FI104252B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien kemialliseksi syntetisoimiseksi kiinteässä faasissa - Google Patents

Description

104252

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien kemialliseksi syntetisoimiseksi kiinteässä faasissa

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin kemialliseksi syntetisoimiseksi kiinteässä faasissa, jolla peptidillä on kaava

Rl.

10 ^^A°-A1-Aa-Trp-A4-A5-A6-A7-W

jossa A° = Gly, Nle, α-aminovoihappo tai aminohapon Ala, Vai, 15 Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal D-isomeeri, tai se on poistettu, A1 = aminohapon p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp tai β-Nal D-isomeeri, 20 A2 = Gly, Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys, β-Nal, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, Vai, Gin, Asn, Gly, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihap-po, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, 25 Trp, Cys tai β-Nal, A5 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, o-aminovoihappo,-Met, Vai, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, OH, H tai CH3, Trp, Thr tai β-Nal, A6 = Sar, Gly tai aminohapon Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, 30 et, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal D-isomeeri, A7 = 1-metyyli-His, 3-metyyli-His tai His, ja W on 2 104252

Z, O

I II

-NH-CH-Rj-C-V (I) jossa R3 on CHR14- (CH2) nl, jolloin R14 on joko H tai OH ja nl 5 voi olla joko 1 tai 0, tai R3 on poistettu, ja Z1 on jonkin aminohapoista Gly, Ala, sykloheksyyli-Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro tai HyPro tunnistusryh-mä tai isopropyyli, sykloheksyylimetyyli, β-Nal, β-naftyy-10 limetyyli tai fenyylimetyyli, ja V on joko OR4 tai

N

"Nv 15 jolloin R4 on C1_20-alkyyli, C3.20-alkenyyli, C3.20-alkinyyli, fenyyli, naftyyli tai C7.10-fenyylialkyyli, ja R5 ja R6 ovat itsenäisesti H, C1.12-alkyyli, C7_10-fenyylialkyyli, alempi asyyli tai 20 N\

H

25 jossa R15 on C1.12-alkyyli , C7_10-fenyylialkyyli tai alempi asyyli,

Rn Z η Z2 O

Il I II

N-CH-R4-CH-C-V (II) 30 jossa R4 on CH2-NH, CO-CH2 tai CH2-CH2, ja Z3 ja Z2 ovat itsenäisesti jonkin aminohapoista Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, β-Nal, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro, HyPro tai syk- i 3 104252 loheksyyli-Ala tunnistusryhmä tai sykloheksyylimetyyli, ja V on joko ORs tai ^Re

5 N

^R7, jossa kukin ryhmistä R8, Rs, R6 ja R7 itsenäisesti on H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyy-10 lialkyyli, R9 Z3 O ^ Rio

I I II

-N-CH—C-N (III)

\R

K11 15 jossa Z1 on jonkin aminohapoista Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro tai HyPro tunnistusryhmä, ja R9, R10 ja RX1 kukin on itsenäisesti H, alempi alkyy-20 li, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylialkyyli, tai -N (IV) \r K13 ·. 25 jossa R12 ja R13 ovat kumpikin itsenäisesti H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylialkyyli, edellyttäen, että kaavojen (I) - (IV) osalta mikä tahansa asymmetrinen hiiliatomi voi olla R, S tai raseeminen seos, 30 ja edelleen edellyttäen, että R3 ja R2 ovat kumpikin itsenäisesti H, 03_12 — alkyyli, C7.10-fenyylialkyyli, COE1( jos- * sa E3 on C1_20-alkyyli, C3_20-alkenyyli, C3.20-alkinyyli, fenyy-li, naftyyli tai C7.10-fenyylialkyyli, tai alempi asyyli, ja Ri ja R2 ovat sidottuja mainitun peptidin N-terminaaliseen 35 aminohappoon, ja edelleen edellyttäen, että kun joko Rx tai 4 104252 R2 on COElf toisen täytyy olla H, tai peptidin farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodostamiseksi. Uudet peptidit ovat hyödyllisiä esim. hyvänlaatuisten tai pahanlaatuisten kudoskasvannaisten hoidossa ja gastrointestinaalisissa 5 sairauksissa.

Sammakkoeläinten peptidi bombesiini, pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 [Anastasi et ai., Experientia 27:166 - 167 (1971)], on läheistä sukua nisäkkäiden gastriinia vapauttaville peptideille 10 (GRP) , esim. sianGRP:lle, H2N-Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-

Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val -Gly-His-Leu-Met- (NH2) [McDonald et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 90:227 - 233 (1979)] ja ihmisen GRP:lie, H2N-Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-15 Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Vai-Gly-His-

Leu-Met- (NH2) . Bombesiinin on havaittu olevan kasvutekijänä useille ihmisen syöpäsolulinjoille, mukaanluettuna pienisoluinen keuhkokarsinooma (SCLC), ja se on todettu ihmisen rinta- ja eturauhassyövistä (Haveman et ai., toim. 20 Recent Results in Cancer Research - Peptide Hormones in Lung Cancer, Springer-Verlag, New York: 1986) . Useiden näistä syövistä tiedetään erittävän peptidihormoneja, jotka ovat sukua GRP .-lie tai bombesiinille. Niin muodoin bombesiinin antagonisteja on esitetty näiden syöpälaatujen *. 25 hoidossa käytettäviksi aineiksi.

Cuttitta et ai. osoittivat, että spesifinen mono-klonaalinen vasta-aine bombesiinille inhiboi in vivo karvattomaan hiireen siirrostetun ihmisen pienisoluisen keuh-kosyöpäsolulinjan kasvua [Cuttitta et ai., Cancer Survey 30 4:707 - 727 (1985)]. 3T3-hiiren fibroblasteissa, jotka ovat herkkiä bombesiinin mitoottiselle vaikutukselle, Zachary ja Rosengurt havaitsivat, että aine P -antagonisti (Spantide) toimi bombesiiniantagonistina [Zachary et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 82:7616 - 7620 (1985].

35 Heinz-Erian et ai. vaihtoivat bombesiinin asemassa 12 ole van histidiinin D-fenyylialaniiniin ja havaitsivat bombe- 5 104252 siiniantagonistiaktiivisuutta marsun haiman hajotetuissa erityssoluryhmissä [Heinz-Erian et ai., Am. J. of Physiol. 252:G439 - G442 (1987)]. Rivier raportoi työstä, joka oli suunnattu vähentämään bombesiinin bioaktiivisen C-termi-5 naalisen dekapeptidin konformaation vapautta liittämällä molekyyliin sisäisiä disulfidisiltoja; Rivier mainitsi kuitenkin, että toistaiseksi bombesiinianalogit, joissa tämä modifikaatio oli, eivät osoittaneet mitään antagonis-tiaktiivisuutta [Rivier et ai., "Competitive Antagonists 10 of Peptide Hormones", Abstracts of the International Symposium on Bombesin-Like Peptides in Health and Disease, Rooma, Italia (Lokakuu, 1987)].

Lyhenteet (epätavalliset): pGlu = (pyroglutamaattihappo); 15

H,C—CH-COOH

2( I

H,C NH

V

II

0 20

Nle = H2N-CH-COOH (norleusiini) (ch2) 3-ch3 β-leu = β-homoleusiini • 25 γ-leu = gamma-homoleusiini D-Cpa = D-p-kloorifenyylialaniini HyPro = hydroksiproliini Nal = naftyylialaniini Sar = sarkosiini 30 Sta (statiini) = (3S, 4S)-4-amino-3-hydroksi-6-metyylihep-tanoiinihappo, ja sillä on kemiallinen rakenne: 6 104252 /CH3

CH

ίπ2 OH

nh2-ch—ch—ch2—co2h ; 5 AHPPA = {3S, 4 S) -4-amino-3 -hydroksi-5-fenyy1ipentanoi ini-happo ACHPA = (3S, 4S)-4-amino-5-sykloheksyyli-3-hydroksipenta-noiinihappo; 10 R = oikea (D) konfiguraatio; S = vasen (L) konfiguraatio; rasemaatti = R:n ja S:n yhtäsuuri sekoitus 1-metyyli-His, 3-metyyli-His = metyyli (CH3) -ryhmä typessä histidiinin asemissa 1 tai 3: ch2—n3h^ 15 / ,^CH2 CH—N1

HCH

NH2---CH---COOH

20 Yhteenveto keksinnöstä

Lineaarinen peptidi (se on ei-syklinen), joka on luonnossa esiintyvän, biologisesti aktiivisen sammakko-eläinbombesiinin tai nisäkkään gastriinia vapauttavan peptidin (GRP) analogi, jolla on aktiivinen kohta ja sitoutu-*. 25 miskohta, joka vastaa peptidin sitoutumisesta kohdesolun reseptoriin, peptidisidoksen pilkkoutumisen luonnossa esiintyvän bombesiinin tai GRP:n aktiivisessa kohdassa ollessa tarpeeton biologiselle aktiivisuudelle in vivo, ja jolla analogilla on yksi seuraavista muunnelmista: 30 (a) jäännöksen deleetio aktiivisessa kohdassa ja jään nöksen modifikaatio aktiivisen kohdan ulkopuolella, tai (b) yhden tai kahden jäännöksen korvaus aktiivisessa kohdassa synteettisellä aminohapolla.

