FI110435B - Uusia proteaaseja - Google Patents

Description

1 110435

Uusia proteaaseja - Nya proteaser

Keksintö koskee alkalofiilisten Bacillus lajin kannoista 5 peräisin olevia pesuaineproteaaseja. Tarkemmin keksintö koskee uutta emäksistä proteaasia, joka on peräisin Bacillus sp. JA16-38A -kannasta. Keksintö koskee myös menetelmää proteaasin valmistamiseksi, proteaasin käyttöä pesuaine-entsyyminä ja pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät kek-10 sinnon mukaista proteaasia.

Pesuaine-entsyymejä on markkinoitu enemmän kuin 20 vuoden ajaan ja ne ovat hyvin vakiintuneita tavallisina pesuaineen ainesosina sekä jauhe- että nestepesuaineissa kaikkialla 15 maailmassa. Suuntauksen ollessa kohti alemmassa lämpötilassa suoritettavia pesuja kohti, pesuaine-entsyymin kulutus on kasvanut viimeisten vuosien aikana. Entsyymit, joita on käytetty pesuformulatioissa, käsittävät proteaasit, lipaa-sit, amylaasit, sellulaasit kuten myös muut entsyymit tai 20 niiden seokset. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

Pesuaineproteaasit on kehitetty eristämällä proteaaseja, joita on löydetty luonnosta, mitä on seurannut niiden tes-:*·*: taaminen pesuaineformulaatioissa. Useimmat pesuaineproteaa- 25 sit saadaan Bacillus-suvun jäsenistä. Tällä hetkellä mark- kinoille tulee uuden tyyppisiä proteaaseja, tarjoten sen mahdollisuuden, että saadaan parempi kustannus/tehokkuus-suhde erilaisissa spesifioiduissa olosuhteissa.

• · « 30 Esimerkkejä kaupallisista proteaasituotteista ovat : V ALCALAS E™, ESPERASE" ja SAVINASE™, kaikki saatavissa fir- : masta Novo Nordisk A/S, Tanska. Nämä ja samanlaiset entsyy- mituotteet muista kaupallisista lähteistä ovat aktiivisia pesuaineliuoksissa, so. pH-arvoissa alueella 8-11 ja sek- 35 vestrausaineiden, pinta-aktiivisten aineiden ja valkaisu-' ‘ aineiden kuten natriumperboraatti läsnäollessa. ALCALASE™ -proteaasia tuottaa Bacillus licheniformis -lajin kannat.

2 110435 ESPERASE™ ja SAVINASE™ -proteaasit saadaan kasvattamalla alkalofiilisia Bacillus-kantoja.

Esillä olevan keksinnön sisällä oleva kohde on tarjota 5 uusia pesuaineproteaaseja, joilla on parannettu kustan nus /tehokkuussuhde.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan uusia pesuaineproteaase ja.

10

Ensimmäisessä näkökulmassa keksintö tarjoaa proteaasin, jonka näennäismolekyylipaino on 28 kD, pl noin 6,4, pH-optimi pH-alueella 9-11 (25 °C:ssa), lämpötilaoptimi alueella 40-50 "c (pH 9,5:ssä), ja immunokemialliset omi-15 naisuudet, jotka ovat identtiset tai osittain identtiset

Bacillus sp. JA16-38A, NCIMB nro 40263:sta johdetun proteaasin ominaisuuksien kanssa. Spesifisemmässä näkökulmassa proteaasi on saaatavilla Bacillus sp. JA16-38A -kannasta. Vielä spesifisemmässä näkökulmassa proteaasi on saatavilla 20 Bacillus sp. JA16-38A:sta, NCIMB nro 40263:sta, tai sen mutantista tai variantista.

Toisessa näkökulmassa keksintö tarjoaa Bacillus sp. JA16-38A -kannan eristetyn biologisesti puhtaan kasvuston. Spe-;v;25 sifisemmässä näkökulmassa tarjotaan Bacillus sp. JA16-38A, NCIMB nro 40263 -kanta, tai sen mutantti tai variantti.

Kolmannessa näkökulmassa keksintö tarjoaa menetelmän prote- * aasin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista 30 se, että kasvatetaan proteaasia tuottavaa Bacillus sp.

• ·’ JA16-38A -kantaa sopivassa ravintoelatusaineessa, joka ·.·: sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja,

mitä seuraa halutun entsyymin talteenottaminen. Spesifisem-mässä näkökulmassa viljellään Bacillus sp. JA16-38A, NCIMB

• 35 nro 40263 tai sen mutanttia tai variantia.

• · ·

Neljännessä näkökulmassa patenttivaatimusten kohteena on entsyymin käyttö pesuaine-entsyyminä. Spesifisemmässä näkö 110435 3 kulmassa keksintö tarjoaa pesuainekoostumuksen ja pesuaine-lisäaineen, joka sisältää proteaasia.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa 5 patenttivaatimuksissa.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen viittaamalla liitteenä oleviin piirroksiin, joissa: 10 Kuva 1 esittää suhteen lämpötilan ja keksinnön mukaisen entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden välillä (entsyymi-valmiste saatu esimerkin 1 mukaisesti, kaseiinin ollessa substraattina ja pH 9,5:ssä); ja 15 Kuva 2 esittää suhteen pH:n ja keksinnön mukaisen entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden välillä (entsyymivalmiste saatu esimerkin 1 mukaisesti, kaseiinin ollessa substraattina ja 25 °C:ssa). 1

Mikro-organismi

Keksinnön mukaiset uudet mikro-organismit, jotka kykenevät tuottamaan keksinnön mukaista entsyymiä, eristettiin oleel-lisesti menetelmällä alkalofUlisten Bacillusten valikoimi- • · :v. seksi, joka menetelmä on kuvattu Brittiläisessä patentissa ··/·_ 25 nro 1 243 784. Yksi sellainen kasvusto, Bacillus sp. JA16- ! 38A, on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talle- tuslaitokseen NCIMB, numerolla 40263.

a t » < · V ‘ Tämän keksinnön mukainen mikro-organismi on aerobinen, 30 itiöitä muodostava bakteeri, joka kuuluu sukuun Bacillus.

't1: Morfologisesti sitä voidaan kuvata liikkuvina nauhoina, ‘ : joiden halkaisija on 0,6 - 0,8 mikronia, ja pituudeltaan . 2-3 mikronia. Itiöt ovat pyöreistä ellipsoideihin, eivät ! laajenna itiöpesäkettä, keskeisestä loppua edeltävään. Op- 35 timilämpötila kasvulle on 35-40 °C ja optimi pH kasvulle on 8,5 - 9,5, ei kasvua alle pH 8, eikä kasvua 50 °C:ssa. Mik-··; ro-organismi muodostaa valkoisista värittömiin läpinäkyviin kasvustoihin ravinne agar-levyillä, eikä havaittu pigmentin diffuusiota agariin.

4 110435

Keksinnön mukainen mikro-organismi voidaan lisäksi tunnus-omaistaa taulukossa 1 esitettyjen koetulosten avulla.

Taulukko 1

5 Koe DSM 485 DSM 4972 JA16-38A

Elatusaine agar (Difco) pH 91 + + +

Elatusaine agar (Difco) pH 71 H - H

Elatusaine agar (Difco) pH li1 +

B. subtilis minimielatusaine H - H

10 (Spizizen) pH 71

Kasvu 50 °C:ssa' +

Kasvu NaCl:ssä: - + - 2 % + 5 % + 15 7 % - + - 10 % Tärkkelyksen + + + kaseiinin + + + gelatiinin + + + "*"**20 CMC: n hydrolyysi

Happo: glukoosista + H + : mannityolista + '25 sorbitolista ksyloosista • · · * ·’ Nitraatin + · Anaerobisen kasvun -

Voges proskauer -reaktion - - - .,..:30 pelkistys ‘ ‘ DSM 485: B. alkalophilus • ti DSM 497: B. alkalophilus alalaji halodurans JA16-38A: B. sp. JA16-38A, NCIMB nro 40263 „ 110435

D

H = heikko 1: mitattu 2 päivän inkubaation jälkeen. Kaikki muut 7 päivän inkubointeja.

2: arvot kirjallisuudesta 5 3: positiivinen 14 päivän inkuboinnin jälkeen, negatiivinen 7 päivän jälkeen.

Mikro-oraanismien kasvatus

Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voidaan kasvattaa ae-10 robisissa olosuhteissa ravintoelatusaineeessa, joka sisäl tää assimiloitavissa olevaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden oleellisten ravinteiden kanssa, elatusaineen koostuessa tunnetun tekniikan periaatteiden mukaisesti.

15 Sopivia hiililähteitä ovat hiilihydraatit kuten sakkaroosi, glukoosi ja tärkkelys, tai hiilihydraattia sisältävät aineet kuten soijapavut, puuvillansiemenjauho, maissijyvät, mallas, riisi ja durra. Hiilihydraattikonsentraatio, joka saadaan väliaineeseen voi vaihdella suuresti, esimerkiksi 20 jopa ylös 25 %:iin ja alas 1-5 %:iin, mutta tavallisesti β ίο % on sopiva, prosenttiosuuksien ollessa laskettu glukoo-siekvivalentteina.

:*·*: Ravinne-elatusaineessa oleva typpilähde voi olla epäorgaa- • * - *:25 ninen ja/tai orgaaninen luonteeltaan. Sopivia epäorgaanisia • · typpilähteitä ovat nitraatit ja ammoniumsuolat. Orgaanisten typpi lähte iden joukosta useita käytetään säännöllisesti fermentointiprosesseissa. Havainnollistavia esimerkkejä ovat soijapapujauho, puuvillansiemenjauho, maapähkinäjauho, 30 kaseiini, vilja, viljan liotusneste, hiivauute, urea ja al-: burniini. Lisäksi ravinne-elatusaineen pitäisi sisältää myös V ’ tavallisia hivenaineita.

Koska tämän keksinnön uudet Bacillus-lajit ovat alkalofii-• 35 lisiä, ja kasvavat heikosti pH:ssa alle 8, kasvatus suori tetaan edullisesti emäksisissä pH-arvoissa, jotka voidaan savuttaa lisäämällä sopivia puskureita kuten natriumkarbonaatti tai natriumkarbonaatin ja natriumbikarbonaatin seok- 6 110435 set, kasvuelatusaineen steriloinnin jälkeen. Tankkifermen-toreissa kasvatusta varten on tarpeellista käyttää keinotekoista ilmastusta. Ilmastuksen nopeus on samanlainen, jota käytetään tavanomaisessa tankkifermentoinnissa.

5

Proteaasien talteenottaminen ia puhdistus

Fermentoinnin jälkeen solunulkoiset proteaasit, jotka mikro-organismit ovat tuottaneet, voidaan ottaa talteen ja puhdistaa tunnetun tekniikan periaatteiden mukaisesti, 10 esimerkiksi käyttämällä vaiheita kuten raaka-aineen poistaminen kasvustoliemestä sentrifugoimalla tai rumpusuoda-tuksella, liemen konsentroimisella käyttämällä haihdutusta tai ultrasuodatusta, ja puhdistamista anioninvaihtokormato-grafialla tai saostamalla asetonilla, mitä seuraa affini-15 teettikromatografia. Lopuksi voidaan lisätä säilöntäaineita puhdistettuihin proteaaseihin.

Proteolyyttisen aktiivisuuden analyysi

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään kasiini substraat-20 tina. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö, Casein Protease Unit (CPU) määritetään sen entsymin määränä, joka vapauttaa 1 mM primaarisia aminoryhmiä (määritettynä vertailuna seriini-standardin kanssa) minuuttia kohti standardiolosuhteissa, so. 30 minuutin inkubointi 25 °C:ssa ja pH:ssa 9,5. Kansio •" * *;25 AF 228/1, kuvaten analyyttisen menetelmän, on saatavuilla pyydettäessä firmasta Novo Nordisk A/S, Tanska, joka kansio sisällytetään tähän viitteenä.

* · · • · ·

Entsyymi 30 Keksinnön mukainen entsyymi on uusi pesuaineproteaasi. Se • ·* on emäksdinen proteaasi, jota saadaan kasvattamalla keksin- : nön mukaista mikro-organismia, edullisesti Bacillus sp.

JA16-38A, NCIMB nro 40263, tai sen mutanttia tai variant-tia, sopivassa ravintoelatusaineessa, joka sisältää hiili-• 35 ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja. Entsyymi voidaan ‘ ‘ saada myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

I « t 7 110435

Keksinnön mukainen proteaasi voidaan kuvata seuraavilla tunnuspiirteillä.

Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet 5 Molekyylipaino 28 kD, määritettynä SDS-PAGElla. pl 6,4 mää ritettynä isoelektrisellä fokusoimisella LKB Ampholine® PAG -levyillä. Proteaasiaktiivisuutta inhiboi PMSF, α-1-anti-trypsiini ja kalkkunan munanvalkuaisen proteinaasi-inhi-biittori. EDTA ja soijapapuproteiini-inhibiittori eivät 10 vaikuttaneet proteaasiaktiivisuuteen.

Lämpötila-aktiivisuus-suhde määritettiin kaseiini substraattina. Edellä kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden analyysiä käytettiin sellaisella muutoksella, että inkubaa-15 tiolämpötilaa vaihdeltiin 15-70 "C intervallein. Tulos on esitetty kuvassa 1. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta lämpötiloissa alle 15 °C:sta yli 70 °C:een, ja läm-pötilaoptimi rajoissa 40-50 °C, noin 45 °C.

20 Aktiivisuuden riippuvuus pHrsta määritettiin samalla mene telmällä käyttämällä puskureita, jotka säädettiin edeltä määrättyihin pH-arvoihin pH-alueella 6-11. Tulokset on esitetty kuvassa 1. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivi-suutta pH-arvoissa alle 6:sta yli li reen, pH-optimin olles-25 sa alueella pH 9 - pH 11, noin pH 10.

Keksinnön mukaisella proteaasilla on hyvin suuri spesifinen aktiivisuus kaseiinia vastaan, vastaten yli 300 CPUrta entsyymiproteiinin grammaa kohti, kuten määritettynä aktii-30 vikohtatitrauksella (katso esimerkiksi Schonbaum, G. R., * Zerner, B. & Bender, M. L. (1961); J. Biol. Chem.; 236 V : 2930).

Keksinnön mukainen proteaasi on stabiili 60 minuuttia 40 * 35 "Crssa ja pesuolosuhteissa, sekä valkaisuaineiden kuten ' * perboraatti ja NOBS kanssa että ilman, eurooppalais- tai amerikkalaistyyppisissä pesuaineissa.

8 110435

Immunokeinialliset ominaisuudet

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunolo-gisesti ristireaktio-identitettikokeilla. Identiteettiko-keet voidaan suorittaa hyvin tunnetulla Ouchterlony kak-5 soisimmunodifuusiomenettelyllä tai kaksoisristi-immunoelek- troforeesilla teoksen Axelsen, N. H.; Handbook of Immuno-precipitation-in-Gel Techniques? Blackewell Scientific Publications (1983), luvut 5 ja 14, mukaisesti. Termit "antigeeninen identtisyys" ja "osittainen antigeeninen identti-10 syys" kuvataan samassa kirjassa, luvut 5, 19 ja 20.

Monospesifinen antiseerumi kehitettiin edellä kuvatun menetelmän mukaisesti immunisoimalla kaniineja keksinnön mukaisella puhdistetulla proteaasilla. Immunogeeni sekoitettiin 15 Freundin apuaineen kanssa ja injektoitiin ihonalaisesti kaniineihin joka toinen viikko. Antiseerumia saatiin 8 viikon kokonaisimmunisaatiojakson jälkeen ja immunoglobu-liini valmistettiin siitä kuten on kuvattu viitteessä N. H. Axelsen, edellä.

20

Ouchterlony-kaksoisimmunodiffuusiokokeet eivät osoittaneet ristireaktiota keksinnön mukaisen proteaasin ja tunnettujen *:**: emäksisten seriiniproteaasien ALCALAS E™, ESPERASE™ ja SA- :*·; VINASE™, subitilisin BPN' ja KAZUSASE™ välillä.

:\\25

Pesuainekoostumukset

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi käsittää yhtä tai '..I useampaa pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla tyypiltään »tl * anionista, ionitonta, kationista, amfoteerista tai kaksois- 30 ionista tai näiden seosta. Tyypillisiä esimerkkejä anioni- - .* sista pinta-aktiivisista aineista ovat lineaariset alkyyli- V · bentseenisulfonaatit (LAS), alkyylisulfaatit (AS), aflaole- .*··. fiinisulfonaatit (AOS), alkoholietoksisulfaatit (AES) ja luonnollisten rasvahappojen alkalimetallisuolat. Esimerkke-• 35 jä ionittomista pinta-aktiivisista aineista ovat alkyylipo- lyetyleeniglykolieetterit, nonyylifenolipolyetyleeniglyko-lieetterit, sakkaroosin ja glukoosin rasvahappoesterit, polyetoksyloitujen alkyyliglukosidien esterit.

9 110435

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää myös muita pesuaine-ainesosia, jotka tunnetaan tekniikan tasossa, kuten bilderit, valkaisuaineet, valkaisuaktivaattorit, korroosionestoaineen, sekvesterointiaineet, sakkauman uu-5 delleenkerrostumisen estoaineet, parfyymit, entsyymien ja valkaisuaineiden stabilisaattorit, formulaatiohapot, optiset kirkastajat, vaahdon voimistajat, kelatointiaineet, täyteaineet, kankaan pehmentäjät jne. Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voidaan formuloida oleellisesti kuten J. 10 Falbe on kuvannut [Falbe, J.j Surfactants in Consumer Products. Theopry, Technology and Application; Springer Verlag 1987, katso erityisesti osa, jonka otsikkona on "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents"].

15 Tällä hetkellä ollaan siinä käsityksessä, että keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää entsyymivalmistetta määrässä, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU:ta proteolyyttistä entsyymiä pesuliuoksen litraa kohti.

20 Keksinnön mukaiset pesuainekoostumuset voidaan formuloida mihin tahansa tarkoituksen mukaiseen muotoon, kuten jauheet, nesteet jne.

• · « : ' : Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi edullisesti sisäl- 25 tää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, esimerkiksi lipaase- * < ··· ja, amylaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja ja/tai peroksi- • · · · daaseja, jotka tavallisesti kuuluvat pesuainekoostumuksiin.

Keksinnön mukaiset proteaasit voidaan sisällyttää pesuaine- ,,. 30 koostumukseen lisäämällä erillisiä lisäaineita, jotka si-» · · * ·’ sältävät pesuaineproteaasin, tai lisäämällä yhdistetty '·' ’ lisäaine, joka käsittää erilaisia pesuaine-entsyymejä.

Keksinnön mukainen lisäaine voidaan formuloida esimerkiksi • ,35 rakeiksi, nesteiksi, lietteiksi jne. Edullisia pesuaineli-säaineformulaatioitaa ovat pölyämättömät rakeet, nesteet, *··.* erityisesti stabiloidut nesteet, lietteet tai suojatut entsyymit. Pölyämättömät rakeet voidaan tuottaa esimerkiksi 110435 10 GB-patenttijulkaisun l 362 365 tai US-patentin 4 106 991 mukaisesti ja voidaan mahdollisesti päällystää tekniikan tason tunnetuilla menetelmillä. Pesuaine-entsyymit voidaan sekoittaa ennen rakeistusta tai sen jälkeen. Nestemäiset 5 entsyymivalmisteet voidaan esimerkiksi stabiloida lisäämällä polyolia kuten esimerkiksi propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boorihappoa, vakiintuneiden menetelmien mukaisesti. Muut entsyymistabilisaatto-rit ovat hyvin tunnettuja tekniikan tasossa. Suojatut ent-10 syymit voidaan valmistaa EP-patenttijulkaisussa 238 216 esitetyn menetelmän mukaisesti.

Käyttökelpoisessa toteutusmuodossa keksinnön mukainen pro-teaasi voidaan liittää puhdistuaineformulaatioihin esimer-15 kiksi EP-patenttijulkaisujen 342 177, 368 575, 378 261 ja 378 262 mukaisesti.

Keksintöä valaistaan seuraavissa esimerkeissä, joiden ei tarkoiteta millään tavalla rajoittavan patenttivaatimuksis-20 sa esitetyn keksinnön piiriä.

Esimerkki 1

Valmistusesimerkki

Bacillus sp. JA16-38A:ta viljeltiin 25 °C:ssa pyöröravis- ·*·*: 25 tuspullossa (300 rpm) 500 ml:n Erlenmeyerpulloissa, jotka » * sisälsivät 100 ml elatusainetta, jolla oli seuraava koostu-mus (litraa kohti): * · · • * » * * *

Perunatärkkelys 100 g 1 9 · ·

Jauhettu ohra 50 g * · · ; Soijapapujauho 20 g V : Na2HP04 X 12 H20 9 g

Pluronic® 0,1 g

Natriumkaseinaatti 10 g • , 35

Elatusaineessa oleva tärkkelys nesteytetään a-amylaasilla ja elatusaine steriloidaan kuumentamalla 120 ”C:ssa 45 minuuttia.

11 110435

Steriloinnin jälkeen elatusaineen pH säädetään 9,7:ään lisäämällä 10 ml 1 M natriumseskvikarbonatin liuosta.

5 päivän inkuboinnin jälkeen viljelmän proteolyyttinen 5 aktiivisuus määritettiin käyttämällä edellä kuvattua mene telmää.

Kasvatuksen jälkeen liemen entsyymiaktiivisuus oli 100 CPU/1.

10

Kiinteän aineen erottamisen jälkeen proteaasi puhdistettiin tavanomaisella kromatografisella menetelmällä.

Saanto 1 l:n kasvustoliemestä oli 5,0 ml, jonka aktiivisuus 15 oli 1500 CPU/1. Puhtaus oli enemmän kuin 90 % kuten määri tettiin SDS-PAGElla.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistetun valmisteen tunnuspiirteisiin on viitattu aikaisemmin tässä selityksessä ja 20 tässä viitataan aikaisempaan kohtaan.

Esimerkki 2

Pesuteho

Pesutehokokeet suoritettiin ruohomehulla tahratulla puu-25 villalla, mallipesusysteemissä 20 °C:ssa, isoterminen 10 minuuttia.

Tässä kokeessa käytettiin 2,0 g/1 amerikkalaistyyppistä % · · * jauhepesuainekoostumusta. Pesuaine ei sisältänyt mitään 30 entsyymiä ennen keksinnön mukaisen proteaasin lisäämistä.

I I « ·' Pesuaine liuotettiin noin 6° dH (saksalainen kovuus) ve- » * · V : teen. Tekstiili/pesuneste-suhde oli noin 6 g tekstiiliä pesuaineliuoksen litraa kohti. pH oli 9,5. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin. Esimerkin 1 mukaista entsyymivalmis-• 35 tetta käytettiin annoksena kuten taulukossa 1 on esitetty.

Pesun jälkeen kangasta huuhdottiin juoksevassa vesijohtovedessä 25 minuuttia ja ilmakuivattiin. Proteaasin tehokkuus 12 110435 määritettiin remission (%R) muutoksena (AR) 460 nm:ssä mitattuna laitteella Datacolor Elrephometer 2000, A:n ollessa remissio proteaasilisäyksellä pesun jälkeen miinus remissio pesun jälkeen ilman proteaasin lisäystä.

5

Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

konsentraatio delta R

10 0,0025 CPU/1 1,46 0,005 CPU/1 1,88 0,01 CPU/1 2,62 0,02 CPU/1 6,15 0,04 CPU/1 9,83 15 0,08 CPU/1 11,22 0,2 CPU/1 12,20

Differentiaaliset remissioarvot osoittavat, että keksinnön mukaisella proteaasilla on hyvä pesutehokkuus.

20

Esimerkki 3

Pesuaineiden stabiilisuus * "·**: Keksinnön mukaisen entsyymin (saatu esimerkin 1 mukaisesti) :*·*: stabiilisuus testattiin pesuaineiden läsnäollessa. Resnai s’-*: 25 neet, joita käytettiin tässä, olivan amerikkalaistyyppisiä « t jauhepesuainekoostumuksia, joita käytettiin myös esimerkis- sä 2.

• * * % · * * · i · * Jäännösaktiivisuus mitattiin 60 minuutin jälkeen 40 °C:ssa 30 1/1 g pesuainetta/l ja JA16-38A-proteaasin 6 °dH vettä (0,3 » * · : ·' CPU/1). Mitattu jäännösaktiivisuus oli 90 %.

* * · » · · Tämä koe osoittaa, että proteaasi on stabiili pesuaineissa pesuolosuhteissa.

» • · t · 13 110435

International Application No: PCT/ / MICROORGANISMS _ ? 1 o

Opb ©nai Shoot In connection vtth th· micfoorganUm roforrod to on »09« 1—--, ---of th· Ooocnp«on 1 A. IDINTinCATtOM OP DXPOSIT *

Further dope·*· or· Idonttflod on on additional shoot Q»

Nomo of dopoaltary inotmAon * NATIONAL COLLECTIONS OF INDUSTRIAL & MARINE BACTERIA LTD.

Addrooa of deeoottory tnotttvtloo (Including peataf cod· ond country) * 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland

Dot· of oooooft * Act—ton Number · 27 February 1990 NCIMB 40263

A. ADDITIONAL INDICATION! 1 (!*·»♦ bunk If not appUcabl·). Th«· information lo conbnuod on κ aapa rata attach·· anoet Q

In respect of those designations in which a European patent is sought, a sample of the deposited microorganism will be made available only by the issue of such a sample to an expert nominated by the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC) until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application has been refused or is deemed to be withdrawn.

C. ΟΜΙβΝΑΤΧΟ STATIC FOJt WHICH INDICATIONS A*X NADI » (H Iho indication» »ro not lor all dooJfftdtod Stttoo) * -·» · --------------- • · * · · t 1 a » t * ♦ t * »

* · t I

i » · •it i ‘ ! D. SIPAAAT1 aUMHISMIMt OF INDICATION· · IlM·· Mank Λ not ippllcabla) * * 1 » * Th· indication· liatod boiow will bo aubmm*d 10 th« international Bureau later · (Specify th« parwraJ natur» of tho Indication· 0.0·* t * * ·· Accaaaion Nwmbor of Dopoalt”) \ t t i $

I k I

1 * X. g] Thu ehoot *11 rocaiT*d with th· international application «h*n filed (to b· chockod by th· rocoiving Office)

OjOiuta________

, (Authored Officer) jJ

• » , . f Q Th« dat· of recast (from th· applicant) by th· International Bureau 1· - » * t 11 ----------—---------——--------- (Authortjod Officer)

Form PCT/MO'IM (January 10C1)

Claims (8)

14 110435

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ominaisuudet : 5 (a) näennäismolekyylipaino 28 kD; (b) pl noin 6,4; (c) pH-optimi pH-alueella 9-11 (25 °C:ssa); (d) lämpötilaoptimi alueella 40-50 °C (pH 9,5:ssä); (e) immunokemialliset ominaisuudet, jotka ovat identtisiä 10 tai osittain identtisiä sellaisen proteaasin ominaisuuksien kanssa, joka on saatavissa Bacillus lajista J16-38A, NCIMB nro 40263, ja että proteaasi voidaan saada viljelemällä Bacillus sp. JA16-38A:ta, NCIMB nro 40263.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että proteaasi saadaan Bacillus sp. JA16-38A -kannasta, NCIMB nro 40263.

3. Bacillus sp. JA16-38A -kannan eristetty, biologisesti puhdas viljelmä, NCIMB nro 40263. Mil

4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen proteaa- • t t : ·1 sin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään pro- ' .25 teaasia tuottavaa Bacillus sp. JA16-38A -kantaa, NCIMB nro 40263, sopivassa elatusaineessa, joka sisältää hiili- ja • · · • typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halutun ; ; : entsyymin talteenottaminen. .’.JO 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen proteaasin käyttö • 1 .···. pesuaine-entsyyminä. · is 110435

8. Puhdistusainelisäaine, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista proteaasia, pölyämättömien rakeiden, nesteen, erityisesti stabiloidun nesteen, 5 lietteen tai suojatun entsyymin muodossa.