FI119191B - Bifunktionaalinen proteiini, valmistus ja käyttö - Google Patents

Bifunktionaalinen proteiini, valmistus ja käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI119191B
FI119191B FI964311A FI964311A FI119191B FI 119191 B FI119191 B FI 119191B FI 964311 A FI964311 A FI 964311A FI 964311 A FI964311 A FI 964311A FI 119191 B FI119191 B FI 119191B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gly
ser
thr
leu
gin
Prior art date
Application number
FI964311A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI964311A (fi
FI964311A0 (fi
Inventor
Bernd Groner
Dirk Moritz
Original Assignee
Bernd Groner
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bernd Groner filed Critical Bernd Groner
Publication of FI964311A publication Critical patent/FI964311A/fi
Publication of FI964311A0 publication Critical patent/FI964311A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119191B publication Critical patent/FI119191B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

. 119191 * 1 BIFUNKTIONAALINEN PROTEIINI, VALMISTUS JA KÄYTTÖ
Keksintö koskee bifunktionaalista proteiinia, joka kykenee ohjaamaan mainittua proteiinia tuottavan isäntäsolun tun-5 nistamaan spesifisesti valikoidut kohdesolut. Edelleen keksintö koskee menetelmää mainitun proteiinin valmistamiseksi, mainittua proteiinia koodaavaa DNA-rakennetta, koostumusta, joka sisältää mainittua DNA:ta ilmentävän isäntäsolun, sekä vasta-aineita, jotka tunnistavat spesi-10 fisesti mainitun proteiinin. Lisäksi keksintö koskee sellaisen isäntäsolun käyttöä, esim. tuhoamaan valikoivasti kasvainsoluja in vitro tai in vivo.
Adoptiivisen immuunihoidon, jota kutsutaan myös soluimmuu-15 nihoidoksi (cellular immunotherapy), periaatteena on ira-munologisesti aktiivisten solujen siirto nisäkkääseen vahvistamaan nisäkkään immuunivastetta sairaustilaa kohtaan. Tätä varten esim. ihmispotilaasta tai muusta kohteesta otetaan imusoluja, viljellään niitä valinnaisesti 20 immuunijärjestelmää voimistavien aineiden, kuten inter- leukiini 2:n, läsnäollessa, minkä jälkeen ne annetaan (uudelleen) potilaalle, tavallisesti immuunijärjestelmää voimistavan aineen läsnäollessa. Potilaassa immunologisesta aktiiviset solut lievittävät sairaustilaa.
25 ·*·· • · , Adoptiiviseen immuunihoitoon soveltuviksi ehdotettuja im- a··* * * munologisesti aktiivisia soluja ovat lymfokiinien aktivoi- • i mat tappajasolut (LAK-solut), jotka ovat peräisin luonnol-.1: lisistä tappajasoluista (NK-soluista), ja in vitro herkis- ,ϊ.: 30 tetyt lymfosyytit (IVS), jotka ovat peräisin sytolyytti- »t» ,ϊ · sistä tai sytotoksisista T-lymfosyyteistä (CTL:-soluista), joita kutsutaan myös tappaja-T-lymfosyyteiksi. LAK-solut : ovat sytolyyttisiä soluja, jotka reagoivat monien erilais- #·· ten kohdesolujen kanssa. Ne eivät ole MHC- (major histo- (')t 35 compatibility complex) -rajoitteisia ja ne kykenevät ha- # · **··] jottamaan kasvainsoluja, mutta myös normaaleja soluja in vitro. CTL-soluilla on klonaalisia erityispiirteitä, so.
j#:’: kukin klooni on spesifinen tietylle kohdesolun pinnalla • · • · · • 99 0 · 119191 2 olevalle antigeenirakenteelle. Tietty CTL tunnistaa ja sitoutuu yhteen ainoaan antigeeniin, jolloin se aktivoituu ja voi sitten lisääntyä ja tuhota kohdesoluja. Tunnistus-prosessi on MHC-rajoitteinen ja -riippuvainen, koska anti-5 geeni tunnistetaan vain kun se on liittynyt yhteen koh-desolun ilmentämän self-luokka I:n MHC-pintamolekyylin kanssa.
T-solujen suorittama spesifisen antigeenin tunnistus vä-10 littyy T-solun antigeenireseptorin (TCR) kautta (A. Weiss, Cell 73, 209-212 (1993)). Ligandin sitoutuminen reseptoriin saattaa laukaista solun efektoriohjelmat, kuten esimerkiksi tyrosiinikinaasien aktivoinnin, solunsisäisen kalsiumionien vapautumisen ja interleukiini 2:n tuotannon 15 (R.T. Abraham et ai., Trends Biochem. Sei. 17, 434-438 (1992)).
TCR on multimeerinen pintakompleksi, joka sisältää ainakin kuuden geenin tuotteita, joita kaikkia tarvitaan tehokkaa-20 seen solukalvoilmentymiseen. TCR:n klonotyyppiset alfa-ία) ja beta- (β) ketjut välittävät spesifisen kohdesolun tunnistuksen. Nämä ketjut ovat ei-kovalenttisesti liittyneet CD3-kompleksin ei-polymorfisiin komponentteihin gam-...· ma- (γ), delta- (6) ja epsilon- (G) ja zeta- (ζ) ketju.
25 Dlsulfidisidoksinen ζ-homodimeeri on solukalvon läpäisevä V, molekyyli, ja sen soluliman puoleisella osalla on keskei- ^ nen merkitys TCR-välitteisessä viestin välityksessä ja *'* solun hajoamisen induktiossa, ζ-ketju kykenee itsenäiseen • · ;j·* viestin välitykseen, so. ζ riittää yksin vasteen välittä- • · «* * 30 miseen. ζ-ketjun fuusioituminen solunulkoisen ligandinsi- tojadomeenin kanssa saattaa johtaa molekyyliin, joka voi- ,:,J daan aktivoida interaktiolla ligandin kanssa (S.J. Frank ‘,J ϊ et ai., Science 249, 174-177 (1990); C. Romeo & B. Seed, .*··, Cell 64, 1037-1046 (1990); F. Letourneur & R.D. Klausner, * · 35 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 8905-8909 (1991)). ζ:η v * . isoformi, eta (η), on ζ-geenin transkriptin vaihtoehto!- • · · sesti silmukoitu muoto.
f · ♦ · · * ♦· ♦ · 119191 3
Kasvaimen muodostukseen kuuluu onkogeenien ja syövänesto-geenien mutaatio somaattisissa soluissa. Tällaiset mutaatiot saattavat johtaa rakenteellisiin muutoksiin tai proteiinien yli-ilmentymiseen. Molemmat tapaukset saattavat 5 johtaa muutoksiin näiden proteiinien solunsisäisessä prosessoinnissa ja uusien antigeenirakenteiden esiintymiseen yhdessä solujen pinnan MHC-antigeenien kanssa. Onkogeeni-tuotteita kohtaan suunnattujen vasta-aineiden toteaminen kasvainpotilaiden seerumissa viittaa siihen, että onkogee-10 nituotteet saattavat olla antigeenisiä. Lisätodistuksen tästä antigeenisuudesta antaa solun immuunivasteen herääminen. Useissa mallijärjestelmissä on esitetty sellaisen CTL: n esiintyminen, joka tunnistaa ja eliminoi kasvainso-luja (T. Boon, Adv. Cancer Res. 58, 177-210 (1992); M.W.
15 Kast et ai., Cell 59, 603-614 (1989); Disis et ai., Cancer Res. 54, 16-20 (1994)).
Nykyiset menetelmät, joissa pyritään käyttämään hyväksi T-lymfosyyttien sytolyyttistä aktiivisuutta esim. syövän 20 hoitoon, kärsivät monista puutteista, kuten esimerkiksi luontaisesti esiintyvän CTL:n tunnistusprosessin MHC-ra-joitteisuudesta. Sellaiselle lähestymistavalle on tarvetta, jossa voitetaan tällä hetkellä tavatut rajoitukset.
» e··· 0 0 25 Keksintö koskee sellaista parannettua lähestymistapaa, * · e jossa manipuloidaan CTL-tunnistuksen spesifisyyttä, esi- £ e * merkiksi muutetaan CTL-tehoa ja selektiivisiä kasvaimen vastaisia aineita. Tämä lähestymistapa perustuu yhdenmu- ‘ * 0 'jj·' kaisten geneettisten muutosten tunnistamiseen hyvänlaatui- V' 30 sissa ja erityisesti pahanlaatuisissa kasvainsoluissa. Kun CTL varustetaan määrätyllä kasvainsoluspesifisyydellä, * voidaan keskittyä tiettyihin kasvainsoluihin ja tuhota mainitut kohdesolut MHC:n rajoittamatta ja MHC:stä riippu- t matta. CTL:n, johon on siirretty uusi, MHCistä riippumaton * 0 35 tunnistusspesifisyys, aikaansaamaa kasvainsolun hajotusta voidaan käyttää in vitro (ex vivo) tai in vivo, esimerkik- e ψ |,| ϊ si syövän hoitoon kuuluvassa geenihoidossa.
t · f · · • ·· f ψ 119191 4
Kasvainsolut ovat (ennalta) määriteltyjä tai valikoituja kohdesoluja siinä mielessä, että niissä on antigeenirakenne (ligandi), jonka tunnistaa ja sitoo antigeeninsitojado-meeni, joka on keksinnön mukaisen kimeerisen proteiinin 5 osa.
Keksintö koskee kimeeristä proteiinia, joka kykenee ohjaamaan CTL:n spesifisesti tunnistamaan ja tuhoamaan valikoituja kasvainsoluja. Yksityiskohtaisemmin keksintö koskee 10 kimeeristä proteiinia, joka sisältää tunnistustoiminnon, sarana-alueen ja TCR:n ζ-ketjun sekä CTL:n, joka tuottaa yhtä tai useampaa sellaista proteiinimolekyyliä. Soluun sitoutuneen ligandin sitoutuminen keksinnön mukaisen kimeerisen proteiinin tunnistusosaan johtaa ζ-ketjuvälittei-15 seen viestin välitykseen CTL:n sisällä, ja lopulta tämä johtaa ligandia kantavan solun hajoamiseen.
Keksinnön mukainen kimeerinen proteiini on sellainen proteiini, jota ei esiinny luonnossa. Proteiini on bifunktio-20 naalinen siinä mielessä, että se kykenee sekä spesifisesti tunnistamaan ja sitoutumaan tiettyyn antigeenirakenteeseen (sen tunnistustoimintadomeenin välityksellä) että toimimaan viestinsiirtokomponenttina (sen ζ-ketjuosan välityksellä). Sarana-alue toimii välikkeenä ja varmistaa tunnis-25 tustoimintadomeenille tarpeellisen saavutettavuuden ja joustavuuden. Sarana-alueen ymmärretään olevan olennainen • · keksinnön mukaisen kimeerisen proteiinin toimivuudelle.
• ·
Kimeerisen proteiinin rakennejärjestys on edullisesti sel- ·1" lainen, että tunnistustoiminto sijaitsee N-terminaalissa * 1 1 *;!;1 30 ja on kytkeytynyt sarana-alueen välityksellä ζ-ketjuosaan, *·1 1 joka sijaitsee kimeerisen proteiinin C-terminaalissa.
Koska keksinnön mukainen kimeerinen proteiini on solunpin-nan reseptori, se sisältää solunulkoisen domeenin, solu-kalvon läpäisevän domeenin ja soluliman domeenin, ja se 35 insertoidaan isäntäsolun, esim. CTL:n, solukalvoon. Kek- • · **'. sinnön mukaisen proteiinin toimivuus isäntäsolussa on to- , dettavissa määrityksellä, joka soveltuu mainitun proteii- • » • · · • · » • # · · t * · 1 • · · • · . 119191 nin viestinsiirtokyvyn osoittamiseen tietyn ligandin sitoutumisen jälkeen, esim. määrityksellä, jolla voidaan todeta ligandin sitoutumisen laukaisema viestinsiirron reaktiotie. Sellainen on esimerkiksi määritys, jossa mita-5 taan kalsiumionien vapautumisen lisääntyminen, solunsisäi-nen tyrosiinin fosforylaatio, inositolifosfaatin saanto (turnover) tai näin aikaansaatu interleukiini (IL) 2:n, γ-interferonin, GM-CSF:n, IL-3:n tai IL-4:n tuotanto. (R.T. Abraham et ai., Trend Biochem. Sei. 17, 434-438 (1992)).
10 Tällaiset määritykset ovat alan asiantuntijalle helposti saatavilla. Viitataan esimerkeissä käytettyihin määrityksiin. On selvää, että näitä määrityksiä voidaan modifioida, esim. käyttämällä muita sopivia solulinjoja.
15 Tunnistustoiminnosta vastaa vasta-aineen, erityisesti yk-siketjuisen vasta-aineen (scFv), antigeeninsitojadomeeni. Yksiketjuiset vasta-aineet ovat geenifuusioita, jotka sisältävät monoklonaalisten vasta-aineiden raskaan ja kevyen ketjun muuntelevat domeenit. Mainittu tunnistus- ja sitou-20 tumistoiminto on annettu TCR-kompleksin ζ-ketjulle, jolloin kierretään TCR:n α/β-ketjujen kautta tapahtuva MHC-rajoitteinen antigeenin tunnistus.
s
Antigeeninsitojadomeeni saadaan monoklonaalisesta vasta-...: 25 aineesta, joka on spesifisesti suunnattu soveltuvaa kas- vainsolulla olevaa antigeeniä vastaan.
• · · • · · #j# Sellainen antigeeni on sopiva, jolla on normaali soluun « ***' verrattuna kohonnut tai spesifinen ilmentyminen kasvainso- * t · ·” 30 lun pinnalla, esim. antigeeni, joka muodostuu yhdenmukai- • · · *·1 1 sista (consistent) geenimuutoksista kasvainsoluissa. Esi merkkejä sopivista antigeeneistä ovat tiehytepiteelin mu-siini, gp 36, TAG-72, kasvutekijän reseptorit ja glykoli : sfingolipidit sekä muut hiilihydraattiantigeenit, joita .···. 35 ilmennetään etupäässä kasvainsoluissa. Tiehytepiteelin • · musiinia ilmennetään voimistuneesti rinta-, munasarja- ja • · . haimakarsinoomasoluissa, ja sen tunnistaa esim. monoklo- 9 · ♦ 1 1 • · · «·· · · • · · 9 ·· • · 119191 6 naalinen vasta-aine SM3 (Zotter et al., Cancer Rev. 11, 55-101 (1988)). Glykoproteiinia gp 36 esiintyy ihmisen leukemia- ja lymfoomasolujen pinnalla. Mainitun antigeenin tunnistaa esimerkiksi vasta-aine SN 10. TAG-72 on pankar-5 sinooma-antigeeni, jonka tunnistaa monoklonaalinen vasta-aine CC49 (Longenecker, Sem. Cancer Biol. 2, 355-356). Kasvutekij^reseptoreita ovat esimerkiksi ihmisen epider-maalisen kasvutekijän (EGF) reseptori (Khazaie et ai., Cancer and Metastasis Rev. 12, 255-274 (1993)) ja HER2, 10 jota kutsutaan myös erbB-2:ksi tai gp 185:ksi (A. Ullrich ja J. Schlessinger, Cell 61, 203-212 (1990)). ErbB-2-re-septori on solukalvon läpäisevä molekyyli, jota yli-ilmen-netään suuressa prosenttiosuudessa ihmisen karsinoomia (N.E. Hynes, Sem. in Cancer Biol. 4, 19-26 (1993)). Nor-15 maalissa aikuisen kudoksessa erbB-2:ta ilmennetään vähän. Tämä ero ilmentymisessä todistaa erbB-2-reseptorin olevan "kasvaimen voimistama".
Antigeeninsitojadomeeni saadaan edullisesti monoklonaali-20 sesta vasta-aineesta, joka on valmistettu käyttämällä im-munogeeninä eläviä ihmisen kasvainsoluja, joissa antigeeni esiintyy luonnollisessa muodossaan. Keksinnön edullisessa suoritustavassa kimeerisen proteiinin tunnistusosa sitoutuu spesifisesti kasvutekijän reseptorin, erityisesti HER :*·· 25 2:n, solunulkoisessa domeenissa olevaan antigeeniseen de- .;··« terminanttiin. HER2 kasvutekijän reseptoria vastaan suun- natut monoklonaaliset vasta-aineet ovat tunnettuja, ja • · niitä on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa S.J. McKenzie et m . ai., Oncogene 4, 543-548 (1990), R.M. Hudziak et ai., • mm 30 Molecular and Cellular Biology 9, 1165-1172 (1989), kan- • · · sainvälisessä patenttihakemuksessa WO 89/06692 (Genentech) . ja japanilaisessa patenttihakemuksessa Kokai 02-150 293 • · * *;j·’ (Ajinomoto KK). Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on *·* * muodostettu sellaisia eläviä ihmisen kasvainsoluja vas- .***. 35 taan, joissa on natiivissa muodossaan olevaa HER2:ta, • · · ....: kuten esimerkiksi SKBR3-soluissa, kuvataan esimerkiksi EP- patenttihakemuksessa 502 812 (Ciba-Geigy), joka sisällyte- • · · m m 9 • mm · m · m · · • ·· • · 7 119191 tään tähän viitteenä, ja tähän sisältyvät vasta-aineet FRP5, FSP16, FSP77 ja FWP51. Näitä vasta-aineita tuottavat hybridoomasolulinjat on talletettu talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, PHLS 5 Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, UK) 21. marraskuuta, 1990 talletusnumeroilla 90112115, 90112116, 90112117 ja vastaavasti 90112118.