Analogi kykenee toimimaan luonnossa esiintyvän pep- 35 tidin kompetitiivisena inhibiittorina siten, että se sitoutuu reseptoriin, mutta jonkin muunnelmista avulla siltä 7 104252 puuttuu luonnossa esiintyvän peptidin biologinen aktiivisuus in vivo.

Antagonistit aikaansaavien modifikaatioiden asemat määräytyvät luonnossa esiintyvän peptidin aktiivisen koh-5 dan sijainnin mukaan. Esimerkiksi lineaariset peptidit, joille ei-peptidisidoksen lisääminen kahden jäännöksen väliin, tai kahden luonnollisen aminohapon korvaaminen synteettisillä β- tai γ-aminohapoilla, tai C-terminaalisen jäännöksen deleetio ("des") ovat hyödyllisiä luomaan tai 10 lisäämään antagonistiaktiivisuutta ovat niitä, joiden aktiivisuus liittyy aminohappoketjun kahteen C-terminaali-seen jäännökseen. Siksi luonnossa esiintyvän peptidin, jolle keksinnön mukaisesti saatavat peptidit ovat analogeja, aktiivinen kohta sisältää mieluiten ainakin yhden 15 aminohapon peptidin karboksiterminaalisessa osassa, ja keksinnön mukaisesti saatava lineaarinen peptidi sisältää saman aminohapon karboksiterminaalisessa osassaan. Samoin, kun aktiivinen kohta sijaitsee luonnossa esiintyvän peptidin aminoterminaalisessa osassa, vastaavilla keksinnön 20 mukaisesti saatavilla analogeilla on modifikaatioita aminoterminaalisissa osissaan.

Edullisissa suoritusmuodoissa aktiivinen kohta sisältää vähintään yhden aminohapporyhmän, joka sijaitsee luonnossa esiintyvän peptidin karboksyyliterminaalisessa : 25 osassa, ja tämä aminohapporyhmä sijaitsee lineaarisen pep tidin karboksyyliterminaalisessa osassa.

Toisissa edullisissa suoritusmuodoissa aktiiviset kohdat sisältävät vähintään yhden aminohapporyhmän, joka sijaitsee luonnossa esiintyvän biologisesti aktiivisen 30 peptidin aminoterminaalisessa osassa, ja tämä aminohappo-ryhmä sijaitsee lineaarisen peptidin aminoterminaalisessa osassa.

Modifikaatiot voidaan tehdä alueelle, joka osallistuu reseptoriin sitoutumiseen, tai ei-sitoutuvalle alueel-35 le. Edullisesti keksinnön mukaisesti saatavat analogit • * 8 104252 ovat 25 % homologisia, kaikkein edullisimmin 50 % homologisia luonnossa esiintyvän peptidin kanssa.

Keksinnön mukaisilla analogeilla voi olla yksi modifikaatioista, jotka on annettu alla esitetyissä yleisis-5 sä kaavoissa; joko ei-peptidisidos peptidisidoksen asemasta aktiivisessa kohdassa olevan aminohapon ja seuraavan aminohapon välissä, tai statiini- tai AHPPA- tai ACHPA-ryhmä, tai β- tai γ-aminohappo yhden tai kahden luonnollisen aminohapon paikalla, tai C-terminaalisessa aminohapos-10 sa deleetio, jota voi seurata tai voi olla seuraamatta substituentin lisäys todelliseen C-terminaaliseen ryhmään, tai sellaisen N-terminaalisen ryhmän läsnäolo, joka ei ole niiden peptidien luonnollinen N-terminaalinen aminohappo, joista analogit on johdettu. (Statiinilla, AHPPA:11a ja 15 ACHPA:lla on on yllä määritelty kemiallinen rakenne. Siinä missä on käytetty statiinia, voidaan käyttää myös AHPPA:a tai ACHPA:a.)

Ei-peptidisidoksella tarkoitetaan, että kahden ryhmän välillä olevaan sidokseen osallistuva hiiliatomi pel-20 kistetään karbonyylihiilestä metyleenihiileksi, se on CH2-NH, tai vähemmän edullisesti, että hiiliatomiin sidotulla ryhmällä on metyleenihiili aminoryhmänsä paikalla, se on CO-CH2. [Yksityiskohtaisen esityksen ei-peptidisidosten kemiasta ovat esittäneet Coy et ai. (1988) Tetrahedron 44, 25 3:835 - 841, mikä liitetään tähän viitteeksi.]

Yksi luonnossa esiintyvän peptidin modifikaatio, jolla luodaan antagonisti, on molekyylin aminoterminaali-sessa päässä, joka voi olla elektronin luovuttava jäännös, se on, typpeä sisältävä aminohappo, kuten ne, jotka on 30 kuvattu aminoterminaalisiin asemiin alla kuvatuissa ylei-; sissä kaavoissa; esimerkiksi N-terminaalinen aminohappo, joka on A°, tai jos A° on poistettu A1, voi olla aromaattinen D-isomeeri. (Kun "D":tä ei ole ilmoitettu aminohapon konfiguraatioksi, tarkoitetaan L:ää.) Toinen modifikaatio 9 104252 on C-terminaalisessa ryhmässä, joka voi olla mikä tahansa alla kuvatuista "W"-ryhmistä.

Keksintö koskee sellaisen terapeuttisen peptidin valmistamista, joka sisältää seitsemästä kymmeneen 5 aminohapporyhmää, täydellisenä, ja joka on analogi yhdelle seuraavista luonnossa esiintyvistä peptideistä päättyen karboksipäähän, jossa on Met-jäännös: (a) litoriini, (b) neuromediini, (c) kymmenen aminohapon karboksiterminaalinen alue nisäkkäiden gastriinia vapauttavasta hormonista 10 ja (d) kymmenen aminohapon karboksiterminaalinen alue sam- makkoeläinbombesiinista.

Tarkemmin esitettynä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin kemialliseksi syntetisoimiseksi kiinteässä faasissa, jolla peptidillä on 15 kaava

Ri

A°-A1-A2-Trp-A4-A5-A6-A7-W

20 jossa A° = Gly, Nle, α-aminovoihappo tai aminohapon Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02; OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal D-isomeeri, tai se .. 25 on poistettu, A1 = aminohapon p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp tai β-Nal D-isomeeri, A2 = Gly, Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys, β-Nal, His, Ι-ΒΟ metyyli-His tai 3-metyyli-His, : A4 = Ala, Vai, Gin, Asn, Gly, Leu, Ile, Nle, o-aminovoihap po, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal, A5 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, 10 104252

Met, Vai, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, OH, H tai CH3, Trp, Thr tai β-Nal, A6 = Sar, Gly tai aminohapon Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, 5 Cys tai β-Nal D-isomeeri, A7 = 1-metyyli-His, 3-metyyli-His tai His, ja W on

Z, O

I tl -NH-CH-R3-C-V (I) 10 jossa R3 on CHR14- (CH2) nl, jolloin R14 on joko H tai OH ja nl voi olla joko 1 tai 0, tai R3 on poistettu, ja Zx on jonkin aminohapoista Gly, Ala, sykloheksyyli-Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, 15 N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro tai HyPro tunnistusryh- mä tai isopropyyli, sykloheksyylimetyyli, β-Nal, β-naftyy-limetyyli tai fenyylimetyyli, ja V on joko 0R4 tai

/RS

20 N

^Re· jolloin R4 on C^o-alkyyli, C3.20-alkenyyli, C3.20-alkinyyli, fenyyli, naftyyli tai C7_10-fenyylialkyyli, ja R5 ja R6 ovat ; 25 itsenäisesti H, C1.12-alkyyli, C7_10-f enyylialkyyli, alempi asyyli tai

^RlS

N

30 ^"H

jossa R1S on C^^-alkyyli, C7.10-f enyylialkyyli tai alempi asyyli,

R8 Zi Z2 O

li I )· 35 N—CH-R4-CH-C-V (II) 11 104252 jossa R4 on CH2-NH, CO-CH2 tai CH2-CH2, ja Z1 ja Z2 ovat itsenäisesti jonkin aminohapoista Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, β-Nal, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro, HyPro tai syk-5 loheksyyli-Ala tunnistusryhmä tai sykloheksyylimetyyli, ja V on joko ORs tai N ' 10 ^R7, jossa kukin ryhmistä R8, R5, R6 ja R7 itsenäisesti on H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyy-lialkyyli, 15

R-9 O ^RlO

-N— CH— C-N (III) ^ Rn 2 0 jossa Zx on jonkin aminohapoista Gly, Ala, Vai, Leu, Ile,

Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro tai HyPro tunnistusryhmä, ja R9, R10 ja R1X kukin on itsenäisesti H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylialkyyli, tai 25 ^ Rl2 -N (IV)

V

3 0 jossa R12 ja R13 ovat kumpikin itsenäisesti H, alempi alkyy- : li, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylialkyyli, edellyttäen, että kaavojen (I) - (IV) osalta mikä tahansa asymmetrinen hiiliatomi voi olla R, S tai raseeminen seos, ja edelleen edellyttäen, että Rx ja R2 ovat kumpikin itse-35 näisesti H, C1_12-alkyyli, C7_10-fenyylialkyyli, COE1# jos- 12 104252 sa Εχ on C^Q-alkyyli, C3_20-alkenyyli, C3_20-alkinyyli, fenyy-li, naftyyli tai C7.10-fenyylialkyyli, tai alempi asyyli, ja Ri ja R2 ovat sidottuja mainitun peptidin N-terminaaliseen aminohappoon, ja edelleen edellyttäen, että kun joko R3 tai 5 R2 on COE1# toisen täytyy olla H, tai peptidin farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodostamiseksi.

W:n ollessa (I) terapeuttisella peptidillä on edullisesti kaava, jossa A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu, 10 A1 = D-Phe, Ό-β-Nal tai D-Cpa, A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, A5 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala, 15 A7 = His, edellyttäen, että kun R3 on CH2-CH2, Z3 on Leu:n tai Phe:n tunnistusryhmä, tai kun R3 on CH2, Z1 on P~Leu:n tai Leu:n tunnistusryhmä, tai kun R3 on CHOH-CH2, Z3 on Leu:n tunnistusryhmä, tai isopropyyli, sykloheksyylimetyyli, β-naftyy-20 limetyyli tai fenyylimetyyli, edellyttäen, että kun V on R_ / ^

N

\ o δ ' .. 25 sekä R5 että R6 on H.

Edullisesti peptidillä on yleinen kaava, jossa V on NHR6, kun R6 on NH2.

Edullisimmin terapeuttisella peptidillä on seuraava aminohappokaava: 3 0 D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- β-1ιθη-ΝΗ2.

: W:n ollessa (II), terapeuttisella peptidillä on edullisesti kaava, jossa A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu, A1 = D-Phe, Ο-β-Nal tai D-Cpa, 35 A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, • « 13 104252 A4 = Ala, A5 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala ja A7 = His, 5 ja jossa R4 on CH2NH, jokainen Zx on sykloheksyyl ime tyyli tai Leu:n tai Phe:n tunnistusryhmä, tai Z2 on Met:n, Leu:n tai Phe:n tunnistusryhmä.

Edullisimmin terapeuttisella peptidillä on Ό-β-Nal asemassa A1, jolloin sekä Z3 että Z2 ovat itsenäisesti joko 10 Leu tai Phe.

Esimerkkejä tällaisista peptideistä ovat: D-P-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|r [CH2NH] Leu-NH2 tai D- β -Nai -Gln-Trp-Ala-Val -Gly-His -Leui|f [CH2NH] Phe -NH2 .

Lisäksi terapeuttinen peptidi voi käsittää sen, 15 että R4 on CH2NH ja Z2:een liittynyt hiiliatomi on R-konfi-guraatiossa. Esimerkki tällaisesta peptidistä on D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|»CH2NH] -D-Phe-NH2.

Lisäksi peptidi voi käsittää seuraavan: A° tai A1 on D-aminohappo, V on OR4; esimerkiksi metyyliesterijohdannai-20 nen, kuten terapeuttinen peptidi D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-

Gly-His-Leu-Met-metyyliesteri.

W:n ollessa (III), peptidissä on edullisesti A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu, A1 = D-Phe, ϋ-β-Nal tai D-Cpa, ;· 25 A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, A5 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala, A7 = His, 30 edellyttäen, että on minkä tahansa aminohapoista Leu tai : D- tai L- p-X-Phe, jossa X H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3 tunnistusryhmä, ja R9, R10 ja Rn kukin on itsenäisesti H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyy-lialkyyli.

» 14 104252

Edullisimmin peptidi käsittää sen, että Zx on Leu, R9 on H, ja sekä R10 että RX1 on alempi alkyyli. Esimerkkejä tällaisista peptideistä ovat: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-etyyliamidi ja 5 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2.

W:n ollessa IV, terapeuttinen peptidi käsittää edullisesti sen, että A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu, A1 = D-Phe, Ό-β-Nal tai D-Cpa, 10 A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, A5 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala, A7 = His, 15 ja sekä R12 että R13 ovat H, ja sekä R3 että R2 ovat itsenäisesti H, alempi alkyyli tai alempi asyyli.

Edullisesti, kun joko R12 tai R13 on muu kuin H, A7 on His, A6 on Gly, A5 on Vai, A4 on Ala ja A2 on His.

Edullisesti tässä kuvattujen kaavojen mukaisten 20 terapeuttisten peptidien aminohapposekvenssit ovat vähintään 25 % homologisia luonnossa esiintyvän peptidin aminohapposekvenssin kanssa; edullisimmin tämä homologia on vähintään 50 %.

(Ei-peptidisidoksia, joista peptidisidos on pelkis-;· 25 tetty on merkitty tässä "i|i[CH2NH]" tai "ψ" .) Tämän keksinnön mukaisesti saatavat antagonistit ovat hyödyllisiä sairauksien hoidossa, jotka käsittävät pahanlaatuisten tai hyvänlaatuisten kudosten lisääntymisen, kuten syövän muodot, joissa bombesiinin sukuiset tai 30 GRP:n sukuiset aineet toimivat autokriinisinä tai para-\ kriinisinä mitoottisina tekijöinä, esim. maha-suolisto- kanavan syövät, haimasyöpä, paksusuolensyöpä, keuhkosyöpä, erityisesti pienisoluinen alatyyppi, tai rintasyöpä, tai arteroskleroosin hoidossa ja gastrointestinaalisten kudos-35 ten häiriöissä, jotka liittyvät mahalaukun ja haiman eri- • » 15 104252 tykseen ja liikkuvuuteen, esimerkiksi estämällä amylaasin eritystä, tai ruokahalun kontrolloijana.

Yllä annetuissa yleisissä kaavoissa, kun mikä tahansa R1-33 tai R15 on aromaattinen, lipofiilinen ryhmä, 5 in vivo aktiivisuus voi olla pitkäkestoinen, ja keksinnön mukaisesti saatavien yhdisteiden vapauttamista kohdekudok-seen voidaan edistää.

a-aminohapon tunnistusryhmä on atomi tai atomiryh-mä, muu kuin a-karbonyylihiiliatomi, a-aminotyppiatomi tai 10 H-atomi, liittyneenä asymmetriseen a-hiiliatomiin. Esimerkein kuvattuna, alaniinin tunnistusryhmä on CH3, valiinin tunnistusryhmä on (CH3)2CH, lysiinin tunnistusryhmä on H3N+ (CH2)4 ja fenyylialaniinin tunnistusryhmä on (C6H6)CH2. β- tai γ-aminohapon tunnistusryhmä on analoginen atomi tai 15 atomiryhmä, joka on vastaavasti liittyneenä β- tai γ-hii-liatomiin. Kun aminohapon tunnistusryhmää ei ole määritelty, se voi olla o, β tai γ.

Muut keksinnön piirteet ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavasta edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta ja 20 patenttivaatimuksista.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Kuvaamme ensin lyhyesti piirrokset.

Piirrokset

Kuvio 1 on sarja luonnossa esiintyvien peptidien ;· 25 aminohapposekvenssejä, joille keksinnön mukaisesti saata vat peptidit ovat analogeja.

Kuvio 2 on kaavio, joka esittää bombesiinianalogin D-Phe6BN(6-l3)metyyliesterin injektion vaikutuksen bombe-siinilla stimuloituvan haiman amylaasin määritykseen.

30 Kuvaamme nyt keksinnön mukaisten, edullisten suori- • tusmuotojen rakenteen, synteesin ja käytön.

Rakenne

Keksinnön mukaisesti saatavilla peptideillä on kaikilla ei-peptidisidos vähintään yhdessä osoitetuista 35 asemista, lukuunottamatta statiinilla korvattuja analogeja ja β-leurta, kuten stae-desLeue-Met -litoriinilla.

» 16 104252

Ei-peptidisidoksella tarkoitetaan, että kahden ryhmän väliseen sidokseen osallistuva hiiliatomi on pelkistetty karbonyylihiilestä metyleenihiileksi . Peptidisidoksen pel-kistysmenetelmän, jolla saadaan tämä ei-peptidisidos, ovat 5 kuvanneet Coy et ai., US-patenttihakemus, sarjanumero 879 348, joka on saman hakijan, kuin tämä hakemus, ja täten liitetään tähän viitteeksi. Mikä tahansa litoriinian-tagonistien aminohapoista asemissa 0, 1, 2 ja 9 voidaan poistaa peptideistä, ja peptidit ovat yhä aktiivisia anta-10 gonisteina.

Keksinnön mukaisesti peptidit voidaan antaa käyttöön farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen muodossa. Esimerkkejä edullisista suoloista ovat sellaiset, joilla on terapeuttisesti hyväksyttävät orgaaniset hapot, esim. 15 etikka-, maito-, sitruuna-, omena-, askorbiini-, meripihka-, bentsoe-, salisyyli-, metaanisulfoni-, tolueenisulfo-ni tai pamiinihappo, samoin kuin polymeerihapot, kuten tanniinihappo tai karboksimetyyliselluloosa, ja suolat, joilla on epäorgaaniset hapot, kuten hydrohaliinihapot, 20 esim. suolahappo, rikkihappo tai fosforihappo.

Litoriinianalogien synteesi (peptidi ei keksinnön mukainen)

Litoriiniantagonistin pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|r [CH2NH] Leu-NH2 synteesi esitetään seuraavassa. Muut ;· 25 bombesiini-, litoriini-, neuromediini- tai GRP-antagonis tit voidaan valmistaa tekemällä soveliaat muutokset seu-raavaan synteesimenetelmään.

Ensimmäinen vaihe on välituotteen pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (bentsyylioksikarbonyyli) -Leui|r[CH2NH] Leu-bents-30 hydryyliamiinihartsin valmistus seuraavalla tavalla.

·, Bentshydryyliamiini-polystyreenihartsi (Vega Bio- chemicals, Inc.) (0,97 g, 0,5 mmol) kloridi-ionimuodossa laitetaan seuraavan reaktiosyklin toteuttamaan ohjelmoidun Beckman 990B peptidisyntetisaattorin reaktiokammioon: (a) 35 metyleenikloridi; (b) 33 % trifluorietikkahappo (TFA) metyleenikloridissä (2 kertaa 1 ja 25 minuuttia, kumpi- 17 104252 kin) ; (c) metyleenikloridi; (d) etanoli; (e) metyleeniklo-ridi; ja (f) 10 % trietyyliamiini kloroformissa.

Neutraloitua hartsia sekoitetaan alfa-t-butoksikar-bonyyli(Boc)-leusiinin ja di-isopropyylikarbodi-imidin 5 kanssa (1,5 mmol kumpaakin) metyleenikloridissa 1 tunnin ajan, ja saatu aminohappohartsi viedään yllä kuvatun pesuohjelman vaiheiden (a) - (f) läpi. Boc-leusiinialdehydi (1,25 mmol), valmistettu Fehrentzin ja Castron, Synthesis, p.676 (1983) menetelmällä, liuotetaan 5 ml:aan kuivaa di-10 metyyliformamidia (DMF) ja lisätään hartsi-TFA-suolasus-pensioon, jonka jälkeen lisätään 100 mg (2 mmol) natrium-syanoborohydridiä [Sasaki ja Coy, Peptides 8:119 - 121 (1987); Coy et ai., id.]. Yhden tunnin sekoituksen jälkeen hartsiseoksen havaitaan olevan negatiivinen ninhydriini-15 reaktiossa (1 min), mikä osoittaa vapaiden aminoryhmien täydellistä derivatisoitumista.

Seuraavat aminohapot (1,5 mmol) liitetään sitten peräkkäin di-isopropyylikarbodi-imidin (1,5 mmol) läsnäollessa, ja saatu aminohappohartsi viedään pesu/suojauksen 20 poisto -vaiheiden (a) - (f) läpi samalla menettelytavalla kuin yllä: Boc-His(bentsyylioksikarbonyyli), Boc-Gly,

Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln (kytketty 6 M p-nitro-fenyyliesterin ylimääränä) ja pGlu. Valmistettu hartsi pestään sitten metanolilla ja ilmakuivataan.

25 Yllä kuvattu hartsi (1,6 g, 0,5 mmol) sekoitetaan anisolin (5 ml) ja vedettömän vetyfluoridin (35 ml) kanssa 0 °C:ssa ja sekotetaan 45 min. Ylimäärä vetyfluoridia haihdutetaan nopeasti kuivan typpivirran alla ja vapaa peptidi saostetaan ja pestään eetterillä. Raakapeptidi 30 liuotetaan pienimpään mahdolliseen määrään 2 M etikkahap-.· poa ja eluoidaan Sephadex G-25 -pylväässä (2,5 x 100 mm) (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.). Fraktiot, jotka UV-ab-sorptiolla ja ohutkerroskromatografiällä (TLC) sisältävät pääyhdisteen, yhdistetään, haihdutetaan pieneen tilavuu- 18 104252 teen ja lisätään oktadekyylisilaani-silikapylvääseen (2,5 x 50 cm) (Whatman LRP-1, 15-20 μια mesh-koko) .

Peptidi eluoidaan lineaarisella 0 - 30 % asetonit-riiligradientilla 0,1 % trifluorietikkahapossa vedessä.

5 Fraktiot tutkitaan TLC:llä ja analyyttisellä korkean erotuskyvyn nestekromatografiällä (HPLC) ja ne yhdistetään, jotta saadaan suurin puhtausaste. Liuoksen toistetulla lyofilisoinnilla vedestä saadaan 60 mg tuotetta valkoisena kuohkeana j auheena.

10 Tuotteen havaitaan HPLC:llä ja TLC:llä olevan homo geeninen. Happohydrolysaatin aminohappoanalyysi vahvistaa peptidin koostumuksen. Leui|r [CH2-NH] Leu -sidoksen läsnäolo osoitetaan nopea-atomipommitusmassaspektrometrialla. pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phet|i [CH2NH] Leu-NH2 ja pGlu-Gln-15 Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|r [CH2NH] Leu-NH2 tai muut peptidit valmistetaan samanlaisilla saannoilla analogisella tavalla muuntamalla tarkoituksenmukaisesti yllä kuvattua menettelytapaa .

D-Phe^n, Leusij; [CH2NH] D-Phe9-litoriinin, D-Phe-Gln-20 Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui); [CH2NH] -D-Phe-NH2 :n kiinteät aasi- synteesi suoritettiin seuraavasti: ensin syntetisoitiin

Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (tosyyli) -Leut|i [CH2NH] -D-Phe-bentshydryyliamiinihartsi.

Bentshydryyliamiini-polystyreenihartsi (Advanced . 25 ChemTech, Inc.) (1,25 g, 0,5 mmol) kloridi-ionimuodossa laitetaan kohdissa (a) - (f) yllä kuvatut vaiheet suorit tamaan ohjelmoidun Advanced ChemTech ACT 200 peptidisynte-tisaattorin reaktiokammioon.

Neutraloitua hartsia sekoitetaan Boc-D-fenyyliala-30 niinin ja di-isopropyylikarbodi-imidin kanssa (1,5 mmol kumpaakin) metyleenikloridissa 1 tunnin ajan ja saatu ami-nohappohartsi viedään yllä kuvatun pesuohjelman vaiheiden (a)-(f) läpi. Boc-ryhmä poistetaan sen jälkeen TFA-käsit-telyllä. Boc-leusiinialdehydi (1,25 mmol), valmistettu 35 Fehrentzin ja Castron menetelmän mukaan (1) , liuotetaan • 19 104252 5 ml:aan kuivaa DMF ja lisätään hartsi-TFA-suolasuspensi-oon, jonka jälkeen lisätään 100 mg (2 mmol) natriumsyano-borohydridiä (2,3). Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen hartsiseoksen havaitaan olevan negatiivinen ninhydriini-5 reaktiossa (1 min), mikä viittaa vapaiden aminoryhmien täydelliseen derivatisaatioon.

Seuraavat aminohapot (1,5 mmol) liitetään sitten peräkkäin samalla menettelytavalla: Boc-His(bentsyylioks-ikarbonyyli), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln 10 (liitetty saman määrän hydroksibentsotriatsolia läsnäollessa) , Boc-D-Phe (liitetty saman määrän hydroksibentsotriatsolia läsnäollessa). Kuivauksen jälkeen peptidihartsi painoi 1,93 g.

Hartsi (1,93 g, 0,5 mmol) sekoitetaan anisolin 15 (5 ml) ja vedettömän vetyfluoridin (35 ml) kanssa 0 °C:ssa ja sekoitetaan 45 min. Ylimäärä vetyfluoridia haihdutetaan nopeasti kuivan typpivirran alla ja vapaa peptidi saoste-taan ja pestään eetterillä. Raakapeptidi liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään 2 M etikkahappoa ja eluoidaan 20 Sephadex G-25 -pylväässä (2,5 x 100 mm). Fraktiot, jotka uv-absorptiolla ja ohutkerroskromatografiällä sisältävät pääkomponentin, yhdistetään, haihdutetaan pieneen tilavuuteen ja lisätään Vydac oktadekyylisilaani (10 - 15 μΜ) -pylvääseen (2,5 x 50 cm). Tämä eluoidaan lineaarisella 25 gradientilla 15 - 45 % asetonitriiliä 0,1 % trifluorietik-kahapossa vedessä. Fraktiot tutkitaan ohutkerroskromatograf iällä ja analyyttisellä korkean erotuskyvyn nestekro-matografiällä ja yhdistetään suurimman puhtausasteen saavuttamiseksi. Liuoksen toistetulla lyofilisaatiolla ve-30 destä saadaan 120 mg tuotetta valkoisena, kuohkeana jauheena.

Muut peptidit, esim. D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuiliCHjNH] -D-Phe-NH2 voidaan syntetisoida käyttäen olennaisesti samaa menettelytapaa.

20 104252 Ι<βνιβψ[ΟΗ2ΝΗ] D-Phe9 litoriinin synteesi D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu\|r [CH2NH] -D-Phe-NH2:n kiinteäfaasisynteesi suoritettiin seuraavasti: ensin syntetisoitiin Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(tosyyli)-5 Leuijr [CH2NH] -D-Phe-bentshydryyliamiinihartsi .

Bentshydryyliamiini-polystyreenihartsi (Advanced

ChemTech, Inc.) (1,25 g, 0,5 mmol) kloridi-ionimuodossa laitetaan seuraavan reaktiosyklin toteuttamaan ohjelmoidun Advanced ChemTech ACT 200 peptidisyntetisaattorin reak-10 tiokammioon: (a) metyleenikloridi; (b) 33 % trifluorietik-kahappo (TFA) metyleenikloridissa (2 kertaa 1 ja 25 minuuttia, kumpikin); (c) metyleenikloridi; (d) etanoli; (e) metyleenikloridi; ja (f) 10 % trietyyliamiini kloroformissa .

15 Neutraloitua hartsia sekoitetaan Boc-D-fenyyliala- niinin ja di-isopropyylikarbodi-imidin kanssa (1,5 mmol kumpaakin) metyleenikloridissa 1 tunnin ajan ja saatu ami-nohappohartsi viedään yllä kuvatun pesuohjelman vaiheiden (a)-(f) läpi. Boc-ryhmä poistetaan sen jälkeen TFA-käsit-20 telyllä. Boc-leusiinialdehydi (1,25 mmol), valmistettu Fehrentzin ja Castron menetelmän mukaan (1) , liuotetaan 5 ml:aan kuivaa DMF ja lisätään hartsi-TFA-suolasuspensi-oon, jonka jälkeen lisätään 100 mg (2 mmol) natriumsyano-borohydridiä (2,3) . Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen 25 hartsiseoksen havaitaan olevan negatiivinen ninhydriini-reaktiossa (1 min), mikä viittaa vapaiden aminoryhmien täydelliseen derivatisaatioon.

Seuraavat aminohapot (1,5 mmol) liitetään sitten peräkkäin samalla menettelytavalla: Boc-His(bentsyylioks-30 ikarbonyyli), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln (liitetty saman määrän hydroksibentsotriatsolia läsnäollessa) , Boc-D-Phe (liitetty saman määrän hydroksibentsotriatsolia läsnäollessa). Kuivauksen jälkeen peptidihartsi painoi 1,93 g.

21 104252

Hartsi (1,93 g, 0,5 mmol) sekoitetaan anisolin (5 ml) ja vedettömän vetyfluoridin (35 ml) kanssa 0 °C:ssa ja sekoitetaan 45 min. Ylimäärä vetyfluoridia haihdutetaan nopeasti kuivan typpivirran alla ja vapaa peptidi saoste-5 taan ja pestään eetterillä. Raakapeptidi liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään 2 M etikkahappoa ja eluoidaan Sephadex G-25 -pylväässä (2,5 x 100 mm). Fraktiot, jotka UV-absorptiolla ja ohutkerroskromatografiällä sisältävät pääkomponentin, yhdistetään, haihdutetaan pieneen tilavuu-10 teen ja lisätään Vydac oktadekyylisilääni (10 - 15 μΜ) -pylvääseen (2,5 x 50 cm). Tämä eluoidaan lineaarisella gradientilla 15 - 45 % asetonitriiliä 0,1 % trifluorietik-kahapossa vedessä. Fraktiot tutkitaan ohutkerroskromato-grafialla ja analyyttisellä korkean erotuskyvyn nestekro-15 matografiällä ja yhdistetään suurimman puhtausasteen saa vuttamiseksi. Liuoksen toistetulla lyofilisaatiolla vedestä saadaan 120 mg tuotetta valkoisena, kuohkeana jauheena .

Tuotteen havaitaan HPLC:llä ja TLCrllä olevan homo-20 geeninen. Happohydrolysaatin aminohappoanalyysi vahvistaa oktapeptidin koostumuksen. Leui|i [CH2-NH] Leu -sidoksen läsnäolo osoitetaan nopea-atomipommitusmassaspektrometrialla.

D-Phe1-Des-Met9 -litoriinin synteesi D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2 :n kiinteäfaa-/ 25 sisynteesi suoritettiin seuraavasti:

Vaihe (1) : Bentshydryyliamiini-polystyreenihartsi (Advanced ChemTech, Inc.) (0,62 g, 0,25 mmol) kloridi-io-nimuodossa laitetaan seuraavan reaktiosyklin toteuttamaan ohjelmoidun Advanced ChemTech ACT 200 peptidisyntetisaat-30 torin reaktiokammioon: (a) metyleenikloridi; (b) 33 % tri-fluorietikkahappo (TFA) metyleenikloridissa (2 kertaa 1 ja 25 minuuttia, kumpikin); (c) metyleenikloridi; (d) etanoli; (e) metyleenikloridi; ja (f) 10 % trietyyliamiini kloroformissa.

22 104252

Neutraloitua hartsia sekoitetaan Boc-leusiinin ja di-isopropyylikarbodi-imidin kanssa (1,5 mmol kumpaakin) metyleenikloridissa 1 tunnin ajan ja saatu aminohappohart-si viedään yllä kuvatun pesuohjelman vaiheiden (a) - (f) 5 läpi. Seuraavat aminohapot (1,5 mmol) liitetään sitten peräkkäin samalla menettelytavalla: Boc-His(bentsyylioks-ikarbonyyli), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln (liitetty 6 M ylimääränä p-nitrofenyyliesteriä) ja pGlu (liitetty hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa). Kuivauk-10 sen jälkeen peptidihartsi painoi 0,92 g.

Vaihe (2): hartsi (0,92 g) sekoitetaan anisolin (5 ml), ditiotreitolin (200 mg) ja vedettömän vetyfluori-din (35 ml) kanssa 0 °C:ssa ja sekoitetaan 45 min. Ylimäärä vetyfluoridia haihdutetaan nopeasti kuivan typpivirran 15 alla ja vapaa peptidi saostetaan ja pestään eetterillä. Raakapeptidi liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään 2 M etikkahappoa ja eluoidaan Sephadex G-25 -pylväässä (2,5 x 100 mm). Fraktiot, jotka UV-absorptiolla ja ohutkerroskro-matografiällä sisältävät pääkomponentin yhdistetään, haih-20 dutetaan pieneen tilavuuteen ja lisätään Vydac oktadekyy-lisilaani (10 - 15 μΜ) -pylvääseen (2,5 x 50 cm). Pylvästä eluoidaan lineaarisella gradientilla 0 - 30 % asetonitrii-liä 0,1 % trifluorietikkahapossa vedessä. Fraktiot tutkitaan ohutkerroskromatografiällä ja analyyttisellä korkean . 25 erotuskyvyn nestekromatografiällä ja yhdistetään suurimman puhtausasteen saavuttamiseksi. Liuoksen toistetulla lyofi-lisaatiolla vedestä saadaan tuote valkoisena, kuohkeana jauheena; tämän tuotteen havaitaan HPLC:llä ja TLC:llä olevan homogeeninen. Happohydrolysaatin aminohappoanalyysi 30 vahvistaa peptidin koostumuksen.

D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2 :n synteesi toteutettiin käyttäen samaa menetelmää, kuin yllä on kuvattu (0,62 g, 0,25 mmol bentshydryyliamiinihartsia vaiheessa (1), ja 0,92 g vaiheessa (2)).

104252 N-asetyyli-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2: n synteesi suoritettiin käyttäen samaa menetelmää, kuin yllä on kuvattu, käyttäen 0,62 g (0,25 mmol) bentshydryyliamii-nihartsia vaiheessa (1) ja sekoittaen 0,92 g hartsia 5 anisolin kanssa vaiheessa (2) , paitsi että lopullinen Boc-ryhmä poistettiin ja hartsi asetyloitiin etikka-anhyd-ridillä metyleenikloridissa.

Sta8-Des-Met9-litoriinin synteesi (peptidi ei keksinnön mukainen) 10 Statiini, AHPPA tai ACHPA -jäännös voidaan substi- tuoida minkä tahansa kahden aminohapon paikalle peptidissä, kun peptidi sisältää vain peptidisidoksia. Esimerkiksi sta8-des Met9 -litoriini valmistettiin analogisella tavalla liittämällä ensin statiini hartsiin ja jatkamalla sitten 15 Boc-His(bentsyylikarbonyyli):n lisäyksellä. Statiini tai Boc-statiini voidaan syntetoida Richin et ai. menetelmän mukaan, Rich et ai. 1978, J. Organic Chem. 43; 3624; ja Rich et ai, 1980, J. Med. Chem. 23: 27, ja AHPPA ja ACHPA voidaan syntetoida Huin et ai. menetelmän mukaan, Hui et 20 ai. 1987, J. Med. Chem. 30: 1287; Schuda et ai., 1988, J. Org. Chem. 53:873; ja Rich et ai., 1988, J. Org. Chem. 53:869.

Peptidin BIM-26120 , pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-NH2 kiinteäfaasisynteesi suoritettiin käyttäen seuraa-. 25 via menettelytapoja, joissa alfa-t-butoksikarbonyylista- tiini (valmistettu Richin et ai. menetelmän mukaan, Rich et ai., J. Org. Chem. 1978, 43:3624) liitetään ensin me-tyylibentshydryyliamiini-polystyreenihartsiin. Asetylaa-tion jälkeen välituote p-Glu-Gln-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-30 (bentsyylioksikarbonyyli)-Sta-metyylibentshydryyliamiini-: hartsi valmistetaan. Synteettinen menetelmä, jota tässä valmistuksessa käytetään, on yksityiskohtaisesti seuraava: 1) Alfa-t-butoksikarbonyylistatiinin liittäminen me tyy 1 iben t shydryy li euni inihar t s i in 35 Metyylibentshydryyliamiini-polystyreenihartsi (Vega

Biochemicals, Inc.) (1,0 g, 0,73 mmol) kloridi-ionimuodos- 24 104252 sa laitetaan Vega 250C Coupler peptidisyntetisaattorin reaktiokammioon. Syntetisaattori oli ohjelmoitu toteuttamaan seuraavat reaktiot: (a) metyleenikloridi; (b) 10 % trietyyliamiini kloroformissa; (c) metyleenikloridi ja (d) 5 dimetyyliformamidi.

Neutraloitua hartsia sekoitetaan 18 tunnin ajan valmistetun aktiivisen esterin kanssa, joka on tehty alfa-t-butoksikarbonyylistatiinista (1,46 mmol), di-isopropyy-likarbodi-imidin (2 mmol) ja hydroksibentsotriatsolihyd-10 raatin (1,46 mmol) kanssa dimetyyliformamidissa 0 °C:ssa yhden tunnin ajan. Saatu aminohappohartsi pestään syntetisaattorissa dimetyyliformamidilla ja sen jälkeen mety-leenikloridilla. Hartsiseoksessa havaittiin Kaiser nin- hydriinitestillä (5 minuuttia) tässä vaiheessa statiinin 15 hartsiin liittymisen tasoksi 84 %.

Asetylaatio tehtiin sekoittamalla aminohappohartsia 15 minuutin ajan N-asetyyli-imidatsolin (5 mmol) kanssa metyleenikloridissa. Hartsin vapaiden aminoryhmien deriva-tisaatiota 94 - 99 % tasolle osoitettiin Kaiser ninhydrii-20 ni-testillä (5 minuuttia). Boc-statiini-hartsi pestään sitten metyleenikloridilla.

2) Loppujen aminohappojen liittäminen.

Peptidisyntetisaattori ohjelmoidaan toteuttamaan seuraava reaktiosykli: (a) metyleenikloridi; (b) 33% trif-. 25 luorietikkahappo (TFA) metyleenikloridissa (2 kertaa 5 ja 25 minuuttia, kumpikin); (c) metyleenikloridi; (d) iso- propyylialkoholi; (e) 10 % trietyyliamiini kloroformissa ja (f) metyleenikloridi.

Seuraavat aminohapot (2,19 mmol) liitetään sen jäl-30 keen peräkkäin di-isopropyylikarbodi-imidillä (4 mmol) yk-sin tai di-isopropyylikarbodi-imidillä (4 mmol) plus hyd-roksibentsotriatsolihydraatilla (1,47 tai 0,73 mmol) ja saatu peptidihartsi pestään syntetisaattorissa dimetyyli-formamidilla ja sen jälkeen metyleenikloridilla, ja sitten 25 104252 viedään yllä kuvatun pesu -ja suojauksenpoisto-ohjelman vaiheiden (a) - (f) läpi.

Boc-His (bentsyylioksikarbonyyli) (kytketty kaksinkertaisen määrän hydroksibentsotriatsolia läsnäollessa); 5 Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala ja Boc-Trp (kytketty ennalta muodostettuina hydroksibentsotriatsolin aktiivisina estereinä, jotka valmistettiin reaktiolla 0 °C:ssa yhden tunnin ajan saman määrän hydroksibentsotriatsolihydraattia kanssa); Boc-Gln ja pGlu (myös kytkettynä ennalta muodos-10 tettuina hydroksibentsotriatsolin aktiivisina estereinä, jotka valmistettiin reaktiolla 0 °C:ssa yhden tunnin ajan saman määrän hydroksibentsotriatsolihydraattia kanssa). Valmiiksi tehty peptidihartsi pestään sitten metanolilla ja ilmakuivataan.

15 Yllä kuvattua peptidihartsia (1,60 g, 0,73 mmol) sekoitetaan anisolin (2,5 ml), ditioerytreitolin (50 mg) ja vedettömän vetyfluoridin (30 ml) kanssa 0 °C:ssa yhden tunnin ajan. Ylimäärä vetyfluoridia haihdutetaan nopeasti kuivan typpivirran alla ja vapaa peptidi saostetaan ja 20 pestään eetterillä. Raakapeptidi liuotetaan 100 ml 1 M etikkahappoa ja liuos haihdutetaan alennetussa paineessa. Raakapeptidi liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään metanoli/vettä l/l ja trituroidan 10 tilavuudella etyyliasetaattia .

' 25 Trituroitu peptidi lisätään oktadekyylisilaani-si- likapylväseen (9,4 mm I.D. x 50 cm) (Whatman Partisil 10 ODS-2 M 9). Peptidi eluoidaan lineaarisella gradientilla 20-80 % 20/80 0,1 % trifluorietikkahappo/asetonitriiliä 0,1 % trifluorietikkahapossa vedessä. Fraktiot tutkitaan 30 TLCillä ja analyyttisellä korkean erotuskyvyn nestekroma-tografiällä (HPLC) ja yhdistetään suurimman puhtausasteen saavuttamiseksi. Liuoksen lyofilisoinnilla vedestä saadaan 77 mg tuotetta valkoisena, kuohkeana jauheena.

Muut yhdisteet, jotka sisältävät D-Cpa1, β-leu8, 35 desMet9 -litoriinia voidaan valmistaa kuten yllä on kuvattu • < 26 104252 ja testata agonisti- tai antagonistitehokkuutensa suhteen seuraavalla testiohjelmalla.

Vaihe 1

Peptidin stimuloiman [3H] -tyrnidiinin oton määritys 5 3T3-soluviljelmässä

Soluviljelmä

Swiss 3T3 solujen kantaviljelmiä kasvatetaan Dulbeccon munnetulla Eagles ravintoalustalla (Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM), jota on täydennetty 10 % 10 vasikan sikiöseerumilla, kostutetussa 10 % CO2/90 % ilma -atmosfäärissä 37 °C:ssa. Tutkimuskäyttöä varten solut levitetään 24-kuoppaisiin ryhmälevyihin ja käytetään neljä päivää viimeisen alustanvaihdon jälkeen. Solut pidätetään solusyklin G1/G0 -vaiheeseen vaihtamalla seerumivapaaseen 15 DMEM:iin 24 tuntia ennen tymidiinin oton määritystä.

DNA-synteesimääritys

Solut pestään kahdesti 1 ml:lla DMEM (-seerumia), inkuboidaan sitten DMEM (-seerumin), 0,5 μΜ [metyyli3H] tymidiinin (20Ci/mmol, New England Nuclear) , bombesiinin 20 (3 nM) ja lopulta neljän eri konsentraation testiyhdistei- tä kanssa (1, 10, 100, 1 000 nM) 1,0 ml lopullisessa tilavuudessa. 28 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa, määritetään [metyyli-3H] -tymidiinin liittäminen happoon liukenemattomiin pooleihin, kuten seuraavassa on esitetty. Solut 25 pestään kahdesti jääkylmällä 0,9 % NaClrlla (1 ml erissä) ja happoon liukoinen radioaktiivisuus poistetaan 30 minuutin (40C:ssa) inkuboinnilla 5 % trikloorietikkahapon (TCA) kanssa. Viljelmät pestään sitten kerran (1 ml) 95 % etanolilla ja tehdään liukoisiksi 30 minuutin inkuboinnilla 30 (1 ml) 0,1 N NaOH:n kanssa. Liukoiseksi tehty materiaali siirretään pulloihin, jotka sisältävät 10 ml ScintArta (Packard), ja radioaktiivisuus määritetään nestetuikespek-trometrialla.

27 104252

Vaihe 2

Pienisoluinen karsinooma (SCLC)

Bombesiinin stimuloiman [3H] -tymidiinin oton määritys 5 Soluviljelmä

Ihmisen solujen karsinoomasolulinja (NCI-H69) -viljelmiä (saatu American Type Culture Associationista) pidetään yllä RPMI 1640 -alustalla, jota on täydennetty 10 % vasikan sikiöseerumilla 10 % CO2/90 % ilmassa 37 °C:ssa. 10 Kaksikymmentäneljä tuntia ennen määritystä solut pestään seerumivapaalla alustalla ja levitetään 24-kuoppaisille ryhmälevyille.

DNA-synteesimääritys

Bombesiini (lnM), 0,5 μΜ [metyyli-3H] -tymidiini 15 (20 Ci/mmol, New England Nuclear) ja neljä konsentraatiota testattavista yhdisteistä (1, 10, 100, 1000 nM) lisätään viljelmiin, jotta saadaan lopullinen tilavuus 0,5 ml. 28 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa solut kerätään GF/B -lasikuitusuodattimille ja DNA saoste jääkylmällä 20 TCA:lla. [3H] -tymidiinin liittyminen happoon liukenemattomiin DNA-fraktioihin määritetään nestetuikespektromet-rialla.

Vaihe 3

Peptidi-indusoitu pankreatiitti . 25 Näissä tutkimuksissa käytetään Sprague-Dawley koi- rasrottia (250 g). Testattava yhdiste tai 0,9 % NaCl annetaan s.c. 15 minuuttia ennen bombesiini-injektiota. Bombe-siini-injektiot annetaan s.c. annoksena 10 μg/kg, ja verinäytteet otetaan 1 t 30 min, 3 t ja 6 t. Plasman amylaasi-30 konsentraatio määritetään Pantrak Amylaase-testillä.

Vaihe 4 [125I] -gastriinia vapauttavan peptidin (GRP) sitoutumisen bombesiinireseptoreihin inhibitio in vitro

Membraaneja eri kudoksista (rotan aivot, rotan hai-35 ma, rotan aivolisäkkeen etulohko, SCLC, 3T3 solut) valmis- « 28 104252 teilaan homogenisoimalla 50 mM Tris-HCl:ssä, joka sisältää 0,1 % naudan seerumin albumiinia ja 0,1 mg/ml basitrasii-nia, mitä seuraa kaksi sentrifugointia (39 000 xg x 15 min, 4 °C:ssa), joiden välillä uudelleen suspendointi 5 tuoreeseen puskuriin. Määritystä varten näytteitä (0,8 ml) inkuboidaan 0,5 nM [125I]GRP:n ('2000 Ci/mmol, Amersham

Corp.) ja eri konsentraatioden testiyhdisteitä kanssa lopullisessa tilavuudessa 0,5 ml. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 4 °C:ssa sitoutumisreaktio lopetetaan nopealla 10 suodatuksella Whatman GF/C suodattimien läpi, jotka on esiliotettu 0,3 % vesipitoisessa polyetyleeni-imiinissä, jotta vähennetään epäspesifistä sitoutumista. Suodattimet ja putket pestään kolme kertaa 4 ml :11a jääkylmää puskuria, ja suodattimiin kiinnittynyt radioaktiivisuus laske-15 taan gammaspektrometrialla. Spesifinen sitoutuminen määritetään sitoutuneen totaali [125I]-GRP:n määränä, josta vähennetään 1 000 nM bombesiinin läsnäollessa sitoutuneen määrä.

Vaihe 5 20 Gastriinin vapautumisen inhibitio

Nukutettujen rottien mahat perfusoitiin suolaliuoksella, joka on kerätty yli 15 minuutin jaksoina mahanpor-tin kanyloinnilla, kun testipeptidiä on infusoitu reisi-laskimon läpi ajanjaksoilla nollasta 150 minuuttiin.

. 2 5 Vaihe 6

Kasvainten vastainen aktiivisuus in vivo NCI-H69 pienisoluiset keuhkokarsinoomasolut siirrettiin in vitro -viljelmistä siirrostamalla jokaiseen eläimeen viiden 75 cm2 kudosviljelmä-virtauspullon määrä 30 oikeaan kylkeen. In vitro NCI-H69 -solut kasvavat soluagg-: regaattisuspensiona. Siksi ei tehty mitään yritystä hajot taa soluaggregaatteja fysikaalisilla tai kemiallisilla tavoilla. Kasvaimen koko laskettiin kahden läpimitan keskiarvona, se on (pituus ja leveys/2) mm.

29 104252

Tulokset testipepti.di.en määrityksistä

Joukko bombesiinin tai GRP:n analogeja, joista jokainen sisälsi ei-peptidisidoksen tai statiini-, AHPPA-tai ACHPPA-jäännöksen, voidaan syntetisoida ja testata yhdellä 5 tai useammalla yllä kuvatuista vaiheen 1-6 määritysmenetelmistä; tulokset vaiheen 1 ja 2 testeistä on annettu taulukossa 1, joka on liitetty tähän. Taulukko 1 esittää ei-peptidianalogien kaavat ja tulokset [12SI] -GRP:n sitoutumisen 3T3-fibroblast ien bombesiinireseptoreihin ja viljel-10 tyjen 3T3-solujen bombesiinin stimuloiman [3H]tymidiinin oton in vitro -inhibitiolle. [T3 GRP-reseptori ja tymidiinin oton tulokset on esitetty IC50:nä (nM).] Taulukossa I annetaan myös tulokset erään toisen luonnossa esiintyvän peptidin, neuromediini C:n, jonka C-terminaaliset seitse-15 män aminohappoa ovat samat kuin bombesiinilla ja GRPLillä, ei-peptidisidoksen sisältäville analogeille. (Taulukossa I "litoriini" tarkoittaa 9 jäännöksen peptidianalogia tai sen johdannaista, kun taas "neuromediini-C" tarkoittaa 10 jäännöksen analogia tai sen johdannaista.) 20 Taulukossa I ei-peptidisidoksen paikkaa osoittaa symbolin ψ [CH2NH] paikka, se on i|r[CH2NH] on aina esitetty ennen aminohappoa, joka siinä peptidissä on sitoutunut siitä N-terminaaliseen aminohappoon ei-peptidisidoksella. Kun mitään aminohappoa ei ole spesifioitu "rakenteella", . 25 ei-peptidisidos yhdistää kaksi peptidiä, jotka on kuvattu jälkikirjoituksina annetuilla numeroilla.

Taulukosta I voidaan nähdä, että edullinen sijoituspaikka ei-peptidisidokselle litoriinianalogeissa on A8 -A9 -asemassa, kaksi aktiivisinta analogia (osoitettuna al-30 haisella GRP-reseptorin IC50-arvolla) ovat BIM-26100 (Phe8 [CH2NH]Leu9) jaBIM-26101 (Leu8 [CH2NH] Leu9) .

Lisäksi, kuten taulukossa I on kuvattu, BIM-26113 (D-Phe1, Leu8i|r [CH2NH] Leu9 ja BIM-26114 (D-Nal1, Leu8i|f [C-H2NH] Leu9) ovat aktiivisia 3T3 GRP -resep-35 torin sitomisessa ja tymiinin oton määrityksissä. Aivan » 30 104252 erityisesti BIM-26136 (D-Nal1, Leui|f [CH2NH] Phe9) , joka sisältää amino-ja karboksiterminaaliset aromaattiset ryhmät, jotka kykenevät muodostamaan hydrofobisia vuorovaikutuksia, on hyvin tehokas analogi. Lopuksi, kun statiini tai 5 β-leusiini korvaa litoriinin A8- ja A9- jäännökset, saadut analogit BIM-26120 ja BIM-26182 ovat myös tehokkaita antagonisteja. Taulukko I esittää myös, että neuromediini C -analogit, jotka sisältävät ei-peptidisidoksen ryhmien A9 ja A10 välillä, esim. BIM-26092, 26095, 26106 ja 26107, 10 ovat antagonisteja, kun ne testataan 3T3 GRP -reseptorilla ja tymidiinin oton määrityksillä.

Taulukossa I annetaan myös negatiiviset tulokset neuromediini C -analogeille, esim. BIM-26108. Siten ei-peptidisidoksen sijaintipaikan tässä annettuja ohjeita 15 tulisi käyttää yhdessä yllä kuvattujen rutiinimääritysme-netelmien kanssa, jotta selektoidaan hyödylliset antagonistit .

Kuvio 2 esittää bombesiiniantagonistin D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|j [CH2NH] Phe-NH2 vaikutusta bom-20 besiinin stimuloimaan amylaasin eritykseen rotassa. Tulokset osoittavat, että tämä analogi on tehokas antagonisti; 5 nM analogia voi inhiboida amylaasin erityksen, jonka 0,5 nM bombesiinia on stimuloinut 150 minuuttia boluksen injektion jälkeen.

2 5 Käyttö

Keksinnön mukaisesti saatavia peptideitä voidaan antaa nisäkkäälle, erityisesti ihmiselle, yhdellä tavanomaisista tavoista (esim. oraalisesti, parenteraalises-ti, transdermaalisesti tai transmukosaalisesti) , jatkuvan 30 vapautumisen tarjoavassa muodossa käyttäen biohajoavia, biosoveltuvia polymeerejä, tai paikallisena antona (esim. kasvaimenvastaisen bombesiinin tapauksessa keuhkoihin) käyttäen misellejä, geelejä ja liposomeja.

Keksinnön mukaisesti saatavat bombesiiniantagonis-35 tit soveltuvat kaikkien sellaisten syövän muotojen hoita- 31 104252 miseen, joissa bombesiinin sukuiset aineet toimivat auto-kriinisinä tai parakriinisinä mitoottisina aineina, erityisesti ne soveltuvat pienisoluisen keuhkokarsinooman hoitamiseen. Peptidejä voidaan myös käyttää mahahapon eri-5 tyksen estämiseen ja GI-kanavan liikkeen häiriöihin, ekso-kriinisen haiman adenokarsinooman oireiden helpottamiseen ja/tai hoitamiseen ja näivetystautisten potilaiden ruokahalun parantamiseen. Peptidit voidaan antaa ihmispotilail-le annoksena 0,5 Mg/kg/päivä - 5 mg/kg/päivä. Joillekin 10 syövän muodoille, esim. pienisoluiselle keuhkokarsinoomal-le, edullinen annos parantavaa hoitoa varten on 250 mg/po-tilas/päivä.

·<

Taulukko I

32 104252

3T3 GRP

g resep- Tymidiinin tori otto

Tunnus _Rakenne_ IC 5 0 (nM) IC50( nM) BIM-26092 Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leum[CH2NFjLeu-NH2 j· ' t~> u 4 2 466 2q neuromeduni u SIM-26095 pGlu-Gln-Trp-Ala-V&l-D-Äla-Hi s-Leuiv t CHjNH ] Leu-NH2 litoriini x> 2623 1209 BIM-26100 pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-15 Pheψ[CH2NH]L·eu-NK2 litoriini 1! 23 26 Ξ IM—2 6101 pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-

Leui[CH2NH]Leu-NK2 litoriini 11 118 296 20 E IM-2 610 5 D-Ala-Asr.-Hi s-Trp-Al a-Vai- D-ALa-His-Leuvji[CH2CH]Leu-NH2 neuromediini C 11 107 107 ΞΙΚ-26106 desGlv-D-Ala-His-Tro-Ala-Val- . 25 D-Ala-His-Leu«i[CH2NH]Het-NH2 neuromediini C 11 4C1 354 EIK-2 6107 D-Pne-Hi s-Trp-Ala-Val-Gly-

Hl E-Leuu; [ CHjKH ] Leu-NH2 neuromediini C

33 1 0 4 2 5 2

Taulukko 1 (jatkuu) 3T3 GRP Tymidiinin resep- otto c tori ° Tunnus Rakenne IC50(nM) IC50(nM) BIM-2610 8 N-Ac-D-Ala-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-L.eui|j[CHjNH)Leu-NH2 neuromediini C 1 841 >1000 10 BIM-26113 D-?he-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s-Leuv(/ [ CH2NH ] Leu-NH2 litoriini 5jB 9 EIH-26114 D-Nal-C-ln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu*|)[CH,NH)Leu-NK_ litoriini 23,5 28 BIM-26120 pGiu-Glr.-Trp-Äla-Val-Gly-His-Sta-NH2 litoriini 1 150 165 20 BLM-26122 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-C-ly-His-Leu-NHj litoriini 5,9 28,6 ΞΙΜ-26136 D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-25 Leum[CH_NH]Phe-NH2 litoriini 1,4 3,3 EIK-25182 D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- 0,88 4,77 3-Leu-N»2 litoriini peptidi ei keksinnön mukainen

Claims (20)

34 1 0 4 2 5 2

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin kemialliseksi syntetisoimiseksi kiinteässä faasissa, 5 jolla peptidillä on kaava Ri A° - A1 - A2 - Trp - A4 - A5 - A6 - A7 - W R2^ 10 jossa A° = Gly, Nle, α-aminovoihappo tai aminohapon Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal D-isomeeri, tai se 15 on poistettu, A1 = aminohapon p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp tai β-Nal D-isomeeri, A2 = Gly, Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys, β-Nal, His, 1-20 metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, Vai, Gin, Asn, Gly, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihap-po, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal, A5 = Gin, Asn, Gly, Ala, Leu, Ile, Nle, a-aminovoihappo, : 25 Met, Vai, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, OH, H tai CH3, Trp, Thr tai β-Nal, A6 = Sar, Gly tai aminohapon Ala, Vai, Gin, Asn, Leu, Ile, Met, p-X-Phe, jossa X = F, Cl, Br, N02, OH, H tai CH3, Trp, Cys tai β-Nal D-isomeeri,

30 A7 = 1-metyyli-His, 3-metyyli-His tai His, ja . W on Z, O I H -NH-CH-R3-C-V (I) 35 jossa R3 on CHR14- (CH2) nl, jolloin R14 on joko H tai OH ja nl 35 104252 voi olla joko 1 tai 0, tai R3 on poistettu, ja Z1 on jonkin aminohapoista Gly, Ala, sykloheksyyli-Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro tai HyPro tunnistusryh-5 mä tai isopropyyli, sykloheksyylimetyyli, β-Nal, β-naftyy- 1imetyyli tai fenyylimetyyli, ja V on joko OR4 tai N 10 ^R,, jolloin R4 on C^Q-alkyyli, C3_20-alkenyyli, C3_20-alkinyyli, fenyyli, naftyyli tai C7.10-fenyylialkyyli, ja Rs ja R6 ovat itsenäisesti H, C1.12-alkyyli, C7_10-fenyylialkyyli, alempi 15 asyyli tai ^R1S N 20 jossa R15 on C1.12-alkyyli, C7.10-fenyylialkyyli tai alempi asyyli, Ro Zi Z2 o I I I II V 25 N-CH-R4-CH-C-V (II) jossa R4 on CH2-NH, CO-CH2 tai CH2-CH2, ja Z3 ja Z2 ovat itsenäisesti jonkin aminohapoista Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, β-Nal, p-X-Phe, jossa X = H, F, 30 Cl, Br, N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro, HyPro tai syk loheksyyli-Ala tunnistusryhmä tai sykloheksyylimetyyli, ja V on joko ORs tai 36 104252 /R‘ N ^R7, 5 jossa kukin ryhmistä Rg, R5, R6 ja R7 itsenäisesti on H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyy-lialkyyli, R9 Zx O R10 I I II

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu, A1 = D-Phe, D-p-Nal tai D-Cpa, A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala,

20 A5 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala, A7 = His, ja W on (I), edellyttäen, että kun R3 on CH2-CH2, Z3 on aminohapon Leu : 2 5 tai Phe tunnistusryhmä, tai kun R3 on CH2, Z1 on aminohapon β-Leu tai Leu tunnistusryhmä, tai kun R3 on CHOH-CH2, Z1 on aminohapon Leu tunnistusryhmä, tai isopropyyli, syklohek-syylimetyyli, β-naftyylimetyyli tai fenyylimetyyli, edellyttäen, että kun V on 30 :· Z* N xr6. 3. sekä R5 että R6 on H. 38 104252

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa V on NHRg ja R6 on H.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n- 5. e t t u siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaa va D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-P-Leu-NH2.

5 A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, A6 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala, A7 = His, ja 10 W on (III), edellyttäen, että Z1 on jonkin aminohapoista Leu tai D- tai L- p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, N02, OH tai CH3, tun-nistusryhmä ja R9, R10 ja Ru kukin on itsenäisesti H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylial- 15 kyyli.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu,

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa A1 on D-β-Nal ja Z1 ja Z2 ovat itsenäisesti joko Leu tai Phe.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaa- ; 25 va D- P-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|r [CH2NH] Leu-NH2.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaava D-P-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leui|i [CH2NH] Phe-NH2.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa R„ . on CH2-NH ja Z2:een liittynyt hiiliatomi on R-konfiguraa- tiossa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla 35 on kaava D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu [CH2NH] -D-Phe-NH2. 39 104252

10 A1 = D-Phe, Ό-β-Nal tai D-Cpa, A2 = Gin, His, 1-metyyli-His tai 3-metyyli-His, A4 = Ala, A5 = Vai, A6 = Sar, Gly, D-Phe tai D-Ala,

15 A7 = His, ja W on (II), jossa R4 on CH2-NH, jokainen Z2 on sykloheksyyl ime tyyli tai aminohapon Leu tai Phe tunnistusryhmä, tai Z2 on aminohapon Met, Leu tai Phe tunnistusryhmä.

10 -N— CH—C-N (III) jossa Z1 on jonkin aminohapoista Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Glu, Gin, p-X-Phe, jossa X = H, F, Cl, Br, 15 N02, OH tai CH3, Trp, Cys, Met, Pro tai HyPro tunnistusryh- mä, ja R9, R10 ja RX1 kukin on itsenäisesti H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylialkyyli, tai ^/-^12

20 -N (IV) jossa R12 ja R13 ovat kumpikin itsenäisesti H, alempi alkyyli, alempi fenyylialkyyli tai alempi naftyylialkyyli, ·’ 25 edellyttäen, että kaavojen (I) - (IV) osalta mikä tahansa asymmetrinen hiiliatomi voi olla R, S tai raseeminen seos, ja edelleen edellyttäen, että Rx ja R2 ovat kumpikin itsenäisesti H, C1.12-alkyyli, C7_10-f enyylialkyyli, COEj, jossa Ej on C-L^o-alkyyli , C3_20-alkenyyli, C3.20-alkinyyli , fenyy-30 li, naftyyli tai C7_10-fenyylialkyyli, tai alempi asyyli, ja , R1 ja R2 ovat sidottuja mainitun peptidin N-terminaaliseen aminohappoon, ja edelleen edellyttäen, että kun joko R3 tai R2 on COE^ toisen täytyy olla H, tai peptidin farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodostamiseksi, tunnet -35 t u siitä, että 37 104252 (a) C-terminaalinen aminohapporyhmä sidotaan kiinteään faasiin karboksyyliryhmänsä välityksellä, (b) C-terminaaliseen aminohapporyhmään kytketään valittu aminohappo peptidisidoksella, jolloin valitun aminohapon 5 funktionaalinen ryhmä, jota ei vaadita kytkemiseen, suoja taan ennen kytkemistä ja suojaus poistetaan sen jälkeen, (c) kiinteään faasiin sidotun peptidin N-terminaaliseen aminohapporyhmään kytketään peptidisidoksella toinen valittu aminohappo vaiheessa (b) kuvatulla tavalla, 10 (d) toistetaan vaihe (c), kunnes valitun koostumuksen omaava peptidi on muodostettu, ja (e) pilkotaan peptidi kiinteästä faasista ja modifioidaan pilkottua peptidiä edelleen, jos se on tarpeen.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa A° = Gly, D-Phe tai se on poistettu, A1 = D-Phe, Ό-β-Nal tai D-Cpa,

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jossa Zx on Leu, R9 on H, ja R10 ja Rn kukin on alempi alkyyli.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaava D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-etyyliamidi.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaava D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2. • , „ 104252 40