FI120042B - Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita - Google Patents

Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita Download PDF

Info

Publication number
FI120042B
FI120042B FI20051161A FI20051161A FI120042B FI 120042 B FI120042 B FI 120042B FI 20051161 A FI20051161 A FI 20051161A FI 20051161 A FI20051161 A FI 20051161A FI 120042 B FI120042 B FI 120042B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
tnf
sequence
leu
ser
thr
Prior art date
Application number
FI20051161A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20051161A (fi
Inventor
Craig A Smith
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of FI20051161A publication Critical patent/FI20051161A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120042B publication Critical patent/FI120042B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuu-sioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynuk-leptideja ja vektoreita 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FT 944516.
Keksinnön tausta
Useiden sytokiinien tiedetään sitoutuvan kohdesolu-jen pinnalla oleviin spesifisiin reseptoriproteiineihin, Tunnistettuihih spesifisiin reseptoriproteiineihin kuuluu 10 kasvainkupliotekijäreseptoreita ja inLer1eukiini-1-reseptoreita . Parhaillaan ollaan kohdistamassa runsaasti voimavaroja useiden reseptorien eristämiseen ja luonnehtimiseen näiden fysiologisten tehtävien tutkimiseksi ja mahdollisten terapeuttisten käyttömuotojen selvittelemiseksi. Sillä, 15 että potilaalle annettu liukoinen reseptori sitoo tiettyä nimenomaista molekyyliä, johon sen vaikutus kohdistuu, voi olla mahdollista lievittää sairauksia, joissa kohteena olevalla molekyylillä on osuutta.
Kasvainkuoliotekijä-O! (TNFa, josta käytetään myös 20 nimitystä kakektiini) ja kasvaihkuoliotekijä-β (TNFp, josta käytetään myös nimitystä lymf o toksiini) ovat nisäkkäiden \ endogeenisiä erittyviä homologisia proteiineja, jotka kykenevät käynnistämään hyvin monenlaisia toimintoja lukuisissa solutyypeissä. Näiden kahden sytokiinin rakenteellisten ja 25 toiminnallisten ominaisuuksien suuren yhdenmukaisuuden johdosta niistä on käytetty yhteisnimitystä "TNF". On eristet- f ty komplementaarisia cDNA-klooneja, jotka koodaavat TNFo*:aa [Fennica, et ai., Nature 312 (1984) 724] sekä TIU?^:aa [Gray, et ai.. Nature 312 (1984) 721] ja jotka ovat tehneet 30 mahdollisiksi TNF:n rakennetta ja biologisia ominaisuuksia koskevat jatkotutkimukset, j TNF-proteiinien biologinen vaikutus soluihin käyn- j nistyy niiden sitoutumisesta spesifisiin TNF:n reseptori- \ j proteiineihin {TNF-R-proteiinit), jotka ilmentyvät TNF:ään j 35 reagoivan solun plasmamembraanin pinnalla. Ensimmäinen j näyttö TNFa:n ja TNF(3;n sitoutumisesta solujen pinnalla j j 5 ] j 2 olevaan yhteiseen reseptoriin saatiin käyttämällä kohdun-kaulankarsinoomahumaanisolulinjaa ME-180 [Aggarwal, et ai.,
Mature 318 (1985) 665], Hohmann, et ai. [J. Biol. Chem. 264 (1989) 14927] ovat julkaisseet tutkimusraportin, jonka nru-5 kaan eri solutyypeissä on olemassa ainakin kaksi erilaista solun pinnalla olevaa TNF:n reseptoria, vaikkakin näiden TNF-R-mo1ekyy1ien välinen suhde on epäselvä. Näiden reseptorien näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 75 - SO kDa ja noin 55 - 60 kDa, vastaavassa järjestyksessä ilmöi-10 tettuna. Solun pinnalla olevien iNF-reseptorien lisäksi on myös ihmisen virtsasta tunnistettu liukoisia proteiineja, jotka kykenevät sitomaan TNF:ää [Peetre, et ai., Eur, J.
Haematol, 41 (1988) 114; Seckinger, et ai,, J. Exp. Med.
167 (1988 ) 1511; Seckinger, et ai . , J. Biol. Chem, 264 15 (1989) 11966; Seckinger, et ai,, GB-pätenttihakemusjulkaisu nro 2 218 101; Engelmann, et ai,, J, Biol. Chem. 264 (1989) 11974] .
Intepleukiini-lof (IL-la) ja interleukiini-ΐβ (IL-Ιβ) ovat kaukaisesti toisiaan muistuttavia polypeptidihorrno-20 neja, joilla on keskeinen osuus immuuni- ja tulehdusas- teiden säätelyssä. Nämä kaksi proteiinia vaikuttavat useisiin erilaisiin solutyyppeihin ja niillä on useita biologisia aktiivisuuksia. Niissä biologisissa aktiivisuuksissa, joiden on katsottava johtuvan IL-Ia:sta ja IL-Ιβ:sta, 25 välittyvät vaikutukset ainakin kahden sellaisen plasmamem-brääniin sitoutuneen reseptorin välityksellä, jotka sitovat sekä IL-la:aa että IL-Ιβ:aa. B-soluissa ilmentyvät IL-1:n \ reseptorit {näistä käytetään tässä keksinnössä nimitystä ] IL-1 :n tyypin XI reseptorit.) ovat erilaisia kuin T-solujen j 30 ja muiden solutyyppien pinnalla ilmentyvät IL-l:n resepto- ! rit (näistä käytetään tässä keksinnössä nimitystä IL-1:n tyypin I reseptorit),
Keksinnön yhteenveto j Tämä keksintö kohdistuu eristettyyn polyhykleoti- j 35 diin, joka koodaa fuusioproteiinia, joka sisältää kasvain- | kuoliotekijäreseptori (TNF-R)-polypeptidiä, joka on liitet- j \ |
X
3 ty kovalenttisesti toiseen TNF-R-polypeptidiin, Reseptori sisältää kahta TNF-R-polypeptidiä, jotka on liitetty kovalenttisesti yhteen interleukiini-l-reseptori {ΙΙ,-lR) -poly-peptidiin.
5 Reseptorit valmistetaan edullisesti fuusiaproteii- neina yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen. Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön fuusi©proteiineja, jotka sisältävät kahta biologisesti aktiivista polypeptidikomponenttia TNF-R-poly-peptidiä.
10 Tämän keksinnön s ove11utusmuodos s a funsioproteiini sisältää TNF-R:ää ja TT.-1R: ää. Fuusi ©proteiini sisältää edullisesti kahta TNF-R-polypeptidiä ja yhtä iL-lR-poly-peptidiä.
Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön näitä fuu-15 sioproteiineja koodaavia eristettyjä .DNA-jaksoja, tällaisia im-jaksoja sisältäviä yhdisbelfijä-ilmentämisvektoreita-, näitä ilmentämisvektoreita sisältäviä isäntäsoluja ja menetelmiä yhdistelmä-funsioproteiinien valmistamiseksi näitä | isäntäsoluja viljelemällä. Tästä keksinnöstä saadaan käyt- { 20 töon farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät edellä \ esitetyn kuvauksen mukaista puhdistettua fuusioproteiinia | ja sopivaa laimenninta, kantaja-ainetta tai lisäainetta. j Tällaiset koostumukset ovat käyttökelpoisia kasvainkuolio- j tekijän tai interleukiini-1:ή välityksellä tapahtuvien sai- j 25 rauksien hoidossa, diagnoosissa ja määrityksissä. j
Keksinnön mukaiselle eristetylle pölynukleotidille | on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaiselle ilmentymisvektorille on tunnus- | omaista, että se sisältää kyseistä polynukleotidiä. Keksin- | : ί 30 non mukaiselle menetelmälle fuusioproteiinien valmistami- \ seksi tai sitä sisältävän farmaseuttisen koostumuksen, vai- | mistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk- | \ sessa 9 tai 10 esitetään.
4
Piirrosten pääpiirteittäinen selitys
Kuvio 1 on tyypin X humaani - IL ~ 1R: n cDNA- kl oonin restriktiokartta. Kuviossa on esitetty kohdat, joista tietyt restriktioentsyymit pilkkovat cDNA: ta.
5 Kuvioissa 2A - 2B on esitetty yhden humaani--TNF-It ki oonin osittainen cDNA-jakso ja siitä päätelty aminohappo-jakso . Nukleotidit on numeroitu translaatioon osallistumattoman 5'-puoleisen alueen alusta lähtien. Aminohapot on numeroitu signaalipeptidijakson alusta lähtien. Selvästi 10 tunnistettavaa signaalipeptidijaksoa edustavat aminohapot -22 - -1. Asemassa 1 oleva kypsän 'TNF-R-proteiinin N-termi-naalinen leusiini on alleviivattu. Aminohappojen 236 - 265 alueelta peräisin oleva selvästi tunni s tet tava transmem-hraanialue on myös alleviivattu. Useiden erilaisten liu~ 15 koisten TNF-R-moiekyylien C-terminaaliset päät on merkitty nuolella (#) · Kuviossa on myös esitetty i Imen tämi s vektorien konstruoimiseen käytettyjen tiettyjen restriktio-enäonukleaasien katkaisukohdat,
Kuvio 3 esittää plasmidi vektoria, joka sisältää I
20 sellaista fuusioproteiinia koodaavaa DNA-fragmenttia, jolla |
on kaava TNF -R-kytki j äj akso- TNF - R ja joka on konstruoitu I
esimerkissä 11 kuvatulla tavalla. |
Kuvio 4 esittää plasmidivektoria, joka sisältää j sellaista fuusioproteiinia koodaavaa DNA-fragmenttia, jolla j 25 on kaava IL-lR-kytkijäjakso-XNF-R-kytkijäjakso-TNF-R ja joka on konstruoitu esimerkissä 12 kuvatulla tavalla.
..... $
Kuvio 5 esittää kolmea plasmidivektoria, jotka ovat 1 tiettyjen tämän keksinnön mukaisten vektorien, jotka on kuvattu esimerkissä 12, konstruoimisessa olevia välituot- | 30 teitä. j
Keksinnön yksityiskohtainen selitys j Tässä kuvataan reseptoreita, jotka sisältävät en- j simmäistä TNF-R-poiypeptidiä, joka on liitetty kovalentti- | sesti toiseen TNF-R-polypeptidiin. Reseptori sisältää kahta ! 35 TNF-R-polypeptidiä, jotka on liitetty kovalent ti s es t i yhteen XL-lR-polypeptidiin. TNF-R-polypeptidikomponentit ja i 5 IL-lR-polypeptidikomponenti b (milloin niitä on käytetty) voivat olla liitetyt toisiinsa millä tahansa menetelmällä yhden polypeptidin liittämiseksi toiseen. Kytkemismenetel-miin, joiden käyttö voi tulla kysymykseen, kuuluvat silloi-5 tusreagenssien ja peptidikytkijajaksojen käyttö. TNF-R- ja iL-lR-polypeptidit ovat peräisin nisäkäslajeista ja ne ovat edullisesti peräisin ihmisestä.
Reseptorit, on edullista valmistaa fuusioproteiihei-na yhdistelmä-DNÄ-menetelmiä käyttäen.
10 Tämän keksinnön sövellutusmuodossa fuusioproteiini sisältää TNF™R:ää ja nisäkkäiden interleukiini-1-i'eseptoria (IL-lRiää). Fuusioproteiinin muodostamiseksi liitetään toisiinsa kaksi TNF-R-polypeptidiä ja yksi IL-lR-polypeptidi.
Nämä kaksi TNF-R-polypeptidiä ovat TNF:n sitoutumisen edis- 15 tämiseksi peräkkäin {vastakohtana sille, että IL-1R olisi sijoitettu kahden TNF-R-mo:lekyylin väliin) . Esimerkkejä tällaisista fuusioproteiineista ovat proteiinit, joita edustavat kaavat: 20 TNF-R-kytkijäjakso-TNF-R-kytkijäjakso-IL-1R ja j
IL-1R-kytkij äj aks o-TNF-R-kytki jäjakso-TNF-R
jossa kukin kytkijäjakso on peptidikytkijäjakso. Kunkin fuusioproteiinin. N-terminaalinen pää on kunkin kasvan vasem·· 25 maila puolella.
Näiden fuusioproteiinien kukin TNF-R-polypeptidi-komponentti kykenee sitomaan itsenäisesti kasvainkuolidte- I
kijää (TNF). Samoin kukin näissä fuusioproteiineissa käy- J
tetty IL-lR-polypeptidi kykenee sitomaan itsenäisesti in- |
A
30 terleukiini-1:ta (IL-l:tä). Kahden peräkkäisen TNF-R-poly peptidi n käyttö fuusioproteiinissa on edullista siinä mie-lessä, että tämä lisää TNF:n sitoutumisaffiniteettia verrattuna yhden TNF-R-polypeptidin aikaansaamaan TNF:n sitoutumiseen.
35 Sellaiset peptidikytkijäjaksot, joita voidaan käyt tää tässä keksinnössä, pitävät TNF-R-polypeptiäejä (sekä 6 IL-lR-polypeptideja, milloin nämä ovat käytössä} sellaisen riittävän suuruisen etäisyyden päässä toisistaan, että tämä varmistaa kunkin polypeptidin laskostumisen asiaankuuluvalla tavalla halutulle biologiselle aktiivisuudelle vält-5 tämättömiin sekundäärisiin ja tertiäärisiin rakenteisiin.
Kytkijäjakson on myös annettava TNF-R- ja IL-lR-polypep-tidien ekstrasellulaarisille domeeneilie mahdollisuus asettua asiaankuuluvaan avaruudelliseen orientaatioon TNF-n tai IL-l:n sitöutumisköhdan muodostamiseksi. Nämä peptidikytki-10 jäjaksot toimivat loitontavina osina, joiden vastakohtana Ovat fuusioproteiinien farmaseuttisesti aktiiviset TNF-R-ja IL-lR-polypeptidikompönentit. Sopivat polypeptidikytki-jäjaksot asettuvat edullisesti (1) joustavaan oienneeseen konföriöaatioon, (2) niillä ei ole taipumusta kehittää jär-15 jestynyttä sekundäärirakeimetta, joka saattaisi häiritä proteiinien funktionaalisia dömeeneja, ja (3) niillä on mahdollisimman vähän sellaisia hydrofobisia tai varauksellisia ominaisuuksia, jotka saattaisivat edistää vuö.ro~ \ vaikutusta proteiinien funktionaalisten domeenien kanssa, | 20 Tyypillisiin proteiinien pinnalle sijoittuviin aminohappoi- |
bin proteiinien joustavissa alueissa kuuluvat giysiini J
{Gly}, asparagiini (Asn) ja seriini (Ser). Käytännöllisesti j katsoen kaikkien: Gly:tä, Asnfää ja Ser;ää sisältävien ami- | nohappojäksopermutaatioiden voitaisiin odottaa olevan edel- | 25 la. olevan peptidikytkl jäjakson periaatteiden, mukaisia, 1
Kytkijäjaksossa voidaan myös käyttää muita lähes neutraa- j
leja aminohappoja, kuten treoniinia (Thr) ja alaniinia (Ala):, Sopivat peptidikytkijäjaksot sisältävät tavallisesti I
aminohappöketjuu, jonka pituus on edullisesti 5 - 100 j
30 aminohappoa ja edullisimmin 10 - 20 aminohappoa, Esimerkke- I
ja tällaisista kytkijäjaksoista ovat, mainittxiihin kuitenkaan rajoittumatta, (Gly,jSer)n, jossa n on 1-12, Gly.iSerGlysSer ja (GlyaSerGlysSer)2, TNF-R- ja IL-lR-polypeptidit 35 Tässä keksinnössä termit "interleukiini-1-reseptori" ja "IL-1R" tarkoittavat proteiineja, jotka kykenevät j j j •k :1 7 sitomaan interleuki ini-1 (IL-1) -molekyylejä ja niiden tehtävänä natiivissa konfiguraatiossäan hnmaaniplasmamem-braaniproteiineina on välittää IL-1:n antama signaali soluun. Tässä keksinnössä telmit "TNF-reseptori" ja “TNF-R" 5 tarkoittavat proteiineja, jotka ovat biologisesti aktiivisia siinä mielessä, että ne kykenevät sitomaan kasvain-kuoliotekijää (TNF). Näiden proteiinien natiivit membraa-niin sitoutuneet muodot välittävät samalla tavoin soluun TiNOF-molekyylin sitoutumisesta alkunsa saaneen biologisen 10 signaalin, TNF-R-polypeptidit voivat olla identtisiä tai erilaisia. Tämä sama pitää paikkansa IL-lR-polypeptidien kyseessä ollessa.
Täydellisiin reseptoreihin kuuluu tavallisesti li-gandiin sitoutuva sölunulkoinen domeeni, hydrofobinen trans-15 membraanidomeeni, joka: pysyy plasmamembraanin lipidikak- soiskerroksessa, ja sytoplasminen eli solunsisäihen domeeni, jonka arvellaan tuovan biologisen signaalin efektori-soluihin solun sytoplasmassa tapahtuvien peräkkäisten kemiallisten reaktioiden välityksellä. Hydrofobinen transmem-20 braanidomeeni ja transmembraanidomeenista välittömästi myö- (
täsuuntaan oleva sytoplasmisen domeenin voimakkaasti varaa- I
tunut alue toimivat yhdessä siten, että ne pysäyttävät. s IL-1:n ja TNF:n reseptorien kuljetuksen plasmamembraanin j läpi. Tässä keksinnössä selitettyjen TNF-R- ja IL-1R- | 25 proteiinien solunulkoinen domeeni on proteiinin N-termi-naalinen osa, joka alkaa aminohaposta 1 ja päättyy trans-membraanialuetta välittömästi edeltävään aminohappoon. |
Sytoplasminen domeeni on transmembraanialueesta myötäsuun- \ taan oleva osa proteiinia.
30 Niihin TNF-R-poiypeptideihin, joita voidaan käyttää j
tämän keksinnön mukaisten fuusioproteiinien komponentteina, I
kuuluu polypeptidi, joka sisältää kuvioissa 2A - 2B esitetyn jakson aminohapot 1 - 439, joka on täysimittaisen natiivin TNF-R.: n jakso. Nämä TNF-R:xi DNA- ja aminohap-35 pöjaksot, on myös esitetty jakso tunnisteissa nro 1 ja 2.
Haluttaessa käyttää signaalijaksoa voi TMF-R~polypeptidi 8 myös sisäl täs· kuvioiden 2A — 2B mukaisen jakson aminohapot -22 -439. Se, että molekyylissä halutaan käyttää signaali jaksoa, on riippuvainen sellaisistä tekijöistä, kuten TNF-R-polypeptidin asema fuusioproteiinissa seka nisäkkäi-5 den signaalijakson mahdollinen muokkautuminen aiotuissa isäntäsoluissa, mitä on tarkasteltu tuonnempana. Tämän hu-mäani-TNF-Rm kypsä täysimittainen, natiivi glykosyloitunut muoto on glykoproteiini, jonka suhteellinen moolimassa on noin 80 kilodaltohia (kDa). Tässä patenttiselityksessä 10 tarkoittaa termi "kypsä" proteiinia, jossa ei ole sitä johto- eli signaalijaksoa, jollainen voi esiintyä natiivin geenin täysimittaisissa transkriptiotuotteissa. Proteiini voi sisältää signaalijakson heti ilmentämisen jälkeen. Proteiinin kypsän muodon synnyttää signaalijakson pilkkoutu-15 minen proteiinin erittyessä solusta.
Muita sopivia TNF-R-polypeptidejä on kuvattu EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 422 339 (tästä käytetään tuonnempana nimitystä EP-422' 339), joka on liitetty kokonaisuudessaan tähän keksintöön siihen oikeuttavien sään-
•I
20 nösten nojalla. Kaksi sopivaa TNF-R-polypeptidiä sisältävät j ryhmänä 174 arginiinin (Arg), mutta ne ovat muutoin \ identtiset edellä kuvattujen polypeptidien suhteen, jotka sisältävät tämän patenttihakemusjulkaisun kuvioiden 2A - 2B | mukaiset aminohapot 1 - 439 tai -22 - 439, vastaavassa | 25 järjestyksessä ilmoitettuna. TNF-R:n aminohappojakso, joka | on identtinen (tämän keksinnön mukaisten) kuvioiden 2A - 2B mukaisen aminohappojakson suhteen, lukuunottamatta sitä, j että kypsän jakson asemassa 174 olevan metioniinin (Met) 1 tilalla on arginiini (Arg), on kuvattu julkaisussa EP- j 30 422 339 (tätä ori käsitelty kyseisessä julkaisussa olevassa } kuviossa 39).
Julkaisun EP-422 339 kuviossa 21 on kuvattu toisen käyttökelpoisen TNF-R-polypeptidin cDNA-jakso ja tämän koodaama aminohappojakso. Julkaisun EP-422 339 kuvion 21 mu-35 kaisen cDNA-jakson koodaava alue ja tämän koodaama aminohappo jakso on esitetty tämän patenttihakemuksen jaksotun- j | 9 nisteenä nro 3 ja 4. Vaikkakin julkaisussa EP-422 339 tästä proteiinista on käytetty nimitystä 30 kilodaitonin proteiini, niin sen suhteellisiksi moolimassoiksi on raportoitu muunlaisia suhteellisia moolimassoja. Esimerkiksi jiilkai-5 sussa Loetscher, et ai. [Cell 61 (19905 351] ja julkaisussa EP-417 563 on suhteellisen moolimassan raportoitu olevan noin 55 kilodaltöniä. Käyttökelpoisiin TNF-R-polypeptidei~ hin sisältyvät polypeptidit, jotka sisältävät jaksötunnis-teen nro 4 mukaisen jakson aminohapot 1 - 415, tai halut-10 taessa käyttää signaalijaksoa, jaksotunnisteen nro 4 laukaisen jakson aminohapot -40 - 415. Menetelmiä tämän TNF R -proteiinin valmistamiseksi joko puhdistamalla se virtsasta tai U937-soluviljelmän kasvatusmedlamista tai käyttämällä yhdistelmä-DNA-menetelmiä, on kuvattu julkaisussa EP- 15 422 339. Tälle TNF-R:lie on tunnusomaista N-terminaalinen jakso (proteiinin kypsää muotoa vastaava jakso), joka on Äsp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-, kun taas kuvioiden 2A - 2C mukaisen TNF-R-proteiinin kypsän muodon ΚΓ-terminaalinen jakso on Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-. | 20 Tietyissä tämän keksinnön sovellutusmuodoissa j TNF-R-polypeptidi on liukoinen TNF-R-polypeptidi. Liukoi- ] sista TMF-R-polypeptideistä puuttuu ainakin osa siitä transmembraanialueesta, joka edistää proteiinin pysymistä solun pinnalla (kyseinen alue puuttuu edullisesti koko-25 naan). Liukoisista polypeptideistä puuttuu tavallisesti myös syto-plasmisen domeenin varauksia sisältävä alue (tämä sijaitsee heti transmembraanialueen jälkeen myötäsuuntaan), i joka myötävaikuttaa molekyylin pysymiseen solun pinnalla. |
On edullista, että proteiinista on poistettu koko transmem- j
30 braanialue ja sytoplasminen alue tai että ne on korvattu I
hydrofiilisillä aminohapoilla liukoisen TNF-R:n muodostaini- j seksi. Liukoinen TNF-R erittyy solusta ja säilyttää halutun j biologisen aktiivisuuden. \
Esimerkkejä liukoisista TNF-R-polypepfcideistä ovat | 35 polypeptidit, jotka sisältävät kuvion 2A mukaisen jakson j aminohapot. 1 - x, jossa x on C-terminaalinen aminohappo ja j i i * :¾ :¾ :¾¾
S
10 se on mikä tahansa kuvion 2A mukaisista aminohapoista 163 - 235, Erityisiin esimerkkeihin sisältyvät polypep-tid.it, jotka sisältävät kuvion 2A mukaiset hapot 1 - 163, 1 - 185 tai 1 - 235. Liukoinen TNF-R-polypeptidi voi lisäk-5 si sisältää signaalijakson, esimerkiksi kuvion 2A mukaiset aminohapot -22 - 1,
Muita esimerkkejä liukoisista TNF-R-polypeptideistä Ovat polypeptidit, jotka sisältävät kuvioiden 2A - 2B mukaisen jakson aminohapot 1 - 184 tai 1 - 182, -22 - 184 tai 10 -22 - 182. Nämä proteiinit voivat sisältää asemassa 174 joko metioniinih tai argihiinin. Menetelmiin tällaisia TNF-R-polypeptidejä edustavien esimerkkien valmistamiseksi sisältyvät menetelmät, jotka on kuvattu julkaisun EP-422 339 esimerkeissä 17 ja 22.
15 Jaksotumisteessa nro 4 esitetty TNF-R-proteiini sisältää signaalipeptidin (tätä esittävät aminohapot -40 —1) ja asemassa 172 olevasta valiinista alkavan transmerabraani-alueen. Tämän TNF-R-pratelinin edullisiin liukoisiin muo- | töihin kuuluvat muodot, jotka käsittävät jakso tunnisteen { 2 0 nro 4 mukaiset aminohapot -40 - w tai 1 - w, jossa w on | alueelta 161 - 171 oleva kokonaisluku (toisin sanoen C- \ \ terminaalinen pää on mikä tahansa jäksotunnisteen nro 4 j mukaisista aminohapoista 161 - 171). Julkaisun EP-422 339 1 esimerkissä 7 on kuvattu in vitro -olosuhteissa suoritet- \ 25 tavan oligonukleotidikohdemutageneasin käyttöä sellaisen | ilmentämisvektorin konstruoimiseksi, joka koodaa biologi- f sesti aktiivista TNF-R-proteiinia, jonka C-terminaalisena 1 aminohappona on aminohappo 161 {asparagiini}. Lisaksi \
menetelmiä kummankin edellä kuvatun TNF-R-pröteiinin luon- I
30 nossa esiintyvien liukoisten muotojen (toisin sanoen jakso- j tunnisteen nro 2 ja jäksotunnisteen nro 4 mukaisten j proteiinien liukoisten muotojen) puhdistamiseksi humaani- j virtsasta on kuvattu julkaisussa Ehgelmann, et ai. [J. j
Hioi. Chem, 265 (1990) 1531], | 35 lnterleukiini-1-reseptoreihin, joita voidaan käyt- j tää tämän keksinnön mukaisten fuusioproteiinien komponent- j | } 5 $ •s 11 teinä, kuuluvat pölypeptidit, joista on tässä keksinnössä käytetty merkintöjä tyypin X XL~lR ja tyypin II IL-1R.
Tyypin I iL-l-reseptoreita on havaittu: T-solujen ja tiettyjen muiden solutyyppien pinnalla, kun taas on olemassa 5 tutkimusraportteja tyypin II IL-i-reseptöteiden ilmentymisestä B-sölujen pinnalla. Silloin kun mitään erikois-merkintää .ei ole käytetty, tarkoittaa termi ’’IL-l-resep-tori" tässä keksinnössä yhteisesti tyypin I ja tyypin II IL-1 -reseptoreita:.
10 Niihin iL-lR-polypeptideihin, joitä voidaan käyttää tässä keksinnössä, kuuluvat tyypin I iL-lR-polypeptidit, joita on. kuvattu 14.1.1992 jätetyssä US-patenttihakemus- ·; julkaisussa nro 07/821 716; ja 21.12.1989 jätetyssä US-pa-tenttihakemusjulkaisussa nro 455 488; ja EP-patenttihake-15 musjulkaisussa nro 318 296; joiden patehttiselitykset on liitetty kokonaisuudessaan tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla. Tyypin I iL-lR-humaaniproteiiniä koodaava kloonatun cDMAm dna-jakso ja tämän koodaama aminohappo jakso on esitetty tässä keksinnössä jaksotunnis-20 teissä nro 5 ja 6. Tämä proteiini sisältää 5:69 aminohappoa, joista 20 muodostaa N-terminaalisen signaalipeptidin. Asemassa 1 oleva asparagiinihappo (Asp) -ryhmä on kypsän proteiinin ensimmäinen aminohappo, Transmembraanialue sisältää aminohapot 317 (His) - 336 (Tyr). Humaani-IL-1R:n jakso on j 25 myös kuvattu julkaisussa Sims, et ai., Proc NatlAcad. 1
Sei. USA 86 (1989) 8946. |
Aivan kuten TNF-R-pölypepti&ien suhteen oli asian- I
laita, voidaan tässä keksinnössä fmisioproteiineissa käyt- j
tää liukoisia IL—lR-polypeptidejä. Liukoisista XL-lR-poly- I
30 peptideistä puuttuu tavallisesti transmembraanialue ja j niistä puuttuu myös edullisesti sytoplasminen domeeni. !
Liukoiset IL-lR-proteiinit voivat myös sisältää osan trans·?' j ! membraanialuetta tai sytoplasmista domeenia, edellyttäen, | että liukoinen iL-lR-proteiini kykenee erittymään solusta. j 35 Esimerkkeihin liukoisista tyypin I IL-lR-polypep- 1 tideistä kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, j i j Ϊ 3 5 12 polypeptiäit, jotka sisältävät aminohappojakson, jota voidaan kuvata jakso tunnisteen nro 6 aminohapoilla y - x, jossa x on 312 - 316 ja y on -3 - 3. Toisin sanoen N-terminaalinen aminohappo on asemissa -3, -2, -1, 1, 2 tai 3 5 oleva Leu-, Glu-y Ala-, Asp-, Lys- tai Cys-ryhmä, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Liukoisen proteiinin C-terminaalinen aminohappo on asemissa 312, 313, 314, 315 tai 316 oleva Thr-, Asn-, Phe-, Gin- tai Lys-ryhmä, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Edullisiin liukoisiin IL-1R-10 polypeptideihin kuuluvat ne polypeptid.it, jotka sisältävät jakso tunnisteen nro 6 aminohapot 1 - x, jossa, x on 312 -316.
Mitkä tahansa edellä kuvatuista liukoisista tyypin Γ iL-lR-polypeptideistä voivat lisäksi sisältää signaaliin jakson, toisin sanoen jaksotunnisteessä numero 6 aminohappoina -20 - -1 esitetyn: signaalijakson. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää aiotussa isäntäsolussa toimintakykyistä erilaista signaalijaksoa {esimerkiksi hiivan signaalijaksoa) tuonnempana tarkasteltavalla tavalla.
20 Niitä tyypin II IL-lR-polypeptidejä, joita voidaan
käyttää tässä keksinnössä, ovat pölypeptidit, joita on kuvattu 16,6.1991 jätetyssä US-patenttihakemusjulkaisussanro 701 415? ja EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 46Ö 846; joiden patentti selitykset· on liitetty kokonaisuudessaan tähän 25 keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla, Soluly- I
sääteistä talteen otettujen natiivien glykosyloituneiden tyypin II IL-lR-humaaniproteiinien näennäinen suhteellinen moolimassa on SDS-PAGE :1.1a määritettynä noin tavallisesti 60 ~ 68 kilodaltöniä. Jaksotunnisteissa nro 7 ja 8 on esi-30 tetty tyypin II IL-lR-humaaniproteiinia koodaavan kloonatun cDNAin DNA-jakso ja tämän koodaama aminohappojakso. Tämä proteiini sisältää 13-aminohappoisen signaalipeptidiri, Trans- j memhraanialue sisältää aminohapot 331 (Ala) - 356 (Met) . ]
Liukoiset tyypin II IL-lR-proteiinit muodostetaan j 35 deletoimalla proteiinin C-terminaalinen osa, joka ei ole \ välttämätön IL-lm sitoutumiselle, niin että proteiini | 13 erittyy solusta. Asemassa 313 olevan kysteiinlryhmän arvellaan olevan välttämätön tyypin II il-lR-molekyylin tertiää-risen rakenteen säilymiselle sekä sille, että molekyyli kykenee sitomaan IL-I:tä> Esimerkkeihin liukoisista tyypin II 5 IL-lR-polypeptidestä sisältyvät siten polypeptiait, joissa C-terminaalinen aminohappo on mikä tahansa aminohapoista 314 - 333. Toisin sanoen liukoinen IL-1R voi sisältää jakso tunnisteessa nro 8 aminohappoina 1 - x esitetyn .aminohappo: jakson, jossa x on alueelta 314 - 333 oleva kokonaisluku.