Keksinnön mukaisessa kimeerisessä proteiinissa edullinen 10 antigeeninsitojadomeeni on yksiketjuinen yhdistelmävasta-aine (scFv), joka sisältää kevyen ketjun muuntelevan do-meenin (VL), joka on silloitettu raskaan ketjun muuntele-vaan domeeniin (VH) joustavan kytkijäalueen (välikkeen) välityksellä, joka on edullisesti peptidi. Peptidi koostuu 15 edullisesti noin 10-30 aminohaposta, erityisesti luontaisesti esiintyvistä aminohapoista, esim. noin 15:stä luontaisesti esiintyvästä aminohaposta. Sellainen peptidi on edullinen, joka koostuu L-glysiinistä tai L-seriinistä, erityisesti 15 aminohapon peptidi, joka koostuu kolmesta 20 toistoyksiköstä Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Sellainen yksiketjui-nen vasta-aine on edullinen, jossa VH sijaitsee yhdistel-mävasta-aineen N-terminaalissa. Sellainen kimeerinen proteiini on edullinen, jossa yksiketjuisella yhdistelmävas-ta-aineella on edellä määritelty edullinen spesifisyys, ...! 25 esim. kimeerinen proteiini, jonka sisältämässä yksiketjui- sessa yhdistelmävasta-aineessa raskaan ketjun muunteleva .. •t domeeni ja kevyen ketjun muunteleva domeeni ovat peräisin ’ ! monoklonaalisesta vasta-aineesta, esim. muriinin (hiiri ··» **“ tai rotta) monoklonaalisesta vasta-aineesta, joka on suun- • 1 1 30 nattu ihmisen kasvutekijäreseptoria HER2 vastaan, sellai- • · · ’.1 1 nen muriinin monoklonaalinen vasta-aine voi olla esimer kiksi FSP16, FSP77, FRP5 tai FWP51.
• ♦ · • · · ··· :T: Vasta-aineen raskaan tai kevyen ketjun muunteleva domeeni 35 koostuu niin kutsutuista kehysalueista (FR:istä, framework • · ***. regions), jotka ovat melko säilyneitä vasta-aineissa, joilla on erilainen spesifisyys, ja tietylle spesifisyy- • · • · · • · ♦
Ml ♦ · • · • M • · 8 11 9191 delle tyypillisistä hypervariaabelialueista, joita kutsutaan myös komplementaarisuuden määräysalueiksi (CDR, complementarity determining regions). Keksinnön mukaisen ki-meerisen proteiinin antigeeninsitojadomeenissa FR:t on 5 edullisesti saatu nisäkkään, esim. muriinin tai erityisesti ihmisen, vasta-aineesta. Monoklonaalisen vasta-aineen scFv-johdannainen siirretään TCR/CD3-kompleksin ζ-ketjuun.
Erityisen edullinen kimeerinen proteiini sisältää yksiket-10 juisen yhdistelmävasta-aineen, jossa raskaan ketjun muun-televa domeeni sisältää polypeptidin, jolla on kaava FR1-CDR1h-FR2-CDR2h-FR3-CDR3h-FR4 (I) 15 jossa polypeptidiketju kuvataan niin, että se alkaa uloimmasta N-terminaalisesta päästä ja päättyy uloimpaan C-ter-minaaliseen päähän, ja FRX on peptiditähde, joka sisältää vähintään 25-29, edullisesti 25-33, luontaisesti esiintyvää aminohappoa, FR2 on peptiditähde, joka sisältää 12-16 20 luontaisesti esiintyvää aminohappoa, FR3 on peptiditähde, joka sisältää 30-34 luontaisesti esiintyvää aminohappoa, FR4 on peptiditähde, joka sisältää vähintään 6-10, edullisesti 6-13, luontaisesti esiintyvää aminohappoa, CDR1H on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID NO:2:n aminohappo-25 sekvenssistä 31-35; CDR2H on peptiditähde, joka koostuu • i SEKV. ID N0:2:n aminohapposekvenssistä 50-66; ja CDR3H on * * . peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID N0:2:n aminohapposek- I * » : ;* venssistä 99-108, tai CDR1H on peptiditähde, joka koostuu «*« ···· SEKV. ID N0:4:n aminohapposekvenssistä 31-35; CDR2H on 30 peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID N0:4:n aminohapposek- • ·· :.· · venssistä 50-66; ja CDR3H on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID NO:4:n aminohapposekvenssistä 99-109, ja jossa : aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodos- M· .*j*; taen S-S-siltoja. Nämä erityiset komplementaarisuuden mää- 35 räävät alueet ovat Asn-Tyr-Gly-Met-Asn (CDR1H), Trp-Ile- • · ’···] Asn-Thr-Ser-Thr-Gly-Glu-Ser-Thr-Phe-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys- * * Gly (CDR2h) ja Trp-Glu-Val-Tyr-His-Gly-Tyr-Val-Pro-Tyr ♦ · • · · • · · • ·· · • * • · t t · • · 9 119191 (CDR3H) SEKV. ID N0:2:n mukaan, tai Ser-Tyr-Trp-Met-Asn ( CDR1h ), Met-Ile-Asp-Pro-Ser-Asp-Ser-Glu-Thr-Gln-Tyr-Asn-Gln-Met-Phe-Lys-Asp (CDR2H) ja Gly-Gly-Ala-Ser-Gly-Asp-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val (CDR3H) SEKV. ID NO:4:n mukaan.
5
Erityisen edullinen on kimeerinen proteiini, jossa yksi-ketjuinen yhdistelmävasta-aine sisältää kaavan I mukaisen raskaan ketjun muuntelevan domeenin, jossa kehysalueet FRX, FR2, FRa ja FR4 ovat edullisesti peräisin nisäkkään, 10 erityisesti muriinln tai ihmisen, vasta-aineesta.
Keksinnön ensimmäisessä suoritustavassa edullisin on sellainen kimeerinen proteiini, jossa yksiketjuisen yhdistel-mävasta-aineen raskaan ketjun muunteleva domeeni sisältää 15 SEKV. ID N0:2:n aminohapposekvenssin 2-120 muodostaman polypeptidin, jossa valinnaisesti yksi tai useampi, esim.
1, 2, 3 tai 4 yksittäistä aminohappoa aminohapposekvensseissä 2-30 (FRJ, 36-49 (FR2), 67-98 (FR3), ja/tai 110-120 (FR4) korvataan muilla aminohapoilla tai poistetaan, ja 20 jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja, erityisesti kimeerinen proteiini, jossa raskaan ketjun muunteleva domeeni sisältää SEKV. ID N0:2:n aminohapposekvenssin 6-119 muodostaman polypeptidin, jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa ti-25 lassa muodostaen S-S-siltoja.
f · ... Keksinnön toisessa suoritustavassa edullisin on sellainen • · · ! ;* kimeerinen proteiini, jossa yksiketjuisen yhdistelmävasta- • · ·
···· aineen raskaan ketjun muunteleva osa sisältää SEKV. ID
30 N0:4:n aminohapposekvenssin 2-120 muodostaman polypepti- • · · V : din, jossa valinnaisesti yksi tai useampi, esim. 1, 2, 3 tai 4 aminohappoa aminohapposekvensseissä 2-30 (FRt), 36- i 49 (FR2), 67-98 (FR3), ja/tai 110-120 (FR4) korvataan muil- <·· la aminohapoilla tai poistetaan, ja jossa aminohappo Cys 35 saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja, • « '···* erityisesti yhdistelmävasta-aineet, joiden raskaan ketjun * * muunteleva domeeni sisältää SEKV. ID NO:4:n aminohapposek- • · » · » « · · ··· i ♦ · • · · • · · • · 119191 10 venssin 6-120 muodostaman polypeptidin, jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja.
5 Esimerkiksi kehysalueella oleva hydrofobinen aminohappo voidaan korvata toisella aminohapolla, edullisesti myös hydrofobisella aminohapolla, esim. homologisella aminohapolla, se voidaan korvata kahdella aminohapolla (mikä johtaa aminohapon insertioon) tai poistaa. Samoin kehysalu-10 eella oleva hydrofiilinen aminohappo voidaan korvata toisella aminohapolla, kahdella aminohapolla tai poistaa, jolloin korvaavat aminohapot edullisesti säilyttävät vastaavan kehysalueen vetysidosrakenteen. Kaikissa yhden tai useamman aminohapon korvauksissa otetaan edullisesti huo-15 mloon ne ohjeistot, joita alalla tunnetaan vasta-aineen uudelleen muotoilua tai ihmiselle soveltuvaksi tekemistä (humanize) varten. Erityisen huomionarvoisia ovat ohjeistot, joilla pyritään vähentämään uudelleen muotoillun vasta-aineen immunogeenisuutta ("alkuperäiseen" monoklonaali-20 seen vasta-aineeseen verrattuna) ja/tai suunnittelemaan vasta-aine, jonka sidosaffiniteetti suunnilleen vastaa tai ylittää "alkuperäisen" vasta-aineen. Aminohappojen modifikaatio voidaan rajoittaa yhteen FR-alueeseen, so. FR^een, FR2:een, FR3:een tai FR4:ään, tai se voidaan ulottaa kah-25 teen, kolmeen tai kaikkiin neljään FR:ään.
• * f ·« · * * .. . Samalla tavalla keksinnön mukainen edullinen kimeerinen • * » * ; proteiini sisältää yksiketjuisen yhdistelmävasta-aineen, ·*·| jossa kevyen ketjun muunteleva domeeni sisältää polypepti- 30 din, jolla on kaava * *· * « * • * * FR6-CDR1L-FR7-CDR2L-FR8-CDR3L-FR9 (II) t * * * * · ··* •*j*: jossa polypeptidiketju kuvataan niin, että se alkaa uloim- * 35 masta N-terminaalisesta päästä ja päättyy uloimpaan C-ter-*—] minaaliseen päähän, ja FR6 on peptiditähde, joka sisältää luontaisesti esiintyviä aminohappoja, edullisesti 19-25, • * t · · * · · ··· · * · * · · m · · • · 119191 11 erityisesti 19-23, luontaisesti esiintyvää aminohappoa, FR, on peptiditähde, joka sisältää 13-17 luontaisesti esiintyvää aminohappoa, FRe on peptiditähde, joka sisältää 30-34 luontaisesti esiintyvää aminohappoa, FR, on peptidi-5 tähde, joka sisältää luontaisesti esiintyviä aminohappoja, erityisesti 7-11 luontaisesti esiintyvää aminohappoa, ja CDR1L on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID N0:2:n aminohapposekvenssistä 158-168, CDR2l on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID NO:2:n aminohapposekvenssistä 184-190, ja 10 CDR3l on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID N0:2:n aminohapposekvenssistä 223-231, tai CDRlL on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID N0:4:n aminohapposekvenssistä 159-164, CDR2l on peptiditähde, joka koostuu SEKV. ID N0:4:n aminohapposekvenssistä 185-191, ja CDR3l on peptiditähde, joka 15 koostuu SEKV. ID N0:4:n aminohapposekvenssistä 224-231, ja jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja. Nämä erityiset komplementaarisuu-den määräävät alueet ovat Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Tyr-Asn-Ala-Val-Ala (CDR1L), Ser-Ala-Ser-Ser-Arg-Tyr-Thr (CDR2L) ja 20 Gln-Gln-His-Phe-Arg-Thr-Pro-Phe-Thr (CDR3L) SEKV. ID NO 2:n mukaan, tai Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Ile-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ala (CDR1L), Tyr-Thr-Ser-Val-Leu-Gln-Pro (CDR2L) ja Leu-His-Tyr-Asp-Tyr-Leu-Tyr-Thr (CDR3t) SEKV. ID NO:4:n mukaan.
. 25 M»» • ♦
Erityisen edullinen on kimeerinen proteiini, jossa yhdis- • · , telmävasta-aine sisältää kaavan II mukaisen kevyen ketjun » · » • i muuntelevan domeenin, jossa peptiditähteet kehysalueista <··: FRg, FR6, FR, ja FRe ovat edullisesti peräisin nisäkkään, 30 erityisesti muriinin tai ihmisen, vasta-aineesta.
·*· • · · • · ·
Keksinnön eräässä suoritustavassa edullisin on sellainen j kimeerinen proteiini, jossa yhdistelmävasta-aineen kevyen ··* ketjun muunteleva domeeni sisältää SEKV. ID N0:2:n amino- • · * •t 35 happosekvenssin 135-240 muodostaman polypeptidin, jossa *···] valinnaisesti yksi tai useampi, esim. 1, 2, 3 tai 4 amino- ’** * happoa aminohapposekvensseissä 135-157 (FR6), 169-183 « ψ * I * ♦ • * ♦ f·· · • * • · · • *· • * 12 119191 (FR,), 191-222 (FR,), Ja/tai 232-240 (FR,) korvataan muilla aminohapoilla tai poistetaan, ja jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja, erityisesti kevyen ketjun muunteleva domeeni sisältää 5 SEKV. ID N0:2:n aminohapposekvenssin 135-240 muodostaman polypeptidin, jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja.
Keksinnön toisessa suoritustavassa edullisin on sellainen 10 kimeerinen proteiini, jossa yhdistelmävasta-aineen kevyen ketjun muunteleva domeeni sisältää SEKV. ID N0:4:n aminohapposekvenssin 136-240 muodostaman polypeptidin, jossa valinnaisesti yksi tai useampi, esim. 1, 2, 3 tai 4 yksittäistä aminohappoa aminohapposekvensseissä 136-158 (FR6), 15 170-184 (FR7), 192-223 (FR8), ja/tai 232-240 (FR,) korva taan muilla aminohapoilla tai poistetaan, ja jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja, erityisesti kevyen ketjun muunteleva domeeni sisältää SEKV. ID N0:4:n aminohapposekvenssin 136-240 20 muodostaman polypeptidin, jossa aminohappo Cys saattaa olla hapettuneessa tilassa muodostaen S-S-siltoja.
Esimerkiksi kehysalueiden aminohapot voidaan korvata muilla aminohapoilla tai poistaa siten kuin edellä raskaan 25 ketjun kohdalla on yksityiskohtaisesti selostettu.
• · 9 *·««· • · .. , Erityisen edullinen on sellainen kimeerinen proteiini, jo- < » · * i ka sisältää yksiketjuisen yhdistelmävasta-aineen, jossa * · · • »•j raskaan ketjun muunteleva domeeni ja kevyen ketjun muunte- 30 leva domeeni on kytketty toisiinsa välikeryhmällä, joka • t· V * koostuu 10-30:stä, esim. noin 15:stä, aminohaposta, eri tyisesti sellainen yksiketjuinen yhdistelmävasta-aine, * joka sisältää polypeptidin, jolla on kaava Ψ99 ? · · • · * • * * 35 FR1-CDR1H-FR2-CDR2H-FR3-CDR3H-FR<-Sp-FR6-CDR1L-FR7-CDR2l-FR8-CDR3L-FR, (III) *·· ** • · Λ 9 9 I · * « » · f·· · * · * * · • »* 9 ♦ 13 119191 jossa polypeptidiketju kuvataan niin, että se alkaa uloimmasta N-terminaalisesta päästä ja päättyy uloimpaan C-ter-minaaliseen päähän, ja FRX, CDR1H, FR2, CDR2H, FR3, CDR3H, FR4, FR6, CDR1l, FR7, CDR2l, FRe, CDR3L ja FR, ovat, kuten 5 edellä on mainittu, ja Sp on edellä esitetty peptidiväli-ke.
Antigeeninsitojadomeenista voidaan tutkia sen spesifisyys ennalta määrättyä kasvainsoluantigeenia kohtaan alalla 10 tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi sellaisten solujen immunofluoresenssivärjäyksellä, jotka ilmentävät suuria määriä antigeeniä, immunoblottaamalla joko suoraan tai immuunisaostamalla ja proteiiniblottaamalla immunokomplek-sit, tai muulla immunologisella määritysmenetelmällä, ku-15 ten sitoutumis-, risti-inhibitio- tai kompetitiivisella radio- tai entsyymi-immuunimäärityksellä. Antigeeninsito-jadomeenin sidosaffiniteetti voidaan määrittää käyttämällä sopivaa kvantitatiivista määritystä, jonka alan asiantuntija voi helposti aikaansaada tunnettujen tekniikoiden ja 20 periaatteiden nojalla. Haluttaessa antigeeninsitojadomee-nin affiniteettia voidaan verrata sopivaan vertailuvasta-aineeseen, esim. "parentaaliseen" hiiren monoklonaaliseen vasta-aineeseen, josta se on peräisin.
25 Keksinnön mukainen kimeerinen proteiini sisältää antigee- • · , ninsitojadomeenin lisäksi sarana-alueen, joka insertoidaan *ψ ’ lyhyenä, joustavana "liekanaruna" antigeeninsitojadomeenin « « » » ** ja ζ-domeenin väliin. Sarana-alue on peptidi, joka sisälsi’ tää noin 40-200 luontaisesti esiintyvää aminohappoa, edul- \;,5 30 lisesti noin 60-190 aminohappoa. Keksinnön mukaisessa ki~ »t» *,! ’ meerisessä proteiinissa oleva sarana-alue on edullisesti immunoglobuliinin sarana-alueen kaltainen, esim. CD4-mole-j ·1· kyylistä peräisin oleva sarana-alue, kuten esimerkiksi D3D4-immunoglobuliinidomeenit (P.J. Maddon et ai., Proc.
35 Natl. Acad. Sei. USA 84, 9155-9159 (1987), tai CD8a-mole- i m '···1 kyylistä peräisin oleva sarana-alue, esim. Lyt-2 (R. Zomo- • f «·· yskä et ai., Cell 43, 153-163 (1985); B.J. Classon et ai., « » I » « t I I H» · · I < · • »4 • · 119191 14
Int. Immunol. 4, 2, 215-225 (1992)). SEKV. ID NO:7:ssä esitetyssä aminohapposekvenssissä sarana-alue (Lyt-2) ulottuu aminohaposta asemassa 245 aminohappoon asemassa 304.
5
Keksinnön mukainen kimeerinen proteiini sisältää antigee-ninsitojadomeenin ja sarana-alueen lisäksi toiminnallisen ζ-domeenin, joka antaa kimeeriselle proteiinille solukalvon läpäisevän ja viestinvälittäjädomeenin. Toiminnallinen 10 ζ-domeeni sisältää pääosin ζ-ketjun solukalvon läpäisevän ja soluliman puoleisen domeenin. Keksinnön mukaisen kimee-risen proteiinin antigeeninsitojadomeenin ja spesifisen antigeenin välisen vuorovaikutuksen aikaansaama TCR:n ζ-domeenivälitteinen aktivaatio laukaisee monia viestinsiir-15 toreaktioteitä, esim. edellä mainitut. Keksinnön mukaan ζ-ketju on peräisin nisäkkäästä, erityisesti muriinista tai ihmisestä. TCRrssä ζ esiintyy ζζ-disulfidihomodimeerinä. Toiminnallinen ζ-domeeni on proteiini, joka ilmennyttyään sellaisissa T-soluhybridoomissa, joissa ei ole endogeenis-20 tä ζ-ilmentymistä, kykenee palauttamaan mainituille hybri-doomille toiminnallisesti aktiivisen TCR:n, esim. siten, että antigeenin indusoima interleukiini 2:n eritys ja kasvun stimulointi palautuvat (S. Frank et ai., Science 249, . 174-177 (1990)). Esimerkkejä toiminnallisesta ζ-domeenista ···* [ 25 ovat molekyylit, jotka sisältävät muriinin aminohapot 28- 164 (A.M. Weissman, Science 239, 1018-1021 (1988)) ja ami- M · : .* nohapot 28-163 ihmisen ζ-ketjusta (numerointi A.M. Weiss- ..!·* manin ym. mukaan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 9709-9713 • (1988), kuva 2, joka sisällytetään tähän viitteellä). Ote-30 taan huomioon, että tämän keksinnön tarkoitukseen käytettynä ζ-proteiiniin tarkoitetaan sisältyvän variantit sillä . .*. edellytyksellä, että nämä variantit ovat toiminnallisia.
Edulliset variantit ovat peräisin nisäkkäästä, erityisesti ♦ · · muriinista tai ihmisestä.
• · · :...: 35 *·*’· Variantti on esimerkiksi ζ-molekyylin luontaisesti esiin- : .*. tyvä variantti, jota tavataan tietyissä lajeissa. Tällai- • · « * • * • · · • ·· • « 119191 15 nen variantti saattaa olla saman geeniperheen sukuisen geenin tai tietyn geenin alleelivariantin koodaama. Termiin "variantti" sisältyy myös modifioitu ζ-molekyyli, joka voidaan valmistaa in vitro -mutageneesille altistetusta 5 DNA:sta sillä edellytyksellä, että DNA:n koodaamalla pro teiinilla on alkuperäisen ζ-molekyylin toiminnallinen aktiivisuus. Tällaiset modifikaatiot voivat koostua additi-osta, vaihdosta ja/tai deleetiosta, joista jälkimmäisen tuloksena saadaan lyhennettyjä variantteja.
10
Keksinnön mukainen edullinen kimeerinen proteiini sisältää proteiinin, jolla on SEKV. ID N0:7:ssä kuvattu aminohappo-sekvenssi .
15 Edelleen keksintö koskee polyklonaalista ja monoklonaalis-ta vasta-ainetta, joka sitoutuu spesifisesti keksinnön mukaiseen proteiiniin. Sellainen vasta-aine valmistetaan alalla hyvin tunnettujen tavanomaisten menetelmien mukaisesti.
20
Keksinnön mukainen kimeerinen proteiini voidaan valmistaa menetelmällä, joka tunnetaan per se, menetelmälle on tunnusomaista, että jäljempänä lähemmin kuvatut sopivat, keksinnön mukaista proteiinia tuottavia isäntäsoluja lisätään • · · 1 * 1 25 in vitro tai in vivo, ja haluttaessa proteiini eristetään.
***** Edullisesti keksinnön mukainen proteiini tuotetaan mene- • 1 · • telmällä, jossa viljellään sopivaa transdusoitua CTL-solua |j1 olosuhteissa, jotka mahdollistavat proteiinia koodaavan : DNA-rakenteen ilmentämisen, ja valinnaisesti suoritetaan ··· :1j1. 30 määritys, jolla todetaan proteiinin toiminnallisuus. Vielä * keksintö koskee sellaista menetelmää keksinnön mukaisen kimeerisen proteiinin valmistamiseksi, jossa viljellään • 1 i sopivaa isäntäsolua, erityisesti CTL:ää, joka on transdu- ·. soitu sellaisen ekspressiokasetin sisältävällä vektorilla, • · · ’1...· 35 joka sisältää promoottorin ja mainittua proteiinia koodaa- *:2: van DNA:n, jota mainittu promoottori säätelee, olosuhteis- . I·, sa, joissa mainittua DNA:ta voidaan ilmentää. Keksinnön • · · • · · · · • · • · 2 • · 16 119191 mukainen edullinen kimeerinen proteiini rakennetaan siten, että se sisältää scFV:n, sarana-alueen ja toiminnallisen ζ-molekyylin. Keksinnön mukaisen proteiinin valmistusmenetelmän tulisi tuottaa proteiinia sellaisen määrän, joka 5 riittää transdusoidulle isäntäsolulle kohdesolun hajottamiseen.
Sopivia isäntäsoluja ovat esim. primaariset sytotoksiset T-lymfosyytit (CD8+), CD4+ T-auttajasolut ja luontaiset 10 tappajasolut (NK-solut), Nisäkässolut ovat edullisia, erityisesti nisäkkäästä, etenkin ihmisestä, peräisin oleva CTL.
In vitro tarkoittaa edellä ja jäljempänä ex vivo, jolloin 15 siihen kuuluvat soluviljelyolosuhteet.
Esimerkiksi nisäkässolujen lisääminen In vitro suoritetaan sopivilla elatusaineilla, jotka ovat tavanomaisia yleisiä viljelyelatusaineita, kuten esimerkiksi Dulbeccon modifi-20 oltu Eaglen elatusaine (DMEM) tai RPMI 1640 -elatusaine, joita on valinnaisesti täydennetty nisäkässeerumilla, esim. vasikan sikiön seerumilla, tai hivenaineilla ja kasvua ylläpitävillä täydennysalueilla, esim. hoitajasoluilla (feeder cells).
··«« * · 25
Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA:ta tai DNA-rakennetta, • ♦ · • joka sopii T-lymfosyyttien tunnistusspesifisyyden käsitteli· lyyn. Yksityiskohtaisemmin keksintö koskee DNA-rakennetta, ; ·'; joka pystyy ohjaamaan sellaisen kimeerisen proteiinin syn- ··· 30 teesiä, joka sisältää tunnistustoiminnon, sarana-alueen ja ζ-ketjun TCR:n viestinsiirtokomponenttina. Erityisesti keksintö koskee DNA-rakennetta, joka koodaa sellaista ki-
t » I
li’. meeristä proteiinia, joka sisältää antigeeninsitojadomee- • · · \ * nin, sarana-alueen ja ζ-domeenin, erityisesti DNA-raken- 35 netta, joka sisältää vähintään yhden polynukleotidin, joka ·:**: koodaa edellä ja jäljempänä edulliseksi määriteltyä prote- . *. iiniosaa. Edullisessa järjestyksessä antigeeninsltojado- • · t *·· · * · • i » • M * · 17 119191 meeni on suunniteltu ensimmäiseksi osaksi, sarana-alue toiseksi osaksi ja ζ-ketju kolmanneksi osaksi.
Määritelmän mukaan keksinnön mukaisiin DNA-molekyyleihin 5 kuuluvat yksijuosteiset DNA:t, kaksijuosteiset DNA:t, jotka koostuvat mainituista koodaavista DNA-molekyyleistä ja niiden kanssa komplementaarisista DNA-molekyyleistä, tai itse näistä komplementaarisista (yksijuosteisista) DNA-molekyyleistä.
10
Edullisesti keksinnön mukainen DNA-rakenne sisältää neljännen osan, joka sijaitsee ylävirtaan ensimmäisestä osasta (antigeeninsitojadomeenista) ja joka koodaa johtopepti-diä. Edullisesti keksinnön mukaisen DNA-rakenteen neljäs 15 osa koodaa immunoglobuliini- (Ig) -geenin johtopeptidiä, esim. lg:n raskaan ketjun johtopeptidiä. Ig:n raskaan ketjun johtopeptidi edistää muodostuvien polypeptidien kohdistamista solulimakalvoston onteloon; tämän jälkeen se lohkotaan irti ja proteiini järjestetään Golgin ja solu-20 kalvon läpi sen solukalvon läpäisevään sijaintikohtaan. Erityisen edullinen on johtopeptidi, jolla on sekvenssi: Met-Ala-Trp-Val-Trp-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Met-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-Pro-Lys.
**’1 25 Sellainen DNA on edullinen, joka sisältää DNA:n, joka *
koodaa SEKV. ID N0:7:ssä esitetyn aminohapposekvenssin :1·1! muodostamaa proteiinia, esim. DNA:n, jolla on SEKV. ID
·;· NO:5:ssä esitetty nukleotidisekvenssi. SEKV. id N0:7:ssä M·1 j ·1· esitetyllä DNA-sekvenssillä on seuraavat ominaispiirteet: *»1 j·;·. 30 sekvenssin kuvaus: 5'-EcoRI-IgH-ketjun johto-D6/12-scFv- (FRP5):Lyt-2-sarana:-CD3-zeta-(kalvon läpäisevä (TM)) ja . soluliman (Cyt))-EcoRI-3' I 1 · 5'EcoRI-kohta: sijainti 1 • · · 3'RcoRI-kohta: sijainti 1474 35 ATG-aloitus sijainti 40 ····· TAA-lopetus sijainti 1423 . IGH-ketjun johto sijainti 40-93 » 1 · ·«1 1 • · · • «t • ia 119191 SCFv(FRP5) sijainti 94-819 lyt-2 saranainsertti Xbal (sijainti 819) - Xbal (si jainti 1005) zeta-insertti Xbal (sijainti 1005) - EcoRI (si- 5 jainti 1474)
Nykyisen tekniikan tasolla alan asiantuntija kykenee syntetisoimaan keksinnön mukaisen DNA-molekyylin, kun tunnetaan tässä annetut kirjalliset tiedot. Sopivia menetelmiä 10 keksinnön mukaisen DNA-rakenteen saamiseksi ovat alalla hyvin tunnetut menetelmät, joissa esim. syntetisoidaan useita oligonukleotideja, monistetaan spesifisiä geenisekvenssejä, esim. PCR:ää (polymeraasiketjureaktiota) käyttämällä, silmukoidaan ne halutun DNA-sekvenssin saamiseksi 15 ja/tai käytetään DNA-restriktioentsyymejä ja ligaaseja.
Keksinnön mukainen DNA voidaan syntetisoida yhdistämällä kemialliset ja yhdistelmämenetelmät.
Edelleen keksintö koskee vektoria, kuten retrovirusvekto-20 ria, joka sisältää keksinnön mukaisen DNA-rakenteen.
Lisäksi keksintö koskee geneettisesti muokattua transdu- soitua CTL:ää, joka kykenee tuhoamaan kohteena olevia kasvainsoluja MHC:stä riippumatta ja MHC:n rajoittamatta.
:·" 25 Keksinnön mukaan CTL tuottaa edellä identifioidun keksin- ·:**! nön mukaisen kimeerisen proteiinin. CTL transdusoidaan ·1·1. keksinnön mukaisella DNA: 11a, minkä vuoksi se kykenee il- • 1 mentämään mainittua DNA:ta ja tuottamaan mainitun DNA:n • ··· , koodaamaa proteiinia. Kohteena olevien kasvainsolujen tu- !!!_ 30 hoamisen edellytyksenä on, että näin tuotettu proteiini on t · · toiminnallinen, so. mainitun proteiinin antigeeninsitoja-domeenin on kyettävä tunnistamaan ja sitoutumaan kohteena 2 1 1 ···’ oleviin kasvainsoluihin ja ζ-domeenin on kyettävä laukai- V 1 semaan haluttu viesti CTL:ssä. Keksinnön mukaista CTL:ää 35 viljellään olosuhteissa, jotka mahdollistavat (suosivat) • · · ....: sisään viedyn DNA:n ilmentämistä, ja haluttaessa sen tuo- « • · • · 1 • · t • · · • · · • M a · 119191 19 tanto määritetään. Mainitun DNA:n pitkäaikainen ja kohonnut ilmentyminen on edullista.
Lisäksi keksintö koskee menetelmää CTL:n varustamiseksi 5 tarkasti määrätyllä kasvainsoluspesifisyydellä, joka on MHC:stä riippumatonta ja jota MHC ei rajoita, viemällä sisään mainittuun T-lymfosyyttiin DNA-rakenne, joka sisältää tunnistustoiminnon, välikedomeenin ja ζ-ketjun TCR:n vies-tinsiirtokomponenttina. DNA-rakenne voidaan panna CTL-so-10 luun DNA:n siirtomenetelmillä, jotka ovat alan asiantuntijalle selviä, esim. vektorijärjestelmällä, kuten virusta! muulla kuin virusvektorijärjestelmällä. Sopivia virus-vektoreita ovat retrovirus-, adenovirus- ja adenovirukseen liittyvät virusvektorit. Menetelmä soveltuu sekä in vivo 15 että in vitro -tilanteisiin. In vitro -sovellus on edullinen.
T-lymfosyyttiä viljellään tavanomaisissa olosuhteissa, joissa mainitun DNA-rakenteen ilmentyminen on mahdollista, 20 ja sen tuotanto määritetään. Mainitun DNA:n pitkäaikainen ja kohonnut ilmentyminen on edullista. Edullisesti CTL:ää viljellään IL-2:n läsnäollessa. Keksinnön mukainen trans-dusoitu CTL voidaan valikoida sopivan markkerin suhteen. Esimerkiksi transdusoitu CTL voidaan valikoida yhdessä
Mt· ' 1 25 transdusoidun neoresistenssimarkkerin perusteella, jos keksinnön mukainen DNA-rakenne siirretään retrovirusvekto- • · · * ',· rin kautta.
«M
·«·· t Lisäksi keksintö koskee sellaista ainekoostumusta, joka • t1 ,"·. 30 sisältää keksinnön mukaisen transdusoidun CTL:n. Sellainen koostumus sisältää esim. transdusoituja CTL-soluja, jotka tuottavat keksinnön mukaista proteiinia yhdessä tai seok- • · · ::: sena sopivan, esim. farmaseuttisesti hyväksyttävän, kanta- \ jän kanssa. Sellainen kantaja voi olla kiinteä tai neste- ·· · 35 mäinen kantaja. Koostumusta voidaan käyttää ex vivo, esim. *t2i tuhoamaan potilaan kehosta otetussa koostumuksessa (esi- • 1·. merkiksi ruumiinnesteessä tai kudoksessa) olevia ennalta • « · ·«« · · • · · 2 • ·· a · 20 119191 valikoituja kohdesoluja. Kohdesolujen tuhoamisen jälkeen (mikä on tarkastettava) koostumus pannaan uudelleen potilaan kehoon. Keksinnön mukaista koostumusta voidaan näin ollen käyttää kasvainten hoitoon tai apuaineena kasvainten 5 hoitoon.
Lisäksi keksintö koskee menetelmää valikoitujen kasvainso-lujen hajottamiseksi, jossa menetelmässä mainitut kasvain-solut saatetaan yhteyteen keksinnön mukaista kimeeristä 10 proteiinia tuottavien CTL-solujen kanssa. Sekä in vitro että in vivo -tilanteisiin käyttökelpoisessa menetelmässä kasvainsolu on antigeeninsitojadomeenin, joka on osa keksinnön mukaista kimeeristä proteiinia, kohteena.
15 On edullista käyttää isännän omia CTL-soluja, erityisesti silloin kun altistus ja interaktio tapahtuvat in vivo, mutta tarpeen mukaan OTL voi olla peräisin myös muista lähteistä. Muita lähteitä ovat esim. kudosviljelmä tai saman tai eri lajin toinen nisäkäsyksilö.
20 CTL-soluja esiintyy kaikkialla nisäkkään ruumiissa: kudok-sissa, lymfaattisessa järjestelmässä ja veressä. Nisäk- • · käästä valikoidaan ja otetaan sopivat CTL:t. Esimerkiksi • · CTL:ien valikoidaan olevan CD8+ periferaalisia lymfosyyt- • « * * 25 tejä, joita on viljelty in vitro IL-2:n läsnäollessa.
·«* ···· Vaihtoehtoisesti geenin transduktioon käytetään valikoi- • ·*· *·ϊ·* mattomia periferaalisia lymfosyyttejä. Haluttaessa isäntää ··· VΣ voidaan käsitellä siten, että stimuloitujen CTLrien määrä lisääntyy.
30 • · :***: Vielä keksintö koskee keksinnön mukaisten geenimuokattujen ··· *. CTL-solujen käyttöä syövän hoitamiseksi tarkoitettujen **“ lääkkeiden valmistamiseksi. Menetelmässä altistetaan väli- • · *··** koidut kasvainsolut CTL-soluille, jotka tuottavat keksin- :: : 35 non mukaista kimeeristä proteiinia. Tämän menetelmän in vitro (tarkoittaa ex vivo) -sovellus CTL-välitteisen so- • # lunhajotuksen edistämiseksi voi olla sellaisten kasvain-solujen valikoiva käsittely, jotka ovat peräisin syöpä- 21 119191 hoitoa tarvitsevasta nisäkkäästä, erityisesti ihmisestä. Esimerkki olisi keksinnön mukaisen CTL:n käyttö kasvain-solujen eliminoimiseen luuytimestä, joka on otettu potilaasta, esimerkiksi sädehoitoa saavasta potilaasta, ennen 5 kuin luuydin pannaan takaisin. Kasvainsolut hajoavat kas-vainsolujen ja keksinnön mukaisten CTL-solujen vuorovaikutuksen seurauksena. Otetaan myös huomioon, että keksinnön mukaista DNA:ta ilmentävät CTL:t tuotetaan DNA:n trans-duktiolla in vivo, esim. syövän hoitoa tarvitsevaan nisäk-10 kääseen.
Erityisesti keksintö koskee esimerkeissä kuvattuja spesifisiä suoritustapoja (esim. proteiinia, DNA:ta, CTL:ää ja niiden valmistusmenetelmiä). Seuraavat esimerkit kuvaavat 15 keksintöä, mutta eivät missään määrin rajoita sitä.
Lyhenteet: FCS: vasikan sikiön seerumi; LDH: laktaattide-hydrogenaasi; mAb: monoklonaalinen vasta-aine; MoMLV: Mo~ loneyn muriinin leukemiavirus; MoMLV-LTR: Moloneyn murii-20 nin leukemiaviruksen pitkä terminaalinen toisto, scFv: yksiketjuinen vasta-aine; SDS-PAGE: natriumdodekyylisul-f aattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi.
♦ · ♦ • · .. . Aineisto ja menetelmät • · · --- 11 * * 25 Solulinjat ja viljelyolosuhteet ··· ···* '·!.* Klooni 96 (C196) on H-2Kd-rajoitteinen sytotoksinen T-so- ··· *.· · lulinja, joka on peräisin C57BL/6-hiiristä (K. Eichmann et ai., J. Immunol. 147, 2075-2081 (1991)). C196:tta ja in- • · :#i#: 30 fektantteja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen :***: elatusaineessa (DMEM, Gibco) , johon on lisätty 10 % FCS:ää (Boehringer), 5 x 10“5 M 2-merkaptoetanolia, 10 mM HEPES- **' reagenssia, 2 mM L-glutamiinia ja 3 % vakioitua superna- • · *“·* tanttia, joka on saatu X63Ag8-653-plastosytoomasoluista, : 35 jotka on transfektoitu muriinin Il-2:n cDNA:lla (H. Kara- suyama ja F. Melchers, Eur. J. Immunol. 18, 97-104 • · (1988)). Ihmisen leukeemista T-solulinjaa Jurkat, retrovi-ruksen pakkauskykyisiä solulinjoja ΩΕ (J.P. Morgenstern ja 22 119191 H. Land, Nuc. Acids Res. 18, 3587-3596 (1990)) ja P317:ää (A.D. Miller ja G.J. Rosman, Biotechniques 7, 980-990 (1989) ) sekä infektantteja ja aktivoidulla ihmisen erbB-2-reseptorilla transfektoitua muriinin fibroblastisolulin- 5 jaa, NIH3T3#3.7:ää, viljellään DMEMrssä, johon on lisätty 10 % FCS-reagenssia. HC11R1#11 on hiiren nisäepiteelisolu-linja, joka on transfektoitu ihmisen erbB-2-proto-onkogee-nillä (N. E. Hynes et ai., Mol. Cell. Biol. 10, 4027-4034 (1990) ). Tätä solulinjaa kasvatetaan RPMI I640:ssä (Gib-10 co), johon on lisätty 10 % FCS:ää, 10 ng/ml epidermaalista kasvutekijää ja 5 pg/ml insuliinia.
Esimerkki 1: scFv(FRP5):sarana:zeta(ζ):n cDNA:n konstruointi 15
Konstruoidaan DNA, joka koostuu tunnistustoiminnosta, vä-likedomeenista ja ζ-ketjusta, joka toimii TCR/CD3-resep-torikompleksin viestityskomponenttina. Tunnistustoiminnosta vastaa scFv-domeeni. Tämä domeeni on peräisin monoklo-20 naalisesta vasta-aineesta FRP5 (EP-patenttihakemus 502 812). FRP5 on spesifinen erbB-2-reseptorin solunulkoiselle domeenille. scFv (FRP5) sisältää monoklonaalisen vasta-ai- • i ##i.j neen (mAb) raskaan ja kevyen ketjun muuntelevat domeenit • ·
.. . (VH ja VL) , jotka 15 aminohapon kytkysekvenssi (SEKV. ID
• ;* 25 NO:2) liittää yhteen. Tämä scFv-domeeni kykenee tunnista- ··· •**j maan erbB-2-reseptorin solunulkoisen domeenin (W. Weis et *·ί.' ai., Biotechnology 10, 1128-1132 (1992); W Weis et ai., ··· ·.· : Cancer Res. 15, 6310-6317 (1992)). Immunoglobuliinin ras kaasta ketjusta oleva johtosekvenssi lisätään scFv-domee-iV: 30 nin N-terminaaliin. scFv(FRP5):n cDNA liitetään lyhyeeseen :***· kytkytsekvenssiin, joka koodaa 59 aminohappoa CD8a-geenin ··· *. immunoglobuliinin kaltaisesta sarana-alueesta (R. Zomoyska *"* et ai., Cell 43, 153-163 (1985)). Solukalvon läpäisevä ja • · *·;·* viestitysdomeeni kuuluvat TCR:n ζ-ketjulle. Tämä ketju jj*: 35 vastaa TCR:n aktivoinnin jälkeisestä viestin välityksestä.
• · • · · • ··
Sellaista yksiketjuista vasta-ainetta FRP5 koodaava cDNA, joka on spesifinen erbB-2-molekyylin solunulkoiselle do- 23 119191 meenille (SEKV. ID N0:1), subkloonataan plasmidiin, joka sisältää immunoglobuliinin raskaan ketjun johtoalueen (LigH) . Sekä ζ:η cDNA että CD8a-sarana: n cDNA on saatu sy-totoksisen T-solulinjan C196 kokonais-RNA:sta käyttämällä 5 käänteisen transkription ja polymeraasiketjureaktion yhdistelmää (RT-PCR). MoMLV-käänteistranskriptaasia käytetään ensimmäisen juosteen cDNA-synteesiin. Reaktioissa ovat alukkeina 3' ζ-spesifinen oligonukleotidi 5813 (SEKV. ID NO:6) tai vastaavasti 3' CD8a-spesifinen oligonukleoti-10 di 8764 (SEKV. ID NO:7). Näitä cDNA-molekyylejä käytetään PCR-templaatteina ζ-alukeparilla 5812/5813 (SEKV. ID NO:t 8 ja 6), jotka tuovat käyttöön 5'XbaI- ja 3'Hindlll/Bglll-kohdan, ja CD8a-sarana-alukeparilla 8763/8764 (SEKV. ID NO:t 10 ja 8), jotka tuovat Xbal-kohdan molempiin päihin.
15 Ligh-scFv(FRP5):n DNA liitetään ζ:η cDNArhan aloittamalla aminohappotähteestä 28 (numerointi on A.M. Weissmanin ym. mukainen, Science 239, 1018-1021 (1988)) käyttämällä fuusioon Xbal-kohtaa. Tämän jälkeen CD8a-saranan cDNA, joka koodaa aminohappotähteitä 105-164 (numerointi R. Zomoyskan 20 ym. mukaan, Cell 43, 153-163 (1985)), insertoidaan Xbal-kohtaan ja sen oikea orientaatio tarkastetaan. Tuloksena saatu scFv: sarana: ζ : n cDNA-rakenne (SEKV. ID NO: 7) varmis- • · tmf j tetaan täydellisellä DNA-sekvensoinnilla ja lopuksi se • · . subkloonataan pLXSN-retrovirusvektorin ainoaan EcoRI-koh- • · · • ; 25 taan (A.D. Miller ja G.J. Rosman, supra), jolloin saadaan • · · ••j pL (scFv (FRP5): sarana: ζ) SN-rakenne . DNA:n ilmentymistä sää- • · t M.* telee 5' MoMLV-LTR. Plasmidissa on lisäksi neomysiinire- • · · V * sistenssin valintamarkkeri, jota ohjaa SV40:n aikainen promoottori (SN).
:Y: 30 • · pL (scFv: D3/D4 : ζ) SN : n kloonaus ·*· ··· **" Kun ensimmäinen molekyylirakenne sisältää välikkeenä suh- • · *···* teellisen lyhyen ja joustavan muriinin Lyt-2:n tai CD8a- : 35 molekyylin immunoglobuliinin kaltaisen sarana-alueen, toi- nen rakenne sisältää pidempänä ja jäykempänä välikkeenä • · kaksi kalvoproksimaalista immunoglobuliinin kaltaista muriinin L3T4- tai CD4-molekyylin domeenia, joita kutsutaan 24 119191 D3:ksi ja D4:ksi (S.J. Clark et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 1649-1653 (1987)). D3/D4:ää koodaava cDNA saadaan PCR:llä käyttämällä pcd-L3T4 4,25 -plasmidi-DNA:ta (D.R. Littman ja S.N. Gettner, Nature 325, 453-455 (1987)-5 ). Spesifinen alukepari #8761/#8762 monistaa CD4-mo- lekyylin aminohappotähteitä 184-370 koodaavat sekvenssit (P.J. Maddon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9155-9159 (1987)) tuoden molempiin cDNA-päihin Xbal-restriktio-kohdat. Tuote subkloonataan pL(FZ)SN-vektorin Xbal-koh-10 taan. Sen jälkeen, kun insertin oikea orientaatio on tarkastettu, tuloksena saadun sekvenssin identiteetti varmistetaan DNA-sekvensoinnilla. pL(F4Z)SN:n rakenne esitetään kuvassa 1.
15 Alukkeet L3T4/CD4D3/D4:n cDNA:n monistamiseen: 'Ylävirtaan' -5'Lyt-2/CD8-spesifinen oligonukleotidi #87611’: #8761: 5'-AGCTTCTAGAGTTTCAGAGCACAGCTCTCACGGCC-3' 20 'Alavirtaan' -3'Lyt-2/CD8-spesifinen oligonukleotidi #87 621): ..... #8762: 5 ' -TCGATCTAGAGTCTGGTTCACCCCTCTGG-3 ' • · —— ·1· · • · - .
, ^Xbal-restriktiokohdat on alleviivattu.
* 1 i • · • # ··· *··1 • 1 » • · · ·«· *«· • · · • f « « • · • » · • « · • 1 ·· · • · * · • Φ1 • · · ···· • · · • · • ♦ • · · • · • · « • · ♦ ·1· ♦ · • » · • ·· • · 119191 25
Esimerkki 2; scFv(FRP5);sarana;t:n DNA;n Ilmentäminen retrovirusoeenlslirron jälkeen pLXSN-vektorijärjestelmä kykenee ohjaamaan scFv(FRP5):sa-5 rana:£:n DNA:n tehokasta synteesiä sen jälkeen, kun se on transduktiolla siirretty sytotoksisiin T-soluihin, ja se mahdollistaa infektoitujen solujen G418-valikoinnin. Pysyvä muriinin CTL-linja, C196, tartutetaan esimerkin 1 pL-(scFv(FRP5):sarana:ζ)SN~rakenteella.
10
Ekotrooppinen pakkauskykyinen solulinja ΩΕ transfektoidaan kalsiumfosfaattisaostuksella pL(scFv(FRP5):sarana:ζ)SN-plasmidi-DNA:lla. Transfektoidut solut valikoidaan pysyvästi neomysiinianalogin G418 (Geniticin, 1 mg/ml, Gibco) 15 läsnäollessa. Virussupematantit otetaan talteen 48 tunnin kuluttua G418-resistenttien auttajasolujen yhteenkasautu-masta ja niitä käytetään infektoimaan amfotrooppinen pakkauskykyinen solulinja PA317 8 mg/ml:n polybreeniä läsnäollessa. Klonaaliset, korkean titterin tuottajalinjät saa-20 daan valikoimalla elatusaineessa, joka sisältää 1,0 mg/ml G418:aa. Näiden tuottajalinjojen superaatantteja käytetään infektoimaan C196-solut. Infektoitujen solujen kloonit, jotka on valittu scFv(FRPS):sarana:ζ:η DNA:n runsaan ilmentymisen perusteella, otetaan ja määritetään kimeeristen ...: 25 solun pintaproteiinien tuotantoa varten (esimerkki 3).
Klooni CFYZ.l saadaan kasvun perusteella 1,0 mg/ml:ssa *· t .. . G418:aa. Jurkat-solut infektoidaan käyttämällä samaa mene- • · * ; telmää, klooni JFYZ.4 saadaan kasvun perusteella G418:n • · · •••j pitoisuudessa 2,0 mg/ml.
*.:.s 30 • ·· *.1 1 Esimerkki 3: Solun pintaproteiinien biokemiallinen karak terisointi : a) Transdusoidulla CTL:llä tuotettujen kimeeristen scFv- i':1: (FRP5): sarana ^-proteiinien SDS-PAGE-analyysi 35 • · *·1, Esimerkin 2 valikoitujen kloonien solunpinta biotinoidaan, ne hajotetaan ja immunosaostetaan anti-ζ-mAb:llä. Pinnan * i • · · • · 1 · • · · ♦ ·♦ • · 119191 26 biotinointia varten 3 x 107 elävää solua pestään kolme kertaa biwa-puskurissa (PBS, 1 mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2) ja resuspendoidaan 1,5 ml:aan Sulfo-NHS-biotiinia biwa-pusku-rissa (Pierce, 0,5 mg/ml). Sen jälkeen, kun on inkuboitu 5 15 minuutin ajan 4 “C:ssa, reaktio sammutetaan lisäämällä 25 mM L-lysiiniä biwa-puskurissa. Solut pestään kolme kertaa sammutuspuskurissa (25 mM L-lysiiniä biwa-puskurissa) ja hajotetaan puskurissa, joka sisältää 1 * NP-40:tä, 150 mM NaCliia, 50 mM Tris/HCl:ää pH 8,0, 5 mM EDTAita, 1 10 mM PMSFtää, ja johon on lisätty proteaasi-inhibiittori- seos. Postnukleaarisia lysaatteja esipuhdistetaan yli yön Protein A Sepharosella (Pharmacia). Immuunisaostus tehdään lisäämällä 3 mg ζ-spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta H146-968, joka tunnistaa ihmisen ja hiiren ζ-ketjun C00H-15 pään, sitten inkuboidaan 3 tunnin ajan, minkä jälkeen in-kuboidaan 1 tunnin ajan Protein A Sepharosella. Sakka pestään neljä kertaa NET-TON-liuoksessa (650 mM NaCl:ia, 5 mM EDTA:ta, 50 mM Tris/HCl:ää, 0,5 % Triton X-100:aa, 1 mg/ml ovalbumiinia). Deglykosylaatiota varten sakat denaturoi-20 daan 5%:isessa SDS:ssä joko 10%:isen 2-merkaptoetanolin kanssa tai ilman 100 eC:ssa ja inkuboidaan 2000 U:n kanssa PNGase F:ää (Biolabs) 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Näytteitä keitetään joko ei-pelkistävässä tai pelkistävässä Laemmli-näytepuskurissa ja niille tehdään elektroforeesi 5-20%:i-25 silla SDS-PAGE-gradienttigeeleillä. Proteiinit siirretään PVDF-kalvolle (Millipore) ja blokataan PBS-T:ssä (PBS, 0,4 • · % Tween-20:tä), joka sisältää 5 % kuorittua maitojauhetta • · j (Fluka). Kalvoa inkuboidaan yhden tunnin ajan PBS-T:n •**i kanssa, joka sisältää piparjuuriperoksidaasi-streptavidii- | ♦ · 30 nia (HRP-Strep, Southern Biotechnology, 1 : 5000). Sen | * · .* * jälkeen, kun kalvoa on pesty neljä kertaa 7 minuutin ajan PBS-T:ssä, täplä kehitetään käyttämällä ECL-kemolumine-*·,:.*· senssireagenssia (Amersham). Pelkistävissä olosuhteissa tehty immuunisakkojen SDS-PAGE-analyysi paljastaa sarjan ,·*··, 35 vyöhykkeitä, joiden ilmeinen molekyylipaino on noin 48-65 f * ***. kDa, infektoitujen solujen lysaateista (klooni CFYZ.l),
iMII
mutta ei parentaalisolujen (C196-soluja) lysaateista.
• · • · ♦ φ · · ··· · * · « · · • ♦· • ♦ 119191 27
Kooltaan 48 kDa: n vyöhyke vastaa scFv(FRPS):sarana^-proteiinia, jonka laskennallinen molekyylipaino on 48,7 kDa. Mainitun proteiinin aminohapposekvenssi esitetään SEKV. ID N0:5:ssä. Mainitussa sekvenssiluettelossa monoklonaalises-5 ta vasta-aineesta FRP5 saatu tunnistusosa ulottuu aminohaposta asemassa 6 (Gin) aminohappoon asemassa 240 (Ile), CD8a:sta saatu sarana-alue ulottuu aminohaposta asemassa 245 (Ile) aminohappoon asemassa 304 (Phe), ja ζ-ketju ulottuu aminohaposta asemassa 307 (Asp) aminohappoon ase-10 massa 443 (Arg). Suurmolekyylipainoisia lajeja ilmestyy scFv:n ja sarana-alueen kompleksiglykosylaation seurauksena. Endoglykosidaasi PNGase F:llä suoritetun deglykosylaa-tion seurauksena saadaan yksinkertainen proteiinimalli ja ilmeinen molekyylipaino alenee noin 47 kDa:iin. Endogeeni-15 nen ζ-ketju todetaan 16 kDa:n vyöhykkeenä (ennustettu 16,3 kDa) infektoimattomissa ja infektoiduissa soluissa. Kun SDS-PAGE-analyysi suoritetaan ei-pelkistävissä olosuhteissa, havaitaan sekä disulfisidoksiset scFv:sarana:ζ-homodi-meerit, joiden ilmeinen molekyylipaino on noin 96 kDa, 20 että scFv(FRP5):sarana:ζ-molekyylien heterodimeerit, joissa on endogeeninen ζ ja joiden ilmeinen molekyylipaino on noin 64 kDa. PNGase F -käsittely alentaa hieman näiden kahden vyöhykkeen molekyylipainoja. Todettu 32 kDa:n vyöhyke vastaa CTL:n endogeenisiä ζ-ζ-homodimeerejä.
·· 25 b) scFv(FRPS):sarana:ζ-proteiinia tuottavien T-solujen virtaussytometrinen analyysi • · scFv(FRP5): sarana ^-proteiinin solun pinnan ilmentyminen ***! ja erbB-2-reseptorin sidosaffiniteetti transdusoiduissa 30 C196 CTL-soluissa ja transdusoiduissa Jurkat-soluissa | · * ·' * varmistetaan virtaussytometrialla.
«
Yksisolususpensiot, joissa on 5 x 105 elävää solua (Jur- */ · kat-soluja, JFYZ.4-soluja, C196-soluja, CFYZ.1-soluja), .·*··, 35 värjätään erbB-2-proteiinin puhdistetun solunulkoisen do- • · t|*‘. meenin kanssa (erbB-2ecd, ilmennetään Sf9-hyönteissoluissa • · . käyttämällä bakulovirusilmentymisvektoria; Disis et ai., • • t · • · « «·» » « * • * * • f · • « 119191 28
Cancer Res. 54, 16-20 (1994)) yhden tunnin ajan, ja sen jälkeen FITC-konjugoidun anti-erbB-2 monoklonaalisen vasta-aineen FSP77 (EP-patenttihakemus 502 812) kanssa 45 minuutin ajan 4 °C:ssa 100 pl:ssa PBS:ää, joka sisältää 1 5 % BSA:ta ja 0,1 % natriumatsidia. Myös FSP77 on spesifinen erbB-2-reseptorin solunulkoiselle domeenille, mutta se tunnistaa eri epitoopin mAb FRP5:stä (I.M. Harwerth et ai., J. Biol. Chem. 21, 15160-15167 (1992)). Saadaan 10 000 eteenpäin sironta/sivusironta -valikoivaa (gated) 10 elävää solua ja analysoidaan virtaussytometrialla, joka paljastaa puhdistetun, liukoisen erbB-2-reseptorin so-lunulkoisen domeenin sitoutumisen transdusoituihin T-so-luihin JFYZ.4 ja CFYZ.l, mutta ei infektoimattomiin Jur-kat- tai C196-soluihin.
15
Sarana-alue antaa scFv-osalle joustavuuden ja saavutettavuuden ja se on välttämätön edellytys erbB-2-reseptorin solunulkoisen domeenin sitoutumiselle scFv-domeeniin. Myös CD4:n D3D4:n insertio mahdollistaa sitoutumisen. Sellainen 20 rakenne, jossa tutkitaan scFv-domeenin suoraa fuusiota ζ-ketjuun, ilman sarana-aluetta tai välikettä, johtaa sellaiseen pintareseptoriin, joka ei voi sitoutua erbB-2-proteiiniin.
;··: 25 Esimerkki 4: scFv(FRP5); sarana:£-fuusioproteiinln viestin ....: välitys T-solujen, joihin on pantu sopivaa kalsiumia kelatoivaa • · 9\m fluoresoivaa väriainetta, solunsisäinen kalsium- (Ca2*)- • **** konsentraatio mitataan sen jälkeen, kun soluja on inkuboi- t * · l[\ 30 tu liukoisen erbB-2-reseptorin kanssa. Tätä tarkoitusta | · · ·' * varten viljellyt JFYZ.4-infektantit ja Jurkat-solut sus- pendoidaan 1 x 107/ml RPMI 1640:aan, johon on lisätty 2 % FCS:ää ja 5 mM Indo-l/AM:ää (Calbiochem) (M. Lopez et ai., : Cytometry 10, 165-173 (1989)), ja pyöritetään 45 minuutin .··. 35 ajan 37 °C:ssa. Kahden pesukerran jälkeen 3 x 10s solua inkuboidaan jäillä 2 mg:n kanssa puhdistettua erbB-2eod:ta.
• * . Reaktio pannaan alkuun 37 eC:ssa lisäämällä yhtäaikaa 5 mg • · * • · · • ♦ · ♦ ·· · • · • · · • ·· « · 119191 29 anti-erbB2 mAb FSP77:ää, mitä seuraa ristisitoutuminen vuohen anti-hiiri-ig-antiseerumin (GaM Ig, Southern Biotechnology) kanssa. Kontrollina solut laukaistaan lisäämällä anti-ihmis-CD3e mAb:tä (Serve) ja GaM lg:tä. Kal-5 siumvirtaa seurataan 15 minuutin ajan virtaussytometrillä mittaamalla emissio 405 ja 525 nm:ssä.
Ristisitoutuminen johtaa nopeaan solunsisäisen kalsiumin lisääntymiseen JFCZ.4-soluissa, mutta ei parentaalisissa 10 Jurkat-soluissa, mikä on verrattavissa tulokseen, joka saatiin CD3-kompleksin ristisitoutumisella anti-CD3e mAb:n kanssa infektoimattomissa soluissa. Tämä osoittaa sen, että solunsisäinen viestinvälitys sysätään alkuun scFv(FRP-5):saranaίζ-proteiinin ristisitoutumisen jälkeen solunul-15 koisen ligandidomeenin kautta, ja että scFv(FRP5):sarana: ζ-proteiini on toiminnallisesti aktiivinen.
Esimerkki 5: In vitro -svtotoksisuusmääritvs Infektoltujen C196- (CFYZ.l) -solujen sytolyyttinen aktli-20 visuus määritetään in vitro. Kohdesoluina käytetään onko-geenisesti transformoituja hiiren NIH/3T3-fibroblasteja ja HCll-epiteelisoluja, jotka ilmentävät ihmisen erbB-2-re-septoria (N.E. Hynes et ai., supra). Solun hajoamisen mittana käytetään LDH:n vapautumista näistä soluista (T. Dec-:**: 25 ker ja M.L. Lohmann-Matthes, J. Immunol. Methods 115, 61- ».·: 69 (1988)).
·1 · • · « • · • a
Sytotoksisuusmääritys suoritetaan phenol red free -alus- * talla, johon on lisätty 4 % vakioitua supernatanttia, joka 30 sisältää yhdistelmä-muriini-Il-2:ta (rmIl-2, recombinant ** 1 murine 11-2, katso edellä). Kohdesoluja lisätään vakiomää rä (7500/kolo) efektorien (CFYZ.1-soluja) 2-kertaiseen *.:.1 sarjalaimennokseen, mitä seuraa kahdeksan tunnin inkuboin- ·»· * ti 37 9C:ssa ja 5%:isessa C02:ssa. Kaikki laimennokset .···. 35 suoritetaan kolmena kappaleena. LDH-pitoisuus määritetään supernatantin 50 μ1:η erästä käyttämällä CytoTox 96 -mää- • 1 ritystä (Promega) (T. Decker ja M.L. Lohmann-Matthes, sup-
St1 • · 1 ··· 1 • · · • · • · 30 119191 ra). LDH-aktiivisuutta, joka on mitattu kohdesolujen hajoamisen jälkeen 0,4%:isella Triton X-100:lla, pidetään 100 %:na. Mitatut kokeelliset arvot korjataan efektori- ja kohdesoluista tapahtuvan spontaanin LDH-vapautumisen suh-5 teen. Infektoidut C196-solut/ jotka ilmentävät scFv(FRP-5): sarana^-rakennetta, hajottavat tehokkaasti erbB-2:ta ilmentävät NlH/3T3-solut tai HCll-solut efektori- ja kohdesolujen 1 ja 10 välisessä suhteessa. Ihmisen erbB-2-reseptorilla transfektoitujen epiteeli- ja fibroblastikoh-10 desolujen hajoaminen tapahtuu MHC:n rajoittamattomalla tavalla, joka ei ole erotettavissa normaalista antigeenispe-sifisestä solun sytotoksisuudesta. Sitä vastoin solun hajoamista ei havaita silloin, kun efektoreina käytetään pa-rentaalisia C196-soluja. Monoklonaalinen vasta-aine FRP5 15 ja siitä saatu scFv-domeeni ovat spesifisiä ihmisen erbB-2-molekyylille, eivätkä ne tunnista hiiren homologia, jota ilmennetään matalalla tasolla molemmissa solulinjoissa. Tämän vuoksi solun hajoamista ei havaita, kun transfektoi-mattomia NIH/3T3-soluja tai HCll-soluja inkuboidaan sel-20 laisten T-solujen kanssa, jotka ilmentävät scFv(FRP5):sarana :ζ-rakennetta.
Esimerkki 6: Kasvaimen vastainen aktiivisuus in vivo ;*·· 25 Transdusoitujen CTL-solujen (infektoituja Cl96-soluja) ···*· kasvaimen vastaisen aktiivisuuden määrittämiseen in vivo ·*·*· käytetään kahta koejärjestelyä. Ensimmäisessä järjestelys- sä 5 x 105 NIH3T3#3.7-kasvainsolua sekoitetaan 5 x 106 *,·, kanssa CFYZ.l-soluja tai parentaalisia C196-soluja (efek- I « * •V. 30 torin suhde kohteeseen 1:10) 0,1 ml:ssa elatusainetta, ja *· · r • · * heti sen jälkeen seos injektoidaan ihon alle (s.c.) pal jaiden (nude) Balb/c-hiirien oikeaan kylkeen (H.J. Winn, :.ί.’ J. Immunol. 86, 228-234 (1961)). Kasvainten kasvua seura-
Ml *.· · taan kaliiperimittauksin. Kontrollina injektoidaan pelkäs- ,··. 35 tään NIH3T3#3.7-kasvainsoluja. Jokainen ryhmä koostuu vii- t’**· destä eläimestä. Toisessa järjestelyssä paljaiden Balb/c- · . hiirien oikeaan kylkeen pannaan s.c. 4 x 105 NIH3T3#3.7- • · • · · • · ·
Ml » • · • * ί • · 119191 31 kasvainsoluja. Neljäntenä ja viidentenä päivänä, kun kasvain on käsin tuntuva, parentaalisia C196-soluja ja CFYZ-.1-soluja injektoidaan häntälaskimon sisään (1 x 107 solua 0,2 ml:ssa elatusainetta). Intraperitoneaalisesti annetaan 5 500 U rhll-2:ta (Hoffman-La Roche) 0,2 ml:ssa PBS:ää nel jäntenä, viidentenä ja kuudentena päivänä. Kasvainten kasvua seurataan kaliiperimittauksin. Kontrolleina injektoidaan NIH3T3#3.7-soluja sekä ilman 11-2:ta että sen kanssa. Jokainen ryhmä koostuu viidestä eläimestä. Ihmisen 10 erbB-2-onkogeenillä transformoidut NIH/3T3-solut johtavat nopeaan kasvainten muodostukseen ihonalaisen ruiskeen jälkeen paljaisiin Balb/c-hiiriin, joilta puuttuu kateen-korva (athymic). CFYZ.1-infektanttien ja kasvainsolujen yhtäaikainen anto estää täysin kasvainten muodostumisen 7 15 päivään asti. Infektoimattomien parentaalisten C196-solu-jen annolla ei kuitenkaan ole vaikutusta kasvainsolujen kasvuun. Samanlainen tulos saadaan, kun paljaisiin hiiriin pannaan ensin NIH/3T3-erbB-2-kasvainsoluja ja sen jälkeen niitä käsitellään CFYZ.1-soluilla yhdessä eksogeenisen II-20 2:n kanssa. Transdusoitujen CTL:ien anto hidastaa selvästi kasvainsolujen kasvua seitsemän päivän aikana, mikä näin osoittaa systeemisen in vivo -vaikutuksen. Soluilla on kyky löytää kasvain, aktivoitua ja osoittaa sytolyyttinen aktiivisuutensa eri kohtaan annettuna.
:··: 25 ····; Nämä tulokset osoittavat, että spesifisyys ja näin ollen transdusoitujen CTL:ien sytolyyttinen efektorikoneisto φ · voidaan tehokkaasti suunnata uudelleen ennakolta määrltet-tyä pinta-antigeenia, erbB-2-reseptoria, vastaan, jolla on t * i 30 tärkeä merkitys monien ihmisen adenokarsinoomien, esimer- I s · * kiksi rinta-, munasarja-, maha- ja koolonsyövän, etiologiassa. Kohdennetun T-soluvaikutuksen periaatetta pidetään * · · >» siksi käyttökelpoisena terapeuttisena lähestymistapana, ja *.! * yleensä sitä voidaan soveltaa sellaisten kasvainsolujen ."* 35 eliminaatioon, jotka ilmentävät pinta-antigeenia korkeam- ··· pina tasoina kuin normaalit solut. Rakenne sallii sellais- • · ten CTL:ien tuottamisen, joissa on monia haluttuja spesi- • * · »vt ··· · • · • · · • ·* • · 119191 32 fisyyksiä, vaihtamalla scFv-osa ja korvaamalla se millä tahansa olemassa olevalla antigeenin tunnistustoiminnolla, joka on saatu spesifisestä monoklonaalisesta vasta-aineesta. Tehokkaiden siirtojärjestelmien, esim. retrovirusvek-5 torien, käyttö mahdollistaa scFv:sarana:ζ:η DNA:n siirron solutyyppeihin, joita ei ole helppo transfektoida.
Talletustiedot:
Hybridoomasolulinjat, jotka tuottavat vasta-aineita FRP5, 10 FSP16, FSP77 ja FWP51, on talletettu talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, UK) 21. marraskuuta, 1990, talletusnumeroilla 90112115, 90112116, 90112117 ja vastaavasti 90112118.
15
Piirrosten lvhvt kuvaus:
Kuva 1: pL(F4Z)SN-retrovirusvektorin rakenne. cDNA, joka koodaa CD4:n immunoglobuliinin kaltaisten D3- ja D4-domee-nien aminohappotähteitä 184-370, saadaan PCR:llä ja sub-20 kloonataan PL(FX)SN-vektorin Xbal-kohtaan. Fuusiorajojen aminohapposekvenssit esitetään yksikirjaimisin koodein.
··1« * · ·» · • 1 1 • 1 • · ·· ···· « 1 < ( · · «·« • m· f · · I · « • « · 1 * « · ·«« « ·· • · · * · · • · · * · • · « • · • » t a · • · t • ·· · · • » » φ ·· • · 119191 33
SEKVENSSILISTAUS
(1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA:
(A) NIMI: CIBA-GEIGY AG
(B) KATU: Klybeckstr. 141 (C) KAUPUNKI: Basel
(E) MAA: SVEITSI
(F) POSTINUMERO (ZIP): 4002 (G) PUHELIN: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Bifunktionaalinen proteiini, valmistus ja käyttö (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 11 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, ver sio #1.25 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID N0:1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 748 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen •
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
#···1 2 3 / (ix) OMINAISPIIRRE: • · : (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi * ej, (B) SIJAINTI: 9..728 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote1 "scFv(FRP)5" • I » · I · · • a1 iji (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l: AAGCTTCT CAG GTA CAA CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAA CTG AAG AAG CCT 50 j1;1· Gin val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro 2 % 1 S 10 3 : : ··· • 1 s .1· • 1 · ··· · • · • · · S · • · 119191 34 GGA GAG ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCC TCT GGG TAT CCT TTC AC A 98
Gly Glu Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 15 20 25 30 AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA CAG GGT TTA AAG 146
Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys 35 40 45 TGG ATG GGC TGG ATT AAC ACT TCC ACT GGA GAG TCA ACA TTT GCT GAT 194
Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp 50 55 60 GAC TTC AAG GGA CGG TTT GAC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AAC ACT 242
Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr 65 70 75 GCC TAT TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AGT GAA GAC ATG GCT ACA TAT 290
Ala Tyr Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr 80 85 90 TTC TGT GCA AGA TGG GAG GTT TAG CAC GGC TAC GTT CCT TAC TGG GGC 338
Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly 95 100 105 110 CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTT TCC TCT. GGC GGT GGC GGT TCT GGT GGC 386
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 GGT GGC TCC GGC GGT GGC GGT TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CAC 434
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gin Leu Thr Gin Ser His 130 135 140 AAA TTC CTG TCC ACT TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG 482 !**! Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser He Thr Cys Lys ....: 145 150 155 • · !V. GCC AGT CAG GAT GTG TAT AAT GCT GTT GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA 530 i ·* Ala Ser Gin Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro ·:* 160 165 170 ···· • GGA CAA TCT CCT AAA CTT CTG ATT TAC TCG GCA TCC TCC CGG TAC ACT 578 l*i\ Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr ·' * 175 180 185 190 • t GGA GTC CCT TCT CGC TTC ACT GGC AGT GGC TCT GGG CCG GAT TTC ACT 626
Gly val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr ,*!*. 195 200 205 • · · .···. TTC ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT 674 phe Thr He Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys •j··: 210 215 220 * • · • · · I · · • ·· · « t • ft · • ·· • * 119191 35 CAG CAA CAT TTT CGT ACT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAA TTG 722
Gin Gin His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 GAG ATC TAGCTGATCA AAGCTCTAGA 748
Glu lie 240 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 240 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pto Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met ‘35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr ...S 65 70 75 80 • # ·*··; Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys . 85 90 95 • · ♦ • a • ·
Ala Arg Trp Glu Vai Tyr His Gly Tyr Vai Pro Tyr Trp Gly Gin Gly ···· 100 105 110 J * t VS Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly *.* ! 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser His Lys Phe :130 135 140 a·· • tl ' Leu Ser Thr Ser Vai Gly Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 • · * · <#"j Gin Asp Vai Tyr Asn Ala Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin *·’" 165 170 175 a · • · · • · · ··· * a * % 4 · • ·· • · 119191 36
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val 180 185 190
Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin 210 215 220
His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie 225 230 235 240 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 748 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 9..728 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "scFv(FWP51)" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: AAGCTTCT CAG GTA CAA CTG CAG CAG TCT GGG GOT GAG CTG GTG AGG CCT 50
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu vai Arg Pro * * 1 5 10 „ , GGG ACT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GAT TAC ACC TTC ACC 98 ; Gly Thr Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr .;. 15 20 25 30 ···· t AGC TAC TGG ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAA 146
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu *#* * 35 40 45 TGG ATT GGT ATG ATT GAT CCT TCA GAC AGT GAA ACT CAA TAC AAT CAA 194 } Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Gin Tyr Asn Gin 50 55 eo *.! 1 ATG TTC AAG GAC AAG GCC GCA TTG ACT GTA GAC AAG TCC TCC AAT AC A 242 ϊ ' Met Phe Lys Asp Lys Ala Ala Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Asn Thr 65 70 75 t * * • · • · · • · · »«· t t 9 • * · • #* 9 · 37 11 9191 GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT 290
Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 80 85 90 TAC TGT GCA AAA GGG GGG GCC TCT GGG GAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG 338
Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 95 100 105 110 GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTT TCC TCT GGC GGT GGC GGT TCT GGT 386
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC GGT TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT 434
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gin Leu Thr Gin Ser 130 135 140 CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT CTG GGA GGC GAA GTC ACC ATC ACT TGC 482
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Glu Val Thr He Thr Cys 145 150 155 AAG GCA AGC CAA GAC ATT AAG AAG TAT ATA GCT TGG TAC CAA CAC AAG 530
Lys Ala Ser Gin Asp He Lys Lys Tyr He Ala Trp Tyr Gin His Lys 160 165 170 CCT GGA AAA AGT CCT CGG CTA CTC ATA CAC TAC ACA TCT GTA TTA CAG 578
Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu He His Tyr Thr Ser Val Leu Gin 175 180 185 190 CCA GGC ATC CCA TCC AGG TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT 626
Pro Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr 195 200 205 TCC TTC AGC ATC CAC AAC CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT 674 ϊ*’ϊ Ser Phe Ser He His Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr . 210 215 220 • ft·*· ft ft JVj TGT CTA CAT TAT GAT TAT CTG TAC ACG TTC GGA GGG GGC ACC AAG CTG 722 • *’ Cys Leu His Tyr Asp Tyr Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu ·:· 225 230 235 ftftfft » M.'· GAG ATC TAGCTGATCA AAGCTCTAGA 748
Glu He * ’ 240 Ϊ (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: »ft· *T: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 240 aminohappoa i***: (B) TYYPPI: aminohappo ***· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 4ft· * r x ' ft · • ft ft ft ft « ft ft · ft*· ft ft ft ft · · ft «ft ft · 119191 38 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS; SEKVENSSI ID NO:4;
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Gin Tyr Asn Gin Met Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ala Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ala Ser Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser 130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Glu Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala 145 150 155 160
Ser Gin Asp Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly ϊ»·ί 165 170 175 •
Lys Ser Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Vai Leu Gin Pro Gly :V. 180 185 190 « · • · ·" Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe 195 200 205 i:; • •t j1!‘« Ser Ile His Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu *’ 1 210 215 220
His Tyr Asp Tyr Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 «•t • · · # Ψ · ft (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1479 eraäsparia ϊ f » » t«f 1 »
Af· • ·· « 1 119191 39 (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 40..1422 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote- "johto-scFv(FRP5): lyt-2 sarana:zeta" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO*.5: GAATTCGGCA CGAGCTTAAG GCACCACTTC TTAGACATC ATG GOT TGG GTG TGG 54
Met Ala Trp Vai Trp 1 5 ACC TTG CTA TTC CTG ATG GCA GCT GCC AAA GTG CCC AAG CAG ATC CAG 102
Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Lys Vai Pro Lys Gin Ile Gin 10 15 20 TTG GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AAG 150
Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Vai Lys 25 30 35 ATC TCC TGC AAG GCC TCT GGG TAT CCT TTC ACA AAC TAT GGA ATG AAC 198
Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 40 45 50 TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA CAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATT 246
Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile 55 60 65 ’*’** AAC ACC TCC ACT GGA GAG TCA ACA TTT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG 294 ·:··· Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg 70 75 80 85 • · · » · TTT GAC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AAC ACT GCC TAT TTG CAG ATC 342 phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Ile : ;*; 90 95 100 • · · *·.·* · AAC AAC CTC AAA AGT GAA GAC ATG GCT ACA TAT TTC TGT GCA AGA TGG 390
Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp 105 110 115 » * · *";* GAG GTT TAC CAC GGC TAC GTT CCT TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC 438 V : Glu Vai Tyr His Gly Tyr Vai Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai • 120 125 130 • · • ♦ • · · • * • · • · · * · « • · · · • · * · · « · · * ♦ 119191 40 ACC GTT TCC TCT GGC GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT GGC TCC GGC GGT 486
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly GXy Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 135 140 145 * GGC GGT TCT GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CAC AAA TTC CTG TCC ACT 534
Gly Gly Ser Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser His Lys Phe Leu Ser Thr 150 155 160 165 TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGO ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT GTG 582
Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val 170 175 180 TAT AAT GCT GTT GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT CCT AAA 630
Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys 185 190 195 CTT CTG ATT TAC TCG GCA TCC TCC CGG TAC ACT GGA GTC CCT TCT CGC 678
Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 200 205 210 TTC ACT GGC AGT GGC TCT GGG CCG GAT TTC ACT TTC ACC ATC AGC AGT 726
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser 215 220 225 GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG CAA CAT TTT CGT 774
Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr p'he Cys Gin Gin His Phe Arg 230 235 240 245 ACT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAA TTG GAG ATC AAA GCT CTA 822
Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Ala Leu 250 255 260 ···* GAG ATC AGC AAC TCG GTG ATG TAC TTC AGT TCT GTC GTG CCA GTC CTT 870 . Glu He Ser Asn Ser Val Met Tyr Phe Ser Ser Val Val Pro Val Leu 265 270 275 • a · • · · ·* CAG AAA GTG AAC TCT ACT ACT ACC AAG CCA GTG CTG CGA ACT CCC TCA 918 ·;· Gin Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser 280 285 290 • · · • · · ··* CCT GTG CAC CCT ACC GGG ACA TCT CAG CCC CAG AGA CCA GAA GAT TGT 966 *·* ’ Pro .Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gin Pro Gin Arg Pro Glu Asp Cys 295 300 305 • CGG CCC CGT GGC TCA GTG AAG GGG ACC GGA TTG GAC TTT CTA GAG GAT 1014
Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Leu Glu Asp vt * 310 315 320 325 * * * · *···* CCC AAA CTC TGC TAC TTG CTA GAT GGA ATC CTC TTC ATC TAC GGA GTC 1062 ·;·*: Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly He Leu Phe He Tyr Gly Val . 330 335 340 ! .*; • · * ··· · • * • · · • *· • · 41 119191 ATC ATC ACA GCC CTG TAO CTG AGA GCA AAA TTC AGO AGG AGT GCA GAG 1110 lie lie Thr Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu 345 350 355 ACT GCT GCC AAC CTG CAG GAC CCC AAC CAG CTC TAC AAT GAG CTC AAT 1158
Thr Ala Ala Asn Leu Gin Asp Pro Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 360 365 370 CTA GGG CGA AGA GAG GAA TAT GAC GTC TTG GAG AAG AAG CGG GCT CGG 1206
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg 375 380 385 GAT CCA GAG ATG GGA GGC AAA CAG CAG AGG AGG AGG AAC CCC CAG GAA 1254
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn Pro Gin Glu 390 395 400 405 GGC GTA TAC AAT GCA CTG CAG AAA GAC AAG ATG GCA GAA GCC TAC AGT 1302
Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gin Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 410 415 420 GAG ATC GGC ACA AAA GGC GAG AGG CGG AGA GGC AAG GGG CAC GAT GGC 1350
Glu He Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 425 430 435 CTT TAC CAG GGT CTC AGC ACT GCC ACC AAG GAC ACC TAT GAT GCC CTG 1398
Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 440 445 450 CAT ATG CAG ACC CTG GCC CCT CGC TAACAGCCAG GGCATTTCTC CCTCACGGGC 1452
His Met Gin Thr Leu Ala Pro Arg 455 460 AGATCCCCGG GTACCGAGCT CGAATTC 1479 "*· (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: :***: (A) PITUUS: 461 aminohappo I (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · * » I f (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:6: • * · • · · • · • · * *.* ’ Met Ala Trp Vai Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Lys Vai 15 10 15 • · • ·
Pro Lys Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro 20 25 30 * · j.j ϊ Gly Glu Thr Vai Lys life Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr : 35 40 45 • ·· • · 119191 42
Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys 50 55 60
Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp 65 70 75 80
Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr 85 90 95
Ala Tyr Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr 100 105 110
Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser His 145 150 155 160
Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys 165 170 175
Ala Ser Gin Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 180 185 190
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr 195 200 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr 210 215 220 , Phe Thr lie. Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys :··: 225 230 235 240 * * 1 Gin Gin His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu I1.1; 245 250 255 • · >#'j' Glu He Lys Ala Leu Glu He Ser Asn Ser Val Met Tyr Phe Ser Ser **'·. 260 265 270 • · · « 1 · • 1 1 ·’·’· Val Val Pro Val Leu Gin Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val * 275 280 285
Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gin Pro Gin 290 295 300 • · « * 1 1 • · · \ Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu 305 310 315 320 • · ··1 *:2: Asp Phe Leu Glu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly He Leu 325 330 335 • · • · • » · »•I · · • 1 · • 1· 2 4 4 119191 43
Phe Ile Tyr Gly Vai Ile Ile Thr Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe 340 345 350
Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gin Asp Pro Asn Gin Leu 355 360 365
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Vai Leu Glu 370 375 380
Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg 385 390 395 400
Arg Asn Pro Gin Glu Gly Vai Tyr Asn Ala Leu Gin Lys Asp Lys Met 405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Thr Leu Ala Pro Arg 450 455 460 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 443 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7: ··«· » · * · ·
Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu : f 1 5 10 15 • f · ["·, Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 ··· ♦ · ·
Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 « V..* Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala Asp Asp Phe 50 55 60 .···. Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr *···* 65 70 75 80 *· · • • f • · ! * · · mi · • · • · · • M • · 119191 44
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr TVr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Trp Glu Vai Tyr His Gly Tyr Vai Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser His Lys Phe 130 135 140
Leu Ser Thr Ser Vai Gly Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160
Gin Asp Vai Tyr Asn Ala Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 165 170 175
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Vai 180 185 190
Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205
Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Phe Cys Gin Gin 210 ' 215 220
His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240
Lys Ala Leu Glu Ile Ser Asn Ser Vai Met Tyr Phe Ser Ser Vai vai 245 250 255 * * * * , Pro Vai Leu Gin Lys Vai Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Vai Leu Arg *:··: 260 265 270 »t · ί ·* Thr Pro Ser Pro Vai His Pro Thr Gly Thr Ser Gin Pro Gin Arg Pro ··· 275 280 285 • · ®·
Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Vai Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe 290 295 300 * I »
Leu Glu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile . 305 310 315 320 • · · • · · • · ·
Tyr Gly Vai Ile Ile Thr Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg V * 325 330 335 *...* Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gin Asp Pro Asn Gin Leu Tyr Asn 340 345 350 ϊ .·. Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Vai Leu Glu Lys Lys 355 360 365 • f • · · • ·· • · 119191 45
Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn 370 375 380
Pro Gin Glu Gly val Tyr Asn Ala Leu Gin Lys Asp Lys Met Ala Glu 385 390 395 400
Ala Tyr Ser Glu lie Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 405 410 415
His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 420 425 430
Asp Ala Leu His Met Gin Thr Leu Ala Pro Arg 435 440 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 41 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8: CTGAAAGCTT AGATCTGCCC GTGAGGGAGA AATGCCCTGG C 41 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . (A) PITUUS: 35 emäsparia :"! (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · · • 4
‘ : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
444 a M·· • • I * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9: « · · • 4 · TCGATCTAGA AAGTCCAATC CGGTCCCCTT CACTG 35 J · · (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: • 4 · • 44 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 4 f 4 • 4 4 444 4 4 4 4 4 4 4 44 4 · 119191 46
(ii) MOLEKYYLITYYPPX: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10: GATCTCTAGA GGATCCCAAA CTCTGCTACT TGC 33 (2) SEKVENSSIN ID NO:11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11: TCGATCTAGA GATCAGCAAC TCGGTGATGT ACTTCAG 37 *··* • · * * · »« · * * I · * · • I» «*· • * · • « · ««· • · · « · · : M· • * f ♦ · * * f ··· « * • « *«« f • · • · » · * • · · • *« · t f • * · • t» • *

Claims (15)

  1. 47 119191
  2. 1. Bifunktionaalinen proteiini, joka sisältää: 1. yksiketjuisen vasta-aineen, joka on saatu sopivaa 5 kasvainsolun antigeeniä vastaan suunnatusta monoklo- naalisesta vasta-aineesta, 2. sarana-alueen, joka käsittää noin 40 - noin 200 aminohappoa, ja joka on liitetty yksiketjuisen vasta-aineen VL-domeeniin, ja 10 3) toiminnallisen zeta- (ζ)-ketjun, joka saadaan T- solun antigeenireseptorista (TCR), ja joka on liitetty sarana-alueeseen.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen bifunktionaalinen prote-15 iini, tunnettu siitä, että sarana-alue on liitetty yksiket juisen vasta-aineen VL-domeenin C-terminaaliin.
  4. 3. DNA, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista bifunktionaalista proteiinia. 20
  5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA, joka koodaa prote-iinia, joka on tunnettu siitä, että sarana-alue on immu- • · . noglobuliinin kaltainen sarana-alue. • · ·· · • · · * i 25 5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen DNA, joka koodaa ·· · ··! proteiinia, joka on tunnettu siitä, että toiminnallinen ζ- • · · ketju sisältää solukalvon läpäisevän ja soluliman domee- • · · • · · ·.· · nin.
  6. 6. Isäntäsolu, joka ilmentää jonkin patenttivaatimuksista • · ·**'; 3-5 mukaista DNA: ta. • · · ···
  7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, joka on sy- • · *···* totoksinen lymfosyytti (CTL) . • ·*· 35 ♦ ·· ·
  8. 8. In vitro -menetelmä valikoitujen kasvainsolujen hajot- • · tamiseksi, jossa menetelmässä mainitut kasvainsolut saate- 48 119191 taan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaista proteiinia tuottavan CTL:n kanssa.
  9. 9. Menetelmä CTL:n varustamiseksi tarkoin määrätyllä,
  10. 5 MHCrstä riippumattomalla ja MHC:n rajoittamattomalla kas-vainsoluspesifisyydellä, jossa menetelmässä mainittuun CTL:ään viedään patenttivaatimusten 3-5 mukainen DNA.
  11. 10. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin 10 tuottamiseksi, jossa menetelmässä viljellään patenttivaatimuksen 6 mukaista isäntäsolua olosuhteissa, joissa mainittua proteiinia koodaavan DNA:n ilmentyminen on mahdollista .
  12. 11. Ainekoostumus, joka sisältää patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen isäntäsolun.
  13. 12. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen isäntäsolun käyttö syövän hoitamiseksi tarkoitetun lääkkeen valmistamiseksi. 20
  14. 13. Patenttivaatimuksen 7 mukainen CTL käytettäväksi syö-vän hoitomenetelmässä. • · • · ... 14. Polyklonaalinen tai monoklonaalinen vasta-aine, joka • · · • ·1 25 on spesifinen patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiselle pro- ··· teiinille. • ♦ · • · · «·· ···
  15. 15. Vektori, joka sisältää patenttivaatimusten 3-5 mukai sen DNA:n. :: : 30 • · ··· * · • · ··· *··· ··· • · • · ♦ • · ♦ • · · *·♦ · · • · · • ·· * · 49 119191
FI964311A 1994-05-02 1996-10-25 Bifunktionaalinen proteiini, valmistus ja käyttö FI119191B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94810244 1994-05-02
EP94810244 1994-05-02
PCT/EP1995/001494 WO1995030014A1 (en) 1994-05-02 1995-04-20 Bifunctional protein, preparation and use
EP9501494 1995-04-20

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI964311A FI964311A (fi) 1996-10-25
FI964311A0 FI964311A0 (fi) 1996-10-25
FI119191B true FI119191B (fi) 2008-08-29

Family

ID=8218248

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI964311A FI119191B (fi) 1994-05-02 1996-10-25 Bifunktionaalinen proteiini, valmistus ja käyttö

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6984382B1 (fi)
EP (1) EP0758394B1 (fi)
JP (1) JP3742103B2 (fi)
KR (1) KR100373813B1 (fi)
AT (1) ATE228166T1 (fi)
AU (1) AU694222B2 (fi)
CA (1) CA2188422C (fi)
DE (1) DE69528894T2 (fi)
DK (1) DK0758394T3 (fi)
ES (1) ES2185705T3 (fi)
FI (1) FI119191B (fi)
IL (1) IL113530A0 (fi)
NO (1) NO316923B1 (fi)
NZ (1) NZ285395A (fi)
PT (1) PT758394E (fi)
TW (1) TW428026B (fi)
WO (1) WO1995030014A1 (fi)
ZA (1) ZA953440B (fi)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU694222B2 (en) 1994-05-02 1998-07-16 Bernd Groner Bifunctional protein, preparation and use
WO1997024446A2 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Chiron Corporation Gene delivery vehicle-targeting ligands
AU4373197A (en) * 1996-09-19 1998-04-14 Diagnocure Inc. Recombinant single chain antibodies directed against the gp54 cancer marker, composition comprising same and use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE10121113A1 (de) * 2001-04-28 2002-10-31 Gabriele Pecher Genmodifizierte YT Zelllinie und ihre Verwendung
DK2921500T3 (da) 2004-07-10 2023-09-18 The Institute For Cancer Res Genetisk modificerede, humane, naturlige dræbercellelinjer
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
NI200800032A (es) 2005-07-25 2009-03-23 Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20
MX2008015524A (es) * 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
US20100105136A1 (en) * 2006-10-09 2010-04-29 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
SI2132228T1 (sl) 2008-04-11 2011-10-28 Emergent Product Dev Seatle CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom
US9273283B2 (en) 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
EP3012268B1 (en) 2010-09-08 2017-11-15 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
PL3214091T3 (pl) 2010-12-09 2019-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Zastosowanie komórek T modyfikowanych chimerycznymi receptorami antygenowymi do leczenia nowotworów
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
EP2847223B1 (en) 2012-05-07 2019-03-27 Trustees of Dartmouth College Anti-b7-h6 antibody, fusion proteins, and methods of using the same
DK2958943T3 (da) 2013-02-20 2019-12-09 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af humaniseret anti-EGFRvIII kimær antigenreceptor
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
EP3623380A1 (en) 2013-03-15 2020-03-18 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
CA3225453A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
SG10202109752XA (en) 2014-04-07 2021-10-28 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
AU2015292755B2 (en) 2014-07-21 2020-11-12 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
WO2016014535A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
CN114107424A (zh) 2014-10-08 2022-03-01 诺华股份有限公司 预测针对嵌合抗原受体疗法的治疗应答性的生物标志及其用途
IL303247A (en) 2014-12-29 2023-07-01 Novartis Ag Methods for preparing cells expressing a chimeric receptor antigen
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
SG11201708191XA (en) 2015-04-08 2017-11-29 Novartis Ag Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
TW201708538A (zh) 2015-07-21 2017-03-01 諾華公司 改良免疫細胞之功效及擴展之方法
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
US11747346B2 (en) 2015-09-03 2023-09-05 Novartis Ag Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
WO2017053469A2 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
EP3393504A1 (en) 2015-12-22 2018-10-31 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
CN110225927B (zh) 2016-10-07 2024-01-12 诺华股份有限公司 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
EP3589295A4 (en) 2017-02-28 2020-11-04 Endocyte, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY
RU2019133280A (ru) 2017-03-22 2021-04-22 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
AU2019209428A1 (en) 2018-01-22 2020-07-30 Endocyte, Inc. Methods of use for CAR T cells
JP7438988B2 (ja) 2018-06-13 2024-02-27 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
CN110627895B (zh) * 2018-06-25 2021-03-23 北京大学 肺癌特异性tcr及其分析技术和应用
SG11202101849XA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Invectys SA Chimeric antigen receptors against multiple hla-g isoforms
KR20220104217A (ko) 2019-11-26 2022-07-26 노파르티스 아게 Cd19 및 cd22 키메라 항원 수용체 및 이의 용도

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0260880A3 (en) 1986-09-11 1990-03-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Turning on of cytotoxicity
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
FI105320B (fi) 1988-04-04 2000-07-31 Oncogen Menetelmä vasta-aineheterokonjugaattien valmistamiseksi, joita käytetään imusoluaktiivisuuden säätelyssä ja diagnoosissa
AU656544B2 (en) 1990-10-31 1995-02-09 Brigham And Women's Hospital Genetic modification of endothelial cells
KR100246529B1 (ko) * 1990-12-14 2000-04-01 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 수용체 관련된 신호 변환 경로를 위한 키메라 사슬
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU662311B2 (en) * 1991-02-05 1995-08-31 Novartis Ag Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
FR2672901B1 (fr) 1991-02-15 1994-09-30 Immunotech Sa Nouvelles molecules de dna recombinants codant pour une chaine du recepteur pour l'antigene des cellules t, procede de preparation, anticorps et medicaments les renfermant.
WO1992015326A1 (en) 1991-02-27 1992-09-17 The Regents Of The University Of California Targeting complex mediated immunogenicity
NZ241855A (en) 1991-03-07 1994-04-27 Gen Hospital Corp Use of therapeutic cells to obtain cellular response to infection, tumours or autoimmune-generated cells, cells with chimaeric receptors (with binding component and destruction signal), dna encoding the receptor, vectors and antibodies to receptor
US5939531A (en) 1991-07-15 1999-08-17 Novartis Corp. Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1993019163A1 (en) * 1992-03-18 1993-09-30 Yeda Research And Development Co, Ltd. Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
EP0565794A1 (en) 1992-04-14 1993-10-20 British Biotech Pharmaceuticals Limited Induction of CTL responses
AU694222B2 (en) 1994-05-02 1998-07-16 Bernd Groner Bifunctional protein, preparation and use

Also Published As

Publication number Publication date
FI964311A (fi) 1996-10-25
TW428026B (en) 2001-04-01
AU2446995A (en) 1995-11-29
ZA953440B (en) 1995-11-02
NO964641D0 (no) 1996-11-01
DK0758394T3 (da) 2003-03-03
JP3742103B2 (ja) 2006-02-01
NO964641L (no) 1996-11-01
ES2185705T3 (es) 2003-05-01
CA2188422C (en) 2011-03-15
CA2188422A1 (en) 1995-11-09
NO316923B1 (no) 2004-06-28
EP0758394B1 (en) 2002-11-20
DE69528894T2 (de) 2003-03-27
US6984382B1 (en) 2006-01-10
PT758394E (pt) 2003-04-30
DE69528894D1 (de) 2003-01-02
EP0758394A1 (en) 1997-02-19
NZ285395A (en) 1998-10-28
IL113530A0 (en) 1995-07-31
AU694222B2 (en) 1998-07-16
WO1995030014A1 (en) 1995-11-09
ATE228166T1 (de) 2002-12-15
FI964311A0 (fi) 1996-10-25
JPH09512176A (ja) 1997-12-09
KR100373813B1 (ko) 2003-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119191B (fi) Bifunktionaalinen proteiini, valmistus ja käyttö
US11639387B2 (en) Bispecific chimeric antigen receptors, encoding polynucleotides thereof and methods of use thereof to treat disease
EP3313874B1 (en) Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
EP1012259B1 (en) Tumor targeted vector
US7820174B2 (en) T cell receptors and related materials and methods of use
KR20150003306A (ko) B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체
JP2002512502A (ja) 癌細胞の標的細胞溶解
CN112703206A (zh) 靶向肿瘤的重组双功能融合蛋白及其应用
US20240082400A1 (en) Cd64 chimeric receptor and uses thereof
US20230399402A1 (en) Hla class ii-restricted tcrs against the kras g12&gt;v activating mutation
JP2003501402A (ja) 遺伝子治療用生成物
KR20010013219A (ko) 종양표적벡터
Stancovski Tumor-inhibitory strategies directed at the HER-2/neu oncoprotein

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: NOVARTIS AG

FG Patent granted

Ref document number: 119191

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed