FI107539B - Menetelmä yhdistelmä-humaani-hyytymistekijä VIII:n johdannaisen valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä DNA-jakso, vektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

107539

Menetelmä yhdistelmä-humaani-hyytymistekijä VIII: n johdannaisen valmistamiseksi ja menetelmässä käytettävä DNA-jakso , vektori ja isäntäsolu 5 Tämä keksintö liittyy biologisesti aktiivisia yh distelmä-humaani -hyytymistekijä VIII:n johdannaisia koo-dittaviin DNA-jaksoihin, näitä DNA-jaksoja sisältäviin yhdistelmä-ilmentämisvektoreihin, näillä yhdistelmä-ilmen-tämisvektoreilla transformoituihin isäntäsoluihin ja yh-10 distelmä-humaani-hyytymistekijä VIII:n johdannaisten valmistamiseen soveltuviin menetelmiin. Tämä keksintö mahdollistaa humaani-hyytymistekijä Villin johdannaisen valmistamisen, joka käsittää kaksi metalli-ionisillalla yh teen liittynyttä polypeptidiä.

15 Keksinnön tausta

Klassinen hemofilia eli hemofilia A on yleisin periytyvistä verenvuototaudeista. Se on seurausta X-kromoso-miin kytkeytyneestä veren hyytymistekijä Villin puutteesta, sen vaikutukset kohdistuvat yksinomaan miespuolisiin 20 yksilöihin ja sitä esiintyy yhdestä kahteen yksilössä kutakin 10 000 yksilöä kohti. X-kromosomin vaurio siirtyy naispuolisten kantajien välityksellä, jotka eivät itse ole hemofiilisiä. Hemofilia A havaitaan kliinisesti epänormaalista verenvuototaipumuksesta ja ennen kuin käsittely hyy-25 tymistekijä Villin tiivisteillä tuli käytäntöön, oli vaikeaa hemofiliaa sairastavan yksilön elinikä alle 20 vuotta. Hemofiliapotilaiden tilaa kyettiin parantamaan huomattavasti käyttämällä plasmasta peräisin olevia hyytymistekijä Villin tiivisteitä. Keskimääräinen elinikä lisääntyi 30 huomattavasti, jolloin useimmilla potilailla oli mahdollisuus elää enemmän tai vähemmän normaalia elämää. Plasmasta peräisin olevilla tiivisteillä ja niiden käytöllä on ollut tiettyjä ongelmia, joista vakavin on ollut virusten kulkeutuminen niiden välityksellä. Tähän mennessä AIDSiia, 35 B-hepatiittia ja ei A- eikä B-hepatiittia aiheuttavilla viruksilla on ollut vakava vaikutus tähän populaatioon. Vaikka viime aikoina onkin kehitetty erilaisia viruksia 2 107539 inaktivoivia menetelmiä ja uusia erittäin puhdistettuja hyytymistekijä VIII:n tiivisteitä, ei voida taata sitä, että niissä ei ole viruskontaminaatiota. Hyytymistekijä Villin tiivisteet ovat myös melko kalliita, koska raakama-5 teriaalina käytetyn humaaniplasman saatavuus on rajoitettua. On todennäköistä, että suurin osa hemofilia A:n hoitoon käytettävien plasmasta peräisin olevien hyytymistekijä VIII:n tiivisteiden käyttöön liittyvistä ongelmista kyetään ratkaisemaan lähes kokonaan yhdistelmämateriaa-10 lista peräisin olevalla hyytymistekijä VIII -tuotteella, ja useiden tutkimusryhmien työskentely kohdistuu tällaisen tuotteen kehittämiseen. Yhdistelmä-hyytymistekijän kehittämisessä on kohdattu joitakin vaikeuksia, ongelmana on esimerkiksi ollut sellaisten tuotantotasojen saavuttami-15 nen, joissa erityisesti täysimittaisen molekyylin saannot olisivat riittävän korkeita.

On osoitettu, että proteaasi-inhibiittorien läsnä ollessa valmistetussa tuoreessa plasmassa hyytymistekijä Villin moolimassa on 280 kDa ja se koostuu kahdesta poly-20 peptidiketjusta, joiden suuruus on 200 kDa ja 80 kDa [Andersson, L-0., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2979 - 2983]. Nämä ketjut pysyvät' yhdessä metalli-ionisiltojen avulla. Enemmän tai vähemmän proteolyytti-sesti pilkkoutuneita hyytymistekijä VIII -molekyylin muo-. 25 toja on löydetty aktiivisina fragmentteina hyytymistekijä VIII:aa sisältävässä materiaalissa, joka on puhdistettu kaupallisista tiivisteistä [Andersson, L-O., et ai., ibid.; Andersson, L-0., et ai., (1985) EP 0 197 901]. Hyytymistekijä VIII:n pilkkoutunut muoto, jonka moolimassat 30 ovat alueella 260 - 170 kDa, koostuu yhdestä raskaasta ketjusta, jonka moolimassa on alueella 180 - 90 kDa ja jonka kaikilla varianteilla on identtiset aminoterminaaliset päät, ja tämän kanssa yhdessä esiintyvästä yhdestä 80 kDa:n suuruisesta kevyestä ketjusta. Raskaan ketjun 35 aminoterminaalinen alue on identtinen sellaisen yksiket- 3 107539 juisen hyytymistekijä Villin polypeptidijakson kanssa, joka on päätelty hyytymistekijä Villin cDNAin nukleotidi-sekvenssoinnin koetuloksista [Wood, W.I., et ai., Nature 312 (1984) 330 - 336; Vehar, G.A., et ai., Nature 312 5 (1984) 337 - 342].

Pienin hyytymistekijä Villin aktiivinen muoto, jonka moolimassa on 170 kDa ja joka koostuu yhdestä 90 kDain suuruisesta ja yhdestä 80 kDain suuruisesta ketjusta, voidaan aktivoida trombiinilla samassa määrin kuin tätä suu-10 remman moolimassan omaavat muodot, joten se edustaa akti-voimatonta muotoa. Sen on osoitettu olevan biologisesti täysin aktiivista in vivo -olosuhteissa hemofiilisissä koirissa tutkittuna [Brinkhous, K.M., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 8752 - 8756]. Siten 170 kDain 15 muoto vastaa hemostaattiselta tehokkuudeltaan hyytymistekijä Villin suurimoolimassaisia muotoja.

Se tosiseikka, että hyytymistekijä Villin polypep-tidiketjun aminohappojen Arg-740 ja Glu-1649 välinen keskiosan runsaasti glykosyloitunut alue ei näytä olevan täy-20 delliselle biologiselle aktiivisuudelle välttämätöntä, on saanut useat tutkijat yrittämään tätä aluetta vailla olevien yhdistelmä-hyytymistekijäjohdannaisten valmistamista. Tämä on tehty deletoimalla hyytymistekijä Villin keskiosassa sijaitsevaa runsaasti glykosyloitunutta aluet-. 25 ta koodittava cDNA joko kokonaan tai osittain.

Esimerkiksi julkaisussa J.J. Toole, et ai. on raportoitu kaksi eri tapausta sellaisten hyytymistekijä VIII -molekyylien konstruktiosta ja ilmentämisestä, joista puuttuvat aminohapot 982 - 1562 ja 760 - 1639 [Proc. Natl. 30 Acad. Sei. USA 83 (1986) 5939 - 5942]. Julkaisussa D.L.

: Eaton et ai. on raportoitu sellaisen hyytymistekijä Villin konstruktio ja ilmentäminen, josta puuttuvat aminohapot 797 - 1562 [Biochemistry 25 (1986) 8343 - 8347]. R.J.

Kaufman on kuvannut sellaisen hyytymistekijä Villin il-35 mentämisen, josta puuttuvat aminohapot 741 - 1646 (PCT- 4 107539 patenttihakemusjulkaisu nro WO 87/04 187). Julkaisussa N.

Sarver et ai. on raportoitu sellaisen hyytymistekijä VIII:n konstruktio ja ilmentäminen, josta puuttuvat aminohapot 747 - 1560 (DNA 6 (1987) 553 - 564). M. Pasek on 5 raportoinut kaksi eri tapausta sellaisten hyytymistekijä VIII -molekyylien konstruktiosta ja ilmentämisestä, joista puuttuvat aminohapot 745 - 1562 ja aminohapot 741 -1648 (PCT-patenttihakemusjulkaisu nro 88/00 831). K.-D.

Lagner on raportoinut kaksi eri tapausta sellaisten hyyty-10 mistekijä VIII:n molekyylien konstruktiosta ja ilmentämisestä, joista puuttuvat aminohapot 816 - 1598 ja aminohapot 741 - 1689 [Behring Inst. Mitt. 82 (1988) 16 - 25, EP 295 597]. Julkaisussa P. Meulien et ai. on raportoitu kaksi eri tapausta sellaisten hyytymistekijä VIII -molekyy-15 lien konstruktiosta ja ilmentämisestä, joista puuttuvat aminohapot 868 - 1562 ja aminohapot 771 - 1666, [Protein Engineering 2(4) (1988) 301 - 306, EP O 303 540 AI]. Ilmennettäessä näitä hyytymistekijä VIII:n cDNA:n muotoja nisäkässoluissa ovat tuotantopitoisuudet tyypillisesti 20 10 kertaa korkeampia hyytymistekijä VIII:aan verrattuna.

On lisäksi tehty yrityksiä ilmentää erikseen kahdesta eri cDNA-johdannaisesta peräisin olevia 90 kDa:n ja 80 kDa:n ketjuja samassa solussa [Burke, R.L., et ai., J.

Biol. Chem. 261 (1986) 12574 - 12578, Pavirani, A., et . 25 ai., Biochem. Biophys. Res. Comm., 145 (1987) 234 - 240].

Talteen saadun hyytymistekijä VIII:C:n aktiivisuuden palautuminen in vivo -olosuhteissa näyttää tässä systeemissä kuitenkin olevan tehokkuudeltaan rajoitettua.

Tässä keksinnössä kuvataan deletoituja hyytymis-30 tekijä VIII:n cDNA-molekyylejä, jotka koodaavat yhdistel-: mä-hyytymistekijän johdannaisia, joiden moolimassa ja muut biokemialliset ominaisuudet vastaavat aiemmin aikaansaatua plasman hyytymistekijä VIII:n muotoa, jota esiintyy huomattavissa määrin kaupallisissa tiivisteissä [Andersson, 35 L-0. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2979 - r 5 107539 2983]. On todennäköistä, että näillä uusilla deletoiduilla hyytymistekijä VIII:n cDNA-johdannaisilla saatavat yhdiste lmä-hyy tyrni s teki j äprot ei inin saannot ovat riittävän suuret näiden käyttöön teollisessa menetelmässä yhdistelmä-5 hyytymistekijä VIII:n farmaseuttiseksi valmistamiseksi.

Käytetyt määritelmät

Seuraavissa kappaleissa termin "hyytymistekijä Villin deleetiojohdannainen" määritelmänä on sellainen yksi tai useampi polypeptidiketju, jolla on hyytymistekijä 10 VIII:C -aktiivisuutta ja joka on johdettu täysimittaisesta 2332 aminohapon suuruisesta hyytymistekijä Villin polypep-tidistä deletoimalla aminohapot 741 - 1648 käsittävä segmentti ja korvaamalla mainittu segmentti ainakin kolmesta emäksisestä aminohaposta, toisin sanoen lysiinistä tai 15 arginiinista, koostuvalla kytkijäsegmentillä. Termin "hyytymistekijä VIII:RE" määritelmänä on polypeptidiketju, joka on peräisin täysimittaisesta hyytymistekijä Villistä ja josta puuttuvat aminohapot 741 - 1648. Termin "hyytymistekijä VIIIiQD" määritelmänä on polypeptidiketju, joka 20 on peräisin täysimittaisesta hyytymistekijä Villistä ja josta puuttuvat aminohapot 745 - 1562. Termin "hyytymistekijä VIIIiR3" määritelmänä on polypeptidi, josta puuttuvat aminohapot 741 - 1648 ja jossa mainitun segmentin tilalla on kaksi arginiiniryhmää. Termin "hyytymistekijä 25 VIIIiR4" määritelmänä on polypeptidi, josta puuttuvat ami nohapot 741 - 1648 ja jossa mainitun segmentin tilalla on kolme arginiiniryhmää. Termin "hyytymistekijä VIIIiR5" määritelmänä on polypeptidi, josta puuttuvat aminohapot 741 - 1648 ja jossa mainitun segmentin tilalla on neljä 30 arginiiniryhmää.

Keksinnön kuvaus Tässä keksinnössä käsitellään menetelmiä sellaisten proteiinien valmistamiseksi, joilla on hyytymistekijä VII-IiC -aktiivisuutta. Tarkemmin sanottuna tästä keksinnöstä 35 saadaan käyttöön täysimittaisesta hyytymistekijä Villin 6 107539 cDNA:sta peräisin olevia modifioituja hyytymistekijä Villin cDNA-jaksoja, joista eläinsoluissa ilmennettäessä saadaan syntymään suurina pitoisuuksina proteiineja, joilla on hyytymistekijä VIII:C -aktiivisuutta ja jotka koostuvat 5 olennaisesti kahdesta polypeptidiketjusta, joiden moolimassat ovat 90 kDa ja 80 kDa.

Tästä keksinnöstä saadaan siten käyttöön biologisesti aktiivista yhdistelmä-humaanihyytymistekijä Villin johdannaista koodaava DNA-jakso, jolle on tunnusomaista, 10 että se käsittää ensimmäisen DNA-segmentin, joka koodittaa humaani-hyytymistekijä Villin aminohappoja 1 - 740, ja toisen dna-segmentin, joka koodittaa humaani-hyytymistekijä Villin aminohappoja 1649 - 2332 ja mainitut segmentit yhdistää kytkijä-DNA-segmentti, joka koodittaa lysiinistä 15 tai arginiinista koostuvaa ainakin kolmen ja korkeintaan noin kymmenen aminohapon mittaista kytkijäpeptidiä.

Vaikkakin mainitun kytkijä-DNA-segmentin kooditta-man kytkijäpeptidin pituus ei ole ratkaiseva, on edullista, että se ei sisällä enempää kuin noin 10 aminohapporyh-20 mää.

On erityisen edullista, että kytkijäpeptidi koostuu kolmesta tai neljästä aminohapporyhmästä. On erityisen edullista, että Glu-1649iää edeltävä aminohapporyhmä on arginiini.

25 Tämän keksinnön mukaisesti on edullista, että kaik ki kytkijäpeptidin muodostavat ryhmät ovat arginiiniryh-miä.

On huomattava, että kytkijäpeptidi muodostuu emäksisistä aminohapoista, nimittäin lysiini- ja/tai arginii-30 niryhmistä. Näistä ryhmistä ovat arginiiniryhmät edulli sia.

Tämä keksintö liittyy myös sellaisen transkriptio-yksikön sisältävään yhdistelmä-ilmentämisvektoriin, jolle on tunnusomaista, että se käsittää edellä kuvatun DNA-jak-35 son ja lisäksi promoottorin ja polyadenylaatiosignaalijak-son.

7 107539 Tämä keksintö kattaa myös eläimistä peräisin olevat isäntäsolut, joille on tunnusomaista, että ne on transformoitu edellä esitetyllä yhdistelmä-ilmentämisvektorilla.

Tästä keksinnöstä saadaan lisäksi käyttöön menetel-5 mä edellä esitetyn kuvauksen mukaisen biologisesti aktiivisen yhdistelmä-humaanihyytymistekijä VIII :n johdannaisen valmistamiseksi jolle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 8 esitetään. Menetelmä käsittää sen, että viljellään edellä kuvatulla yhdistelmä-ilmentä-10 misvektorilla transformoitua eläinsolulinjaa ravintoliuoksessa, joka mahdollistaa sellaisen humaanihyytymistekijä VIII:n johdannaisen ilmentämisen ja erittämisen, joka koostuu 90 kDam suuruisesta alueesta ja tähän metalli-ionisidoksella liittyneestä 80 kDa:n suuruisesta alueesta, 15 ja että mainittu ilmennetty johdannainen otetaan tämän jälkeen talteen soluviljelyliuoksesta.

Keksinnön mukainen menetelmä mahdollistaa sellaisen humaanihyytymistekijä VIII:n johdannaisen valmistamisen, joka käsittää humaanihyytymistekijä VIII:n 90 kDa:n suu-20 ruisen ketjun ja metalli-ionin välityksellä tähän kytkeytyneen 80 kDa:n suuruisen ketjun ja jossa yhdistämiseen on käytetty vaihtoehtoisesti kytkijäpeptidiä tai tämän osaa.

Jotta kyettäisiin saamaan aikaan edellä olevat po-lypeptidiketjut käsittävä proteiini, jolla on hyytymiste-25 kijä VIII:C -aktiivisuutta, on in vivo -olosuhteissa suoritetussa translaatiossa muodostunut yhtenäinen polypepti-diketju pilkottava joko käyttäen biosynteesin aikaista posttranslationaalista prosessointia molekyyliä tuottavassa solussa tai käyttämällä in vitro -olosuhteissa tapahtu-30 vaa proteolyyttistä prosessointia tai kumpaakin näistä.

' _ Koska humaaniplasmasta on eristettävissä hyytymistekijä VIII:C -aktiivisuutta omaava proteiini, joka käsittää kaksi polypeptidiketjua, joiden moolimassat ovat 200 kDa ja 80 kDa, otaksutaan yksiketjuisessa täysimittaisessa hyyty-35 mistekijä Villin primaarisessa translaatiotuotteessa esiintyvän sopiva prosessoivia entsyymejä vastaava pilk- 8 107539 koutumiskohta. Tärkeä in vivo -olosuhteissa toiminnallinen prosessointikohta sijaitsee todennäköisimmin Arg-1648:n karboksiterminaalisella puolella. Proteolyyttisen maturaa-tion aikana kohdalla Arg-1678 tapahtuvasta pilkkoutumises-5 ta syntyy edellä mainituista 200 kDa:n ja 80 kDa:n mooli-massaisista ketjuista koostuva hyytymistekijä VIII -proteiini. Koska Arg-1648 näyttää sijaitsevan hyytymistekijä VIII -molekyylissä olevien rakenteellisten alueiden välissä, se voi muodostaa prosessointientsyymin tai -entsyymien 10 kohteen, johon pääsylle ei ole steerisiä esteitä. Toinen prosessointikohta voi olla kohdalla Arg-740, josta aiheutuu 200 kDa:n ketjun konversio 90 kDa:n ketjuksi in vitro -olosuhteissa, joka siten johtaa kaupallisissa humaani-plasmasta peräisin olevissa hyytymistekijä VIII -tiivis-15 teissä hyytymistekijä VIII:n 90 kDa:n ja 80 kDa:n muotoihin. Tämän keksinnön mukaisesti on havaittu, että sellaisten hyytymistekijä VIII:n deleetiojohdannaisten valmistamiseksi, jotka voidaan prosessoida joko in vivo- tai in vitro -olosuhteissa kahdeksi moolimassoiltaan 90 kDa ja 20 80 kDa olevaksi polypeptidiketjuksi, voidaan täysimittai sessa hyytymistekijä VIII -proteiinissa olevia Arg-740 ja Glu-1649-ryhmää yhdistävä 908 aminohapon suuruinen polypeptidiket ju korvata ainakin kolmella emäksisellä amino-happoryhmällä, toisin sanoen lysiini- tai arginiiniryhmil-. 25 lä tai näillä molemmilla. Glu-1649:n aminoterminaalisella t puolella olevan aminohapon tulisi edullisesti olla argi-niiniryhmä.

Edellisen esityksen mukaisten kaksi polypeptidi-ketjua sisältävien hyytymistekijä VIII -proteiinien tuo-30 tanto suurina pitoisuuksina sopivissa isäntäsoluissa vaa-: tii sen, että hyytymistekijä Villin deleetion sisältävät johdannais-cDNA-molekyylit kootaan tehokkaiksi transkrip-tioyksiköiksi niihin yhdistettyine sopivine säätely-yksik-köineen kloonausvektoriin, joka voidaan kasvattaa E. co-35 lissa alan ammattimiesten tuntemilla menetelmillä. Trans- 9 107539 kription tehokkaat säätely-yksiköt voivat olla peräisin viruksista, joiden luonnollisia isäntiä ovat eläinsolut, tai ne voivat olla peräisin eläinsolujen kromosomaalisesta DNA:sta. Voidaan edullisesti käyttää promoottori-enhanse-5 ri-yhdistelmiä, jotka ovat peräisin Simian Virus 40:stä, adenoviruksesta, BK-polyomaviruksesta, ihmisen sytomegalo-viruksesta tai Rous sarcoma -viruksen LTR-jaksosta (pitkästä terminaalisesta toistumajaksosta), tai voidaan käyttää promoottori-enhanseri-yhdistelmiä, joihin kuuluvat 10 eläinsoluissa voimakkaasti transkriptioon konstitutiivi-sesti osallistuvat geenit, kuten beeta-aktiini tai GRP78. Jotta sellaisten mRNA-molekyylien pitoisuudet, joiden transkriptio tapahtuu hyytymistekijä Villin cDNA-molekyy-leistä, kyettäisiin saamaan pysyvästi korkealle tasolle, 15 tulisi transkriptioyksikön 3'-puoleisessa osassa olla transkription terminaatio-polyadenylaatiojaksoa koodittava DNA-alue. Tämä jakso on edullisesti peräisin Simian Virus 40:n varhaisessa vaiheessa transkriptoituvalta alueelta, kaniinin beeta-globiinigeenistä tai ihmisen kudosplasmino-20 geeniaktivaattorigeenistä.

Tehokkaiksi transkriptioyksiköiksi kootut hyytymistekijä VIII:n cDNA-molekyylit viedään tämän jälkeen sopivaan isäntäorganismiin eri hyytymistekijä VIII -proteiinien ilmentämistä varten. Tämän organismin tulisi olla 25 edullisesti eläinsolulinja, joka on peräisin selkärankai sista, jotta kyettäisiin varmistamaan, että sen ketjun laskostuminen, disulfidisidosten muodostuminen, asparagii-niin liittynyt glykosylaatio ja muut posttranslationaali-set modifikaatiot sekä erittyminen viljelyliuokseen tapah-30 tuisivat oikealla tavalla. Esimerkkejä muista posttransla- tionaalisista modifikaatioista ovat tyrosiinin O-sulfataa- « tio ja vastasyntyneen polypeptidiketjun proteolyyttinen prosessointi, joka on oleellista 90 kDa:n ja 80 kDa:n kak-siketjuisten hyytymistekijä VIII -molekyylien muodostuin! -35 selle. Esimerkkejä solulinjoista, joiden käyttö voi tulla 10 107539 kyseeseen, ovat apinan COS-solut, hiiren L-solut, hiiren C127-solut, hamsterin BHK-21-solut, ihmisen alkion munuaisen 293-solut ja edullisesti CHO-solut.

Hyytymistekijä Villin cDNA-molekyylejä koodittavat 5 transkriptioyksiköt voidaan viedä eläinsolulinjaan useita eri keinoja käyttäen. Voidaan esimerkiksi muodostaa yhdis-telmämolekyylejä, joissa on edellä kuvattuja transkriptio-yksiköltä ja eri eläinviruksiin perustuvia vektoreita. Esimerkkejä näistä ovat baculovirukseen, vacciniaviruk-10 seen, adenovirukseen ja edullisesti naudan papillomaviruk-seen perustuvat vektorit.

Hyytymistekijä Villin cDNA-molekyylejä koodittavat transkriptioyksiköt voidaan tuoda eläinsoluihin yhdessä jonkin muun yhdistelmägeenin kanssa, joka voi toimia do-15 minanttina selektiomarkkerina näissä soluissa sellaisten spesifisten solukloonien eristämisessä käytettävänä apukeinona, joiden genomiin yhdistelmä-DNA on liittynyt. Esimerkkejä tämäntyyppisistä dominanteista selektiomarkkeri-geeneistä ovat Tn5-aminoglykosidifosfotransferaasi, joka 20 aiheuttaa resistenssin genetisiinille (G418), hygromysii-nifosfotransferääsi, joka aiheuttaa hygromysiiniresistens-sin, ja puromysiiniasetyylitransferääsi, joka aiheuttaa puromysiiniresistenssin. Tällaista selektiomarkkeria koo-dittava transkriptioyksikkö voi olla joko samassa vekto-25 rissa kuin se vektori, joka koodittaa hyytymistekijä VIII:n cDNA-molekyyliä tai se voi olla isäntäsoluun tuotavan ja tähän liittyvän erillisen vektorin koodittama, jolloin on usein tuloksena eri transkriptioyksiköiden sitoutuminen fysikaalisesti lujasti yhteen.

30 Muuntyyppiset selektoitavat markkerigeenit, joita voidaan käyttää yhdessä hyytymistekijä Villin cDNA-mole-kyylin kanssa, perustuvat erilaisiin transkriptioyksiköi-hin, jotka koodittavat dihydrofolaattireduktaasia (dhfr). Tämäntyyppisen geenin tuomisesta soluihin, joilta puuttuu 35 endogeeninen dhfr-aktiivisuus ja jollaisia ovat edullises- 11 107539 ti CHO-solut (DUKX-B11, DG-44), on seurauksena näiden solujen kyky kasvaa nukleosideja sisältämättömillä ravinto-liuoksilla. Esimerkki tällaisesta mediumista on Hamin F12 -kasvatusliuos, josta puuttuvat hypoksantiini, thymidiini 5 ja glysiini. Nämä dhfr-geenit voidaan tuoda yhdessä hyytymistekijä VIII:n cDNA-transkriptioyksiköiden kanssa edellistä tyyppiä oleviin CHO-soluihin joko samaan tai eri vektoriin liitettynä ja ne muodostavat siten yhdistelmä-hyytymistekijä VIII -proteiinia tuottavia dhfr-positiivi-10 siä solulinjoja.

Jos edellä kuvattuja solulinjoja kasvatetaan syto-toksisen dhfr-inhibiittorin, metotreksaatin, läsnä ollessa, syntyy uusia metotreksaatille vastustuskykyisiä solu-linjoja. Näissä solulinjoissa voi yhdistelmä-hyytymisteki-15 jä-proteiinin tuotto olla nopeutunut, mikä johtuu kytket tyjen dhfr- ja hyytymistekijä VIII:n transkriptioyksiköi-den lukumäärän lisääntymisestä. Kun näitä solulinjoja kasvatetaan lisääntyvissä metotreksaattikonsentraatioissa (1-10 000 nM), saadaan uusia solulinjoja, jotka tuotta-20 vat suuria määriä hyytymistekijä VIII -proteiinia.

Edellä kuvattuja hyytymistekijä VIII -proteiineja tuottavia solulinjoja voidaan kasvattaa suuressa mittakaavassa, joko suspensioviljelmässä tai erilaisilla kiinteillä kantaja-aineilla. Esimerkkejä näistä kantaja-ai-25 neista ovat dekstraani- tai kollageenimatriiseihin perustuvat mikrokantaja-aineet, tai ontelokuitujen muodossa olevat kiinteät kantaja-aineet tai erilaiset keraamiset materiaalit. Silloin kun edellä kuvattuja solulinjoja kasvatetaan suspensioviljelmässä tai mikrokantaja-aineiden 30 pinnalla, tämä voidaan tehdä joko kertaviljelmänä tai per-*. fuusioviljelmänä, jolloin solujen kasvatukseen käytettyä liuosta muodostuu pitkien ajanjaksojen kuluessa. Tämän keksinnön mukaisesti edellä kuvatut solulinjat soveltuvat mainiosti sellaisen yhdistelmä-hyytymistekijän tuotantoon 35 tarkoitetun teollisen menetelmän kehittämiseen, joka vas- 12 107539 taa ihmisen plasmasta eristettävissä olevaa autenttista kahdesta polypeptidiketjusta (90 kDa ja 80 kDa) koostuvaa hyytymistekijä VIII:aa.

Yhdistelmä-hyytymistekijä VIII -proteiini, joka 5 kerääntyy edellisen tyyppisten CHO-solujen kasvatusliuok-seen, voidaan konsentroida ja puhdistaa useilla erilaisilla biokemiallisilla menetelmillä mukaan lukien menetelmät, jotka perustuvat yhdistelmä-hyytymistekijä VIII -proteiinin ja solujen kasvatusliuoksessa olevien muiden aineiden 10 välisiin eroihin koossa, varauksessa, hydrofobisuudessa, liukenevuudessa, spesifisessä affiniteetissa jne.

Esimerkki tällaisesta puhdistuksesta on yhdistelmä-hyytymistekijä-proteiinin adsorptio monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joka on immobilisoitu kiinteän tukirakenteen 15 pinnalle. Desorption jälkeen hyytymistekijä VIII -proteiini voidaan puhdistaa edellä mainittuihin ominaisuuksiin perustuvilla erilaisilla kromatografisilla menetelmillä.

Tässä keksinnössä kuvatut yhdistelmä-proteiinit, joilla on hyytymistekijä VIII -aktiivisuutta, voidaan for-20 muloida terapeuttiseen käyttöön tarkoitetuiksi farmaseut tisiksi valmisteiksi. Puhdistetut hyytymistekijä VIII -proteiinit voidaan liuottaa tavanomaisiin fysiologisesti yhteensopiviin vesipitoisiin puskuriliuoksiin, joihin voidaan lisätä vaihtoehtoisesti farmaseuttisia lisäaineita 25 farmaseuttisten valmisteiden aikaansaamiseksi.

Tätä keksintöä kuvataan seuraavaksi vielä yksityiskohtaisemmin käyttämällä tätä keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä. Tämän keksinnön mukaiset erityiset sovellu-tusmuodot on kuvattu yhdessä oheistettujen piirrosten 30 kanssa, joissa:

Kuvio 1 on kaaviokuva täysimittaisen hyytymistekijä VIII:n ja hyytymistekijä VIII:R3:n, hyytymistekijä VIII: R4:n ja hyytymistekijä VIII:R5:n suhteesta. Tässä kuviossa on esitetty primaarirakenne alueesta, joka sijaitsee 90 13 107539 kDa:n ketjun C-terminaalisen pään (Arg-740) ja 80 kDatn ketjun N-terminaalisen pään (Glu-1649) välillä.

Kuvio 2 on kuvaus plasmidista pKGE491, joka sisältää hyytymistekijä VIII:R3-cDNA:n# jonka transkriptiota 5 ohjaa ihmisen sytomegaloviruksen promoottori.

Kuvio 3 on kuvaus plasmidista pKGE674, joka sisältää hyytymistekijä VIII:R4-cDNA:n, jonka transkriptiota ohjaa humaani-GRP78-promottori, ja lisäksi transkriptio-yksikön, joka koodaa hiiren dihydrofolaattireduktaasin 10 cDNA:ta, ja jonka transkriptiota ohjaa mouse mammary tumor -viruksen LTR-jakso.

Kuvio 4 on kuvaus plasmidista pKGE672, joka sisältää hyytymistekijä VIII:R5 -cDNA:n, joka on ihmisen GRP78-promoottorin transkriptiota säätelevän toiminnan alaisuu-15 dessa ja hiiren dihydrofolaattireduktaasin, joka on samanlainen kuin kuviossa 3 esitetty vektori.

Kuvio 5 on kuvaus plasmidista pKGE327, joka sisältää ainoastaan hiiren dihydrofolaattireduktaasi cDNA -transkriptioyksikön (vertaa kuvioon 3).

20 Kuvio 6 on kuvaus hyytymistekijä VIII:R3:n, hyyty mistekijä VIII:R4:n, hyytymistekijä VIII:R5:n ja plasmasta peräisin olevan hyytymistekijä VIII:n immunoblottauksesta natriumdodekyylisulfaatin läsnä ollessa suoritetun polyak-ryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen. Kanava A: plasman 25 hyytymistekijä VIII, kanava B: hyytymistekijä VIII:R3, kanava C: hyytymistekijä VIII:R4, kanava D: hyytymistekijä VIII:R5, kanava ST: BRL:n edeltäkäsin värjätyt moolimassa-standardit, suurimoolimassainen alue, jotka on hankittu Bethesda Research Laboratories -yhtiöstä.

30 Kuvio 7 esittää muutoksia yhdistelmä-hyytymistekijä VIII:R5:n hyytymistekijä VIII -aktiivisuudessa humaani-a-trombiinin kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen.

Kuvio 8 esittää muutoksia yhdistelmä-hyytymistekijä VIII:R5:n SDS-PAGE:n ja immunoblottauksen tuloksissa hu-35 maani-a-trombiinin kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen 14 107539 (0,01 NIH-yksikköä trombiinia/1 IU hyytymistekijä VIII: C:tä).

Esimerkki 1

Konstruoitiin sarja hyytymistekijä VIII:n cDNA:n 5 deleetiojohdannaisia, jotka koodattavat kokonaan ilman B-aluetta olevia polypeptidiketjuja, mutta jotka sisältävät eri määriä emäksisiä aminohappoja, jotka liittävät raskaan ketjun karboksiterminaalisen pään kevyen ketjun aminoterminaaliseen päähän. Nämä hyytymistekijä VIII:n 10 deleetiojohdannaisten primaariset translaatiotuotteet pro sessoituvat proteolyyttisesti in vivo -olosuhteissa kahdeksi polypeptidiksi. Seuraavissa esimerkeissä tarkoittavat aminohappojen nimitykset signaalijaksoa sisältämättömässä täysimittaisessa hyytymistekijä VIII -molekyylissä 15 olevia asemia.

Hyytymistekijä Villin cDNArn mutageneesi hyytymistekijä V11I:R3 -deleetion muodostamiseksi

Hyytymistekijä Villin deleetiojohdannaisen (hyytymistekijä Vili:RE, M. Pasek, PCT-patenttihakemusjulkaisu 20 nro W088/00 831, ATCC 53517) cDNAista saatu 627 emäsparin suuruinen Kpnl-Pstl-restriktiofragmentti, joka koodittaa aminohappoja Leu 587 ja Ala 1702 ja jotka on kytketty toisiinsa täysimittaisen hyytymistekijä Villin Arg 740:n ja Glu 1649 in välisellä suoralla fuusiolla, vietiin bakterio-25 fagivektoriin M13mpl9 [(Yanisch-Perron, C. et ai. Gene 33 (1985) 103 - 119] vakiomenetelmien mukaisesti. Oligonuk-leotidikohdemutageneesi [Nakamaye, K. ja Eckstein, F., Nucleic Acids. Res. 14 (1986) 9679 - 9698] suoritettiin yksinauhaisella DNA-templaatilla, joka oli valmistettu 30 edellä kuvatusta yhdistelmä-bakteriofagista. 10 pgin erän . puhdistettua rengasmaista yksinauhaista faagi-DNAita an nettiin liittyä yhteen pituussuunnassa 8 pikomooliin 5'-puoleisesta päästä fosforyloitua oligonukleotidia, jolla oli jakso: 15 107539 5'-AACAATGCCATTGAACCAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG-3'

Tulokseksi saadulla templaatilla syntetisoitiin toinen 5 rengasmainen DNA-nauha käyttämällä seosta, joka koostui kaikista neljästä deoksinukleotidista, dCTPaS:stä, 12 yksiköstä DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia ja 12 yksiköstä T4-DNA-ligaasia. Kun reaktioseosta oli inkuboitu yön yli 16 °C:ssa, siitä rikastettiin kaksinauhainen DNA suo-10 dattamalla nitroselluloosan läpi 500-millimolaarisen NaCl:n läsnä ollessa. Viidesosaan puhdistetusta kaksinau-haisesta DNArsta valmistettiin katkoksia inkuboimalla sitä 5 yksikön kanssa Ncil-restriktioentsyymiä ja suorittamalla käsittely 50 yksiköllä eksonukleaasi III:a siihen asti, 15 että faagi-DNA:n templaattinauha saatiin osittain poistumaan. Tulokseksi saatu osittainen dupleksi tehtiin kaksi-nauhaiseksi käsittelemällä sitä 3 tunnin ajan 16 °C:ssa 3 yksiköllä DNA-polymeraasi I:tä ja 2 yksiköllä T4-DNA-ligaasia kaikkien neljän deoksinukleotiditrifosfaatin läs-20 nä ollessa. 300 μΐ kompetentteja E. coli TG1 -soluja transformoitiin yhdellä neljäsosalla saatua seosta. Kymmenelle saaduista faagiklooneista suoritettiin dideoksi-DNA-sekvenssointi [Sanger, F. et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467]. Yksi sekvenssoiduista faagi-25 klooneista sisälsi liitosjakson, jossa oli odotettu edellä kuvatun mutageenisen alukkeen mukainen nukleotidijakso. Faagi-liitosjakso koostuu siten hyytymistekijä VIII:n cDNArn 630 emäsparin suuruisesta Kpnl-Pstl-fragmentista, joka koodittaa Arg 740:n ja Glu 1649:n välistä fuusiota 30 kahden ylimääräisen Arg-ryhmän välityksellä (hyytymisteki-; jä VIII:R3).

Hyytymistekijä VIII:R3:a koodittavan nisäkäsilmen-tämisvektorin konstruktio

Edellä esitetyn kuvauksen mukaista hyytymistekijä 35 VIII:R3:a koodittava 630 emäsparin suuruinen Kpnl-PstI- 16 107539 fragmentti pilkottiin Ml3mpl9-faagin DNA:n kaksinauhai-sesta replikatiivisesta muodosta ja vietiin vektoriin pKGE431. Tämä vektori koostuu pUC19:ssä olevan hyytymistekijä VIII:RE:n cDNAista peräisin olevasta 2 046 emäsparin 5 suuruisesta Kpnl-SphI-fragmentista (M. Pasek, PCT-patent-tihakemusjulkaisu nro W088/00 831, ATCC 53517), joka koodi ttaa hyytymistekijä VIII:RE -proteiinin aminohappoja Leu 587 - Met 2176. Edellä esitetyn kuvauksen mukainen hyytymistekijä Vili:R3 -fuusiota koodittava 630 emäsparin suu-10 ruinen fragmentti liitettiin pKGE431:een, joka oli pilkottu täydellisesti Kpnlrlla ja osittaisesti Pstl:lla. Tulokseksi saatu vektori pKGE490 sisältää 2 052 emäsparin suuruisen Kpnl-SphI-liitosjakson, joka koodittaa hyytymistekijä VIII:R3:n aminohappoja Leu 587 - Met 2176. pKGE490 15 pilkottiin Kpnl:llä ja Apal:llä ja vastaava hyytymistekijä VIII :R3 -proteiinin aminohappoja Leu 587 - Ala 2047 koodittava 1 665 emäsparin suuruinen fragmentti liitettiin ligaasilla Kpnl:llä ja Apal:llä pilkotun vektorin pKGE347 suureen fragmenttiin. Vektori pKGE347, joka perustuu E. 20 coli -kloonausvektoriin pBR327, koostuu 741 emäsparin suuruisessa DNA-segmentissä olevasta ihmisen sytomegaloviruk-sen enhanseri/promoottorijaksosta [nukleotidiasemat -671 -+71, Boshart, M. et ai., Cell 41 (1985) 521 - 530], joka sijaitsee vastasuuntaan hyytymistekijä VIII:QD:n cDNA:han 25 nähden, ja se sisältää SV40:n t-antigeenin intronin ja 3'-puoleisessa päässä olevan polyadenylaatiojakson. Tulokseksi saatu vektori (pKGE491), joka on esitetty kuviossa 2, sisältää täydellisen hyytymistekijä VIII:R3:n cDNA:n ja on identtinen pKGE347:n suhteen koodittamaansa erilaista de-30 leetiojohdannais-hyytymistekijä VIII:aa lukuun ottamatta.

*. Hyytymistekijä VIII:n cDNA:n mutageneesi hyytymis tekijä VIII:R4 -deleetion muodostamiseksi Edellisen kuvauksen mukainen hyytymistekijä VIII: R3:n cDNA:n osaa koodittava 630 emäsparin suuruinen Kpnl-35 Pstl-fragmentti vietiin samoilla entsyymeillä avattuun 17 107539 vektoriin pUC19. Tulokseksi saadulle vektorille, jolle annettiin nimitys pKGE657, suoritettiin kohdemutageneesi käyttäen limittäisten alueiden pidentämistä polymeraasiketjureaktiolla [Ho, S.N., et ai., Gene 77 (1989) 51 - 59; 5 Saiki, R.K., et ai., Science 239 (1988) 487 - 491]. Muta-geneesireaktion ensimmäisessä vaiheessa järjestettiin kaksi rinnakkaiskoetta. Kokeessa nro 1 sekoitettiin 100 ng plasmidia pKGE657 1 mikromolaariseen pitoisuuteen kumpaakin seuraavista kahdesta alukkeesta: 10 5-ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3' 5'-GATAACAATTTCACACA-3' Tähän lisättiin lopulliseen 100 μ1:η tilavuuteen seos, 15 jonka koostumus oli 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % gelatiini, 200 μΜ kutakin neljää de-oksinukleotidiä ja 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia. Näytteille suoritettiin 25 käsittelyjaksoa, joissa denaturaa-tio tapahtui 1 minuutin ajan 94 °C:ssa, liittyminen vas-20 tinnauhaan 2 minuutin ajan 50 °C:ssa ja pidentäminen 3 minuutin ajan 72 °C:ssa ja joissa käytettiin DNA Thermal Cycler -laitetta valmistajan (Perkin Elmer Cetus) ohjeiden mukaisesti. Reaktiotuotteiden analyysi agaroosigeelielek-troforeesilla ja värjäys vakiomenetelmillä osoitti, että . 25 oli saatu muodostumaan yksi amplifioitu DNA-tuote, jonka pituus oli 240 emäsparia. Kokeessa nro 2 suoritettiin identtinen polymeraasiketjureaktio, jossa käytettiin seu-raavia alukkeita: 30 5'-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3’ 5'-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3' «

Reaktiotuotteiden analyysi agaroosigeelielektro-foreesilla osoitti, että oli saatu muodostumaan yksi amp-35 lifioitu DNA-tuote, jonka pituus oli 550 emäsparia. Muta- 18 107539 geneesin toisessa osassa yhdistettiin 10 μΐ kumpaakin edellisistä rinnakkaiskokeista saatuja tuoteseoksia kolmanteen polymeraasiketjureaktioon, jonka kokonaistilavuus oli 100 μΐ ja olosuhteet samat kuin edellä, paitsi että 5 käytettiin ainoastaan kahta seuraavanlaista aluketta: 5’-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3' 5'-GATAACAATTTCACACA-3' 10 Reaktioseoksen analyysi agaroosigeelielektroforeesilla osoitti, että oli saatu muodostumaan yksi amplifioitu DNA-tuote, jonka pituus oli 750 emäsparia. Tämä DNA-fragmentti pilkottiin Kpnlillä ja Pstl:llä ja se liitettiin samoilla entsyymeillä avattuun pUC19:aan. Useiden tulokseksi saatu-15 jen plasmidien DNA sekvenssoitiin dideoksiryhmään päättyvän ketjun menetelmällä (Sanger et ai., ks. edellä) ja plasmidille, jossa oli odotettu 633 ep:n suuruinen Kpnl-Pstl-fragmentti ja jonka jakso oli oikea, annettiin nimitys pKGE658. Tämä plasmidiliitosjakso koostuu siten sel-20 laisesta hyytymistekijä VIII:R4:n cDNArsta, joka koodittaa

Arg 740:n ja Glu 1649:n välistä fuusiota kolmen Arg-ryhmän välityksellä.

Hyytymistekijä VlII:R4:ää koodittavan nisäkäsilmen-tämisvektorin konstruktio 25 Vektorista pKGE658 irrotettiin hyytymistekijä VIII: R4:n cDNA:ta koodittava 633 emäsparin suuruinen Kpnl-

Pstl-fragmentti ja tämä vietiin vektoriin pKGE490, joka oli pilkottu täydellisesti Kpnl:lla ja osittaisesti Pstlrlla. Tulokseksi saatu vektori pKGE673 sisältää 30 2 055 emäsparin suuruisen Kpnl-SphI-liitosjakson, joka koodittaa hyytymistekijä VIII:R4:n aminohappoja Leu 587 -Met 2176. pKGE673:sta irrotettiin hyytymistekijä VIII:R4:n aminohappoja Leu 587 - Ala 2047 koodittava 1 668 emäsparin suuruinen Kpnl-Apal-fragmentti ja tämä siirrettiin samoil-35 la entsyymeillä avatun vektorin pKGE601 suureen fragment- 19 107539 tiin. Vektori pKGE601, joka perustuu E. colin kloonausvek-toriin pML2, koostuu 433 emäsparin suuruisen DNA-segmentin koodittamasta humaani-GRP78: n enhanseri/promoottori jaksos-ta [nukleotidiasemat 2 - 445, Ting, J. & Lee, A.S. DNA 5 7(4) (1988) 275 - 286], joka sijaitsee vastasuuntaan hyy tymistekijä VIII:R5:n cDNA:han nähden, sekä SV40:n t-anti-geenin intronista ja 3’-puoleisella alueella olevasta po-lyadenylaatiojaksosta. Tähän alueeseen nähden myötäsuun-taan on sijoitettu mouse mammary tumor -viruksen LTR-jak-10 son ohjaama hiiren dihydrofolaattireduktaasin cDNA:ta koo-dittava transkriptioyksikkö, jossa on käytetty SV40:n 3’-puoleista ohjausyksikköä, joka oli sama kuin aiemmin käytössä ollut yksikkö. Tulokseksi saatu vektori pKGE674 on esitetty kuviossa 3.

15 Hyytymistekijä VIII:n cDNÄ:n mutageneesi hyytymis tekijä VIII:R5 -deleetion muodostamiseksi

Vektorille pKGE 657 tehtiin limittäisten alueiden pidentämiseen perustuva kohdemutageneesi, joka oli analoginen edellisen esimerkin mukaisen hyytymistekijä VIII: 20 R4:ää koskevan menettelyn suhteen. Ensimmäisessä kahdesta rinnakkaisesta reaktiosta käytetyt alukkeet olivat: 5’-ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3' 5'-GATAACAATTTCACACA-3’ 25 •

Edellisen esimerkin mukaisella agaroosigeelielek-troforeesilla suoritettu reaktiotuotteiden analyysi osoitti, että siinä oli muodostunut 240 emäsparin suuruinen reaktiotuote.

30 Toisessa kahdesta rinnakkaisesta reaktiosta käyte- tyt alukkeet olivat: 5’-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3' 5'-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3' 20 107539

Agaroosigeelielektroforeesilla suoritettu reaktio-tuotteiden analyysi osoitti, että oli saatu muodostumaan 550 emäsparin suuruinen reaktiotuote. Mutageneesikokeen toisessa osassa, joka oli analoginen edellisessä esimer-5 kissä kuvatun osan suhteen, saatiin 760 emäsparin suuruinen amplifioitu DNA-tuote. Kpnl:llä ja Pstlrllä suoritetun pilkkomisen jälkeen tämä DNA vietiin plasmidiin pKGE490, joka oli pilkottu täydellisesti Kpnlrllä ja osittaisesti PstI:llä.

10 Plasmidille, jolla oli 636 emäsparin suuruinen ja dideoksiryhmään päättyvien ketjujen menetelmällä suoritetun määrityksen mukaan oikean jakson omaava Kpnl-Pstl-fragmentti, annettiin nimitys pKGE659 ja se sisältämään kokonaisuuteen kuuluu 2 058 emäsparin suuruinen Kpnl-Sphl-15 liitosjakso, joka koostuu sellaisesta hyytymistekijä VIII: R5:n cDNA:n fragmentista, joka koodittaa Arg 740:n ja Glu 1649:n välistä fuusiota neljän ylimääräisen Arg-ryhmän välityksellä.

Hyytymistekijä VIII:R5:ä koodattavan nisäkäsilmen-20 tämisvektorin konstruktio

Hyytymistekijä VIII:R5:n aminohappoja Leu 587 - Ala 2047 koodattava 1 688 emäsparin suuruinen Kpnl-Apal-fragmentti pilkottiin pois vektorista pKGE659 ja vietiin samoilla entsyymeillä avatun pKGE601-vektorin suureen frag- . 25 menttiin käyttäen suoritustapaa, joka oli samanlainen kuin « mitä oli käytetty edellä kuvatun hyytymistekijä VIII:R4:n ilmentämisvektorin pKGE674 ollessa kyseessä. Tulokseksi saatua hyytymistekijä VIII:R5:ä koodattava vektori (pKGE672) on esitetty kuviossa 4.

30 Esimerkki 2

Hyytymistekijä VIII:R3:a tuottavien kiinanhamsterin munasarjasolujen valmistaminen 0,5 miljoonaa dihydrofolaattireduktaasin suhteen vaillinaista kiinanhamsterin munasarjasolua (CH0-DG44, 35 saatu Dr. L.A. Chasinilta, Columbia University, New York) 21 107539 lisättiin kasvatusta varten Dulbecco's Modified Eagles Medium -kasvatusliuoksen ja Ham's F12 -kasvatusliuoksen seokseen (sekoitussuhde 1 : 1), jota oli täydennetty 10-%:isella fetaalisella vasikanseerumilla, ja niitä inku-5 boitiin yön yli 37 °C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä inkubaattorissa. Solut pestiin seuraavana päivänä tuoreella kasvatusliuoksella ja transfektoitiin tämän jälkeen kalsiumfosfaattimenetelmällä käyttäen 10 pg seosta, joka oli valmistettu hyytymistekijä VIII:R3 -ilmentämisvek-10 torista pKGE491 ja dihydrofolaattireduktaasivektorista pKGE327 tällä alalla tunnettuja menetelmiä noudattaen. Vektori pKGE327 sisältää transkriptioyksikön, joka koostuu hiiren dihydrofolaattireduktaasin cDNA:han nähden vas-tasuuntaan sijoitetusta mouse mammary tumor -viruksen LTR-15 jaksosta ja vektorissa olevasta SV 40:n t-antigeenistä ja 3-'puoleisessa osassa olevasta polyadenylaatiojaksosta, jotka on kloonattu myötäpäivään vektoriin pML2 (kuvio 5). Kolmantena päivänä suoritettiin kasvatusliuoksen poisto, solujen pesu ja jakaminen uusiin kasvatusmaljoihin. Nel-20 jäntenä päivänä aloitettiin dihydrofolaattireduktaasiposi- tiivisten solujen selektio korvaamalla kasvatusliuos edellä kuvatulla kasvatusliuoksella, josta’ puuttuivat hypo-ksantiini, glysiini ja tymidiini ja jota oli täydennetty 10-%:isella perusteellisesti dialysoidulla fetaalisella . 25 vasikanseerumilla. Kasvatusliuos vaihdettiin kaksi kertaa viikossa ja dihydrofolaattireduktaasipositiivisten solujen muodostamia pesäkkeitä voitiin koota talteen noin kahden viikon kuluttua. Nämä pesäkkeet yhdistettiin ja niitä kasvatettiin vielä 25 cm2:n soluviljelypulloissa ja kasvatus-30 liuos korvattiin tuoreella 3 % fetaalista vasikanseerumia : sisältävällä kasvatusliuoksella siinä vaiheessa, jolloin pesäkkeet eivät vielä peittäneet toisiaan. Kasvatusliuok-sessa oleva hyytymistekijä VIII:C -aktiivisuus tutkittiin 24 tunnin kuluttua synteettisen substraatin menetelmällä 35 (Coatest hyytymistekijä VIII:C, KABI-Pharmacia), jolloin 22 107539 ilmentymistasoksi saatiin 80 mU/ml. Yhdistetyille dihydro-folaattireduktaasipositiivisille soluille suoritettiin geenien amplifiointi viljelemällä niitä useita viikkoja ravintoliuoksessa, joka sisälsi dihydrofolaattireduktaasi-5 inhibiittoria, metotreksaattia. Asteittain nousevia meto-treksaattikonsentraatioita käyttäen suoritetun selektion jälkeen, jossa konsentraatio oli lopulta 500 mM, saatiin yhdistettyjä resistenttejä soluja käsittävä viljelmä, joka tuotti hyytymistekijä VIII:C:tä pitoisuudessa 1,0 U/ml 10 pyörityslaitepulloissa.

Hyytymistekijä VIII:R4:ää tuottavien kiinanhamste-rin munasarjasolujen valmistaminen Kiinanhamsterin munasarjasolut transfektoitiin hyytymistekijä VIII:R4:ää koodattavalla ilmentämisvektorilla 15 pKGE674 menetellen samoin kuin edellä kuvatun hyytymistekijä VIII:R3:a koodattavan ilmentämisvektorin transfektion ollessa kyseessä. Tässä tapauksessa rinnakkaistransfektio vektorilla pKGE 327 jätettiin suorittamatta, koska tässä vektorissa on selektio- ja amplifiointimarkkerina toimivaa 20 dihydrofolaattireduktaasia koodittava transkriptioyksikkö.

Sellaisessa ravintoliuoksessa suoritetun selektion jälkeen, josta puuttui hypoksantiini, glysiini ja tymiidiini, jota oli täydennetty 10-%:isella perusteellisesti dialy-soidulla vasikanseerumilla ja joka oli samanlainen kuin 25 mitä edellä oli käytetty, saatiin solukloonien yhdistelmä, « joka tuotti 400 mU/ml hyytymistekijä VIII:C -aktiivisuutta Coatest-menetelmällä mitattuna. Selektio geenien ampli-fioimiseksi suorittamalla kloonien viljely 20 nM metotrek-saatissa useiden viikkojen ajan antoi tulokseksi solujen 30 yhdistelmän, joka tuotti 500 mU/ml hyytymistekijä VIII: C:tä. Jatkoselektiosta, joka suoritettiin viljelemällä soluja 200 nM metotreksaattia sisältävässä kasvatusliuok-sessa, saatiin tulokseksi solujen yhdistelmä, joka tuotti 880 mU/ml hyytymistekijä VIII:C:tä. Nämä solut tuottivat 23 107539 800 mU/ml hyytymistekijä VIII:C:tä soluviljelyn tapahduttua pyörityslaitepulloissa.

Hyytymistekijä VIII:R5:ä tuottavien kiinanhamsterin munasarjasolujen valmistaminen 5 Kiinanhamsterin munasarjasolut transfektoitiin edellä esitetyllä tavalla hyytymistekijä VIII:R5:ä koodattavalla ilmentämisvektorilla pKGE672, joka koodittaa sekä hyytymistekijä VIII:R5:ä että samassa plasmidissa olevia dihydrofolaattireduktaasin transkriptioyksiköitä. Sellai-10 sessa ravintoliuoksessa suoritetun selektion jälkeen, josta puuttui hypoksantiini, glysiini ja tymiidiini ja jota oli täydennetty 10-%:isella perusteellisesti dialysoidulla vasikanseerumilla, saatiin solukloonien yhdistelmä, joka tuotti 110 mU/ml hyytymistekijä VIII:C -aktiivisuutta Coa-15 test-menetelmällä mitattuna. Selektio geenien amplifioimi-seksi solujen viljelyllä 20 nM metotreksaatissa useiden viikkojen ajan antoi tulokseksi solujen yhdistelmän, joka tuotti 1,5 U/ml hyytymistekijä VIII:C:ä pyörityslaitepulloissa.

20 Esimerkki 3

Hyytymistekijä VIII:R3:n, hyytymistekijä VIII:R4:n ja hyytymistekijä VIII:R5:n biokemiallinen luonnehtiminen

Esimerkissä 2 kuvattujen amplifioitujen CH0-DG44-25 solulinjojen yhdistelmien tuottamista hyytymistekijä VIII: R3:sta, hyytymistekijä VIII:R4:stä ja hyytymistekijä VIII:R5:stä tutkittiin niiden biokemialliset ominaisuudet. Soluviljelyliuoksesta peräisin olevan materiaalin puhdistus suoritettiin immunoaffiniteettikromatografiaa käyttäen 30 monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka oli suunnattu hyy-. tymistekijä VIII:aa vastaan, jonka jälkeen käytettiin io- ninvaihtokromatografiavaihetta. Saadun materiaalin spesifinen aktiivisuus oli alueella 3 000 - 4 000 IU/A280 ja hyytymistekijä VIII -aktiivisuuden ja hyytymistekijä VIII 35 -antigeenin välinen suhde oli lähes 1 (aktiivisuus määri- 24 107539 tettiin Coatest-määrityksellä (KABI-Pharmacia) ja antigeeni määritettiin ELISA-määrityksellä käyttäen 80 kDa:n ketjua vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita).

Puhdistetuille hyytymistekijä VIII:R3:lle, hyyty-5 mistekijä VIII:R4:lle ja hyytymistekijä VIII:R5:lle tehtiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja Western-blottausanalyysi. SDS-PAGE suoritettiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Laemmli, Nature 227 [(1970) 680 - 685]. Western-blottausanalyysiin, joka suo-10 ritettiin olennaisesti julkaisussa Towbin, H., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76 (1979) 4350 - 4354, kuvatulla tavalla, käytettiin aiemmin kuvattuja kaniinin poly-klonaalisia humaani-hyytymistekijä VIII:aa vastaan suunnattuja vasta-aineita [Andersson, L-0., et ai., Proc. 15 Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2979 - 2983]. Tulokset on esitetty kuviossa 6. Kanava A: plasman hyytymistekijä VIII, joka sisältää 80 kDa:n kevyen ketjun ja raskaita ketjuja, joiden massa on alueella 200 - 90 kDa. Kanava B: hyytymistekijä VIII:R3. Kanava C: hyytymistekijä VIII:R4. 20 Kanava D: hyytymistekijä VIII:R5. Hyytymistekijä VIII: R3:ssa esiintyy vyöhykkeitä, jotka ovat 80 kDa:n, 90 kDa:n, 130 kDa:n ja 170 kDa:n kohdalla. 80 kDa:n ja 90 kDa:n vyöhykkeiden havaittiin olevan geeleissä samoissa kohdissa kuin 80 kDa:n ja 90 kDa:n peptidit, jotka edusta-. 25 vat pienintä biologisesti aktiivista plasman hyytymisteki jä VIII:n kompleksia. 170 kDa:n vyöhyke vastaa todennäköisesti prosessoimatonta primaarista translaatiotuotetta ja 130 kDa:n kohdalla oleva vyöhyke väärällä tavalla prosessoitua hyytymistekijä VIII:R3:n muotoa. Siten ei-autentti-30 siä polypeptidejä on myös saatu 80 kDa:n ja 90 kDa:n suu-: ruisten ketjujen lisäksi. Hyytymistekijä VIII:R4:llä ja hyytymistekijä VIII:R5:llä esiintyy 80 kDa:n ja 90 kDa:n kohdalla olevat vyöhykkeet. Näissä mnateriaaleissa ei esiinny merkittävää määrää prosessoimatonta primaarista 35 translaatiotuotetta (170 kDa:n ketjua). Tämä tarkoittaa 25 107539 sitä, että näissä tapauksissa primaarisen translaatiotuot-teen proteolyyttinen prosessointi kahdeksi polypeptidiket-juksi in vivo -olosuhteissa oli tehokasta. Siten kummassakin tapauksessa saatiin kaksiketjuinen molekyyli, jonka 5 peptidiketjujen moolimassat vastaavat niiden ketjujen moo limassoja, jotka esiintyvät pienimmässä aktiivisessa plasman hyytymistekijä VIII:n muodossa. Lisäksi hyytymistekijä VIII:R5:n automaattisella Edman-hajotuksella määritetty N-terminaalisen jakson määritys osoitti, että 90 kDa:n ja 10 80 kDa:n ketjujen aminoterminaaliset päät ovat identtisiä plasmasta peräisin olevien 90 kDa:n sekä 80 kDa:n ketjut sisältävän hyytymistekijä VIII:n päihin verrattuna.

Kuvioissa 7 ja 8 on esitetty aktivointikäyrä ja SDS-PAGE/Western-blottaustulokset, jotka on saatu hyyty-15 mistekijä VlII:R5:n inkuboinnista trombiinin kanssa (trom-biinia lisättiin 0,01 U kutakin hyytymistekijä VIII -yksikköä kohti). Reaktioseoksesta saadut näytteet analysoitiin välittömästi yksivaiheisella hyytymän muodostumis-menetelmällä. [Mikaelsson, M. et ai., Blood 62 (1983) 20 1006 - 1015.] 17-kertainen aktivoituminen saatiin tapah tumaan kahdessa minuutissa, mitä seurasi inaktivoituulinen. Näytteissä olevan reaktion pysäyttämiseksi lisättiin natriumdodekyylisulfaattia pitoisuuteen 0,02 g/ml SDS/ PAGE-Western-blottausanalyysin suorittamiseksi. Elektrofo-25 reesi ja Western-blottausanalyysi suoritettiin reaktio-seoksesta aikavälein otetuista näytteistä kuviota 6 koskevan kuvauksen mukaisesti. Saadut tulokset osoittivat sen, että hyytymistekijä VIII -peptidien molekyyleissä tapahtuva muutos trombiinin kanssa suoritetun inkuboinnin aikana 30 on identtinen plasman hyytymistekijä VIII:n muutoksen • kanssa. Siten 90 kDa:n peptidi pilkkoutui trombiinilla, jolloin muodostuivat 50 kDa:n ja 40 kDa:n peptidit. 80 kDa:n peptidi pilkkoutui ja muodosti 70 kDa:n peptidin. Trombiinilla tehdyt tutkimukset osoittivat, että vuoro-35 vaikutuksessa tämän entsyymin kanssa hyytymistekijä VIII: 26 107539 R5 käyttäytyy plasman hyytymistekijä VIII:n tavoin. Tämän piirteen katsotaan olevan olennainen biologiselle aktiivisuudelle in vivo -olosuhteissa.

Hyytymistekijä VIII:R5:n vuorovaikutusta ihmisen 5 von Willebrand -tekijän kanssa tutkittiin käyttämällä molekyylikoon mukaisesti rajaavaa kromatografiaa Sepharose CL-6B:ssa. Kymmenen (10) IU hyytymistekijä VIII:R5:ä ja 30 U puhdistettua ihmisen von Willebrand -tekijää inkuboi-tiin keskenään 37 °C:ssa 20 minuutin ajan. Inkubointiseos 10 pipetoitiin tämän jälkeen Sepharose CL-6B:lla pakattuun pylvääseen. Kaikki se materiaali, jossa oli hyytymistekijä VIII -aktiivisuutta, eluoitui ulkoisessa tilavuudessa von Willebrand -tekijän mukana. Kun pylvääseen pipetoitiin hyytymistekijä VIII:R5:ä von Willebrand -tekijää lisäämät-15 tä, niin hyytymistekijä VIII -aktiivisuutta sisältävä materiaali eluoitui ainoastaan sisäisen tilavuuden fraktioissa kohdalla, jossa myös eluoitui plasman hyytymistekijä VIII:n 90 - 80 kDa:n muoto. Tämä tulos osoittaa, että hyytymistekijä VIII:R5:llä on kyky sitoutua von Willebrand 20 -tekijään, mikä on hyvään säilymiseen in vivo -olosuhteissa tarvittava ominaisuus [Brinkhous, K.M., el ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 8752 - 8756].

Tämän keksinnön mukaiset hyytymistekijä VIII -johdannaiset on talletettu talletuslaitokseen Deutsche Samm-25 lung von Mikroorganismen und Zellkulturen 13.3.1991. Tämän mukaisesti hyytymistekijä VIII:R3:lie on annettu haku-numero DSM 6415, hyytymistekijä VIII:R4:lle on annettu hakunumero DSM 6417, ja hyytymistekijä VIII:R5:lle on annettu hakunumero DSM 6416.

Claims (8)

27 107539

1. Biologisesti aktiivista yhdistelmä-humaani-hyytymistekijä VIII -johdannaista koodittava DNA-jakso, 5 tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisen DNA-segmentin, joka koodittaa humaani-hyytymistekijä VIII:n aminohappoja 1 - 740, ja toisen DNA-segmentin, joka koodittaa humaani-hyytymistekijä Villin aminohappoja 1649 -2332, ja mainitut segmentit on yhdistetty kytkijä-DNA-seg- 10 mentillä, joka koodittaa lysiinistä tai arginiinista koostuvaa ainakin kolmen tai korkeintaan noin kymmenen aminohapon mittaista kytkijäpeptidiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että kytkijä-DNA-segmentti koodittaa 15 kolmea tai neljää aminohapporyhmää.

3. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että kytkijä-DNA-segmentti koodittaa kolmea tai neljää aminohapporyhmää ja että Glu-1649:ää edeltävä aminohapporyhmä on arginiini.

4. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että kytkijä-osan kaikki ryhmät ovat arginiiniryhmiä.

5. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että kytkijä- . 25 DNA-segmentti koodittaa kolmea tai neljää aminohapporyh- mää, jotka ovat arginiineja.

6. Yhdistelmä-ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää transkriptioyksikön, joka käsittää minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukaisen

30 DNA-jakson, transkriptiossa käytettävän promoottorin ja . ; polyadenylaatiojakson.

7. Eläimestä peräisin oleva isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 6 mukaisella yhdistelmä-ilmentämisvektorilla. 28 107539

8. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen DNA-jakson ilmentämän biologisesti aktiivisen yhdistelmä-humaani-hyytymistekijä Villin johdannaisen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään 5 eläinsolulinjaa, joka on transfomoitu yhdistelmä-ilmentä-misvektorilla, joka sisältää transkriptioyksikön, joka sisältää mainitun DNA-jakson, transkriptiossa käytettävän promoottorin ja polyadenylaaatiojakson ravintoalustassa, joka mahdollistaa sellaisen humaanihyytymistekijä Villin 10 johdannaisen ilmentämisen ja erittämisen, joka koostuu kahdesta, 90 kDa:n ja 80 kDa:n suuruisesta polypeptidistä, jotka ovat liittyneet yhteen metalli-ionisidoksella, ja mainittu johdannainen otetaan talteen soluviljelyalustas-ta. 15 29 107539