10 Edullisiin esimerkkeihin sopivista liukoisista tyypin II IL-lR-poIypeptideistä kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, polypeptidit, jotka sisältävät jaksotunnis-teen nro 8 aminohapot 1 - x, jossa x on 33 0 - 333, Toisin sanoen liukoisen proteiinin C-terminaalinen aminohappo on 15 asemissa 33.0331, 332 tai 333 oleva Gin-., Ala-, Ser- tai Ser-ryhmä, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna, liukoiset tyypin II IL-iR-polypeptidit voivat lisäksi sisältää signaali jakson, esimerkiksi aminohappoina -13 - -1 jaksotun- f
nisteessä numero 8 esitetyn signaalijakson. Tuonnempana I
20 kuvattavalla tavalla voidaan vaihtoehtoisesti käyttää eri- j laista signaalijaksoa (esimerkiksi hiivan signaalijaksoa), j joka on toimintakykyinen käytettäväksi aiotussa isäntä- f solussa. ] Tässä keksinnössä kuvattuja määritysmenetelmiä voi- \ 25 daan tässä keksinnössä esitettyjen tiettyjen nimenomaisten ;j esimerkkien lisäksi käyttää vielä muiden liukoisten TNF-R- | ja IL-lR-polypeptidien biologisen aktiivisuuden varmistami- | seksi. Liukoinen TNF-R ja liukoinen IL-IR voidaan tunnistaa j
(ja erottaa muista 1iukenema 11omis ta membrääniin sitoutu- I
30 neista vastineistaan) erottamalla haluttua proteiinia Il mentävät kokonaiset solut soluviljelymediumista, esimerkiksi sentrifugoimalla, ja määrittämällä halutun proteiinin esiintyminen mediumista (supernatantista). Määritys soluviljelymediumista voidaan tehdä käyttäen menetelmiä, jotka 35 muistuttavat tuonnempana olevissa esimerkeissä kuvattuja menetelmiä tai jotka ovat näiden suhteen identtiset.
14 TNF-R:n ja IL-lR:n esiintyminen mediumissa viittaa siilien, että proteiini erittyy soluista ja. on siten halutun proteiinin liukoinen muoto, TMF-R- tai IL-lR-poIypeptidien N- tai C-terminänii-5 sessa päässä voi esiintyä vaihtelua sellaisten tekijöiden mukaan, kuten fuusioproteiinia yhdiSteimä-DNA-menetelmien avulla valmistettaessa käytetty isäntäsolutyyppi sekä ne tietyt nimenomaiset solut, joista proteiini puhdistetaan, silloin kun kyseessä ovat TNF-R tai IL-lR, joita ei ole 10 tuotettu ybcli s t e Irnä - DMA-men etelmillä. Tällaisen vaihtelun voidaan esimerkiksi katsoa johtuvan erilaisesta proteiinin translaation jälkeisestä muokkautumisesta erityyppisissä soluissa. N~ tai C-terminaalisen jakson vaihtelut voivat myös johtua niistä oligonukleotideista, jotka ilmentämis-15 vektoreita konstruoitaessa on, valittu TNF-R:ää tai IL-lR:ää koodaavan DNA-jakson jomman kumman tai molemman terminaalisen pään rekonstruoimiseksi, |
Muokkauksessa, esiintyvät eroavuudet voivat johtaa \
sellaisten kypsien TNF-R- tai iL-lR-proteiinien muodostumi- J
20 seen, joissa on jokin muu N-terminaalinen aminohappo kuin I
jakso tunnisteiden nro 2, 4, 6 ja 8 asemassa 1 esitetty | aminohappo,. Translaation jälkeinen muokkautuminen poistaa esimerkiksi tietyissä isäntäsoluissa aloituskodonin koodaa- j man met ioni ini ryhmän, kun taas met ioni uniryhmä säilyy 1 25 muissa isäntäsoluissa tuotettujen proteiinien N-terminaali- ] sessa päässä. On lisäksi tunnettua, että saman proteiinin j kyseäSSä ollessa N- ja C-terminaalisten päissä esiintyy f proteiinilähtömateriaalin mukaista vaihtelua. Joissakin ta- | pauke is S'a voi proteiinin jommassa kummassa terminaalisessa | 30 päässä olevan aminohapon deleetio johtua proteoyysistä, joka tapahtuu joko solunsisäisesti tai puhdistuksen aikana, i
Vaihtelevat N-terminaaliset päät voivat myös: olla tulosta |
signaalipepfeidin pilkkoutumisesta tietyissä isäntäsoluissa I
\ jostakin muusta kohdasta kuin kuvattujen jaksojen aminohap- | " | 35 pojen -1 ja 1 välistä. i § j :¾ 25
Kuten julkaisun EP-422 339 esimerkeissä 10 ja 11 sekä kuviossa 31 on kuvattu, puuttui humaanivirtsasta puhdistetusta kypsästä TKJF-E-proteiinistä, jonka muodostamiseen ei ollut käytetty yhdistelmä-DNÄ-menetelmiä, kaksi 5 N-terminaalista aminohappoa, jotka esiintyivät humaanimono-syy11 i tyyppi s es tä sölulinjasta U937 puhdistetussa TNF-R-proteiinissa, jota ei oltu valmistettu yndistelmä-DNA-mene-telmillä. Virtsasta peräisin olevan TNF-R-.n R-terminaainen aminohappo oli jakso tunnisteen numero 1 asemassa 3 oleva 10 alaniiniryhmä- Julkaisussa Engelmann, et al.: [J. Biol.
Chem. 265 {1990) 1531], on kuvattu TNF:ää sitova proteiini, joka oli puhdistettu ihmisen virtsasta N-terminaalisesta päästä eriasteisesti typistyneissä muodoissa (tätä on käsitelty tiivistelmässä ja sivulla 1 533). Yhden proteii-15 nityypin N-terminaalisen pään aminohappojakso oli Val-Ala-
Phe-Thr-Pro, joka vastaa jaksotunnisteen nro 1 mukaisia aminohappoja 5 - 9. Proteiinin muissa muodoissa oli N-terminaalisena aminohappona joko fenyylialaniini (jaksotun- I
nisteen nro :1 mukainen aminohappo 7) tai treoniini (jakso-2Ö tunnisteen nro 1 mukainen aminohappo 8). ! TNF-R- ja IL-lR-proteiinien N- ja C-terminaalisissa j päissä voi esiintyä sellaisista syistä johtuvaa vaihtelua, j joihin sisältyvät edellä tarkastellut syyt. N-terminaalinen j aminohappd voi esimerkiksi olla mikä tahansa TNF-R;n ky- } 2 5 seessä ollessa jakso tunnisteiden nro 2 tai 4 mukainen, tai IL-1R:n kyseessä ollessa jaksotunnisteiden nro 6 tai 3 f mukainen, asemissa 1-5 oleva aminohappo. C-terminaalista ,j
päätä voidaan typistää tarkoituksellisesti iImentämisek- I
torien konstruoinnin aikana (esimerkiksi konstruoitaessa j
30 edellä olevan kuvauksen mukaisia liukoisia proteiineja I
j koodaavia vektoreita) tai se voi johtua eri tavalla ta- 1 pähtuneesta muokkautumisesta, jossa esimerkiksi voi poistua j korkeintaan noin 5 C-terminaalista aminohappoa, j
Muissa TNF-R- ja IL-lR-polypeptideissä, joiden j 35 käyttö voi tulla kysymykseen, on haluttu biologinen aktii- | visuus jäljellä mutta niiden jakso voi poiketa natlivista ] \ \ ] 16 jaksosta siinä mielessä, että natiiviin jaksoon on lisätty tai siitä on poistettu aminohappoja tai siinä olev(i)a aminohappo (ja) on korvattu jo (i) Häkin muulla (muilla) aminohapot!) 11a. Tällaisten proteiinien biologinen aktiivisuus 5 voidaan varmistaa tässä keksinnössä kuvattuja määrityksiä käyttäen.
Tässä esitetyn TNF-R:n ja lL-l.R:n johdannaisiin kuuluu myös useita primäärisen proteiinin erilaisia raken-nemuotoja, joiden biologinen aktiivisuus on säilynyt.
10 TNF-R- tai IL-lR-proteiini voi esimerkiksi siinä olevien ionisoituvien amino- ja karboksyyliryhmien vuoksi olla happamien tai emäksisten suolojen muodossa tai se voi olla neutraalissa muodossa- Yksittäisiä aminöhappöryhmiä voidaan myös modifioida hapettamalla tai pelkistämällä.
15 Primääristä aminohapporakennetta voidaan modifioida muodostamalla kovalenfctisia. tai aggxegatiivisia konjugaat-teja muiden kemiallisten, ryhmien kanssa, kuten glykosyyli-ryhmipn, lipidien, fosfaatin, asetyyliryhmien ja muiden näitä vastaavien ryhmien kanssa. Ko'valenttisia johdannaisia 1 2Q. valmistetaan liittämällä tiettyjä nimenomaisia funktionää- ] lisiä ryhmiä aminohappojen sivuketjuihin tai N- tai C-terminaalisiin päihin. Luonnossa esiintyviä variantteja voi syntyä RNA:n vaihtoehtoisista silmukoitumistapahtumista.
Muihin proteiineihin, joita voidaan käyttää tässä 25 esitetyssä fuusioproteiineissa, kuuluu TNF-Rm tai IL-lR:n muiden polypeptidien kanssa muodostamia konjugaatteja, joita voidaan valmistaa N-terminaalisinä tai C-terminaalisina fuusioina syntetoimalla viljelmissä. yhdistelmS_DNA-inenet:el" I
mien avulla. Esimerkiksi konjugöitu peptidi voi olla prote- ) 30 i itiin N-terminaali s el la alueella oleva signaali (tai johto) -peptidijakso, joka translaation kanssa samanaikaisesti tai translaation jälkeen ohjaa proteiinin siirtymistä synteesi-paikaltaan toimintakohtaänsa solumembraariin sisä- tai ulkopuolella tai soluseinämäu sisä- tai ulkopuolella (esimer-35 kiksi hiivan a-tekijän johtojakso)., Fuusioproteiinit voivat sisältää peptidejä, joita on lisätty fuusioproteiinin puh- 17 distamisen tai tunnistamisen edistämiseksi. Tällaisiin pep-tideihin kuuluvat esimerkiksi poly-His tai antigeeniset tunnistuspeptidit, joita on kuvattu US-patenttijulkaisussa nro 5 Oli 912 ja julkaisussa Hopp, et ai., Bio/Technology 6 5 (1988) 1204. Yksi tällainen peptidi on FLAG®-peptidi, Asp-
Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), joka on erittäin antigeeninen ja josta saadaan käyttöön spesifiseen monoklo-naaliseen vasta-aineeseen palautuvasti sitoutuva epitooppi, jonka avulla ilmennetty yhdistelmä-proteiini on mahdollista 10 määrittää nopeasti ja puhdistaa vaikeuksitta.. Tämä jakso pilkkoutuu myös spesifisesti naudan limakalvon enterokinaa-silla kohdasta, joka sijaitsee välittömästi vierekkäisten Asp-Lys-ryhmien jälkeen, Fuusioproteiinit, joiden pääteryhmänä on tämä peptidi, voivat myös olla vastustuskykyisiä \ 15 solunsisäiselle pilkkoutumiselle E. cölissa. Muriinihybri- | dooma, jolle on annettu nimitys 4E11, tuottaa monoklonaa- i lista vasta-aihetta, joka sitoo peptidiä DYKDDDDK tiettyjen | divalenttisten metallikationeiden läsnä ollessa (US-patent- f 'tijulkaisussa 5 Oli 912 kuvatulla tavalla), ja se on talle- j 20 tettu talletuslaitokseen American Type Culture Collection f hakunumerolla HB 9 259. j Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut fuusioprote- | iihit. sisältävät sellaista TNF-R:ää tai sellaista IL-lRtää, j joissa glykosylaatio on tapahtunut joko näiden omalla luon- j 25 täisellä tavalla tai tästä poikkeavalla tavalla. Hiivassa tai nisäkäsilmentamisjärjestelmissä, esimerkiksi COS-7-so- 1 luissa, ilmennettyjen TNF-R:n ja lL-lR:n Suhteellinen moo- | limassa ja glykosyl oi tumistapa voi olla ilmentämisjärjes- j telmän mukaan samanlainen tai hieman erilainen kuin natii-30 veissa molekyyleissä. Ei-glykolysoituneita proteiineja saadaan yhdistelmä-proteiinien ilmentämisestä bakteereissa, kuten E, colissa. Proteiineja, joissa on inaktivoituja N-glykösylaatiokohtia, voidaan tuottaa oligonukleotidisyn.-teesillä ja ligaatiolla tai kohdemutageneesimenetelmillä.
35 Näitä mutatoituneita proteiineja voidaan valmistaa hyvästä saannosta tinkimättä homogeenisessa ja vähän hiilihydraat- i j
S
J
::¾ 1 18 tia sisältävässä muodossa hiivailmentämisjärjestelmiä käyttäen. Luonteenomainen piirre eukaryoöfcfcisissa proteiineissa oleville N-glykosylaatiokOh.dille: on aminohappo triplet: ti.
Asn-Äi-Z, jossa Aj on mikä tahansa aminohappo paitsi Pro ja 5 Z on Ser tai Thr. Se sivuketjun amino ryhmä, johon hiilihydraatti liittyy kovalenttisesti, tulee tässä jaksossa olevasta, asparagiinistä. Tämä kohta voidaan hävittää korvaamalla Asn toisella aminohapolla tai ryhmällä Z, poistamalla Asn tai Z tai liittämällä aminohappojen A: ja Z
10 väliin aminohappo, joka ei ole Z, tai aminohappojen Asn ja Αχ väliin jokin muu aminohappo kuin Asn. Tunnettuihin menetelmiin proteiineissa olevien N-glykosylaatiokohtien inak~ tivoimiseksi sisältyvät tIS-patenttijulkaisussa 5 071 972 ja julkaisussa EP-27G 846 kuvatut menetelmät. Esimerkkejä tyy-15 pin II humaani-IL-IR:ssä olevista KT-glykosylaatiokohdista ovat jaksotunnisteessä numero 8 olevat aminohapot 53 - 55, 59-61, 99-101, 206 - 208 ja 264 - 266. Tyypin I IL-1R-proteiinissa (jaksotunniste nro 6) esiintyy potentiaalisia ΚΓ-glykosylaatiokohtia aminohappojen 80 - 82, 173 - 175,
20 213 - 215, 229 - 231, 243-245 ja 277 - 279 kohdalla. I
Kuvioissa 2A - 2B esiintyy N-glykosylaatiokohtia TNF-R:n aminohappojen 171 - 173 ja 358 - 360 kohdalla.
Kysteiiniryhmät, jotka eivät ole välttämättömiä biologiselle aktiivisuudelle, voidaan deletoida tai korvata 25 muilla aminohapoilla tarpeettomien tai vääränlaisten molekyylin sisäisten disulfidisiltojen muodostumisen ehkäisemiseksi molekyylien renaturoituessa. Voidaan esimerkiksi f deletoida kyse Uniryhmä, joka on kuvioiden 2A - 2B mukaisen | TNF-R:n jakson asemassa 178. US-patenttijulkaisussa nro j 3 0 4 518 584 on kuvattu kahdemutagenee.sin käyttö proteiinissa: | olevien kysteiiniryhmien deiätoimiseksi tai korvaamiseksi. ?
Muihin lähestymistapoihin mutagereesin aikaansaamiseksi :{ liittyvät vierekkäisten kaksi emäksisten aminohapporyhmien .1 modifiointi sellaisissa hlivajärjestelmissä tapahtuvan il- j 35 mentymisen edistämiseksi, joissa esiintyy KEX2-proteaasi- ] aktiivisuutta. Julkaisussa EP-212 914 on kuvattu kohdemuta- j ] 19 geneesin käyttö proteiinissa olevien KEX2-proteaasin muok-kauskohtien inaktivoimiseksi. TNF-R-.n ja IL-lRm biologisen aktiivisuuden säilyttämiseksi on korvaamisesta tuloksena edullisesti homologisia tai konservatiivisesti substituoi-5 tuja jaksoja, mikä tarkoittaa sitä, että tietty aminohappo-ryhmä korvataan ryhmällä, jolla on samantyyppiset fysikoke-mialliset ominaisuudet. Esimerkkeihin konservatiivisista substituutioista kuuluvat yhden alifaattisen ryhmän korvaaminen toisella, kuten Ile:n, Vai:n, Leu:n tai Ala:n korvaa-10 minen toinen toisillaan, tai yhden poolisen ryhmän korvaaminen toisella, kuten Lys:n ja Arg:n; Glu:n ja Asp:n; tai Glnm ja Äsn:n väliset korvaukset, limnetaan muita tällaisia konservatiivisia korvaamisia, esimerkiksi sellaisten kokonaisten alueiden korvaamisia, joiden hydrofobiset omi-15 naisuudet ovat samanlaisia. Lisäksi tiettyjä hiomaani-, muoriini- tai muiden nisäkäslajien TKTE-R-molekyyli en välillä olevat tietyt nimenomaiset aminohappoerpavuudet vii-t haavat muihin konservatiivisiin substituutioihin:, joita voidaan tehdä TNF-R:n tai IL-lR:n olennaisia biologisia ominaisuuk- | 20 siä muuttamatta. \
Natiivia aminohappojaksoa voidaan muuttaa millä ta- j hansa usealla tunnetulla menetelmällä. Mutaatioita voidaan | valmistaa tiettyihin nimenomaisiin hakuksiin syntetoimalla | oligonukleotideja, jotka sisältävät mutatoidun jakson, jon- | 25 ka molemmin puolin on restriktiokohdat, joiden avulla tämä j kyetään ligatoimaan natiivin jakson fragmentteihin. Ligaa- ] ti on jälkeen koodaa tulokseksi saatu rekonstruoitu jakso j analogia, jossa on haluttu aminohappoiusertio:, -subs ti- i
tuutio tai -deleetio. I
30 Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää oligonukleotidi- Ί ... | kohdemutageneesimenetelmiä sellaisen muunnetun geenin ai- i i kaansaarniseksi, jossa on vaaditun substituution, deleetion j tai insertion mukaiset tietyt nimenomaiset kodonit. Kuvaa- j , i
via esimerkkejä edellä kuvattujen muutosten tekemisestä on I
35 esitetty julkaisuissa Walder, et ai. [Gene 42 (1986) 133]; |
Bauer, et ai. [Gene 37 (1985) 73] ; Craik [BioTeehniques, | $ j $ 20 (tammikuu 1985} 12 - 19] ; Smith, et ai. [Genetic Engineer ring: Principles and Methods, Plenum Press (1981)]; ja soveltuvia menetelmiä on kuvattu US-patenttijulkaisuissa nro 4 518 584 ja 4 737 462, jotka on liitetty tähän keksin-5 toon siihen oikeuttavien säännösten nojalla.
Aminohappojakson variantti on edullisesti ainakin 80-%risesti identtinen ja edullisimmin ainakin 9Ö-%risesti identtinen natiiviin jaksoon verrattuna. Samanlaisuusaste voidaan määrittää esimerkiksi vertaamalla jaksoa koskevaa 10 informaatiota käyttäen GAP-tietokoneohjelman versiota 6,0, joka on saatavina laitoksesta University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-ohjsimassa on hyödynnetty Needlemanin ja Wunschin. [J. Mol. Bio!. 48 (1970) 443] kohdistusmenetelmää, sellaisena kun se on uudistettu 1.5: julkaisussa Smith ja Waterman (Adv. Appi. Math. 2 (1981) 482], GAP-ohjelmassa on pääpiirteittäin esitettynä kysymys j samanlaisuuden määrittämisestä sen suhteen avulla, joka saadaan jakamalla samanlaisten kohdistettujen symbolien (toisin sanoen nukleotidien tai aminohappojen) lukumäärä 20 niiden symbolien lukumäärällä, jotka ovat lyhyemmässä näistä kahdesta jaksosta. Edullisiin GAP-ohjelman muuttujien | oletusarvoihin kuuluvat (1) nukleotidien unaarinen vertai- i
lumatriisi (tämä sisältää arvon 1 identtisiä tuloksia var- J
ten ja arvon 0 ei-identtisiä tuloksia varten) ja J
25 Gribskov'in ja Burgess'in, Mucl, Acids Res. 14 (1986) 6745, 'f painotettu vertailumatriisi sen mukaisessa muodossa, joka j on kuvattu julkaisussa Schwartz ja Dayhoff, eds., Atlas of s
Protein Sequence and Structure, Matronal Biomedical j
Research Foundation, s. 353 - 358 (1979); (2) 3,0:n suurui- j 30 nen vähennys kustakin aukosta ja yksi ylimääräinen 0,10:· n suuruinen vähennys kussakin aukossa olevasta kustakin sym- | bolista; ja (3) vähennykset jätetään suorittamatta päissä j
olevien aukkojen kyseessä ollessa. I
Edellä kuvattujen IL-lR-polypeptidlen tilalla voi- j 35 daan keksinnön mukaisesti valmistetuissa fuusioproteii- j neissa käyttää muita proteiineja, jotka kykenevät estämään s
S
| 21 IL—l:n sitoutumisen, soluissa oleviin reseptoreihin in vivo -olosuhteissa. Tällaisiin proteiineihin, joita tavallisesti nimitetään IL-I;n reseptoriantagonisteiksi, sisältyvät tavallisesti proteiinit, joita on kuvattu julkaisuissa Eisen-5 berg, et ai. [Nature 343 (1990) 341], Hannuin, et ai.
[Nature 343 (1990) 336] ja Carter, et ai. [Nature 344 (1990) 633], jotka on liitetty kokonaisuudessaan tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla. Nämä antagonistiprot-eiinit sitoutuvat IL-I:n reseptoreihin mutta 10 niillä ei ole IL—i:tä muistuttavaa aktiivisuutta (ne eivät välitä signaalia tai tuota muulla tavoin niitä biologisia vaikutuksia, jotka ovat tulosta IL~l:n sitoutumisesta solujen IL-1-reseptoriin') . Nämä antagonistiproteiin.it kilpailevat IL-1:n kanssa sitoutumisesta endogeeni s i in IL-1:n 15 reseptoreihin ja inhiboivat siten IL~l:n välityksellä tapahtuvia biologisia vaikutuksia in vivo -olosuhteissa.
Yhdistelmä-fuusioproteiineja koodaavat DNA-jaksot Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön eristettyjä DNÄ-jaksoja, jotka koodaavat edellä kuvattuja fuusiopro-20 teiineja. Kyseistä fuusioproteiinia koodaava DNA-jakso konstruoidaan käyttäen: yhdistelmä-DNA-ineneteimiä IL-1R- tai j TNF-R-polypeptidejä koodaavien DNA-fragmenttien liittämi- i seksi asiaankuuluvaan ilmentämisvektoriin. TNF-R:ää koodaaman DNA-fragmentin 3'-puoleinen pää ligatoidaan (peptidi-25 kytkijäjakson välityksellä) IL-1R:ää koodaavan DNA-frag mentin 5'-puoleiseen päähän siten, että jaksojen lukukehykset ovat samassa vaiheessa, jotta mRNA:n translaatiosta on mahdollista saada yksi biologisesti aktiivinen fuusiopro-teiini. Vaihtoehtoisesti voidaan lL-iR:ää koodaavan DNA- f 30 fragmentin 3'-puoleinen pää ligatoida (peptidikytkijäjakson ! välityksellä) TNF-R:ää koodaavan DNA-fragmentin 5’-puolei- | seen päähän menetellen niin, että jaksojen 1ukukehyks e t ovat samassa vaiheessa, jotta mRNA: sta on mahdollista saada translaatiossa yksi biologisesti aktiivinen fuusioprote-35 iini. Samaan lukukehykseen voidaan ligatoida vielä yksi TNF-R:ää koodaava jakso sellaisen jakson aikaansaamiseksi, j | 22 joka koodaa kahta TNF~ R-polypeptidiä ja yhtä iL-lR-polypep-tidiä sisältävää fuusioproteiinia. IL-1R:ää koodaava jakso sijoitetaan edullisesti TNF-R:ää koodaavaan (koodaaviin) jaksoon (jaksoihin) nähden vastasuunkaan. Vaikkakin fuusio-5 proteiini voi TNF-R-peptidin (peptidien) ohella sisältää kahta XL-lR-polypeptidiä, on edullista käyttää yhtä IL-lR:ää.
Yhdestä IL-1R:stä saadaan haluttu korkean affiniteetin IL-l:n sitomisaktiivisUus ilman niitä mahdollisia haittoja, jotka syntyvät toisen IL-lR:n lisäämisen aiheuttamasta fuu-10 sioproteiinin koon suureiitumisesta. Tällaisiin haittoihin voi kuulua vektorin konstruktiomenetelmien tuleminen monimutkaisemmiksi ja mahdollinen halutun proteiinin ilmenty-mistason pieneneminen. Toisessa tämän keksinnön sovellu-tusitiuodossa ligatoidaan TNF-Rtää koodaava DNA-jakso kytki-15 jajaksoon, joka puolestaan ligatoidaan toiseen TNF-Rtää koodaavaan j aksoon.
N-terminaalista signaalijaksoa koodaava DNA-jakso voidaan säilyttää N-terminaalista polypeptidiä koodaavassa |
DNA-jaksossa, kun taas myötäsuuntaan sijaitsevan (sijait- I
20 sevien) DNA-jakso(je)n läpiluvun mahdollisesti, estävät lo- j petuskodonit hävitetään. Käänteisesti pitää paikkansa, että ) C-terminaalista polypeptidiä koodaavaan DNA-jaksoon ;jät-e- | tään tavallisesti translaation lopettamiseen tarvittava j
lopetuskodoni, Signaalijaksoa koodaava DNA on edullista I
.25 poistaa muista DNA-jaksoista kuin N-terminaalista polypep- \ tidiä koodaavista jaksoista. |
Haluttua peptidikytkijäjaksoa koodaava DNA-jakso 1 voidaan liittää TNF-R:ää tai IL-lR:ää koodaavien DNA-jak- | sojen väliin näiden kanssa samaan lukukehykseen käyttäen | 3D mitä taliansa sopivaa tavanomaista menetelmää. Esimerkiksi j
TNF-R:äa tai IL-lR:ää koodaavien jaksojen väliin voidaan I
ligatoida kemiallisesti syntetoitu o1igonukleotidi, joka koodaa kytkljäjaksoa ja joka sisältää asianmukaiset res-triktioenäonukleaasin katkaisukohdat. Vaihtoehtoisesti voi 35 kemiallisesti syntetoitu DNA-jakso sisältää jakson, joka on komplementaarinen joko TNF-R:n tai iL-lR.-n 3 '-puoleisen 23 terminaalisen pään suhteen (ilman lopetuskodonia), jota seuraa kytkijäjaksoa koodaava jakso, jonka jälkeen tulee sellainen 5’-puoleisen terminaalisen pään suhteen komplementaarinen jakso, joka vastaa jompaa kumpaa proteiineista 5 TNF-R tai IL—1R. Tämän jälkeen käytetään oligonukleotidi-kohdemutageneesia kytkijajaksoa koodaavan jakson liittämiseksi vektoriin, joka sisältää TNF-R:n ja lL-lR:n suoran fuusion. Toisessa menetelmässä käytetään sellaisilla aluJo keilla tehtyjä polymeraasiketjureaktioita, joihin sisältyy 10 peptiöikytkijäjaksoa koodaayia osittain yksinauhaisiä seg menttejä. PCR:n avulla muodostetut kahta erilaista proteiinia koodaavat DNA-fragmentit voidaan liittää yhteen antamalla kunkin fragmentin terminaalisessa päässä olevien yksinauhaisten kytkijäjaksöä koodaavien segmenttien liittyä 15 pituussuunnassa yhteen. Edullisia menetelmiä kytkijäjaksoa j koodaavan DNA-segmentin liittämiseksi TNF-R-.n ja IL-lRm f DNA-jaksojen väliin (tai kahden TNF-R-X3NA-jakson väliin) on kuvattu tuonnempana olevissa esimerkeissä 11 ja 12.
TNF-Rjää ja IL-lR:ää koodaavia DNA-jaksoja voidaan 2D eristää millä tahansa sopivalla tavanomaisella menetelmällä, joka soveltuu käytettäväksi tämän keksinnön mukaista j fuusioproteiinia koodaavieii DNA-jaksojen konstruoimisessa. j
Mikro-organismissa ilmennettäviä fuusioproteiineja koodaa- | vat DNA-jaksot eivät edullisesti sisällä yhtään intronia, | 25 jotka voisivat lopettaa DNA: n transkription mRNA:ksi i ennenaikaisesti; transkription ennenaikainen lopettaminen voi olla haluttua esimerkiksi silloin, kun tästä on tulok- 1 sena mutantteja, joiden C-terminaaliset päät ovat typisty- ! neet edullisella tavalla, joista kuvaava esimerkki on trans- \
30 membraanialueen deleetio sellaisen liukoisen reseptorin J
aikaansaamiseksi, joka ei ole sitoutunut solumemkraaniin, 1
Sopivia menetelmiä, tyypin I ja, tyypin II lL-TR::n cDNA:n j kloonaamiseksi ovat menetelmät, joita on esitetty esiiiier- | keissä 8 ja 9, västäavassa järjestyksessä ilmoitettuna. j 35 W-R:ii cDNA voidaan eristää menetelmillä, joihin kuuluvat j esimerkissä 3 selitetyt menetelmät. j \ )
S
24 TNF-R:n koodaava jakso voidaan hankkia käyttöön eristämällä TNF-.R: ää koodaava jakso yhdistelmä-cDNA- tai genomin DNA-kirjasteista. cDNA-kirj'asto konstruoidaan edullisesti hankkimalla käyttöön nisäkkään TNF-R:ää ilmentävää 5 polyadenyloitua mRNA-ta tietystä nimenomaisesta solulin-jasta, esimerkiksi humaanifibroblastisplulinjasta wi-26 VA4 {ATCC CCL 95.1) ja käyttämällä tätä mRNA: ta t empi aa t tina ka ks inauha is en cDNA:n syntetoimiseksi. Tämän jälkeen kaksi-nauhainen cDNA pakataan yhdistelmä-vektoriin, joka tuodaan 10 isäntäsoluun (esimerkiksi asiaankuuluvaan E. coli -kan taan) , jota sitten kasvatetaan. cDNA-kirjaston sisältämät TNF-R-jaksot voidaan tunnistaa seulomalla kirjasto asiaankuuluvalla nukleiinihappokoettimella, joka kykenee hybridi-soi tumaan humaani-TNF-R:n cDNA: lian. Toinen kloonausmene-15 telinä*, jota voidaan käyttää, on tuonnempana esimerkissä 3 kuvattu suora ilmentämismenetelmä. Vaihtoehtoisesti voidaan TNF-R-proteiineja koodaavia DNA-molekyylejä koota yhteen j ligatoimalla synteettisiä öligQnukleötidxalayksikköjä, jot- j ka joko kokonaisuudessaan tai osittain vastaavat kuvioiden j 20 2 a - 2B mukaista jaksoa, täydellisen koodaavan jakson 1 $ aikaansaamiseksi. j
Muita cDNA-klooneja voidaan: eristää muista nisä- I
käsiaseista peräisin olevista CDNA-kirjastoista lajien vä- j lisellä hybridi säätiöllä.. TNF-R:ää tai IL-lR:ää koodaava ] 25 DNA voidaan sen käyttämiseksi hyferidisoinnissa varustaa kova- 1 lenttisella leimalla käyttäen havaittavaa ainetta, kuten j fluoresoivaa ryhmää, radioaktiivista atomia tai kemilumine- |
soivaa ryhmää, asiaankuuluvan alan ammattikokemuksesta tun- I
netuilla menetelmillä. j 30 TNF-reseptoreja ja lL-1-reseptoreja koodaavat j
useimpien nisäkäsgeenien tavoin otaksuttavasti monieksoni- I
| set geenit. Sellaisten vaihtoehtoisten mRNA-konstruktioi- j i
den, joiden voidaan katsoa syntyneen transkription jälkeen I
tapahtuneista erilaisista mRNA:n s i Imuko in t i t. apah tumi s ta ja j 35 joissa ori siinä määrin suuria tässä keksinnössä kuvattujen j cDNA-mo1ekyy1ien suhteen identtisiä alueita tai samanlaisia j 25 alueita, että ne koodaavat biologisesti aktiivista TMF-R:ää tai IL-1R:ää, katsotaan olevan käyttökelpoisia tässä valmistettavien fuusioproteiinien valmistamisessa.
Liukoisia TNF-R- ja IL-lR-polypeptidejä koodaavaa 5 DNA: ta voidaan valmistaa millä taliansa useista tavanomaisista menetelmistä. Haluttua liukoista poiypeptidiä koodaa-va DNA-fragmentti voidaan j atkokloonata iImentämisvektori in. DNA-fragmentteja voidaan valmistaa pilkkomalla täysimittainen kloonattu DNA-jakso restriktioendonukleaasilla 10 ja eristää ne elektroforeesilla agaroosigeeleissä. Vaihtoehtoisesti voidaan haluttu DNA-jakso syntetoida kemiallisesti tunnettuja menetelmiä käyttäen. Halutun DNA-fragmentin liittämiseksi ilmentämisvektoriin voidaan käyttää restriktioendonukleaasin katkaisukohdan (-kohtia) sisältä-15 viä kytkijäjaksöja tai fragmentti voidaan pilkkoa tässä luonnostaan esiintyvistä katkaisukohdista.
Haluttua liukoista proteiinifragmenttia koodaavan DNA-jakson eristämiseen voidaan käyttää myös tunnettuja j
polymeraasiketjureaktio (PCB:) -menetelmiä. Tätä menetelmää J
20 on kuvattu tuonnempana olevissa esimerkeissä. I
Toisessa ratkaisutavassa voidaan käyttää entsymaat- \ tista käsittelyä (käyttäen Bal 31 -eksonukleaasia) termi- j
naalisten. nukleotidien deletoimiseksi DNA-fragmentista sei- I
\ laisen fragmentin aikaansaamiseksi, jolla on tietty nimen;- | 25 omainen haluttu terminaalinen pää. Kaupallisesti saatavilla olevia kytkijäjaksoja ovat sellaiset jaksot, joita 'voidaan. | ligatolda Bal 31:llä tehdyn pilkkomisen synnyttämiin j
tasaisiin päihin ja jotka sisältävät restriktioendo- I
nukleaasi(e)n kaekaisukohdan (-kohtia). Vaihtoehtoisesti j 30 voidaan syntetoida o 1 i. gonukl eo c i de j a, joiden avulla DNA- j i
fragmentin N- tai C-terminaalinen pää voidaan rekonstruoida I
haluttuun kohtaan. Oligonukleotidi voi sisältää restriktio-endonukleaasin katkaisukohdan, joka sijaitsee vastasuun-nassa haluttuun koodaavaan jaksoon nähden ja se voi asettaa 35 aloituskodonin (ATG) koodaavan jakson N-terminaalisen pään kohdalle.
:26 TNF-R:n ja IL~lR:n DNA-jaksot voivat erota jaksö-tunnisteissä nro 1* 3, 5 ja 7 esitetyistä DNA-jaksoista.
Esimerkiksi geneettisen koodin tunnetun degeneratiivisuuden vuoksi voi samaa aminohappojaksoa koodaavissa nnkieotidi-5 jaksoissa olla huomattavaa vaihtelua. DNA-jaksojen* jotka kykenevät; 'hybridisortumaan jäksötuimisteiden nro 1, 3, 5 ja 7 mukaisiin DNA-jaksoihin kohtuullisen rajoittavissa olosuhteissa (55 °C, 5 x SSC) ja. jotka koodaavat biologisesti: aktiivista TNF-R-· tai iL-lR-polypeptidiär ka t sotaankin.
10 tässä keksinnössä olevan TNF-R :ää koodaavia tai iL-lR^ää koodaavia DNA-jaksoja, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Nätiiveihin DNA-jaksoihin voidaan: tehdä tarkoituksellisesti mutaatioita, esimerkiksi edellä kuvattujen ami-nohapposubstituutioiden, -deleetioiden ja -insertioiden 15 aikaansaamiseksi. Tietyt näistä mutaatioista eivät ilmenny lopullisessa proteiinituotteessa. Esimerkiksi ilmentämisen tehostamiseksi voidaan tehdä nukleotidisubstituutioita, joiden tarkoituksena on pääasiassa välttää silmukoiden muodostumista transkriptiossa syntyvän mRNA:n sekundääri-20 rakenteeseen (tätä on käsitelty julkaisussa EP-75 444, joka on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla). Nukleotidijaksoon voidaan tehdä muita muutoksia sellaisten kodonien aikaansaamiseksi, joiden translaatio valitussa isännässä on muita vaihtoehtoja tehokkaampaa, 25 esimerkiksi tunnetut E. colin suosimat kodonit E. colissa tapahtuvan ilmentämisen kyseessä ollessa. Polymeraasiketjureaktioissa voi myös tapahtua vaikutuksettomia mutaatioita (DNA-jakson muutokset, jotka eivät muuta jakson koodaamaa aminohappojaksoa). Yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuo-30 dossa muutetaan jaksotunnisteen numero 5 {tyypin I IL-1R) nukleotidi numero 437 T:stä C:ksi. Tämä vaikutukseton mutaatio oli syntynyt polymeraasiketjureaktion aikana. \ \
Nukleotidijaksoissa olevien mutaatioiden on luon- j nollisesti oltava sellaisia, että koodaavien jaksojen luku- | 35 kehyksen oikea vaihe säilyy. Mutaatiot eivät edullisesti \ muodosta komplementaarisia alueita, jotka hybr i di s o i tu i- | | 27 s ivat ja muodostaisivat sekundäärisiä mRNA-rakenteita., kuten silmukoita tai hiusneularakenteita, jotka vaikuttaisivat haittaavasti fuusiopro.teiini-mRNA:n translaatioon.
Tästä keksinnöstä saadaan siten käyttöön tämän kek-5 sinnon mukaisia DNA-jaksoja, jotka koodaavat edellä kuvattuja fuusioproteiineja, joissa fuusiqproteiinin DNA-jaksossa oleva kukin TNF-R:n DNA-jakso on: (a) jokin sellainen DNA-jakso, joka on peräisin nisäkkään natiivin TNF-R-geenin koodaavasta alueesta (esimerkiksi jaksotunnisteiden numero 10 1 tai 3 mukaisesta koodaavasta alueesta peräisin olevasta cDMA:sta); (O) jokin sellainen DNA-jakso, joka kykenee hyb- ridisoitumaan kohdan (a) mukaiseen DNA-jaksoon kohtalaisesti rajoittavissa olosuhteissa (5Ö °C, 2 x SBC) ja joka koodaa biologisesti aktiivista TNF-R:ää; tai (e) jokin sel-15 lainen DNA-jakso, joka on geneettisen koodin vuoksi ctege-neratlivinen kohdissa (a) tai (b) määriteltyjen DNA-jaksojen suhteen ja joka koodaa biologisesti aktiivista TNF-R:ää. Fuusioproteiinin DNA-jakso voi samalla tavoin > sisältää -sellaista, (sellaisia) IL-lR:ää koodaavaa (koodaa- f 2D Via) DNA-jakso ( j) a, jO(t)ka on (ovat) (a,) jokin sellainen DNA-jakso, joka on peräisin nisäkkään natiivin IL-lR-geenin. \ koodaavasta alueesta (esimerkiksi jakst»tunnisteiden numero ) 5 tai 7 mukaisesta koodaavasta alueesta peräisin olevasta ]
cDNA:sta); (b) jokin sellainen DNA-jakso, joka kykenee hyb- I
25 ridisoitumaan kohdan (a) mukaiseen DNA-jaksoon kohtalaisesti rajoittavissa olosuhteissa (55 °C, 5 x SSC) ja joka | koodaa biologisesti aktiivista IL-lR:ää; tai (c) j okin ] sellainen DNA-jakso, joka on geneettisen koodin vuoksi \ degeneratiivinen kohdissa (a) tai (b) määriteltyjen DNA- | 30 jaksojen suhteen ja joka koodaa biologisesti aktiivista j
ILi-lR: ää. I
i
Yhdistelmä-fuusioproteiinien ilmentäminen | Tästä, keksinnöstä saadaan käyttöön yhdistelmäil- | mentämisvektoreita tässä esitettyjä fuusioproteiineja koo- | 35 daavan DNA:n ilmentämiseksi. Tämän keksinnön mukaiset | yhdistelmä-ilmentämisvektorit ovat replikoituvia DNA-kon- j | 28 struktioita, jotka sisältävät synteettisen tai cDNA:s ta peräisin olevan DNA-jakson, joka koodaa yhtä edellä kuvatuista fuusioproteiineista ja joka on liitetty toiminnallisesti sopiviin transkription ja translaation säätely-5 yksikköihin. Esimerkkeihin geneettisistä yksiköistä, joilla on säätelytehtävä geenien ilmentämisessä, kuuluvat transkription promoottorit, operaattorit tai enhancer-jaksot, sopivia mRNA-ssa olevia ribosomin sitoutumiskohtia koodaava jakso sekä asiaankuuluvat transkription ja translaation 10 aloitus- ja lopetusjaksot- Vektoriin voidaan lisäksi liittää ominaisuus, joka antaa sille kyvyn replikoitua isännässä ja joka tavallisesti on replikaation alkukohta, sekä selektiögeeni transformanttien tunnistamisen edistämiseksi. Ilmentämisvektoreissa käytetyt säätely-yksiköt ovat täval-15 llsesti peräisin nisäkkäiden, mikrobien, virusten tai hyönteisten geeneistä. Voidaan myös: käyttää retroviruksista peräisin olevia ilmentämisvektoreita.
DNAralueet ovat toiminnallisesti liitettyjä, kun. ne ovat toiminnallisessa suhteessa keskenään. Fuusiöproteiinia 20 koodaavan DNA-jakson sanotaan olevan liitettynä toiminnat- j lisesti yhteen tai useampaan edellä kuvattuun säätely-yksikköön, kun fuusioproteiinin DNA-jakso osallistuu transkriptioon tai tulokseksi saatava mRNA osallistuu translaatioon tämän (näiden) säätelyelement(t)i(e)n ohjaamana* 25 Trans f ormo i du t isäntäsolut ovat soluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu vieraalla DNA: 1 la käyttäen yhdistelmä-DNA-menetelmiä. Tässä keksinnössä vieras DNA j sisältää tässä esitettyä fuusiöproteiinia koodaavan jakson. f
Isäntäsolut voidaan transformoida vieraan DNA:n kloonaus- 30 tai monistus tarkoituksissa tai ne voidaan transformoida \ | ilmentämisvektorilla fuusioproteiinin tuottamiseksi asiaankuuluvien promoottorien ohjaamina. Sopiviin isäntäsoluihin ] kuuluvat prokaryootit, hiivasolut tai korkeampien eukary- j oottien solut. Asianmukaisia kloonaus- ja ilmentämis- j 35 vektoreita, jotka soveltuvat käytettäviksi bakteeri-, sie— j ni-, hiiva- ja nisäkässoluisännissä, on kuvattu teoksessa ] ! 29
Pouwels, et al, (Cloning Vectors: A Laboratory Manual,
Elsevier, New York, 1985), jossa olevat asiaankuuluvat selitykset on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla, Fuusioproteiinin valmistamiseen voidaan 5 myös käyttää soluttornia translaatiojärjestelmiä, joissa käytetään tämän keksinnön mukaisista DNA-konstruktiäistä peräisin olevia RNA-molekyyiej ä.
Prökaryootteihin kuuluu gramnegatiivisiä tai gram-pösitiiyisia organismeja. Prokaryoottiset ilmentämisvek-10 torit sisältävät tavallisesti yhden tai useamman fenptyyp-pisesti selektöitavissa olevan markkerin, esimerkiksi sellaisia proteiineja koödaavan geenin, joka tuottaa antibioottiresistenssin tai täydentää auksotrofisen kasvuvaatimuksen, sekä isännän tunnistaman replikaation alkukohdan 15 isännässä tapahtuvan monistumisen varmistamiseksi. Esimerkkeihin transformaatioon soveltuvista sopivista prökary-oottisista isännistä kuuluvat E, coli, bacillukset, kuten Bacillus: subtilis, Salmonella typhimurium ja useat Pseudomonas-, Streptomyces- ja Staphylococcus-sukujen erilaiset 20 lajit, vaikka harkinnan mukaan on mahdollista käyttää muitakin bakteereita. j
Bakteerikäyttöön käyttökelpoiset ilmentämisvektarit | voivat sisältää selektöitavissa olevan markkerin ja bak- f teerin replikaation alkukohdan, jotka ovat peräisin kau- j
. ..... I
25 pallisesti saatavilla olevista plasmideista, jotka sisäl- ] tävät tunnetun kloonausvektorin pBR322 (ATCC 37 017) | geneettisiä yksikköjä. Näihin kaupallisiin vektoreihin kuuluvat; esimerkiksi pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, j
Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison WI, | 30 USA). Nämä pBR322:n "runko"-osat yhdistetään asiaankuulu- ]
vaan promoottoi'iin ja ilmennettävään rakenteelliseen jak I
soon, E. coli transformoidaan tyypillisesti pBR322:n joh- ) dannaisilla, joka plasmidi on E. coli -lajista peräisin oleva plasmidi [Bolivar, et ai., Gene 2 (1977) 95] . pBR322 35 sisältää ampisälliini- ja tetrasykliiniresistenssigeenit, 30 joista saadaan käyttöön yksinkertainen keino transformoitujen solujen tunnistamiseksi.
Yhdis teXmämikrobi-iImen tämisvektoreissa tavaili sesti käytetyt promoottorit sisältävät β-laktamaasi- (peni-5 sillinaasi-) ja laktoosipromoottorijärjestelmän [Chang, et ai., Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel, et ai., Nature 281 (1979} 544]; tryptofaani (trp) -promoottorijärjestäimän [Goeddel, et ai., Nucl. Acids Res. 8 (1980) 4057; ja EP- hakemusjulkaisu 36 776] sekä tac-promoottorin [Maniat is, 10 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412 (1982)]. Yhdessä erityisen käyttökel poisessa bakteeri-iImentamisjärjestelmässä käytetään faagi λ:η Ρι,-promoot toria ja lämpöindusoituvaa cl857ts-repres-soria. Niihin plasmidivektoreihin, jotka ovat saatavilla 15 talletuslaitoksesta American Type Culture Collection ja i jotka sisältävät λ:η P^-promoottorin johdannaisia, kuuluvat plasmidi pKUB2, joka on E. coli -kannassa JMB9 (ATCC \ 37 092) ja pPLc28, joka on E. coli RRl:ssä (ATCC 53 082).
Yhöistelmäfuusioproteiinia voidaan myös ilmentää 20 hiivaisännissä, jotka ovat edullisesti peräisin Saccharo- f myces-lajeista, kuten S. cerevisiae. Voidaan myös käyttää ] muiden sukujen, kuten Pichian tai Kluyveromyceksen, i
hiivoja. Hiivavekfcorit sisältävät tavallisesti 2 pm:n J
hiivaplasmidista tai autonomisesti repiikoituvasta jaksosta j
25 (ARS) peräisin olevan replikaation alkukohdan, promoot- I
torin, fuusioproteiinia koodaavan DNAm, polyadenylaatioon | ja transkription terminaatioon kuuluvat jaksot sekä selek- | tiogeenin. Hiivavektori t sisältävät edullisesti replikaa- j tion alkukohdan ja selektoitavissa olevat markkerit, jotka | 30 mahdollistavat sekä hiivan että E. colin transformaation, j esimerkiksi E. colin ampisilliiniresistenssigeenin ja S, j l cerevisiaen trpl-geenin, josta saadaan selektiomarkkeri | hiivan mutanttikannoille, joilta puuttuu kyky kasvaa tryp- ) tofaanissa, ja voimakkaasti ilmentyvästä hiivageenistä | 35 peräisin olevan promoottorin myötäsuuntaan olevan rakenne- | geenin transkription käynnistämiseksi. Hiivaisähtäsolun j ] j 31 genomissa oleva trpl-vaurio muodostaa sitten tehokkaat puitteet transformaation havaitsemiselle kasvusta ilman tryptofaania.
Sopiviin promoottorijaksoihin hiivavektoreissa kuu-5 luvat metallotioneiinin promoottori, 3-fos foglys eraa 11 i -kinaasin promoottori [Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073] tai muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit [Hess, et ai,, J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; ja Holland, et ai., Biochem. 17 (1978) 4900], kuten 10 enolaasin, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin, hek- sokinaasin, pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofruktokinaa-sin, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasin, 3-fosfoglyseraatti-mutaasin, pyruvaattikinaasin, trioosifos faa tt i-isomeraas in, fosfoglukoosi-isomeraasin ja glukokinaasin promoottorit.
15 Hiivassa tehtävään ilmentämiseen käytettäväksi sopivia f vektoreita ja promoottoreja on lisäksi kuvattu julkaisussa j R. Hitzeman, et ai., EP-hakemusjulkaisussa 73 657. \
Edulliset hiivavefcförit voidaan koota käyttäen j pBR322;sta peräisin olevia DMA-jaksoja E. colissa tapahtu- j 20 vaa selektiota ja repiikaatiota varten (Ampr-geeni ja rep- i likaation alkukohta) sekä hiivan DNA-jaksoja, joihin Ϊ kuuluvat glukoosilla represSöitavissa oleva ADH2-promoot- \ tori ja a-tekij:än. erittymisen johto jakso. ADH2 -promoottori j on kuvattu julkaisuissa Russel, et ai. [J. Biol, Chera. 258 j 25 (1982) 2674] ja Beier, et ai., [Nature 300 (1982) 724] . :j
Hiivassa toimivaa johtojaksoa koodaava DNA-segmentti liite- |
tään edullisesti toiminnallisesti fuusioproteiinia koodaa- J
i van DNA:n 5'-puoleiseen päähän. Jakson koodaama johtojakso- j peptidi edistää fuusioproteiinin erittymistä solusta ja se j 30 pilkkoutuu tavallisesti fuusioproteiinista tämän erittyessä. Yhtenä esimerkkinä voidaan mainita se, että hi ivan j a~tekijän johtojakso, joka ohjaa heterologisten proteiinien j erittymistä, voidaan liittää promoottorin ja ilmennettävän j rakennegeenin väliin. Tätä kysymystä ;ori käsitelty esi- j 35 merkiksi julkaisuissa Kurjan, et ai., Cell 30 (1982) 922; j ja Bitter, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (1984) 5330. j | 32
Johtojakso voidaan modifioida sellaiseksi, että siinä on lähellä sen 3'-puoleista päätä yksi tai useampi käyttökelpoinen restriktiokohta, joiden tarkoituksena on tehdä jöhtojakson fuusio vieraisiin geeneihin helpommaksi.
5 Sopivat hiivan transformaatiomenetelmät ovat tun nettuja alan ammattikokemuksen perusteella. Kuvaavaksi esimerkiksi soveltuva menetelmä on kuvattu julkaisussa Hinnen, et ai . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 {1978) 1929, jossa menetelmässä Trp^-transformantit selektoidaan selektoivassa 10 mediumissa, jonka koostumus on 0,67 % hiivan typpiperus-ravinnetta (yeast nitrogen base) , 0,5 % kasaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 pg adeniinia millilitraa kohti ja 20 pg urasiilia millilitraa kohti. Edellä kuvatun ADH2-promoot-torin sisältävillä vektoreilla transformoituja isäntäkan-15 toja voidaan kasvattaa niiden ilmentämiseksi rikkaassa me diumissa, jonka koostumus on 1 % hiivauutetta, 2 % peptöniä ja 1 % glukoosia ja jota on täydennetty 80 mikrogrammalla adeniinia millilitraa kohti ja. 80 mikrogrammalla urasiilia millilitraa kohti. Mediumissa olevan glukoosin loputtua, f 20: tapahtuu ÄJDH2 -promoottorin derepressiö:, Raakapreparaateiksi saatavat hiivan supernatantit kootaan talteen suodattamalla ja niitä pidetään 4 °C:ssa ennen jatkopuhdistusta.
Yhdistelmä-proteiinin ilmentämiseen voidaan käyttää useita nisäkäs- tai hyönteissoluviljelyjärjestelmiä. Kat-25 ssuksen baculovirusjärjestelmiin heterolggisten proteiinien valmistamiseksi hyönteissoluissa ovat esittäneet Luckow ja Summers, Bio/Technology 6 {1988) 47. Voidaan käyttää nisäk- \ käistä peräisin olevia vakiintuneita splulinjpja. Esimerk- | keihin sopivista nisäkässplulinjöistä kuuluvat apinan mu- | 30 nuaissolujen CQS-7-solulinjat, jotka on kuvattu julkaisussa j
Gluzman [Cell 23 (1981) 175], L~solut, C127-, 3T3-, | kiinanhamsterin munasarja (CHO}-, HeLa- ja BHK-sölulinjat. |
MisäkäsilmentämiSvektorit voivat sisältää yksiköitä, joille j ei tapahdu transkriptiota, kuten replikaation alkukohdan, j 35 ilmennettävään geeniin liitetyn sopivan promoottorin ja ]
enhancer-jakson sekä muita 5'- tai 3’-puoleisia trans- I
] 33 kriptiooh osallistumattomia vierusjaksoja ja 5'- tai 31-puoleisia translaatioon osallistumattömia jaksoja, kuten tarvittavat ribosomien sitoutumiskohdat, polyadenylaatio-kohta, silmukoihhin luovuttaja- ja akseptorikohdat ja 5 transkription terminaatiojaksot.
Selkärankaissolujen trans formoinnissa käytettävissä ilmentämisvektoreissa olevia transkription ja translaation .säätelyjaksoja voidaan saada käyttöön virusperäisistä lähtömateriaaleista. Esimerkiksi tavallisesti käytetyt pro-10 moottorit ja enhancer-jaksot ovat peräisin pglyömästä, adenovirus 2:sta, simian virus 4ö;:sta (SV40) ja humäani-sytomegaloviruksesta. SV40-viruksen genomista peräisin olevia DMA-jaksoja, esimerkiksi SV40:n alkukohtaa, varhaista ja myöhäistä promoottoria, enhancer-jaksoa sekä silmukoi-15 tumis- ja polyadenylaatioköhtia, voidaan käyttää materiaa lina., josta saadaan käyttöön muut hetefologisen DNA-jakson ilmentämiseen vaaditut: geneettiset yksiköt. Varhaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, { koska nämä kumpikin on saatavissa helposti viruksesta frag- { 20. menttina, joka myös sisältää SV40:n viruksen replikaation 1 alkukohdan [Fiers, et ai., Nature 273 (1978) 113] . Voidaan j myös käyttää pienempiä, tai suurempia SV40:n fragmentteja l edellyttäen, että niihin sisältyy noin 250 ep;n suuruinen j jakso, joka ulottuu Hind ITI -kohdasta viruksen replikaa-25 tion alkukohdassa sijaitsevan Bgll-kohdan suuntaan. Esi- j
merkkeinä olevia vektoreita voidaan konstruoida julkaisussa I
Okayama ja Berg [Mol. Cell. Bio:l;, 3 (1983) 280] kuvatulla | tavalla, käyttökelpoinen järjestelmä nisäkkäiden reseptori- j
cDNA-mo1ekyy1ien ilmentämiseksi pysyvästi voimakkaasti il- I
30 mennettynä hiiren Ci27-rintarauhasepiteelisoluissa voidaan I
konstruoida olennaisesti julkaisussa Cosman, et ai. [Mol. I
Immunol. 23 (1986) 935] kuvatulla tavalla.
Fuusioproteiinin valmistaminen ja puhdistus Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä tässä 35: kuvatun yhdistelmä-fuusioproteiinin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että mainittua fuusioproteiinia ::¾ .-:¾ 2 34 koodäävan DNA-jakson sisältävällä ilmentämisvektorilla transformoitua isäntasolua viljellään, olosuhteissa, joissa fuusioproteiinin on mahdollista ilmentyä, joka fuusiopro-teiini puhdistetaan sitten soluviljelymediumeista tai sölu-5 uutteista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa puhdis tusmenetelmää ja paras menetelmä vaihtelee sellaisten tekijöiden mukaan, joita ovat isäntäsölujen tyyppi ja se, erittyykö haluttu proteiini isäntäsoluista vai ei. Fuusio-proteiini erittyy soluviljelymeöiumiin sillain, kun se heti 10 muodostuttuaan on fuusioituneena isäntäspluissa toiminta kykyiseen signaalijaksoon tai johtöpeptidiin, tai silloin, kun proteiini sisältää TNF-R- ja IL-lR-polypeptidien liukoisia muotoja.
Yhdistelmäproteiinia söluviljelymediumiin erittä-15 vistä ilmentämisjärjestelinistä peräisin olevat supernatan- | tit voidaan esimerkiksi aluksi konsentroida käyttäen kau- j pallisesti saatavilla olevaa proteiinien konsentrointisuo- i datinta, esimerkiksi Amicon- tai Millipore Fellicon -ultra- j suodatusyksikköä. Konsentraatiovaiheen jälkeen konsentraat- j 20 tia voidaan käsitellä sopivalla puhdistusmatriksilia, j
Sopiva affiniteettimatriksi voi esimerkiksi sisältää TNFrää j tai IL-l:tä. Affiniteettimatriksi voidaan valmistaa yhdis- 1 tämällä yhdistelmä-humaani-INF täi -IL-1 syanogeenibro- j midilla aktivoituun Sepharoseen (Pharmacia) tai Hydrazide j 25 Affigel'iin (Biorad) valmistajien suosittelemilla tavoilla. j
Edullinen puhdistusmenetelmä sisältää vaiheittaisen immuno- | logisen puhdistuksen käyttäen sopivaan tukiaineeseen sidot- j tuja vasta-aineita. Proteiinit, jotka sitoutuvat tnf-R:lie spesifiseen vasta-aineeseen, otetaan talteen ja saatetaan 30 kosketukseen liukenemattoman kantaja-aineen pinnalla olevan iL-lR:lle spesifisen vasta-aineen kanssa. Molempien vasta-aineiden kanssa immunologisasti reagoivat proteiinit voidaan siten tunnistaa ja eristää. Tyypin I humaani-IL-1R:lie spesifinen rnonoklonaaiinen vasta-aine on talletettu 35 13,9.1990 talletuslaitokseen American Type 'Culture Collec tion hakunumerolla HB 10 556. Vaihtoehtoisesti voidaan & l 35 käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi ma tiilesi a tai alustaa, jossa on ulospäin suuntautuvia dietyyliaminoetyyli (DEAE) -ryhmiä. Matriksit voivat olla akryyli amidia, aga-roosia, dekstraania, selluloosaa tai proteiinien puhdista-5 misessa tavallisesti käytettyjä muita matriksityyppejä. VailTtoShtöisesti voidaan käyttää kationinvaihtovaihetta -Sopiviin kationinvaihtimiin kuuluvat useat erilaiset liukenemattomat matriksit, jotka sisältävät Sulföpropyyli- tai karboksimetyylirylirniä. Edullisia ovat sul£:öp'ropyyliryhmät.
10 Fuusioproteiinikoostumuksen jatkopuhdistukseen voidaan käyttää yhtä tai useampaa korkean suorituskyvyn käänteisfaasi-nestekromatografia (RP-HPLC) -vaihetta, joissa käytetään hydrofobisia RP-HPLC-mediuineja, esimerkiksi silikageeliä, jossa on rungosta poispäin suuntautuvia metyyliryhmiä tai 15 muita alifaattisia ryhmiä.
Bakteeriviljelmässä tuotettu yhdistelmäproteiini eristetään tavallisesti suorittamalla ensin uutto soluna-peista, jonka jälkeen suoritetaan yksi tai useampi vaihe, joihin kuuluvat konsentrointi, ulossuolaus ja vesipitoi-20 sessa mediumissa suoritettu ioninvaihto- tai geeli- (sise exclusion) kromatografia, Viimeisinä puhdistusvaiheina voi- i daari lopuksi käyttää korkean suorituskyvyn nestekromato- | grafiaa (HPLC). Yhdistelmäfuusioproteiinien ilmentämiseen käytetyt mikrobisolut voidaan hajottaa millä tahansa käyt-25 tökelppisella menetelmällä/ mukaan lukien toistetut jäädy- tys-sulätus-käsittelyt, ultraäänikäsittely, mekaaninen hajotus tai soluja hajottavien aineiden käyttö.
Puhdistusta yksinkertaistaa huomattavasti sellaisen j hiivan, fermentaatio,: joka ilmentää fuusiöproteiineja erit- j 30: tyvänä proteiinina.: Suurimittakaavaisesta fermentaatiosta j saatu eritetty yhdistelmä-proteiini voidaan puhdistaa mene- | telmillä, jotka ovat analogiset julkaisussa Urdal, et ai. ij [J. Chromatog. 296: (1984) 171] kuvattujen menetelmien | suhteen ja joihin sisältyy kaksi peräkkäistä käänteisfaasi- j 35 HPLC-vaihetta yhdistelmäproteiinin puhdistamiseksi prepara- ] tiivisessa EPLC-pylväässä. ] 36
Joitakin edellä olevia puhdistusvaiheita tai niitä kaikkia voidaan käyttää useina erilaisina yhdistelminä olennaisesti homogeenisen yhdistelmäproteiinin aikaansaamiseksi. Yhdistelmäsoluviljelmän avulla on mahdollista val-5 mistaa fuusioproteiinia, jossa ei ole niitä kontaminoivia proteiineja, jotka tavallisesti liittyisivät TNF-R:ään täi IL-1R:ään sellaisina kuin ne esiintyvät luonnossa niiden omaa alkuperää edustavissa lajeissa, esimerkiksi soluissa, solueksudaateissa tai ruumiinnesteissä... Edellä olevat puh-10 distusmenetelmät kuuluvat myöskin niihin menetelmiin,, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten ei-yhdistelmä-reseptorien puhdistamiseen.
Vaihtoehtona reseptorien valmistamiselle fuusiopro-teiineiha voidaan TNF-R- ja IL-lR-proteiinit valmistaa ja 15 puhdiätää: erikseen ja kytkeä yhteen myöhemmin. Tunnetaan
useita reagensseja, jotka ovat käyttökelpoisia yhden proteiini molekyylin silloittamiseksi toiseen proteiinimolekyy-lin. Tähän tarkoitukseen, on käytettävissä heterobifunk- I
tionaalisia ja homobifunktionaalisia kytkijämolekyylejä, 20. joita on saatavilla esimerkiksi yhtiöstä Pierce Chemical j
Company, Rockford, Illinois. Tällaisissa kytkijäjaksoissa | on kaksi funktionaalista ryhmää {esimerkiksi estereitä j j a/ma1e imi dej a), jotka reagoivat tiettyjen aminohappos ivu- |
ketjujen funktionaalisten ryhmien kanssa (esimerkiksi ly-25 sUniryhmissä olevien amiinien ja kysteeniryhmiin pelkistä- J
mällä muodostettujen sulfhydryylien kanssa), mikä siten j liittää toisen polypeptidin toiseen. Esimerkkejä tällaisista silloitusreagensseista ovat M-maleimidobentsoyyli- j j sukkinimidyyliesteri ja N-hydroksisukkinimidi. Reagenssi ja j 30 reaktio-olosuhteet on valittava sellaisiksi, että silloit- j taminen ei häiritse TWR:n tai IL-1:n sitoutumista rcscp · ! toriin. TNF-R- ja IL-IR-polypeptid.it kytketään edullisesti j yhdellä edellä kuvatuista peptidikytkijäjaksoista, joka | toimii loitOhtajana. Peptidikytkijäjakso voidaan liittää | 35 TNF-R:ään tai IL-1R:ään millä tahansa tavanomaisista mene- j
telmi stä, joita on käytetty yhden polypeptidin liittämi- I
] $ 37 seksi toiseen. Edellä kuvatut Pierce Chemical Company -yhtiöstä saatavilla olevat silloitusreagenssit kuuluvat niihin reagensseihin, joiden käyttö voi tulla kysymykseen. Peptidikytkijäjaksoon, esimerkiksi tämän terminaalisiin 5 päihin, voidaan liittää aminohappoja, joissa on tällaisten reagenssien kanssa reagoimaan kykeneviä sivuketjuja.
Farmaseuttiset koostumukset Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, jotka sisältävät 10 mitä tahansa edellä kuvattua fuusioproteiinia ja fysiologisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, laimenninta tai lisäainetta. Tällaiset kantaja-aineet, lisäaineet ja laimenti-met ovat käytetyissä annoksissa ja konsentraatioissa ei-toksisia potilaille, joille niitä annetaan. Tällaiset 15 koostumukset voivat sisältää puskureita, antioksidantteja,
kuten askorbiinihappoa, polypeptidejä, joiden suhteellinen moolimassa on pieni (alle noin 10 ryhmää), proteiineja, aminohappoja, hiilihydraatteja, joihin kuuluvat glukoosi, sakkaroosi tai dekstriin.it, kelatoivia aineita, kuten I
20 EDTAita, glutationia sekä muita stabilointiaineita ja j lisäaineita. Esimerkkejä asiaankuuluvista laimentimista j ovat neutraali puskuroitu fysiologinen suolaliuos tai fy~ j
Biologinen suolaliuos, johon on yhdistetty saman lajin yk~ j silöista valmistettua seerumialbumiinia. Koostumus formu- j 25 loidaan edullisesti lyöfilisaatiksi käyttäen laimentimina asiaankuuluvia lisäaineliuoksia (esimerkiksi sakkaroosia), Asianmukaiset annokset voidaan määrittää kliinisissä: ko- | keissa. Annoksen määrä ja antokertojen tiheys on luonnolli- \ sesti riippuvainen sellaisista tekijöistä kuten hoidettavan 30 indikaatioin, vakavuus, haluttu vaste, potilaan terveydentila ;j ja niin edelleen. :j
Sairaustiloja, joissa TNFzllä tai IL-1:llä on ] osuutta, voidaan hoitaa antamalla terapeuttisesti tehokas j määrä farmaseuttisen koostumuksen muodossa olevaa tämän ! 35 keksinnön mukaista fuusioproteiinia potilaalle, jolla on j tällainen sairaus. TNF:llä tai IL-Iiilä sanotaan olevan j ] j 38 osuutta sairaudessa silloin, kuri TNF tai IL-1 aiheuttaa (suoraan: tai epäsuorasti): sairauden tai pahentaa sitä.
Liukoisia reseptoriproteiineja voidaan käyttää sitoutumaan kompetitiivisesti TNF:ään tai IL-1:ääri, mikä siten inhiboi 5 TNF:n ja IL-1:n sitoutumista solun pinnan reseptoreihin.
