCGCT3', SEKVENSSI ID NO:18). Sekä pCARS6-20 että pCARS6-21 pilkottiin HindIII:lla, muo-35 dostettiin uudelleen rengasmaiseksi T4-DNA-ligaasilla ja ligatoitiin tämän jälkeen samalla tavoin kuin edellä 2,3 ke:n suuruiseen Notl-fragmenttiin, jossa oli typiste- 103 tyn PGK-geenin promoottorin sisältävä APT-geenin ilmen-tämiskasetti, plasmidien pCARS6-22 ja pCARS6-23 konstruoimiseksi, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Näiden viiden plasmidin sisältämien insertio-DNA-fragment-5 tien restriktioentsyymikartat on esitetty kuviossa 39.
ATCC 9950 -kanta transformoitiin kullakin tällä tavoin konstruoidulla plasmidilla esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä, jossa käytetyn DNA:n määrä 10 oli 1 μg ja menetelmää käytettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΈ, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm. Viljelmää viljeltiin elektroporaation jälkeen 4 tuntia. Tulos on esitetty taulukossa 8.
15 Taulukko 8: pCARS6:sta peräisin olevien useiden erilais ten plasmidien transformaatiofrekvenssit ja stabiilisuudet
Transformanttien lukumäärä 1 μg:n suuruista plasmidi-DNA-20 erää kohti
Pesäkkeiden
Plasmidi lukumäärä (%) pCARS6 1093 (100) pCARSS-2 710 (65) 25 pCARS6-21 137 (13) pCARS6-22 253 (23) pCARS6- 23 25 (2)
Huomautus 1: Koetulokset on esitetty keskiarvoina kahdes-30 ta rinnakkaisesta kokeesta.
104
Plasmidin stabiilisuus
Plasmidi (%) pCARS6 21,4 5 pCARSS-2 31,9 pCARS6- 21 29,9 pCARS6-22 11,0 pCARS6-23 3,9 10 Huomautus: solusukupolvien lukumäärä on 2,5 - 3,5 solu- sukupolvea .
Kunkin plasmidin stabiilisuus hiivassa tutkittiin seuraa-vaa menetelmää noudattaen. Näin saadut G418:lle resisten-15 tit pesäkkeet ympättiin 4 ml:aan YPD-mediumia ja seoksia viljeltiin ravistellen 30 °C:Ssa 8 tuntia. Solut levitettiin YPD-maljalle sekä YPD-maljalle, joka sisälsi G418:aa. Pesäkkeiden lukumääriä verrattiin toisiinsa sen jälkeen kun maljoja oli viljelty kaksi päivää ja plasmi-20 din säilyminen laskettiin. Tulokset on esitetty taulukossa 8. Viljelmän absorbanssi osoitti, että solut olivat jakautuneet 2,5 - 3,5 kertaa. Tästä tuloksesta käy myös ilmi, että plasmidien pCARS6-21 ja pCARS6-22 kyseessä ollessa, joissa pCARS6-2:een liitetty DNA-fragmentti oli 25 typistetty molemmilta puolilta, esiintyi huomattavan suurta transformaatiofrekvenssin pienenemistä, vaikkakin pCARS6-21:n stabiilisuuden havaittiin olevan samanlainen kuin pCARS6-2:11a. CARS6-23:n kyseessä ollessa, jolla liitettyä DNA-fragmenttia oli typistetty 0,6 ke:ksi, oli 30 myös transformaatiofrekvenssi pienentynyt 1/50:een verrattuna pCARS6:lla saatuun transformaatiofrekvenssiin. Nämä tulokset merkitsevät sitä, että pCARS6:ssa olevaa CUARS1:tä on vaikeampi typistää kuin pCARS6-2:ssa olevaa noin 1,9 ke:n suuruista DNA-fragmenttia.
35 105 (2) pCARS7:n insertio-DNÄ-fragmentin typistäminen ia transformaatiofrekvenssi
Sau3AI:lla osittain pilkottuun plasmidiin pCARS7-2 kloonatun DNA-fragmentin koko oli noin 3,5 ke. Siten auto-5 nomisesti replikoituvan alueen rajoittamiseksi edelleen konstruoitiin viisi plasmidia, jotka sisälsivät osia pCARS7-2:een liitetystä fragmentista käyttäen seuraavaa menetelmää.
10 Plasmidista pCARS7-2 poistettiin 3,3 ke:n suuruinen APT- geenin ilmentämiskasetin sisältävä NotI-fragmentti plas-midin pCARS7-20 konstruoimiseksi, joka tämän jälkeen pilkottiin Xbalilla, muodostettiin uudelleen rengasmaiseksi T4-DNA-ligaasilla ja ligatoitiin APT-geenin ilmentämis-15 kasetin sisältävään 2,3 ke:n suuruiseen NotI- fragmenttiin pCARS7-4:n konstruoimiseksi.
Lisäksi pCARS7-20:sta irrotettiin noin 1,8 ke:n suuruinen EcoRV-Hindlll-fragmentti, noin 1,3 ke:n suuruinen Xbal-20 Hindlll-fragmentti ja noin 1,8 ke:n suuruinen HindiII-
Bglll-fragmentti, ja ne ligatoitiin pBluescript IISK-:een (Stratagene), joka oli pilkottu EcoRVdlla ja HindIII:lla, Xbal:lla ja HindIII:lla tai HindIII:lla ja BamHI:lla, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. 2,3 ke:n suurui-25 nen NotI- fragmentti, jossa oli typistetyn PGK-geenin pro moottorin sisältävä APT-geenin ilmentämiskasetti, ligatoitiin plasmidiin pCARS7-6:n, pCARS7-7:n ja pCARS7-8:n konstruoimiseksi. Näissä kuudessa plasmidissa olevien insertio-DNA-fragmenttien restriktioentsyymikartat on 30 esitetty kuviossa 40.
ATCC 9950 -kanta transformoitiin kullakin näin konstruoidulla plasmidilla esimerkissä 11 kuvatulla elektro-poraatiolla, jossa käytetyn DNA:n määrä oli 1 μg ja mene-35 telmää käytettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 /zF, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm. Viljelmää 106 viljeltiin elektroporaation jälkeen 4 tuntia. Tulos on esitetty taulukossa 9.
Taulukko 9: pCARS7:sta peräisin olevien useiden erilais-5 ten plasmidien transformaatiofrekvenssit ja stabiilisuu- det
Transformanttien lukumäärä 1 /xg:n suuruista plasmidi-DNA-erää kohti
Pesäkkeiden 10 Plasmidi lukumäärä % pCARS7 1833 100 pCARS7-2 1273 69 pCARS7-4 0 0 15 PCARS7-6 598 33 pCARS7- 7 *280 15 PCARS7-8 5 0,2
Huomautus 1: Koetuloksissa on ilmoitettu keskiarvot kah- 20 desta rinnakkaisesta kokeesta
Huomautus 2: * merkitsee sitä, että pesäkkeiden koko on hyvin pieni.
107
Plasmidin stabiilisuus Plastnidi % pCARS7 23,0 5 pCARS7- 2 34,9 pCARS7- 6 18,6 pCARS7- 7 11,4 pCARS7- 8 7,0 10 Huomautus: Solusukupolvien lukumäärä on 2,5 - 3,5 solu-sukupolvea.
Kunkin entsyymin stabiilisuus hiivassa tutkittiin seuraa-van menetelmän mukaisesti. Tällä tavoin aikaansaatuja 15 G418:lle resistenttejä pesäkkeitä ympättiin 4 ml:aan YPD-mediumia ja niitä viljeltiin ravistellen 30 °C:ssa 8 tuntia. Solut levitettiin YPD-maljalle sekä G418:aa sisältävälle YPD-maljalle ja pesäkkeiden lukumääriä verrattiin toisiinsa kahden päivän viljelyn jälkeen soluissa säily-20 neiden plasmidien määrän laskemiseksi (taulukko 9). Viljelmän absorbanssi osoitti, että solut olivat jakautuneet 2,5 - 3,5 kertaa. Nämä tulokset merkitsivät sitä, että transformaatiofrekvenssit plasmideilla pCARS7-2 ja pCARS7-6 pienenivät noin 70 % ja noin 30 % verrattuna 25 pCARS7:n frekvenssiin. Stabiilisuus ei kuitenkaan pienen tynyt samassa määrin. Vaikkakin plasmidilla pCARS7-7, joka sisälsi vielä edelleen typistetyn DNA-fragmentin, transf ormaatiof rekvenssi osoittautui olevan siitä, mitä se oli pCARS7-6:ssa, se muodosti kooltaan hyvin pieniä 30 pesäkkeitä ja sen stabiilisuus osoittautui heikoksi (taulukko 9). Toisaalta transformaatiotrekvenssi oli pCARS7-8:11a heikkoa eikä pCARS7-4:lla saatu yhtään transfor-manttia. Nämä tulokset merkitsivät sitä, että pCARS7:ssa oleva CUARS2 voidaan typistään pCARS7-6:n mukaiseksi 108 1,8 ke:n suuruiseksi DNA-fragmentiksi, vaikkakin trans-formaatiofrekvenssi pienenee.
Nämä kaksi ARS:n typistämistä koskevaa tulosta merkitse-5 vät sitä, että Candida utills -hiivan ARS tarvitsee suh teellisen pitkän alueen siihen, että se kykenisi replikoituinaan autonomisesti. Tämä on hyvin mielenkiintoinen ominaisuus, joka eroaa siitä tosiseikasta, että Saccharo-myces-suvun hiivan noin 200 ep:n suuruinen ARS on 10 toimintakykyinen [Newlon, C.R. ja Theis, J., Current
Opinion in Genetics and Development 3 (1993) 752 - 758].
Esimerkki 29: pCARS6-2:n ia pCARS7-6:n autonomisesti replikoituvan sekvenssin sisältävien DNA-fragmenttien 15 DNA-sekvenssien määritys ia Southern-analyysi (1) Autonomisesti replikoituvia sekvenssejä sisältävien DNA-fragmenttien DNA-sekvenssien määritys pCARSö:ssa ja pCARS7:ssa olevien ARS:ää, CUARSl:tä ja 20 CUARS2:tä sisältävien DNA-fragmenttien DNA-sekvenssi mää ritettiin. Plasmidit, joissa oli useita erilaisia deleetiomutaatioita, valmistettiin DNA-sekvenssien määrittämiseksi deletoimalla ExoIII-nukleaasilla ja mung-pavun nukleaasilla molemmista päistä pCARS6-2:n insertio-25 DNA-fragmenttia, jota käytettiin CUARSlrtä sisältävänä DNA:na, sekä pCARS7-6:n insertio-DNA-fragmenttia, jota käytettiin CUARS2:ta sisältävänä DNA:na. pCARS6-2:n insertio-DNA-fragmentin DNA-sekvenssi on esitetty kuvioissa 41 ja 41 ja pCARS7-2:n insertio-DNA-fragmentin DNA-30 sekvenssi on esitetty kuvioissa 43 ja 44. pCARS6-2:n insertio-DNA-fragmentti sisältää 1921 ep ja sen A + T -määrän suhde emästen kokonaismäärään on 69,5 % ja pCARS7-2:n insertio-DNA-fragmentti sisältää 1788 ep ja sen A + T -määrän suhde emästen kokonaismäärään on 35 70,8 %. Tästä käy siten ilmi, että kummankin DNA-fragmen tin A + T määrä on hyvin korkea.
109
Tietokoneanalyysistä kävi ilmi, että ARS-sekvensseissä tavallisesti havaitun 11 ep:n suuruisen sekvenssin (T/A)TTTA(C/T)(A/G)TTT(T/A) [Newlon, C.R. jaTheis, J., Current Opinion in Genetics and Development 3 (1993) 5 752 - 758] esiintymistä tutkittaessa esiintyy pCARS6- 2:ssa 9 konsensus-sekvenssiä muistuttavaa sekvenssiä (nämä eroavat yhden emäksen verran konsensus-sekvenssistä) ja pCARS7-6:ssa esiintyy 13 samanlaista konsensus-sekvenssiä muistuttavaa sekvenssiä viiden sekvensseistä olio lessa limittäisiä toistensa suhteen (kuviot 41 - 44).
(2) Kaooalelukumäärien selvittäminen Southern-analvvsin avulla
Candida utilis -hiivasolussa olevien ARS:ää sisältävien 15 plasmidien kappalelukumäärän arvioimiseksi suoritettiin pCARS6:lla tai pCARS7:lla transformoiduista Candida utilis -hiivoista valmistetusta DNA:sta Southern-analyysi (kuvio 45-1) . Lisäksi koska kappalelukumäärien laskemiseen käytettiin sisäisenä standardina PGK-geeniä, suori-20 tettiin Southern-analyysi PGK-geenin kappalelukumäärien laskemiseksi (kuvio 45-2).
PGK-geenin kappalemäärien laskemiseen tarkoitettu Southern-analyysi suoritettiin käyttäen DNA:ta, joka oli 25 valmistettu kahdesta ATCC 9950 -kannasta, jotka oli transformoitu sellaisella esimerkissä 18 kuvatulla pCLLACl-plasmidilla, joka oli pilkottu PGK-promoottorissa olevan Sphl-kohdan kohdalta, sekä DNA:ta, joka oli valmistettu kontrollina käytetystä lähtökannasta. Kun PGK-30 promoottorin sisältävä 0,4 ke:n suuruista EcoRI-Xbal- fragmenttia, joka oli irrotettu esimerkissä 4 kuvatusta pGKPT4:sta, käytettiin koettimena Sali:n ja NotI:n seoksella pilkottua DNA:ta varten, havaittiin lähtökantana käytetyssä ATCC 9950 -kannassa 3,2 ke:n suuruinen endo-35 geenisestä PGK-geenistä peräisin oleva vyöhyke (kuvio 45-2, kanava 1). Toisaalta kannassa, johon PGK-promoottorissa olevan Sphl-kohdan kohdalta pilkottu pCLLACl oli liit- 110 tynyt, havaittiin tämän 3,2 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi 5,4 ke:n suuruinen vyöhyke, joka oli muodostunut sen perusteella, että NotI oli pilkkonut useita peräkkäin liittyneitä plasmideja, ja kaksi vyöhykettä, jotka olivat 5 6,4 ke:n ja 2,1 ke:n suuruiset ja jotka olivat muodos tuneet yhden kromosomaalisen PGK-geenin vaurioitumisesta plasmidien liittymisen vaikutuksesta (kanavat 2 ja 3). Koska nämä kaksi 6,4 ke:n ja 2,1 ke:n suuruista vyöhykettä olivat muodostuneet plasmidimolekyylissä olevasta 10 Notl-kohdasta ja PGK-geenin alueella olevasta Sali- kohdasta, jotka sijaitsivat liittyneen plasmidin kummallakin puolella, niin tästä kävi ilmi, että plasmidi-molekyyli oli liittynyt PGK-geenilokukseen homologisen rekombinaation avulla.
15
Kun näiden vyöhykkeiden voimakkuudet määritettiin Imaging Analyzer -laitteella (Fuji Film), niin endogeenisestä PGK-geenistä peräisin oleva 3,2 ke:n suuruinen vyöhyke ja plasmideista peräisin olevat 6,4 ke:n ja 2,1 ke:n 20 suuruiset vyöhykkeet, jotka ovat peräisin kromosomiin liittyneiden plasmidimolekyylien molemmista päistä, olivat transformantissa tiheydeltään lähes samansuuruiset. Tämä merkitsi siten sitä, että PGK-geeniä on solua kohti kaksi kappaletta ja plasmidi-DNA:n 25 liittyminen oli vaurioittanut toista transformanteissa olevista kahdesta kappaleesta. Lisäksi vertaamalla plasmidin peräkkäisestä liittymisestä johtuvan 5,4 ke:n suuruisen vyöhykkeen ja 6,4 ke:n ja 2,1 ke:n suuruisten vyöhykkeiden voimakkuuksia kävi ilmi, että liittyneen 30 plasmidin kappalelukumäärä oli noin 4.
pCARS6:11a ja pCARS7:lla transformoiduista ATCC 9950 -kannoista valmistettu DNA pilkottiin EcoRVhn ja NotI:n seoksella ja suoritettiin Southern-analyysi käyttäen 35 koettimena esimerkissä 4 kuvatusta pGKPT4:sta irrotettua PGK-terminaattorin sisältävää 0,9 ke:n suuruista Xbal-Notl-fragmenttia. Tulos on esitetty kuviossa 45-1. Lähtö-
Ill kannassa ATCC 9950 havaittiin noin 7 ke:n suuruinen endo-geenisestä PGK-geenistä peräisin oleva vyöhyke (kuvio 45-1, kanava 3). Transformantissa havaittiin noin 7 ke:n suuruisen vyöhykkeen lisäksi plasmidista peräisin oleva 5 3,3 ke:n suuruinen vyöhyke. Vertaamalla 7 ke:n ja 3,3 ke:n suuruisten vyöhykkeiden tiheyksiä laskettiin olettaen 7 ke:n suuruisen vyöhykkeen vastaavan kahta kappaletta PGK-geeniä, että pCARS6:n ja pCARS7:n kappale-lukumäärät olivat 1 (kanava 4) ja 0,4 (kanava 2), 10 mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. pCARS7:n kappalelukumäärä voi olla alle yhden siitä syystä, että plasmidimolekyylejä katoaa soluja viljeltäessä. Tämän tuloksen katsottiin merkitsevän sitä, että CUARS:ää sisältävää plasmidia on solua kohti noin 1 kappale.
15 (3) ARS:n esiintymismuoto kromosomissa
Suoritettiin Southern-analyysi useista erilaisista kromo-somaalisista DNA-molekyyleistä, jotka olivat peräisin Hindlll:11a pilkotuista ATCC 9950, -9226, -9256 ja KP
20 2059 -kannoista sekä Saccharomyces cerevisiae S288C:stä.
Suoritettiin hybridisaatio (kuvio 46), jossa koettimina CUARSl:n kyseessä ollessa käytettiin pCARS6-22:sta Xbal:lla ja Hindlll:lla pilkkomalla saatua 1,3 ke:n suuruista fragmenttia (kuvio 39); ja CUARS2:n kyseessä 25 ollessa 1,8 ke:n suuruista pCARS7-6:n EcoRV-Hindlll- fragmenttia (kuvio 40). CUARSl:n kyseessä ollessa havaittiin pCARS6:n restriktioentsyymikartan perusteella odotetun 2 ke:n suuruisen päävyöhykkeen lisäksi 1,6 ke:n suuruinen vyöhyke, joka oli samanmittainen kuin pCARS5:n 30 restriktioentsyymikartan perusteella odotettu Hindlll- fragmentti (kuvio 46-1). Lisäksi CUARS2:n kyseessä ollessa esiintyi pCARS7:n restriktioentsyymikartan perusteella odotetun 2,5 ke:n suuruisen päävyöhykkeen lisäksi erittäin homologisia DNA-sekvenssejä, joita 35 Candida utilis -hiivan kromosomissa oli noin 10 kappaletta ja Saccharomyces-hiivan kromosomissa myös useita kappaleita (kuvio 46-2). Tämä tulos viittaa siihen, että 112 CUARS2 voi olla laajalti säilynyt sekvenssi. Lisaksi tehokkaammissa pesuolosuhteissa (0,1 x SSC, 65 °C), havaittiin tuskin mitään muita signaaleja kuin pääsignaali (kuvio 46-2) .
5
Lisäksi sen tutkimiseksi, ovatko nämä ARS-sekvenssit peräisin kromosomaalisesta DNA:sta vai eivät, suoritettiin Southern-analyysi Candida utiliksen kromosomaalisesta DNA:sta, joka oli erotettu pulssikenttägeelielektro-10 foreesimenetelmällä. ATCC 9950 -kannan DNA erotettiin seitsemäksi vyöhykkeeksi, joissa CUARS1 sijaitsi kuudennessa kromosomissa ylhäältä laskien ja CUARS2 sijaitsi kolmannessa kromosomissa ylhäältä laskien. Kävi myös ilmi, että kloonatut ARS-sekvenssit olivat peräisin kromo-15 somista. pCARS5:n insertio-DNA-fragmentti sijaitsi CUARS1:n tavoin kuudennessa kromosomissa. Kuten esimerkissä 27 kuvatusta sekvenssianalyysistä kävi ilmi, nämä tulokset tukevat sitä mahdollisuutta, että pCARS5:een ja pCARS6:een kloonattu ARS voi olla peräisin 20 homologisista kromosomeista.
Esimerkki 30: Promoottoriaktiivisuutta sisältävien DNA-f racrmenttien kloonaus ARS : ää käyttäen 25 (1) Promoottorin kloonausvektorin konstruktio
Autonomisesti replikoituvan sekvenssin sisältävä DNA irrotettiin esimerkissä 28 konstruoidusta pCARS6-20-plasmi-dista 1,9 ke:n suuruisena Sacl-Smal-fragmenttina. Fragmentti ligatoitiin plasmidiin pAPHl (esimerkki 19), joka 30 oli pilkottu EcoRI:lla ja käsitelty Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi, ja se pilkottiin edelleen Sacl:11a plasmidin pPCVl konstruoimiseksi. pPCVl pilkottiin lisäksi BamHI:11a, käsiteltiin Klenow-entsyymillä tasaisten päiden muodostamiseksi ja siihen ligatoi-35 tiin Hpal-kytkijät (5'GTTAAC3') plasmidin pPCV2 (kuvio 47) konstruoimiseksi.
113 (2) Kirjaston konstruointi ia promoottoriaktiivisuutta sisältävien DNA-fragmenttien kloonaus
Candida utilis ATCC 9950 -kannan kromosomaalinen DNA pilkottiin osittaisesti yhtäaikaisesti restriktioentsyymeil-5 lä RsaI, Haelll ja AluI. DNA-fragmenteille suoritettiin sitten elektroforeesi l-%:isessa agaroosigeelissä ja 0,9 - 1,8 ke:n pituiset fragmentit koottiin talteen. Osittaisesti pilkotut DNA-fragmentit ja plasmidi pPCV2, joka oli pilkottu Hpal:lla ja defosforyloitu, ligatoitiin 10 T4-DNA-ligaasilla. E. coli DH5 transformoitiin tällä DNA- liuoksella ja plasmidi-DNA-seos eristettiin näin saaduista noin 100 000 transformantista genomisen DNA-kirjaston valmistamiseksi. ATCC 9950 -kanta transformoitiin tästä kirjastosta valmistetulla DNA:11a elektroporaatio-15 menetelmällä käyttämällä menetelmää olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 μΕ, resistanssi 1000 Ω ja jännite 5 kV/cm. Kuhunkin elektroporaatioon käytetty DNA-määrä oli 20 - 25 μg. Transformantit selektoitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 200 /xg/ml G418:aa. Toistetuista transformaa-20 tioista, joissa käytettiin yhteensä 280 μg DNA:ta, saa tiin 380 transformanttia. Näistä transformanteista kasvatettiin 84 kantaa, joissa muodostui suhteellisen suuria pesäkkeitä, YPD-maljalla, joka sisälsi 1 mg/ml G418.-aa. Kahtatoista kantaa, joilla saatiin hyvä kasvu, kasvatet-25 tiin YPD-mediumissa, joka sisälsi 1 mg/ml G418:aa, ja näistä soluista valmistettiin kokonais-DNA E. coli DH5:n transformoimiseksi.
Pilkkominen restriktioentsyymeillä osoitti, että kaikki 30 E. colista talteen saadut 12 plasmidi-DNA:ta, toisin sanoen pPCVl, -3, -9, -14, -19, -33, -51, -55, -57, -62, -64 ja -78, sisältävät 0,9 - 1,8 ke:n suuruiset insertio-DNA-fragmentit. Lisäksi promoottoriaktiivisuutta sisältävät DNA-fragmentit irrotettiin Xbal:lla ja ne ligatoitiin 35 pBluescript IISK-:een (Stratagene) plasmidien konstruoimiseksi. Plasmidien osittaiset DNA-sekvenssit määritettiin aloittaen insertio-DNA-fragmenttien molemmilta puo- 114 liitä. pPCV33 ja pPCV78 ja toisaalta pPCV14, pPCV51 ja pPCV55 osoittautuivat sisältävän saman DNA-fragmentin. Tästä syystä oli lopullisesti saatu kloonattua yhdeksän promoottoriaktiivisuutta sisältävää DNA-fragmenttia.
5
Kun ATCC 9950 -kanta transformoitiin elektroporaatio-menetelmällä yhdeksällä plasmidilla, jotka olivat pPCVl, -3, -9, -14, -19, -33, -57, -62 ja -64, saatiin kaikkien plasmidi-DNA-molekyylien kyseessä ollessa 1 μg:n suuruis-10 ta DNA-erää kohti 6000 - 10 000 G418:lle resistenttiä pesäkettä. Lisäksi kahtakymmentä kloonia, jotka sisälsivät kaksi kantaa kymmenestä näillä yhdeksällä plasmidilla saadusta G418:lle resistentistä kannasta ja kontrollina käytetystä pCARS6-2-kannasta, viljeltiin 5 ml:ssa YPD-15 mediumia yön yli ja viljelmät hajotettiin yksittäisiksi pesäkkeiksi YPD-maljalla. 10 pesäkettä kustakin kahdestakymmenestä kloonista viljeltiin G4l8:aa sisältävällä YPD-maljalla plasmidien pysyvyysasteen määrittämiseksi. Tulokseksi saatiin, että vaikkakin pCARS6-2:lla plasmidin 20 pysyvyysaste oli 5 %, niin kaikkien muiden plasmidien pysyvyysaste oli lisääntynyt. Näiden plasmidien joukossa oli erityisesti pPCVl:lla, pPCV19:lla ja pPCV64:lla korkea pysyvyysaste, joka oli alueella 80 - 85 %. Tämä merkitsi siis sitä, että näin saadulla DNA-fragmentilla, 25 joka sisälsi promoottoriaktiivisuutta sisältävän sekvens sin, oli plasmidin stabiilisuutta parantava vaikutus.
(3) Promoottoriaktiivisuutta sisältävän DNA-fragmentin DNA-sekvenssin määritys 30 pPCV19-plasmidin insertio-DNA-fragmentista, joka kuului niihin yhdeksään tällä tavoin aikaansaatuun promoottoriaktiivisuutta sisältävään DNA-fragmenttiin, valmistettiin DNA-sekvenssin määrittämiseksi useita erilaisia deleetio-mutaatioita sisältäviä plasmideja deletoimalla tätä in-35 sertio-DNA-fragmentin molemmilta puolilta ExoIII-nukleaa-sia ja mung-pavun nukleaasia käyttäen. pPCV19:n 1054 ep:n 115 suuruisen insertio-DNA-fragmentin määritetty DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 48.
Esimerkki 31: Hygromvsiini B -resistenssigeenin ilmentä-5 miseen tarkoitetun plasmidin konstruktio ia hiivan ko-transformanttien selektio sitä käyttäen (1) Hygromvsiini B -resistenssigeenin ilmentämiseen tarkoitetun plasmidin konstruktio ia sen toiminnan varmista-10 minen
Hygromysiini B - fosfotransferääsi (HPT) -geeni saatiin PCR:n avulla käyttäen kahta aluketta, jotka oli valmistettu HPT-geenin ja valmiiksi kuvatun DNA-sekvenssin mukaisesti [Gritz, L. ja Davis, J., Gene 25 (1983) 179 -15 188] käyttäen templaattina plasmidia pBIB-HYG [Becker, D., Nucl. Acids Res. 18 (1990) 203]. Alukkeina käytettiin DNA-sekvenssej ä: 5'-GGTCTAGATATGAAAAAGCCTGAAC-3' (SEKVENSSI ID NO:33) ja 5'-GGAGATCTATTCCTTTGCCCTCGGA-3' (SEKVENSSI ID NO:34).
20 Nämä syntetoitiin sellaisiksi, että niihin tuli 5'-puo lella välittömästi ennen aloituskodonia sijaitseva Xbal-kohta ja välittömästi 3'-päässä olevan lopetuskodonin jälkeen sijaitseva Bglll-kohta. Syntetoitu HPT-geeni-fragmentti pilkottiin Xbal:lla ja BglII:lla, liitettiin 25 esimerkissä 4 kuvatun ilmentämisvektorin pPGKPT4 (kuvio 4) Xbal- ja BamHI-kohtien väliin plasmidin pGKHPTl (kuvio 49) konstruoimiseksi. PGK-geenin promoottorin, HPT-geenin ja PGK-geenin terminaattorin sisältämä 3,3 ke:n suuruinen Notl-fragmentti irrotettiin pGKHPTl:sta. Plasmidi pAHGl 30 konstruoitiin liittämällä Notl-fragmentti esimerkissä 30 kuvatun pPCV14-plasmidin NotI-kohtaan. Sen varmistamiseksi, oliko konstruoitu HPT-geenin ilmentämiskasetti toiminnallinen vai ei, transformoitiin ATCC 9950 -kanta plasmidilla pAHGl esimerkissä 11 kuvatulla elektroporaa-35 tiolla. Transformantit, jotka oli valittu siten, että niillä oli resistenssiä G418:aa kohtaan, kasvoivat nestemäisessä YPD-mediumissa, joka sisälsi 200, 400 ja 116 800 μg/ml hygromysiini B:tä, kun taas kontrollina käytetty villikanta ei kasvanut missään näistä mediumeista eikä sillä esiintynyt resistenssiä hygromysiini B:tä vastaan.
5 Kun plasmidi pGKHPTl oli Notlrlla pilkkomalla katkaistu PGK-geenin promoottorin, HPT-geenin ja PGK-geenin termi-naattorin sisältävään fragmenttiin ja vektorifragmenttiin, niin näitä käytettiin ATCC 9950 -kannan transformaatioon. Transformaatio suoritettiin esimerkissä 11 10 kuvatulla elektroporaatiomenetelmällä ja transformantit selektoitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 800 /ig/ml hygromysiini B:tä. Tämän tuloksena saatiin 168 hygromysiini B -resistenssiä pesäkettä 1 μg:n suuruista DNA:n määrää kohti. Tämä on miltei samansuuruinen kuin transformaatio-15 frekvenssi kontrollina käytetyllä NotI:lla pilkotulla plasmidilla pGKAPHl, joka oli 156 pesäkettä 1 /ug:n suuruista DNA-määrää kohti. Siten tämä tulos merkitsee sitä, että hygromysiini B -resistenssigeeniä voidaan käyttää Candida utiliksen transformanttien suoraan selektioon 20 aivan samalla tavoin kuin G418-resistenssigeeniä.
(2) Hiivan kotransformaatio 0,1 μg pPCV64-plasmidia, joka sisältää ARS:n ja joka oli saatu aikaan esimerkissä 30, sekä 1 /xg tai 10 ^g 25 pPGKHPTl-plasmidia, joka NotI:lla pilkkomalla oli kat kaistu PGK-geenin promoottorin, HPT-geenin ja PGK-geenin terminaattorin sisältäväksi fragmentiksi ja vektori-fragmentiksi, yhdistettiin seokseksi ja niitä käytettiin ATCC 9950 -kannan transformaatioon esimerkissä 11 kuvat-30 tua elektroporaatiota käyttäen.
Menetelmää käytettiin olosuhteissa, joissa kapasitanssi oli 25 jUF, resistanssi 600, 800 tai 1000 Ω ja jännite 3,75 tai 5 kV/cm, ja elektroporaatio suoritettiin kahden 35 DNA:n seoksille kuudenlaisia olosuhteita käyttäen. Trans- formantit selektoitiin YPD-maljalla, joka sisälsi 200 /xg/ml G418:aa, ja käyttämällä 0,1 ,ug pPCV64:n DNA: ta 117 saatiin kussakin olosuhteessa 2000 - 7000 transformant -tia. Kussakin olosuhteessa saadut 500 - 2000 G418-resis-tenttiä pesäkettä viljeltiin jäljennös (replica) -viljelminä YPD-maljalla, joka sisälsi 800 μ5/πι1 hygromysiini 5 B:tä. Hygromysiini B -resistenttien pesäkkeiden ja G418- resistenttien pesäkkeiden välinen suhde ei vaihtele kovin paljon erilaisia elektroporaatio-olosuhteita käytettäessä ja se säilyy alueella noin 1 - 2 %. Lisäksi G4l8-resis-tenttejä ja hygromysiini B -resistenttejä kantoja viljel-10 tiin nestemäisessä YPD-mediumissa yön yli sellaisten kantojen aikaansaamiseksi, jotka olivat tulleet herkiksi G418:lie sen ansiosta, että ne olivat menettäneet plasmi-dina esiintyvän pPCV64:n. Kun tutkittiin 40 kantaa, niin saatiin 10 G418-herkkää ja hygromysiini B -resistenttiä 15 kantaa. Näissä kannoissa odotettiin PGK-geenin promoottorin, HPT-geenin ja PGK-geenin terminaattorin sisältävän fragmentin säilyneen kromosomissa. Näistä kymmenestä kannasta valmistettiin kromosomaalinen DNA ja se tutkittiin PCR:11a sen määrittämiseksi, oliko HPT-geenin ilmentämis-20 kasetti liittynyt kromosomiin vai ei.
Tähän tarkoitukseen tulevana alukkeena käytettiin aluketta 1; 5'CAAGTTGATCCTTCTCCGGA3' (SEKVENSSI ID
NO:35), 25 joka oli syntetoitu HPT-geenin ilmentämiseen käytetyn PGK-geenin promoottorifragmentin 5'-pään DNA-sekvenssin ulkopuolella olevan osan perusteella,
aluketta 2; 5'GAAACTTCTCGACAGACGTC3' (SEKVENSSI ID
NO:3 6) , 30 joka oli syntetoitu HPT-geenin sisällä olevan sekvenssin perusteella, ja aluketta 3; 5'CATCGGGTAAGGTCTACATG3' (SEKVENSSI ID NO:3 7) , joka oli syntetoitu HPT-geenin ilmentämiseen käytetyn 35 PGK-geenin terminaattorifragmentissa olevan sekvenssin perusteella.
118 PCR suoritettiin kolmenkymmenen syklin verran olosuhteissa, joissa lämpötila oli 1 minuutin ajan 95 °C, 1 minuutin ajan 55 °C ja 5 minuutin ajan 72 °C. Tulokset olivat kuviossa 50 esitettyjen tulosten mukaiset. Kuvio 50(1) 5 kuvaa alukkeella 1 ja alukkeella 3 saatujen PCR-reaktion tuotteiden elektroforeesia. Jokaisessa näytteessä havaittiin monistuvan 2,7 ke:n suuruisen fragmentin, joka johtui endogeenisestä PGK-geenistä, ja viidessä näytteessä, joiden numerot olivat 3, 5, 7, 9 ja 10, havaittiin 10 2,6 ke:n suuruinen fragmentti. 2,2 ke:n suuruisen frag mentin katsottiin johtuvan siitä, että transformaatioon käytetty fragmentti, joka sisälsi PGK-geenin promoottorin, HPT-geenin ja PGK-geenin terminaattorin, oli korvannut toisen kahdesta endogeenisestä PGK-geenistä. Lisäksi 15 samalle DNA-näytteelle aluketta 1 ja aluketta 2 käyttäen suoritetun PCR:n tulos on esitetty kuviossa 50(2) . Niissä viidessä näytteessä, joissa 2,6 ke:n suuruisen fragmentin havaittiin esiintyvän, havaittiin 1,4 ke:n suuruinen monistunut fragmentti, ja endogeeninen PGK-geeni oli näissä 20 viidessä kloonissa korvautunut HPT-geenillä homologisen rekombinaation avulla.
119 SEKVENSSILISTAUS SEKVENSSI ID N0:1 Pituus: 880
Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Topologia: Lineaarinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
CTGCAAGCTA CTTTGTÄATT AAACAAATAA CGGGATTATA TGTCAATATC ATTATGATTA 60 TTTAGGAAAA CATGTAGACC TTACCCGA.TG CACCTCCACC AACAAGCCAA TTCTGGGTGG 120 GATGGAAGTT ACACACTÖTT GGTACGTTGG TCACCAGTGG GTTTGACAAA TGTGCCAGCT 180 GATGACCATC TCGGTCGTAG ACGTCAAAGT ACTTGTTCAT ATTGGCAATG ACAAACTTTT 240 CTTTATCCGG GGTATATTGC TGCCACCTTG CCTTCAAAAT GGATACCCAT CTTCCCGTTT 300 GACAGTTGTG TTTGATACGA TGACTTGGGG TCAAATCACC TTCAATAGCG AAGTTCTTAG 360 GTTTAGTGCT GATGTCCTCA CCAAGATTGA AGATGTTAAC TGTGTCATCG TAACCGTTAC 420 AAACAAGGTC ACCAGATCTA TTCCAATCCA CGATGGAAAC TGACAATCTT GAATCATAGA 480 OGCCAACAGT GTGAAGAGTC TCCAGGTTAT CA1OXATTC ATCCCAATCA CACGTAGTTA 540 CTGTTCITAG ATCCCAAACC TTCAAAGTTC GATCCAATGA GGCAGTAGCA ATCTGGTTCT 600 TATTCATCGG ATTGGTÄGTG AATCCACCAA TCTTTTTATT CGACAATCTC AAAACTTGTC 660 TTCTTGAGTG ATCGCCTGCT CITAGGTCAA TTCTGCTGAA TTGTCCTTGC ATTGTTGTGT 720 AGTACATTTC ATTGTCGTTG TTGTAATTTA TGTCAGTGAT ACCGACGTCA AAGTCGTTGA 780 TGAATÄACTG TGAGGACTTC ATGGAGCGTA GATCAATTGA GCGAATGGAC CCATCATACG 840 ATGCACTGTA GACCTTCGTC GTGTCATTCA TGTTGAATTC
SEKVENSSI ID NO:2 Pituus: 1346 Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Topologia: Lineaarinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: TATA signaali Asema: 1184..1190 Identifioimismenetelmä: S
120
Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
AAGCTTTTGT CTTTTAGGAG CCTTCTTTTC ACCCTGGCTT TCTTCAGACT CCACGCCTCT 60 CGCCCGTTTG TTGTTGATCT TCTTCTGTTG CTTCTTCGTG AGCTTACCAG TATCCAGATG 120 CGTTGTCAGG GCAAGAGGGT CATGTTCAAG CTCCTCTTTC ACTTTCAGTC CAATACGTTT 180 CCAGGCAGGG ATGTGTTCGC TCATCGTTCC AGACTCGAGT GGTGAAAACT ATGGCAACCT 240 CTACTTCCTT TCCAAACACÄ CAGCGTGCTT TGTAGTGTGT GCCTAAGAGC TGAATTTTTT 300 TTCCTTCCAT GCTGCGCTGC GATGAGCTCT GCCCGCCCGC AGCCTCGGAG GCTAGCGACG 360 TÄTAAAAAAG GCCTGTGAAA ATTTTATCCT CCTCCTTAAC GACCCTTCTT TCTCTTCTTC 420 ACATTCAAAA ACTTCAAGCA GCTGTCTCTG TTCCTTTGCT GTGTTCTACC ATTGGATATT 480 CCCATTCCCC GTGGAGAACC GAACTGGAGT CTAGCAGCAT GCGAGATCAA TATTACACGG 540 TTTGAGTCTG ATACGCTTGA GCAGCCATTT TTTGGCTTCT CCTGGTG1GT ATCCAGATAT 600 AGAAGTTCGT ATACATTTCC CATAGCGATT GTAAAATGAT TCTGCAATGG AACCATCCGT 660 AATTGTAGGC CTGCTGAGAT GGCACTCGCA ATGCCTCTGT GTCTGGTTTT TTGCCTTCTC 720 CGTCCATCAG CACCAGTGGC TTCTTAGGGC ATAACGAGAC GGCTCCTTGG TGAAAGATGC 780 CCTGCTCCGT CTGTCTGCCT GTTGCTACAA CCACTGCGTA GTCAGATGAC CCGGTCTGTG 840 TGCTGTGGAA TCACCGGGAG CGAAATTCCG GTTTCGCTGG CAGATGAGCT CATCAACCAC 900 ATCAACTGGA GCAACCTCAC CAGAGGACAC GTAACCTGCC CGGTTGAATT CTGTCAAACC 960 GTACATCACA CAACAACAGC AGCAGCAACA ACAACAACGT CAGTTGTCGT TCGCATGGCG 1020 ACGTTACCTA ACGGCACCAA CATCGTCTCG TCCTCGCCAA TGCCTGTTTC CCCTACCCGG 1080 AGTGGCCCGG CCCACCTGTC GTTCTTTTTT CGTCAATTGT GTCCAGCTGG TGCCATCACC 1140 ATATGTTCAA GTGCGTGGCC TGTACTAGCG CAGTCTGCTG CAGTATAAAA GGGATTGCTG 1200 AGGCCCCCIT TAGCGTTTCC AATTAACAAT TGATTCCCTT TTCCCCATAG TCCGTTTGTA 1260 CTACATCCTA CATAACAAAA GTGAGTGTTA CAAGACAAGT GTGGCGGTCA ATTGGATCAT 1320 TTGGACTAAC ATACTGGCGG ATAAAG
SEKVENSSI ID NO:3 Pituus : 2330 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo
Juosteisuus: Kaksisäikeinen nukleiinihappo
Molekyylityyppi: Perimän DNA
Sekvenssin ominaispiirteet
Nimi/selitys: CDS
Asema: 1259..2059 121
Alkuperä
Mikro-organismi; Candida utilis
Kanta; ATCC9950
Sekvenssi ÄÄGCTTATGG AGGAGATTGG GAAGATTGAÄ CGAGGTGAGA TGGACACGTT GCTGATTGAC 60 GAGATCGGCA AGAAGGAGGC ACCTGTGGTG AAACCACTTA CACCCGACGT GGATAGTAAT 120 GTAACAGGGG AACCGACTGG ACATAGTTCT ACGACACCAC CACCGGTGGA ACAGGACTCG 180 AGCACAACCA CGAGGAAGAG AGCACAAGAC GATGGTGAGG AAAACACAAG GAAGAAGCCC 240 AAGGTTGAGG CAGAGAAAAA GGCAGAGCAA GAGGCAGAGA AAGAGGCAGA GAAAGAGGCA 300 GAGAAAGAGG CAGAGCAAGA GGCAGAGAAA GAGGCTCCGC GTGCAGTGCC GAACAAGAGA 360 CTACAACACA TTGCTACTCC TCTCATCGAG AGCATCTCGT CATACAAGTA CGCCTCAGCG 420 TTTCTACACC CTGTTAACGA GTCCAGTGCA CCCAACTATT ACTCTCTGAT CAAGAAACCA 480 AGGGATCTGA AGACCATCAA ACAGATGGTC AAGGACGGAC GTATACAGAC CAATCTTGAG 540 CTGGAGAGGG AGATCTTGCT GATGTTTGCC AATGCCATCA TGTACAACAA 3ACCGGGACG 600 GATATCTACG AGTGGACCAA GGAGATGCAG CCGGAAGTTG ACAAGCTCAT CGAGCTGTTT 660 AACGAGAGTA AATAGGATÄC AGGCTAGAGA TCAAAAGAAG AATAGAAACA GCTCGATAAA 720 ACGGTATTGT AAGTGGTATG TACAAAGGGG TGTGTCTTGC TCAACGTCTT TGCATCTGCT 780 GAGTCAAAGC AGCGTTCTGC TCTTGGAATC TAAGACCGAC TCTTTCCGAA TGCTTGAGGA 840 ACTTTTCAGA GCACTTCAAC ACACAGGATT CCTCCTTTGA TGATAGCTTT TCAGAGGTGA 9(X) AGTCGITGAC ACAGTCGCTG AAACAACGCT CAACGAGGTT GGAATAAAGA CGCATAAAGT 960 CCTTCATCTG CTTCTGCTCA ACAAGCTGCT GGAACTGCTG CTGCTCTTTT GGGTTCAATT 1020 GGTCCATCCT TGCTACTTTT CCGCCTAGTT TCGATTCCGA TTCTGATAGA GAAGCCCAGC 1080 TATGAATGGA AGAAATTTTT CACTTTTGTA TGTCCTTTTT TTCACGCTTC GTTGCTTCGG 1140 ACAAAAAAAT AGTGGAGGCA CTCGGTGGAG GGAAGCTATC CTCGAGATGA AAAATTTCAA 1200 GCTCATCTCA TCGTCCAAGT GGGACAGCAA GCTGAGGCTT CTGAAGAGGT TGAGGAAA 1258 ATG GTC ACC ACG TTA TCG TAC ACA GAG AGG GCA TCG CAG CAC CCT TCG 1306
Met Vai Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser Gin His Pro Ser 15 10 15 CCA CTT GCT AAG CGT CTG TTT TCG CTT ATG GAG TCC AAG AAG ACG AAC 1354
Pro Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn 20 25 30 CTG TGT GCC AGT GTC GAT GTT CGT ACC ACA GAG GAG TTG CTC AAG CTC 1402
Leu Cys Ala Ser Vai Asp Vai Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu 35 40 45 GTT GAT ACG CTT GGT CCT TAT ATC TGT CTG TTG AAG ACG CAT ATT GAT 1450
Vai Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60 122 ATC ATT GAT GAC TTC TCT ATG GAG TCT ACT GTG OCT CCA CTG TTG GAG 1498 lie lie Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu 65 70 75 80 CTT TCA AAG AAG CAC AAT TTC CTC ATC TTT GAG GAC CGT AAG TTT GCT 1548 leu Ser Lys Lys His Asn Phe Leu lie Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala 85 90 95 GAT ATC GGC AAC A(X GTC AAG GCA CAG TAC GCC GGT GGT GCG TTC AAG 1594
Asp lie Gly Asn Thr Val Lys Ala Gin Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys 100 105 110 ATT GCG CAA TGG GCA GAT ATC ACC AAG GCC CAC GGT GTC ACC GGT GCA 1642 lie Ala Gin Trp Ala Asp lie Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala 115 120 125 GGT ATC GTC AAG GGG TTG AAG GAG GCT GCA CAG GAA ACC ACG GAT CAG 1690
Gly lie Val Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gin Glu Thr Thr Asp Glu 130 135 140 145 CCA AGA GGG CTG TTG ATG CTT GCG GAG CTG AGC TCC AAG GGC TCC TTG 1738
Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu 150 155 .160 GCC CAC GGG ACA TAT ACC GAG GAG ACC GTG GAG ATT GCC AAA ACT GAT 1786
Ala His Gly Thr Tyr Thr Glii Glu Thr Val Glu lie Ala Lys Thr Asp 165 170 175 AAG GAC TTT TGT ATT GGA TTC ATC GCA CAG AGA GAC ATG GGT GGC AGA 1834
Lys Asp Phe Cys lie Gly Phe lie Ala Gin Arg Asp Met Gly Gly Arg 180 185 190 GAA GAT GGG TTC GAC TGG ATC ATC ATG ACA CCA GGC GTG GGA CTC GAC 1882
Glu Asp Gly Phe Asp Trp lie lie Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp 195 200 205 GAT AAG GGC GAC TCC CTG GGC CAA CAG TAC AGA ACT GTC GAT GAG GTT 1930
Asp Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gin Gin Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val 210 215 220 225 GTC AGT GGT GGC TCT GAC ATC ATC ATC GTT GGT AGA GGC TTG TTT GGA 1978
Val Ser Gly Gly Ser Asp lie lie lie Val Gly Arg Gly leu Phe Gly 230 235 240 AAG GGA AGA GAT CCA ACA GTG GAA GGT GAG CGT TAT AGA AAA GCA GGC 2026
Lys Gly Arg Asp Pro Thr Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly 245 250 255 123 TGG GAT GCT TAT CTC AAG AGA TGC TCA GCT CAA 2059
Trp Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Cys Ser Ala Gin 260 265 T AAGCGTTGAG CTCTGGCTTG TATAGGTTCA CTTGTATAAA 2100
ATGTTCATTA CTGTTTTCGG AAGTTGTAGA TTGCCATTTT TGCGCAAATT GACGCCAGTC 2160 TTTTTTTGCG CCAÄATGTCA GTTTTTTTGC GCCAAAATTT ACTTCATCTT ATACAACTGC 2220 AAAAACCATC CAATCCAATC CAGAAAGGAC TGATCAATGG TGGTGATTGA CTCAAGTTCT 2280 GATGCTACAC AACAGACAGA GCTCTCTAAA AAGAATTCGA TATCAAGCTT
SEKVENSSI ID NO:4 Pituus: 258 aminohappoa Tyyppi: aminohappo Molekyylityyppi: peptidi Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
Met Vai Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser Gin His Pro Ser 1 5 10 15
Pro leu Ala Lys Arg Leu Phe.Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn 20 25 30 leu Cys Ala Ser Vai Asp Vai Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu 35 40 45
Vai Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Ile Asp 50 55 60
Ile Ile Asp Asp Phe Ser Met Glu Ser Thr Vai Ala Pro Leu Leu Glu 65 70 75 ' 80
Leu Ser Lys Lys His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala 85 90 95
Asp Ile Gly Asn Thr Vai Lys Ala Gin Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys 100 105 110
Ile Ala Gin Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Vai Thr Gly Ala 115 120 125
Gly Ile Vai Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gin Glu Thr Thr Asp Glu 130 135 140 145
Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu 150 155 160 124
Ala His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Vai Glu Ile Ala Lys Thr Asp 165 170 175
Lys Asp Phe Cys Ile Gly Phe Ile Ala Gin Arg Asp Met Gly Gly Arg 180 185 190
Glu Asp Gly Phe Asp Trp Ile Ile Met Thr Pro Gly Vai Gly Leu Asp 195 200 205
Asp Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gin Gin Tyr Arg Thr Vai Asp Glu Vai 210 215 220 225
Vai Ser Gly Gly Ser Asp Ile Ile Ile Vai Gly Arg Gly Leu Phe Gly 230 235 240
Lys Gly Arg Asp Pro Thr Vai Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly 245 250 255
Trp Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Cys Ser Ala Gin 260 265 SEKVENSSI ID NO:5 Pituus: 2086 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: introni Asema: 1115..1481 Identifioimismenetelmä: S Nimi/selitys: CDS Asema: 1111..1114 1482..1795 Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi GGATCCAATC GTTGAAAGTG ATCAAGCTGA TTÄCAAAAGT AAGTATGAAA AGAGCCAATG 60 TTGAGAGTCT CAGGAACCAC ATCGACTTCT TCGTGCCATC CTCCCACATT CTGAAGCCCA 120 AGAACCCACA AATCATCAAA CACCAACACG ATGCGGACGC CAACCCGAGT TGTAACGCCA 180 CAAAGTACGG GTACGACCCT GTTCCAGGAG GGCTCACGCC GCAATCAACA ACCAAAGTCG 240 CCACGATCAA CGCCAGTATC AAGTAAAAGA AGAATAGCAT CTCCAGTCTT CCGATAGCTG 300 125 TGTACTTCGÄ TCTGÄCGTTG TAGATGATGA TGATCATGAT CACGäGGGCA CCAATGTTGA 360 CAAAGGCGTT ACCAATCTGG AATATCACGG TATTGGCAAC GTCTATCGGA CGGGCGTAGC 420 ACTCAGGGAT GATCCCTTCG TTCAGGTGCG TGAACTGCTC GTTCGTCGTT GCCTTCACAA 480 CCTGGCACAA CGGGAGCGGC GTGTTGTGGC ATAGCGAGTT GAAATCACCG AATGCCATTG 54Q TGTTTTATCG TTAGGGAGAC CK3TTTGAAG CTGACAGCGG GATGAAGATG AGGAAGGAGA 600 GCACAACAGC TGAGCGGAAG TCTCTGTGAT GCTTGGTGGA CCGGGTGTAG GTGGAATCTC 660 CCTGGTGAGC GTACTTGCAA CGGTGCTCAG (3GACTTCTTC TCGAGAGGAA ACGTAAACAA 720 AGAGGTTTCA ATGTTGATGT TGATGTGTAT TTTTGTTACA AAAGCAGAAA TTGTAAACAA 780 AAAGGTATAA TTAGGGCTCT GGTGTAATGÄ TGGGCACGTG ACGTTACCGT GCTGGTCGAT 840 TTTAGGGCTA TTGGTTCGCG TCCCGCTGGT GTCCGGGTTA GCGTGTCAAT GTGGCGCCTC 900 CCGAITATTA CATAAGAAAA CACCCACCCA CGCAACACCT GGTGTCTGGA TGTTGACGCT 960 TTGTATGCGT GTGTGTGTTT TTCCTTCCGT CTTGTTGGGC CACTCTGCGC GAGCGTTGGC 1020 GACTCACCGG TGAAATTTAT CGAAAACTTT CAGGCTCAGG CCCTTTTCAA CACTACCCTT 1080 TGAGATCACA TCAAGCAGTA ATCAAACACA 1110 ATG G GTATGT GGGAAACGAC 1130
Met Val GACGTGTGCG GTGTGTGAAT GCCATTAGTG GGATATGTGG TAGTCTCGAG CGTGGATATT 1190 ÄTCGATAGGG ATGGTGCTTG TTCTATACGT CTTGCTGGGA AGGAAGAAAG CGATGAAGTA 1250 TGTGGGAAGA AGGGGTGGTT TAAGAGAGGA AGTAGACATG TÄACAAGTGT GTTCAGAGAA 1310 GAAGGACGGA AATATCACCT ATATGACGTA CACATCACGA ACTGCTCCTG GAGGAAGCGA 1370 CAAGATGAAT ATCAACAGGC ATCATCATAT CTCTACAATG GCTCGTTCCC AAAGCACACG 1430 CACAAACAAA TGCGAGACTT TTGTACTAAC AGCTGTATCT CTGACAAATA GTT AAC 1486
Asn GTT CCA AAG ACC AGA AGA ACC TAC TGT AAG GGT AAG GAG TGC AGA AAG 1534
Val Pro Lys Tbr Arg Arg Thr Tyr Cys Lys Gly Lys Glu Cys Arg Lys 5 10 15 CAC ACT CAA CAC AAG GTT ACC CAG TAC AAG GCT GGT AAG GCT TCC CTC 1582
His Thr Gin His Lys Val Thr Gin Tyr Lys Ala Gly Lys Ala Ser Leu 20 25 30 35 TTT GCC CAG GGT AAG CGT CGT TAT GAC CGT AAG CAA TCC GGT TAC GGT 1630
Phe Ala Gin Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gin Ser Gly Tyr Gly 40 45 50 GGT CAA ACC AAG CCA GTT TTC CAC AAA AAG GCT AAA ACC ACC AAG AAG 1678
Gly Gin Thr Lys Pro Val Phe His Lys Lys Ala Lys Thr Thr Lys Lys 55 60 65 126 GTT GTT TTG CGT TTG GAG TGT GTT GTC TGC AAG ACC AAG GCC CAA TTG 1726
Vai Val Leu Arg Leu Glu Cys Vai Val Cys Lys Thr Lys Ala Gin Leu 70 75 80 GCT TTG AAG CGT TGT AAG CAC TTC GAG TTG GGT GGT GAC AAG AAG CAA 1774
Ala Leu Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp Lys Lys Gin 85 90 95 AAG GGT CAA GCT TTG CAA TTC TAAGCTTAAGACAAT TGTTGAAAGT TTTATTATTA 1830 Lys Gly Gin Ala Leu Gin Phe 100 105
TCACTACACT GTGTTTTTGA TGTCATCTAA TGTAAAAGCG TTTATATTAC CACTTGGTTC 1890 GGTATCCTGT AGAAGAATAC GGCCTGTAGC GTAGCATTCC CACAGGAGGA TCACAGCAAC 1950 ATAGACCAAA CAATGTCACG CACGGGGATC GAACGCGGAA CCAAACCTCT CCCTCCTCCC 2010 CCTTTCACCG CGGTTATTTT GTTATGGGCA CACACAGGGG AAGGAAAAAA ATGCACACAC 2070 GCACAAAAGC GAGCTC
SEKVENSSI ID NO:6 Pituus: 106 aminohappoa Tyyppi: aminohappo Molekyylityyppi: peptidi Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
Met Vai Asn Vai Pro Lys Thr Arg Arg Thr Tyr Cys Lys Gly Lys Glu 5 10 15
Cys Arg Lys His Thr Gin His Lys Vai Thr Gin Tyr Lys Ala Gly Lys 20 25 30
Ala Ser Leu Phe Ala Gin Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gin Ser 35 40 45
Gly Tyr Gly Gly Gin Thr Lys Pro Vai Phe His Lys Lys Ala Lys Thr 50 55 60
Thr Lys Lys Vai Vai Leu Arg Leu Glu Cys Vai Vai Cys Lys Thr Lys 65 70 75 80
Ala Gin Leu Ala Leu Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp 85 90 95 127
Lys Lys Gin Lys Gly Gin Ala Leu Gin Phe 100 105 SEKVENSSI ID NO:7
Pituus: 975 emästä
Tyyppi: Nukleiinihappo
Juosteisuus: Kaksisäikeinen
Molekyylityyppi: Perimän DNA
Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
AAGCTTACAG CGAGCACTCA AATCTGCCCT CCGAGCCCTC CGGCCCTCTC TTCAACAÄAC 60 TCGCGCTGCA CTTCGTCGTC AGTGGTGCCA ATCACCCAAC GTGGAGGTAT CAAGAGGTGC 120 TCCAGCCCAC AAAGCGACAT CAAAGACAAC AACCCTGCCG GCCTACGTCC TACACACCCT 180 GGTGATCGCA GACATTGTAC AAGGTGCCAC GCAATAACCT ACAGGCACCG CACATGACGA 240 TGGCCTTGGT TGTGCAACCA GTGACTTCCA CGGTCCACGC AGCAACATGA ACCACACCAC 300 CCAGAATCGA TGCGCGCAAC AACAGTTGTT CCGGTTCACT CAGCCCCACA GCGAGTCGCT 360 GGCAGAACAC GAGCCTGAGG GCGGAAAGAG GGTAGAGGAA AGCGCAAGGA CAGGGGACAA 420 CCTGGCCCAA TTGATGTCAT ATAAACCCTC TCGATCAATT GAGCACACTC ATCCGCCAAT 480 TGACCCCTGT TCGCAGCTCC ACGCCCCATG TTCCTCGTCC CTGGTGTAGC TTCTCCCCTA 540 AATTCCAGCG CITCGTTCCG CCCTCCCTGT CTCCCGGGTT TAACGAACGT GTGTACCATC 600 TGATGGTAAT CCGCTCCCGT CCGCGCAACA CAACTCACAA GCAGATCACA CCTGTACACG 660 CCGCTGCTGA TGCGCCCAAT TTAATTTTTT TTCTCTCAAT GTAGGGGAGA AGCCTTGGGA 720 GCTCCCGACT CCCAGTTGGG CACAGCTGCC ACCTCATGAC TTTTCCTGTG TGTGCCTGTC 780 TGACGTTACG TGTGATGTAG TGGCCCCCGT TCGGTGTGTT TTCGCCTGTT GCGCTGTGCC 840 CCCCTTAAAA GTATAAAAGG AAGTGCAATT GCTGTTTGTG TTGATTGTTG ATCCTTGTTT 900 CCTCTGTTTC CTCCTCATCA CACAAGAAAG GTTTCTTCTT TCCAACAGAT ACAAAACACA 960 CTTACÄAACA ACATA
SEKVENSSI ID NO:8 Pituus: 802 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis 128
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi ATTGTATGAC TTTTATTTAT GGGATTACGT ΤΆΤΑΑΑΤΤΑΤ GATCCTCATG GATTATCTTA 60 TTAAGTCTCC ATCTTGTAGC TTGTAATATG ATGAACACTC GTGAGTTTTC CAGGTAATTC 120 ACCGTGCCTC GTCCATGCAC TTTTATCAGC CTCGACGTCA TACATTGCAT GGTGAGTAAC 180 TGGAAAACGG CTTTTTACGT TCTGTTGTAT ATGGCTAAAC GCTTCTATGG CACGGCGCTA 240 TTAACCTGTC TG&CATTTCA ACCTGGTGTT GATGGCTTAA ACGATAATAC GGTGAGATAT 300 ATAGCTAACÄ GAATGGGGGT GACGCACTGA TTCCACTGTA TATATAGGCG ATATGTGTTG 360 TTGGATGGAC GirTCTTTGT CTCCTGATCC ACAATAGTAG CTCAGCTCCG TGCCAACTGG 420 TTCGCTGGTA CGATAGTGAG GGATGAÄTGA AACCTTTTCG TTTTCTTCTG CGCTTCCACG 480 GAACTGTGTA GAITTCTCTC GTGAATAGCG AGTTAAGCCA CGAGTGGGGT CTGCAATTGA 540 AGGTGTGATA CCAGAGTCAA AAGTTTGGAT GTGATGGAAA CTTCAAAGGC TTCTCGGTGG 600 TATATCAAAC GATTCACAGA GGTAGAAGCG GATCTTGAAG GCCAGAATAT GCATTAAAAC 660 CAGCGTATAT CAGTTTTGCT TTCCCAGAGA GGACTTTTGC ATTATTCTTC AGCTTTATCC 720 CTGGATTTTG GGAGATGAAA CATTGACAAA GCTGGTTCGT GATCCTAAAT ACTTGCCTAC 780
TGACTCCTGA GGTATTACAC GT
SEKVENSSI ID NO:9 Pituus: 599 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGÄ ATTCGGATCG 60 GTGTTTTGGG CAGTGGGACC AAATCGATGC CCATGTTGTT TTTTTGTATT TTCGCAACTT 120 TTTCCCCATT CGGTCATACC GAAGGCGGTT CAAGCCTGCA AGAGACAACA ACTATGGCTG 180 CTGTTCTTGG AATGAAAATA AACGCATTTG GAAGTTTTGC AGCCAAAACA GGATGCGTTT 240 TCGCCATTTC GGTGCGGCAT TTCCGGTTTC AGATTTTCGC GAAATTTGTT TTTCCCATCA 300 AATCIGCAAA TTTCGGAAAC GGGCCGCGCT GATTGGCTGC GTCCTGAAGC GGCAATTTTT 360 CTCCCTCTCG TTTGTTGATA CAACCAAGAA TITCTTTTCG TGCTCTGCGC CAGCGCTATC 420 CAAATGTTTA TAAATCTTGA TGTGATTTCC CGTTTTCTGT CCTTGCTCAT TCTGTCTCTC 480 TGTTGAACCA TTGTTGTTTT ACGAACTCAA GGTCCAATTG GAACAGTATG TGCACTGCCA 540 ATGGAGCATT GAAAGGGTTA TTCGATGTCG TCACCACGTG ATACTAACCA TTGATATAG
129 SEKVENSSI ID NO;10 Pituus: 1188 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyy1ityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
GCCGCTÄÄTÄ CCCCTTÄGGT TTTCGTTTCA TACATAGAGT GGTIGTTGTT TAÄCATTTTA 60 TCGTGATTAA TTTTTAATCG AGTAATATAT TATTGGAAAA GTTTTTAGAC TTTGAAGCGT 120 AGTATCGGTG GCTTTGCGGA GCTTAGCGCT GTGTCCTTTC TCCGTTGTTT ATGGAGTGTT 180 GATGTTTTGT GATTTACAGC GATGTCCGGG TTTTTGTGTA CACGCTGCCC TTGAACCAAA 240 AAAAAAGCTG CTGGGAATCG ATCGAGGGAA AAAACATCAC CAAAAAAAAA ACAAACAGCA 300 GAAAGTAAAC AAACAACATT ACAAACAACA ACATCACACA GCGGCACGCT TTAAACCAGG 360 GCGGTAGTGA CGTGACTTGC TTGTTTTCGA TCAGCGAGTG CGGTGTTATC GATATCITCG 420 AATCTGCTTA TAGTTCAAGA ACGCCTGGAT CCCAAGCGTA GTGAAGTGTT CTCTTTTGTT 480 TACTTTCTGT TTTGTATATT AGTTCGGAAC CCATTAGAAA AGGTTCATCT CTGAGATAAA 540 GAGCAAAGAC GCACGAGACA ATCAATCATT TGAGATGGGA TCAGTATCAG CGGAGAGTGC 600 TGATAAGATT GAGGAGAACA GAGCAACTGG GGCTTGTTTG GACATTCTCT CACCACCAAA 660 GCCTTCGTCA ACGTCCACAC CACCTACAGC GACTGCTGGT GCCATTGGCG GGTCTGGTAA 720 TGAAACCAGT GACAGCTTCA ATCCTTTTGA GAAGGACTCA CTGGATGAAT CTGCTTCGGT 780 GTTATCCACA AAGCAACTGC TTGCTGAGGG ACAGGGATCA AATGCCCTGC CATCTGAACT 840 CGTTGATATC AACTTGGCGA TTAGCGCTCT TAACTTGGAC TTTGACGGTC AAAAACGTGG 900 ACAAACTACA GCCACTACAG AGCCAGTAGG TGTTTTGAAA GATGGTGCCG AACCTAGTGC 960 TACAGGATCA GACGACCACC CGCCACCAGC TCTGTATCCA CCAGGTATGA TCCCACAGCA 1020 CATGCCATTT TTCCCGCTAA ACGAATTTGG ACAGCCAATG CATGCACCAT TCCCTGGAGA 1080 CTATCCACAT AGTCCAATCC CGTGGGATTC CAAACCTGGA CAGACTCCTT TTGGTTTAAT 1140 GGGATCTCAT GGCCCAAÄTA TGGATGGGTT ACGCTCACAA ÄTGGTACC
SEKVENSSI ID NO:11 Pituus: 1921 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis 130
Kanta ATCC9950 Sekvenssi GATCATGTTT CGTACAAAAC ACCGCCACTC CGTTATGAGA AAGTCATAGT TATATTTCGG 60 GGAAACTTAT GTTGCTTGCA AGGAATAATA GACAGACAAA TGTTTTACGA AACTGAAGGA 120 TTAATACAAT TGATGCAAAA AAACAAAAAA AAAAAAAAAA AAAÄAAAAAA AAAAAAAACA 180 AAAÄCACAAA AACACAAAGA AAAAAAACAC AAÄGAAAAAA AACACAGAAC ATCCAAAACA 240 AAACAACAAT ATATATATAT TTGCTAATAC CATCACCCTC CCTCATACAA AAAAAAAAAG 300 AAAATGGAAG GAGCACGTAT ATCTTTTCTA TGATCTTTGG ATATGGAATA GATAAGCAAC 360 CCCTCTAGTG AAGTACACAT CAAGATACTT GGGGAGCAAA CTGAGAGCAC ATGATATACA 420 CGAAAGCCAC CATATATCAT ATATAAAAAT ATGAAACATG AAAAGTTATT CATCTGTTGG 480 ATTCACTTTT ATATGTTTTC ATGCATTGTC TACTCTATGC CTCTCTCTTT TCTCTGTTCC 540 TTTACACTCC TCTATTATCA AATTGAGTGT TTCATTTATC AAAGAAGTTT GAGCTGGATC 600 AGAACTTTAG ATATTCATTC CTGTTTTCGA TATATCTATA CGATGTTCTA ATATCCACTC 660 - TCACTACCAT TGTTAAAAAA AGTTAAAATT ATAGCTGTGT GCCTTAAGGG AATAAAGGAA 720 ATGGATCTTT TGAATGTTAA AAAACGAGAT ACTCTTTTGT AAACCAGAAA ACGATTTTCA 780 AAACACAAAT TGGTGAATGT CACCAAGCAA AAATTGTATC CTAAAAAAAA TAAATTTATG 840 AACTAAATTA TCTCTGAACA GACATTTAGT CAACCTTTTC TCCTTGCTCC TCGGTCAAAG 900 GTTTTTCGTA TAGATATATA TACGGGTTGC TTTTTTGTTT CCACTCGTCT AATCGAGTTT 960 CGATATCAAT GGAGATTTAT TCTTTGGCTT TGATTCCATA ATAATCCATA TCCTAATAAA 1020 ACACTTTGAA GCGAATTGAA ACCCCAATAT CTITCTGGCC ATTAAAACAT TTATAAAGTA 1080 CTGGATGTTT AAAGAGCTTT GAGAATTGCC TAGCTTCAAA ATATATTTGT CTCCAATTAT 1140 GATTTTGTAT TTTCCTTTCT TTGTITTCTG TAGTTATTTA AAATAAGTTC ACTACGTTGT 1200 TTTTTGAGGA ACCGTTACTC TATTTACTCA AATTTATTAT CAAAATGTTT TTTTTTCGTT 1260 TGATTTATTC AAATGCTGTC GATATGTCCC AGAAATATCA TACAATTCAA ATTTCTAAAG 1320 CCAGCGTTTA TTATAAAGCT TTGAGTTCTT TCGACTTAAT TACATGTATG TAGCTCAAAC 1380 CAAAGTTACT CTATAATTAT AAAAAGACTA TGAACCAATT CAAGAATTCC CCATTTCCAG 1440 CAAATTTAGT ATAGCTCAAA TTCACACTGT CATATGCAAA AACCTAAATA AGCAGATCAT 1500 TGTAAAGAGC CGGCAGTTGT ATATTCCAGT GGGGCTGAAC TTGTGGTTAG GATTCACAGA 1560 CATCTTGTTG TCGGATTTCT ATTGATAGAA GCTGIGCCAT TGAAAATGGA AATATAAAAT 1620 GGTATTGGGT TGATCATATA TGAATTTCTT ATTACTCATA ATAATAGGAG AAATCATCGA 1680 ACATGGAACA TAGATGCTAA TTAAGGTACG TACAGCATCC TGTTCAATAT TTCAACTTTT 1740 TAAGTATTAA ATTAGTGAAG AAATGTATTA TGAACCATTG TTCAATAATT CTAATGTGTT 1800 TTTTGTGGTT TTTTTTTTGG CTTTTGGGAC ATTGTAATTT TTACTCATTT ATTCGATGTC 1860 TCTTCAGGTT TTTGTGTTTT TTTTTTTTGT GTTTAAATCT TCGCGGAATT GAGATAAGAT 1920 C 1921 131 SEKVENSSI ID NO:12 Pituus: 1798 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis Kanta: ATCC9950
Sekvenssi' AAGCTTATAG AATTTGAAGA TATAAAAACA CAACAAAGCT ATGAAAGCAA TGAGGGGACG 60 ATTTGATGAA CAGAAGGAGC TATTCCCATT AATTTAATAT CTACCAATAG ATATGTCAGT 120 CAAACATGTC AGAAGTCATA CTCACTAATT ATATGAGCGG GTGCGTTAGA TATTTATATG 180 AGTTTGCATC TTTCTACATG GGGCTTTCAA GTAACTGGAA GTAATACAAC TTTTGTTTAA 240 GTTGATAAAA ACAAAAAAGA AAAAAACAAA AAACAAAAAA ACAAAAATAA AAAAAAAAAA 300 AAACAAAAAA AAAAAAACAC ACACGCACAC ACACACATAT ACAAACACAT ACAAAAAACT 360 TATCATAATT AAGATAAATG AAAGCTATCT AAAATTTCCA GACATTTTCT GAAAAAGTGG 420 CTGCCAGCTT TATTGCTTTG CTTTAAATTT ATAAAGAAAA CTTCTTTGAA ATCGAATATG 480 AAACAAGAGG AAACGGATGA AAGGATAAAA CACAAATACA GGAAAACATT ATTACAAATA 540 AAGCACCTGT AAGAGATAAA TTTGTTACAT TTAAAGGATT CTACTTACAT ATACAGAGAA 600 AGCAATTTCA TAGACATAGG GTCTACCGAA CAGTCTTGAT A1TTCAGACT AGTATTTTTG 660 TTGTATTATG GGGCTTGCTC GGTATGTTAG TAAAAAGTTC ATTTTAAAAT TTTCCAAGAA 720 GTGTTTTTAT TGCAGAAAAA TÄTCCGTGGT TCAAGAGATA ATGGGCTGTA AATTTGTTTT 780 GTACCAAAAA TATCTTAATT AATACAAAGA ATACCTTTTA TGAAGGTAGA TCAAGATCTT 840 AAATTTCATT ACTCAGAAAT GAATATACTT GAAACTTCCG AAATACTATG TTATGGGGAA 900 CAAATAAGAG GAGCCATTTC ATATTTATTT TGGAAAGATC GTTTTCTATG CGCAGTTGTT 960 GGAATAGCGA TATTATCATG ACCTTATATT CAGTCAGAGA AAATAGGGTA CGAATTTGAA 1020 AACAATGTTT CAGCTTCAAA GAGGACCTTT AAACGGTCAG GCAAAAGTTG AGGTGTCAGT 1080 GTGTATAAAA ATGTTCAATT CATTTTTGGT TGAAAGATGC TTTAAAAGGT TGGTGCAAAG 1140 AATCATATAT GTGTATTGGC TAGTTAAAAG TTGCTTTATT AAAAATATAT GCAAACTAAA 1200 TTGTCTATAC GATTGATAAG GTGAAACTTA GATAAACAAT GAAAAAGGAA GGTGCTTTGA 1260 AAACCGACCA GCTTCAAATA AATATGTAAC TATTTTTATG GATGTGAAAA TTAAATGTTG 1320 TCGAATCTGC TGTTTCTAGA TTTGTAGATG AAAATGTTGA CGTGAGAGTT TTCATTTGTT 1380 TGTATTTTAT ATTATGCTTT GATTACTACT CATAGCTTGG GTTTAGCATG GCCTGAGTAA 1440 GTAGGAAGAT CCAATAAATT GACTGTTGTC GTTTTGAAAT TAAATACTGA AATGAATAAA 1500 AGTTTGACGA GAAAAGACCT GAAATATATA AAAATGTTTT GTATTATTTA AGTCGGTTAC 1560 ATTCTCTCAC TTTATTGTAA CAACCATTAT AGTGATGGGG AAAAAATAAA ACATAAGCCA 1620 CATAAGGAGA TATTGTTCTT TATTGAAAGG ATGGAATCAT TTTCTGGAAA TGTCAAAAAT 1680 132 TAAATATTAC TTGGTTTTTG ÄTGAÄTTGTA GAAGAAAAAG TAAATGCTGC TATTCTCTTT 1740 CTTTACATTT TCCÄTGTTTC CTGATTCTGG CTATGTCACT TTAAGTTGTT GAGATATC 1798 SEKVENSSI ID NO:13 Pituus: 1054 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Perimän DNA Alkuperä
Mikro-organismi: Candida utilis
Kanta: ATCC9950
Sekvenssi
CCACATTTGT TGTACGAGAA GGGCCAACGA CAGCTCTCTT CGAGGAAGAC TTGGAGATAA 60 G(XTTGCTTG ATTTGTAATC TTCAAGAGAG AGCTCTTTGT AGCTTGTCTT GTTGAGTGTC 120 TGAGAAGCAT TTGTGCAATG AATATGGGAG AGATGAGATG AGTAGAGAGC AGCACAAGTG 180 GAATCAAATC ACAATAACAA CrTTAGCCAC AGGGAGGTTA AAAGAGGAGA AGAAGGAGTC 240 CTTTCCAATT GTGGCTAGTG CAGAAGAGAA AATTTGCTTG CTACAATCGT GGTGTGTATG 300 CAAACCCGTT GTAAAGGTGG TGTCTTTGTA TATGTAGGGT GTGTGGCTTC GTCTCGAGAA 360 AGCACATAAG CTGTGGCGCA CTTTCTCGGG TAAGTGATTT AATTGCACGT GATCTCAATT 420 TCTTTTTTTG AAGCCACTAA AGCTTACGTA AGCGACCACG GATCTGGTGT TGGGATGTTT 480 TGGTTTTGGG AGGGGCAGGG GGTTTACATG TTGGCTTTAT CGATTGCGGC GCTTTGrGTT 540 TGGGGGTGTA TGCCCTAGCG AOXTGTGGG CCACTGCCCA GGTGCCCAGG TGCGACCAGG 600 AAAAAAATTT CTTCATCGCT AGAGCTTTCT TCAACCCCCT TTCmCCTA ATTCTTTTCA 660 ÄCTAACAACA AATAAACACA GTAACAAGAT GTCATCTGAC CTTTCAGACG TTAGACTCTT 720 TGTCAGACCA CTTCCATTCG ATGTTAACGA AGAGGACTTG AAGAGCTTCT TCTCCCCTAT 780 TGGTGAAATC ACCGATTTCA TCGTTGCTAG AGGTTATGCC TTTGTTGAAT ACGCTAATGC 840 AGATTTGGCA AGACAAGCCA TCGCTGAATT GCACCAAAAG CCGTTCGGTG ATGTTCCATT 900 ATCCTTGGAG TACGCTAAGG CTCAAAAGCC AAGATTCAGA CTTCTTGTTT CTAACATGCC 960 AGAAGGTGCT GAGTGGCAAG ATCTGAAAGA TTTTGCTCTC CAAAAGGGAT TCGAAGTTAC 1020 CTACGCCAAC GTTTTCCAAA GAGAGAACAA CGGT
SEKVENSSI ID NO:14 Pituus: 30 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet 133
Nimi/selitys: aluke
Sekvenssi GGTCGACATA TCGTGGTAAG CGCCTTGTCA 30 SEKVENSSI ID NO:15 Pituus: 30 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi TTCTAGACTT TATCCGCCAG TATGTTAGTC 30 SEKVENSSI ID NO:16 33 emästä
Nukleiinihappo
Juosteisuus: Yksisäikeinen
Molekyylityyppi: Synteettinen DNA
Sekvenssin ominaispiirteet
Nimi/selitys: aluke
Sekvenssi GGGTACCTAA CTGCAAGCTA CTTTGTAATT AAC 33 SEKVENSSI ID NO:17 Pituus: 30 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GGAATTCAAC ATGAATGACA CGACGAAGGT 30 SEKVENSSI ID NO:18 Pituus: 10 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo 134
Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Muu nukleiinihappo Sekvenssi AGCGGCCGCT 10 SEKVENSSI ID NO:19 Pituus: 30 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi ACCACTATTA CCACTACGGT TTGCTCTACA 30 SEKVENSSI ID NO:20 Pituus: 30 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GACACATCTC TGAGCAGCAT GACTTGGTTG 30 SEKVENSSI ID NO:21
Pituus: 12 emästä
Tyyppi: Nukleiinihappo
Juosteisuus: Yksisäikeinen
Molekyylityyppi: Synteettinen DNA
Sekvenssi CTAGATGGTA GG 12 SEKVENSSI ID NO:22 Pituus: 10 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo 135
Juosteisuus: Kaksisäikeinen Molekyylityyppi: Muu nukleiinihappo Sekvenssi CCGGATCCGG 10 SEKVENSSI ID NO:23 Pituus: 31 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke
Sekvenssi CCAAGCTTAC AGCGAGCACT CAAATCTGCC C 31 SEKVENSSI ID NO:24 Pituus: 36 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi CCTCTAGATA TGTTGTTTGT AAGTGTGTTT TGTATC 36 SEKVENSSI ID NO:25 Pituus: 30 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GGGATCCATT GTATGACTTT TATTTATGGG 30 SEKVENSSI ID NO:26 Pituus: 30 emästä 136
Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GGACTAGTGA GATGACTCTA GGCATCTTCT 30 SEKVENSSI ID NO:27 Pituus: 26 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi ATGACTGATA CATCATCCTC TTCATC 26 SEKVENSSI ID NO:28 Pituus: 28 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi TAACGACAGC TGGCAAACCG ACTGGGAC 28 SEKVENSSI ID NO:29 Pituus: 34 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GGCGGCCGCA ATTAACCCTC ACTAAAGGGA ACGA 34 137 SEKVENSSI ID NO:30 Pituus: 32 emästä Tyyppi* Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi TTCTAGACTA TATCAATGGT TAGTATCACG TG 32 SEKVENSSI ID NO:31 Pituus: 25 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi CCGGTACCTA AGCCGCTAAT ACCCC 25 SEKVENSSI ID NO:32 Pituus: 35 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GGGCGGCCGC ACTCGCTGAT CGAAA 25 SEKVENSSI ID NO:33 Pituus: 25 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke 138
Sekvenssi GGTCTAGATA TGÄAAAAGCC TGAAC 25 SEKVENSSI ID NO;34 Pituus: 25 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi; Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GGAGATCTAT TCCTTTGCCC TCGGA 25 SEKVENSSI ID NO:35 Pituus: 20 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi CAAGTTGATC CTTCTCCGGA 20 SEKVENSSI ID NO:36 Pituus: 20 emästä Tyyppi: Nukleiinihappo Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppi: Synteettinen DNA Sekvenssin ominaispiirteet Nimi/selitys: aluke Sekvenssi GAAACTTCTC GACAGACGTC 20 SEKVENSSI ID NO:37 Pituus: 20 emästä Tyyppi:Nukleiinihappo 139
Juosteisuus: Yksisäikeinen Molekyylityyppii Synteettinen DNA Sekvenssinominaispiirteet Nimi/selitys: aluke
Sekvenssi CATCGGGTAA GGTCTACATG 20

Claims (5)

1. DNA-sekvenssi, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka antaa hiivalle sykloheksimidiresistenssin ja joka koodaa syklo-5 heksimidille resistenttiä L41-proteiinia, jonka aminohappo-sekvenssi on kuviossa 14 esitetty sekvenssi (SEKVENSSI ID NO:6), edellyttäen että asemassa 56 olevan proliinin tilalla on glutamiini.
2. Plasmidi, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin käyttö lää-keaineresistenttinä markkerigeeninä transformoidun Candida 15 utiliksen selektoimiseksi.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, jolloin transformoitu Candida utilis on.tuotettu renkaanmuotoisella inte-graatiovektorilla, joka sisältää Candida utiliksen kromoso- 20 maalisen DNA:n osan suhteen homologisen sekvenssin ("homologinen DNA-sekvenssi") ja patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin transformantin selektioon tarkoitettuna markkerigeeninä ja mahdollisesti heterologisen geenin, ja hetero-loginen geeni on liitetty Candida utiliksen kromosomaaliseen 25 DNA:han homologisen rekombinaation avulla silloin kun vektori on katkaistu homologisen DNA-sekvenssin alueelta restriktio-entsyymillä lineaariseen muotoon ja viety Candida utilikseen.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, jolloin sellaisen 30 DNA-sekvenssin molemmat päät, joka sisältää mainitun markke- rigeenin ja mainitun mahdollisen heterologisen geenin, on kovalenttisesti liitetty mainittuun homologiseen DNA-sek-venssiin, ja jolloin heterologinen geeni on liitetty Candida utiliksen kromosomaaliseen DNArhan homologisen rekombinaation avulla silloin, kun vektori on katkaistu homologisen DNA-sek-venssin alueelta restriktioentsyymillä lineaariseen muotoon ja viety Candida utilikseen. 5
FI960331A 1994-05-25 1996-01-24 Transformoitu Gandida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla FI121013B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP13501594 1994-05-25
JP13501594 1994-05-25
JP28582394 1994-10-26
JP28582394 1994-10-26
JP12928795 1995-04-28
JP7129287A JPH08173170A (ja) 1994-05-25 1995-04-28 キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現
PCT/JP1995/001005 WO1995032289A1 (fr) 1994-05-25 1995-05-25 Lignee transformee de levure candida utilis et expression d'un heterogene dans cette lignee
JP9501005 1995-05-25

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI960331A0 FI960331A0 (fi) 1996-01-24
FI960331A FI960331A (fi) 1996-03-20
FI121013B true FI121013B (fi) 2010-06-15

Family

ID=27315910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI960331A FI121013B (fi) 1994-05-25 1996-01-24 Transformoitu Gandida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5849524A (fi)
EP (2) EP0717107B1 (fi)
JP (4) JPH08173170A (fi)
KR (2) KR100263962B1 (fi)
AT (1) ATE347598T1 (fi)
AU (1) AU699864B2 (fi)
CA (1) CA2168037C (fi)
DE (1) DE69535326T2 (fi)
FI (1) FI121013B (fi)
NO (1) NO960247L (fi)
WO (1) WO1995032289A1 (fi)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6642021B2 (en) 1996-03-29 2003-11-04 University Of Maryland Methods of producing carotenoids by the expression of plant ε-cyclase genes
US6284534B1 (en) 1996-08-23 2001-09-04 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Yeast vector comprising a shortened promoter sequence
CU22722A1 (es) * 1996-10-03 2002-02-28 Ct Ingenieria Genetica Biotech Sistema de transformación para la expresión de genes heterólogos en la levadura candida utilis
DE19736343B4 (de) 1997-08-21 2006-02-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Erhöhung der Genexpression von Saccharose Synthase
US6638735B1 (en) * 1998-05-07 2003-10-28 Doosan Corporation Plasmid for gene expression in pichia ciferrii and transformation method using the same
JP2000342263A (ja) * 1999-06-02 2000-12-12 Japan Energy Corp ハイグロマイシン耐性遺伝子及び形質転換されたＣａｎｄｉｄａ属酵母
DE19963690A1 (de) * 1999-11-23 2001-06-13 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Vektoren und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine in Pilzen
CN1301747A (zh) * 1999-12-27 2001-07-04 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——核糖体s19e蛋白10和编码这种多肽的多核苷酸
US7141410B2 (en) * 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
JP2002325573A (ja) * 2001-04-27 2002-11-12 Japan Science & Technology Corp ベクター
US6645739B2 (en) * 2001-07-26 2003-11-11 Phoenix Pharmacologies, Inc. Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same
CA2474152A1 (en) * 2001-11-23 2003-06-19 Cargill Dow Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of candida species
JP2005528112A (ja) * 2002-05-30 2005-09-22 カーギル ダウ エルエルシー 酵母におけるｄ−乳酸の生産方法およびその材料
JP4587750B2 (ja) * 2004-09-13 2010-11-24 株式会社興人 転写活性化タンパク質をコードするキャンディダユティリス由来の遺伝子
JP4671394B2 (ja) * 2004-09-13 2011-04-13 株式会社興人 キャンディダ・ユティリス由来のプロモーターｄｎａ
JP4563228B2 (ja) * 2004-09-13 2010-10-13 株式会社興人 キャンディダ・ユティリス由来のａｒｓ遺伝子
KR101482081B1 (ko) * 2005-03-18 2015-01-13 마이크로비아 인크. 유질 효모와 진균 내에서 카로티노이드의 생산
EP2078092A2 (en) 2006-09-28 2009-07-15 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US7771977B2 (en) 2006-09-29 2010-08-10 National University Corporation NARA Institute of Science and Technology Alkane polyol dehydrogenase
US20090277974A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Samino Citrawireja Lawn And Garden Sprinkler Housing
WO2010024444A1 (ja) 2008-09-01 2010-03-04 ダイセル化学工業株式会社 光学活性なアミン誘導体の製造方法
US20110262977A1 (en) 2008-09-01 2011-10-27 Daicel Chemical Industries, Ltd. Process for production of optically active amine derivative
KR20110124781A (ko) * 2009-02-23 2011-11-17 기린 홀딩스 가부시키가이샤 자일로오스를 탄소원으로 사용할 수 있는, 캔디다 유틸리스에 의한 물질의 제조법
US8597923B2 (en) * 2009-05-06 2013-12-03 SyntheZyme, LLC Oxidation of compounds using genetically modified Candida
US8158391B2 (en) 2009-05-06 2012-04-17 Dna Twopointo, Inc. Production of an α-carboxyl-ω-hydroxy fatty acid using a genetically modified Candida strain
US20120276606A1 (en) 2009-10-30 2012-11-01 Daicel Corporation Recombinant microorganisms with 1,3-butanediol-producing function and uses thereof
EP2626430B1 (en) 2010-10-05 2017-07-12 Ajinomoto Co., Inc. Yeast and yeast extract containing gamma-glu-abu, and method for producing the yeast or yeast extract containing gamma-glu-abu
EP3020801A4 (en) 2013-07-12 2017-01-18 Ajinomoto Co., Inc. YEAST WITH HIGH CONTENT OF Abu, upsilon-Glu-Abu, AND/OR UPSILON-Glu-Abu-Gly
EP3341476B1 (en) 2015-08-24 2019-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing phytosphingosine or sphinganine
CA2996025A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing sphingoid base or sphingolipid
CN112575013B (zh) * 2020-12-24 2022-05-17 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 基因gnatb作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用
WO2022158535A1 (en) 2021-01-20 2022-07-28 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing phytosphingosine or phytoceramide
EP4281574A1 (en) 2021-01-20 2023-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing phytosphingosine or phytoceramide

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341116C (en) * 1983-02-22 2000-10-17 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein
JPS59162884A (ja) * 1983-03-09 1984-09-13 Kohjin Co Ltd 新規な雑種プラスミドおよびそれを含有する微生物
GB8314961D0 (en) * 1983-05-31 1983-07-06 Kingsman A J Dna sequence
JPS60210815A (ja) * 1984-04-04 1985-10-23 Hitachi Ltd 変圧器鉄心
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
JPS6442673A (en) 1987-08-11 1989-02-14 Seiko Epson Corp Printer
JP3036002B2 (ja) * 1990-07-06 2000-04-24 東洋紡績株式会社 キャンデイダ・ユテイリス由来のａｄｅ１遺伝子を含有するｄｎａ断片
FR2679253B1 (fr) * 1991-07-15 1994-09-02 Pasteur Institut Proteines de resistance a la cycloheximide. utilisation comme marqueur de selection par exemple pour controler le transfert d'acides nucleiques.
JP2984143B2 (ja) * 1992-05-15 1999-11-29 キッコーマン株式会社 新規なウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びウリカーゼの製造法
JPH0614865A (ja) 1992-07-02 1994-01-25 Asahi Optical Co Ltd 内視鏡の先端部
DE4244915C2 (de) * 1992-08-14 1998-12-03 Widmar Prof Dr Tanner DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind

Also Published As

Publication number Publication date
NO960247D0 (no) 1996-01-22
EP0717107A4 (en) 2002-05-22
JP4623925B2 (ja) 2011-02-02
JP4017966B2 (ja) 2007-12-05
KR100263962B1 (ko) 2000-08-16
WO1995032289A1 (fr) 1995-11-30
JP3385027B2 (ja) 2003-03-10
DE69535326T2 (de) 2007-06-21
US5849524A (en) 1998-12-15
EP1792993A1 (en) 2007-06-06
FI960331A0 (fi) 1996-01-24
JP2003144185A (ja) 2003-05-20
FI960331A (fi) 1996-03-20
NO960247L (no) 1996-03-22
ATE347598T1 (de) 2006-12-15
JPH08173170A (ja) 1996-07-09
EP0717107B1 (en) 2006-12-06
CA2168037A1 (en) 1995-11-30
JP2003174879A (ja) 2003-06-24
AU2537795A (en) 1995-12-18
DE69535326D1 (de) 2007-01-18
EP0717107A1 (en) 1996-06-19
AU699864B2 (en) 1998-12-17
CA2168037C (en) 2003-07-01
KR100320905B1 (ko) 2002-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121013B (fi) Transformoitu Gandida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla
KR0181179B1 (ko) 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법
JP2873012B2 (ja) 酵母ベクター
Percival-Smith et al. Characterization and mutational analysis of a cluster of three genes expressed preferentially during sporulation of Saccharomyces cerevisiae
Soliday et al. Structure of the cutinase gene and detection of promoter activity in the 5'-flanking region by fungal transformation
US8883482B2 (en) Methods for increasing homologous recombination of a nucleic acid sequence
JP3009679B2 (ja) ペクチンリアーゼ発現系
AU744698B2 (en) Candida utilis transformation system
US5627046A (en) Yeast promoter and its use
WO2001040489A1 (en) Methods for producing a polypeptide using a consensus translational initiator sequence
AU754951B2 (en) Yeast transformation cassette
Johnston et al. Cloning and characterization of the Schizosaccharomyces pombe DNA ligase gene CDC17
CA2132299A1 (en) A process for producing heme proteins
US5627049A (en) K. lactis RP28 ribosomal protein gene promoter and use thereof
AU599574B2 (en) Recombinant saccharomyces
US20030199038A1 (en) Method for preparing polypeptide variants
Gerhold et al. The topoisomerase I gene from Ustilago maydis: sequence, disruption and mutant phenotype
CA2115507A1 (en) .beta.-tubulin from acremonium chrysogenum, its preparation and use
JPS60188073A (ja) バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド
JPH08270A (ja) 酵母凝集遺伝子ｆｌｏ８
JPH0458891A (ja) アクレモニウム・クリソゲナムのプロモーター
JPH062063B2 (ja) 新規ｄｎａおよびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 121013

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed