KR100373813B1 - 이관능성단백질,그의제조및용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이관능성 단백질을 생산하는 숙주가 선별된 표적 세포를 특이적으로 인지하도록 조절할 수 있는 이관능성 단백질에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA 구조물, 상기 DNA를 발현하는 숙주 세포로 이루어진 조성물 및 상기 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 종양 세포를 선별적으로 살생하는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 자기 자신을 생산하는 숙주 세포로 하여금 선별된 표적 세포를 특이적으로 인식하도록 지시할 수 있는 이관능성 단백질에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 단백질의 제조 방법, 상기 단백질을 코딩하는 DNA 구조물, 상기 DNA를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물 및 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 종양 세포를 선별적으로 살생하는 것 등의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
양자(養子, adoptive) 면역 치료 (또한 세포 면역 치료법이라고도 부름)의 원리는 면역학적 활성 세포를 포유류에 천이하여 포유류의 질병 상태에 대한 면역 반응을 증진하는 것이다. 이러한 목적을 위해 면역 세포를 예를 들어, 인간 환자 또는 다른 피검체로부터 제거하고, 임의의 면역 증진제 예를 들어, 인터루킨 2의 존재하에 배양하고 난 후, 통상적으로 면역 증진제의 존재 하에 환자에게 (재)투여한다. 환자에서, 면역학적 활성 세포는 질병 상태를 완화시키는 작용을 한다.
양자 면역 치료법을 위해 제안된 면역학적 활성 세포로는 천연 킬러 (NK) 세포로부터 유도된 림포킨 활성화 킬러 (LAK) 세포, 세포 분해 또는 세포 독성 T 임파구 (CTL, 킬러 T 임파구라고도 부름)로부터 유도된 시험관 내 임파구 (IVS) 등이 있다. LAK 세포는 세포 분해성 세포로서 광범위한 표적 세포와 반응한다. 이들은 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 제한되지 않고, 종양 세포를 분해하며 또한시험관 내에서 정상세포도 분해할 수 있다. CTL은 클론 특이성 즉, 각각의 클론이 표적 세포의 표면 상에서 특정 항원 구조에 대해 특이적이다. 특정 CTL은 고유 항원을 인식하고 결합하여 활성화된 후, 증식하여 표적 세포를 파괴한다. 항원은 표적 세포에 의해 발현되는 자기 클래스 I MHC 표면 분자 중 하나와 결합함으로써만인식되기 때문에 인식 과정은 MHC-제한적이고, 의존적이다.
T 세포에 의한 특이적 항원의 인식는 T 세포 항원 수용체 (TCR)에 의해 매개된다 (A. Weiss, Cell 73, 209-212 (1993)). 수용체에 대한 리간드의 결합은 세포 이펙터 프로그램, 예를 들어 티로신 키나아제 활성화, 세포내 칼슘 이온 방출 및 인터루킨 2 생산 등을 촉발시킬 수 있다 (R.T. Abraham 등, Trends Biochem, Sci. 17, 434-438 (1992)).
TCR은 다량체 표면 복합체로 6개 이상의 유전자의 생성물로 이루어져 있으며, 이들 모두가 세포막으로의 효율적인 발현에 필요하다. TCR의 클로노타입 알파(α) 및 베타(β) 쇄는 특이적 표적 세포 인식을 매개한다. 이 쇄들은 CD3 복합체 감마 (), 델타 (δ), 및 엡실론 (ε) 및 제타 () 쇄의 비다형성 성분과 비공유적으로 결합되어 있다, 디술피드 결합된동종이량체 (homodimer)는 트랜스멤브레인 분자이고 그의 세포질 부분은 TCR로 매개된 신호전달 및 세포 분해의 유도에서 중심적인 역할을 한다.쇄는 자율 신호전달이 가능하다. 즉,는 단독으로도 충분히 반응을 매개할 수 있다.쇄와 세포외 리간드 결합 도메인을 융합하면 리간드와의 작용에 의해 활성화될 수 있는 분자를 얻을 수 있다(S.J. Frank 등, Science 249,174-177(1990); C. Romeo & B. Seed, Cell 64, 1037-1046 (1990); F. Letourneur & R.D. Klausner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8905-8909 (1991)).의 이소폼(isoform)인 에타 ()는유전자 전사물이 달리 스플라이싱된 (alternatively spliced) 형태를 나타낸다.
종양 형성은 체 세포에서 발암 유전자 및 종양 억제제 유전자의 돌연변이와 관련이 있다. 이러한 변이는 단백질의 구조적 변화나 과잉 발현을 초래할 수 있다. 두 현상 모두 이들 단백질의 세포내 프로세싱을 변화시켜서 세포 표면 상에서 주요조직적합성 항원과 연계된 신규 항원 구조를 제공할 수 있다. 종양 환자의 혈청에서 발암 유전자 생성물에 대한 항체가 검출되는 것은 발암 유전자 생성물이 항원성이라는 것을 나타낸다. 이 항원 유발성에 대한 추가의 증거는 세포 면역 반응이 유발된다는 점이다. 종양 세포를 인식하고 제거하는 CTL이 발생된다는 것은 많은 모델 시스템에서 증명되어 왔다 (T.Boon, Adv. Cancer Res 58, 177-210 (1992); M.W. Kast 등, Cell 59, 603-614 (1989); Disis 등, Cancer Res. 54, 16-20 (1994)).
암 치료에 T-임파구의 세포 분해 활성을 활용하고자 하는 현재의 방법들은 자연 발생 CTL의 인식 과정이 MHC-제한적이라는 것 등의 여러 단점으로 어려움을 겪고 있다. 따라서 현재 직면한 한계를 극복하기 위한 방법이 요구된다.
본 발명의 목적은 CTL-인식 특이성의 조작을 포함하는 개선된 방법, 예를들어 변화된 CTL의 능력을 가진 선별적 항종양제를 제조하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 양성 및 특히 악성 종양 세포에서 일관되게 나타나는 유전적 변화를 밝혀낸 것에 기초한 것이다. CTL에 특정한 종양 세포 특이성을 부여하면, 특정 종양 세포로의 표적화 및 이 표적 세포의 MHC 비제한적 및 MHC 비의존적 파괴를 가능하게 한다. 신규하며, MHC 비의존적 인식 특이성을 지닌 CTL에 의한 종양 세포 분해는 시험관 내 (생체 외부) 또는 생체 내, 예를 들어 암 치료에 관여하는 유전자 치료 방법에서 개발될 수 있다.
여기서 종양 세포는 본 발명의 키메라 단백질의 일부분인 항원 결합 도메인이 인식하고 결합할 항원성 구조 (리간드)를 보유한다는 점에서 미리 정의되거나 또는 선별된 표적 세포이다.
본 발명은 CTL이 선별된 종양 세포를 특이적으로 인식하고 살생하도록 지시할 수 있는 키메라 단백질에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인식 기능부, 힌지 영역 및 TCR의쇄를 포함하는 키메라 단백질, 및 이러한 단백질 분자를 하나 이상 생성하는 CTL을 제공한다. 본 발명의 키메라 단백질의 인식 부분으로 세포 결합 리간드가 결합하면 CTL 내에서쇄 매개된 신호전달이 일어나고, 결국 그 리간드를 보유하는 세포는 CTL에 의해 분해된다.
본 발명의 키메라 단백질은 자연 상태에서는 존재하지 않는 단백질이다. 이 단백질은 특정 항원 구조를 특이적으로 인식 및 결합할(그의 인식 기능 도메인을 경유) 뿐만 아니라, 신호전달 성분으로도 작용(쇄 부분을 경유)한다는 점에서 이관능성이다. 힌지 영역은 스페이서로 작용하고, 인식 기능 도메인에게 필요한 접근성 및 유연성을 보장한다. 힌지 영역은 본 발명의 키메라 단백질의 기능을 위해 필수적인 것으로 이해된다. 키메라 단백질 내에서의 배열은 인식 기능부가 N-말단에 위치하고, 힌지 영역을 경유하여 키메라 단백질의 C-말단에서쇄와 연결되도록 이루어지는 것이 바람직하다. 세포 표면 수용체 분자인 본 발명의 키메라 단백질은 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 도메인으로 이루어지며, 숙주 세포, 예를 들어 CTL의 세포막으로 삽입된다. 숙주 세포 내에서 본 발명의 단백질의 기능은 특정 리간드의 결합시 상기 단백질의 신호전달을 증명하기에 적절한 분석법, 예를 들어 리간드의 결합 시에 개시되는 신호전달 경로의 검출 분석법으로 검출하는데, 예를 들어 칼슘 이온 방출, 세포내 티로신 인산화, 이노시톨 인산염 전환 증가 또는 인터루킨 (IL) 2, 인터페론, GM-CSF, IL-3, IL-4 생산 증가 정량법에 관한 검출이 따라서 효과적이다 (R.T. Abraham 등, Trends Biochem. Sci. 17, 434-438(1992)). 이러한 분석법은 당업계의 통상적인 기술로 쉽게 개인에게 이용될 수 있다. 참고 문헌은 실시예에서 사용된 분석법에 관한 것이다. 이 분석법들은 다른 적절한 세포주를 이용하여 개질될 수 있다.
인식 기능부는 항체의 항원 결합 도메인 특히 단일쇄 항체 (scFv)에 의해 제공된다. 단일쇄 항체는 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 유전자 융합체이다. 상기 인식 및 결합 신호는 TCR 복합체의쇄에 전달되는데, 이는 TCR의α/β쇄를 통한 MHC 제한적 항원 인식 보다 월등하다.
항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 적절한 항원에 대한 특이적인 단일클론항체로부터 유도된다.
적절한 항원은 정상 세포와 비교하여 종양 세포의 표면 상에서 증진되거나 또는 특이적으로 발현되는 항원, 예를 들어 종양 세포에서의 일관된 유전적 변화에 의해 생성된 항원이다. 적절한 항원의 예로는 무엇보다도 종양 세포에서 발현되는 관 상피 뮤신 gp 36, TAG-72, 성장 인자 수용체, 글리코스핑고리피드 및 그외 다른 탄수화물 항원 등이 있다 (하기 표시된 항원 및 항체에 관한 참고문헌 참조). 관표피 뮤신은 유방암종, 자궁암종 및 췌장암종 세포 상에서 발현이 증진되고, 예를 들어, 단일클론 항체 SM3 (Zotter 등, Cacer Rev. 11, 55-101 (1988))에 의해 인식된다. 글리코단백질 gp36은 인간 백혈병 및 임파종 세포의 표면 상에서 발견된다. 이 항원 인식 항체의 예로는 SN10이 있다. TGA-72는 단일 클론 항체 CC49에 의해 인식되는 췌장암종 항원이다 (Longenecker, Sem. Cancer. Biol. 2, 355-356). 성장 인자의 예로는 사람 표피 성장 인자 (EGF) 수용체 (Khazaie등 Cancer and Metastasis Rev. 12, 255-274 (1993)) 및 HER2 (또한 erbB-2 또는 gp 185로 불림)이 있다 (A. Ulrich And J. Schlessinger, Cell 61, 203-212 (1990)). erbB-2 수용체는 높은 발생률의 인간 암종에서 과잉 발현되는 트랜스멤브레인 분자이다(N.E.Hynes, Sem, In Cancer Biol. 4, 19-26 (1993)). 정상 성인 조직에서 erbB-2의 발현율은 낮다. 이러한 발현의 차이로 erbB-2 수용체를 "증진된 종양"으로 구별한다.
항원 결합 도메인은 항원을 그 본래 형태로 표면제시하는 살아있는 인간 종양 세포를 면역유발원으로 사용함으로써 생산된 단일 클론 항체로부터 얻는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시 태양에서, 키메라 단백질의 인식 부분은 성장 인자 수용체, 특히 HER2의 세포외 도메인 상에서 항원 결정체에 특이적으로 결합된다. HER2 성장 인자 수용체에 대해 유도된 단일 클론 항체는 공지되어 있고, 예를 들어 S.J. Mc Kenzie 등, Oncogene 4, 543-548 (1990), R.M. Hudziak 등, Molecular And Cellular Biology 9, 1165-1172 (1989), 국제 특허출원 공개 제 WO89/06692호 (Genentech사) 및 일본특허출원 kokai 제02-150-293호 (Ajinomoto KK사)에 의해 기재되어 있다. HER2를 그 본래 행태대로 표면제시하는 살아있는 인간 종양 세포, 예를 들어 SKBR3 세포에 대해 유발된 단일클론 항체는 본 명세서에 참고 문헌으로 기재된 유럽 특허 공개 제502812호(시바-가이기사) 등에 기재되어 있고, 그 예로는 항체 FRP5, FSP16, FSP77 및 FWP51 등이 있다. 이 항체들을 생산하는 히브리도마 세포주는 1990년 11월 21일에 ECACC (European Collection Of Animal Cell Cultures, PHLS Centre For Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, UK)에 번호 90112115, 90112116, 90112117 및 90112118로 각각 기탁되었다.
본 발명의 키메라 단백질에 바람직한 항원 결합 도메인은 유연한 링커 (스페이서), 바람직하게는 펩티드를 경유하여 중쇄 가변 도메인 (VH)와 가교된 경쇄 가변 도메인 (VL)으로 이루어진 단일쇄 재조합 항체 (scFv)이다. 상기 링커 펩티드는 약 10 내지 약 39개의 아미노산, 특히 천연 아미노산, 예를 들어 약 15개의 천연 아미노산으로 구성되는 것이 유리하다. 바람직한 것은 L-글리신 및 L-세린 중에서 선택된 아미노산으로 구성된 펩티드이며, 특히 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 반복 유닛 3개로 구성된 15개 아미노산으로 구성된 펩티드이다. 유리한 것은 VH가 재조합 항체의 N-말단에 위치한 단일쇄 항체이다. 바람직하게는 단일쇄 재조합 항체가 상기 정의한 바람직한 특이성을 갖는 키메라 단백질로, 예를 들어 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 단일 클론 항체 (예를 들어 사람 성장 인자 수용체 HER2에 대한 쥐의 단일 클론 항체, 예를 들어 FSP16, FSP77, FRP5 및 FWP51로 이루어진 군으로부터 선택된 쥐의 단일 클론 항체)로부터 유도된 단일쇄 재조합 항체를 포함하는 키메라 단백질이다.
항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인은 상이한 특이성을 가진 항체에서 상당히 보존적인 소위 프레임워크 영역(FR) 및, 특정 특이성에 특징부인 과가변 영역, 소위 상보성 결정 영역 (CDR)으로 구성된다. 본 발명에 따른 키메라 단백질의 항원 결합 도메인에서, FR은 포유류, 예를 들어 쥐 또는 특히 사람 항체로부터 유도된 것이 바람직하다. 단일 클론 항체의 scFv 유도체를 TCR/CD3 복합체의쇄로 이식한다.
특히 바람직한 키메라 단백질은 단일쇄 재조합 항체를 포함하며, 여기서 중쇄 가변 도메인이 화학식(I)의 폴리펩티드를 포함한다.
상기 식 중에서,
이 폴리펩티드쇄는 N-말단극에서 시작되어 C-말단극에서 종결되는 것으로 기재되어 있으며,
FR1은 25-29개, 바람직하게는 25-33개 이상의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR2은 12-16개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR3은 30-34개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR4는 6-10개 이상, 바람직하게는 6-13개 이상의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
CDR1H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 31 내지 35의 펩티드 잔기이고,
CDR2H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 50 내지 66의 펩티드 잔기이고,
CDR3H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 99 내지 108의 펩티드 잔기이거나, 또는
CDR1H는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 31 내지 35의 펩티드 잔기이고,
CDR2H는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 50 내지 66의 펩티드 잔기이고,
CDR3H는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 99 내지 109의 펩티드 잔기이고,
상기 서열의 아미노산 중 Cys는 S-S 브릿지를 형성하는 산화된 형태일 수 있다. 이 특정 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO:2에 따른
특히 바람직한 것은 재조합 단일쇄 항체가 화학식 (I)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 키메라 단백질로, 여기서 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3및 FR4는 바람직하게는 포유류 특히, 쥐 또는 사람 항체로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 첫번째 실시 태양에서 가장 바람직한 키메라 단백질은 재조합 단일쇄 항체의 중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 2 내지 120의 폴리펩티드를 포함하는 것이며, 아미노산 서열 2 내지 30 (FR1), 36 내지 49 (FR2), 67 내지 98 (FR3) 및(또는) 110 내지 120 (FR4) 내에서 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 단일 아미노산이 다른 아미노산으로 임의로 치환되거나 또는 결실되고, 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이고, 그중에서도 특히 중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 6 내지 119의 폴리펩티드를 포함하고 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이다.
본 발명의 두번째 실시 태양에서 가장 바람직한 키메라 단백질은 재조합 단일쇄 항체의 중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 2 내지 120의 폴리펩티드를 포함하는 것이고, 아미노산 서열 2 내지 30 (FR1), 36 내지 49 (FR2), 67 내지 98 (FR3) 및(또는) 110 내지 120 (FR4) 내에서 임의로 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 단일 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 결실되고, 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이고, 그중에서도 특히 중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 6 내지 119의 폴리펩티드를 포함하고 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이다.
예를 들어, 프레임워크 영역 내에서 소수성 아미노산은 다른 아미노산, 바람직하게는 소수성 아미노산, 예를 들어 동족 아미노산으로 치환되거나 두 개의 아미노산으로 치환 (아미노산의 삽입을 초래)되거나 결실될 수 있다. 이와 같이, 프레임워크 영역 내의 친수성 아미노산은 다른 아미노산으로 치환되거나 두 개의 아미노산으로 치환되거나 또는 결실될 수 있고, 여기서 아미노산을 치환하는 것은 해당 프레임워크 영역의 수소결합 구조를 유지하는 것이 바람직하다. 유리하게는 하나 이상의 아미노산의 치환이 항체의 재성형 또는 인간화에 대한 당업계의 공지된 방법으로 간주될 수 있다. 특히 주목할만한 것은 재성형 항체의 면역 유발성을 감소시키는 것 ("본래의" 단일 클론 항체와 비교할 때)을 목적으로 하고(거나) "본래의" 항체의 결합 친화력과 같거나 그보다 결합 친화력이 큰 항체를 설계하는 지침이다. 아미노산의 변형은 단일 FR 즉, FR1, FR2, FR3, 또는 FR4로 한정될 수 있고, 또는 2, 3, 또는 4개의 FR 모두에 해당될 수 있다.
이와 같이 본 발명의 바람직한 키메라 단백질은 경쇄 가변 도메인이 하기 일반식 (II)의 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단일쇄 항체를 포함한다.
상기 식 중에서,
이 폴리펩티드쇄는 N-말단극에서 시작되어 C-말단극에서 종결되는 것으로 기재되어 있으며,
FR6은 바람직하게는 19-25개, 특히 19-23개 이상의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR7은 13-17개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR8은 30-34개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR9는 천연 아미노산, 특히 7-11개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
CDR1L은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 158 내지 168의 펩티드 잔기이고,
CDR2L는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 184 내지 190의 펩티드 잔기이고,
CDR3L는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 223 내지 231의 펩티드 잔기이거나, 또는
CDR1L는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 159 내지 164의 펩티드 잔기이고,
CDR2L는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 185 내지 191의 펩티드 잔기이고,
CDR3L는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 224 내지 231의 펩티드 잔기이고,
상기 서열의 아미노산 중 Cys는 S-S 브릿지를 형성하는 산화된 형태일 수 있다. 이 특정 상보성 결정 영역은 SEQ ID NO:2에 따른
특히 바람직한 키메라 단백질은 재조합 항체가 화학식 (II)의 경쇄 가변 도메인을 포함하며 프레임워크 영역 FR6, FR7, FR8및 FR9의 펩티드 잔기가 바람직하게는 포유류 특히, 쥐 또는 사람 항체로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 한 실시 태양에서, 가장 바람직한 키메라 단백질은 재조합 항체의 경쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:2의 아미노산 135 내지 240의 폴리펩티드를 포함하며, 아미노산 서열 135 내지 157 (FR6), 169 내지 183 (FR7), 191 내지 222 (FR8) 및 (또는) 232 내지 240 (FR9) 내에서 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 단일아미노산이 다른 아미노산으로 임의로 치환되거나 또는 결실되고, 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이고, 그 중에서도 특히 경쇄 파변 도메인이 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 135 내지 240의 폴리펩티드를 포함하며, 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태인 키메라 단백질이다.
본 발명의 다른 실시 태양에서 가장 바람직한 키메라 단백질은 재조합 항체의 경쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:4의 136 내지 240의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하며, 아미노산 서열 136 내지 158 (FR6), 170 내지 184 (FR7), 192 내지 223 (FR8) 및(또는) 232 내지 240 (FR9) 내에서 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 단일 아미노산이 다른 아미노산으로 임의로 치환되거나 또는 결실되고, 아미노산 Cys는 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이고, 그 중에서도 특히 경쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 136 내지 240의 폴리펩티드를 포함하고 아미노산 Cys가 S-S 브릿지를 형성하는 산화 형태일 수 있는 키메라 단백질이다.
예를 들어, 프레임워크 영역 내에서 아미노산은 상기 중쇄에서와 같이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 결실될 수 있다.
특히 바람직한 것은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 10 내지 30개, 예를 들어 약 15개의 아미노산으로 구성된 스페이서기를 통해 연결되어 있는 단일 쇄 재조합 항체를 포함하는 키메라 단백질로, 특히 단일쇄 재조합 항체가 하기 일반식 (III)의 폴리펩티드로 이루어진 것이다.
상기 식 중에서,
이 폴리펩티드쇄는 N-말단극에서 시작되어 C-말단극에서 종결되는 것으로 기재되어 있으며,
FR1, CDR1H, FR2, CDR2H, FR3, CDR3H, FR4, FR6, CDR1L, FR7, CDR2L, FR8, CDR3L및 FR9는 상기 정의한 바와 같고, Sp는 상기 정의한 펩티드 스페이서이다.
항원 결합 도메인은 당업계의 공지된 방법, 예를 들어 고수준의 항원을 발현하는 세포의 면역형광 염색, 직접 또는 면역 침전법 및 면역 복합체의 단백질 블롯팅을 경유한 다른 면역 블롯팅, 또는 결합, 교차 억제 또는 경쟁 방사능 또는 효소면역 분석법과 같은 다른 면역 분석법에 의해 사전에 정한 종양 세포 항원에 대한 그의 특이성이 시험될 수 있다. 항원 결합 도메인의 결합 친화력은 공지된 기술 및 원리에 기반을 둔 당업계의 통상적인 기술에 의해 쉽게 수행될 수 있는 적절한 정량 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 필요하다면, 항원 결합 도메인의 친화력은 적절한 대조구 항체의 친화력, 예를 들어 그것이 유래된 "모체" 단일 클론 생쥐의 항체와 비교할 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 항원 결합 도메인 뿐 아니라 항원 결합 도메인과도메인 사이에 짧고 유연한 밧줄로서 삽입된 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은약 40 내지 약 200개의 천연 아미노산, 바람직하게는 약 60 내지 약 190개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 키메라 단백질에서 힌지 영역은 면역 글로불린성 힌지 영역, 예를 들어 D3D4 면역 글로불린 도메인과 같은 CD4 분자로부터 유래된 힌지 영역 (P.J. Maddon 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9155-9159 (1987)) 또는 CD8α분자로부터 유도될 수 있는 힌지 영역, 예를 들어 Lyt-2 (R.Zomoyska 등, Cell 43, 153-163 (1985); B.J. Classon 등, Int. Immunol. 4, 2, 215-225(1992))이다. SEQ ID NO:7 중의 아미노산 서열에서 힌지 영역 (Lyt-2)은 아미노산 위치 245에서 아미노산 위치 304로 연장되어 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 항원 결합 도메인 및 힌지 영역 뿐 아니라 상기 키메라 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이면서 신호전달 도메인을 이루는 관능성도메인을 포함한다. 관능성도메인은 본질적으로쇄의 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인을 포함한다. 본 발명의 키메라 단백질의 항원 결합 도메인과 특이적 항원과의 상호작용에 의해도메인 매개로 TCR이 활성화되면, 몇가지 신호전달 경로, 예를 들어 상기한 것 중의 하나가 촉발된다. 본 발명에 따른쇄는 포유류, 특히 쥐 또는 사람에게서 유래된 것이다. TCR 내에서는 디술피드 동종이량체로 존재한다. 관능성도메인은 내인성발현이 결핍된 T 세포 히브리도마에서 발현되면 상기 히브리도마에서 기능적 활성 TCR을 (예를 들어 항원 유도적 인터루킨-2 분비 및 성장 자극이 재획득되는 방식으로) 복원할 수 있는 단백질이다 (S. Frank 등, Science 249, 174-177 (1990)). 관능성도메인의 예는 쥐쇄의 아미노산 28 내지 164를 포함하는 분자 (A. M. Weissman 등, Science 239, 1018-1021(1988)) 및 사람쇄의 아미노산 28 내지 163을 포함하는 분자 (참고로 본원에 도입된 문헌 (A.M. Weissman 등, Proc. Natl. Acad, Sci, USA 85, 9709-9713 (1988))의 도 2에 따라 번호매김) 등이 있다. 본 발명의 목적을 위해 사용된단백질은 그의 변형체들이 관능성이라면 그 변형체도 포괄하는 의미이다. 바람직한 변형체는 포유류, 특히 쥐 및 사람 유래의 변형체이다.
예를 들어, 변형체는 특정 종 내에서 발견되는분자의 천연 발생 변형체이다. 이러한 변형체는 동일 유전자 군 또는 특정 유전자의 대립유전자적 (allelic) 변형체의 관련 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 용어 "변형체"는 또한 시험관 내에서 돌연변이시킨 DNA로부터 생산될 수 있는 변형된분자를 포함한다. 이러한 변형은 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환 및(또는) 결실로 이루어질 수 있고, 후자는 짧은 변형체를 초래한다.
본 발명의 바람직한 키메라 단백질은 SEQ ID. No. 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 및 단일 클론 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 당업계의 통상적인 방법에 따라 제조된다.
본 발명의 키메라 단백질은 본 발명의 단백질을 생산하는, 아래에 추가로 정의된 적절한 숙주 세포가 시험관 내 또는 생체내에서 증식되고, 필요하다면 단백질이 단리된다는 점에서 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 단백질은 단백질을 코딩하는 DNA 구조물의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 적절히 형질도입된 CTL을 배양하고, 임의로 단백질의 관능성을 검출하는 분석을 수행하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다. 추가로 본 발명은 프로모터 및 상기 단백질 코딩 DNA를 포함하는 발현 카셋트를 포함하는 벡터로 형질도입시킨 적절한 숙주 세포 (특히 CTL)을 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 키메라 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 DNA는 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 프로모터에 의해 제어된다. 바람직한 본 발명의 키메라 단백질은 scFv, 힌지 영역 및 관능성분자를 포함하도록 제작된다. 본 발명의 키메라 단백질의 생산 방법은 형질도입된 세포가 표적 세포를 분해할 수 있을만큼 충분한 양으로 단백질을 생산해야만 한다.
적당한 숙주 세포의 예로는 1차 세포 분해 T 임파구 (CD 8+), CD 4+T 헬퍼 세포 및 천연 킬러 세포 (NK) 등이 있다. 바람직한 포유류 세포, 특히 포유류의 CTL은 특히 인간 기원의 CTL이다.
상기 또는 하기에 사용된 바와 같이 시험관 내에서는 생체 외부를 의미하여, 따라서, 세포 배양 조건을 포함한다.
예를 들어, 시험관 내에서 포유류 세포의 증식은 통상적인 표준 배지인 적절한 배지, 예를 들어 DMEM (Dulbecco'S Modified Eagle Medium) 또는 RPMI 1640 배지에서, 임의로 포유류 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 소량 원소 및 성장 유지 보충물, 예를 들어 공급 세포 (Feeder Cell)가 보충되어 수행된다.
또한 본 발명은 T 임파구의 인식 특이성을 조작하기에 적절한 재조합 DNA 또는 DNA 구조물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 인식 기능부, 힌지 영역 및 TCR의 신호전달 성분으로서의쇄를 포함하는 키메라 단백질 합성을 지시할 수 있는 DNA 구조물을 제공한다. 특히 본 발명은 항원 결합 도메인, 힌지 영역 및도메인을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 구조물을 제공하며, 특히 DNA 구조물은 상기 또는 하기에서 바람직한 것으로 지목된 단백질 부분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 배열에서, 항원 결합 도메인은 제1부로서, 힌지 영역은 제2부로서,쇄는 제3부로 간주된다.
본 발명의 DNA는 코딩 단일 가닥 DNA, 상기 코딩 DNA와 그의 상보적 DNA 또는 이들의 상보적 DNA (단일 가닥) 그 자체로 이루어진 이중 가닥 DNA를 포함하는 것으로 정의된다.
유리하게 본 발명의 DNA 구조물은 제1부 (항원 결합 도메인)의 상부에 위치하면서 리더 펩티드를 코딩하는 제4부를 포함한다. 바람직하게는 DNA 구조물의 제4부는 면역 글로불린 (Ig) 유전자의 리더 펩티드, 예를 들어 Ig 중쇄 리더 펩티드를 코딩한다. Ig 중쇄 리더 펩티드는 초기 폴리펩티드를 소포체 강으로 표적화를 증진한 후 절단되며, 단백질은 골지 및 막을 따라 그의 트랜스멤브레인 위치로 솔팅된다. 특히 바람직한 것은 Met-Ala-Trp-Val-Trp-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Met-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-Pro-Lys 서열을 갖는 리더 펩티드이다.
바람직한 것은 SEQ ID No. 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA, 예를 들어 SEQ ID No. 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA이다. SEQ ID No. 5에 기재된 DNA 서열은 서열 5'-EcoRI-IgH쇄 리더 D6/12-scFv(FRP5):Lyt-2 힌지:-CD3 제타(트랜스멤브레인(TM) 및 세포질(Cyt))-EcoRI-3')로 기재되는 특징을 갖는다.
당업계의 현재 상태는 당업계의 통상적인 기술자가 본 명세서에 기재된 정보를 가지고 본 발명의 DNA 분자를 합성할 수 있을 것이다. 본 발명의 DNA 구조물을 얻는 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 많은 올리고뉴클레오티드의 합성, 특이적 유전자 서열의 증폭, 예를 들어 PCR(폴리머라제 연쇄 반응법) 기술, 목적 DNA 서열을 얻기 위한 유전자 스프라이싱 및(또는) DNA 제한 효소 및 리가제의 사용 등이 있다. 본 발명의 DNA는 화학적 방법과 재조합적 방법을 병행하여 합성될 수 있다.
또한 본 발명은 벡터, 예를 들어 본 발명의 DNA 구조물을 포함하는 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 MHC-비의존적 및 MHC-비제한적 방법으로 표적 종양세포를 파괴할 수 있는 유전자조작 형질도입 CTL을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라, CTL은 상기에 밝힌 본 발명의 키메라 단백질을 생산한다. CTL은 본 발명의 DNA로 형질도입되어 상기 DNA를 발현시키고, 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 생산한다. 표적 종양 세포의 파괴는 이렇게 생산된 단백질이 관능성 즉, 상기 단백질의 항원 결합 도메인이 표적 종양 세포를 인식 및 결합하고,도메인은 CTL내에서 목적 신호를 개시할 수 있어야 한다. 본 발명의 CTL은 도입된 DNA의 발현이 가능한 조건 하에 배양되고, 필요하다면 그의 생산을 분석한다, 상기 DNA의 발현은 연장되고 고양되는 것이 바람직하다.
더욱이, 본 발명은 인식 기능부, 스페이서 도메인 및 TCR의 신호전달 성분으로서의쇄를 포함하는 DNA 구조물을 T 임파구애 도입함으로써 MHC-비의존적이고, MHC-비제한적인 특정 종양 세포 특이성을 CTL에 부여하는 방법을 제공한다. DNA 구조물은 당업계에 공지된 DNA 수송 방법, 예를 들어 벡터 시스템, 예를들어 바이러스 또는 비바이러스 벡터 시스템으로 CTL로 도입될 수 있다. 적절한 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 벡터 등이 있다.방법은 생체 내 및 시험관 내에서 모두 수행될 수 있다. 시험관 내에서의 수행이 바람직하다.
T 임파구는 상기 DNA 구조물 발현이 가능한 조건 하에서 배양되고, 그의 생산이 분석된다. 상기 DNA 발현은 연장되고 고양되는 것이 바람직하다. CTL을 IL-2의 존재 하에 배양하는 것이 유리하다. 본 발명의 형질도입된 CTL은 적절한 마커를 통해 선별될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 구조물이 레트로바이러스 벡터를 통해 수송될 경우, 형질도입된 CTL은 함께 형질도입된 네오마이신(neo) 내성 마커에 의해 선별될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 형질도입된 CTL을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 예를 들어, 본 발명의 단백질을 생산하는 형질도입된 CTL이 허용가능한, 예를 들어 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 또는 혼합물 형태로 함유한다. 이러한 담체는 고체이거나 액체 담체이다. 이 조성물은 환자의 체내로부터 제거된 물질 (예를 들어, 체액 또는 조직)에서 미리 선정된 표적 세포를 살생하기 위하여 생체 외부에서 사용될 수 있다. 표적 세포가 살생된 후, 체내로부터 제거되었던 상기 물질은 환자의 체내로 재도입된다. 따라서 본 발명의 조성물은 종양의 치료 또는 보조 치료를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 종양 세포를 본 발명의 키메라 단백질 생산 CTL과 접촉시키는 것을 포함하는, 선별된 종양 세포 분해 방법을 제공한다. 시험관 내 및 생체 내에서 모두 수행될 수 있는 이 방법에서 종양 세포는 본 발명의 키메라 단백질의 한 부분인 항원 결합 도메인에 의해 표적화된다.
특히 CTL의 노출 및 상호작용이 생체 내에서 일어난 경우에는 숙주 세포 자신의 CTL를 사용하는 것이 바람직하나, 적절한 경우에는 CTL은 다른 숙주 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 다른 숙주 세포로는 예를 들어, 동종 또는 이종의 조직 배양물 또는 다른 포유류 등이 있다.
CTL은 포유류의 체내 도처에서 즉, 조직, 임파 체계 및 혈액에서 발견된다. 적절한 CTL를 선별하여 포유류로부터 채취한다. 예를 들어 CTL은 IL-2의 존재하에 시험관 내에서 배양된 CD8+말초 임파구로서 선별된다. 별법으로 비선별된 말초 임파구는 유전자 형질도입을 위해 사용된다. 필요하다면, 자극 CTL의 수가 증가하도록 숙주 세포를 처리할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 유전자조작 CTL을 사용하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 이 방법은 선별된 종양 세포를 본 발명의 키메라 단백질을 생산하는 CTL에 노출시키는 것을 포함한다. 시험관 내에서(생체 외부에서) CTL-매개된 분해 증진 방법은 암 치료가 필요한 포유류, 특히 사람에게서 끄집어낸 종양세포를 선별적으로 처리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CTL을 사용하여 환자, 예를 들어 방사선 치료 중인 환자로부터 제거된 골수로부터 종양 세포를 제거하여, 골수를 재도입하는 것이다. 종양 세포와 본 발명의 CTL간의 작용 결과, 종양세포는 분해된다. 이 암 치료 방법이 생체 내에서 수행되는 경우, 본 발명의 형질도입된 CTL을 치료할 포유류, 특히 사람의 체내로 재도입하는 단계가 추가될 수 있다. 또한 본 발명의 DNA를 발현하는 CTL은 예를 들어, 암 치료가 필요한 포유류에서 생체내의 DNA 형질도입에 의해 생산되는 것이다.
또한 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CTL 또는 이 CTL을 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 특히 실시예에 기재된 구체적 실시 태양 (단백질, DNA, CTL 및 이들의 제조 방법)에 관한 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 범주를 한정하는 것이 아니라 설명하려는 것이다.
약자:
FCS: 소 태아 혈청, LDH: 락테이트 탈수소효소, mAb: 단일 클론 항체, MoMLV: 몰론니 쥐 백혈병 바이러스, MoMLV-LTR: 몰론니 쥐 백혈병 바이러스 긴 종결 반복부, scFv: 단일쇄 항체, SDS-PAGE: 소듐도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
재료 및 방법
세포주 및 배양 조건
클론 96(Cl96)은 C57BL/6 생쥐로부터 유도된 H-2Kd-제한적 세포독성 T 세포주이다 (K. Eichmann 등, J. Immunol. 147, 2075-2081 (1991)), Cl96 및 감염주는 10% FCS (베링거사), 5×10-2M 2-메르캅토에탄올, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민 및 쥐의 II-2 cDNA로 형질감염된 X63Ag8-653 플라스토시토마 세포로부터 얻은 3%의 조건화된 상등액을 보충한 둘베코스 개질된 이글스 배지 (DMEM, 기브코사)에서 유지된다 (H.Karasuyama and F.Melchers, Eur. J. Immunol. 18, 97-104 (1988)). 사람 백혈병 T 세포주 Jurkat, 레트로바이러스 패키징 세포주ΩE (J. P. Morgenstern and H. Land, Nuc. Acids Res. 18, 3587-3596 (1990)) 및 P317 (A. D. Miller and G. J. Rosman, Biotechniques 7, 980-990 (1989)) 및 감염주 및 활성화된 사람 erbB-2 수용체, NIH3T3#3.7로 형질감염된 쥐 섬유아세포주 등은 10% FCS로 보충된 DMEM에서 배양된다. HC11R1#11은 10% FCS, 10 ng/ml 표피 성장 인자 및 5 ㎍/ml 인슐린으로 보충된 RPMI 1640 (기브코사)에서 증식시킨 사람 erbB-2 원시 발암 유전자 (proto-onco gene) (N. E. Hynes 등, Mol. Cell Biol. 10, 4027-4034 (1990))로 형질 감염된 생쥐 유방 표피 세포주이다.
실시예 1: scFv(FRP5):힌지:제타(
) cDNA의 제작:
인식 기능부, 스페이서 도메인 및 TCR/CD3 수용체 복합체의 신호전달 성분으로서의쇄를 포함하는 DNA를 제작하였다. 인식 기능부는 scFv 도메인이 담당한다. 이 도메인은 단일클론 항체 FRP5로부터 유래된 것이다 (유럽특허출원 EP-A-502 812호). FRP5는 erbB-2 수용체의 세포외 영역에 대해 특이적이다. scFv(FRP5)는 15 아미노산 링커 서열 (Seq. ID No. 2)에 의해 연결된 단일클론 항체 (mAb)의 중쇄 및 경쇄 (VH및 VL)의 가변 영역을 포함한다. 이 scFv 도메인은 erbB-2 수용체의 세포외 도메인을 인식할 수 있다 (W. Wels 등, Biotechnology 10, 1128-1132 (1992); W. Wels 등, Cancer Res. 15, 6310-6317 (1992)). 면역 글로불린 중쇄로부터 유래된 리더 서열을 scFv 도메인의 N-말단에 부가하였다. scFv(FRP5) cDNA를 CD8α유전자의 면역 글로불린 유사 힌지 영역으로부터의 59 아미노산을 코딩하는 짧은 링커 서열에 연결(ligation)시켰다 (R. Zomoyska 등, Cell 43, 153-163(1985)). 트렌스멤브레인 및 신호전달 도메인은 TCR의쇄에 걸쳐 있다. 이 쇄는 TCR 활성화 이후의 신호 변환을 담당한다.
erbB-2 분자의 세포외 도메인에 특이적인 단일쇄 항체 FRP5를 코딩하는 cDNA를 면역 글로불린 중쇄 리더 (LIgH)를 포함하는 플라스미드에 서브클로닝하였다. 역전사 및 폴리머라제 연쇄 반응법 (RT-PCR)을 병용하여 세포독성 T 세포주 C196의 총 RNA로부터cDNA 및 CD8α힌지 cDNA를 둘다 유도하였다. 제1 가닥 cDNA 합성을 위하여 MoMLV 역전사효소를 이용하였다. 이 반응물을 각각 3'-특이적 올리고뉴클레오티드 5813 (Seq. ID No. 6) 또는 3' CD8α-특이적 올리고뉴클레오티드 8764 (Seq. ID No. 7)로 개시하였다. 이들 cDNA를 양 말단에 5' XbaI 부위 및 3' HindIII/BgII 부위를 도입시키는프라이머 쌍 5812/5813 (Seq. ID No. 8 및 6)과 XbaI 부위를 도입시키는 CD8α힌지 프라이머 쌍 8763/8764(Seq. ID No. 10 및 8)을 갖는 PCR 주형으로서 사용하였다. LIgH-scFv(FRP5) DNA는 융합을 위한 XbaI 부위를 사용하여 아미노산 잔기 28 (A.M. Weissman 등, Science 239, 1018-1021. (1988)에 따라 번호매김함)로부터 출발하여cDNA에 연결하였다. 이어서, 아미노산 잔기 105 내지 164 (R. Zomoyska 등, Cell 43, 153-163(1985)에 따라 번호매김)를 코딩하는 CD8α힌지 cDNA를 XbaI 부위에 삽입하고, 올바른 방향을 가졌는지 확인하였다. 얻어진 scFv:힌지:cDNA 구조 (Seq. ID No. 7)를 완전한 DNA 서열분석으로 확인하고, 마지막으로 pLXSN 레트로바이러스 벡터의 단일 EcoRI 부위로 서브클로닝하여 pL(scFv(FRP5):힌지:) SN 구조를 얻는다. DNA의 발현은 5' MoMLV-LTR에 의해 조직되었다. 이 플라스미드는 또한 SV40 초기 프로모터 (SN)에 의해 추진되는 네오마이신 내성을 위한 선별가능한 마커를 보유한다.
pL (scFv:D3/D4:
) SN의 클로닝
제1 분자 디자인은 쥐의 Lyt-2 또는 CD8α분자의 비교적 짧고 유연한 면역글로불린 힌지 유사 영역을 사슬로서 포함하는 반면, 제2 디자인은 쥐의 L3T4 또는 CD4 분자의 D3 및 D4로 표시된 2개의 막 인접 면역 글로불린 유사 도메인을 더 길고 더 강한 스페이서로서 포함하였다 (S.J. Clark 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1649-1653 (1987)). D3/D4 코딩 cDNA를 pcd-L3T4 4.25 플라스미드 DNA를 사용한 PCR에 의해 수득하였다 (D.R. Littman 및 S.N. Gettner, Nature 325, 453-455 (1987)), 특이적 프라이머 쌍 #8761/#8762는 cDNA의 양 말단에 XbaI 제한부위를 도입하는 CD4 분자 (P.J. Maddon 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9155-9159 (1987))의 아미노산 잔기 184-370을 위한 코딩 서열을 증폭시켰다. 생성물을 pL(FZ)SN 벡터의 XbaI 부위에 서브클로닝시켰다. 삽입물의 올바른 방향성을 확인한 후, 얻어진 구조의 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. pL(F4Z)SN의 구조를 도 1에 도시한다.
실시예 2: 레트로바이러스 유전자 전이 후 scFv(FRP5):힌지:
DNA의 발현
pLXSN 벡터계는 세포독성 T 세포내로 형질도입된 후 scFv(FRP5):힌지:DNA의 효과적인 합성을 유도할 수 있고, 이 감염된 세포는 G418 선별이 가능하다. 쥐의 CTL 세포주 C196을 실시예 1의 pL(scFv(FRP5):힌지:) SN 구조물로 감염시켰다.
에코트로픽(ecotropic) 패키지 세포주 ΩE를 인산칼슘 침전법에 의해 pL(scFv(FRP5):힌지:) SN 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 네오마이신 유사체 G418 (Geniticin, 1 mg/ml, Gibco) 존재하에 안정하게 선별하였다. G418 내성 헬퍼 세포로부터 48 시간 후 바이러스 상등액을 수확하고 이것을 사용하여 폴리브렌 8 mg/ml 존재하에 앰포트로픽(amphotropic) 패키지 세포주 PA317을 감염시켰다. 1.0 mg/ml G418가 함유된 배지 중에서 선별함으로써 클론성 고 역가 생산 세포주를 얻었다. 이들 생산 세포주의 상등액을 사용하여 C196 세포를 감염시켰다. scFv(FRP5):힌지:DNA의 높은 발현을 위하여 선별한 감염 세포의 클론을 얻었고, 키메라 세포 표면 단백질의 생성 여부를 분석하였다 (실시예 3). 클론 CFYZ.1을 1.0 mg/ml G418 중에서 배양하여 수득하였다. 유르캇(Jurkat) 세포를 동일한 방법을 사용하여 감염시키고, 클론 JFYZ.4를 2.0 mg/ml G418 중에서 배양하여 수득하였다.
실시예 3: 세포 표면 단백질의 생화학적 특성
a) 형질도입된 CTL에 의해 생성된 키메라 scFv(FRP5):힌지:단백질의 SDS-PAGE 분석
실시예 2의 선별된 클론을 세포 표면에 비오틴화하고 용해시키고 항-mAb로 면역 침전시켰다. 표면 비오틴화를 위하여, 3 × 107개의 생존 세포를 비바(biwa) 완충액 (PBS, 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2) 중에서 3회 세척하고, 비바 완충액(Pierce, 0.5 mg/ml) 중의 1.5 ml 술포-NHS 비오틴 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 15 분간 배양한 후, 비바 완충액 중의 25 mM L-리신을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 세포를 퀀칭 완충액(비바 완충액 중의 25 mM L-리신) 중에서 3회 세척하고, 프로테아제 억제제 칵테일로 보강시킨 1% NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM 트리스/HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 1 mM PMSF를 함유하는 완충액 중에서 용해시켰다. 후핵(postnuclear) 용해물을 프로테인 A 세파로즈 (Pharmacia)로 하룻밤 미리 세척하였다.사슬의 사람 및 생쥐 COOH 말단을 인식하는-특이적 mAb H146-9783 mg을 첨가하여 면역 침전법을 수행하고, 3 시간 동안 인큐베이션한 후, 프로테인 A 세파로즈와 함께 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 침전물을 NET-TON (650 mM NaCl,5 mM EDTA, 50 mM 트리스/HCl, 0.5% 트리톤 X-100, 1 mg/ml 오발부민) 중에서 4 시간 동안 세척하였다. 탈글리코실화를 위하여, 침전물을 100℃에서 10% 2-메르캅토에탄올 존재하에 또는 부재하에 5% SDS로 변성시키고, 37℃에서 1 시간 동안 2.000 U PNGase F (Biolabs)와 함께 인큐베이션시켰다. 시료를 비환원성 또는 환원성 램리(Laemmli)-시료 완충액 중에서 끓이고, 5∼20% SDS-PAGE 구배겔을 통해 전기 영동시켰다. 단백질을 PVDF 막 (Millipore)으로 옮기고, 5% 탈지우유 분말 (Fluka)이 함유된 PBS-T (PBS, 0.4% 트윈-20) 중에서 블로킹하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제-스트렙타비딘 (HRP-Strep, Southern Biotechnology, 1:5.000)이 함유된 PBS-T와 상기 막을 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 PBS-T 중에서 7 분간 4회 세척한 후, ECL-화학 형광제 (Amersham)을 사용하여 블롯을 전개시켰다. 환원 조건 하에 면역 침전의 SDS-PAGE 분석으로, 감염된 세포 (클론 CFYZ.1)의 용해물로부터는 약 48∼65 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 일련의 띠들이 발견되었으나, 모세포 (C196 세포)의 용해물로부터는 발견되지 않았다. 48 kDa의 띠는 계산된 분자량이 48.7 kDa인 scFv(FRP5):힌지:단백질에 해당한다. 이 단백질의 아미노산 서열을 Seq. ID No. 5에 나타내었다. 상기 서열 목록에서, mAb FRP5로부터 유래된 인식 부위는 위치 6의 아미노산 (Gln)으로부터 위치 240의 아미노산 (Ile)까지 연장되고, CD8α로부터 유래된 힌지 영역은 위치 245의 아미노산(Ile)으로부터 위치 304의 아미노산 (Phe)까지 연장되며,사슬은 위치 307의 아미노산 (Asp)으로부터 위치 443의 아미노산 (Arg)까지 연장된다. 분자량이 더 큰 것들은 scFv 및 힌지 영역의 복합 글리코실화의 결과로 발생한다. 엔도글리코시다제 PNGase F를 사용하여 탈글리코실화하면 단순화된 단백질 패턴이 얻어지고 겉보기 분자량이 약 47 kDa까지 감소되었다. 내인성-사슬은 감염되지 않은 및 감염된 세포 중에서 16 kDa (예상치: 16.3 kDa)의 띠로서 검출되었다. SDS-PAGE 분석을 비환원성 조건 하에서 수행했을 때, 겉보기 분자량이 약 96 kDa인 디술파이드-결합된 scFv:힌지:동종이량체, 및 겉보기 분자량이 약 64 kDa인 내인성을 갖는 scFv(FRP5):힌지:분자의 이종 이량체가 둘다 관찰되었다. PNGase F 처리는 이들 두 띠의 분자량을 약간 감소시켰다. 검출된 32 kDa의 띠는 CTL의 내인성-동종이량체에 해당한다.
b) scFv(FRP5):힌지:단백질을 생성하는 T 세포의 유동 세포수 계산법
세포 표면 발현 및 형질 도입된 C196 CTL 및 형질 도입된 유르캇 세포 중에서의 scFv(FRP5):힌지:단백질의 erbB-2 수용체 결합능을 유동 혈구 계산법으로 측정하였다.
5 ×105개의 생존 세포의 단일 세포 현탁액(유르캇 세포, JFYZ.4 세포, C196 세포, CFYZ.1세포)을 정제된 erbB-2 단백질의 세포외 도메인 (erbB-2ecd, 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 Sf9 곤충 세포에서 발현됨, Disis 등, Cancer Res. 54, 16-20 (1994))으로 1시간 동안 유지시킨 후, FITC-접합 항-erbB-2 단일 클론 항체 FSP77 (유럽 특허 공개 제502812호)로 45분 동안 4℃에서 1% BSA 및 0.1% 소듐아지드를 함유하는 100 ㎕ PBS에서 유지시켰다. 또한, FSP77은 erbB-2 수용체의 세포외 도메인에 특이적이나, mAb FRP5로부터 상이한 에피토프를 인식한다 (I.M. Harwerth 등, J. Biol. Chem. 21, 15, 15160-15167 (1992)). 10,000개의 전방 산란/측면 산란으로 게이트된 가시적 세포를 얻고, 유동 세포수 계산법으로 분석하여, 정제되고, 가용성인 erbB-2 수용체의 세포외 도메인의 결합을 형질도입된 T 세포 JFYZ.4: 세포, CFYZ.1세포에 나타내나 비감염된 유르캇 또는 C196 세포에는 나타내지 않았다.
힌지 영역은 scFv기에 접근성과 유연성을 제공하고, erbB-2 수용체의 세포 외 도메인의 scFv 도메인에 대한 결합이 필요한 선결조건이었다. CD4 D3D4의 삽입 또한 결합을 가능하게 하였다. 힌지 영역 또는 스페이서없이, scFv 도메인의쇄에 대한 직접 융합이 시험된 구조물은 erbB-2 단백질에 결합하지 못하는 표면 수용체를 초래한다.
실시예 4: scFv(FRP5):힌지:
융합 단백질의 신호전달
적절한 칼슘-킬레이팅 형광 염료와 함께 적재된 T 세포의 세포내 칼슘 농도를 가용성 erbB-2 수용체와 인큐베이션한 후 측정하였다. 이 목적을 위해, 배양된 JFYZ.4 감염체 및 유르캇 세포를 2% FCS 및 5 mM Indo-1/AM (칼바이오켐사)로 보충된 RPMI 1640에 1×107ml로 현탁하고(M. Lopez 등, Cytometry 10, 165-173 (1989)), 45분간 37℃에서 회전시켜 주었다. 두번 세척한 후, 3×105세포를 2 mg의 정제된 erbB-2ecd와 함께 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 37℃에서 5 mg의 항-erbB-2 mAb FSP77을 동시에 투여한 후 염소의 항-쥐 Ig 항혈청과 교차결합시켜 반응을 촉발시켰다 (GαM Ig, 서던 바이오테크놀로지사), 대조구로서, 세포를 항-사람 CD3εmAb (Serva) 및 GαM Ig의 첨가함으로써 반응을 일으켰다. 칼슘 플럭스는 유동 세포계수기로 15분 동안 405 및 525 nm에서 발광을 측정함으로써 모니터링하였다.
비감염 세포에서 항-CD3εmAb와 CD3 복합체를 교차결합시킴으로써 얻어지는 것과 비교하여 교차결합은 JFCZ.4 세포에서 빠른 세포내 칼슘 증가를 초래하나, 모체 유르캇 세포에서는 그렇지 못하였다. 이는 세포내 신호전달이 세포외 리간드 도메인을 경유하여 scFv(FRP5):힌지:단백질의 교차결합시에 개시됨을, 즉 scFv(FRP5):힌지:단백질이 관능성임을 의미하였다.
실험예 5: 시험관 내 세포독성 분석법
감염된 C196 (CFYZ.1) 세포의 세포 분해 활성을 시험관 내에서 측정하였다. 사람 erbB-2 수용체를 발현하는 발암 유전자로 형질전환된 쥐의 NIH/3T3 섬유아세포 및 HCl 표피 세포를 (N.E. Hynes 등) 표적 세포로 사용하였다. 이 세포로부터 방출된 LDH를 세포 분해의 척도로 사용하였다 (T. Decker and M. L. Lohmann-Matthes, J. Immunol Methods 115, 61-69 (1988)).
세포독성 분석법을 재조합 쥐 IL-2 (rmIL-2)이 함유된 4%의 조건화된 상등액으로 보충된, 페놀 레드가 없는 배지에서 수행하였다. 일정 수의 표적 세포(7500/웰)를 이펙터 (CFYZ.1 세포)의 2배 희석액 시리즈에 첨가한 후, 5% CO2, 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션시켰다. 모든 희석물은 3벌로 수행하였다. 상등액의 50 ㎕ 분취액의 LDH 함량을 CytoTox96 분석법 (프로메가사)을 사용하여 분석하였다(T.Decker M.L. Lohmann-Mattes). 표적 세포를 0.4% TRITON X-100으로분해한 후 측정한 LDH 활성을 100%로 간주했다. 측정된 실험치는 이펙터 및 표적 세포로부터 LDH의 자발적 방출분을 보정한 것이다. scFv(FRP5):힌지:구조물을 발현하는 감염된 C196 세포는 이펙터 대 표적 비율 1 대 10에서 erbB-2를 발현하는 NIH/3T3 세포 또는 HC11 세포를 효율적으로 분해하였다. 인간 erbB-2 수용체로 형질감염된 표피 및 섬유아 표적 세포의 분해는 정상 항원 특이적 세포의 세포독성과 구별되지 않는 MHC-비제한적 방법으로 일어났다. 대조적으로 C196 모세포가 이펙터로 사용되는 경우 분해가 관찰되지 않았다. mAb FRP5 및 유도된 scFv 도메인은 인간 erbB-2 분자에 대해 특이적이며, 상기 두 세포주 모두에서 낮은 수준으로 발현되는 쥐 상동체를 인식하지 않았다. 이러한 이유로, 비형질감염된 NIH/3T3 세포 또는 HC11 세포가 T 세포를 발현하는 scFv(FRP5):힌지:구조물과 인큐베이션시키는 경우, 세포 분해가 관찰되지 않았다.
실시예 6: 생체 내 항종양 활성
두 개의 실험 계획을 생체 내에서 형질도입된 CTL (감염된 C196) 항-종양 활성을 측정하는 데 사용하였다. 제1 계획에서 5×105NIH3T3#3.7 종양 세포를 0.1ml 배양 배지에서 (이펙터 대 표적 세포의 비율은 1:10) 5×105의 CFYZ.1세포 또는 모체 C196 세포와 혼합하고, 즉시 Balb/c 누드 쥐의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다 (H.J. Winn, J. Immunol. 86, 228-234 (1961)). 칼리퍼 측정 후 종양을 증식시켰다. NIH3T3#3.7 종양 세포만을 대조구로서 주사하였다. 각 군은 5 마리의 생쥐로이루어졌다. 제2 계획에서, Balb/c 누드 쥐의 오른쪽 옆구리에 4×105의 NIH3T3#3.7 종양 세포를 접종하였다. 4일째와 5일째에 종양이 촉각으로 확인된 경우, 모체 C196 세포 및 CFYZ.1세포를 꼬리 정맥내로 정맥내 주사하였다 (0.2 ml 배양 배지 중 1×107의 세포). 0.2 ml의 PBS중의 rhIL-2 500U(호프만-라로쉬)를 4, 5 및 6일 째 복막내로 투여하였다. 종양의 성장이 칼리퍼 측정 후에 수반되었다. IL-2이 존재 또는 부재 하에 NIH3T3#3.7 종양 세포를 대조구로서 주사하였다. 각 군은 5 마리의 생쥐로 구성되었다. 인간 erbB-2 암 유전자로 형질전환된 NIH/3T3 세포는 흉선없는 Balb/c 누드 생쥐 내로 피하 주사 후 종양의 빠른 형성을 초래하였다. CFYZ.1 감염체 및 종양 세포를 동시에 투여한 경우에는 7일 동안 종양 형성이 완전히 억제되었다. 그러나, 비감염된 모체 C196 세포의 투여는 종양 세포 증식에 아무 효과도 나타내지 않았다. 누드 생쥐가 NIH/3T3-erbB-2 종양 세포로 먼저 접종되고, 이어서 외인성 IL-2와 혼합된 CFYZ.1 세포로 처리되는 경우 유사한 결과를 얻었다. 형질도입된 CTL의 투여는 7일 동안 종양 세포 증식을 강력히 저지하므로, 전신성 생체내 효과를 보여준다. 이들 세포는 상이한 부위에 투여되더라도 종양을 찾아가 활성화되어 자신의 세포독성 활성을 발휘하는 능력이 있다.
이 결과는 형질도입된 CTL의 특이성 및 이로 인한 세포분해 이펙터 기구가 사전에 정해진 표면 항원인 erbB-2 수용체를 향해 효율적으로 재유인된다는 것을 보여주며, 이는 유방암, 자궁암, 위암 및 결장암 등을 비롯한 많은 인간 선암(腺癌)의 병인학에서 중요한 기능을 한다. 그러므로, 표적화된 T 세포 작용의 원리는유용한 치료 방법으로 생각되며, 일반적으로 보면 정상 세포에서 보다 높은 수준으로 표면 항원을 발현하는 종양 세포의 제거에 적용할 수 있는 것으로 보인다. scFv 부분을 교환하고 특이적 단일클론 항체로부터 유래되는 임의의 기존 항원 인식 기능부로 교체함으로써 원하는 많은 특이성을 갖는 CTL의 유발할 수 있다. 효율적인 수송 체계, 예를 들어 레트로바이러스의 사용은 scFv:힌지:DNA를 쉽게 형질도입되지 않는 세포 타입에 수송하는 것을 가능하게 한다.
미생물 수탁 자료
FRP5, FSP16, FSP77 및 FWP51을 생성하는 히브리도마 세포주는 1990년 11월 21일에 ECACC (European Collection Of Animal Cell Cultures, Phls Centre For Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, UK)에 번호 90112115, 90112116, 90112117 및 90112118로 각각 수탁되었다.
도 1: pL(F4Z)SN 레트로바이러스 벡터의 구조. D3 및 D4 도메인과 같은 CD 4 면역 글로불린의 아미노산 잔기 번호 184-370을 코딩하는 cDNA가 PCR로 유도되고, PL(FX)SN 벡터의 XbaI 자리로 서브클로닝된다. 융합 경계지점의 아미노산 서열을 1글자 코드로 나타냈다.
Claims (13)
1) 종양 세포 상의 적절한 항원에 대한 단일 클론 항체로부터 유도될 수 있으며 하기 화학식 III의 폴리펩티드를 포함하는 단일쇄 항체, 2) 단일쇄 항체의 VL 도메인에 연결된 40 내지 200개의 아미노산을 포함하는 힌지 (hinge) 영역, 및 3) 힌지 영역에 연결된 T 세포 항원 수용체 (TCR)로부터 유도될 수 있는 관능성 제타()쇄를 포함하는 이관능성 단백질.
<화학식 III>
상기 식에서,
폴리펩티드쇄는 N-말단극에서 시작되어 C-말단극에서 종결되는 것으로 기재되어 있으며,
FR1은 25-29개 이상의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR2은 12-16개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR3은 30-34개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR4는 6-10개 이상의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
CDR1H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 31 내지 35의 펩티드 잔기이고,
CDR2H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 50 내지 66의 펩티드 잔기이고,
CDR3H는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 99 내지 108의 펩티드 잔기이거나,
또는
CDR1H는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 31 내지 35의 펩티드 잔기이고,
CDR2H는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 50 내지 66의 펩티드 잔기이고,
CDR3H는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 99 내지 109의 펩티드 잔기이고,
Sp는 10 내지 30개의 아미노산으로 구성된 펩티드 스페이서이며,
FR6은 19-25개 이상의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR7은 13-17개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR8은 30-34개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
FR9는 7-11개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기이고,
CDR1L은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 158 내지 168의 펩티드 잔기이고,
CDR2L는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 184 내지 190의 펩티드 잔기이고,
CDR3L는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 223 내지 231의 펩티드 잔기이거나,
또는
CDR1L는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 159 내지 164의 펩티드 잔기이고,
CDR2L는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 185 내지 191의 펩티드 잔기이고,
CDR3L는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 224 내지 231의 펩티드 잔기이고, 상기 아미노산 서열 중에서 Cys는 S-S 브릿지를 형성하는 산화된 형태일 수 있다.
제1항에 있어서, 힌지 영역이 단일쇄 항체의 VL도메인의 C-말단에 연결된 이관능성 단백질.
제1항 또는 제2항의 이관능성 단백질을 코딩하는 DNA.
제3항에 있어서, 힌지 영역이 면역 글로불린성 힌지 영역인 단백질을 코딩하는 DNA.
제3항 또는 제4항에 있어서, 관능성쇄가 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 것인 단백질을 코딩하는 DNA.
제3항의 DNA를 발현하는 세포 독성 임파구 (CTL).
제1항의 단백질을 생산하는 CTL을 종양 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 인간이 아닌 대상에서 선별된 종양 세포를 분해하는 방법.
제3항에 따른 DNA를 CTL에 도입하는 것을 포함하는, 인간이 아닌 대상에서 MHC-비의존적이고 MHC-비제한적인 특정 종양 세포 특이성을 CTL에 부여하는 방법.
제6항의 CTL을 제1항의 단백질을 코딩하는 DNA의 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 제1항의 단백질 생산 방법.
제6항의 CTL을 포함하는 암 치료용 조성물.
제6항의 CTL을 사용하는 것을 포함하는 인간 이외의 대상에서 암을 치료하는 방법.
제1항 또는 제2항의 단백질에 대해 특이적인 다클론 또는 단일 클론 항체.
제3항의 DNA를 포함하는 벡터.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94810244 | 1994-05-02 | ||
| EP94810244.7 | 1994-05-02 |
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