ES2210354T3 - Factor de necrosis tumoral humano delta y epsilon. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LOS FACTORES DE NECROSIS TUMORAL HUMANOS DELTA Y EPSILON, A LOS POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS POLIPEPTIDOS, PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR LOS POLIPEPTIDOS, EN PARTICULAR POR EXPRESION DE LOS POLINUCLEOTIDOS Y AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LOS POLIPEPTIDOS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A PROCEDIMIENTOS PARA EL USO DE TALES POLINUCLEOTIDOS, POLIPEPTIDOS, AGONISTAS Y ANTAGONISTAS PARA APLICACIONES QUE SE REFIEREN, EN PARTE, A LOS CAMPOS DE LA INVESTIGACION, EL DIAGNOSTICO Y CLINICOS.

Description

Factor de necrosis tumoral humano \delta y \epsilon.

La invención se refiere, en parte, a polinucleótidos y polipéptidos recientemente identificados; a procesos para fabricar los polinucleótidos y los polipéptidos, y variantes y derivados suyos; agonistas y antagonistas de los polipéptidos; y a usos de los polinucleótidos, polipéptidos, variantes, derivados, agonistas y antagonistas. En particular, en estos y en otros aspectos, la invención se refiere a polinucleótidos y polipéptidos de factor de necrosis tumoral humano delta y epsilon, referidos algunas veces a partir de aquí como "TNF delta" y "TNF epsilon".

Antecedentes de la invención

Los factores de necrosis tumoral humanos \alpha (TNF-\alpha) y \beta (TNF-\beta o linfotoxina) son miembros relacionados de una amplia clase de mediadores de polipéptido, que incluye los interferones, las interleuquinas y los factores de crecimiento, denominados de forma colectiva citoquinas (Beutler, B. y Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7: 625-655, 1989).

El factor de necrosis humano (TNF-\alpha y TNF-\beta) fue descubierto originariamente como resultado de su actividad antitumoral, sin embargo, ahora es reconocido como una citoquina pleiotrópica capaz de numerosas actividades biológicas que incluyen la apoptosis de algunas líneas de células transformadas, la mediación en la activación y proliferación celular y también presenta una función importante en la regulación inmune y en la inflamación.

Hasta la fecha, existen nueve miembros conocidos de la superfamilia de ligandos de TNF, TNF-\alpha, TNF-\beta (linfotoxina-\alpha), LT-\beta, OX40L, FASL, CD30L, CD27L, CD40L y 4-1BBL. Los ligandos de la superfamilia de ligandos de TNF son ácidos, moléculas similares a TNF con una homología de secuencia de aproximadamente 20% en los dominios extracelulares (intervalo, 12%-36%) y existen principalmente en la forma unida a membrana siendo la forma biológicamente activa un complejo trimérico/multimérico. Las formas solubles de la superfamilia de ligandos de TNF sólo han sido identificadas para TNF, LT\alpha, y FASL (para una visión general, véase Gruss, H. y Dower, S.K., Blood, 85 (12): 3378-3404 (1995)), incorporada aquí al completo como referencia. Se ha publicado sobre ESTs: Seed en EP-A1 330 191 (EST N 90606) y Adams, Nature 355: 632-634 (EST M 78230). Además, se ha depositado un fragmento genómico de ADN bajo Z60980.

Estas proteínas participan en la regulación de la proliferación, activación y diferenciación celular, incluyendo el control de la supervivencia o muerte celular mediante apoptosis o citotoxicidad (Armitage, R.J., Curr. Opin. Immunol., 6: 407 (1994) y Smith, C.A., Cell, 75: 959 (1994)).

El TNF es producido por una variedad de tipos de células, incluyendo monocitos, fibroblastos, células T, células asesinas naturales (NK, del inglés "natural killers"), y predominantemente es producido por macrófagos activados. Se ha publicado que el TNF-\alpha tiene un papel en la necrosis rápida de tumores, en la inmunoestimulación, en la enfermedad autoinmune, en el rechazo de transplantes, en la resistencia a parásitos, produciendo una respuesta antiviral, en el choque séptico, en la regulación del crecimiento, en efectos endoteliales vasculares y en efectos metabólicos. El TNF-\alpha también activa las células endoteliales para que segreguen varios factores, que incluyen PAF-1, IL-1, GM-CSF y IL-6 para promover la proliferación celular. Además, el TNF-\alpha regula diversas moléculas de adhesión celular tales como E-Selectina, ICAM-1 y VCAM-1.

La primera etapa en la inducción de varias respuestas celulares mediadas por los miembros de la superfamilia de ligandos de TNF es su unión a receptores superficiales celulares específicos. La superfamilia de ligandos de TNF contiene hasta el presente diez proteínas de membrana conocidas y varias estructuras de lectura abierta víricas que codifican moléculas relacionadas con TNFR. El receptor p75 de baja afinidad del Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) fue el primer receptor clonado de esta familia (Jonson, D. y col., Cell, 47: 545 (1986). Por consiguiente, la clonación de dos receptores específicos de TNF muestra que estaban relacionados con el receptor de NGF (Loetscher, H. y col., Cell, 61:351 (1990). En los últimos años, se ha establecido una nueva superfamilia de receptores de TNF de transmembrana de tipo I. Esta familia incluye el receptor del factor de crecimiento nervioso p75, el p60 TNFR-I, el p80 TNFR-II, el TNFR-RP/TNFR-III, el CD27, el CD30, el CD40, el 4-IBB, el OX40 y el FAS/APO-1. Además, se han identificado varias estructuras de lectura víricas abiertas que codifican receptores de TNF solubles, tales como el SFV-T2 en el virus de fibroma de Shope (Smith, C.A. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 335, 1991) y el Va53 o el SaIF19R en el virus de vaccínia (Howard, S.T., Virology, 180: 633, 1991). Estos receptores se caracterizan por múltiples dominios ricos en cisteína en el dominio extracelular (aminoterminal), que han demostrado estar involucrados en la unión de ligandos. La homología media en la región extracelular rica en cisteína entre los miembros de la familia humana está en el intervalo entre 25 y 30%.

Claramente, existe una necesidad de factores que regulen la activación, y la diferenciación de células normales y anormales. Por lo tanto, existe una necesidad de identificar y caracterizar dichos factores que modulan la activación y la diferenciación de células, tanto en estados normales como en estados de enfermedad. En particular, existe una necesidad de aislar y caracterizar ligandos de TNF adicionales semejantes a los miembros de la superfamilia de ligandos de TNF que controlen la apoptosis de líneas de células transformadas, que medien en la activación y en la proliferación celular y que estén unidas funcionalmente como mediadores primarios de regulación inmune y de respuesta antiinflamatoria, y, entre otras cosas, que puedan jugar un papel en la prevención, en la mejora o en la corrección de disfunciones o enfermedades.

Sumario de la invención

Con estos y otros fines, un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos polipéptidos, referidos como nuevos TNF delta y TNF epsilon que han sido putativamente identificados como ligandos de factor de necrosis tumoral por homología entre la secuencia de aminoácidos establecida en las Figuras 1 y 2 y secuencias de aminoácidos conocidos de otras proteínas en la familia del factor de necrosis tumoral tales como el TNF-\alpha y el TNF-\beta humanos.

Los polipéptidos de la presente invención han sido identificados como nuevos miembros de la superfamilia de ligandos de TNF basándose en similitudes estructurales y biológicas.

Además, otro objetivo adicional de la invención es proporcionar polinucleótidos que codifican TNF delta y TNF epsilon, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido aquí designado como TNF delta y TNF epsilon.

En una realización particularmente preferida de este aspecto de la invención los polinucleótidos comprenden la región que codifica TNF delta y TNF epsilon humanos en las secuencias establecidas en las Figuras 1 y 2.

De acuerdo con este aspecto de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican TNF delta, que incluyen mARNs, cADNs, ADNs genómicos y, en realizaciones adicionales de este aspecto de la invención, sus variantes, análogos o derivados, o fragmentos suyos que incluyen fragmentos de las variantes, análogos y derivados, biológica, diagnóstica, clínica o terapéuticamente útiles.

Entre las realizaciones particularmente preferidas de este aspecto de la invención están las variantes alélicas naturales del TNF delta y del TNF epsilon humanos.

De acuerdo con este aspecto de la presente invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido maduro de TNF delta humano expresado por el cADN humano contenido en el Depósito ATCC nº 97377 depositado el 8 de diciembre de 1995, y un polipéptido maduro de TNF epsilon humano expresado por el cADN humano contenido en el Depósito ATCC nº 97457 depositado el 1 de marzo de 1996.

También es un objetivo de la invención proporcionar polipéptidos de TNF delta, particularmente polipéptidos de TNF delta y TNF epsilon humanos, que destruyen algunas líneas de células transformadas, median en la activación y en la proliferación celular y están unidas funcionalmente como mediadores primarios de regulación inmune y de respuesta antiinflamatoria.

De acuerdo con este aspecto de la invención se proporcionan nuevos polipéptidos de origen humano referidos aquí como TNF delta y TNF epsilon así como sus fragmentos, variantes y derivados, variantes y derivados de los fragmentos, y análogos de los anteriores, biológica, diagnóstica o terapéuticamente útiles.

Entre las realizaciones particularmente preferidas de este aspecto de la invención están las variantes de TNF delta y TNF epsilon humanos codificadas por alelos naturales del gen de TNF delta y TNF epsilon humanos.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un proceso para producir los anteriores polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, variantes y derivados, fragmentos de las variantes y de los derivados, y análogos de todos ellos. En una realización preferida de este aspecto de la invención se proporcionan métodos para producir los anteriormente mencionados polipéptidos de TNF delta y TNF epsilon que comprenden cultivar células hospedantes que tienen expresamente incorporado un poolinucleótido que codifica TNF delta humano exógenamente derivado y un polinucleótido que codifica TNF epsilon humano exógenamente derivado en las condiciones necesarias para expresar el TNF delta y el TNF epsilon en el hospedante y a continuación recuperar el polipéptido expresado.

De acuerdo con otro objetivo de la invención se proporcionan productos, composiciones y métodos, inter alia, para, entre otras cosas: establecer la expresión del TNF delta y del TNF epsilon en las células determinando los polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon o los polipéptidos de mARN que codifica TNF delta o de mARN que codifica TNF epsilon; determinar las variaciones y aberraciones genéticas, tales como los defectos en los genes de TNF delta y de TNF epsilon; y administrar un polipéptido o polinucleótido de TNF delta o de TNF epsilon a un organismo para aumentar la función de TNF delta o de TNF epsilon o para remediar la disfunción de TNF delta o de TNF epsilon.

De acuerdo con determinadas realizaciones preferidas de este y otros aspectos de la invención se proporcionan polinucleótidos y en particular sondas que se hibridan con las secuencias de TNF delta o TNF epsilon humanos.

En determinadas realizaciones preferidas adicionales de este aspecto de la invención se proporcionan anticuerpos contra los polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon. En determinadas realizaciones particularmente preferidas en este aspecto, los anticuerpos son altamente selectivos hacia el TNF delta o el TNF epsilon humanos.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan agonistas de TNF delta y de TNF epsilon. Entre los agonistas preferidos están las moléculas que imitan el TNF delta o el TNF epsilon, que se unen a moléculas o moléculas receptoras de unión a TNF delta o a moléculas o moléculas receptoras de unión a TNF epsilon, y que provocan o aumentan respuestas inducidas por TNF delta o por TNF epsilon. También entre los agonistas preferidos están las moléculas que interactúan con TNF delta o con TNF epsilon o con polipéptidos de TNF delta o de TNF epsilon, o con otros moduladores de actividades de TNF delta, y con ello potencian o aumentan un efecto de TNF delta y de TNF epsilon o más de un efecto de TNF delta o de TNF epsilon.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan antagonistas de TNF delta de TNF epsilon. Entre los antagonistas preferidos están aquellos que imitan al TNF delta y al TNF epsilon para unirse a receptores o moléculas de unión de TNF delta y de TNF epsilon pero que no provocan una respuesta inducida por TNF delta y por TNF epsilon o más de una respuesta inducida por TNF delta y por TNF epsilon. También entre los antagonistas preferidos están las moléculas que se unen a o interaccionan con el TNF delta y el TNF epsilon de tal modo que inhiben un efecto del TNF delta y del TNF epsilon o más de un efecto del TNF delta y el TNF epsilon o que previenen la expresión de TNF delta y de TNF epsilon.

Los agonistas y antagonistas pueden ser usados para imitar, aumentar o inhibir la acción de los polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon. Pueden ser usados, por ejemplo, para prevenir el choque séptico, la inflamación, la malaria cerebral, la activación del virus del VIH, el rechazo injerto-hospedante, la reabsorción ósea, la artritis reumatoide y la caquexia.

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido de TNF delta y de TNF epsilon o un polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon para la administración a células in vitro, a células ex vivo y a células in vivo, o a organismos multicelulares. En determinadas realizaciones particularmente preferidas de este aspecto de la invención, las composiciones comprenden un polinucleótido de TNF delta y de TNF epsilon para la expresión de un polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon en un organismo hospedante para el tratamiento de la enfermedad. En este sentido, es particularmente preferida la expresión en un paciente humano para el tratamiento de una disfunción asociada con actividad endógena aberrante de TNF delta y de TNF epsilon.

Otros objetivos, características, ventajas y aspectos de la presente invención serán evidentes para aquellos con conocimientos en la técnica a partir de la siguiente descripción. Sin embargo, debería entenderse, que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se muestran sólo a modo de ilustración.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras muestran determinadas realizaciones de la invención. Sólo son ilustrativas y no limitan la invención a no ser que se indique aquí lo contrario.

La Figura 1 muestra el nucleótido y la secuencia de aminoácidos deducida del TNF delta humano.

La Figura 2 muestra el nucleótido y la secuencia de aminoácidos deducida del TNF epsilon humano.

La Figura 3 muestra las regiones de similitud (informe de alineamiento) entre las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de TNF\alpha, de TNF\beta, de TNF\delta y de TNF\varepsilon.

La Figura 4 muestra las características estructurales y funcionales del TNF delta deducidas mediante las técnicas indicadas, en función de la secuencia de aminoácidos.

Las siguientes explicaciones ilustrativas son proporcionadas para facilitar la comprensión de determinados términos usados aquí con frecuencia, particularmente en los ejemplos. Las explicaciones son proporcionadas por comodidad y no limitan la invención.

El término "digestión" de ADN se refiere a la ruptura catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en determinadas secuencias del ADN. Las diferentes enzimas de restricción referidas aquí están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos para su uso son conocidos y de rutina para alguien con conocimientos.

Con propósitos analíticos, típicamente, se digiere 1 \mug de plásmido o de fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de tampón de reacción. Con el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digieren típicamente de 5 a 50 \mug de ADN con de 20 a 250 unidades de enzima en volúmenes proporcionalmente mayores.

Los tampones y las cantidades de sustrato apropiados para enzimas de restricción concretas son descritos en los manuales estándar de laboratorio, tales como aquellos referenciados más adelante, y son especificados por los suministradores comerciales.

Habitualmente se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero las condiciones pueden variar de acuerdo con los procedimientos estándar, con las instrucciones del suministrador y con las particularidades de la reacción. Después de la digestión, las reacciones pueden ser analizadas, y los fragmentos pueden ser purificados mediante electroforesis a través de un gel de agarosa o de poliacrilamida, usando métodos bien conocidos que son rutinarios para aquellos con conocimientos en la técnica.

El término "elemento genético" generalmente significa un polinucleótido que comprende una región que codifica un polipéptido o una región que regula la transcripción o la traducción u otros procesos importantes para la expresión del polipéptido en una célula hospedante, o un polinucleótido que comprende tanto una región que codifica un polipéptido como una región operativamente unida que regula la expresión.

Los elementos genéticos pueden estar comprendidos en un vector que se reproduce como un elemento episomal; es decir, como una molécula físicamente independiente del genoma de la célula hospedante. Pueden estar comprendidos dentro de minicromosomas, tales como aquellos que surgen durante la amplificación de ADN transfectado mediante selección de metotrexato en células eucariontes. Los elementos genéticos también pueden estar comprendidos en el genoma de una célula hospedante; no en su estado natural sino, en lugar de eso, tras una manipulación tal como el aislamiento, la clonación y la introducción en una célula hospedante en la forma de ADN purificado o en un vector, entre otros.

El término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural; es decir, si existe en la naturaleza, ha sido cambiado o retirado de su entorno original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido que existe de forma natural o un polipéptido que está presente de forma natural en un animal vivo en su estado natural no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de las materias coexistentes de este estado natural está "aislado", tal como se emplea el término aquí. Por ejemplo, con respecto a los polinucleótidos, el término aislado significa que está separado del cromosoma y de la célula en la que existe de forma natural.

Como parte del aislamiento o a continuación de éste, dichos polinucleótidos pueden unirse con otros polinucleótidos, para mutagénesis, para formar proteínas de fusión, y para la propagación o la expresión en un hospedante, por ejemplo. Los polinucleótidos aislados, por sí solos o unidos a otros polinucleótidos tales como vectores, pueden ser introducidos en células hospedantes, en cultivos o en organismos completos, después de lo cual dichos ADNs todavía estarían aislados, tal como se usa el término aquí, porque no estarían en su forma o entorno natural.

De un modo similar, los polinucleótidos y polipéptidos pueden existir en una composición, tal como formulaciones de un medio, disoluciones para la introducción de polinucleótidos o de polipéptidos, por ejemplo, en el interior de células, composiciones o disoluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones que existan de forma natural, y, en ellas permanecen polinucleótidos y polipéptidos aislados, con el significado de este término tal como se emplea aquí.

El término "ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces de fosfodiéster entre dos o más polinucleótidos, que casi siempre son ADNs de doble cadena. Las técnicas para la ligación son bien conocidas en la técnica y en los manuales y referencias estándares de laboratorio se describen protocolos, tales como por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, un Laboratory Manual, 2ª Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) y Maniatis y col., pag. 146, como se cita más adelante.

El término "oligonucleótido(s)" se refiere a polinucleótidos relativamente cortos. A menudo el término se refiere a desoxiribonucleótidos de cadena sencilla, pero también se puede referir a ribonucleótidos de cadena doble o sencilla, a híbridos ARN: ADN y a ADNs de doble cadena, entre otros.

Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos sonda de ADN de cadena sencilla, a menudo son sintetizados mediante métodos químicos, tales como aquellos implementados en sintetizadores automáticos de oligonucleótidos. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden ser fabricados mediante una variedad de métodos, que incluyen técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro, y mediante expresión de ADNs en células y organismos.

Inicialmente, los ADNs sintetizados químicamente se obtienen típicamente sin un fosfato 5'. Los extremos 5' de dichos oligonucleótidos no son sustratos para la formación de enlaces de fosfodiéster mediante reacciones de ligación que emplean ligasas de ADN típicamente usadas para formar moléculas de ADN. Cuando se desea la ligación de dichos oligonucleótidos, se puede añadir un fosfato mediante técnicas estándar, tales como aquellas que emplean una quinasa y ATP.

El extremo 3' de un oligonucleótido sintetizado químicamente generalmente tiene un grupo hidroxilo libre y, en presencia de una ligasa tal como la T4 ADN ligasa, formará fácilmente un enlace de fosfodiéster con un fosfato 5' de otro polinucleótido, tal como otro oligonucleótido. Como es bien conocido, esta reacción puede ser evitada selectivamente, cuando se desee, eliminando los fosfatos 5' de el(los) otro(s) polinucleótido(s) antes de la ligación.

Generalmente los plásmidos son designados aquí mediante una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números, de acuerdo con las convenciones de nomenclatura estándar que son familiares para aquellos con conocimientos en la técnica. Los plásmidos de partida descritos aquí o bien están disponibles comercialmente, públicamente disponibles en una base sin restricciones, o bien pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles mediante una aplicación rutinaria de procedimientos publicados y bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y de expresión que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención son bien conocidos y fácilmente disponibles para aquellos con conocimientos en la técnica. Además, aquellos con conocimientos pueden construir fácilmente cualquier número de otros plásmidos adecuados para su uso en la invención. Las propiedades, construcción y uso de dichos plásmidos, así como de otros vectores, en la presente invención serán fácilmente evidentes para aquellos con conocimientos a partir de la presente descripción.

El término "polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, que puede ser ADN o ARN sin modificar o ADN o ARN modificados. De este modo, por ejemplo, los polinucleótidos como se usan aquí se refiere a, entre otros, ADN de cadena sencilla y doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y de regiones de cadena doble, ARN de cadena sencilla y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y de regiones de cadena doble. Además, polinucleótido como se usa aquí se refiere a regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o ambos, ARN y ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir por completo una o más moléculas, pero más típicamente incluyen sólo una región de parte de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es un oligonucleótido.

Como se usa aquí, el término polinucleótido incluye ADNs o ARNs como se ha descrito anteriormente que contienen una o más bases modificadas. De este modo, ADNs o ARNs con cadenas principales modificadas para mejorar la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como se entiende dicho término aquí. Además, ADNs o ARNs que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por mencionar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos tal como se usa aquí el término.

Se apreciará que se ha realizado una gran variedad de modificaciones en el ADN y en el ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por aquellos con conocimientos en la técnica. El término polinucleótido tal como se emplea aquí abarca dichas formas modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente de los polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y de ARN característicos de virus y de células, que incluyen células sencillas y complejas, inter alia.

El término "polipéptidos", como se usa aquí, incluye todos los polipéptidos como se describe a continuación. La estructura básica de los polipéptidos es bien conocida y ha sido descrita en innumerables libros de texto y en otras publicaciones de la técnica. En este contexto, el término es usado aquí para referirse a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos uno a otro en una cadena lineal mediante enlaces peptídicos. Como se usa aquí, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que comúnmente también son referidas en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente son referidas en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos.

Se apreciará que los polipéptidos a menudo contienen aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos comúnmente referidos como los 20 aminoácidos que existen de forma natural, y que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden ser modificados en un polipéptido dado, bien mediante procesos naturales, tales como el procesado y otras modificaciones post-translacionales, pero también mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Incluso las modificaciones comunes que se producen de forma natural en los polipéptidos son demasiado numerosas para realizar aquí un listado exhaustivo, pero están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la vasta bibliografía de investigación, y son bien conocidos por aquellos con conocimientos en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención están, para nombrar unas pocas ilustrativas, la acetilación, la acilación, la ADP-ribosilación, la amidación, el enlace covalente de flavina, el enlace covalente de un resto hemo, el enlace covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, el enlace covalente de un lípido o de un derivado de lípido, el enlace covalente de fosfotidilinositol, la reticulación, la ciclización, la formación de enlaces de disulfuro, la formación de retículos covalentes, la formación de cisteína, la formación de piroglutamato, la formilación, la gamma-carboxilación, la glicosilación, la formación de anclaje GPI, la hidroxilación, la iodación, la mutilación, la miristoilación, la oxidación, el procesado proteolítico, la fosforilación, la prenilación, la racemización, la selenoilación, la sulfación, la adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como la arginilación, y la ubiquitinación.

Dichas modificaciones son bien conocidas por aquellos con conocimientos en la técnica y han sido descritas con gran detalle en la bibliografía científica. Varias modificaciones particularmente comunes, la glicosilación, el enlace de lípidos, la sulfación, la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ADP-ribosilación, por ejemplo, son descritas en la mayoría de textos básicos, tales como, por ejemplo Proteins-Structure and Molecular Properties, 2ª edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman y colaboradores, Nueva York (1993). En este tema hay disponibles muchas revisiones detalladas, tales como, por ejemplo, aquellas proporcionadas por Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectivas and Prospects, páginas 1 a 12 en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academia Press, Nueva York (1983); Séller y col., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol., 182: 626-646 (1990) y Rattan y col., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci., 663: 48-62 (1992).

Se apreciará, como es bien conocido y como indica a continuación, que los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificaciones, generalmente como resultado de procesos de posttranslación, incluyendo sucesos de procesado natural, y procesos llevados a cabo por la manipulación humana que no se producen de forma natural. Así mismo, los polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados pueden ser sintetizados mediante procesos naturales no translacionales y mediante métodos completamente sintéticos.

Las modificaciones se pueden producir en cualquier posición en un polipéptido, incluyendo la cadena principal del polipéptido, las cadenas laterales de aminoácidos o los extremos carboxilo. De hecho, así mismo el bloqueo del grupo amino o del grupo carboxilo en un polipéptido, o de ambos, mediante una modificación covalente, es común en los polipéptidos naturales y en los sintéticos y dichas modificaciones pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el residuo amino terminal de los polipéptidos fabricados en E. coli, antes del procesado proteolítico, será casi invariablemente N-formilmetionina.

A menudo, las modificaciones que se producen en un polipéptido serán función de cómo se hagan. Para los polipéptidos fabricados mediante la expresión de un gen clonado en un hospedante, por ejemplo, la naturaleza y extensión de las modificaciones se determinarán en su mayor parte mediante la capacidad de modificación posttranslacional de célula hospedante y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como es bien conocido, la glicosilación a menudo no se produce en hospedantes bacterianos tales como E. coli. Del mismo modo, cuando se desea la glicosilación, debería expresarse un polipéptido en un hospedante de glicosilación, generalmente una célula eucarionte. Las células de insectos a menudo llevan a cabo las mismas glicosilaciones posttranslacionales que las células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para expresar de forma eficaz proteínas de mamífero que tienen estructuras nativas de glicosilación, inter alia. Consideraciones similares se aplican otras modificaciones. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o diferente grado en diversas posiciones en un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. En general, como se usa aquí, el término polipéptido abarca todas estas modificaciones, particularmente aquellas que están presentes en polipéptidos sintetizados mediante la expresión de un polinucleótido en una célula hospedante.

El término "variante(s)" de polinucleótidos o de polipéptidos, como se usa el término aquí, son polinucleótidos o polipéptidos que difieren de un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente. A continuación y en cualquier lugar en la presente descripción se describen variantes en este sentido en mayor detalle.

Una variante de polinucleótido es un polinucleótido que difiere de otro polinucleótido de referencia en la secuencia de nucleótidos. Generalmente, las diferencias son limitadas de tal modo que las secuencias de nucleótidos de la referencia y de la variante son muy similares de forma general y, en muchas regiones, son idénticas. Como se destaca más adelante, los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden ser mudos. Esto es, pueden no alterar los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Cuando las alteraciones están limitadas a cambios mudos de este tipo, una variante codificará un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que la referencia. También como se indica más adelante, los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de referencia. Dichos cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute más adelante.

Una variante de polipéptido es un polipéptido que difiere de otro polipéptido de referencia en la secuencia de aminoácidos. Generalmente, las diferencias están limitadas de tal modo que las secuencias de la referencia y de la variante son muy similares de forma general y, en muchas regiones, son idénticas. Una variante de polipéptido y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación.

El término "molécula receptora", como se usa aquí, se refiere a moléculas que se unen o interaccionan de forma específica con los polipéptidos de TNF delta o de TNF epsilon de la presente invención, incluyendo no sólo los receptores clásicos, que son preferidos, sino también otras moléculas que se unen específicamente a o que interaccionan con polipéptidos de la invención (que también pueden ser referidos como "moléculas de unión" y "moléculas de interacción", respectivamente, y como "moléculas de unión de TNF delta" y "moléculas de interacción de TNF delta" o "moléculas de unión de TNF epsilon" y "moléculas de interacción de TNF epsilon"). La unión entre polipéptidos de la invención y dichas moléculas, incluyendo las moléculas receptoras o de unión o de interacción, puede ser exclusiva de los polipéptidos de la invención, lo que es muy altamente preferido, o puede ser altamente específica para los polipéptidos de la invención, lo que es altamente preferido, o puede ser altamente específica para un grupo de proteínas que incluye los polipéptidos de la invención, lo que es preferido, o puede ser específico para varios grupos de proteínas, incluyendo al menos una de ellas polipéptidos de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y polinucleótidos de TNF delta y TNF epsilon, entre otras cosas, como se describe en mayor detalle más adelante. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos que están relacionadas mediante homología de la secuencia de aminoácidos con la superfamilia de ligandos de TNF. La invención se refiere específicamente a TNF delta que tiene las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos establecidas en la Figura 1, y a las secuencias de nucleótidos de TNF y de aminoácidos del cADN humano en ATCC Depósito nº 97377. La invención también se refiere específicamente a TNF epsilon que tiene las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos establecidas en la Figura 2, y a las secuencias de nucleótidos de TNF y de aminoácidos del cADN humano en ATCC Depósito nº 97457. Los depósitos son referidos a partir de aquí como clones depositados o como "el cADN de los clones depositados". Se apreciará que las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos establecidas en las Figuras 1 y 2 fueron obtenidas por secuenciamiento del cADN humano de los clones depositados. Por tanto, la secuencia del clon depositado está controlando cualquier discrepancia entre las dos y cualquier referencia a las secuencias de las Figuras 1 y 2 incluye referencia a las secuencias de cADNs humanos de los clones depositados.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon que tienen las secuencias de aminoácidos deducidas de las Figuras 1 y 2.

Usando la información proporcionada aquí, tal como la secuencia de polinucleótidos establecida en la Figura 1, s puede obtener un polinucleótido de la presente invención que codifica polipéptido de TNF delta humano usando procedimientos estándar de clonación y de monitorización, tales como aquellos para clonar cADNs usando mARN de células de tejido humano como materia de partida. Ilustrativo de la invención, el polinucleótido establecido en la Figura 1 fue descubierto en una biblioteca de cADN derivada de las células de tejido coronario humano.

El TNF delta humano de la invención está estructuralmente relacionado con otras proteínas de la superfamilia de ligandos de TNF, como demuestran los resultados de secuenciamiento del cADN que codifica TNF delta humano en el clon depositado. La secuencia de cADN obtenida de este modo se muestra en la Figura 1. Contiene una estructura de lectura abierta que codifica una proteína de aproximadamente 233 residuos de aminoácidos con un peso molecular deducido de aproximadamente 25871 kDa. La proteína exhibe la mayor homología a TNF\alpha, entre las proteínas conocidas. La secuencia completa de aminoácidos del TNF delta de la Figura 1 tiene aproximadamente un 38% de identidad con la secuencia de aminoácidos del TNF\alpha.

Un polinucleótido de la presente invención que codifica polipéptido de TNF epsilon humano puede ser obtenido usando procedimientos estándar de clonación y monitorización, tales como aquellos para clonar cADNs usando mARN de células de tejido humano como materia de partida. Ilustrativo de la invención, el polinucleótido establecido en la Figura 2 fue descubierto en una biblioteca de cADN derivada a partir de células de tejido coronario humano.

El TNF epsilon de la invención está estructuralmente relacionado con otras proteínas de la superfamilia de ligandos de TNF, como demuestran los resultados de secuenciamiento del cADN que codifica TNF epsilon humano en el clon depositado. La secuencia de cADN obtenida de este modo se muestra en la Figura 2. La secuencia de TNF epsilon es casi idéntica a la secuencia de TNF delta mostrada en la Figura 1 menos los 50 aminoácidos iniciales y menos una región de TNF delta que comprende desde el aminoácido 86 al aminoácido 92. Por consiguiente, el TNF epsilon es una variante montada del TNF delta. El TNF epsilon comprende 168 residuos de aminoácido y la secuencia de la Figura 2 muestra la proteína madura de TNF epsilon sin ninguna región hidrófoba N-terminal. La proteína exhibe la mayor homología a TNF\alpha. El TNF epsilon de la Figura 2 tiene aproximadamente un 20% de identidad con la secuencia de aminoácidos del TNF\alpha.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tal como el mARN, o en la forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, cADN y ADN genómico obtenido por clonación o producido por técnicas sintéticas químicas o por una combinación. El ADN puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. El ADN de cadena sencilla puede ser la cadena de codificación, también conocida con la cadena sentido, o puede ser la cadena no codificadora, también denominada cadena antisentido.

La secuencia de codificación que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de codificación del polinucleótido mostrado en las Figuras 1 y 2. También puede ser un polinucleótido con una secuencia diferente, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código génico, codifica el polipéptido del ADN de las Figuras 1 y 2.

Los polinucleótidos de la presente invención que codifican el polipéptido de las Figuras 1 y 2 pueden incluir, pero no se limitan a, la secuencia de codificación del polipéptido maduro, por sí mismo; la secuencia de codificación del polipéptido maduro y secuencias de codificación adicionales, tales como aquellas que codifican un líder o secuencia secretora, tal como una secuencia de pre-, pro- o prepro- proteína; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin las secuencias de codificación adicionales mencionadas antes, junto con secuencias no codificadoras adicionales, que incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, intrones y secuencias 5' y 3' no codificadoras, tales como las secuencias transcritas no traducidas, que juegan un papel en la transcripción, en el procesado de mARN (incluyendo señales de deslizamiento y poliadenilación, por ejemplo), en la unión de ribosomas y en la estabilidad del mARN; secuencias codificadoras adicionales que codifican aminoácidos adicionales, tales como aquellos que proporcionan funcionalidades adicionales.

De este modo, por ejemplo, el polipéptido puede ser fusionado a una secuencia marcadora, tal como un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En determinadas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en el vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Genz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrita por Wilson y col, Cell, 37: 767 (1984), por ejemplo.

De acuerdo con lo anterior, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa aquí abarca a los polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la presente invención, particularmente el TNF delta humano y el TNF epsilon que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las Figuras 1 y 2. El término abarca a los polinucleótidos que incluyen una región sencilla continua o regiones discontinuas que codifican un polipéptido (por ejemplo, desbaratado por intrones) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificadoras y/o no codificadoras.

La presente invención además se refiere a variantes de los nucleótidos antes descritos que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las Figuras 1 y 2. Una variante del polinucleótido puede ser una variante que existe de forma natural tal como una variante alélica natural, o puede ser una variante de la que no se sepa que exista en la naturaleza. Dichas variantes no naturales del polinucleótido pueden ser fabricadas mediante técnicas de mutagénesis, que incluyen aquellas aplicadas a polinucleótidos, células u organismos.

Entre las variantes de este tipo están las variantes que difieren de los polinucleótidos anteriormente mencionados en sustituciones, eliminaciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, eliminaciones o adiciones pueden incluir uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en las regiones codificadoras o no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, eliminaciones o adiciones conservativas o no conservativas de aminoácidos.

Entre las realizaciones particularmente preferidas de la invención en este sentido están los polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos del TNF delta y del TNF epsilon establecidas en las Figuras 1 y 2; sus variantes, análogos, derivados y fragmentos, y fragmentos de las variantes, análogos y derivados.

Adicionalmente, en este contexto son particularmente preferidos los polinucleótidos que codifican TNF delta y TNF epsilon que tienen las secuencias de aminoácidos del polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon de las Figuras 1 y 2 en los que se sustituyen, eliminan o añaden varios, unos pocos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácido, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas están las sustituciones, adiciones y eliminaciones mudas, que no alteran las propiedades y actividades del TNF delta y del TNF epsilon. En este sentido, también son especialmente preferidas son las sustituciones conservativas. Lo más preferido son los polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de las Figuras 1 y 2, sin sustituciones. Otras realizaciones preferidas de la invención son los polinucleótidos que son idénticos al menos en un 70% a un polinucleótido que codifica el polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en las Figuras 1 y 2, y los polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Alternativamente, lo más preferido son los polinucleótidos que comprenden una región que es idéntica en al menos el 80% a un polinucleótido que codifica polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon y sus polinucleótidos complementarios. En este contexto, son particularmente preferidos los polinucleótidos idénticos al menos en un 90% al mismo, y entre estos polinucleótidos particularmente preferidos, aquellos con al menos un 95% son especialmente preferidos. Además, aquellos con al menos un 97% son altamente preferidos entre aquellos con al menos un 95%, y entre éstos aquellos con al menos un 98% y al menos un 99% son particularmente altamente preferidos, siendo el más preferido el de al menos un 99%.

En este sentido, las realizaciones particularmente preferidas, además, son los polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el cADN de las Figuras 1 y 2.

La presente invención además se refiere a polinucleótidos que se hibridan a las secuencias anteriormente descritas. En este contexto, la presente invención especialmente se refiere a polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas a los polinucleótidos anteriormente descritos. Tal como se usa aquí, el término "condiciones rigurosas" significa que la hibridación se producirá cuando al menos un 95% y preferiblemente al menos un 97% de las bases entre secuencias son complementarias (por ejemplo, G:C; A:T).

Como se discute aquí adicionalmente en relación a los ensayos de polinucleótido de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención tal como son discutidos más adelante, pueden ser usados como una sonda de hibridación para el cADN y para el ADN genómico para aislar cADNs de longitud completa y clones genómicos que codifican TNF delta y TNF epsilon y para aislar cADN y clones genómicos de otros genes que tienen una elevada similitud de secuencia con el gen de TNF delta y de TNF epsilon humanos. Dichas sondas generalmente comprenderán al menos 15 bases. Preferiblemente, dichas sondas tendrán al menos 30 bases y pueden tener al menos 50 bases.

Por ejemplo, la región codificadora del gen de TNF delta y de TNF epsilon puede ser aislada mediante monitorización usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. A continuación se usa un oligonucleótido marcado que tiene la secuencia complementaria a la del gen de la presente invención para monitorizar una biblioteca de cADN humano, de ADN genómico humano o de mARN humano para determinar con qué miembros de la biblioteca se hibrida la sonda.

Los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados como reactivos de investigación y como materiales para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas, como se discute en mayor profundidad aquí en relación a los ensayos de polinucleótidos, inter alia.

Los polinucleótidos pueden codificar un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos aminoterminales o carboxiterminales adicionales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo). Dichas secuencias pueden jugar un papel en el procesado de una proteína a partir de un precursor hasta una forma madura, pueden facilitar el tráfico de proteínas, pueden prolongar o acortar la vida media de las proteínas o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in situ, los aminoácidos adicionales pueden ser procesados a partir de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Una proteína precursora, que tiene la forma madura del polipéptido fusionado con una o más prosecuencias puede estar en una forma activa del polipéptido. Dichos precursores inactivos generalmente son activados cuando las prosecuencias son eliminadas. Algunas o todas las prosecuencias pueden ser eliminadas antes de la activación. Generalmente, dichos precursores se denominan proproteínas.

En suma, un polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede ser referida como una preproproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son secuencias líder de una preproteína, o de una preproproteína, que es un precursor para una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente son eliminadas durante las etapas de procesado que producen formas activas y maduras del polipéptido.

Se han depositado depósitos que contienen cADN de TNF delta y de TNF epsilon humanos con una "American Type Culture Collection" (recolección de cultivo tipo americana), como se ha indicado antes. También como se ha indicado antes, el depósito de cADN es referido aquí como "el clon depositado" o como "el cADN del clon depositado". Los clones fueron depositados con la American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., el 8 de diciembre de 1995 y el 1 de marzo de 1996, y se les asignó los Depósitos ATCC nº 97377 y 97457, respectivamente. Los materiales depositados son plásmidos pBluescript SK (-) (Stratagene, La Jolla, CA) que contiene toda la longitud del cADN de TNF delta y de TNF epsilon humanos.

Los depósitos han sido fabricados bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos del procedimiento de patente. Las cepas estarán al alcance del público, irrevocablemente y sin restricción o condición, tras la publicación de una patente. Se proporcionan los depósitos meramente por comodidad de aquellos con conocimientos en la técnica y no son una admisión de que se requiera un depósito para el capacitamiento, tal como el requerido bajo 35 U.S.C. \NAK112. La secuencia de los polinucleótidos contenida en el material depositado, así como la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado, están controlando en el suceso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias. Puede requerirse una licencia para fabricar, usar o vender los materiales depositados, y dicha licencia no es concedida aquí.

La presente invención además se refiere a polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon humanos que tienen las secuencias de aminoácidos deducidas de las Figuras 1 y 2. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético. En determinadas realizaciones preferidas es un polipéptido recombinante.

La invención también se refiere a fragmentos, análogos y derivados de estos polipéptidos. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de las Figuras 1 y 2 significan un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que dicho polipéptido. Por tanto, un análogo incluye una proproteína que puede ser activada mediante ruptura de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo.

El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de las Figuras 1 y 2 puede ser (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácido están sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código génico, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para purificar el polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Se considera que dichos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de aquellos con conocimientos en la técnica a partir de las enseñanzas aquí presentadas.

Entre las realizaciones de la invención particularmente preferidas en este sentido están los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de TNF delta y de TNF epsilon establecida en las Figuras 1 y 2, sus variantes, análogos, derivados y fragmentos, y variantes, análogos y derivados de los fragmentos. Alternativamente, las realizaciones de la invención particularmente preferidas en este sentido son los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de TNF delta y de TNF epsilon del cADN humano del clon depositado, de sus variantes, análogos, derivados y fragmentos, y de variantes, análogos y derivados de los fragmentos.

Entre las variantes preferidas están aquellas que difieren de una referencia en sustituciones de aminoácidos conservativas. Dichas sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado de un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Son típicamente observados como sustituciones conservativas los reemplazamientos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Ile; el intercambio de los residuos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los residuos amida Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y los reemplazamientos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.

Más particularmente preferidos en este sentido son las variantes, análogos, derivados y fragmentos, y las variantes, análogos y derivados de los fragmentos, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon de las Figuras 1 y 2 ó del cADN del clon depositado, en el que varios, unos pocos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 ó ningún residuo de aminoácido son sustituidos, eliminados o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas son las sustituciones, eliminaciones y adiciones mudas, que no alteran las propiedades y actividades del TNF delta y del TNF epsilon. También son especialmente preferidas en este sentido las sustituciones conservativas. Lo más preferido son los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de las Figuras 1 y 2 sin sustituciones.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención son preferiblemente proporcionados en forma aislada, y preferiblemente son purificados hasta homogeneidad.

Los polipéptidos de TGF delta de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:2 (en particular el polipéptido maduro) así como los polipéptidos que tienen al menos un 70% de similitud (preferiblemente al menos un 70% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:2 y más preferiblemente al menos un 90% de similitud (más preferiblemente al menos un 90% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:2 y aún más preferiblemente al menos un 95% de similitud (aún más preferiblemente al menos un 95% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:2 y también incluye porciones de dichos polipéptidos con dicha porción del polipéptido que contiene generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Los polipéptidos de TGF epsilon de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:4 (en particular el polipéptido maduro) así como los polipéptidos que tienen al menos un 70% de similitud (preferiblemente al menos un 70% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:4 y más preferiblemente al menos un 90% de similitud (más preferiblemente al menos un 90% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:4 y aún más preferiblemente al menos un 95% de similitud (aún más preferiblemente al menos un 95% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. Nº:4 y también incluye porciones de dichos polipéptidos con dicha porción del polipéptido que contiene generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Como es conocido en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos es determinada por comparación de la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de polipéptidos; por lo tanto, los fragmentos pueden ser empleados como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden ser usados para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es enteramente lo mismo que una parte pero no que toda la secuencia de aminoácidos de los anteriormente mencionados polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon y sus variantes o derivados. Dichos fragmentos pueden estar "libres", es decir, sin formar parte de o estar fusionados a otros aminoácidos o polipéptidos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o una región. Cuando se encuentran comprendidos dentro de un polipéptido más grande, los fragmentos actualmente discutidos más preferiblemente forman una región continua sencilla. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido sencillo más grande. Por ejemplo, determinadas realizaciones preferidas se refieren a un fragmento de un polipéptido de TNF delta y de TNF epsilon de la presente invención comprendido dentro de un polipéptido precursor diseñado para la expresión en un hospedante y que tiene regiones heterólogas de pre y pro-polipéptido fusionadas al extremo amino del fragmento de TNF delta y de TNF epsilon y una región adicional fusionada al extremo carboxilo del fragmento. Por lo tanto, los fragmentos en un aspecto del significado que se pretende aquí, se refieren a la porción o porciones de un polipéptido de fusión o de una proteína de fusión derivada de TNF delta y de TNF epsilon.

Como ejemplos representativos de los fragmentos de polipéptido de la invención, pueden mencionarse aquellos que tienen entre aproximadamente 30 y aproximadamente 233 aminoácidos. En este contexto, "aproximadamente" incluye el intervalo y los intervalos particularmente enumerados mayores o menores en varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácido en cualquier extremo o en ambos extremos. Por ejemplo, aproximadamente de 100 a 233 aminoácidos en este contexto significa un fragmento de polipéptido desde 100 aminoácidos más/menos varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 ó 1 hasta 233 residuos de aminoácido más/menos varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 ó 1, es decir, varía como mucho entre 100 menos varios aminoácidos y 233 más varios aminoácidos, y como poco entre 100 más varios aminoácidos y 233 menos varios aminoácidos.

En este sentido son altamente preferidos los intervalos enumerados más/menos tantos como 5 aminoácidos en cualquiera o en ambos extremos. Particularmente altamente preferidos son los intervalos enumerados más/menos tantos como 3 aminoácidos en cualquiera o en ambos extremos citados. Especialmente particularmente altamente preferidos son los intervalos más/menos 1 aminoácido en cualquiera o en ambos extremos de los extremos citados sin adiciones o eliminaciones. Los más altamente preferidos de todos en este sentido son los fragmentos entre aproximadamente 15 y aproximadamente 233 aminoácidos.

Entre los fragmentos especialmente preferidos de la invención están los mutantes truncados de TNF delta y de TNF epsilon. Los mutantes truncados incluyen los polipéptidos de TNF delta y de TNF epsilon que tienen la secuencia de aminoácidos de las Figuras 1 y 2, o de sus variantes o derivados, excepto las eliminaciones de una serie continua de residuos (esto es, una región, una parte o una porción continua) que incluye el extremo amino, o una serie continua de residuos que incluye el extremo carboxilo o, como en los mutantes doblemente truncados, la eliminación de dos series continuas de residuos, una que incluye el extremo amino y otra que incluye el extremo carboxilo. Los fragmentos que tienen los tamaños de intervalo establecidos aproximadamente, también son realizaciones preferidas de los fragmentos truncados, que generalmente son especialmente preferidos entre los fragmentos.

También son preferidos en este aspecto de la invención los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales de TNF delta y TNF epsilon. Las realizaciones preferidas de la invención en este sentido incluyen fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y regiones que forman hélice alfa ("regiones alfa"), regiones de lámina beta y regiones formadoras de lámina beta ("regiones beta"), regiones de giro y regiones formadoras de giro ("regiones de giro"), regiones de bobina y regiones formadoras de bobina ("regiones de bobina"), regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones beta antipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie y regiones de alto índice antigénico de TNF delta y TNF epsilon.

En la Figura 4 se presentan determinadas regiones preferidas en este sentido para el TNF delta y en la Figura 5 para el TNF epsilon, e incluyen, pero no se limitan a, regiones de los tipos anteriormente mencionados identificados mediante análisis de la secuencia de aminoácidos establecida en las Figuras 1 y 2. Como se establece en las Figuras 4 y 5, dichas regiones preferidas incluyen regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de bobina Garnier-Robson, regiones alfa, regiones beta y regiones de giro Chou-Fasman, regiones hidrófilas y regiones hidrófobas Kyte-Doolittle, regiones alfa y beta anfipáticas Eisenberg, regiones flexibles Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie Emini y regiones de elevado índice antigénico Jameson-Wolf.

Entre los fragmentos altamente preferidos en este sentido están aquellos que comprenden regiones de TNF delta y de TNF epsilon que combinan varias características estructurales, tales como varias de las características establecidas anteriormente. En este sentido, las regiones definidas por los residuos que siguen a la región de péptidos señal de las Figuras 1, 2, 4 y 5, que se caracterizan todas por composiciones de aminoácidos altamente características de regiones de giro, regiones hidrófilas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, y regiones de alto índice antigénico, son regiones especialmente altamente preferidas. Dichas regiones pueden estar comprendidas dentro de un polipéptido más grande o pueden ser por sí mismas un fragmento preferido de la presente invención, como se ha discutido anteriormente. Se apreciará que el término "aproximadamente" como es usado en este párrafo tiene el significado establecido anteriormente en relación a los fragmentos en general.

Regiones adicionalmente preferidas son aquellas que median actividades de TNF delta y de TNF epsilon. Las más altamente preferidas en este sentido son los fragmentos que tienen una actividad química, biológica o de otro tipo de TNF delta y de TNF epsilon, incluyendo aquellos con una actividad similar o con una actividad mejorada, o con una no deseada actividad disminuida. Altamente preferidos en este sentido son los fragmentos que contienen regiones que son homólogas en secuencia, o en posición, o tanto en secuencia como en posición, a las regiones activas de polipéptidos relacionados, tales como los polipéptidos relacionados establecidos en la Figura 3, que incluyen TNF \alpha y \beta humanos. Entre los fragmentos particularmente preferidos en este sentido están los mutantes truncados, como se ha discutido anteriormente.

Se apreciará que la invención también se refiere a, entre otros, polinucleótidos que codifican los fragmentos anteriormente mencionados, polinucleótidos que se hibridan con polinucleótidos que codifican los fragmentos, particularmente aquellos que se hibridan bajo condiciones estrictas, y polinucleótidos, tales como los prímeros PCR, para amplificar los polinucleótidos que codifican los fragmentos. En este sentido, los polinucleótidos preferidos son aquellos que corresponden a los fragmentos preferidos, como se ha discutido anteriormente.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedantes que generalmente son diseñadas con vectores de la invención y la producción de los polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células hospedantes pueden ser diseñadas genéticamente para incorporar los polinucleótidos y para expresar los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser introducidos en células hospedantes usando técnicas de infección, transducción, transfección, transvección y transformación bien conocidas. Los polinucleótidos pueden ser introducidos solos o con otros polinucleótidos. Esos otros polinucleótidos pueden ser introducidos independientemente, pueden ser cointroducidos o pueden ser introducidos unidos a los polinucleótidos de la invención. De este modo, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden ser transfectados en células hospedantes con otro polinucleótido, separado, que codifica un marcador seleccionable, usando técnicas estándar de cotransfección y selección en, por ejemplo, células de mamífero. En este caso los polinucleótidos generalmente se incorporarán de forma estable al genoma de la célula hospedante.

Alternativamente, los polinucleótidos pueden estar unidos a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un hospedante. El constructo vector puede ser introducido en las células hospedantes mediante las técnicas anteriormente mencionadas. Generalmente, se introduce un vector plásmido como ADN en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. También puede usarse la electroporación para introducir polinucleótidos en un hospedante. Si el vector es un virus, puede ser empaquetado in vitro o puede ser introducido en una célula de empaquetamiento y el virus empaquetado puede ser transducido al interior de las células. Se conoce bien una amplia variedad de técnicas adecuadas para fabricar polinucleótidos y para introducir polinucleótidos en células de acuerdo con este aspecto de la invención y son rutinarias para aquellos con conocimientos en la técnica. Dichas técnicas son exhaustivamente revisadas en Sambrook y col., citado anteriormente, que es ilustrativo de los muchos manuales de laboratorio que detallan estas técnicas. De acuerdo con este aspecto de la invención el vector puede ser, por ejemplo, un vector plásmido, un vector fago de cadena sencilla o de cadena doble, un vector vírico de ADN o de ARN de cadena sencilla o de cadena doble. Dichos vectores pueden ser introducidos en las células como polinucleótidos, preferiblemente ADN, mediante técnicas bien conocidas para introducir ADN y ARN en el interior de células. Los vectores, en el caso de los vectores fagos y víricos también pueden ser, preferiblemente, introducidos en las células como virus empaquetados o encapsulados mediante técnicas de infección y transducción bien conocidas. Los vectores víricos pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En este último caso, la propagación vírica generalmente se producirá sólo en las células hospedantes complementarias.

Preferidos entre los vectores, en ciertos aspectos, son aquellos para expresión de polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención. Generalmente, dichos vectores comprenden regiones de control que actúan como cis eficaces para la expresión en un hospedante unido operativamente al polinucleótido a expresar. Los factores que actúan como trans bien son apropiadamente suministrados por el hospedante, bien son suministrados por un vector complementario o bien son suministrados por el vector por sí mismo después de ser introducido en el hospedante.

En determinadas realizaciones preferidas en este sentido, los vectores mantienen una expresión específica. Dicha expresión específica puede ser una expresión inducible o una expresión sólo en determinados tipos de células o ambas, inducible y específica. Particularmente preferidos entre los vectores inducibles son los vectores que pueden ser inducidos para la expresión mediante factores ambientales que son fáciles de manipular, tales como la temperatura y los aditivos nutrientes. Se conoce bien una variedad de vectores adecuados a este aspecto de la invención, que incluyen vectores de expresión constitutivos e inducibles para su uso en hospedantes procariontes y eucariontes, y son empleados de forma rutinaria por aquellos con conocimientos en la técnica.

Las células hospedantes diseñadas pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales, que pueden ser modificados apropiadamente para, inter alia, promotores de activación, transformantes de selección o genes de amplificación. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y otros similares, previamente usados con la célula hospedante seleccionada para la expresión, serán generalmente adecuadas para la expresión de polipéptidos de la presente invención como será evidente para aquellos con conocimientos de la técnica.

Se puede usar una gran variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido de la invención. Dichos vectores incluyen vectores cromosomales, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de epitomas de levadura, de elementos cromosomales de levadura, de virus tales como el báculovirus, los virus papova, tales como el SV40, los virus de vaccínea, los adenovirus, los virus de viruela de ave de corral, los virus de pseudorrabia y los retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como aquellos derivados de plásmido y elementos génicos bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos, todos pueden ser usados la expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para expresar un polipéptido en un hospedante puede ser usado para la expresión en este sentido.

La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias bien conocidas. En general, se une una secuencia de ADN para la expresión a un vector de expresión rompiendo la secuencia de ADN y el vector de expresión con una o más endonucleasas de restricción y a continuación uniendo los fragmentos de restricción usando ligasa de ADN T4. Los procedimientos para la restricción y la ligación que pueden ser usados con este fin son bien conocidos y rutinarios para aquellos con conocimientos. Los procedimientos adecuados en este sentido, y para construir los vectores de expresión usando técnicas alternativas, que también son bien conocidos y rutinarios para aquellos con conocimientos, son establecidos con gran detalle en Sambrook y col., citado anteriormente.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a una(s) secuencia(s) de expresión de control apropiada(s), que incluye, por ejemplo, un promotor para dirigir la transcripción de mARN. Representantes de dichos promotores incluyen el promotor fago lambda PL, los promotores lac, trp y tac de E. coli., los promotores tempranos y tardíos SV40 y los promotores de LTRs retrovirales, por nombrar sólo unos pocos de los bien conocidos promotores. Se entenderá que numerosos promotores no mencionados adecuados para su uso en este aspecto de la invención son bien conocidos y pueden ser fácilmente empleados por aquellos con conocimientos de la manera ilustrada por la discusión y los ejemplos incluidos aquí.

En general, los constructos de expresión contendrán posiciones para el inicio y el fin de la transcripción, y, en la región transcrita, una posición de unión de ribosomas para la traducción. La porción codificadora de los transcritos maduros expresados mediante los constructos incluirá un AUG iniciador de la traducción al principio y un codón de terminación apropiadamente posicionado al final del polipéptido a traducir.

Además, los constructos pueden contener regiones de control que regulan y engendran expresión. Generalmente, de acuerdo con muchos procedimientos comúnmente practicados, dichas regiones operarán controlando la transcripción, tal como posiciones de unión represoras y potenciadores, entre otros.

Los vectores para la propagación y para la expresión generalmente incluirán marcadores seleccionables. Dichos marcadores también pueden ser adecuados para la amplificación, o los vectores pueden contener marcadores adicionales para este propósito. En este sentido, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedantes transformadas. Los marcadores preferidos incluyen reductasa de dihidrofolato o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariontes, y genes de resistencia a tetraciclina o a ampicilina para el cultivo de E. coli y otras bacterias.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito aquí, así como un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, puede ser introducido en un hospedante apropiado usando una variedad de técnicas bien conocidas adecuadas para la expresión de un polipéptido deseado. Ejemplos representativos de hospedantes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de E. coli, de Streptomyces y de Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS y de melanoma de Bowes; y células de plantas. Se conocen bien hospedantes para una gran variedad de constructos de expresión, y aquellos con conocimientos serán capaces, a partir de la presente descripción, de seleccionar fácilmente un hospedante para expresar un polipéptido de acuerdo con este aspecto de la presente invención.

Más particularmente, la presente invención también incluye constructos recombinantes, tales como constructos de expresión, que comprenden una o más de las secuencias descritas anteriormente. Los constructos comprenden un vector, tal como un vector plásmido o vírico, en el cual una secuencia tal de la invención ha sido insertada. La secuencia puede ser insertada en una orientación hacia delante o inversa. En determinadas realizaciones preferidas en este sentido, el constructo además comprende secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, un promotor, unido operativamente a la secuencia. Aquellos con conocimientos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y hay muchos vectores disponibles comercialmente adecuados para su uso en la presente invención.

Los siguientes vectores, que están disponibles comercialmente, son proporcionados a modo de ejemplo. Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias están el pQE70, el pQE60 y el pQE9, disponibles en Qiagen; los vectores pBS, los vectores Phagescript, los vectores Bluescript, el pNH8A, el pNH16a, el pNH18A, el pNH46A, disponibles en Stratagene; y el ptrc99a, el pKK223-3, el pKK233-3, el pDR540, el pRIT5 disponibles en Pharmacia. Entre los vectores eucariontes preferidos están el pWLNEO, el pSV2CAT, el pOG44, el pXT1 y el pSG disponibles en Stratagene; y el pSVK3, el pBPV, el pMSG y el pSVL disponibles en Pharmacia. Estos vectores se presentan simplemente a modo de ilustración de los muchos vectores disponibles comercialmente bien conocidos que están disponibles para aquellos con conocimientos en la técnica para su uso de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Se apreciará que cualquier otro plásmido o vector adecuado para, por ejemplo, la introducción, mantenimiento, propagación o expresión de un polinucleótido o de un polipéptido de la invención en un hospedante puede ser usado en este aspecto de la invención.

Las regiones de promotor pueden ser seleccionadas a partir de cualquier gen deseado usando vectores que contienen una unidad de transcripción de informe que carece de una región de promotor, tal como una unidad de transcripción de transferasa de acetilcloranfenicol (cat, del inglés "chloramphenicol acetyl transferasa"), corriente debajo de la posición o posiciones de restricción para introducir un fragmento promotor candidato; es decir, un fragmento que puede contener un promotor. Como es bien sabido, la introducción en un vector de un fragmento que contiene un promotor en la posición de restricción por encima del gen cat da lugar a la producción de actividad CAT, que puede ser detectada mediante ensayos CAT estándar. Los vectores adecuados para este fin son bien conocidos y fácilmente disponibles. Dos de dichos vectores son el pKK232-8 y el pCM7. Por tanto, los promotores para la expresión de polinucleótidos de la presente invención incluyen no sólo promotores bien conocidos y fácilmente disponibles, sino también promotores que pueden ser obtenidos fácilmente mediante la anterior técnica, usando un gen de informe.

Entre los promotores bacterianos conocidos adecuados para la expresión de polinucleótidos y de polipéptidos de acuerdo con la presente invención están los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, el PR lambda, los promotores PL el promotor trp. Entre los promotores eucariontes conocidos adecuados en este sentido están el promotor temprano inmediato CMV, el promotor de kinasa timidina HSV, los promotores tempranos y tardíos SV40, los promotores de LTRs retrovirales, tales como aquellos del virus de sarcoma de Rous ("RSV"), y los promotores de metalotioneina, tal como el promotor de metalotioneina-I de ratón. La selección de los vectores y de los promotores apropiados para la expresión en una célula hospedante es un procedimiento bien conocido y las técnicas requisito para la construcción del vector de expresión, la introducción del vector en un hospedante y la expresión en el hospedante son rutinarias en la técnica.

La presente invención también se refiere a células hospedantes que contienen los constructos descritos anteriormente. La célula hospedante puede ser una célula eucarionte superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucarionte inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedante puede ser una célula procarionte, tal como una célula bacteriana.

La introducción de un constructo en la célula hospedante puede ser efectuada mediante transfección de fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección catiónica mediada por lípidos, la electroporación, la transducción, la infección o por otros métodos. Dichos métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tal como Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, (1986). Los constructos en células hospedantes pueden ser usados de forma convencional para producir el producto génico codificado mediante la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamíferos, en levadura, en bacterias, o en otras células bajo el control de los promotores apropiados. Los sistemas de traducción libres de células también pueden ser empleados para producir dichas proteínas usando ARNs derivados a partir de constructos de ADN de la presente invención. Vectores de expresión y de clonación apropiados para su uso con hospedantes procariontes y eucariontes son descritos por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Generalmente, los vectores recombinantes de expresión incluirán los orígenes de replicación, un promotor derivado a partir de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo, y un marcador seleccionable para permitir el aislamiento de células que contienen vector después de la exposición al vector. Entre los promotores adecuados están aquellos derivados a partir de los genes que codifican enzimas glicolíticas tales como la kinasa de 3-fosfoglicerato ("PGK"), el factor-a, la fosfatasa ácida, y las proteínas de choque térmico, entre otros. Los marcadores seleccionables incluyen el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención mediante eucariontes superiores puede ser incrementada insertando una secuencia potenciadota dentro del vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan como cis, normalmente entre aproximadamente 10 y 300 bp que actúan para incrementar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula hospedante dado. Ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador SV40, que está localizado en lado posterior del origen de replicación en el bp 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en lado posterior del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

Los polinucleótidos de la invención, que codifican la secuencia estructural heteróloga de un polipéptido de la invención generalmente serán insertados dentro del vector usando técnicas estándar de tal modo que está unido operativamente al promotor para la expresión. El polinucleótido se posicionará de tal modo que la posición de inicio de la transcripción está localizada apropiadamente 5' con respecto a una posición de unión de ribosoma. La posición de unión de ribosoma será 5' con respecto al AUG que inicia la traducción del polipéptido a expresar. Generalmente, no habrá otras estructuras de lectura abiertas que empiecen con un codón de iniciación, usualmente AUG, y que yazcan ente la posición de unión de ribosoma y el AUG de inicio. También, generalmente, habrá un codón de interrupción de la traducción al final del polipéptido y habrá una señal de poliadenilación y una señal de terminación de la transcripción apropiadamente dispuesta en el extremo 3' de la región transcrita.

Para la secreción de la proteína traducida dentro del lúmen del retículo endoplasmático, dentro del espacio periplásmico o dentro del entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas dentro del polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas. De este modo, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede ser añadida al extremo N del polipéptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula hospedante, durante la purificación o durante la posterior manipulación y almacenamiento. La región también puede ser añadida al polipéptido para facilitar la purificación. Dichas regiones pueden ser eliminadas antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos péptido a los polipéptidos para dar lugar a la secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otras cosas, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica.

Los hospedantes procariontes adecuados para la propagación, el mantenimiento o la expresión de polinucleótidos y de polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis y Salmonella typhimurium. Varias especies de Pseudomonas, Streptomyces, y estafilococos son hospedantes adecuados en este sentido. Además, en este sentido también pueden emplearse muchos otros hospedantes conocidos por aquellos con conocimientos.

Como ejemplo representativo, pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen de replicación bacteriano derivado a partir de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos génicos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Bistec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "cadena principal" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a expresar.

Después de la transformación de una cepa hospedante adecuada y del crecimiento de la cepa hospedante hasta una densidad celular apropiada, en la que el promotor seleccionado que es inducible es inducido mediante los medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o exposición a inductor químico) y las células son cultivadas durante un periodo adicional. Típicamente, las células son cosechadas a continuación mediante centrifugación, desbaratadas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante es retenido para una mayor purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser desbaratadas por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disrupción mecánica, o el uso de agentes de rotura, dichos métodos son bien conocidos por aquellos con conocimientos en la técnica.

Asimismo, pueden ser empleados para la expresión varios sistemas de cultivo de células de mamífero. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas en Gluzman y col., Cell, 23: 175 (1981). Otras líneas de células capaces de expresar un vector compatible incluyen por ejemplo, las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa, de riñón humano 293 y BHK.

Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador apropiado, y también cualquier posición necesaria de unión de ribosomas, de poliadenilación, posiciones dadoras y aceptoras de montaje, secuencias transcripcionales de terminación, y secuencias 5' de flanqueo no transcritas que son necesarias para la expresión. En determinadas realizaciones preferidas en este sentido, las secuencias de ADN derivadas a partir de posiciones de montaje SV40, y las posiciones de poliadenilación SV40 son usadas para elementos génicos no transcritos requeridos de estos tipos.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o de etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación. Para replegar la proteína se pueden emplear técnicas bien conocidas para regenerar la conformación activa si el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de forma natural, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedante procarionte o eucarionte, incluyendo, por ejemplo, células de bacteria, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo inicial de metionina modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedante.

Los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención pueden ser usados de acuerdo con la presente invención para una variedad de aplicaciones, particularmente para aquellas que hacen uso de las propiedades químicas y biológicas del TNF delta y del TNF epsilon. Entre éstas están las aplicaciones en apoptosis de líneas de células transformadas, la mediación de la activación y la proliferación celular y los mediadores primarios de susceptibilidad a patógenos de respuesta inmune de regulación antimicrobial, antivírica y antiinflamatoria. Aplicaciones adicionales se refieren a la diagnosis y al tratamiento de desórdenes celulares, de tejidos y de organismos. Estos aspectos de la invención son ilustrados en mayor profundidad mediante la siguiente discusión.

Esta invención también está relacionada con el uso de los polinucleótidos de la presente invención para detectar polinucleótidos complementarios tales como, por ejemplo, un reactivo de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polipéptido de la presente invención asociada con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadir o definir una diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad que es el resultado de una subexpresión o de una sobreexpresión o de una expresión alterada del polipéptido de la presente invención, tal como, por ejemplo, neoplasia tal como tumores.

Los individuos que portan mutaciones en un gen de la presente invención pueden ser detectados a nivel de ADN mediante una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para la diagnosis pueden ser obtenidos a partir de células de pacientes, tal como a partir de sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de autopsia. El ADN genómico puede ser usado directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente usando PCR antes del análisis. PCR (Saiki y col., Nature, 324: 163-166, 1986). También se puede usar ARN o cADN del mismo modo. Como ejemplo, los prímeros de PCR complementarios al ácido nucleico que codifican TNF delta o TNF epsilon pueden ser usados para identificar y analizar expresiones y mutaciones de TNF delta y de TNF epsilon. Por ejemplo, las eliminaciones y las inserciones pueden ser detectadas mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas hibridando ADN amplificado con ARN de TNF delta o de TNF epsilon radiomarcado o, alternativamente, con secuencias de ADN antisentido de TNF delta o de TNF epsilon radiomarcado. Se pueden distinguir secuencias perfectamente igualadas a partir de duplicados no igualados mediante digestión de ARNasa o por diferencias en las temperaturas de fusión.

Las diferencias de secuencia entre un gen de referencia y los genes que tienen mutaciones también pueden revelarse mediante secuenciamiento directo de ADN. Además, los segmentos de ADN clonado pueden emplearse como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de dichos métodos puede ser potenciada enormemente mediante el uso apropiado de PCR o de otro método de amplificación. Por ejemplo, se usa un primero de secuenciamiento sin producto PCR de doble cadena o una molécula molde de cadena sencilla generada por un PCR modificado. La determinación de la secuencia se lleva a cabo mediante procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciamiento automáticos con etiquetas fluorescentes.

Las pruebas génicas basadas en las diferencias en la secuencia de ADN pueden ser realizadas por detección de la alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes. Pequeñas eliminaciones e inserciones de secuencia pueden ser visualizadas mediante electroforesis de gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden distinguirse con los geles desnaturalizantes de gradiente de formamida en los que las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN son retardadas en el gel a diferentes posiciones de acuerdo con su temperatura de fusión o su temperatura de fusión parcial específicas (véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242, 1985).

Los cambios en la secuencia en localizaciones específicas también pueden ser revelados mediante ensayos de protección de nucleasa, tal como protección de Rnasa y S1 o el método de ruptura química (por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 85: 4397-4401, 1985). De este modo, la detección de una secuencia específica de AND puede realizarse por métodos tales como la hibridación, la protección de RNasa, la ruptura química, el secuenciamiento directo de ADN o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, polimorfismos de longitud de fragmento de restricción ("RFLP", del inglés "restriction fragment length polymorphisms") y el análisis de Southern blot de ADN genómico). Además de más secuenciamientos de ADN y de electroforesis de gel, las mutaciones también pueden ser detectadas mediante análisis in situ.

Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está específicamente dirigida a y puede hibridarse con una localización particular de un cromosoma humano individual. Además, existe una necesidad actual por identificar posiciones particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos de marcado de cromosomas basados en los datos de la secuencia real (repiten polimorfismos) están disponibles actualmente para marcar la localización cromosomal. El mapeo de ADNs a cromosomas de acuerdo con la presente invención es un primer paso importante en la correlación de esas secuencias con los genes asociados con la enfermedad.

En determinadas realizaciones preferidas en este sentido, el cADN descrito aquí es usado para clonar ADN genómico de un gen de la presente invención. Esto puede llevarse a cabo usando una variedad de técnicas y bibliografías bien conocidas, que generalmente están disponibles comercialmente. El ADN genómico es usado para el mapeo in situ de cromosomas usando técnicas bien conocidas para este propósito. Típicamente, de acuerdo con los procedimientos rutinarios para el mapeo de cromosomas, puede ser necesario algo de prueba y error para identificar una sonda genómica que proporcione una buena señal de hibridización in situ.

En algunos casos, además, las secuencias pueden ser mapeadas a cromosomas preparando prímeros PCR (preferiblemente de 15 a 25 bp) a partir de cADN. El análisis por ordenador de la región 3' sin traducir del gen es usado para seleccionar de forma rápida prímeros que no se extienden más de un exón en el ADN genómico, complicando de este modo el proceso de amplificación. Estos prímeros son usados a continuación para la monitorización PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente al primero darán lugar a un fragmento amplificado.

El mapeo PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos prímeros de oligonucleótidos, la sublocalización puede realizarse con paneles de fragmentos a partir de cromosomas específicos o de conjuntos de clones genómicos grandes de un modo análogo. Otras estrategias de mapeado que pueden ser usadas de forma similar para mapear a su cromosoma incluyen la hibridación in situ, la premonitorización con cromosomas clasificados por flujo marcados y la preselección mediante hibridación para construir librerías de cADN específicas de cromosomas.

La hibridación in situ de fluorescencia (FISH, del inglés "fluorescente in situ hybridization") de un clon de cADN con una extensión cromosomal de metafase puede usarse para proporcionar una localización cromosomal precisa en una etapa. Esta técnica puede ser usada con un cADN tan corto como 50 ó 60. Para una revisión de esta técnica, véase Verma y col., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).

Una vez que una secuencia ha sido mapeada a una localización cromosomal precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede ser correlacionada con los datos del mapa génico. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a través de la Universidad Johns Hopkins, Welch Medical Library. La realización entre los genes y las enfermedades que pueden ser mapeadas a la misma región cromosomal son identificados a continuación a través de análisis de conexión (co-herencia de genes físicamente adyacentes).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en el cADN o en la secuencia genómica entre los individuos afectados y los no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal, entonces la mutación probablemente sea el agente causante de la enfermedad.

Con la actual resolución del mapeo físico y de las técnicas de mapeo génico, un cADN localizado con precisión en una región cromosomal asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Esto asume resolución de mapeado de 1 megabase y un gen por 20 kb).

La presente invención también se refiere a un ensayo de diagnóstico tal como un ensayo de diagnóstico cuantitativo para detectar niveles de una proteína en la presente invención en células y tejidos, incluyendo la determinación de niveles normales y anormales. De este modo, por ejemplo, un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión de proteína de TNF de la presente invención comparado con las muestras de tejido normales de control puede ser usado para detectar la presencia de neoplasia, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden ser usadas para determinar niveles de una proteína, tal como una proteína de la presente invención, en una muestra derivada a partir de un hospedante son bien conocidas para aquellos con conocimientos en la técnica. Dichos métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de Western Blot y ensayos ELISA. Entre éstos el ELISA es frecuentemente el preferido. Un ensayo ELISA inicialmente comprende la preparación de un anticuerpo específico a una proteína de la presente invención, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, generalmente se prepara un anticuerpo de informe que se une a un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo de informe es unido a un reactivo detectable tal como un reactivo radioactivo, fluorescente o enzimático, que en este ejemplo es la enzima peroxidasa de rábano picante.

Para llevar a cabo un ensayo ELISA se retira una muestra de un hospedante y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, un plato de poliestireno, que se une a las proteínas en la muestra. Cualquier posición de unión de proteínas libre sobre el plato es recubierta a continuación por incubación con una proteína no específica tal como albúmina de suero bovino. A continuación, el anticuerpo monoclonal es incubado en el plato, tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales se unen a cualquier proteína de la presente invención unida al plato de poliestireno. Los anticuerpos monoclonales no unidos son eliminados por lavado con un tampón. El anticuerpo de informe unido a la peroxidasa de rábano picante es colocado en el plato, dando como resultado la unión de un anticuerpo de informe a cualquier anticuerpo monoclonal unido a una proteína de la presente invención. A continuación, el anticuerpo de informe sin unir es eliminado por lavado. Los reactivos para la actividad de la peroxidasa, que incluyen un sustrato colorimétrico, son añadidos a continuación al plato. La peroxidasa inmovilizada, unida a la proteína de la presente invención a través de anticuerpos primarios y secundarios, produce un producto de reacción coloreado. La cantidad de color desarrollado en un periodo de tiempo dado indica la cantidad de proteína de la presente invención presente en la muestra. Los resultados cuantitativos son obtenidos típicamente por referencia con una curva estándar.

Se puede emplear un ensayo competitivo en el que los anticuerpos específicos a la proteína de la presente invención unida a un soporte sólido y a la proteína etiquetada de la presente invención, y una muestra derivada a partir de un hospedante son pasados sobre un soporte sólido y la cantidad de etiqueta detectada unida al soporte sólido puede ser correlacionada con una cantidad de proteína de la presente invención en la muestra.

Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos suyos, o células que los expresan, pueden ser usados como un inmunogen para producir anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una librería de expresión Fab. Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente invención pueden ser obtenidos por inyección directa de los polipéptidos en un animal o por administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá a continuación a los polipéptidos por sí solo. De este modo, incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento de los polipéptidos puede ser usada para generar anticuerpos que se unen a todos los polipéptidos nativos. Dichos anticuerpos pueden ser usados a continuación para aislar el polipéptido de un tejido que expresa ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas de células. Ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C., Nature, 256: 495-497 (1975), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula-B humana (Kozbor y col., Immunology Today, 4: 72 (1983) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., pag. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc. (1985)).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. nº 4.946.778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena sencilla para los productos de polipéptidos inmunogénicos de esta invención. Asimismo, se puede usar ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados para los productos de polipéptidos inmunogénicos de esta invención.

Los anticuerpos anteriormente descritos pueden ser empleados para aislar o para identificar clones que expresan el polipéptido o para purificar el polipéptido de la presente invención mediante la unión del anticuerpo a un soporte sólido para el aislamiento y/o la purificación por cromatografía de afinidad.

De este modo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados para inhibir la neoplasia, tal como el crecimiento de células tumorales. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser responsables de la destrucción del tumor a través de la apoptosis y de la citotoxicidad a determinadas células. Los polipéptidos de la presente invención también inducen la regulación al alza de células de adhesión, por ejemplo, LFA-1, por tanto, pueden ser empleados para la curación de heridas. Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser empleados para tratar enfermedades que requieren actividad de promoción de crecimiento, por ejemplo, restenosis, puesto que los polipéptidos de la presente invención tienen efectos de proliferación sobre las células de origen endotelial. Los polipéptidos de la presente invención pueden, por lo tanto, ser empleados también para regular la hematopoyesis en el desarrollo de células endoteliales.

Los polipéptidos de la presente invención también estimulan la activación de células T, y pueden, por lo tanto, ser empleados para estimular una respuesta inmune contra una variedad de infecciones parasitarias, bacterianas y víricas. Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser empleados en este sentido para eliminar células T autoreactivas para tratar y/o prevenir enfermedades autoinmunes. Un ejemplo de enfermedad autoinmune es la diabetes de Tipo I.

Esta invención también proporciona un método para la identificación de moléculas, tales como moléculas receptoras, que se unen a las proteínas de la presente invención. Los genes que codifican proteínas que se unen a las proteínas de la presente invención, tales como proteínas receptoras, pueden ser identificados mediante numerosos métodos conocidos por aquellos con conocimientos en la técnica, por ejemplo, "panning" de ligandos y clasificación FACS. Dichos métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio tales como, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991).

Por ejemplo, para este propósito se puede emplear la clonación de la expresión. Con este fin se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula que responde a las proteínas de la presente invención, se crea una librería de cADN a partir de este ARN, se divide la librería en conjuntos y los conjuntos son transfectados individualmente en células que no responden a las proteínas de la presente invención. Las células transfectadas son expuestas a continuación a las proteínas marcadas de la presente invención. Las proteínas de la presente invención pueden ser marcadas por una variedad de técnicas bien conocidas que incluyen métodos estándar de radio-ionización o de inclusión de una posición de reconocimiento para una kinasa de proteína específica de la posición. Después de la exposición, las células son fijadas y se determina la unión a citostatina. Estos procedimientos son llevados a cabo convenientemente en láminas de vidrio.

Los conjuntos son identificados por cADN que produjo células de unión de TNF delta o de TNF epsilon. Se preparan subconjuntos a partir de estos positivos, se transfectan dentro de células hospedantes y se monitorizan como se ha descrito anteriormente. Usando un proceso iterativo de subdivisión y de remonitorización, se pueden aislar uno o más clones sencillos que codifican la molécula de unión putativa, tal como una molécula receptor.

Alternativamente, un ligando marcado puede ser unido por fotoafinidad a un extracto de célula, tal como una membrana o un extracto de membrana, preparado a partir de células que expresan una molécula a la que se une, tal como una molécula receptor. El material reticulado es resuelto mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE, del inglés "Polyacrylamide Gel Electrophoresis") y es expuesto a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el ligando-receptor puede ser escindido, resuelto en fragmentos de péptidos, y sometido a microsecuenciamiento de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir del microsecuenciamiento puede ser usada para diseñar sondas de oligonucleótidos únicas o degeneradas para monitorizar librerías de cADN para identificar genes que codifican la molécula receptora putativa.

Los polipéptidos de la invención también pueden ser usados para establecer la capacidad de unión de TNF delta y de TNF epsilon de las moléculas de unión de TNF delta y de TNF epsilon, tales como moléculas receptoras, en células o en preparaciones libres de células.

La invención también proporciona un método para monitorizar compuestos para identificar aquellos que potencian o bloquean la acción del TNF delta o del TNF epsilon en las células, tal como su interacción con moléculas de unión de TNF delta o de TNF epsilon tales como moléculas receptoras. Un agonista es un compuesto que incrementa las funciones biológicas naturales de los polipéptidos de la presente invención o que funciona de una forma similar a los polipéptidos de la presente invención, mientras que los antagonistas disminuyen o eliminan dichas funciones.

Por ejemplo, un departamento celular, tal como una membrana o una preparación suya, tal como una preparación de membrana, puede ser preparado a partir de una célula que expresa una molécula que se une a TNF delta o a TNF epsilon, tal como una molécula de una ruta reguladora o de señalización modulada por TNF delta o por TNF epsilon. La preparación es incubada con TNF delta o con TNF epsilon marcados en ausencia o en presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de TNF delta o de TNF epsilon. La capacidad de la molécula candidata para unirse a la molécula de unión se ve reflejada en la unión disminuida del ligando marcado. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del TNF delta o del TNF epsilon en la unión de molécula de unión de TNF delta o de TNF epsilon, lo más probable es que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y que provocan efectos que son los mismos o están íntimamente relacionados con los de TNF delta o los de TNF epsilon son agonistas.

Los efectos similares a los de TNF delta o a los de TNF epsilon de agonistas y antagonistas potenciales pueden medirse, por ejemplo, determinando la actividad de un segundo sistema mensajero después de la interacción de la molécula candidata con una célula o con una preparación celular apropiada, y comparando el efecto con el del TNF delta o el del TNF epsilon o con el de moléculas que provocan los mismos efectos que el TNF delta o el TNF epsilon. Los sistemas mensajeros secundarios que pueden ser útiles en este sentido incluyen pero no se limitan a los sistemas mensajeros secundarios de la guanilato ciclasa AMP, del canal de iones o de la hidrólisis de fosfoinositida.

Otro ejemplo de un ensayo para antagonistas de TNF delta o de TNF epsilon es un ensayo competitivo que combina el TNF delta o el TNF epsilon y un antagonista potencial con moléculas receptoras de TNF delta o de TNF epsilon unidas a membrana o con moléculas receptoras de TNF delta o de TNF epsilon recombinantes en las condiciones apropiadas para un ensayo competitivo de inhibición. El TNF delta o el TNF epsilon pueden ser marcados, tal como con radioactividad, de tal forma que el número de moléculas de TNF delta o de TNF epsilon unidas a una molécula receptora puede ser determinado con precisión para establecer la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención y que con ello inhiben o extinguen su actividad. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína íntimamente relacionada o un anticuerpo que se une a las mismas posiciones sobre una molécula de unión, tal como una molécula receptora, sin inducir actividades inducidas por TNF delta o por TNF epsilon, evitando con ello la acción de un polipéptido de la presente invención impidiéndole la unión a su receptor.

Otro antagonista potencial es una forma soluble del receptor de TNF delta o de TNF epsilon que se une a TNF delta o a TNF epsilon y evita que interaccione con receptores de TNF delta o de TNF epsilon unidos a membrana. De este modo, los receptores no son estimulados por su ligando.

Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se une y ocupa la posición de unión del polipéptido, evitando con ello la unión a moléculas de unión celular, tales como moléculas receptoras, de tal forma que la actividad biológica normal es evitada. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a antagonistas de moléculas orgánicas pequeñas, peptídicos o no peptídicos.

Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido. La tecnología antisentido puede ser usada para controlar la expresión génica a través de ADN o ARN antisentido o a través de la formación de triple hélice. Las técnicas antisentido son discutidas, por ejemplo, en Okano, J., Neurochem., 56: 560, 1991; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fl (1988). La formación de la hélice triple es discutida en, por ejemplo, Lee y col., Nuclei Acids Research, 6: 3073 (1979); Cooney y col., Science, 241: 456 (1988); y Dervan y col., Science, 251: 1360 (1991). Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN o a un ARN complementario. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la presente invención puede ser usada para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de entre aproximadamente 10 y 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN es diseñado para ser complementario a una región del gen involucrado en la transcripción evitando con ello la transcripción y la producción de TNF delta o de TNF epsilon. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN en el polipéptido de TNF delta o de TNF epsilon. Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden ser entregados a las células de tal forma que el ARN o el ADN antisentido pueden ser expresados in vivo para inhibir la producción de un polipéptido de la presente invención.

Los antagonistas pueden ser empleados en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como el descrito aquí.

Los antagonistas pueden ser empleados por ejemplo para tratar la caquexia que es un defecto de clarificado de lípidos que es el resultado de una deficiencia sistémica de la lipoproteína lipasa, que es suprimida por el TNF delta o por el TNF epsilon. Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar la malaria cerebral en la que los polipéptidos de la presente invención parecen jugar un papel patogénico. Los antagonistas también pueden ser empleados para tratar la artritis reumatoide inhibiendo la producción de citoquinas inflamatorias inducida por el TNF delta o por el TNF epsilon, tales como las IL1 en las células sinoviales. Cuando se trata la artritis, los polipéptidos de la presente invención son preferiblemente inyectados intraarticularmente.

Los antagonistas también pueden ser empleados para evitar el rechazo injerto- hospedante evitando la estimulación del sistema inmune en presencia de un injerto.

Los antagonistas también pueden ser empleados para inhibir la reabsorción ósea y, por lo tanto, para tratar y/o prevenir la osteoporosis.

Los antagonistas también pueden ser empleados como agentes antiinflamatorios, y para tratar el choque endotóxico. Esta crítica condición es el resultado de una respuesta exagerada a infecciones bacterianas o de otro tipo.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden el polinucleótido o los polipéptidos discutidos anteriormente o los agonistas o antagonistas. De este modo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados en combinación con un vehículo o vehículos esterilizados o no esterilizados para su uso en células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, disolución salina, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de ellos. La formulación debería ajustarse al modo de administración.

La invención además se refiere a conjuntos y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las anteriormente comentadas composiciones de la invención. Asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta del producto para la administración a humanos.

Los polipéptidos y otros compuestos de la presente invención pueden emplearse solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en cualquier modo efectivo y conveniente, incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradermal, entre otras.

Las composiciones farmacéuticas generalmente son administradas en una cantidad efectiva para el tratamiento o la profilaxis de una indicación o indicaciones específicas. En general, las composiciones son administradas en una cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de masa corporal. En la mayoría de los casos serán administradas en una cantidad no en exceso de aproximadamente 8 mg/kg de masa corporal por día. Preferiblemente, en la mayoría de los casos, la dosis es desde aproximadamente 10 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de masa corporal, diariamente. Se apreciará que la dosificación óptima será determinada por métodos estándar para cada modalidad e indicación de tratamiento, teniendo en cuenta la indicación, su gravedad, la vía de administración, las condiciones de complicaciones y otros parecidos.

Los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas que son polipéptidos de esta invención pueden ser empleados de acuerdo con la presente invención mediante la expresión de dichos polipéptidos in vivo, en modalidades de tratamiento que a menudo son referidas como "terapia génica".

De este modo, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser diseñadas con un polinucleótido, tal como un ADN o un ARN, que codifica un polipéptido ex vivo, y a continuación las células diseñadas pueden ser proporcionadas a un paciente a tratar con el polipéptido. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas ex vivo mediante el uso de un vector plásmido retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente invención. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica y su uso en la presente invención será evidente a partir de las enseñanzas aquí presentadas.

De forma similar, las células pueden ser diseñadas in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede ser diseñado para la expresión en un vector retroviral de replicación defectuosa, como se ha discutido anteriormente. A continuación, el constructo de la expresión retroviral puede ser aislado e introducido en una célula de empaquetamiento, transducido con un vector plásmido retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente invención de tal modo que la célula de empaquetamiento produce ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden ser administradas a un paciente para diseñar las células in vivo y para la expresión del polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención mediante dicho método deberían ser evidentes para aquellos con conocimientos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención.

Los retrovirus a partir de los cuales pueden derivarse los vectores plasmidos mencionados aquí anteriormente incluyen, pero no se limitan a, el virus de la Leucemia Murina de Moloney, el virus de necrosis de bazo, retrovirus tales como el virus de Sarcoma de Rous, el virus de Sarcoma de Harvey, el virus de leucosis de ave, el virus de leucemia de gibón, el virus de inmunodeficiencia humano, el adenovirus, el virus de Sarcoma Mieloproliferativo, y virus tumorales de mamíferos. En una realización, el vector plásmido retroviral es derivado a partir del virus de Leucemia Murina de Molones.

Dichos vectores incluirán uno o más promotores para expresar el polipéptido. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, el LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor del citomegalovirus humano (CMV) descrito en Millar y col., Biotechniques, 7: 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, los promotores celulares tales como los promotores celulares eucariontes que incluyen, pero no se limitan a, la histona, la polimerasa de ARN III, y promotores de \beta-actina). Otros promotores virales que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina kinasa (TK), y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para aquellos con conocimientos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas aquí.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención será colocada bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovíricos, tales como el promotor adenovírico tardío principal; o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus respiratorio sincitial (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de metalotioneina; los promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor Apoya; los promotores de globina humana; los promotores de timidina kinasa víricos, tales como el promotor de timidina kinasa de Herpes Simple; los LTRs retrovirales (que incluyen los LTRs retrovirales modificados anteriormente descritos aquí); el promotor de \beta-actina; y los promotores de hormona humana del crecimiento. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido.

El vector plásmido retrovírico es empleado para transducir líneas de células de empaquetamiento para formar líneas de células productoras. Ejemplos de células de empaquetamiento que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas de células PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCRIP, GP+E-86, GP-envAm12, y DAN, como se describe en Millar, A., Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990). El vector puede ser transducido en células de empaquetamiento a través de cualquier medio conocido en la técnica. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación de CaPO_{4}. En una alternativa, el vector plásmido retrovírico puede ser encapsulado dentro de un liposoma, o puede ser acoplado a un lípido, y a continuación ser administrado a un hospedante.

La línea de células productoras generarán partículas de vector retrovírico infeccioso, que incluyen la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Dichas partículas de vector retrovírico pueden ser empleadas a continuación para transducir células eucariontes, tanto in vitro como in vivo. Las células eucariontes transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican el polipéptido. Las células eucariontes que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a, células de tallo embriónico, a células de carcinoma embriónico, así como células de tallo hematopoyético, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales.

La presente invención se describe más en detalle mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan meramente para ilustrar la invención mediante referencia a realizaciones específicas. Estas ejemplificaciones, aunque ilustran determinados aspectos específicos de la invención, no retratan las limitaciones ni circunscriben el alcance de la invención descrita.

Todos los ejemplos fueron llevados a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para aquellos con conocimientos en la técnica, excepto donde se describe en detalle otra cosa. Las técnicas de biología molecular rutinarias de los siguientes ejemplos pueden ser llevadas a cabo como se describe en los manuales estándar de laboratorio, tales como Sambrook y col., Moolecular Cloning: A Laborator Manual, 2ª Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), aquí referido como "Sambrook".

Todas las partes o cantidades establecidas en los siguientes ejemplos están en peso, a no ser que se indique lo contrario. A menos que se establezca otra cosa, la separación por tamaño de los fragmentos en los ejemplos siguientes fue llevada a cabo usando técnicas estándar de electroforesis de gel de poliacrilamida y de agarosa ("PAGE") de Sambrook y de otras numerosas referencias tales como, por ejemplo, Goeddel y col., Nuclei Acid Res., 8: 4057 (1980). A no ser que se describa lo contrario, las ligaciones fueron llevadas a cabo usando tampones, temperaturas y tiempos de incubación estándar, cantidades aproximadamente equimolares de fragmentos de ADN a ser ligados y aproximadamente 10 unidades de ligasa de ADN T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de ADN.

Ejemplo 1 Expresión y purificación de la forma soluble del TNF \delta y del TNF \epsilon humanos usando bacterias

La secuencia de ADN que codifica el TNF delta o el TNF epsilon humanos en los polinucleótidos depositados fue amplificada usando prímeros de oligonucleótidos PCR específicos para la secuencia de aminoácidos terminada en carboxilo de la proteína de TNF delta o de TNF epsilon humanos y a las secuencias vector 3' con respecto al gen. Se añadieron nucleótidos adicionales que contienen posiciones de restricción para facilitar la clonación a las secuencias 5' y 3' respectivamente.

El primero de oligonucleótido 5' tenía la secuencia 5' GCG GGA TCC CAG AGC CTC ACC ACA G 3' que contiene la posición de restricción subrayada, seguida por 16 nucleótidos de la secuencia de codificación establecida en las Figuras que empiezan con la base número 115 del codón ATG.

El primero 3' tiene la secuencia 5' CGC AAG CTT ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC 3' contiene la posición de restricción subrayada Hindi seguida por 20 nucleótidos complementarios a los 13 últimos nucleótidos de la secuencia de codificación establecida en las Figuras 1 y 2, que incluyen el codón de parada.

Las posiciones de restricción eran convenientes a las posiciones de enzimas de restricción en los vectores de expresión bacterianos pQE-9, que fueron usados para la expresión bacteriana en estos ejemplos. (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA). El pQE-9 codifica resistencia antibiótica a ampicilina ("Amp") y contiene un origen de replicación bacteriano ("ori"), un promotor inducible IPTG, una posición de unión de ribosomas ("RBS"), una etiqueta 6-His y posiciones de enzima de restricción.

El ADN amplificado de TNF delta humano y el vector pQE-9 fueron ambos digeridos con BamHI y con Hindi y los ADNs digeridos fueron entonces ligados juntos. La inserción del ADN del TNF delta en el vector restringido pQE-9 colocó la región codificadora del TNF delta por debajo de y operativamente unido al promotor inducible IPTG del vector y en línea con un AUG iniciador apropiadamente posicionado para la traducción del TNF delta.

La mezcla de ligación fue transformada en células competentes de E. coli usando procedimientos estándar. Dichos procedimientos son descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). La cepa de E. coli M15/rep4, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y que confiere resistencia a la kanamicina ("Kan"), fue usada para llevar a cabo el ejemplo ilustrativo descrito aquí. Esta cepa, que sólo es una de las muchas cepas adecuadas para expresar TNF delta, está disponible comercialmente en Qiagen. Los transformantes fueron identificados por su capacidad para crecer sobre placas LB en presencia de ampicilina. El ADN de plásmido fue aislado a partir de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado fue confirmada mediante análisis de restricción.

Los clones que contienen los constructos deseados fueron cultivados a lo largo de la noche ("O/N") en un cultivo líquido en un medio LB suplementado tanto con ampicilina (100 \mug/ml) como con kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo O/N fue usado para inocular un cultivo grande, en una dilución de aproximadamente 1:100 a 1:250. Las células fueron cultivadas hasta una densidad óptica de 600 nm ("OD_{600}") de entre 0,4 y 0,6. A continuación se añadió isopropil-B-D-tiogalactopiranoside ("IPTG") hasta una concentración final 1 mM para inducir la transcripción a partir de promotores sensibles represores lac, desactivando el represor lacI. Posteriormente, las células fueron incubadas durante otras 3 o 4 horas. A continuación, las células fueron cosechadas por centrifugación e desbaratadas, por métodos estándar. Los cuerpos de inclusión fueron purificados a partir de células desbaratadas usando técnicas de recolección rutinarias, y la proteína fue solubilizada a partir de los cuerpos de inclusión en urea 8M. Se hizo pasar la disolución de urea 8M que contiene la proteína solubilizada sobre una columna PD-10 en una disolución salina tamponada de fosfato ("PBS") 2X, eliminando con ello la urea, intercambiando el tampón y replegando la proteína. La proteína fue purificada mediante una etapa adicional de cromatografía para eliminar la endotoxina. A continuación, fue filtrada y esterilizada. La preparación de proteína filtrada y esterilizada fue almacenada en PBS 2X a una concentración de 95 microgramos por ml.

El análisis de la preparación de TNF delta mediante métodos estándar de electroforesis de gel de poliacrilamida reveló que la preparación contenía aproximadamente un 80% de monómero que tiene el peso molecular esperado de, aproximadamente, 20,8 kDa.

La proteína es purificada mediante cromatografía sobre una columna de níquel-quelato bajo condiciones que permiten la unión tipo de proteínas que contienen la etiqueta 6-HIS. La proteína es eluida de la columna en HCl guanidina 6 molar a pH 5,0 y renaturalizada.

Ejemplo 2 Clonación y expresión de TNF \delta y TNF \epsilon humanos solubles en un sistema de expresión de baculovirus

La secuencia de cADN que codifica la proteína de longitud completa de TNF delta o de TNF epsilon humanos, en el clon depositado es amplificada usando prímeros de oligonucleótidos PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen:

El primero 5' tiene la secuencia 5' GCG GGA TCC CCA GAG CCT CAC CAC AG 3' que contiene la posición de enzima de restricción BamHI subrayada seguida de 16 bases de la secuencia del TNF delta o del TNF epsilon de las Figuras 1 y 2. Insertado en un vector de expresión, como se describe más adelante, el extremo 5' del fragmento amplificado que codifica el TNF delta o el TNF epsilon humanos proporciona un péptido señal eficaz. Una señal eficaz para la iniciación de la traducción en células eucariontes, como se describe en Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987) es apropiadamente localizada en la porción del vector del constructo.

El primero 3' tiene la secuencia 5' CGC TCT AGA ACA ATC ACA GTT TCA CAA AC 3' que contiene la posición de restricción XbaI subrayada seguida de nucleótidos complementarios a los últimos 13 nucleótidos de la secuencia codificadora de TNF delta o de TNF epsilon establecida en las Figuras 1 y 2, incluyendo el codón de parada.

El fragmento amplificado es aislado a partir de gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible ("Geneclean", BIO I01 Inc., La Jolla, CA). El fragmento es digerido a continuación con BamHI y Asp718 y es purificado de nuevo sobre gel de agarosa al 1%. Este fragmento se denomina aquí F2.

El vector pA2GP es usado para expresar la proteína del TNF delta o del TNF epsilon en un sistema de expresión del baculovirus, usando métodos estándar, tales como aquellos descritos en Summers y col., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin nº 1555 (1987). Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por las posiciones de restricción convenientes. El péptido señal de AcMNPV gp67, que incluye la metionina N-terminal, está localizado justo por encima de la posición BamHl. La posición de poliadenilación del virus de simio 40 ("SV40") es usada para una poliadenilación eficaz. Para una selección sencilla del virus recombinante se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli en la misma orientación que el promotor de polihedrina y es seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas a ambos lados por las secuencias víricas para la recombinación homóloga mediada por células con el ADN vírico natural para generar virus viable que exprese el polinucleótido clonado.

Podrían usarse muchos otros vectores de baculovirus en lugar del pA2-GP, tal como el pAc373, el pVL941 y el pAcIMI puesto que, como aquellos con conocimientos apreciarán fácilmente, la construcción proporciona señales apropiadamente localizadas para la transcripción, la traducción, el tráfico y otras parecidas, tal como un AUG en línea y un péptido señal, según se requiera. Dichos vectores son descritos en Luckow y col., Virology, 170:31-39, entre otros.

El plásmido es digerido con las enzimas de restricción BamHI y XbaI y a continuación es desfosforilado usando fosfatasa intestinal de ternero, usando procedimientos rutinarios conocidos en la técnica. A continuación, el ADN es aislado a partir de gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible ("Geneclean" BIO I0I Inc., La Jolla, CA). Este ADN vector se denomina aquí "V2".

El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 son ligados juntos con ligasa de ADN T4. Se transforman células de E. coli HB101 con una mezcla de ligación y son extendidas sobre placas de cultivo. Las bacterias son identificadas porque contienen el plásmido con el gen de TNF delta o de TNF epsilon humanos mediante digestión del ADN de colonias individuales usando BamHI y XbaI y, a continuación, analizando el producto de digestión mediante electroforesis de gel. La secuencia del fragmento clonado es confirmada mediante secuenciamiento de ADN. Este plásmido se denomina aquí pBacTNF delta.

Se co-transfectan 5 \mug del plásmido pBacTNF delta con 1,0 \mug de un ADN de baculovirus linealizado disponible comercialmente ("BaculoGold^{TM} baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA), usando el método de lipofección descrito en Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84: 7413-7417 (1987). Se mezclan 1 \mug de BaculoGold^{TM} virus DNA y 5 \mug del plásmido pBacTNF delta en un pocillo esterilizado de una placa microtiter que contiene 50 \mul de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Más tarde, se añaden 10 \mul de Lipofectina más 90 \mul de medio de Grace, se mezclan y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de transfección es añadida gota a gota a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa es agitada atrás y adelante para mezclar la nueva disolución añadida. A continuación, la placa es incubada durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas la disolución de transfección es eliminada de la placa y se añade 1 ml de medio de Grace de insecto suplementado con suero fetal de ternero al 10%. La placa se devuelve al interior de un incubador y se continúa con el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días el sobrenadante es recogido y se realiza un ensayo de placa, como se describe en Summers y Smith, citado anteriormente. Se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir una fácil identificación y aislamiento de los clones que expresan gal, lo que produce placas de color azul. (También se puede encontrar una detallada descripción de un "ensayo de placa" de este tipo en la guía del usuario para cultivo de células de insecto y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, se añade el virus a las células. Después de la incubación apropiada, las placas de color azul son recogidas con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contiene los virus recombinantes es resuspendido a continuación en un tubo Eppendorf que contiene 200 \mul de medio de Grace. El agar es eliminado mediante una breve centrifugación y el sobrenadante que contiene el baculovirus recombinante es usado para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días después, los sobrenadantes de estas placas de cultivo son recogidos y, a continuación, son almacenados a 4ºC. Se identifica un clon que contiene el TNF delta o el TNF epsilon apropiadamente insertados mediante análisis de ADN o de TNF epsilon que incluye mapeado de restricción y secuenciamiento. Esto se denomina aquí V-TNF delta.

Las células Sf9 son cultivadas en un medio de Grace suplementado con un 10% de FBS desactivado térmicamente. Las células son infectadas con el baculovirus recombinante V-TNF delta a una multiplicidad de infección ("MOI") de aproximadamente 2 (de aproximadamente 1 a aproximadamente 3). Seis horas después el medio es eliminado y es sustituido con un medio SF900 menos metionina y cisteína (disponible en Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después, se añaden 5 \muCi de 35S-metionina y 5 \muCi de 35S cisteína (disponible en Amersham). Las células son incubadas durante 16 horas más y, a continuación, son cosechadas por centrifugación, se las somete a lisis y las proteínas marcadas son visualizadas mediante SDS-PAGE y autoradiografía.

Ejemplo 3 Distribución de tejido de la expresión de TNF \delta

El análisis Northern blot fue llevado a cabo para examinar los niveles de expresión de TNF delta en tejidos humanos, usando métodos descritos por, entre otros, Sambrook y col., citados anteriormente. Las muestras de ARN celular totales son aisladas con el sistema RNAzol^{TM} B (Biotecx Laboratorios, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033).

Aproximadamente 10 \mug de ARN Total fue aislado a partir de las muestras de tejido. El ARN fue resuelto en tamaño mediante electroforesis a través de gel de agarosa al 1% bajo condiciones fuertemente desnaturalizantes. El ARN fue extraído del gel sobre un filtro de nylon, y el filtro es preparado a continuación para la hibridación con una sonda de polinucleótido marcado detectable.

Como una sonda para detectar el mARN que codifica el TNF delta, la cadena antisentido de la región de codificación del cADN insertado en el clon depositado fue marcada hasta una actividad específica elevada. El cADN fue marcado mediante extensión de prímero, usando el kit Prime-It, disponible en Stratagene. La reacción se llevó a cabo usando 50 ng del cADN, siguiendo el protocolo estándar de reacción como recomienda el suministrador. El polinucleótido marcado fue purificado y separado de otros componentes marcados de la reacción mediante cromatografía en columna usando una columna Select-G-50, obtenida a partir de 5-Prime-3-Prime, Inc. del 5603 de Arapahoe Road, Boulder, CO 80303.

La sonda marcada fue hibridaza con el filtro, a una concentración de 1.000.000 cpm/ml, en un volumen pequeño de un 7% de SDS, NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,4 a 65ºC, toda la noche.

Después de eso la disolución sonda fue desaguada y el filtro se lava dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5 x SSC, 0,1% SDS. A continuación, el filtro es secado y expuesto a la película a -70ºC durante la noche con una pantalla de intensificación.

La autoradiografía muestra que el mARN para el TNF delta fue detectado en todos los 16 tejidos con mayor expresión en el corazón seguido por la placenta y el riñón.

Ejemplo 4 Expresión terapéutica de genes de TNF \delta y TNF \epsilon humanos

Los fibroblastos son obtenidos a partir del sujeto mediante biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en un medio de cultivo de tejido y es dividido en pequeñas piezas. Se colocan pequeños trozos del tejido sobre la superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejido, aproximadamente se colocan 10 piezas en cada matraz. El matraz es puesto boca arriba y boca abajo, cerrado firmemente y se deja a temperatura ambiente durante toda la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz es invertido (los trozos del tejido permanecen pegados al fondo del matraz) y se añade medio fresco (por ejemplo, medio de Ham F12, con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina). A continuación, el tejido es incubado a 37ºC durante aproximadamente una semana. En ese momento, se añade medio fresco y posteriormente se cambia cada varios días. Después de otras dos semanas en el cultivo, emerge una monocapa de fibroblastos. La monocapa es tripsinizada y escalada en matraces más grandes.

Se digiere un vector para terapia génica con enzimas de restricción para clonar un fragmento que va a ser expresado. El vector digerido es tratado con fosfatasa intestinal de ternero para evitar la autoligación. El vector lineal desfosforilado es fraccionado sobre un gel de agarosa y es purificado.

El cADN capaz de expresar TNF delta o TNF epsilon activos, es aislado. Los extremos del fragmento son modificados, si es necesario, para la clonación dentro del vector. Por ejemplo, el saliente 5' puede ser tratado con polimerasa de ADN para crear extremos despuntados. Los extremos salientes 3' pueden ser eliminados usando nucleasa S1. Los eslabones pueden ser ligados a los extremos despuntados con ligasa de ADN T4.

Se mezclan juntas cantidades iguales de la cadena principal lineal del virus de la leucemia murina de Molones y el fragmento de TNF delta o de TNF epsilon y son unidas usando ligasa de ADN T4. La mezcla de ligación es usada para transformar E. coli y las bacterias son colocadas en placa a continuación sobre kanamicina que contiene agar. El fenotipo de kanamicina y el análisis de restricción confirman que el vector tiene el gen apropiadamente insertado.

Las células de empaquetamiento son cultivadas en un cultivo de tejido hasta densidad confluente en un Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero de ternero (CS), penicilina y estreptomicina. El vector que contiene el gen de TNF delta o de TNF epsilon es introducido dentro de las células de empaquetamiento mediante técnicas estándar. Las partículas víricas infecciosas que contiene el gen de TNF delta o de TNF epsilon son recogidas a partir de las células de empaquetamiento, que ahora se denominan células productoras.

Se añade medio fresco a las células productoras, y después de un periodo de incubación apropiado el medio es recogido de las placas de células productoras confluentes. El medio, que contiene las partículas víricas infecciosas, es filtrado a través de un filtro Millipore para eliminar las células productoras separadas. El medio filtrado es usado a continuación para infectar células fibroblasto. El medio es eliminado de la placa subconfluente de fibroblastos y es rápidamente sustituido por el medio filtrado. Se puede incluir Polybrene (Aldrich) en el medio para facilitar la transducción. Después de una incubación apropiada, el medio es eliminado y sustituido por medio fresco. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos serán infectados y no se requiere selección. Si el título es bajo, entonces es necesario usar un vector retrovírico que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his, para seleccionar células transducidas para la expansión.

A continuación, los fibroblastos diseñados pueden ser inyectados en ratas, tanto solos como después de haber sido cultivados hasta confluencia sobre gotas de microportadores, tales como gotas de cytodex 3. Los fibroblastos inyectados producen producto TNF delta o TNF epsilon, y las acciones biológicas de la proteína son comunicados al hospedante.

Claims (20)

1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en

a) polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida como se muestra en la Figura 1 ó 2;

b) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora como se muestra en la Figura 1 ó 2 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

c) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el cADN contenido en ATCC 97377 o en ATCC 97457;

d) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora del cADN contenido en ATCC 97377 o en ATCC 97457 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

e) polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d), en el que se sustituyen, se eliminan o se añaden de 1 a 5 ó de 5 a 10 aminoácidos, en cualquier combinación;

f) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende un fragmento de al menos 30 o de al menos 50 aminoácidos de longitud de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d) en el que dicho fragmento es capaz de estimular una respuesta inmune;

g) polinucleótidos como se ha definido en (f) que están unidos operativamente a una secuencia reguladora heteróloga;

h) polinucleótidos que son idénticos en al menos un 70% a un polinucleótido como se ha definido en uno cualquiera de los apartados (a) a (d) y que codifica un polipéptido capaz de estimular una respuesta inmune; y

i) polinucleótidos que codifican un polipéptido que es idéntico en al menos un 70% a un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) a (d);

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1 que es ADN o ARN.

3. El ADN de la reivindicación 2 que es ADN genómico.

4. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está fusionado a un polinucleótido heterólogo.

5. Un vector que contiene el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector de la reivindicación 5 en el que el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células hospedantes procariontes o eucariontes.

7. Una célula hospedante diseñada genéticamente con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o con el vector de la reivindicación 5 ó 6.

8. Un proceso para producir un polipéptido capaz de estimular una respuesta inmune que comprende: cultivar la célula hospedante de la reivindicación 7 y recuperar el polipéptido codificado por dicho polinucleótido del cultivo.

9. Un proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido que es capaz de estimular una respuesta inmune que comprende células diseñadas genéticamente con el vector de la reivindicación 5 ó 6.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó que es obtenible mediante el proceso de la reivindicación 8.

11. Un anticuerpo específico para el polipéptido de la reivindicación 10.

12. Una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente con un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Un antagonista/inhibidor del polipéptido de la reivindicación 10, en el que dicho antagonista/inhibidor es un anticuerpo de la reivindicación 11 capaz de inhibir o de extinguir la actividad del polipéptido de la reivindicación 10 ó una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12 capaz de unirse y de inhibir con ello la expresión del polinucleótido o del ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polipéptido de la reivindicación 10 ó un ADN codificador y capaz de expresar dicho polipéptido in vivo o el antagonista/ inhibidor de la reivindicación 13 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12 ó el anticuerpo de la reivindicación 11.

16. El uso del polipéptido de la reivindicación 10 ó del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la neoplasia, para la curación de heridas, para el tratamiento de la restenosis, para regular la hematopoyesis en el desarrollo de células endoteliales, para la estimulación de una respuesta inmune contra infecciones de parásitos, bacterias o virus, o para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes.

17. El uso del antagonista/inhibidor de la reivindicación 13 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la caquexia, de la malaria cerebral, de la artritis reumatoide, para la prevención del rechazo injerto-hospedante, para inhibir la reabsorción ósea, para el tratamiento y/o la prevención de la osteoporosis, o para el tratamiento del choque endotóxico.

18. Un proceso para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una expresión en defecto del polipéptido de la reivindicación 10 que comprende determinar una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

19. Un proceso de diagnóstico que comprende analizar la presencia del polipéptido de la reivindicación 10 en una muestra derivada a partir de un hospedante.

20. Un método para identificar compuestos que se unen a y que inhiben la activación del polipéptido de la reivindicación 10, que comprende:

a) poner en contacto una célula que expresa sobre su superficie un receptor para el polipéptido, estando dicho receptor asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto a dicho receptor, con un TNF delta analíticamente detectable y un compuesto bajo las condiciones que permiten la unión al receptor; y

b) determinar si el compuesto se une a o inhibe el receptor detectando la ausencia de una señal generada a partir de la interacción del TNF delta con el receptor.