Terapeuttista käyttöä varten annetaan tämän keksinnön mukaisia puhdistettuja fuusioprqteiinejä potilaalle, joka on edullisesti ihminen, indikaation suhteen asiaankuuluvalla tavalla annettavaa hoitoa varten. Siten farmaseut-10 tisia koostumuksia voidaan esimerkiksi antaa boli-injektio-na, jatkuvana infuusiona, antamalla niiden vapautua /jatkuvasti implanteista tai käyttäen jotakin muuta sopivaa menetelmää:.
Farmaseuttisissa koostumuksissa käytetyn fuusiopro-15 teiihin on oltava puhdistettua siinä mielessä, että fuusio-proteiini ei sisällä olennaisesti mitään muita alunperin luontaisia tai endogeenisiä proteiineja ja se sisältää alle noin 1 massa-% tuotantomenetelmistä jäljelle jääneitä pro- j teiinikontaminantteja. Tällaiset koostumukset voivat kui- j 20 tenkin sisältää muita proteiineja, joita on lisätty stabi- j lointiaineiksi, kantaja-aineiksi, lisäaineiksi tai samanaikaisesti käytettäviksi terapeuttisiksi aineiksi. Fuusiopro- \ teiini on puhdistettu olennaisesti homogeeniseksi, jos se | on havaittavissa yhtenä proteiinivyöhykkeenä polyakryyli- j 25 amidigeelissä hopeavärjäyksellä. j Tässä kuvattuja fuusioprbteiineja voidaan antaa j sellaisten sairaustilojen hoitamiseksi, joissa TNF:llä ar- \ vellaan olevan ainakin osittaisesti osuutta, joita sairaus- j
tiloja ovat kakeksia, reumaattinen niveltulehdus, diabetes, I
30 multippeliskleroosi, keuhkOfibroosi ja silikoosi sekä aivo- j malaria, sekä allograftin ja ksenograftin hyij intä kään- | teishyljinnässä. On myös viitteitä siitä, että TNF:llä on ] osuutta sepsiksessä ja septisessä sokissa. Bakteerien endo- j toksiini voi aiheuttaa sepsiksen tietyntyyppisten: baktee- | 35 reiden infektoimissa nisäkkäissä ja sen arvellaan; stimuloi- | van makrofageja tuottamaan tekijöitä, joihin sisältyy TNF. j \ \ \ k 39
Folks, et ai. ΓΡΝΑΞ USA 86 (1989) 2365], ovat ehdottaneet, että ΤΝΡ-ά:11a on tärkeä osuus HIV-infektion patogeneesissä.. TI\fF-a;n indusoimaa HIV: n ilmentymistä solulinjässa käytetään mallina HIV:n latenssista sen tutkimiseksi, miten 5 latentti infektio muuttuu produktiiviseksi infektioksi..
Tietyt sytokiinit (IL-1, TL-2 ja muut pesäkestimu-laätiotekijät) voivat indusoida isännän tuottamaan merkittäviä määriä TNF:ää,. Kaavan TNF-R-kytkijäjakso-TNF-R mukaisia fuusioproteiineja voidaan käyttää sytokiiniterapiaan 10 liittyvien sivuvaikutusten hoitoon. Sen tärkeän osuuden, johdosta, joka IL-1:llä on TNF:n muodostumisessa, voivat sekä IL-l-reseptor(e)i(t)a että TNF-reseptor(e)i{t)a sisältävät fuusipproteiixiit olla edullisia TNF: ään liittyvien kliinisten indikaatiöiden hoidossa.: 15 TNF:m on raportoitu indusoivan IL-1;n erittymistä in vivo -olosuhteissa. Siten IL-I:n välityksellä tapahtuvien sairaustilojen hoitamisessa voidaan käyttää fuusioproteiineja, jotka sitovat sekä TNF:ää että IL-1:ta. Tämän keksinnön mukaisia fuusioproteiineja voidaan antaa esimer- j i l * < * Ϊ
20 kiksi ihmisessä esiintyvien immuunivasteiden ehkäisemistar- J
koituksessa. Alloantigeenia vastaan muodostunut immuunivas- j te aiheuttaa useita erilaisia sairauksia tai sairaustiloja, j IL-lR estää alloantigeenin aiheuttamissa immuunivasteissa \ ij lymfoproliferaatiota ja tulehdusta, jotka ovat seurausta j 25 T-solujen aktivoitumisesta. IL-1S:ää voidaan siten käyttää estämään alloantigeenin aikaansaamia immuunivasteita esi- f merkiksi allograftien (kuten iho-, munuais- ja sydän- | siirteet:) hyljinnän ja luuydinsiirtopotilaiden käänteishyl- il jintäreaktioiden kliinisessä hoidossa. IL-1:11a arvellaan f 30 olevan tautia aiheuttava osuus allergioissa ja autoimmuuni- ;j sissa toimintahäiriöissä (kuten reumaattinen niveltulehdus, f diabetes ja multippeliskleroosi, jotka ovat riippuvaisia |
T-solujen aktivaatiosta niitä antigeenejä vastaan, joita I
järjestelmä ei tunnista isännän omiksi antigeeneiksi. j 35 TNF:llä ja IL-1:llä on osuutta useissa samantyyppi- j sissä sairauksissa, mikä voidaan nähdä veisaamalla edellä 1
S
j 40 esitettyjä luetteloita TNF: n välityksellä ja IL-l:n välityksellä syntyvistä sairauksista. Lisäksi TNF ja IL-1 ovat kaksi tärkeimpiin tulehduksen välittäjäaineisiin kuuluvaa molekyyliä, jotka vaikuttavat usein yhdessä toimien. Tämän 5; keksinnön mukaisten fuusioproteiinien, jotka sisältävät seka TNF:n että IL-1:n reseptoreita, käytöstä saadaan siten etuja monien sellaisten sairauksien hoidossa, joissa sekä TNFrllä että IL-I:!lä arvellaan olevan osuutta taudin syntymisessä.
10 Tiettyihin sovellutuksiin on tässä kuvatuissa fuu- si.Oproteiineissa edullista käyttää IL-lR:n ja TNF-R:n liukoisia muotoja. Proteiinien puhdistus yhdistelmäisäntä-soluista helpottuu< koska liukoiset proteiinit erittyvät sölulsta. Lisäksi liukoiset proteiinit soveltuvat tavaili- 15 sesti paremmin annosteltavaksi suonensisäisesti ja niillä voi olla terapeuttista vaikutusta (IL-1:n ja/tai TNF:n sitominen) kiertävässä veressä. Liukoiset fuusioproteiinit estävät IL-1:tä ja/tai TNF:ää sitomalla signaalin välittymistä solun pinnalla olevien endogeenisten IL-1:n tai TNF:n ! \ 20 reseptorien välityksellä. j Tässä kuvattuja fuusioproteiineja voidaan myös | käyttää reagensseina reseptoriin perustuvissa immunomääri- | tyksissä, reagensseina TNF- tai IL-1-määrityksissä tai si- j tovina aineina TNF:n tai IL-1:n affiniteettipuhdlstuksessa.
25 Seuraavat esimerkit on esitetty tämän keksinnön kuvaamiseksi eivätkä ne ole tarkoitettu sitä millään tavoin | rajoittaviksi. j
Esimerkit
Esimerkki 1 i \ 30 TNFm sitoutumismäärifcykset j Ä„ TNFcun ja TNFfJjn varustaminen radioaktiivisella j leimalla, |
Yhdistelmä-humaani-TMFa:;aa, joka oli sellaisen fuu- | siöproteiinin muodossa, joka sisälsi N-terminaalisessa \
35 päässä olevan hydrofiiIisan oktapeptidin, ilmennettiin I
erittyvänä proteiinina hiivassa ja se puhdistettiin 1 41 affiniteettilcroinatQgrafialla [Hopp, et al,, Bio/Technology 6 (1988) 1204]. Puhdistettu yhdistelma-humaanl-TNFO han kittiin yhtiöstä R&D Systems (Minneapolis, MM) , Kumpikin proteiini varustettiin radioaktiivisella leimalla käyttäen 5 kaupallisesti saatavilla olevaa kiinteän faasin reagenssia,
Iodo-Gen'ia (Pierce). Tässä menetelmässä pipetoitiin 5 pg Iodo-Gen‘ia lasista valmistetun 10 x 75 mm;n suuruisen koeputken pohjalle ja tätä inkuboitiin 20 minuuttia 4 °C:ssa seoksen kanssa, jonka määrä oli 75 pl ja jonka koostumus 10 oli 0",1 M natriumfosfaatti, pH 7,4 ja 20 pl (2 mCi) Ma125I.
Tämän jälkeen tämä liuos pipetoitiin toiseen lasista valmistettuun koeputkeen, joka sisälsi 5 pg TMFg:aa (tai TNFp:ää) 45 pl-ssa PBScää, ja sitä käsiteltiin 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Reaktioseos fraktioitiin geelisuödatuksella, 15 joka suoritettiin pakatulta tilavuudeltaan 2 ml:n suuruisessa Sephadex G-25;ssa (Sigma), joka oli tasapainotettu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -mediumissa, joka sisälsi 2,5 ·% (w/v) naudan seefumialbumiinia (BSA) , j 0,2 % (w/v) natriumatsidia ja 20 millimolaarista Hepes’ta, \ 2 0 ja jonka pH oli 7,4 (sitoutumismedium), Lopulliset yhdistetyt 125l-TNF-jakeet laimennettiin sitoutumismediumiin | käyttökantaliuokseksi, jonka konsentraatio oli 1 x ID"7 M j } ja jota säilytettiin korkeintaan yhden kuukauden ajan j 4 QC:ssa ilman havaittavaa reseptoria sitovan aktiivisuuden |
25 häviämistä,, Spesifinen aktiivisuus rutlinipreparaateissä on I
1: x 1Q6 cpm/mmol TNF:ää,: | B. Sitoutuminen kokonaisiin soluihin
Kokonaisilla soluilla tehdyt sltoutumlsmääritykset I
suoritettiin kahdella menetelmällä. Ensimmäisessä menetel- | 30 mässä soluja kasvatettiin ensin joko suspensiossa (esirner- j kiksi U937 j tai antamalla niiden kiinnittyä kudosvil jely- | maljoihin (esimerkiksi yhdistelmä-TNP-reseptoria ilmentävät j \ WJ.26-VA4- tai COS-solut) . Kiinnittyneet solut poistettiin \ myöhemmin 37 DC:ssa 10 minuuttia kestävällä EDTA-käsitte- | 35 lyllä, jossa EDTA:n konsentraatio oli 5 mM, Tämän jälkeen suoritettiin sitöutumismäärltykset käyttäen ftalaattiöljy- ] is 42 erotusmenetelmää. [Dower, et ai., J. Immunol. 132 (1984) 751] olennaisesti julkaisussa Park, et ai. [J. Biol. Chem.
261 (1986) 4177] kuvatulla tavalla. 125i-TNF:n epäspesifinen sitoutuminen .määritettiin siten, että määrityksessä oli 5 2 00:-kertainen tai suurempi mooliylimäärä leimalla varusta-· matönta T5JF:ää, Sitoutumismäärityksessä käytettiin natrium-ätsidia (0,2 %) inhiboimaan *2SI-TNF-n sisäänottoa soluihin.
Toisessa menetelmässä tutkittiin sellaisten COS-solujen, jotka oli fransfektoitu TNF-R;ää sisältävällä plasmidilla 10 ja jotka ilmentävät TNF-reseptoreita pinnallaan, kykyä sitoa 125I-TNF:ää käyttäen julkaisussa Sims, et ai. [Science 241 (1988) 585] kuvattua maljoilla tehtävää sitoutumis- määritysta.
C. Kiinteän faasin si t outumi smääri tykset 15 TNF-Rm kyvystä adsorboitua pysyvästi nitrosellu- loosaan humaanisoluj en detergent tiuutteista. ja säilyttää kuitenkin TNF:ää sitova aktiivisuus saatiin käyttöön keino TNF-R:n havaitsemiseksi. Valmistettiin solu-uutteet yhdistämällä solunappi kaksi kertaa omaan tilavuuteensa PBS:ää, 20 joka sisälsi 1 % Triton X-100:aa ja proteaasi-inhibiit-toriseosta (2 mM fenyy].imetyylisulfonyylifluoridi, 10 μΜ pepstatiini, 10 μΜ leupeptiini, 2 mM o-fenantroliini ja 2 mM EGTä) , seosta samalla voimakkaasti pyörreseköittaen.
Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia, minkä jälkeen se 25 sentrifugoitiin 12 000 k g:n voimalla 15 minuuttia 8 °C:ssa tumien ja muun jätteen poistamiseksi. Kahden mikrolitran suuruisia eriä solu-uutteita pipetoitiin kuivien BA8521-nitroselluloosamembraanien (Schleicher and Schuell, Keene, NH) pinnalle ja niiden annettiin kuivua. Membraaneja inku- 1 30 boitiin kudosviljelymaljoilla 30 minuuttia Tris:11a (0,05 M) puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (0,15 M), jon- ]
ka pH oli 7,5 ja joka sisälsi 3 % w/v BSA:ta epäspesifisten I
sitoutumiskohtien tekemiseksi reagoimattömiksi. Tämän jäi- ] keen meridiaanin päälle pipetoitiin seos, joka sisälsi 35 5 x 10"11~molaartista i25I-TNF:ää PBS:n sekä 3-% risen BSA: n seoksessa, ja seosta inkuboitiin 2 tuntia 4 °C:ssa sitä j i 5 | 43 samalla ravistellen. Tämän vaiheen lopussa membraanit pestiin 3 kertaa PBS:ssä, kuivattiin ja asetettiin Kodak X-Omat AR -filmille 18 tunnin ajaksi -70 °C:seen.
D. Signaalinvälittyrnismääritykset 5 THF-signaalin välittymisen inhibitioaktiivisuus voidaan määrittää: transfektoimalla solut yhdistelmä-TNF-R-DNA-itiolekyyleiliä, jotka koodaavat membraaniin sitoutunutta TNF-Riää, solun pinnalla esintyvän yhdistelmä-reseptorin ilmentymisen aikaänSaamiseksi. Solut saatetaan sitten kosii 0 ketukseen TNFm kanssa ja tuloksena olevat metaboliset vai kutukset tutkitaan. Jos saadaan vaikutus, jonka On katsottava johtuvan ligandin toiminnasta eikä sen ole katsottava johtuvan soluissa ehdogeenisena olevien TNF-resep-torien vaikutuksesta, niin yhdistelmä-reseptorilla on sig-15 haalia Välittävää aktiivisuutta. Kuvaavia esimerkkejä menetelmistä sen määrittämiseksi, onko polypeptidillä signaalia välittävää aktiivisuutta, on kuvattu julkaisuissa Xdzerda, j et ai,.., J. Exp. Med. 171 (1990) 861Curtis, et ai., Proc. ΐ
Kati. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3045; Prywes, et ai., EMBO 1
2Ö J. 5 (1986) 2179 ja Chou, et ai., J. Biol. Chem. 262 (1987) I
ΐ 1842. Liukoisen TNF-R-polypeptidin 'kyky inhiboida kompe- \
tifiivis.esti signaalin välittymistä voidaan määrittää samanlaisia menetelmiä käyttäen. Primäärisiä soluja tai solu- J
linjoja, jotka ilmentävät endogeenista TNF-reseptoria ja \ 25 joilla on havaittava biologinen vaste TKF:ää kohtaan, voi- f
täisiin käyttää vaihtoehtona membraanin sitoutunutta yhdis- I
telmä-TNF~R:ää ilmentävien solujen käytölle. Signaalin vä~ j
Iit.tymi.sen pienentyminen lisättäessä määritykseen liukoista j TTVF-R-polypeptidiä viittaa siihen, että: liukoinen TNF-R si-30 too TKF: ää, joten pienempi määrä. TKFrää sitoutuu solun pinnan TKF-reseptareihin signaalin välittymisen aloittamiseksi .
44
Esimerkki 2 IL-lm sitoutumismäär i tykset A. rIL-Ιβίη varustaminen radioaktiivisella leimalla
Yhdistelmä-huinaäni-IL-i(3: aa valmistettiin iImentä-5 mällä E. co-lissa ja puhdistamalla se homogeeniseksi julkaisussa Kronheim, et ai. [Bio/Technology 4 (1986) 1078] kuvatulla tavalla. IL-Ιβ varustettiin leimalla käyttäen Boltonin ja Hunterin di-jodi (125I)-reagenssia (New England Nuclear, Glenolden, PA) . Kymmenen mikrogrammaa (0,57 nmol) 10 proteiinia 10 ul:ssa fosfaatilla (0,015 mol/1) puskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS,· 0,15 mol/1), jonka pH oli 7,2, yhdistettiin 10 μΐ:aan natriumboraatiliä (0,1 mol/1) puskuroitua fysiologista suolaliuosta (0,15 mol/1), jonka pH oli 8,5, ja tämä saatettiin reagoimaan Boltonin ja 15 Hunterin reagenssin kanssa, jonka konsentraatio oli 1 mCi (0,23 nmol}, 12 tunnin ajan H °C:ssa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämän jälkeen seokseen lisättiin 30 μΐ 2-prosenttista gelatiinia ja 5 μΐ glysiinietyyliesteriä, jonka konsentraatio oli 1 mol/1, ja proteiini erotettiin rea-20 goimattomasta Boltonin ja Hunterin reagenssistä Biogel™ P6-pylväässä (Biorad Laboratories, Richmond, CA) , jonka pakattu tilavuus oli 1 ml. Leiman havaittiin rutiinityössä liittyvän 50 - 60~%:sesti. Radioaktiivisella jodilla varustamisessa saavutetut spesifiset aktiivisuudet olivat 2 5 alueella 1 x 1015 - 5 x 1.015 cpro/mmöl-1 (0,4 - 2 atomia I: tä proteiinimolefcyyliä kohti) ja nätriurndodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS/PAGE) tuli \ esille yksi leimalla varustettu polypeptidi, joka oli s koöltäan 17,5 kD, mikä oli yhdenmukainen tulos IL-1:Ile j 30 aikaisemmin raportoitujen arvojen suhteen. Leimalla varustettu proteiini pii sapetettavissa yli 98-%:sesti TCA:11a, mikä viittasi siihen, että 125I oli sitoutunut kovalent tl-s es t i pr o he i in i in.
$ ( ;i| :}| 45 B, Membraaniin sitoutuneen X.L-lRsn sitoutuniis-inhibitiomääritykset "IL-1" tarkoittaa yhteisesti IL-Ia:aa ja IL-ip:aa. inhibitiovakio IL-lR-proteiinin sitoutumiselle voidaan mää-5 r it tää sitOutiimisinhibitiomäärityksillä, joissa käytetään 'kilpailevan molekyylin (IL-ip-n tai I'L-lci:n) vaihtelevia konsentraätioita, joita molekyylejä inkuboidaan seoksessa, jossa on vakiomäärä radioaktiivisella leimalla varustettua IL-Ij3:aa tai IL-Icxraa ja iL-lR:ää ilmentävä soluja. Kil-10: pälievä yhdiste, jota ei ole varustettu radioaktiivisella leimalla, sitoutuu reseptoriin ja estää radioaktiivisella leimalla varustetun llgandin sitoutumisen reseptoriin. Sitoutumismäänitykset suoritettiin käyttäen ftalaattiöljy-erotusmenetelmää olennaisesti julkaisuissa Dower, et ai., 15 J, Immunol. 132 (1984) 75,1 ja Park, et ai., J. Biol. Chera. 261 (1986) 4177 kuvatulla, tavalla. Tämä: tehtiin pääpiir teittäin siten, että membraaniin sitoutunutta yhdistelmä-IL-1R: :ää ilmentäviä isäntäsöluja ihkuboitiin kuusi kuoppain silla levyillä (Costar, Cambridge, MA) 4 pG:ssa kaksi tun-2 0 tia käyttäen 125l-IL-lp :aa 1 ml: ssa. s i t. ou tumi smediumia [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -medium, johon oli yhdistetty 2 % BSA:ta, Hepes-puskuria, jonka konsen-traatio oli 20 niM ja 0,1 % natriumatsidia, ja jonka pH oli 7,2]. Seokseen oli lisätty natriumatsidia, joka Oli tar-25 koitettu inhiboimaan 125I-IL-l:n joutumisen solujen sisään ja sen pilkkoutuininen soluissa 37 °C: ssa. Levyj ä inku-boitiin poytäravistelijassa 37 °C:Ssa 1 tunnin ajan. Rinnakkaiset erät inkubointiseosta pipetoitiih tämän jälkeen polyeteenistä valmistettuihin sentrifugiputkiin, jotka si-30 saisivat ftalaattiöljyseosta, joka sisälsi 1,5 osaa dibu-tyyliftalaattia yhdistettynä yhteen osaan bis(s-etyy-liheksyyli)ftalaattia. Käytettiin myös kontrollikoeputkia, jotka epäspesifisen sitoutumisen määrittämiseksi sisälsivät satakertaisen mooliylimäärän leimalla varus tamafeonta IL-35 l,B:ää. Sitoutunutta 12;>Ι-Ιί·-1:tä sisältävät solut erotettiin sitoutumattomasta 125I-IL-1 :stä sentrifugoimalla seoksia 5 46 minuuttia 15 000 x g:n voimalla Eppendorf Microfuge'ssa.
Soluihin liittynyt radioaktiivisuus määritettiin sitten gammalaskij alla, C. Liukoisen IL~lR:n sitoutumisinlxibitiomääritys 5 Inhibitiovakio liukoisen humaani-IL-1R:n sitoutu miselle voidaan määrittää sitoutujnisirihibitioiaäärityksellä, jossa käytetään vaihtelevia konsentraatiota IL-Ιβ-η kanssa kilpailevaa yhdistettä, joita inkuboidaan seoksessa, jossa on vakiomäärä radioaktiivisella leimalla varustettua I-IL-10 l|3:aa ja tyypin II iL~lR:ää ilmentäviä CB23-soluja (Ep-
Stein-Barrin viruksella transformoitu napaveren B-lymfo-syyttisolulinja). Määrityksissä, joihin liittyy liukoisen tyypin I lL-lR:n käyttö:, voidaan CB2 3-solujen tilalla käyttää endogeenisiä tyypin I TL-l-reSeptoreita ilmentävää 15 solulinjaa, Sitoutumismääritykset suoritettiin käyttäen ftalaattiöljyerotusmenetelmää olennaisesti julkaisuissa Dower,: et ai,, J. Immunol, 132 (1984) 751 ja Park, et ai., j J. Biol. Chem. 261 (1986) 4177 kuvatulla tavalla. Tämä j tehtiin pääpiirteittäin siten, että CVI-BBMA (nisäkäs) 20 -solut transfektoitiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla
ilmentämisvektori11a pDC406, joka sisälsi liukoista tyypin I
Il humaani - IE-1R: ää koodaavaa cDNAc.tä. Soluis ta saadut I
ij supernatantit koottiin talteen kolme päivää transfektion 1 jälkeen ja niistä tehtiin sarjalaimennokset sitoutu- | 25 mismediumiin [Roswell Park Memorial Institute {RPMI) 1640 \ -medium, joka sisälsi 2 % BSA:ta, Hepes-puskuria, jonka j
konsentraatio oli 20 mM, ja 0,2 % natriumatsidia ja jonka I
pH oli 7,2] 6-kuoppaisissa levyissä .50 μ1:η tilavuuteen | kuoppaa kohti. Supernatantteja sekä 50 μ1*.η eriä seosta, 1 ! 3 0 joka sisälsi 9 x 10'iö -molaarista 125I-IL-ljJ-:äa sekä j 2,5 X 106 CB23-solua, inkUboitiin 8 °C;ssa 2 tuntia seosta j samalla ravistellen. Kahdet rinnakkaiset 60 μΐ:n suuruiset j j erät inkubointiseoksia pipetoitiin sitten polyeteenistä j valmistettyihin sentrifugipytkiin, joissa oli 1,5 osaa di- | 35 butyyliftalaattia ja 1 osa bis(s-etyyliheksyyli)ftalaattia j sisältävää ftaiaattiöljyseosta. Sarjassa käytettiin myös j i | i 47 negatiivista kontrollikoeputkea, joka sisälsi epäspesifisen sitoutumisen määrittämiseksi (löO-%:inen inhibit io) leimalla varustamatonta IL-Ιβ:ää, jonka konsentraatio oli 3 x 10"6 M, ja kontrollikoeputkea, joka maksimaalisen si-5 toutumisen määrittämiseksi sisälsi 50 ml sitoutumismediu-mia, jossa oli ainoastaan radioaktiivisella leimalla varustettua IL-Ιβ:aa. Sitoutunutta i25I”lL~l§-aa sisältävät solut erotettiin sitoutumattomasta 125I-IL~1$:sta sentrifugoimalla seoksia 5 minuuttia 15 000 x g:n voimalla Eppendorf Micro-10 fuge’ssa. Supernatantit, jotka sisälsivät soluihin sitoutumatonta i25I-IL-Ιβ:aa, heitettiin pois ja solut huuhdottiin varovasti jääkylmällä sitoutumismediumilla. Soluja inkuboi-tiin seoksessa, joka sisälsi 1 ml trypsiinin ja EDTA:n seosta, 37 °C:ssa 15 minuuttia ja ne koottiin sitten tal- 15 teen. Soluihin liittynyt radioaktiivisuus määritettiin sitten gammalaskijalla. Liukoisen IL~lR:n kyky inhiboida IL~la:n sitoutumista endogeenisiin solureseptoreihin voidaan määrittää samalla menetelmällä. Analogisia meneelmiä ) voidaan käyttää määrityksissä, joihin liittyy liukoisen j 2 0 TNF~R;n käyttö:, |
Esimerkki 3 j
Hiimaäni-THF^R-cDHA: n. eristys ilmentämällä aktiivis- | ta proteiinia suoraan COS-7-soluissa j TNF-R:n ilmentymistä koskeva seulonta suoritettiin j 25 useille erilaisille humaanisolulinjoille käyttäen perus- j teenä niiden kykyä sitoa 125I-leimalla varustettua TKTF:ää, \ WI~26VA4 -hurnaanif ibroblastisolulinjan (ÄTCC CCL 95,1) havaittiin ilmentävän kohtalaisen määrän reseptoreja solua j kohti. Tasapainotilassa tehdyt sitoutumistutkimukset osoit- j 30 tiväh, että 125I-TNF:n sitoutuminen solulinjassa oli kaksi” ! vaiheista ja se käsitti noin 4 OÖÖ korkea-affiniteettista ] kohtaa (Ka = 1 x: 1Ö10 M'1)- ja 15 OÖQ mätala-af f initeettista :j kohtaa (Ka = 1 x 108 M’1) solua kohti, |
Valmistettiin koon suhteen jaottelematon eDHA-kir- j 35 jasto käyttäen sellaisesta totaali“RMA:sta eristetyn poly- | adenyloidun roRNAtn käänteistranskriptiota, joka oli uutettu 1 | ] 48 kermesmarjan mitogeenin läsnä ollessa kasvatetuista Wl-26 VA4 -humaanifibroblastisoluista vakiomenetelmiä käyttäen [Gubler, et ai., Gene 25 (1983) 263; Ausubel, et ai., eds.,
Current Protocols in Molecular Biology, Voi 1, (1987)].
5 Solut koottiin talteen hajottamalla solut guanidiinihydro-kloridiliuoksessa ja kokona!s-RNA eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla [March, et ai., Nature 315 (1985) 641],
Poly-A'1 -RNA eristettiin oligo-dT-selluloosakromato-orafialla ja kaksinauhainen cDNA valmistettiin menetel-10 maila, joka oli samanlainen kuin julkaisussa Gubler ja
Hoffman [Gene 25 (1983) 263] kuvattu menetelmä. Tämä tapahtui pääpiirteittäin siten, että poly-A*-RNA muunnettiin RNA-cDNA-hybridiksi käänteistranskriptaasi11a käyttäen älukkeena oligo-dT:tä. Tämän jälkeen RNA-cDNA-hybridi muun-15 nettiin kaksinauhaiseksi cDNAiksi käyttäen RNaasi H: ta yhdessä DNA-pölymeraasi Iin kanssa. Tulokseksi saadun kaksi-nauha is en ePNÄm päät tasoitettiin käyttäen T4 :n DNA-poly-xneraasia. Päistään tasoitettuun cDNArhan lisättiin EcoRI-kytkijäjaksoadapterit (nämä sisälsivät sisäiset Notl-koh-20 dat), jotka fosföryloitiin ainoastaan toisesta päästä j (Invitrogen). Kytkijä-adapterijaksot sisältävä cDNA käsi- j teltiin T4:n polynukleotidikinaasilla kytkijä-adapteri- j jakson 5'-puoleisen vapaaksi jääneen alueen fosforyloi- j miseksi ja ligatoitumattomat kytki jäjaksot poistettiin suo- ] 25 rittamalla CDNA:lie käsittely Sepharose CL4B -pylväässä.
Kytkijä-adapterijaksoilla varustettu CDNA ligatoitiin EcoRIilla pilkottuihin ja defösforyloituihin bakteriofagi kgtlQm käsivarsiin (Huynh, et ai.., CDNA Cloning: A
Practical Approach, Glover, ed., IRL Press, pp 49 - 78) , j 30 joiden molaarinen konsentraatio oli samansuuruinen. Liga- | to itu DNA pakattiin, faagiparCikkelexhin käyttäen kaupalli- | \ ..sesti saatavilla olevaa reagenssipakkausta rekombinantti- j kirjastot, aikaansaamiseksi (Stratagene Cloning Systems, San j
Diego, CA, USA) . Rekombinanttieri lukumäärää lisättiin { 35 edelleen maljäämällä faagi E. coli -kannan c600(hfl") | bakteerikasvuston pinnalle. j ] 49
Faagi-DNA puhdistettiin tulokseksi saadusta kgtlO :n cDNÄ-kirjaatosta ja cDNA-liitosjaksot irrotettiin pilkkomalla restriktioentsyymillä Notl. Pilkotulle seokselle agaroosigeelissä tehdyn elektroforeesin jälkeen eristettiin 5 yli 2 000 ep :n suuruiset cDNA-molekyylit.
Tulokseksi saadut cDNA-molekyylit ligatoitiin euka-ryoottiseen iImentämisvektoriin pCAV/NOT, joka oli suunniteltu ui s äkäs s oltuihin transfektoituna ilmentämään moni-paikkaiseen kloonauskohtaansa liitettyjä cDNA-jaksoja.
10 pCAV/NOT oli koottu pPC2öl:n [pMLSV:n johdannainen, joka on kuvattu aiemmin julkaisussa Gasman, et ai., Nature 312 (1984) 768], SfIÖ:n ja sytomegalöviruksen DNA:sta ja se sisältää transkription suunnassa replikaation alkukohdasta lueteltuna peräkkäiset jaksot, jotka ovat: (1) SV40-jaksot, 15 jotka ovat peräisin koordinaateista 5 171 - 270 ja joihin kuuluvat replikaation alkukohta, enhancer-j aksot ja varhainen ja myöhäinen promoottori; (2) sytomegalöviruksen jaksot, joihin kuuluvat promoottori- ja enhancer-alueet (nukleotidit 671 - + 63 jaksosta, joka on julkaistu jul-20 kaisussa Boechart, et ai, [Cell 41 (1985) 521]; {3) adenovirus-2 :n jaksot, jotka sisältävät ensimmäisen eksonin j ja osan intronia, joka sijaitsee kolmiosaisen, johtojakson ensimmäisen ja toisen eksonin välissä* toisen eksonin ja osan kolmiosaisen johto jaksot, kölmatta eksonia sekä moni-· 25 paikkaisen klponauskphdan (MCS), joka sisältää kohdat
Xholrlle, Kpnl:lle, Smalille, Notl:Ile ja Bgir-lle; (4) SV40:n jaksot, jotka ovat peräisin koordinaateista 4 127 -4 100 ja 2 770 - 2 533 ja joihin sisältyy varhaisen transkription polyadenylaatio- ja termiriaatiosignaalit; (5) 30 jaksot, jotka ovat peräisin pBR322:sta ja pBC2Ql:n virukseen liittyvistä VAI- ja VAXI-jaksoista, yhdessä adeno- f viruksen jaksojen 10 532 - 11 156 kanssa, jotka sisältävät ;! VAI- ja VAli-geenit, joiden jälkeen tulevat alueilta j 4 363 - 2 486 ja 1 094 - 375 olevat pBR322:n jaksot, jotka j 35 sisältävät ampisilliiniresistenssigeenin ja replikaation | j | ) 50 alkukohdan. pCAV/NOT on talletettu talletuslaitDkseen American Type Culture Collection hakunumerölla ATCC 68 014.
Tulokseksi saatua pCAV/NOT:ssa olevaa WI-26 VA4-cDNA-kirjastoa käytettiin. E. coli kannan DH5a transformoi-5 miseen ja rekombinantit maljattiin, jotta saataisiin aikaan noin 80S pesäkettä maljaa kohti ja riittävä määrä maljoja yhteensä noin 50 000 pesäkkeen aikaansaamiseksi seulontaa kohti. Pesäkkeet kaavittiin kultakin maljalta, yhdistettiin ja kustakin yhdistetystä preparaatista valmistettiin plas-10 midi-DNA. Tämän jälkeen yhdistettyä DNA:ta käytettiin transfektoimaan lähes konfluentti kerros apinan COS-7-solu-ja käyttäen DEAE-dekstraania, jonka jälkeen suoritettiin käsittely klorokiinilla julkaisuissa Luthman, et ai. [Nucl.
Acids Res:. 11 (1983) 1295] ja McCutehän, et ai. [J. Natl.
15 Cancer Inst., 41 (1986) 351] kuvatulla tavalla. Tämän jälkeen soluja kasvatettiin viljelmässä kolme päivää, minkä \
tarkoituksena oli saada liitetyt jaksot ilmentymään väli- I
aikaisesti. Kolmen päivän kuluttua soluviljelmien super- f
natantit heitettiin pois ja kullakin maljalla olevista I
20 yksi s;o Inker rpks i S ta määritettiin niiden kyky sitoa tnf : ää i menetellen tässä seuraavalla tavalla. Kuhunkin maljaan 1 lisättiin kolme millilitraa sitoutumismediumia, joka sisäl- i
si 125I-leiroalia varustettua Flag®-TNF:ää, jonka konsen- I
traatio oli 1,2 x 1Q“U M, ja maljoja inkuboitiin 4 °C:ssa 25 120 minuuttia. Tämän jälkeen tämä medium heitettiin pois ja
kukin maljoista pestiin kerran kylmällä sitqutumismediu- I
millä (tämä ei sisältynyt lainkaan leimalla varustettua | TNF:ää) ja kaksi kertaa kylmällä PBS:11a. Tämän jälkeen i kunkin maljan reunat poistettiin murtamalla, josta jäi jäi- 1
30 jelle laakea levy, joka saatettiin kosketukseen röntgen- I
i filmin kanssa 72 tunnin ajaksi 70 °C:ssa käyttäen vah- | vx s tus verkkoa julkaisussa Sims, et ai.. Science 241 (1:988) ] 585, kuvatulla tavalla, TNFiää sitova aktiivisuus saatiin j näkyville valotetuilla filmeillä tummana kohteena suht.eel- j 35: li s en yhtenäistä taustaa vasten. j \ i 51
Kun kirjastosta oli seulottu tällä tavalla noin 240 0:06 rekombinänttia, havaittiin, että yhdestä transfek-tanttiyhdishelmasta saatiin TNF:ää sitovia kohteita, jotka olivat selvästi näkyvissä taustan valottumista vasten.
5 Tämän jälkeen käytettiin positiivisesta yhdistelmästä peräisin olevaa pakastettua bakteerikantapreparaattia sellaisten maljojen valmistamiseksi, jotka sisälsivät noin 150 pesäkettä. Näistä maljoista tehtiin kopiokappaleet nitro-selluloosasuodattimille, jonka jälkeen maljoilta kaavittiin 10 materiaalia, valmistettiin plasmidi-DNA ja tämä transfek- toitiin edellä kuvatulla tavalla positiivisen maljan tunnistamiseksi. Tämän maljan nitroselluloosakopiosta peräisin olevista yksittäisistä pesäkkeistä saatuja bakteereja kasvatettiin 0,2 ml:n suuruisissa viljelmissä, joita käytet-15 tiin sitten sellaisen plasmidi-DNA:n valmistamiseen, joka transfektoitiin CÖ&-7-soluihin edellä kuvatulla tavalla.
Tällä tavoin eristettiin yksi klooni, joka kykeni aikaansaamaan humaani-TNF-R:n ilmentymisen CQS-soluissa. Tätä TNF-R-cDNA:ta sisältävä ilmentämisvektori pCAV/NOT on fcal-20 letettu talletuslaitokseen American Type Culture Collec- I
tion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852;, USA | {hakunumero 68 088) ja sille on annettu nimitys pCAV/NOT- | TNF-R.
Esimerkki 4 25 Liukoista huTNF-RÄ235: tä kooäaavien cDNA-molekyy li en konstruktio
Konstruoitiin cDNA, joka koodaa liukoista huTNF-RÄ235:ttä. Tämän molekyylin koodaama proteiini sisältää kuvion 2 A mukaisen aminohappo jakson -22 - 235. Sig-30 naalijakson muokkauksesta syntyy proteiini, jolla on kuvion 2A mukainen aminohappojakso 1 - 235. pCAV/NÖT-TNF-R:sta | pilkottiin restriktioentsyymeillä Notl ja Pvu2 840 ep:n \ suuruinen fragmentti. Notl:n katkaisukohta on pCAV/NOT-TNF- | R:n monipäikkaisen kloonauskohdan kohdalla ja Pva2:n kat- | 35 kaisukohta On TNF-R:ää koodaavalla alueella 20 nukleotidin j verran transmembraanialueesta 5'-puoleiseen suuntaan. | j 52 TNF-R-jaksojen 31-puoleisen pään uudelleenkanstruoimiseksi syntetoitiin kaksi oligonukleötidia ja ne liitettiin pituussuunnassa yhteen oligonukleotidikytkijäjakson muodosta-mis.eks i, j oka on: 5 jakso tunniste: nro 9 Pvu2 BamHl Bgl2 CTGAAGGGAGCACTGGCGACTAAGGATCCA GACTTCCC TC GTGAC CGCTGATTCCTAGGTC TÄG 10 AlaGluGlySerThrGlyAspEnd Tässä oligonukleotidikytkijäjaksossa on terminaaliset Pvu2-ja Bgl2-restriktiokohdat, se muodostaa uudelleen TNF-R:n kaksikymmentä nukleotidia, minkä jälkeen tulee terminaatio-15 kodoni (alleviivattuna) ja BamHl-xestriktiokohta (tämä on käyttökelpoinen eristettäessä kokonainen liukoinen TNF-R pilkkomalla Notl,: n ja BamHlm seoksella). Tämä öligonukleo-tidi ligatoitiin sitten 840 ep:n suuruisen Notl/Pvu2~TNF-R-liitosjakson kanssa Bgl2:n ja Notl:n seoksella pilkottuun 20 pCAV/NOT:hen plasmidin psolhuTNF-RÄ23 5/CAVNOT aikaansaami seksi, joka transfektoitiin CÖS-7-soluihin edellä kuvatulla tavalla. Tämä ilmentämisvektori indusoi sellaisen liukoisen humaani-TNF-R:n iImentyrnisen, joka kykeni sitomaan TNF:ää.
Esimerkki 5 25 Liukoista huTNF~RÄ185:tä koodaavien cDNA-molekyy- lien konstruktio
Konstruoitiin sellaista liukoista huTNF-RA185:ttä köodäava eDNA, jolla on kuvion 2A mukaisten kohtien -22 - f * ΐ 185 välinen aminohappojakso (tai aminohapot 1 - 185 sa.gnaa- | 30 lijakson muokkautumis en jälkeen asiaankuuluvassa isäntä- solussa), pilkkomalla pCAy/MÖT-TNF-R-sta 640 ep;n suux'uinen fragmentti restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2. Notl tri katkaisukohta on pCAV/NOT-TNF-R;n monipaikkaisen kloonaus-kohdan kohdalla ja Bgl2:n katkaisukohta on TNF-R:ää koo-35 haavalla alueella nukleotidin 637 kohdalla, joka sijaitsee 237 nukleotidiä transmembraanialueesta 5'-puoleiseen suun-
;S
53 taan. Syntetisoitiin oligonukleotidikytkijäjaksot, jotka olivat:
Jaksotunniste nro 10 5 Bgi2 5 ' -GATCTGTÄACGTGGTGGCCÄTCCCTGGGAÄTGCAAGCATGGäTGC-3 ' ACÄTTGCACCACCGGTAGGGÄCCCTTACGTTCG IleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspÄla 10 Jaksotunniste nro 11
Nqtl 5 ' - AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3 ’ täcctäcgtcägacgtgcaggtgcagggggtgggccactcgccgg
Vai Cy s Thr S erThr Ser ProThrArgEnd 15
Edellä olevat oligonukleotidikytkijäjaksot konstruoivat uudelleen reseptorimolekyylin 3’-puoleisen pään nukleotidiin 7Ö8 asti, jota seuraa terxninaatiökodöni (alleviivattu) . Nämä oligonufcleotidit ligatqitiin sitten 640 ep:n 20 suuruisen No tl-TNF-R-1i i tosj aks on kanssa Notl:lla pilkot- j
Luun pCAV/NOT:hen, minkä tuloksena saatiin ilmentämisektori ! ps oiTNFRAl85/CAVNOT, joka cransfektoitiin COS-7-soluihin | edellä kuvatulla tavalla. Tämä ilmentämisvektori indusoi ) liukoisen humaani-TNF-R:n ilmentyrnisen:, jolla on kyky sitoa |
25 TNF:ää. J
Esimerkki 6
Liukoista huTNF-KAl63:a koodaavien cDMA-molekyylien. j
konstruktio I
Konstruoitiin sellaista liukoista huTNF-RÄ163*a i 30 koodaava cDNA, jolla on kuvion 2A mukaisten kohtien -22 - j 163 välinen aminohappojakso (1 - 163 signaalijakson j j muokkautumisen jälkeen), pilkkomalla pCAV/NOT-TMF-R:sta 640 | ep: n suuruinen fragmentti restriktioentsyymeillä No tl ja Bgl2 esimerkissä 4 kuvatulia tavalla. Syntetisoitiin seu-35 naavat oligonukleotidikytkijäjaksot j -¾ 54
Bgl2 Notl Oäksq tunniste: nro 12 51 -Gätctgttgagc -3’
ACAACTCGCCGG
HeCysEnd 5 Tämä edellä oleva oligonukleotidikytkijäjakso konstruoi uudelleen reseptoriniolekyyiin 3' -puoleisen pään nukleotidiin 642 asti (aminohappo 163), ja tämän jälkeen seuraa terminaatiokodoni (alleviivattu). Tämä oligonukleotidi 10 ligatoitiin sitten 640 ep:n suuruisen Notl-TNF-R-liltoS'-· jakson kanssa Notl: 11a pilkottuun pCAV/NOT:hen, minkä tuloksena saatiin ilmentämisvektori psöiTNFRÄ16:3/CAWGT, joka transfektoitiin CÖS-l-soluihin edellä kuvatulla tavalla. Tämä ilmentämisvektori indusoi liukoisen humaani~ 15 TNF-R;n ilmentymisen, jolla on kyky sitoa TNF:ää esimerkissä 1 kuvatussa sitoutumismäärityksessä-Esimerkki 7 tiukoista huTMF-RÄ142 itä koodaavien cDNA-molekyy- j $
lien konstruktio I
20 Konstruoitiin liukoista huTNF-RÄ142:ta koodaava I
cDNA (tällä on kuvion 2A mukaisten kohtien -22 - 142 \ s välinen aminohappojakso (kohtien 1 - 142 välinen jakso sig- 1 naalijakson muokkautumisen jälkeen), pilkkomalla pCAV/NOT- j TNF-R:sta 550 epm suuruinen fragmentti restriktioemtsyy-25 meillä Notl ja AlwNl. AlwNl:n katkaisukohta on TNF:n koo- i daavalla alueella nukleotidin 549 kohdalla. Syntetisoitiin | ;ä oligonukleotidikytkijänaksot, jotka olivat: |
Jaksotunnis te nro 13 ;j 30 Bgl2 Notl
5'-GTGäAACATCAGäCGTGGTGTGCAäöCGGTGTTAAA-O' I
CTTGACTTTGTAGTCTGCACCACACGTTCGGGACAATTTCTAGA
End 35 Tämä edellä oleva oligonukleOtidikYtkijäjakso konstruoi uudelleen reseptorimolekyylin 3'-puoleisen pään nukleo- j | :i| il & 55 tidiin 579 asti (aminohappo 142}, jota seuraa terminaa— tiokodoni (alleviivattu} . Tämä oligpnuklaptidi ligatoitiin sitten 550 ep:n suuruisen No11 /AlwNl-TNF-R-1i i tos ja.kson kanssa Notl/Bgl2:11a pilkottuun pCAV/NOT:hen, minkä tulok-5 sena saatiin ilmentämisvektori ps olTNFRÄl42/CAVNO?, joka transfektoitiin COS-7-soluihin edellä kuvatulla tavalla.
Tämä ilmentämisvektori ei indusoinut sellaisen liukoisen humaani-TNF-Rrn ilmentymistä, joka olisi kyennyt sitomaan TNF:ää. Arvellaan, että tämä tietty nimenomainen konstruk-10 feio ei: kyennyt ilmentämään biologisesti aktiivista TNF-Riää, koska yksi tai useampi välttämättömistä kyste-: iiniryhmistä (esimerkiksi Cysl57 tai Cys163} , jotka tarvitaan molekyylin sisäiseen sitoutumiseen (TNF-R-molekyylin asiaankuuluvan fcertiäärisen rakenteen muodostamiseksi) oli 15 el imiiip i tuutit.
Esimerkki 8
Tyypin I humaani - IL·-1R: n cDNA-kloonien eristys cdnä, joka, kpodaa tyypin I humaani-IL-1R-proteiinia, eristettiin hybridisoimalla koettimeen, joka oli 20 peräisin tyypin I muriini-IL-lR-.n cDNA: sta. Tämän muriini- IL-1R:n cDNA:n kloonaus on kuvattu julkaisun EP-318 296 i esimerkissä 4. Muriini-cDNA:n sisältävä vektori on talletettu 19,11.1987 talletuslaitokseen American Type Culture Collection nimityksellä GEMBL78 ja sille on annettu haku-25 numero ATCC 67 563.
Tämän talletetun muriinikloonin 78 2 356 emäsparin (ep) suuruinen fragmentti eristettiin julkaisussa Sims, et ai. [Science 241 (1988) 585] kuvatulla tavalla ja se varustettiin radioaktiivisella leimalla käytettäväksi koettimena 30 käyttäen DNÄ-pplymeraasi-I:llä suoritettua katkostranslaatiota. Käytetty menetelmä oli olennaisesti samanlainen kuin j julkaisussa Maniatis, et ai. (Molecular Cloning: A. Labora- j tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) p. 109} j kuvattu menetelmä.
35 Tätä koetintä käytettiin seulontaan, jossa humaani- j IL-1R:ää haettiin humaani-cDNA-kirjastoista julkaisussa | | ] j 56
Sims, et a.1., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86 (1989) 8946, kuvatulla tavalla. Konstruoitiin cDNA-kirjasto käyttämällä sellaisen palyadenyloidun mRNA: n käänteistranskriptiota, joka oli eristetty kokonais-RlSfA: sta, joka oli uutettu sel-5 laisen humaani-T-solulinjän viljellyistä soluista, jolle oli annettu nimitys klooni 22 ja joka on kuvattu julkaisussa Acres, et ai. [J. Immunol. 138 (1987) 2132].
Näitä soluja viljeltiin julkaisussa Acres, et ai, (edellä) kuvatulla tavalla RFMX 1640 -mediumissa, joka sisälsi 10 10-%:ista Eetaalista naudan seerumia ja jossa oli OKT3- vasta-ainetta konsentraatiossa 10: ng/ral seka humaani-IL·-2: ta konsentraatiossa 10 ng/ml. cDNA tehtiin kaksinauhai-seksi käyttäen DNA-polymeraasi Intä/ sen päät tasoitettiin käyttäen T4:n DNA-pplymeraasia:, metyloitiin EcoRI-metylaa-15 silla cDNA;ssa olevien E,coRI:n Ratkaisukohtien suojaami seksi ja ligatoitiin EcoRI-kytkijäjaksoihin. Tulokseksi saadut konstruktiot pilkottiin EcoRI:11a kaikkien kytkijä- j jakson kopioiden pois-tamiseksi cDNA:n kummastakin päästä \ yhtä jaksoa lukunottamatta ja ligatoitiin AgtlO:n EcoRI:11a \ 20 pilkottuihin ja de-fosforyloituihin käsivarsiin (Huynh, et | ai., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL i
Press, pp. 49 - 78) . Ligatoitu DNA pakattiin faagipartik- \ “ * keleihin käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa reagens- j
sipakkausta (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA
2.5 92121) rekomhinanttikirjaston aikaansaamiseksi, Rekombinan- tit maljättiin E. coli -kannalle C60Q (hfl-) ja seulottiin j tavanomaisilla plakkihybridisaatiomenetelmillä kohtalaisen \ rajoittavissa olosuhteissa (50 °C, 6 x SSC). j
Useiden seulontakierrosten jälkeen kirjastosta | 30 eristettiin yhdeksän kloonia, jotka hybridisoituivat cDNA- 1 koettimeen. Nämä kloonit puhdistettiin plakkipuhdistuksella j ja niitä käytettiin bakteriofagi~DNA:n valmistamiseen, joka | pilkottiin EcoRI:11a. Pilkkomisseoksille suoritettiin elek- ] troforeesi agaroosigeelissä, blottaus nylonsuodattimille ja. | 35 niiden hybridisoituminen tutkittiin uudelleen. Rloon.it ] pilkottiin EcoRI:11a, jonka jälkeen suoritettiin prepara- j ] $ ;| i 57 tiivinen agaroosigeeiielektroforeesi ja jatkokloohaus:
RcoRI:llä pilkottuun vakiokloonausvektorin pBR322:n johdannaiseen (pGEMBL) , joka sisälsi polylinker-jakson, jossa oli ainutkertaisena esiintyvä EcoRI-kohta, BamHl-kohta ja 5 useita muita ainutkertaisena esiintyviä resctiktiokohtia.
Kuvaava esimerkki tämän tyyppisistä vektoreista on esitetty julkaisussa Dente, et ai* [Nucl. Acids Res* 11 (1983) 1645].
4,8 ke:n suuruisen humaani-IL-lR-kloonin restrik-10 tiokartoitus ja s elevens sointi antoi viitteitä siitä,, että tämä klooni sisälsi 518 aminohappoa koodaavar. jakson, jonka aminohappojakso vastaavaan marxinijaksoon verrattuna oli transmembraanialueesta molekyylin pään suuntaan olevalla solunulkoisella eli N-terminaalisella alueella 8ö-%:isesti 15 identtinen, transmembraanialueella 63-%:isesti identtinen ja sytoplasmlsella eli C-terminaalisella alueella 80-%: i-sesti identtinen. Humaani-iL-lR-kloonin 5'-puoleisesta osasta peräisin oleva 440 ep:n suuruinen EcoRI-NsiI-fragmentti varustettiin katkostranslaatiota käyttäen 32P-lei-20 maila edellä kuvatulla tavalla ja tätä käytettiin sellaisen cDNÄ-kirjaston seulontaan, joka oli tehty satunnais- i alukkeiden avulla edellä kuvatulla tavalla valmistetusta humaani-T-solulinjan kloonin 22 mRNÄrsta. Eristettiin 23 koettimeen hybridisoituvaa kloonia ja ne analysoitiin res-25 triktiokartoituksella. Yhdelle näistä klooneista tehdystä
sekvenssoinnista saatiin jaksoa koskevaa informaatiota, joka vastasi humaaniproteiinin 34 viimeistä N-terminaalista aminohappoa. Tämän tyypin I humaani-IL-1R:n täydellisen koodaavan alueen DNA-jakso ja siitä päätelty aminohappo-30 jakso on esitetty jaksötunnisteissa nro 5 ja 6. Tämä humaani -TT.-1 R-proteiini käsittää 569 aminohappoa (20 aminohapon mit-tainen signaalipeptidi mukaan luettuna), ja se sisältää 16 kysteiiniryhmää, joista 13 on säilynyt hiiren ja ihmisen I
geenien välillä. Humaanijaksossa on lisäksi 6 potentiaalis- j 35 ta N-glykosylaatiokohtaa, joista 5 on säilynyt hiiren ja j
ihmisen välillä. I
| | 58
Esimerkki 9
Tyypin il iL-lStiää koodaajien cDKA-molekyylien eristys
Tyypin II hiimaani-IL-lRiää koodaava DNA-jakso eris-5 tettiin cDNA-kirjastosta, joka oli valmistettu vakiomene-teImien avulla sellaisen polyadenyloidun RNA:n käänteis-transkription avulla, joka oli eristetty lyrnf oblas toidi-sesta humaani-B-solujen solulinjasta CB23, joka on kuvattu julkaisussa Benjamin & Dover, Blood 75 (1990) 2017.
10 Pääpiirteittäin voidaan todeta, että CB23-solulinja on EBV:llä transformoitu napaversn (CBj lymfosyyttisolulinja, joka oli valmistettu käyttäen julkaisussa Benjamin, et ai.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 3547, kuvattuja menetelmiä.
15 CB23-kirjasto seulottiin käyttämällä yhdistettyjen cDNA-fragment ti en modifioitua suoraa ilmentämistä apinan munuaissoluiinjassa CV1/ΞΒΝΑ-1 sellaisen nisäkäsilmentärais-vektorin (pCD4;Q6) avulla, joka sisältää SV40:stä, Epstein-Barrin viruksesta ja pBR322:sta peräisin olevat repli-20 kaation alkukohdat. pDC406 on julkaisussa Dover, et ai., J.
Immunol, 142 (1989) 4314 kuvatun HAV-BO:n johdannainen.
pGD406 eroaa HAV-EOrsta siinä suhteessa, että siitä on deletoitu HAV-EQ:ssa Olevassa adenovirus 2:n koImiosoisessa johto jaksossa oleva introni:, CV-l/EBNA-l-solulinja oli 25 valmistettu transfektoimalla CV-l-solulinja Epstein-Barrin viruksen tuma-antigeeni-1:tä (EBNA-1:tä) koodaavalla geenillä sekä CMV:n säätely j akso j a sisältävällä vektorilla sillä tavoin, että EBNA-1 ilmentyy humaani -CMV:; n esi varhaisen enhancer-jakson ja promoottorijakson yhdistelmän ohjaa- \ 30 mana. EBNA-1-geenin avulla EBV:n replikaation alkukohdan sisältävien ilmentämisvektoreiden, kuten pDC406rn, on mahdollista replikoitua episomina,
Transfektantit, jotka ilmentävät biologisesti aktiivista tyypin II IL-lR.-ää, tunnistettiin aluksi käyttäen 35 modifioitua objektilaseilla tehtävää autoradiografista
menetelmää olennaisesti julkaisussa Gearing, et ai., EMBO J
i ] j 59 J, 8 (1989) 3667 kuvatulla tavalla. Tämä tapahtui pää piirteittäin siten, että CV-l/EBNA-l-solut transfektoitiin suoraan objektilaseilla pDC406:ssa olevilla DNA-minipre-paraateilla, joka olivat peräisin yhdistetyistä cDNA-kloo-5 neista, ja soluja viljeltiin 2 - 3 päivää sillä tavoin, että niiden oli mahdollista ilmentää väliaikaisesti tyypin I IL-1R:ää„ Tämän jälkeen transfektoituja soluja sisältäviä ptjjektilaseja inkuboitiin 12Sl-IL-ip:ää sisältävässä mediumissa, pestiin sitoutumattoman leimalla varustetun IL-Ιβ:n 10 poistamiseksi, kiinnitettiin gluteerialdehydillä, kastettiin nestemäiseen yalokuvausemulsioon ja valotettiin pimeässä. Kun objektilasit oli kehitetty, ne tutkittiin yksittäin mikroskoopilla ja tyypin II !L-lR:ää ilmentävät positiiviset so-lut tunnistettiin autoradiografisten hopeajy-15 vien esiintymi-sen perusteeilä vaaleata taustaa vastaan.
Tätä lähestymistapaa käyttäen seulottiin noin 25 0 000 cDMA-molekyyliä noin 3 000 cDNA-molekyylin yhdistelminä käyttäen autoradiografista objektilasimenetelmää, kunnes yhden transfektanttiyhdistelmän määritys osoitti 20 siinä esiintyvän useita IL-Ιβ: n sitoutumisen suhteen selvästi positiivisia soluja. Tämä yhdistelmä jaettiin sitten 500 molekyylin yhdistelmiin ja seulottiin uudelleen objek- { tilasiautoradiografiällä. Tunnistettiin positiivinen yhdistelmä, Tämä yhdistelmä jaettiin edelleen 75 molekyylin yh-25 distelmiin ja seulottiin maljoilla tehdyillä sitoutumis- määrityksillä, jotka analysoitiin kvantitoimalla sitoutuneen i25I-XL-ip;n määrä. Solut kaavittiin maljoilta ja laskettiin sen määrittämiseksi, mikä 75 ehdokasta sisältävä yhdistelmä oli positiivinen. Tästä 75 ehdokkaan yhdistel- ] 30 mästä seulottiin yksittäisiä pesäkkeitä, kunnes turnis- | tettiin yksi klooni, joka ohjasi sellaisen ointaproteiinin f synteesiä, jolla oli havaittavaa IL-Ιβ:ää sitovaa aktiivi- j suutta. Tämä klooni eristettiin ja sen liitos jakso sek- ;j venssoitiin sen tyypin II humaani-IL-1R cDNA:n jakson mää- j 35 rittämiseksi, joka on esitetty tämän koodaaman aminohappo- jakson ohella jaksotunnis teissä nro 7 ja 8, Tyypin II j $ $ ! : | :¾ 60 humaani-IL-1R cDNA: ta sisältävä pDC406-klQoha:usvektori, jolle on annettu nimitys pHu IL-1R-II 75, talletettiin 5.7.19,90 E. coli -isäntäsoluissa talletn,^lait©?cs:ie.eEL. Aflieri-can Type Culture Collection, Rockville, MD. USA (ATCC) 5 hakunumero11a ATCC 68 337. Talletus tehtiin Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.
Kuten on asianlaita useimpien nisäkkäiden geenien suhteen, on nisäkkäiden tyypin II IL-1R otaksuttavasti moni eksonisten geenien koodaajaa. Tämän keksinnön suojapiiriin 10 katsotaan kuuluvan sellaiset vaihtoehtoiset mRHA-konstruktiot, jotka ovat tulosta erilaisista xnRNAm transkription jälkeisistä silmukoitumistapahtumista ja joissa esiintyy suuria identtisiä tai samanlaisia jaksoja sisältäviä alueita niihin cDNA-molekyyleihin verrattuna, joita tässä kek-15 sirniossä esitetyt patenttivaatimukset koskevat.
Esimerkki 10
Liukoista tyypin II humaani-IL-XR;ää koodaavien j cDNA-molekyylien konstruktio ja ilmentäminen j cDNA, joka koodaa liukoista tyypin II humaani-IL- j 20 lR:ää (jonka aminohappojakso on jaksotunnisteen nro 8 ami- j nohappojakson -13 - 333 mukainen), konstruoitiin polymeraa- j siketjureaktio (FCR) -monistuksella käyttäen templaattina | täysimittaista tyypin II IL-lRm cDNA-kloonia 75 (ATCC ]
68 337) vektorissa pDC406 (tämä on kuvattu esimerkissä 9). J
25 Konstruoitiin ensin 5'-puoleinen öligonukleotidialuke (jak- | sotunniste nro 14) ja 3'-puoleinen oligonukleotidialuke | (jaksotunniste nro 15j., jotka olivat: jaksotunniste nro 14: | 5'-GCGTCGACCTAGTGACGGTCÄTÄCAAATC-3' ! \
30 <SalI> I
jaksotunniste nro 15: j 5'-GCGCGGCCGCTCÄGGÄGGAGGCTTCCTTGACTG-3’ 1 <-No 11->End\1991 \1172 35 5'-puoleinen aluke vastaa tyypin II humaani-IL-lR-kloonin 75 (jaksotunniste nro 7) translaation osallistumattomalta s :| 61 alueelta peräisin olevia nukleotideja 31 - 51, joissa on 5' -puolelle lisätty Sall-restriktiökohdasta koostuva lisäosa; tämä nukleotidijakso kykenee liittymään pitkittäin yhteen siihen {-)-nauhaan, joka on komplementaarinen 5 humaani-kloonin 75 nukleotidien 31 - 51 suhteen. 3’-puoleinen aluke on komplementaarinen nukleotidien: 1 191 - 1 172 suhteen (tämä sisältää antisense-nukleotidit, jotka koodaavat tyy-pin II humaani-IL-IR kloonin 75 kolmea aminohappoa ja sen 5'-puoleiseen päähän on liitetty Notl-10 restriktiokohdasta ja lopetuskodonistä koostuva lisäosa.
1,5 ml:n vetoiseen Eppendorf-mikrosentrifugiputkeen lisättiin PCR-reagenssit, jotka olivat; 10 x PCR-puskuria (500 mM KC1, 100 mM Tris-HGl, pH 8,3,: 25 aG, 15 mM MgGl2 ja 1 milligramma gelatiinia mil li litrassa); (Perkins -Elmer 15 Cetus, Norwalk, GN) , 10 )il kutakin dNTP:tä sisältävää 2-mil-limolaarista liuosta (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP ja 2 mM d.TTP) , 2,5 yksikköä Taq-DNÄ-pplymeraasia (0,5 μΐ va-kioliuosta, jonka konsentraatio oli 5 000 yksikköä/ml) { (Perkins"Elmer Cetus), 50 ng templaatti-DNA:ta ja 5 μΐ kun- \ 20 kin edellä olevan oligonukleotidialukkeen liuosta, joiden j konsentraatio oli 20 μΜ, ja 74,5 μΐ vettä, jolla lopullinen j tilavuus säädettiin 100 piiksi. Valmiin liuoksen päälle j lisättiin 100 μΐ parafiiniö1jyä. PCR suoritettiin käyttäen | DNA-1ämmityssykii-inkubointi1aite11a (thermal cycler) (Eri- ] 25 comp, San Diego, CA) denaturoimalla templaätti aluksi ]
94 °C:ssa 90 sekunnin ajan, antamallä molekyylien liittyä I
pituussuunnassa uudelleen yhteen 55 °C:ssa 75 sekunnin ] ajaksi ja pidentämällä cDNÄ 72 °C:ssa 150 sekunnin ajan. f
Tämän jälkeen PCR:n suoritukseen käytettiin 20 monistus-30 sykliä käyttäen ohjelmallisesti säädettyjä vaiheita (dena- I
turaatio 94 °C:ssa, 25 s; yhteenliittäminen 55 °C:ssa, j 45 s; pidentäminen 72 °C:ssa, 150 s), jonka jälkeen käy- | tettiin viisi minuuttia kestävää pidentämistä 72 °C:ssa. ! ...... i Näyte poistettiin parafiiniölijystä ja DMA uutettiin ] 35 käyttämällä uuttoa fenolin ja kloroformin seoksella ja sen- j trifugoimalla tehtyä pylvaskromatografiaa G-50:ssa (Boeh- | ] | 0¾ $ 62 ringer Mannheim). 10 μ1:η suuruiset erät uutettua DNA:ta erotettiin elektroforeesilla l-%:isessa SeaKem-agaroosissa (FMC-Bioprodugts, Rockland, ME) ja värjättiin etidiumbromi-dilla sen varmistamiseksi, että DNA-fragment in koko oli 5· yhdenmukainen ennustetun tuotteen suhteen.
Tämän jälkeen pilkottiin 20 μΐ,-η erä PCR: 11a monistettuja cDNA-tuotteita Sali- ja Notl^restriktioentsyymeillä vakiomenetelmiä käyttäen. SaII-/NotI-restriktiofragmentti erotettiin sitten 1,2-%: isessa. matalassa lämpötilassa kyy-10 tyvässä (LGT) Seaplague^-agarooslssa ja fragmenttia: edustava vyöhyke eristettiin. Tämä fragmentti ligatoitiin pDC406-vektoriin tavallisella "geelin sisässä tehtävällä1' ligaatiomenetelmällä. Tulokseksi saatu vektori transfektoi-tiin GVl-EBNA-soluihin ja suoritettiin liukoisen IL-1R-15 proteiinin ilmentäminen.
Esimerkki 11
Di-TMF-Riää koodaavan vektorin konstruointi vektori, joka koodaa kaavan TNF-R-peptidikytkija- j jakso-TMF-R mukaista fuusioproteiinia ja joka on esitetty s 20 kuviossa 3, konstruoitiin seuraavasti. TNF-R-jaksossa ole- } vat asiaankuuluvat restriktioentsyymien katkaisukohdat on j myös esitetty kuvioissa 2A - 2B. ]
Ilmentämisvektöri, joka oli konstruoitu esimerkissä I
4 ja jolle oli annettu nimitys psol huTNF - RA2 35/ CAVNOT, j
25 pilkottiin Not X -restriktioentsyymillä, jonka katkaisu- I
kohta on pCAV/NOT-vektorin monipaikkaisen kloonauskohdan | kohdalla (toisin sanoen tähän liitettyyn TNF-R-jaksoon | nähden vastasuurmassa olevassa kohdassa). Not I:llä suo- 1 ritetusta pilkkomisesta syntynyt vapaaksi jäänyt nauhan osa j 30 täytet-tiin käyttäen DNA polymeraäsi I:n Kienow-fragmenttia | tasaisen pään aikaansaamiseksi. Tämän jälkeen vektori pii- j kottiin Bam HI:11a, jonka katkaisukohta sijaitsee myötä- j suuntaan aminohappoa 235 vastaavan kodonin jälkeen sijäit- | sevasta lopetuskodönlsta, esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. ] j 35 Notl/Bam HI -fragmentti, jonka päät oli tehty j tasaiseksi ja joka sisälsi TNF-R-jakson, eristettiin tavan- ] ί 63 omaisten menetelmien mukaisesti ja liitettiin plasmidi-vektoriin, josta käytettiin nimitystä pCAV/DHFR ja joka oli pilkottu Sma Iillä ja Bgl II:11a. pCAV/DHFR-vektor i on iImentämisvektori, joka sisältää monipaikkaiseen kloonaus-5 kohtaan nähden vastasuunnassa sijaitsevat SV40:n promoottori jaksot: sekä muita esimerkissä 3 kuvattuja pCAV/ΝΟΤ:n piirteitä ja jossa selektiomarkkerina on myös dihydrofo-laattireduktaasi (DHFR) -geeni. Niille nisäkässoluille, jotka ovat saaneet sisäänsä vektorin mutta jotka ovat 10 muutoin DHFR~-tyyppisiä, on DHPR-geenistä hyötyä selektiossa, jossa soluja kasvatetaan metotreksaatin {MTXj läsnä ollessa. Pilkkomisesta Sma I:llä saadaan syntymään tasaiset päät, joihin TNF-R;n sisältävän fragmentin Not I:11ä tasaiseksi tehdyt päät ligatoidaan. Bgl 11:11¾ syntyneet vapaak-15 si jääneet nauhan päät ligatoidaan TNF-R:ää sisältävän fragmentin päihin, jotka on saatu pilkkomalla Bam Hiillä.
Ligaatio hävittää Bam Hl- ja Bgl li -kohdat. E. coli -solut transformoidaan ligaatipseoksella tavanomaisten menetelmien avulla. Plasmidi-DNA otetaan talteen isäntäsoluista ja 20 haluttu konstruktio varmistetaan oikeaksi restriktioana- I
lyysillä. Tulokseksi saadulle vektorille, joka sisältää | TNF-R-liitosjakson, on annettu nimitys pCAV/DHFR/TNF-R.
Eristettiin DNA-fragmentit, jotka on tarkoitettu j
käytettäväksi kahta sellaista TNF-R-polypeptidiä koodaavan. I
25 vektorin valmistamiseksi, joissa nämä ovat peptidikytkijä- ] jakson erottamina, ja nämä olivat: j (A) pCÄV/DHFR/TNF-R-vektorin Asp718 (restriktioent-syymi) - Esp I -fragmentti. Asp718 pilkkoo vektorin siihen | liitettyyn TNF-R-jaksoon nähden vastasuunnassa olevasta j 30 kohdasta; Esp I (tämä on saatavilla U.S. Biochemicals -yhtiöstä) , pilkkoo TNF-R-jakson kuviossa 2A esitetystä kohdasta. Halutun fragmentin pituus on noin 6,7 kilo emä spar ia j (kep) ja se sisältää vektorin jaksot ja TNF-R-jakson 3 ' - j puoleisen pään. j 35 (B) Esimerkissä 4 konstruoidun ja plasmidiksi psol ) hu TNF-R Ä235/CAVNOT nimitetyn iImentämisvektorin Asp718 - j | 64
PvuII -fragmentti, Asp7l8 pilkkoo vektorin siihen liitettyyn TNF-R-jaksoon nähden vastasuunnassa olevasta kohdasta.
Haluttu 865 ep:n suuruinen fragmentti sisältää TNF-R-jakson, joka ulottuu 5'-puoleisesta signaalijaksosta esimer-5 kissa 4. esitettyyn Pvu II -kohtaan.
(C) Kaksinauhäinen oligonukleotidi, jolla on jakso (jaksotunnisteet nro 16 ja 17): 5’ ctgäagggagcactgqcgäoggtggcggtggatccggcgötGgcggcgoctcättgcccgcccagg 31 10 3 GÄCTtCCCTCGTGACCGCTGCCACCGCCACCTÄGGCGGCCAeeGCeGCCGAeTAACGGGCGGGTCC 3'
GluGlySerThrGlyAspGiYGlyGl^iySarGlyGIyGlyGlyGlySerlieuPi-oAlaGlnVal (D) Esimerkissä 4 konstruoidun ja plasmidiksi psol hu TNF-R Ä235/CAVNOT nimitetyn ilmentämisvektorin Bgl I ~ 15 Espl -fragmentti. Halutun fragmentin pituus on noin 304 ep,
Bgl I pilkkoo TNF-R:n aminohappoa 5 (Vai) vastaavan kodonin I
sisällä olevasta kohdasta; Esp I pilkkoo TNF-R: n jakson j
kuviossa 2A esitetystä kohdasta; fragmentti (A) muodostaa I
loppuosan (3'-puoleisen pään) tästä liukoista TNF-R:ää 20 koodaävasta jaksosta.
Qligonukleotiäi (C) valmistetaan oligonukleotidi en kemialliseen synteesiin käytettävillä tavanomaisilla mene- ; telmi11JL Tämä oligonukleotidi konstruoi uudelleen ensim- \ maisen TNF-R:n jakson 3'-puoleisen pään Pvu II -kohdasta j 25 solunulkoisen domeenin viimeiseen aminohappoon (asemassa j
235 oleva Asp). Tämä oligonukleotidi sisältää myös lukuke- I
hyksessä olevan jakson, joka koodaa peptidikytkijäjaksoa 1
Gly^Sef GlysSer. Oiigonukleotidin tämän osan jaksoa voidaan j
haluttaessa muuttaa muita peptidikytkijäjaksoja koodaavak- I
\ 30 si, Oligonukleotidi C konstruoi myös uudelleen toisen TNF- j
R:n jakson 5'-puoleisen pään leusiinia vastaavasta kodo- I
riista, joka on kypsän proteiinin ensimmäinen aminohappo, j
nauhan 3'-puoleisessa yli jääneessä osassa olevaan valiinia I
(aminohappoa 5) vastaavaan osittaiseen kodon!in, millä Vai- j 35 kodoni muodostuu uudelleen ligatoitaessa tämä nauha siihen j | |
J
il 65 komplementaariseen vapaaksi jääneeseen nauhan osaan, joka sijaitsee fragmentin D Bgl 1:11a pilkotussa päässä.
Kirjaimilla A - D merkityt DNA-fragment it liga-toitiin toisiinsa kUviDssa 3 esitetyistä asemista sellaisen 5 vektorin muodostamiseksi, jolle annettiin nimitys pCAV DHFR Di-TNF-R ja joka koodaa tämän keksinnön mukaista fuusio-proteiinia. E. coli -soluja transformoidaan ligaatioseok-sella tavanomaisten menetelmien avulla. Plasmidi-DNA otetaan talteen isäntäsoluista ja haluttu konstruktio varmis-10 t ethän. restfiktioanalyysillä, Tämän ilmentämisvektorin koo daama vastasuunnassa oleva TNF-R-polypeptiöi sisältää jak-sotunnisteen nro 2 mukaiset aminohapot -22. - 235 (toisin sanoen liukoisen TNF-R:n, joka sisältää N-terminaalisen jakson ja kokonaisen solunulkoisen domeenin mutta joka ei 15 sisällä lopetuskodonia). Myötäsuunnassa olevasta TNF-R- polypeptldistä puuttuu signaalijakso ja se sisältää jakso-tunnisteen nro 2 mukaiset aminohapot 1-235 ja välittömästi aminohapon 235 jälkeen sijoitetun Ippetuskodonin.
Tämän nimenomaisen konstruktion peptidikytkijäjakso oh j 20 Gly^SerGlysSer. j Tällä ilmentämisvektorilla transfektoidaan nisäkäs-soluja tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja niitä viljellään ) halutun fuusioproteiinin tuottamiseksi. Yksi sopiva nisä- \ kässolulinja on DHFR'-tyyppinen kiinanhamsterin munasarja-25 solulinja, jolle on annettu nimitys GHO-Kl ja joka on \
saatavilla talletuslaitoksesta American Type Culture Col- I
lection, Rockville, MD, hakunumeroila CCL61. Solut voidaan i
trans fektoläa ilmentämisvektorilla tavanomaisella kalsium-fosfaattisaostuksella olennaisesti julkaisussa Graham ja I
30 van der Eb, Virology 52 (1983) 456, kuvatulla tavalla. j
Transfektoituja soluja viljellään tarkoitukseen sopivissa i tavanomaisissa olosuhteissa ja halutun fuusioproteiinin j esiintyminen spluviljelymediumissa varmistetaan määrityk- | sillä, kuten esimerkeissä 1 ja 2 kuvatuilla määrityksillä. j 35 Toinen sopiva nisäkässolui in ja on CQS-7-splulinja. j
Yhdessä kokeessa COS-7-solut transfektoitiin edellä kuva- I
$ • § 6:6 tulla TNF-H-dimeeriä koodaavalla iImentamisvektorlila ja soluja viljeltiin sillä tavoin, että niiden oli mahdollista ilmentää dimeeriä. Konsentroimattomasta supernatant is ta (tämä sisälsi eritettyä dimeeriä) määritettiin sen kyky '5 inhiboida radioaktiivisella jodilla varustetun muriini-TNFarn sitoutumista U937-soluun (tämä on TNFtn endogeenisiä reseptoreita sisältävä humaanimonosyyttiä muistuttava solu-linja) . Suoritettiin sitoutumia inhibitiomääritys tavanomaisten menetelmien mukaisesti, jotka olivat samanlaiset 10 kuin esimerkin 2 osassa C kuvatut menetelmät* Negatiivi sissa konirollikoeputkissa (epäspesifisen sitoutumisen määrittämiseen) oli radioaktiivisella leimalla varustamatonta TNFa:aa, 09 3 7-SO lii ja 'ja radioaktiivisella jodilla varustettua TNFa: aa. Positiiviset kontrollikoeputket (inhiboi-15 irtät tornissa, olosuhteissa saatavan maksimiarvon määrittä miseksi radioaktiivisena jodilla varustetun TNFa:n sitoutumiselle ΪΙ9 3 7-soluihin) sisälsivät sitoutumismediumia, U937“Soluja ja radioaktiivisella jodilla varustettua j TNFa:aa. Dimeeriä sisältävä supernatantti inhiboi yli 90 % j 20 positiivisella kontrollilla havaitusta TNF :n sitoutumisesta j U9 37 -soluihin:. j
Esimerkki 12
Yhtä IL-lR-polypeptidiä ja kahta TNF-R-polypeptidiä ] sisältävä fuusioproteiini | 25 Plasmidivektori, jossa on kaavan IL-lR-peptidikyt- \ kijäjakso-TNF-R-peptidikytkijäjakso-TNF-R mukaista fuusio- |
proteiinia koodaavaa DNA:ta, konstruoidaan seuraavalla I
tavalla. |
Liukoista, tyypin I IL-lR-polypeptidiä koodaava cDNA 30 eristettiin ja monistettiin tunnetulla polymeraasiketjureaktio (PCP.) -menetelmällä. Syntetoitiin PCR-reaktiossa alukkeina käytettäviksi tarkoitetut öligönufcleotidit, jotka olivat: 67 jaksotunniste nro 18: 5' ACCGÄGGGACCTGAGCG 3’ jäksotunniste nro 19:
5: 3 ’ TeAATTATATAGGTCAGTGACeACCGCCACCTAGGCCGCCACCGC
CGCCGAGT 5’ Nämä sekä tuonnempana tarkasteltavat oligonukleotidit syntetoidaän tavanomaisin menetelmin, esimerkiksi käyttäen; 10 automaattista DNA-synteesilaitetta, kuten yhtiöistä Bio-search, Inc,, San Rafael, Kalifornia, tai Applied Biosys-tearns, saatavilla olevia laitteita. PCR-reaktiossa käytetty templaatti on plasmi&ivektori, joka on valmistettu liittämällä vektoriin tyypin I humaani-IL-lR:n cDNA ja jolle on 15 annettu nimitys SF GAV. SF CAV -vektori on kuviossa 5 esitetty nisäkäsilmentämisvektori (tässä on esitetty SF CAV:n käyttö yhdessä muussa tuonnempana kuvattavassa vektori-konstruktiossa) . E. coli -soluissa oleva SF CAV talletet- j tiin 27.2,1992 talletuslaitokseen American Type; Culture \ 20 Collection Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti ja sille on annettu hakunumero 68 922.
SF CAVissa olevat SV40-, CMV-, pA- ja VA-jaksot j sekä ampisilliiniresistenssigeeni ovat samanlaiset kuin, j plasmidin pCAV/NOT edellä olevassa esimerkissä 3 kuvatut 1 , j 25 jaksot gä myös PCT-patenttihakemusjulkaisun WG 90/05 183 | esimerkissä 8 ja kuviossa 3 kuvatut; jaksot. Monipaikkainen kloonauskohta, joka sijaitsee adenovirus-2:n kolmiosaisen j johtojakson (TPL) ja pA-jakson välissä, sisältää restrik- \ tioendonukleaasien Xhol, Kpnl, Smal, NotI ja Bgll tunnis- *
30 tuskohdat, TPL-jakso eroaa pCAV/NOTm tpl-jaksosta siinä, I
että SF GAV:n TPL-jaksosta on deletoitu IL-lR-.ää koodaavien vektorien konstruktiolle haitalliseksi arveltu alue. Tämä haitallinen vaikutus IL-lR-vektoreihxn voi mahdollisesti johtua jaksossa olevasta haitallisesta kryptisestä promoot-35 torista, josta haitallinen proteiini ilmentyy E. colissa. 1 68 Vähäinen hiomaani - IL- IE- n ilmentyminen kryptisestä promoottorista voi olla toksista bakteereille.
SF CAV pilkotaan Smal :11a, joka tunnistaa moni-paikkaisessa kloonauskohdassa olevan ainutkertaisena esiin-5 tyväh restriktiokohdan ja muodostaa tasaiset päät. DNA-fragmenfcti, joka sisältää tyypin I IL-IE:n cDNA:n, valmistetaan käyttämällä pilkkomista StyI:n ja Bglll:n seoksella, jonka jälkeen vapaaksi jääneet päät täytetään käyttäen DNÄ-polyroeraasi I:n Klenow-fragmenttia tasaisten 10 päiden aikaansaamiseksi. StyI:n katkai sukohta on jakso-tunnisteen nro 5 nukleotidin 49 kohdalla ja Bglllm katkai-sukohta on nukleotidin 1 997 kohdalla. IL-lR:n cDNA-fragment: tl ligatoidaan Smal:llä pilkottuun SF CAV -vektoriin ja E. coli -solut transformoidaan ligaatioseoksella vakiomene-15 telmillä. Tulokseksi saatu vektori otetaan talteen E. coli -soluista ja tätä käytetään tempiaattina ECR-reaktiossa.
5'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 18) vastaa sitä .17 nukleotidin suuruista jaksoa, joka esiintyy vektorissa vastasuuhtaän vektoriin liitettyyn IL-1R cDNArhan 20 nähden. 3'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 19) sisältää J
segmentin, joka on komplementaarinen jaksotunnisteen nro 5 \ nukleotidien 1 060 - 1 079 suhteen, jotka koodaavat IL-lR:n j solunulkoisen domeenin C-terminaalisen pään lähettyvillä olevia aminohappoja 306 (osittainen kodon!) - 312. Tämä | 25 3'-puoleinen aluke sisältää myös peptidikytkijäjaksoa {
Gly^SerGlysSer koodaavan jakson. !
Suoritetaan PCR-reaktio millä tahansa sopivalla \ menetelmällä, kuten menetelmillä,: joita on kuvattu julkai- i SUssa Särki, et ai., Science ;23j (1988) 487; teoksessa j 30 Recombinant DNA Methodology, Wu, et ai, , eds., Academic j
Press Inc,, San Diego (1989) pp 189 - 196; sekä teoksessa PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et ai., eds,, Academic Press, Inc. (1990), Sopivaa PCR-menetelmää edustava esimerkki on seuraavaksi esitettävä s 35 menetelmä. Kaikki lämpötilat on ilmoitettu celsiusasteina. j 0,5 ml:n vetoiseen Eppendorf-mikrosentrifugiputkeen lisä- j j •ä | 69 tään PCR-raagenssit, jotka ovat: 10 μΐ 10 x PCR-puskuria (500 mM KCl f, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 25 QC:ssa, 25 mM MgCl2 ja 1 mg gelatiinia millilitrassa) {..Perkin-Elmer Cetus,
Nor^alk, CN) , 8 μΐ liuosta, jonka konsentraatio on 2,5 mM 5 ja joka sisältää kutakin dlJTP:tä: (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP ja 2 inM dTTP) , 2,5 yksikköä Taq DNA-palymeraasia (Perkins-Elmer Cetus) (0,5 μΐ standardi liuos ta·, jossa on 5 000. yksikköä millilitrassa) , 1 ng templaatti-DNA: ta, 1 ö0 pikomoolia kutakin oligonukieotidialuketta sekä sell äitien 10 määrä vettä, että lopulliseksi tilavuudeksi saadaan 100 μΐ.
Lopullisen seoksen päälle pipetoidaan 100· μΐ parafiiniöljyä. PCR suoritetaan käyttäen .'DNA- lämpösykii-inkubo inti -laitetta (Erieomp, San Diego, CA), Templaatti denaturoidaan 94 ”C: ssa 5 minuutta ja PCR suoritetaan käyttäen 25 monis-15 tussykliä ja käyttäen vaiheittaista ohjelmaa (denaturaatio 94 °C:ssa, 1,5 minuuttia; yhteenliittäminen pituussuunnassa 60 °C:ssa, 1 minuutti; pidennys 72 °C:ssa 1 minuutti).
Reaktioseoksesta otetun näytteen elektroforeesista l-%:sessa matalassa lämpötilassa sulavassa (LMT) SeaKem-20 agaroosissa (FMC BioProducts, Rockland, ME) ja etidiumro- midivärjäyksestä saadaan PCR-reaktion tuotteena näkyviin j yksi odotettua kokoa oleva DNA-fragmentti. PCR:llä monistettu DNÄ-fragmehtti käsittää lyhyen vektorijakson, joka sisältää Asp718-restriktiokohdan, joka on vastasuuntaan IL-25 lR:n aminohappoja 1 (Asp) - 312 (Thr) koodaavaan jaksoon nähden ja jonka jälkeen tulee peptidikytkijäjaksoa koodaava yksinauhainen segment1i.
Suoritetaan toinen PCR-reaktio liukoista TNF-R-po-lypeptidiä koodaavan cDNA-fragmentin er is tämiseksi ja
30 monistamiseksi. Templaatti oli vektori, jolle esimerkissä 4 I
oli annettu nimitys psolltuTNF-R A235/CÄVNQT ja. joka sisäl- j
tää jaksotunnisteen nro 1 mukaisia TNF~R:n aminohappoja I
-22 - 235 koodaavan cDNA-liitosjakson. Reaktiossa käytetyt | alukkeet ovat: | ] :1 $ 70 jaksotunniste nro 20: 51 GGTGGCGGTGGÄTCCGGCGGTGGCGGCOGCTGäTTGCCCGCCCAGGTQGCA 3' jaksotunniste nro 21: 5 3' TGäCGCGCGACTCGTTCG 5' 5'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 20) sisältää peptidi-kytkijäjaksoa koodaavan segmentin, joka on komplementaarinen jakso tunnisteen numero 19 mukaisen alukkeen peptidi-10 kytkijäjaksoa koodaavan osan suhteen. Tätä kytkijäjaksoa koodaavaa segmenttiä seuraa kypsän TNF-R:,n kuutta ensimmäistä aminohappoa vastaavat kodonit (Leu-Ala.).
3'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 21) sisältää nukleotideja:, jotka ovat komplementaarisia TNF-R:n jakso-15 tunnisteen nro 1 mukaisten nukleotidien 461 - 478 suhteen, jotka koodaavat aminohappoja 103 (Tyr, osittainen kodoni) -109 (Gin, osittainen kodoni) .. Tähän alukkeeseen 'Sisältyy myös Espl-restriktiokohta, joka, esiintyy luontaisesti TNF-R-proteiinin tässä osassa.
20 PCR-reaktio suoritetaan edellä kuvatulla tavalla. |
Tällä toisella PCR-reaktiolla monistettu DNA-fragmentti I
sisältää edellä kuvatun kytkijäjaksoa koodaavan segmentin, jota seuraa TNF ~R: n aminohappo jaksoa 1 (Leu) - 109 (Gin, osittainen kodoni) koodaava jakso. Tämä DNA-fragmentti 25 visualisoidaan elektroforeesilla, jonka jälkeen geeli värjätään etidiumbrpmiäilla edellä kuvatulla tavalla. Suorite taan kolmas PCR-reaktio, jolla on tarkoitus eristää sellainen monistettu kaks inauhainen DNA-fragmentti, joka sisältää kytkijäjakson erottamat IL-lR:n ja TNF-R:n jaksot.
30 0,5 ml;n vetoiseen koeputkeen yhdistettiin reagenssit, \ jotka olivat: f 3 μΐ (noin 5 - 10 ng) edellä olevassa ensimmäisessä j PCR-reaktiossa monistettua IL-lR-peptidikytkijäjakso-DNA- j fragmenttia - 3 μ1:η suuruinen näyte otetaan suoraan LMT- |
35 agaroosista mikröpipetillä käyttäen UV-valoa etidiumbro- I
] 71 mielillä värjätyssä: geelissä olevan halutun vyöhykkeen visualisoiraiseen 3 μΐ (noin 5 - 10 ng) edellä olevassa toisessa PCR-reaktiossa monistettua peptidikytkijäjaksa-TNF-R-DNA-frag- 5 menttia - 3 μΐ:n suuruinen näyte pipetoidaan mikropipetillä suoraan halutun vyöhykkeen sisältävästä LMT-agaroösialuees- ta 10 ui 10 x PCR-puskuria (tämä on kuvattu edellä) 100 prnol 5'-puoleisena alukkeena käytettävää jaksa-10 tunnisteen nro 18 mukaista oligonukleotidia 100 pmol 3'-puoleisena alukkeena käytettävää jakso-tunnisteen nro 21 mukaista oligonukleotidia 4 ui 2,5-millimolaarista liuosta, joka sisältää kutakin neljää dNTP:tä 15 0,5 μΐ Taq-DNA-polymeraasia (5 yksikköä/μΐ) vettä lopullisen tilavuuden säätämiseksi 100 ui:ksi PCR-reaktiosyklit suoritetaan edellä mainituissa lämpötiloissa ja käyttäen edellä mainittuja aikoja. Aloitettaessa käytetyn denatureintivaiheen jälkeen liittyvät 20 näiden kahden dna-fragmentin komplementaariset peptidikytki jä jakso ja koodaavat segmentit pituussuunnassa yhteen.
Reaktion lopputuote on tasaiset päät sisältävä kaksi-nauhainen monistettu DNA-fragmentti, jonka pituus on noin 1 370 ep ja joka sisältää peptidikytkijäjaksoa koodaavaan 25 jaksoon nähden vastasuunnassa olevan IL-lR:n DNA-jakson ja näiden jälkeen tulevan TNF-R:n DNA-jakson.
Tästä kolmannesta PGR-reaktioseoksesta oleva 25 μ1:η suuruinen näyte: saatetaan reagoimaan puhdistamattomana restriktioentsyymien Asp718 ja Espl kanssa, Asp 718:n kat-30 kaisukohta on, kuten edellä jo mainittiin, vastasuunnassa IL-1R-jakson edellä, Esplrn katkaisukohta on TNF-R-jäkson sisällä kuten kuviosta 2A ja edellä olevasta tarkastelusta $ käy ilmi. Restriktioendonukleaasi Cell II on Espl:n iso- j skitsomeeri ja sitä voidaan käyttää Espl;· n. tilalla. Haluttu ] 35 fragmentti, josta tuonnempana käytetään nimitystä fragment- j ti E, puhdistetaan tavanomaisin menetelmin, kuten erotta- j i j 72 maila se geelielektroforeesilla, esimerkiksi matalassa lämpötilassa sulavassa 1,0~%:iöessa Seaplaque-agaroDsigeelissä ja eristämällä haluttua fragmenttia edustava vyöhyke.
Eristetään kaksi muuta DNA-fragmen11ia, joille on 5 annettu nimitykset F ja G, ja nämä yhdistetään fragmenttiin E sellaisen ilmentämisvektorin konstruoimiseksi, jossa on toinen TNF:-R-jakso, joka on liitetty (peptidikytkijäjakson välityksellä} myötäsuuntaan edellä olevan esityksen mukai-sesti valmistetun IL-lR-kytki jäjakso-TNF-R-DiJä- fragmentin 10 suhteen. Tulokseksi saatava vektori ja sen sisältämät fragmentit F*» F ja G on esitetty kuviossa 4.
DNA-fragmentti, josta on käytetty nimitystä F, valmistetaan pilkkomalla kuviossa 3 esitetty ja esimerkissä 11 konstruoitu vektori EspI:11a. Eristetään fragmentti, 15 joka sisältää TNF-R:n 3’-puoleisen osan {tämä ulottuu kuviossa 2A esitetystä Espl-kohdasta aminohappoa 235 vastaavaan kodoniin) , tämän jälkeen tulevan Gly4SerGly5Ser-peptidikytkijäjaksoa koodaavan jakson ja tämän jälkeisen toisen TNF-R-jakson, joka ulottuu aminohappoa 1 (L,eu) vas- !
20 taavä:Sta: kodonista kuvion 3 mukaisen vektorin toisessa I
{myötäsuuntaan olevassa) TNF-R-jaksossa olevaan Esp'I-kohtaan, Tästä fragmentista, jonka pituus on noin 739 emäs-paria,; on tuonnempana käytetty nimitystä fragmentti F.
Fragmentti G, joka sisältää vektorin jaksoja 25 (mukaan lukien DHFR:n) sekä TNR-R-jakson 31-puoleisen osan, eristetään "silmukoitunutta muotoa sisältämättömästä" vektorista seuraavalla tavalla. Esimerkissä 11 valmistettu pCÄV/DHFR/TNF-R-vektori sisältää jakson, jonka arvellaan | olevan epäedullinen IL-lR:ää koodaavien vektorien konstruk- il 30 tiolle, mikä johtuu mahdollisesti tässä jaksossa olevasta j kryptisestä promoottorista, josta haitallinen proteiini il- j mentyy E. colissa:. Valmistettiin pCAV/DHFR/TNF-R:n johdan- j nainen korvaamalla haitallisen jakson sisältävä Ndel/Asp; | 718 -vektorifragmentti silmukoitunutta muotoa sisältämät- j 35 tömästä vektorista SF CAV (ATCC 68 922, tämä on kuvattu j
S
73 edellä) peräisin olevalla Ndel/Asp: 718 -fragmentilla. Tämä konstruktio on esitetty kuviossa 5.
SF CAV pilkotaan Ndel :1,1a ja Asp 718:11a (aiiautker-taisena esiintyvät kohdat tässä plasmidissa) ja eristetään 5 kuviossa 5 oleva noin 500 ep::n suuruinen fragmentti, josta on käytetty nimitystä H. Fragmentista H puuttuu pCAV/ DHFR /TNF-Rn vastaavassa fragmentissa esiintyvä haitallinen jakso.
Esimerkissä 11 valmistettu ja kuviossa 5 esitetty 10 pCÄV/DHFR/TNF-R-vektori pilkotaan Asp 718:11a, Espl:lla ja Hdelrlla. Eristetään noin 495 ep:n suuruinen Asp 718/EspI-fragmentti {fragmentti I). Eristetään myös noin 4 647 ep:n suuruinen NdeT/EspI-fragmentti (fragmentti J).
Edellä olevan esityksen mukaan valmistetut DNA-15 fragmentit H, 1 ja J ligatoidaan toisiinsa kuviossa 5 esitetyn vektorin SF CAV/DHFR/TNF-R muodostamiseksi, joka ei sisällä siimukoitunutta muotoa. E. coli -solut transformoidaan ligaatioseoksella tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Plasmidx-DNA otetaan talteen isäntäsoluista ja haluttu 20 konstruktio: varmistetaan oikeaksi restriktioanalyysillä.
Tämän jälkeen SF pCäV/PHFR/TWF-r pilkotaan Asp 718:11a ja Espl:lla. Fragmentti, josta kuviossa 5 on käytetty nimitystä G, sisältää vektorin jaksoja (mukaan lukien DHFR:n) ja. TNF-R::n j akson 3' -puoleisen pään ( sisäisestä Espl-koh-25 dasta aminohappoa 235 koodaavaan kodoniin ja tätä seuraa-vaan lopetuskodoniin asti) ja se eristetään tavanomaisin menetelmin.
Edellä valmistetut dna-fragmentit: E, F ja G liga- i toidaan toisiinsa sellaisen vektorin muodostamiseksi, joka 30 on esitetty kuviossa 4 (ja jolle on annettu nimitys SF CAV DHFR tri-R). E. coli -solut transformoidaan ligaatioseoksella ja haluttu plasmidi otetaan talteen edellä kuvatulla tavalla. Tämän vektorin koodaama fuusioproteiini (N-terminaalisesta päästä C-terminaaliseen päähän lueteltuna) si-35 sältää tyypin I lL-lR:n aminohapot -20 - 312 (jaksoturmiate nro 5) ; GlyiSerGlysSer-peptidikytkijäjakson,*: TNF-R:;:n amino- 74 hapot 1 - 235 {jaksotunniste nro 1) ; Gly<jSerGlysSer- peptidikytkijä jakson; ja toisen TNF-R-polypeptidin, joka sisältää jaksotunnisteen nro 1 mukaiset aminohapot 1 - 235.
Ni s äkäs s o lu j a t rans f .ektoi daan iImentämisvekt or i 11a 5 tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja niitä viljellään halutun funsioproteiinin tuottamiseksi. Yksi sopiva nisäkässo-lulinja on CHO-Kl:ksi nimitetty kiinanhamsterin munasarja-solulinja, joka on tyypiltään DHFR” ja joka on saatavilla talletuslaitoksesta American Type Culture Collection, Rock-10 ville, MD, hakunumerolla CCL 61. Solut voidaan transfektoi-da ilmentämisvektorxlla tavanomaista kalsiumfosfaattisaos-tusta käyttäen menetellen olennaisesti julkaisussa Graham ja van der Eh,, Virology 52 (1983) 456, kuvatulla tavalla. Transfektoituja soluja viljellään sopivissa tavanomaisissa 15 olosuhteissa ja halutun fuusioproteiinin esiintyminen soluva 1 jelymediumissa varmistetaan määrityksillä, kuten esimerkeissä 1 ja 2 kuvatuilla määrityksillä. ;
Edellä kuvatulla tavalla konstruoidun ilmentämis-vektorin DNA-sekvenssoinnissa tuli fuusioproteiinia koodaa- j 20 vissa jaksoissa ilmi kaksi pistemutaatiota, jotka ovat j saattaneet ilmaantua PCR:n aikana, Jaksotunnisteen nro 5 1 {tyypin I ID-IR) asemassa 437 oleva "T" oli vaihtunut j "G”:ksi ja jaksotunnisteen nro 1 (TNF-R) asemassa 687 oleva 1 "C" oli vaihtunut "T":ksi. Nämä mutaatiot ovat vaikutuk-25 set torni a, joten IL-lR-peptidilcytkijäjakso-TNF-R-peptidikyt- \ kijäjakso-TNF-R-fuu.sioproteiinin {josta tuonnempana käyte- \
tään nimitystä " trimeerinen reseptori") aminohappojakso on I
edellä esitetyn kuvauksen mukainen. | Tällä ilmentämisvektorilla transfektoitiin COS-7- j 30 soluja ja soluja viljeltiin sillä tavoin, että trimeerisen
reseptorin oli mahdollista ilmentyä. Viisinkertaisesti kon- I
sentroidusta supernatantista (tämä sisälsi eritettyä tri- J
meeristä reseptoriproteiinia) määritettiin sen kyky inhi- s
hoida radioaktiivisella jodilla varustetun muriini-TNFa:n I
| 35 (0,5 nM) sitoutuminen U937-soluihin (tämä on endogeenisiä | TNF-reseptoreja sisältävä monosyyttityyppinen humaanisolu- | $ * 75 linja) , Suoritettiin sitoutumisinhibltiömääritys: käyttäen tavanomaisia menetelmiä, jotka olivat samanlaiset kuin esimerkin 2 osassa C kuvatut menetelmät, Negatiiviset kontrol-likoeputket (epäspesifisen sitoutumisen määrittämiseksi) 5 sisälsivät TNFaraa, josta puuttui radioaktiivinen leima, 11937-soluja ja radioaktiivisella jodilla varustettua TNFa: aa, Positiiviset kontroilikoeputket (iniiiboimat.tornissa olosuhteissa saatavan maksimiarvon määrittämiseksi .radioaktiivisella jodilla varustetun TNFccn sitoutumiselle U937-10 soluihin) sisälsivät sitoutumismediumia, U937-soluja ja radioaktiivisella jodilla varustettua TNFa:aa. Trimeeristä reseptoria sisältävä supematantti inhiboi TNF:n sitoutumista ϋ937-soluihin noin 10Ö-%:sesti positiivisessa kontrollissa havaittuun sitoutumiseen verrattuna» 15 Viisinkertaisesti konsentroidusta supernatantista, joka sisälsi trimeeristä reseptoria/ määritettiin myös sen kyky inhiboida radioaktiivisella jodilla varustetun humaa-ni-iL-loun (0,14 nM) sitoutuminen endogeenisiä XL-:l-resep-toreja sisältäviin EL4 6.1 -soluihin. EL4 6.1 -solulinja on 20 valmistettu muriinityoomasolulinjasta julkaisussa MacDonald, et ai. [J, Immunol. 135 (1985) 3944] kuvatulla | tavalla. Negatiivisissa kontrollikoeputkissa (epäspesifisen | sitoutumisen määrittämiseksi) oli IL-la:aa, jossa ei ollut radioaktiivista leimaa, EL4 6.1 -soluja ja radioaktiivi-25 sella jodilla varustettua IL-Ia:aa. Positiivisissa kontrollikoeputkissa (inhiboimattornissa olosuhteissa saatavan maksimiarvon määrittämiseksi radioaktiivisella jodilla varustetun IL-la:n sitoutumiselle EL4 6.1 -soluihin) oli sitou-tumismediumia, EL4 6.1-soluja ja radioaktiivisella jodilla 30 varustettua IL-la:aa. Trimeeristä reseptoria sisältävä su-pernatantti inhiboi 47 % IL-l:n sitoutumisesta EL4 6,1 -so- i luihin positiivisessa kontrollissa havaittuun sitoutumiseen \ verrattuna. Monomeerista liukoista tyypin I IL-lRuää ilmen- ] tävistä COS·-7-soluista peräisin oleva supernatantti, josta ] 35 tehtiin määritys kontrolliksi, inhiboi 52 % siitä IL-1:n j ] Ί ) 76 sitoutumisesta EL4 6.1 -soluihin, joka havaittiin positiivisen kontrollin kyseessä ollessa.
Esimerkki 13
Yhtä IL-iR-polypeptidiä ja yhtä TNF-R-polypeptidiä 5 sisältävä fuusioproteiini (vertailu)
Esimerkissä 12 valmistetut fragmentit E ja G voidaan ligatoida toisiinsa vektorin muodostamiseksi, joka sisältää kaavan IL-lR-peptidikytkijäjakso-TNF-R, jossa pep-tidikytkijäjakso on Glyj.SerGlysSer; mukaista fuusioproteii-10 nia koodaavan DNA-jakson. IL-1R ja TNF-R ovat esimerkissä 12 kuvattuja liukoisia polypeptiöeja. Esimerkin 12 mukainen fuusioproteiini on edullinen siitä syystä, että TNF:n sitoutuminen saadaan tapahtumaan tehokkaasti, kun yhden TNF-R-polypeptidin tilalla käytetään kahta TNF-R-polypeptidiä.
15 Tällä ilmentämisvektorilla transfektoitiin C0S-7- soluja ja niitä viljeltiin siten, että IL-lR-peptidikyt-kijäjakso-TNF-R-fuusiQproteiinin oli mahdollista ilmentyä. Viisinkertaisesti konsentxOidusta supernatantista (tämä sisälsi eritettyä fuusioproteiinia) määritettiin sen kyky 20 inhiboida radioaktiivisella jodilla varustetun humaani-IL- |
la:n (0,14 nM) sitoutumista EL4 6.1 -soluihin (esimerkissä 12 kuvattu muriinityoomasta peräisin oleva IL-l-resepto-reita sisältävä solulinja}. Käytetty sitoutumisinhibition määritysmenetelmä oli samanlainen kuin esimerkin 2 osassa C I
25 kuvattu menetelmä ja positiiviset ja negatiiviset kontrollit olivat esimerkissä 12 kuvattujen kontrollien mukaiset. Fuusioproteiinia sisältävä supernatantti inhiboi 53 % positiiviselle kontrollille havaitusta IL-1:n sitoutumi- j sesta EL4 6.1 -soluihin. | 30 Muut fuusioproteiin.it \
Alan ammattikokemuksen perusteella on selvää, että | tässä kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää muiden fuusio-proteiinien valmistamiseksi, jotka ovat muuntyyppisiä kuin edellä olevissa esimerkeissä esitetyt sovellutusmuodot, 35 Feptidikytkijäjaksoa voidaan: esimerkiksi muuttaa syntetoi- malla erilaista peptidikytkijäjaksoa koodaava oligonukleo- | 77 tidi, Liisaksi voidaan eristää vaihtoehtoisia IL-TR- tai TNF-R-proteilnieu fragmentteja käyttämällä PCR~alukke±ta, joiden halutaan liittyvän pituussuunnassa johonkin muuhun kuvattujen DNA-jaksojen osaan, mikä siten määrää halutun 5 fragmentin terminaaliset päät. DNA-fragmentin terminaalisen pään uudelleenmuodostamiseen käytettyihin oligonukleotidei-hin (esimerkiksi esimerkissä 4 käytetty oligonukleotiäl) voidaan tehdä muutoksia lopetuskodonin sijoittamiseksi minkä tahansa halutun aminohapon jälkeen. Lisäksi ilmentä-10 misvefctorin valinta on riippuvainen käytettäväksi, aiotuista isäntäsoluista.
Jaksotunnisfceiden pääpiirteittäinen kuvaus
Jaksotunnisteessa numero 1 ja jaksotunnisteessa numero 2 on esitetty humaani-TNF-R:n cDNA:n nukleotidijakso 15 ja sen koodaama aminohappojakso. Kypsä proteiini rajoittuu aminohappoihin 1 - 439 - Signaalipeptidi rajoittuu aminohappoihin -22 - -1. Transmembraanialue rajoittuu aminohappoihin 236 - 265.
Jaksotunnisteissa nro 3 ja nro 4 on esitetty humaa-20 ni-TNF-R:n cDNA:n nukleotidijakso ja sen koodaama aminohappo jakso. Tämä TNF-R on eri proteiini kuin jaksotunnisteiden j nro 1 ja 2 mukainen TNF-R. Kypsä proteiini rajoittuu amino- j happoihin 1 - 415, Signaalipeptidi rajoittuu aminohappoihin -40 - -1. Transmembraanialue rajoittuu aminohappoihin 172 -25 192.
Jaksotunnisteessa nro 5 ja jaksotunnisteessa nro 6 on esitetty tyypin I humaani~IL-1R:n cDNA:n nukleotidijakso ja sen koodaama aminohappojakso. Kypsä proteiini rajoittuu f aminohappoihin 1 - 549. Ennustettu signaalipeptidi rajoit- j 30 tuu aminohappoihin -20 - ~1. Transmerabraanialue rajoittuu \ aminohappoihin 317 - 336. |
Jaksotunnisteessa nro 7 ja jaksotunnisteessa nro 8 j
on esitetty tyypin II humaani-IL-lR:n cDNA:n nukleotidijak- I
so ja sen koodaama aminohappojakso. Kypsä proteiini rajoit-35 tuu aminohappoihin 1 - 385. Ennustettu signaalipeptidi : 78 rajoittuu aminohappoihin -13 - -1. Transmembraanialue rajoittuu aminohappoihin 331 - 356.
Jaksotunnisteissa nro 9 - 15 ja 18 - 21 on laivattu oligonukleotidit, joita on käytetty useiden erilaisten 5 sellaisten yhdistelmä-plasmidien konstruoimiseen, jotka on kuvattu esimerkkejä käsittelevässä Osassa.
Jaksotunnisteet nro 16 ja 17 esittävät sellaista oligonukleotidijaksoa ja tämän koodaamaa aminohappojaksoa, joka sisältää GlydSerGlysSer-peptidikytkijäjakson. Tätä 10 oligonukleotidia käytetään esimerkissä 11 kuvatussa vekto-r ikons tr uk ti o ss a.
1 79
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Smith* Craig A, (ii) TITLE OF INVENTION: Fusion Proteins Comprising Tumor Necrosis Factor Receptor {iii.> NUMBER OF SEQUENCES: 21 iiv'i CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Immunes Corporation (B) STREET: 51 University Street (C) CITY: Seattle CD! STATE: Washington (E) COUNTRY: U.S.A, (F) ZIP: 90101 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release 11.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: IB) FILING DATE.: (C} CLASSIFICATION: (vii J PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 479,661 (B) FILING DATE; 07-FEB-19S0 (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 523,635
(B) FILING DATE: 10-MAY-199Q
(vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 701,415 (B) FILING DATE: 16-JUN-1991 (vii) PRIOR APPLICATION DATA; (A) APPLICATION NUMBER: US 821,716 (B) FILING DATE: 14-JAN-1992 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: Seese, Kathryn A. I
(B) REGISTRATION NUMBER: 32,172 | (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 2502 (iJt) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (206) 587-0430 (B) TELEFAX: (206) 5B7-0606 1 INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: ti) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1641 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 80 (C) STRANDEDMESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (Al ORGANISM: Homo sapiens £G> CELL TYPE: Fibroblast (H) CELL LINE: WI-26 VA4 (vii) IMMEDIATE SOURCE: (A) LIBRARY: WI-26 VA4 (B) ' CLONE: 1 (ixj FEATURE: {A! NAME/KEY: CDS CB) LOCATION: BS..1473 lix) FEATURE; (A) NAME/KEY: tnatjpeptide (B) LOCATION: 154..1470 list) FEATURE: (AI NAME/KEY; sig__peptide (B) LOCATION: SB..153 {x} PUBLICATION INFORMATION: (A) AUTHORS: Smith, Craig A.
Davis, Terri Anderson, Dirk Soisin, Lisabeth Beckmann, M. P.
Jerry, Rita Dower, Steven K.
Cosman, David Goodwin, Raymond G.
(B} TITLE: A Receptor for Tumor Necrosis Factor Defines an Unusual Family of Cellular and Viral Proteins fC! JOURNAL: Science (DS VOLUME; 24B (F) PAGES: 1015-1023 £G) DATE: 25-MAY-19S0 j
Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l:
GCGAGGCAGG CAGCCTGGAG AGAAGGCGCT GGGCTGCGAG GGCGCGAGGG CGCGAGGGCA SI
G53G5CAACC GGACCCCGCC CGCATCC ATG GCG CCC GTC GCC GTC TGG GCC 1M
Met Ala Pro Vai Ala Val Trs Ala -22 -20 ' ‘ -15 GCG CTG GCC GTC GGA CTG GAG CTC TGG GCT GCG GCG CAC GCC TTG CCC 15=
Ala Leu Ala Val Glv Leu Glu Lsu Trp Ala Ala Ala His A.i= Leu Pro -10 ‘ -5 1 81 GCC CAG GTG GCA TTT ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TGG 207
Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cvs 5 10 15 CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC AGC AAA 255
Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys Cys Ser Lys 20 25 30 TGC TCG CCG GGC GAA CAT GCA AAA GTC TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC 303
Cys Ser Pro Ely Gin His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Set Asp
35 40 45 SO
ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG: GAC AGC ACA TAC ACC CAG CTC TGG AAC 351
Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Tip: Asn 55 60 55 TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC TCT GAC CAG 399
Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Set Arg Cys Ser Ser Asp Gin
70 75 BO
GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG; AAC CGC ATC TGC ACC TGC 447
Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Aan Arg lie Cys Thr Cys 05 90 95 AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC CGG CTG 495
Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser L/s Gin Glu Gly Cys Arg Leu 100 105 - li:j> TGC GCG CCG CTG C/ -lAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CCA 543
Cys Ala Pro Leu A=. Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg PrD
H5 120 125 130 GGA ACT GAA ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG GGG ACG 591
Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr 135 140 145 TTC TCC AAC ACG ACT TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAG CAG ATC 639
Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp He Cys Arg Pro His Gin lie 150 155 160 TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT GGG AAT GCA AGC ATG GAT GCA GTC TGC 667
Cys Asn val Val Ala He Pro Gly Asn Ala Ser Met Aso Ala Val Cvs 165 170 175 ACG TCC ACG TCC CCC ACC CGG AGT ATG GCC CCA GGG GCA GTA GAC ΤΓΑ 7 35
Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu
1Θ0 185 ISO
CCC CAG CCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG CAG CCA ACT CCA GAA 7B3
Pro Gin Pro Val Sar Thr Arg Ser Gin His Thr Gin Pro Thr Pro Glu 195 200 205 210 CCC AGO ACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG GGC CCS AGC Eli
Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Glv Pro Ser 215 220 " 225 CCC CCA GCT GAA GGG AGC ACT GGC GAG TTC GCT CTT CCA GTT GGA CTG 575
Pro Pro; Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Phe Ala Leu Pro Vai Gly leu 230 235 240 ! 82 ATT GTE GGT GTG ACA GCC TTG GET CTA CTA ATA ÄTÄ GGA GTG GTG AAC 927
Ile Vai Gly Val Thr Ala Lea Gly Leu Leu lie lie Gly Vai Vai Aan 245 250 255 TGT GTC ATC ATS ACC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AGA 975
Cys val lie Met Thr Gin Val Lys Lys Lys P.ro Leu Cys Leu Gin Arg 2G0 265 270 GAA GCC AAG GTG CCT CAC TTG CCT GCC GAT AAG GCC CGG GGT ACA CAG 1023
Glu &la Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin 275 280 285 290 GGC CCC GAG CAG CAG CAC CTG CTG ATC AGA GCG CCG AGC TCC AGE AGC 1071
Gly Pro Glu Gin Gin His Leu Leu lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser 295 300 305 AGC TCC CTG GAG AGC TCG GCC AST GCG TTG GAC AGA AGG GCG CCC ACT 1119
Ser Ser Leu Glu Sec Sec Ala Ser Ala Lau. Asp P.rg Arg Ala Pro Thr 310 315 320 CGG AAC CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG GAG GCC AGT GGG GCC GGG GAG 1167
Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala Giv Glu 325 330 335 GCC CGG GGC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC CCT GGT GGC GAT GGG 1215
Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly 340 345: 350 ACC CAG GTC AAT GTC ACC TGC ATC GTG AAC GTC TGT AGC AGC TCT GAC 1263
Thr Gin Val Ash Val Thr Cys He Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp 355 360 365 370 CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGC TCC ACA ATG GGA GAC ACA 1311
His Ser Ser Gin Cys Ser Set Gin Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr 375 380 385 GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TCC 1359
Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gin Val Pro She Ser 390 395 ’ 400 AAG GAG GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG AGG CCA GAG ACC CTG 1407
Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu 405 410 415 CTG GGG AGC ACC GAA GAG AAG CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GCT 145;
Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala 420 425 430 GGG ATG AAG CCC ACT TAACCAG3CC GGTGTGGGCT GTGTCGTAGC CAAGSTGGGC 1520
Gly Met Lys Pro Ser 435 440 TGAGCCCTGG CAGGATGACC CTGC3AAGGG GCCCTGGTCC TTCCAGGCCC CCACCACTAG 1;7C GACTCTGAG5 CTCrTTCTGG GCCAAGTTCC TCTAGT3CCC TCCACAGCCG CAGCCTCCCT 1650 CTGACCTGCA G 1Si: 83 <2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ΪΆ) LENGTH: 4 61 and no acids (B5 TYPE', amino acid JD! TOPOLOGY: linear (id) MOLECULE TYPE; protein {Kil SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ: ID NO:2:
Met Ala Pro Vai Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Vai Gly Leu Glu Leu -22 -20 -15 -10
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr
-5 1 5 IQ
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin IS 20 25
Thr Ala Gin' Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys 3D 35 40
Val Phe. Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Gys Asp Sex Cys Glu Asp 45 50 55
Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys: Leu Ser Cys 60 65 70
Gly Ser Arg Gys Ser Ser Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg 75 80 85 90
Glu Gin Asn Arg lie Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 95 100 105
Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 110 115 120:
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 125 130 135
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 140 145 150
Asp lie Cys Arg Pro His Gin lie Cys Asn Val Val Ala lie Pro Gly 155 150 165 170
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 175 180 185
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser 190 195 200
Gin His Thr Gin Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 205 210 215
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Set Thr Gly 220 225 230 84
Asp Phe Ala Leu Pro Vai Gly Leu Ile Vai Gly Vai Thr Ala Leu Gly 235 240 245 250
Leu Leu Ile Ile Gly Vai Vai Asn Cys Val lie Met Thr Gin Val Lys 255 260 265
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro 270 275 280
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin His Leu Leu 285 290 295
He Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser 300 305 310
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly 315 320 325 330
Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser 335 340 345
Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gin Val Asn Val Thr Cys He 350 355 360
Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cys Ser Ser Gin 365 370 375
Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro 3B0 385 390
LyS Asp Glu Gin ?sl Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser I
395 400 405 410 I
Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro 415 420 425
Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 430 435 (2} INFORMATION FDR SEQ ID NO;3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:: (A) LENGTH: 136B base pairs (BJ TYPE: nucleic acid (C) STRÄNDEDNESS: single CD) TOPOLOGY; linear j (ii) MOLECULE TYPE: cDNA to nvRNA j (Lii) HYPOTHETICAL: NO j iivj ANTI-SENSE: NO | (Vi) ORIGINAL SOURCE: |
CAJ ORGANISM: HOMO SAPIENS
j ivii) IMMEDIATE SOURCE: \
CB} CLONE: lambda~gtl0-7ctn£bp J
j 85 (ix) FEATURE!
(A) NAME/KEY; COS
!B> LOCATION: 1,.1365 fix) FEATURE: (A) NAME/KEY: mat_j?eptide (B) LOCATION: 121,.1353 (ix} FEATURE: (A) NAME/KEY: Sigjaeptide {B) LOCATION: 1..120 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: ATG GGC CTC TCC ACC GIG CCT GAC CTG CTG CTG CCG CTG GTG CTC CTG 40
Met; Gly Leu Ser Thar Vai Pro ASp Leu Leu Leu Pro Leu Vai Leu Leu -40 -35 -30 -25 GAG CTG TTG GTG EGA ATA TAC CCC TCA GGG GTT ATT GGA CTG GTC CCT 96
Glu Leu Leu Vai Gly He Tyr Pro Ser Gly Val He Gly Leu Val Pro -20 -15 -10 CAC CTA GGG GAC AGG GAG AAG AGA GAT AST GTG TGI CCC. CAA GGA AAA 144
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Girt Gly Lys -5 1 5 TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT ICG AIT TGC TS.T ACC RAG TGC CAC AAA 192
Tyr lie His Pro Gin Asn. Asn Ser Ha Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 10 15 20 GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC 240 - Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp 25 30 35 40 TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC 280
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 45 50 55 AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG 336
Aeg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val 60 65 70 GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG 3B4
Glu He Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 75 80 85 AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG ACT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC 432
Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Fhe Gin Cys Phe 90 95 100 AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT GGG ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG 430
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asa Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu 105 110 113 " 120 AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC CAT GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA 3¾¾
Lys Gin Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Glv Phe Phe Leu Arg Glu 125 130 " 135 86 AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC TGT AAG AAA AGC CTG: GAG TGC AGG 575
Asn Glu Cvs Vai Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
140 145 ISO
AAG TTG TGC OTA CCC CAG ATT: GAG AAT GTT AAG GGC ACT GAG GAC TCA 624 lys Leu Cys Leu Pro Gin lie Glu Asii Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 155 1SD 165 GGC ACC ACA GTG CTG TTG CCG CTG GTC ATT TTC TTT GGT CTT TGC GTT 672
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Vai He Phe phe Gly Leu Cys Leu
170 175 ISO
TTA TCG CTC GTC TTC ATT GGT TTA ATG TAT CGC TAC CAA CGG TGG AAG 720
Leu Ser Leu Leu Phe lie Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gin Arg Trp Lys IBS 190 195 :200 TCC AAG CTC TAC TCC ATT GTT TGT GGG AAA TCG ACA CCT GAA AAA GAG 758
Ser Lys Leu Tyr Ser lie Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 205 210 215 GGG GAG CTT GAA GGA ACT ACT ACT AAG CCC CTG GCC CCA AAC CCA AGC 816
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 220 225 230 TTC AGT CCC ACT CCA GGC TTC ACC CCC ACC CTG GGC TTC AGT CCC GTG 664
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val 235 240 245 CCC AGT TCC ACC TTC ACC TCC AGC TCC ACC TAT ACC CCC GGT GAC TGT 912
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 250 255 260 CCC AAC TTT GCG GGT CCC CGC AGA GAG GTG GCA CCA CCC TAT CAE GGG 950
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gin Gly 265 270 275 2:80 CCT GAC CCC ATC CTT GCG ACA GCC CTC GCC TCC GAC CCC ATC CCC AAC 1008
Ala Asp Pro He Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro lie Pro Asn 235 290 295 CCC CTT CAG AAG TGG GAG GAC AGC GCC CAC AAG CCA CAG AGC CTÄ GAC 1055
Pro Leu: Gin Lys Trp Glu Aso Ser Ala His Lvs Pro Gin Ser Leu Ase 300 ' 30:5 ’ 310 ACT GAT GAC CCC GCG ÄCG CTG TAC GCC GTG GTG GAG AAC GTG CCC CCG HO4
Thr As? As? Pro Ale Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu A3n Val Pro Pro 315 320 325 TTG CGC TGG AAG GAA TTC GTG CGG CGC CTA GGG CTG AGC GAC CAC GAG 1152
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Glv Leu Ser As» Kis Glu 330 335 340 ATC GAT CGG CTG GAG CTG CAG AAC GGG CGC TGC CTG CGC GAG GCG CAA 1200
He Asp Arg Leu Glu Leu Gin Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gin 345 350 ’ 355 360 TAC AGC ATG CTG GCG ACC TGG AGG CGG CGC ACG CCG CGG CGC GAG GCC 124 3
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Tr» Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 365 370: . .375 87 ACG CTG GAG CTG CTG GGA CGC GTG CTC CGC GAC ATG GAC CTG CTG GGC 12 96
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Vai Len Arg Asp Het Asp Leu Leu Gly 3S0 385 390 TGC CTG GAG GAC ATC GAG GAG GCG CTT TGC GGC CCC GCC GCC CTC CCS 1344
Cys Leu Glu Asp lie Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 3S5 400 405 CCC GCG CCC AGT CTT CTC AGA TGA 1368
Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 410 415 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: {il SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 455 amino acids £B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
Ui) MOLECULE TYPE: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu -40 -35 -30 -25
Glu Leu Leu Val Gly He Tyr Pro Ser Gly Val He Gly Leu Val Pro -20 -15 -1-6
His Leu Gly Asp Arg Glu Lvs Arg Asp Ser Val Cys Pro Gin Glv Lvs -5 1 5
Tyr Ile Kis Pro Gin Asn Ash Ser lie Cys Cys The Lys Cys His Lys 10 15 20
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly pro Gly Gin Asn Thr Asn 25 30 35 4 £):
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 45 50 52
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arc Lys Glu Met Glv Gin· Val j 60 55 70
Glu He Ser Ser Cvs Thr Vai Asp Arc Asp Thr Val Cys Glv Cys Arg 75 30 85
Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu: Asn Leu Phe Gin Cvs Phe 90 55 100
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu 105 110 115 120 ]
Lys Gin Aaa: Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe phe Leu Arc Glu 125 13:0 123
Asn Glu Cys val Ser Cys Ser Asn Cvs Lys Lv* Ser Leu Glu Cvs Tr.r j 140 145 ' 150 " ! ] :! j 88
Lys Leu Cys Leu Pro Gin Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Giu Asp Ser 155 160 165
Gly Thr Thr Val Leu leu Pro leu Val lie Phe Phe Gly leu Cys leu 170 175 180 leu Ser Leu Leu Phe lie Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gin Arg Trp Lys 1B5 190 195 200
Ser Lys Leu Tyr Ser lie Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 205 210 215
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 220 225 230
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val 235 24:0 24 5
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 250 255 260
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gin Gly 265 270 275 2B0
Ala Asp Pro lie Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro lie Pro Asn 2B5 290 295
Pro Leu Gin Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gin Ser Leu Asp 300 305 330
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro 315 320 325
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu 330 335 340
He Asp Arg Leu Glu Leu Gin Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gin 345 350 355 360
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 365 370 375
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 380 385 390
Cys Leu Glu Asp He Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 395 400 405
Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 410 415 {2] INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: 11} SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 3011 base pairs (S) TYPE: nucleic acid to STRANDEDNESS: single ID) TOPOLOGY: linear
<ii> MOLECULE TYPE: cDNA to mHNA
89
(lii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vl3 ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: HUIL-1R
fix} FEATURE: (A) NAME/KEY: CDS ifi) LOCATION; 84..1793 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY:i· matjpeptida (B) LOCATION: 1447*. 1790 (ix) feature:: (A) NAME/KEY: sig_peptide {B} LOCATION: 84.7143 ixi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQIDNO:S:
AGACGCACCC TCTGAAGATG GTGGACTCCC TCCTGAGAAG CTGGGACCCC TTGGTAAAAG SO
ÄCAAGGCCTT CTCGAÄGAAG AAT ATG AAA GTG TTA CTC AGA CTT ATT TGT 110
Met Lys Val leu Leu Arg Leu lie Cys -20 -15 TTC ATA GCT CTA CTG ATT TCT TCT CTG GAG GCT GAT AAA TGC AAG GAA 158
Phe ills Ala Leu Leu lie Ser Ser Leu Giu Ala Asp Lys Cys Lys Gin -10 --5 1 5
CGT GAA GÄA. AAA ATA ATT TTA GTG TCA TCT GCA AAT GAA ATT GAT GTT 2QS
Arg Glu Glu Lys lie lie Leu Val Ser,Ser Ala Äsn Glu Ile Asp Vel 10 15 20 CGT CCC TGT: CCT C?I AAC CCA, AAT GAA CAC AAA GGC ACT ATA ACT TGC- 234
Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro Asn Glu His Lys Gly Thr lie fht Trp 25 30 35 TAT AAA GAT GAC AGC AAG.ACA CCT GTA TCT ACÄ GAA CAA GCC TCC AGG 302
Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr Pro Val Ser Thr Glu Gin Ala Ser Arg 40 45 50 ATT CAT CAA CAC AAA GAG AAA GTT TGG TTT GTT CCT GCT AAG GTG GAG 350
Ile Kis Gin Kis Lys Glu Lys Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu 55 60 65 GAT TCA GGA CAT TAC TAT TGC GTG GTA AGA AAT TCA TCT TAG TGC CTC 393
Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys Val Val Arg Asn Set Ser Tyr Cys Leu 7:0 75 80 * " 05 AGA ATT AAA ATA AGT GCA AAA TTT GTG GAG AAT GAG CCT AAC TTA TGT 44s
Arg lie Lys lie Ser Ala Lys Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys 90 95 100 i 90 TAT AAT GCA CAA GCC ATA TTT AAG CAG AAA CTA CCC GTT GCA GGA GAC 494
Tyr Asn Ala Gin Ala lie Phe Lys Gin Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp 105 110 115 GGA GGA CTT GTG TGC CCT TAT ATG GAG TTT TTT AAA AAT GAA AAT AAT 5.42
Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn 120 125 130 GAG TTA CCT AAA TTA CAG TGG TAT AAG GAT TGC AAA CCT CTA CTT CTT 590
Glu Leu Pro Lys Leu Gin Trp Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu 135 140 145 GAG AAT ATA CAC TTT AGT GGA GTC AAA GAT AGG CTC ATC GTG ÄTG AAT 638
Asp Asn lie His Phe :Ser Gly Val Lys Asp Arg Leu lie Val Met Asn 150 155 160 165 GTG GCT GAA' AAG CAT AGA GGG AAC TAT ACT TGT CAT GCA TCC TAG ACA 6S6
Val Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr 170 175 100 TAG TTG GGC AAG CAA TAT CCT ATT ACC CGG GTA ATA GAA TTT ATT ACT 734
Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro lie Thr Arg Val lie Glu Phe lie Thr 185 190 195: CTA GAG GAA AAC AAA CCC ACÄ AGG CCT GTG ATT GTG AGC CCA GCT AAT 782
Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg Pro Val lie Val Ser Pro Ala Asn 200 205 210 GAG ÄCA ATG GAA GTA GAC TTG GGA TCC CAG ATA CAA TTG ATC TGT AAT 830
Glu Thr Met Glu Val Asp Leu Gly Ser Gin lie Gin Leu lie Cys Asn 215 220 225 GTC ACC GGC CAG TTG AGT GAC ATT GCT TAG TGG AAG TGG AAT GGG TCA 878
Val Thr Gly Gin Leu Set Asp lie Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser 230 235 240 245 GTA ATT GAT GAA GAT GAC CCA GTG CTA GGG GAA GAC TAT TAC AGT GTG 926
Val lie Asp Glu Asp Asp Pro Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val 250 255 260 GAA AAT CCT GCA AAC AAA AGA AGG AGT ACC CTC ATC ACA GTG CTT AAT 574
Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Sar Thr Leu lie Thr Val Leu Asn 265 270 275 ATA TCG GAA ATT GAA AGT AGA TTT TAT AAA CAT CCA TTT ACC TGT TTT 1022 .Ile Ser Glu lie Glu Ser Arg Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe 260 28.5 290
GCC AAG AAT ACA CAT GGT ATA GAT GCA GCA TAT ATC CAG: TTA ATA TAT 107C
Ala Lys Asn Thr His Gly lie Asp Ala Ala Tyr lie Gin Leu lie: Tvr 295 300 305 CCA GTC ACT AAT TTC CAG: AAG CAC ATG ATT GGT ATA TGT GTC ACG TTG: III-
Pro Val Thr Asn Phe Gin Lys His Mac lie Gly lie Cys Val Thr Leu 310 315 320 325 ACA GTC ·ΑΤΑ. ATT GTG TGT TCT GTT TTC ATC TAT AAA ATC TTC ,AAS ATT 1166
Thr Val Tie He V'ai Cys Ser Val Phe He Tyr Lys lie Phe Lys lie 330 335 " 340 j :1 j 91 GAC ATT GTG: CTT TGG TAC AGG GAT ICC TGC TAT GAT TTT CTC CCA. ATA 1214 ASP Ile Vai Abu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro: Ile :3'45 350 355 AAA GCT TCA GAT GGA AAG ACC TAT GAC GCA TAT ATA CTG TAT CCA AAG 1262
Lys Ala Ser Asp Gly Lys Xhr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lvs 360 365 370 ACT GTT GGG G AA GGG TCI ACC TCT GAC TGT GAT ATT TTT GTG TTT AAA 1310
Thr Vai Gly Glu Gly Ser Thr ser Asp Cys Asp Us Phe Vei Ph a Lys 375 380 385 GTC TTG CCT GAG GTC XTG GAA AAA CAG TGT GGA TAT AAG CTG TTC: ATT 1356
Vai Leu Pro Glu Vai Leu Glu Lys Glu Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile 390 395 4 00 4.05·: TAT GGA AGG GAT GAC TAC GTT GGG GAA GAC ATT GTT GAG GTC ATT ÄAT: 1406
Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Vai Gly Glu Asp Ile Vai Glu Vai lie. Aan: 410 415 420 GAA AAC G;TA AAG AAA AGC AGA AGA CTG ATT ATC ATT TTÄ GTC AGA GAA 1454
Glu Asn Vai Lys Lys Ser Arg Arg Leu Ile lie Ile Leu Vai Arg Glu 425 430 435 ACA TCA GGC TTC AGC TGG CTG GGT GST TCA TCT GAA GAG CAA ATA GCC 1502
Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Giv Gly Ser Ser Glu Glu Gin lie Ala 440 445 450 ATG TAT AAT GCT GTT GTT CAG GAT GGA ATT AAA GTT GTC CTG CTT GAG 1550
Met Tyr Asn Ala Leu Vai Gin Asp Gly Ile Lys Vai Vai Leu Leu Glu 455 460 465 CTG GAG AAA ATC CAA GAC TAT GAG AAA ATG CCA GAA TCG ATT AAA TTC 1596
Leu Glu Lvs lie Gin Asp Tyr Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lvs Phe 470 475 480 485 ATT AAG CAG AAA CAT GGG GCT ATC CGC TGG TCA GGG GAC TTT ACA CAG 1646
Ile Lys Gin Lys Kis Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gin 490 495 500 GGA CCA CAG TCT GCA AAG ACA AGG TTC TGG AAG AAT GTC AGG TAC CAC 1594
Gly Pro Gin Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Vai Arg Tvr His 505 Slfl 515 ATG CCA GTC CAG CGA CGG TCA CCT TCA TCT AAA CAC CAG TTA CTG TCA 1742
Met Pro Vai Gin Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys Kis Gin Leu Leu Ser 520 525 530 CCA GCC ACT AAG GAG: AAA CTG CAA: AGA GAG GCT CAC QTG CCT CTC GGG .1790
Pro Ala Thr Lvs Glu Lys Leu Gin Arg Glu Ala His Vai Pro Leu Gly 535 540 545 TAGCATGGAG AAGTTGCCAA GäGTTCTTTA GGTGCCTCCT GTCTTATGGC GTTGCAGGCC 155: AGGTTATGCC TCATGCTGAC ttgcagagtt catggaatg? aactatatca tcctttatcc is:c
ctgaGgtcac CTGGAATCAG ATTATTAAGG GäATAAGCCA TGACGTCAAX AGCAGCCCÄG l&TC
GGCACTTCAG AGTAGAGGGC TTGGGAAGäT CTTTTAAAAA GGCAGTAuGC CCGGTGTGGT 2030 92 GGCTCACGCC TATAATCCCA GCACTTTGGG AGGCTGAAGT GGGTGGATCA CCAGAGGTCA 2090 GGAGTTCGAG ACCAGCCCAG CCAACATGGC AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAAAAA 2150 TGAGCTAGGC ATGGTGGCAC ACGCCTGTAA TCCCAGCTAC ACCTGAGGCT GAGGCAGGAG 2210 AATTGCTTGA ACCGGGGAGA CGGAGGTTGC AGTGAGCCGA GTTTGGGCCA CTGCACTCTA 2270 GCCTGGCAAC AGAGCAAGAC TCCGTCTCAA AAAÄAGGGCA ATAAATGCCC TCTCTGAATG 2330 TTTGAACTGC CAAGAAAAGG GATGGAGACA GCGAACTA6A AGAAAGGGCA AGAAGGAAAX 2390 AGCCACCGTC TACAGATGGC TTAGTTAAGT CATCCACAGC CCAAGGGCGG CGGCTATGCC 2450 TTGTCTGGGG ACCCTGTAGA GTCACTGACC CTGGAGCGGC TCTCCTGAGR GGTGCTGCAG 2510 GCAAAGTGAG ACTGACACCT CACTGAGGAA GGGAGACATA TTCTTGGAGA ACTTTCCATC 2570 TGCTTGTATT TTCCATACAC ATCCCCAGCC AGAAGTTAGT GTCCGAAGAA GAGCTTGAAA 2630 ACTCACTl'CA ATGAACAAAG GGATTCTCGA GGATTCCAAA GTTTTGAAGT CATCTTAGCT 2690 GTCCACRGGA GGGAGAGAAC TTAAAAAAGC AACAGTAGCA GGGAATTGAT CCACTTCTTA 2750 ATGCTTTCCT CCCTGGCATG ACCATCCTGT CCTTTGTTAT TATCCTGCAT TTTACGTCTT 2810 TGGAGGAACA GCTCCCTAGT GGCTTCCTCC GTCTGCAATG TCCCTTGCAC AGCCCACACA 2670 TGAACCatCC TTCCCATGAT GCCGCTCTTC TGTCATCCCG CTCCTGCTGA AACACCTCCC 2930 AGGGGCICCS GCTGTTCAGG AGCTGAAGCC CATGCTTTCC CACCAGCATG TCACXCCCAG 2990 ACGACCrCCC TGCCCTGrCC T 3011 12) INFORMATION FOR 5EQ ID NO;6: {i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH,: 569 amino acids (H> TYPE; amino acid (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE; protein fJii ) SEQUENCE DESCRXSTION: SEQ ID NO; 6 :
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu lie Cys Phe lie Ala Leu Leu lie Ser -20 -15 * -10 -5
Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lvs Glu Arg Glu Glu Lys lie lie Lau 1 ’ 5 10
Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asa Vai Arc Pro Cys Pro Leu Asn Pro 15 20 25
Asn Glu His Lys Gly Thr lie Thr Trp tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr 30 35 ' " 40
Prs Val Ser Thr Glu Gin Ala Ser Arg lie His Gin His Lvs Glu Lvs 4s 50 55 ' 60 93
Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys 65 70 75
Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg lie Lys He Ser Ala Lys 80 B5 9Ö
Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gin Ala lie Phe 95 100 105
Lys Gin Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr 110 115 120
Wet Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gin Trp 125 130: 135 140
Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn lie His Phe Ser Gly 145 150 153
Val Lys Asp Arg Leu lie Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly 150 165 170
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro 175 ISO 165 lie Thr Arg Val lie: Glu Phe lie Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr 190 195 200
Arg Pro Val lie Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu 205 210 215 220
Gly Ser Gin He Gin Leu He Cys Asn Val Thr Gly Gin Leu Ser Asp 225 230 235
He Ala Tyr Hp Lys Trp Asn Gl.y Ser Val He Asp Glu Asp Asp Pro 240 245 250
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg 255 260 265
Arg Ser Thr Leu Tie Thr Val Leu Asn lie Ser Glu lie Glu Ser Arg 270 275 200
Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly lie 285 290 2 95 300
Asp Ala Ala Tyr He Gin Leu He Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gin Lys 305 310' 315
His Met lie Gly He Cys Val Thr Leu Thr Val lie lie Val Cys Ser j 320 325 330
Val Phe lie Tyr Lys lie Phe Lys lie Asp He Val Leu Trp Tyr Arg 335 340 345
Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro lie Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr 350 355 360
Tyr Asp Ala Tyr He Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr 385 370 375 380 94
Ser Asp Cys Asp lie Phe Vai Phe Lys Vai Leu Pro Giu Val Leu Glu 385 390 395
Lys Gin Cys Gly Tyr Lys Leu Phe lie Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val 400 4OS 410
Gly GlU Asp lie Val Glu Val lie Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser: Arg 415 420 425
Arg Leu lie lie 11a Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu 430 435 440
Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gin lie Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gin 445 450 455 4S0
Asp Gly He Lys Val Val Leu Leu Glu Leu, Glu Lys lie Gin Asp Tyr 465 470, 47:5
Glu Lys Mat Pre» Glu Ser IXa Lys Phe lie Lys Gin Lys His Gly Ala 48,0: 485 490 lie Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gin Gly Pro Gin Ser Ala Lys Thr 435 500 505
Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gin Arg Arg Ser 510 515 520
Pro Ser Ser Lys His Gin Leu Leu ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu 525 530 535 540
Gin Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly 545 {2> INFORMATION FOR SE.Q ID NO:7: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1357 base pairs I
(B) TYPE! nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single CD) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE:! cDNA t,D raRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO:
(iv) ANTI-SENSE: NO
{Vi) ORIGINAL SOURCE: {ft) ORGANISM: Homo sapiens (G) CELL TYPE:: Huaain B cell lymphoblastoid (H) CELL LINE: CB23 (vii) IMMEDIATE SOURCE: {B> CLONE: pHuIL-lRII75 fix) FEATURE:;:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) : LOCATION: 154..1350 95 fist) FEATURE: (A) NAME/KEY: mat_peptide (Si.' LOCATION; 193,,1347 fix) FEATURE: (A! NAME:/KEY: sig_peptide (B) LOCATION: 154..102 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: CTGGAAAATA CATTCTGCTA CTCTTAAAAA CTAGTGACGC TCRTACAAAT CAACAGAAAG 60 AGCTTCTGAA GGAAGACTTT AAAGCTGCTT CTGCCACGTG CTGCTGGGTC TCAGTCCTCC 120 AGTTCCCGTG TCCTCTGGAA GTTGTCAGGA GCA ATG TTG CGC TTG TAG GTG TTG 174
Met Leu Arg Leu Tyr Val Leu -13 -10 GTA ATG GGA GTT TCT GGC TTC ACC CTT CAG CCT GCG GCA CAC ACA GGG 222
Val Met Gly Val Ser Ala Phe Thr Leu Gin Pro Ala Ala His Thr Gly -5 l 5 10 GCT GCC AGA AGC TGC CGG TTT CGT GGG AGG CAT TAG AAG CGG GAG TTC 270
Ala Ala Arg Ser Cys Arg Phe Arg Gly Arg His Tyr Lys Arg Glu Phe 15 20 25 AGG CTG GÄA GGG GAG CCT GTA GCC CTG AGG TGC CCC CAG GTG CCC TAC 318
Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Ala Leu Arg Cys Pro Gin Val Pro Tyr 30 35 4Ö TGG TTG TGG GCC TCT GTC AGC CCC CGC ATC: AAC CTG ACA TGG CAT AAA 366
Trp leu Trp Ala Ser Val Ser Pro Arg lie ASn Leu Thr Trp His Lys 45 50 55 AAT GAC TCT GCT AGG ÄCG GTC CCA GGA ΘΑΑ GAA GAG ACA CGG ATG TGG 414
Asn Asp Ser Ala Arg Thr Val Pro Gly Glu Glu Glu Thr Arg Met Trp 6D 65 70 GCC CAG GAC GGT GCT CT:G TGG CTT CTG CCA: GCC TTG CAG GAG GAC TCT 462
Ala Gin Asp Gly Ala Leu Trp Leu: Leu Pro Ala Leu Gin Glu Asd Ser 75 80 B5 ‘ 90 GGC ACC TAC GTC TGC ACT ACT AGA AAT GCT TCT TAC TGT GAC AAA ATG 510
Gly Thr Tyr Val Cys Thr Thr Arg Asn Ala Ser Tyr Cys Asp Lys Met 95 100 105 TCC ATT GAG GTC AGA GTT TTT GAG AAT ACA GAT GCT TTC CTG CCG TTC 558
Ser lie Glu Leu Arg Val Phe Glu Asd Thr Asp Ala Phe Leu Pro Phe 110 115 120 ATC TCA TAC CCG CAA ATT TTA ACC TTG TCA ACC TCT GGG GTA TTA GTA 60=
He Ser Tyr Pro Gin lie Leu Thr Leu Ser Thr Ser Glv Val Leu Val 125 130 135 TGC CCT GAC CTG ACT GAA TTC ACC CGT GAC AAA ACT GAC GTG AAG ATT 654
Cys Pro Asp Leu Ser Glu Phe Thr Arg Asp Lys Thr Asp Val Lys lie 140 145 150 j 5 3 j 36 CAA TGG TAC AM GAT TCT CTT CTT TTG GAT AAA GAC AAT GAG AAA TTT 702
Gin Trp Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asn Glu Lys Phe 155 160 165 170 CTA AGT GTG AGG GGG ACC ACT CAC TTA CTC GTA CAC GAT GTG GCC CTG 750
Leu Ser Val Arg Gly Thr The His Leu Leu Val His Asp Val Ala Leu
175 180 ' IBS
GAA GAT GOT GGC TAT TAC CGC TGT GTC CTG ACA TTT GCC CAT GAA GGC 798
Glu Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val Leu Thr Phe Ala His Glu Gly 190 195 200 CAG CAA TAC AAC ATC ACT AGG AGT ATT GAG CTA CGC ATC AAG AAA AAA 8«6
Gin Gin Tyr Asn lie Thr Arg Ser lie Glu Leu Arg lie Lys Lys Lys 205 210 215 AAA GAA GAG ACC ATT CCT GTG ATC ATT TCC CCC CTC AAG ACC ÄTA TCA. 394
Lys Glu Glu Thr lie Pro Val lie lie Ser Pro Leu Lys Thr He Sar 220 225 230 GCT TCT CTG GGG TCA AGA CTG: ACA ATC CCS TGT AAG GTG TTT CTG GGÄ 942
Ala Ser Leu Gly Ser Arg Leu Thr lie Pro Cys Lys Val Phe Leu Gly 235 240 245 250 ACC: GGC ACA CCC TTA ACC ACC ATG CTG TGG TGG ACG GCC AAT GAC ACC 990
Thi: Gly Thr Pro Leu Thr Thr Met Leu Trp Trp Thr Ala Asn Asp Thr 255 260 265 CAC ATA GAG AGO GCC TAC CCG GGA GGC CGC GTG, ACC GAG GGG CCA CGC 1038
His He Glu Ser Ala Tyr Pro Gly Gly Arg Val Thr Glu Gly Pro Arg 270 275 280 CAG GAA TAT TCA GAA AAT AAT GAG AAC TAC ATT GAA GTG CCA TTG ATT 1086
Gin Glu Tyr Ser Glu Asn Asn Glu Asn Tyr Tie Glu Val Pro Leu He 285 290 295 TTT GAT CCT GTC ACA AGA GAG GAT TTG CAC ATG GAT TTT AAA TGT GTT 1134
Phe Asp Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu His Het Asp Phe Lys Cys Val 300 305 310 GTC CAT AAT ACC CTG AGT TTT CAG ACA CTA CGC ACC ACA GTC »AG GAA H82
Val His Asn Thr Leu Ser Phe Gin Thr Leu Arg Thr Thr Val Lys Glu 315 320 325 330
GCC TCC TCC ACG TTC TCC TGG GGC ATT GTG CTG GCC CCA CTT TCA CTG 123C
Ala Ser Ser Thr Phe Ser Trp Glv He Val Leu Ala Pro Leu Ser Leu 335 ' 340 345 GCC TTC TTG GTT TTG GGG GGA ATA TGG ATG CAC AGA CGG TGC AAA CAC 1278
Ala Phe Leu Val Leu Gly Glv He Trp Het His Arg Arg Cys tvs His 350 · ’ 355 360 AGA ACT GGA AAA GCA GAT GGT CTG ACT GTG CTA TGG CCT CAT CAT CAA 132-
Arg Thr Gly Lys Ala Asp Glv Leu Thr Val Leu Trp Pro His His Gin 355 - - 3'go * 375 GAC TTT CAA TCC TAT CCC AAG TGAAATAAAT 1357
Asp Phe Gin Ser Tyr Pro Lys 380 385 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8 : 97 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (Al LENGTH: 398 amino acids (S) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (iii MOLECULE TYPE: protein (xl) SEQUENCE DESCRIPTION!: SEQ ID NOiBi
Met Leu Arg Leu Tyr Val Leu Val Met Gly Val Ser Ala phe Thr Leu *13 -10 -5 1
Gin Pro Ala Ala His Thr Gly Ala .Ala Arg Ser Cys Arg Phe Arg Gly S 10 15
Arg His Tyr Lys Arg Giu Phe Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Ala Leu 20 25 30 35
Arg Cys pro Gin Val Pro Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Val Ser Pro Arg 40 45 50 lie Asn Leu Thr Trp His Lys Asn Asp: Ser Ala Arg Thr Val Pro Gly 55 50 65
Glu Glu Glu Thr Arg Met Trp Ala Gin Asp Gly Ala Leu Trp Leu Leu 70 75 80
Pro Ala Leu Gin Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys Thr Thr Arg Asn B5 90 95
Ala Ser Tyr Cys Asp Lys Met Ser He Glu Leu Arg Val Phe Glu Asn 100 1D5 110 115
Thr Asp Ala· Phe Leu Pro Phe lie Ser Tyr Pro Gin He Leu Thr Leu 120 125 130
Ser Thr Ser Gly Val Leu Val Cys Pro Asp Leu Ser Glu Phe Thr Arg 135 140 245
Asp Lys Thr Asp Val Lys lie Gin Trp Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Leu ISO 155 iso
Asp Lys Asp Asn Glu Lys Phe Leu Ser Val Arg Gly Thr Thr His Leu 165 17:0 175
Leu Val His Asp Val Ala Leu Glu Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val 180 185 190 195
Leu Thr Phe Ala His Glu Gly Gin Gin Tyr Asn lie Thr Arg Ser lie 200 205 210
Glu Leu Arg lie Lys Lys: Lys Lys Glu Glu Thr lie Pro Val lie lie 215 220 225
Ser Pro Leu Lys Thr lie Ser Ala Ser Leu Gly ser Arg Leu Thr lie 230 235 240 98
Pro Cys Lys Val Phe Let: Gly Thr Gly Thr Pro Leu Thr Thr «et Leu 245 250 -255
Trp Trp The Ala Asn Asp Thr His lie Glu Ser Ala Tyr Pro Gly Gly 260 265 270 275
Arg Val Thr Glu Gly pro Arg Gin Glu Tyr Ser Glu Asn Asn Glu Asn 2B0 205 290
Tyr Ile Glu Val Pro Leu lie phe Asp Pro Val Thr Arg Glu A3p Leu 295 30Q 305
His Met Asp Phe Lys Cys Val Val His Asn Thr Leu Ser Phe Gin Thr 31D 315 320
Leu Arg Thr Thr Val Lys Glu Ala Ser Ser Thr Phe Ser Trp Gly lie 325 330 335
Val Leu Ala Pro: Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Gly Gly lie Trp 340 345 350 355
Mat Vila Arg: Arg Cys Lys His Arg Thr Gly Lys Ala Asp Gly Leu Thr 360 365 370
Val Leu Tip Pro His His Gin Asp Pha Gin Ser Tyr Pro Lys 37:3 380 385 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO; 9.- (1:) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (δ'ί TYPE: nucleic acid (C.) STRANDEDNESS: single (DJ TOPOLOGY: linear foci) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:9: CTGAAGGGAG CACTGGCGAC TAAGGATCCA 30 <2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :10: ti > SEQUENCE CHARACTERISTICS:' (At LENGTH: 4:5 base pairs (B) TYPE: nucleic acid | fC! STRANDEDNESS; single j ID) TOPOLOGY: linear j i«i) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NQ-.IO·; GATCTGTAAC GTGGTGGCCA TCCCTGGGAA TGCAAGCAT6 GATGC 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: fi) SEQUENCE CHARACTERISTICS: fA) LENGTH: 33.base pairs 99 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO; 11: AGTCTGCACG TCCACGTCCC CCACCCGGTG AGC '33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 12 base pairs (B) TYPE: nucleic acid {C) STRANDEDNESS: single {D) TOPOLOGY- linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: GATCTGTTGA GC 12 12) INFORMATION FOR SEQ I'D NO;13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single CD) TOPOLOGY: linear !xii SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13; CTGAAACATC AGACGTGGTG TGCAAGCCCT GTTAAA 36 (2) INFORMATION FOR SEQ ID ND:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 29 base pairs CB) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single CD) TOPOLOGY: linear ixi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: GCGTCGACCT AGTGACGCTC ATACAAATC 29 !2 3 INFORMATION FOR SEQ ID NO :15: (A> SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B! TYPE: nucleic acid !C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:IS: 33 100 GCGCGGCCGC TCAGGAGGAG GCTTCCTTGA CTG INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH; 66 base pairs {BJ TYPE: nucleic acid <C} STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY; linear
(ii) MOLECULE TYPE: CHINA to inRNA
fiii) HYPOTHETICAL: NO
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 3..65 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: 47 CT GAA GGG AGC ACT GGC GAC GGT GGC GGT GGA TCC GGC GOT GGC (2GC Glu Gly Sex Thr Gly Asp Gly Gly Gly Glv Ser Ely G.ly Sly 1 5 10 15 66 GGC TCA TTG CCC GCC CAG G Gly Ser Leu Pro Ala Gin 20 (Ξ) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 aniino acids (B} TYPE: amino acid iDi TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
Glu Gly Ser Thr Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 IS
Ser Leu Ft© Ala Gin 20 (25 INFORMATION FOR SEQ ID NO:IB: (I) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid j <C) STRANDEDNESS: single | (DJ TOPOLOGY; linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO; 3.8 : 101 ACCGAGGGAC CTGAGCG 17 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO;19: (1} SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: S3 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:19: TGAGCCGCCG CCACCGCCGG ATCCÄCCGCC ACCAGTGACT GGATATATTA ACT 53 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 51 base pairs (3) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D} TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20: GGTGGCGGTG GÄTCCGGCGG TGGCGGCGGC TCATTGCCCG CCCAGGTGGC A 51 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21: ii) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A} LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (Cl STRANDEDNESS: single |
(D) TOPOLOGY: linear I
(xi} SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: GCTTGCTCAG CGCGCAGT 10 i i

Claims (10)

1. Eristetty polynukleotidi, tunnettu siitä, että se .koodaa fuusioproteiinia, joka sisältää kahta 5 frimiaanikasväinkuoliatekijäxi reseptoria (TNF-R:ääj ja yhtä humaani-interleukiini-1-reseptoria ML-lR:ää), jolloin fuu-sioproteiinilla on kaava: TNF-R-kytkijäjakso-TNF-R-kytkijäjakso-IL-lR, tai
10 IL-1R-kytki j äjakso-TNF-R-kytki j ä j aks o-TNF-R, jossa kytkijäjakso on peptidikytkijäjakso.
2* Patenttivaatimuksen 1 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa 15 kukin peptidikytkijäjakso sisältää 5 - 100 aminohappoa, jotka ovat glysiini, asparagiini, setiini, treeniini tai alaniini.
3. Patenttivaatimukseh 1 tai 2 mukainen polynuk-ieotidi, tunnettu siitä, että se koodaa fuusioprote- 20 iinia, jossa kukin TNF-R on liukoinen TNF-R, ja IL-lR on liukoinen IL-lR.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa kukin liukoinen TNF-R sisältää aminohappojak- 25 son, joka on jakso tunnisteen nro; 1 mukaiset aminohapot 1 — x tai -22 - x, jossa x on kokonaisluku 163 - 235.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen poly nukleotidi, tunnettu siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa liukoinen IL-lR sisältää aminohappoj akson, 30 joka on jaksotunnisteen nro 5 mukaiset aminohapot 1 - x tai -20 - x, jossa x on kokonaisluku 312 - 316.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen poly nukleotidi, tunnettu siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa liukoinen IL-lR sisältää aminohappojakson, joka on jaksotunnisteen nro 7 mukaiset aminohapot 1 - x tai -13 - x, jossa x on kokonaisluku 330 - 333.
7., Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä, että mainittua TNF-FUää 5 koodaa polynukleotidi, joka on jaksötuimisteessä. numero 1 tai jaksotunnisteessa numero 3 esitettyä nukleotidijaksoa sisältävä poljuiukleotidi tai polynukleotidi, joka kykenee hybridi s o it uniaan kohtalaisesti rajoittavissa olosuhteissa jaksotunnisteen nro 1 ja/tai jaksotunnisteen nro 3 mukai-10 seen nukleotidijaksoon, jolloin mainittu TNF-R:ää koodaava polynukleotidi koodaa biologisesti aktiivista TNF-R-poly-pept idiä ,* j a mainittua lL-lR:ää koodaa polynukleotidi, joka on jaksotunnisteessa numero 5 tai jaksotunnisteessa numero 7 15 esitettyä nukleotidijaksoa sisältävä pölynukleotidi tai polynukleotidi, joka kykenee hybridisoitumaan kohtalaisesti rajoittavissa olosuhteissa jaksotunnisteen nro 5 ja/tai jaksotunnisteen nro 7 mukaiseen nukleotidijaksqpn, jolloin mainittu JL-lR:tä koodaava polynukleotidi koodaa biologi-20 sesti aktiivista Ib-lR-polypeptidiä.
8. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen polynuk-leotidin.
9. Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi, 2:5 joka sisältää kahta humaani-kasvainkuoliotekijän reseptoria (TNF-R:ää) ja yhtä humaani-interleukiini-l-reseptoria (lL-lR:ää}, jolloin fuusioproteiinilla on kaava TNF-R-kytkij äj aks o-TNF-R-kytki j äj akso-IL-1R, tai 30 IL-1R-kytkijäjakso-TNF-R-kytkijäjakso-TNF-R, jossa kukin kytki jäj akso on peptidikytkijäjaksO:, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 8 mukaisen ilmentämisvektorin sisältävää isäntä-solua olosuh 104: teissä, jotka edistävät fuusioproteiinin ilmentymistä ja otetaan fuusioproteiini talteen.
10. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1-7 5 mukaisen polynukleotidin koodaamaa fuusioproteiinia, tunnettu siitä, että viljellään mainittua polynukleotidia sisältävää isäntäsolua olosuhteissa, jotka edistävät fuusio-proteiinin ilmentymistä, ja otetaan fuusioproteiini talteen ja sekoitetaan se sopivan laimentimen, lisäaineen ja/tai 10 kanta j; a- aine en kanssa. ΐ | |
FI20051161A 1992-03-30 2005-11-15 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita FI120042B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86071092A 1992-03-30 1992-03-30
US86071092 1992-03-30
PCT/US1993/002938 WO1993019777A1 (en) 1992-03-30 1993-03-26 Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
US9302938 1993-03-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20051161A FI20051161A (fi) 2005-11-15
FI120042B true FI120042B (fi) 2009-06-15

Family

ID=25333845

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944516A FI116943B (fi) 1992-03-30 1994-09-29 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori
FI20051161A FI120042B (fi) 1992-03-30 2005-11-15 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944516A FI116943B (fi) 1992-03-30 1994-09-29 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20060275868A1 (fi)
EP (2) EP1239043A3 (fi)
JP (1) JPH07508639A (fi)
KR (1) KR950700937A (fi)
AT (1) ATE242322T1 (fi)
AU (1) AU671116B2 (fi)
CA (1) CA2133326C (fi)
DE (1) DE69333027T2 (fi)
ES (1) ES2197149T3 (fi)
FI (2) FI116943B (fi)
NO (1) NO323197B1 (fi)
NZ (1) NZ251820A (fi)
WO (1) WO1993019777A1 (fi)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006737A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Kenneth Francis Prendergast Glycophorin binding protein (gbp130) fusion compositions
EP0779923A2 (en) * 1994-09-09 1997-06-25 Neurocrine Biosciences, Inc. Interleukin-1 type 3 receptors
US6239268B1 (en) 1994-09-09 2001-05-29 Neurocrine Biosciences, Inc. Interleukin-1 type 3 receptors
US5712381A (en) * 1994-10-19 1998-01-27 Genetics Institute, Inc. MADD, a TNF receptor death domain ligand protein
US5852173A (en) * 1994-10-19 1998-12-22 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death ligand proteins and inhibitors of ligand binding
US5849501A (en) * 1994-10-19 1998-12-15 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death domain ligand proteins and method to identify inhibitors of ligand binding
US5847099A (en) * 1994-10-19 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death domain ligand proteins
CN1261579C (zh) 1996-02-20 2006-06-28 应用研究***Ars控股公司 形成异源二聚体的杂种蛋白质
US6194177B1 (en) 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
ATE406176T1 (de) 1996-12-06 2008-09-15 Amgen Inc Il-1-inhibitor in kombinationstherapie zur behandlung il-1-vermittelter krankheiten
US7070771B1 (en) 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
US6893838B1 (en) 1998-04-07 2005-05-17 Genetics Institute Llc DADD, death activator death domain protein
CA2337438A1 (en) * 1998-07-13 2000-01-20 Parkash S. Gill Novel inhibitors of angiogenesis and tumor growth
US7083949B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
AU2000236029A1 (en) * 1999-02-23 2000-09-14 Anne Chew Receptor isogenes: polymorphisms in the tissue necrosis factor receptor
US6627199B1 (en) 1999-07-09 2003-09-30 Amgen Inc Isolation, identification and characterization of tmst2, a novel member of the TNF-receptor supergene family
CA2381284A1 (en) 1999-08-04 2001-02-15 Amgen Inc. Fhm, a novel member of the tnf ligand supergene family
WO2001010908A1 (en) 1999-08-04 2001-02-15 Amgen Inc. Ntr3, a member of the tnf-receptor supergene family
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
KR100408017B1 (ko) * 2000-11-15 2003-12-06 김영상 종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질
EP2087908B1 (en) 2001-06-26 2018-05-30 Amgen Inc. Antibodies to opgl
US20030049255A1 (en) * 2001-08-07 2003-03-13 Sims John E. Interleukin-1 receptors in the treatment of diseases
WO2003026695A1 (en) * 2001-09-21 2003-04-03 Genset S.A. Agonists and antagonists of cylixin for the treatment of metabolic disorders
US7786282B2 (en) 2001-12-06 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain
CN1304425C (zh) * 2002-07-01 2007-03-14 上海兰生国健药业有限公司 含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白及其制备方法
US7700318B2 (en) * 2004-08-25 2010-04-20 Amprotein Corporation Chimeric polypeptide and use thereof
US7767206B2 (en) 2006-10-02 2010-08-03 Amgen Inc. Neutralizing determinants of IL-17 Receptor A and antibodies that bind thereto
US8277651B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
DK2501716T3 (en) 2009-11-19 2015-04-07 Solis Biodyne Oü Formations to increase polypeptidstabilitet and activity and related practices
WO2011088120A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 Amgen Inc. Antibody formulation and therapeutic regimens
US20140234330A1 (en) 2011-07-22 2014-08-21 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
US20170174772A1 (en) 2014-03-31 2017-06-22 Kirin-Amgen, Inc. Methods of treating nail and scalp psoriasis
US20190092818A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Kite Pharma, Inc. Chimeric polypeptides and uses thereof
CN115073607A (zh) * 2021-03-12 2022-09-20 上海康岱生物医药技术股份有限公司 Tnfr2与baff受体的融合蛋白
CN115944714B (zh) * 2022-10-20 2023-12-15 苏州大学 能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料及其制备方法与应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769326A (en) * 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
JPS61139317U (fi) * 1985-02-19 1986-08-29
US5342921A (en) * 1985-03-28 1994-08-30 Chiron Corporation Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5071972A (en) * 1986-01-31 1991-12-10 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding novel thrombolytic proteins
US5098702A (en) * 1986-04-09 1992-03-24 Cetus Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
IL80005A (en) * 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5512544A (en) * 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
US4968607A (en) * 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
EP0325224B1 (en) * 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
DE3817955A1 (de) * 1988-05-27 1989-11-30 Hoechst Ag Tnf-inhibitor enthaltendes arzneimittel
US5075222A (en) * 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
DE3922089A1 (de) * 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5945397A (en) * 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
EP1132471A3 (de) * 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
JPH0578396A (ja) * 1989-12-13 1993-03-30 Yeda Res & Dev Co Ltd ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白
US5136021A (en) * 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
WO1991017184A1 (en) * 1990-04-27 1991-11-14 The Upjohn Company Modified interleukin-1 inhibitors
AU651596B2 (en) * 1990-06-05 1994-07-28 Immunex Corporation Type II interleukin-1 receptors
US20030064480A1 (en) * 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
GB9022648D0 (en) * 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE4037837A1 (de) * 1990-11-28 1992-06-04 Behringwerke Ag Zellfreie rezeptorbindungsteste, ihre herstellung und verwendung
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
AU670125B2 (en) * 1992-09-15 1996-07-04 Immunex Corporation Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
DE69739375D1 (de) * 1996-11-27 2009-06-04 Immunex Corp Verfahren zur regulierung der stickstoffmonoxid-erzeugung

Also Published As

Publication number Publication date
AU671116B2 (en) 1996-08-15
CA2133326C (en) 2005-03-01
FI116943B (fi) 2006-04-13
EP0670730B1 (en) 2003-06-04
DE69333027D1 (de) 2003-07-10
JPH07508639A (ja) 1995-09-28
NO943617D0 (no) 1994-09-29
FI944516A0 (fi) 1994-09-29
US20060275868A1 (en) 2006-12-07
NZ251820A (en) 1996-07-26
WO1993019777A1 (en) 1993-10-14
NO943617L (no) 1994-11-29
FI20051161A (fi) 2005-11-15
ATE242322T1 (de) 2003-06-15
CA2133326A1 (en) 1993-10-14
EP0670730A1 (en) 1995-09-13
EP0670730A4 (en) 1997-02-26
FI944516A (fi) 1994-11-22
DE69333027T2 (de) 2004-05-06
KR950700937A (ko) 1995-02-20
NO323197B1 (no) 2007-01-15
AU3970293A (en) 1993-11-08
EP1239043A2 (en) 2002-09-11
ES2197149T3 (es) 2004-01-01
EP1239043A3 (en) 2003-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120042B (fi) Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita
US6541610B1 (en) Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
AU646695B2 (en) Isolated viral protein cytokine antagonists
FI106044B (fi) Menetelmä nisäkkään interleukiini-4-reseptorin (IL-4R) ja sen vasta-aineen tuottamiseksi ja IL-4R:ä koodaava DNA, vektori ja isäntäsolu
KR100283541B1 (ko) 신규 사이토킨
ES2210354T3 (es) Factor de necrosis tumoral humano delta y epsilon.
NZ238255A (en) Type ii interleukin i receptor proteins and their preparation
IE83679B1 (en) Type II interleukin-1 receptors
AU4920993A (en) Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
WO1994026290A1 (en) Cytokine designated 4-1bb ligand and human receptor that binds thereto
IL95572A (en) Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
JP2005507870A (ja) 低毒性のインターロイキン−２突然変異体
IE63450B1 (en) Leukemia inhibitory factor receptors
IE903467A1 (en) Granulocyte-colony stimulating factor receptors
JP3907661B2 (ja) インターフェロン−α／β結合タンパク質、その製造法およびそれを含有する医薬組成物
IE902158A1 (en) Interleukin-7 Receptors
WO1995026985A1 (en) Modified receptors that continuously signal
AU625534B2 (en) Interleukin-1 receptors
NZ280051A (en) Tnf-r dimers (tumour necrosis factor - receptor), dna coding for same and vectors including the dna
IE75902B1 (en) Interleukin-4-binding protein-gamma
CA1340761C (en) Interleukin-4-receptors
IE911108A1 (en) Isolated Viral Protein Cytokine Antagonists

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120042

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed