ES2970720T3

ES2970720T3 - Fotorreceptores y progenitores de fotorreceptores producidos a partir de células madre pluripotentes

Info

Publication number: ES2970720T3
Application number: ES14764825T
Authority: ES
Inventors: Robert Lanza; Shi-Jiang Lu; Wei Wang
Original assignee: Astellas Institute for Regenerative Medicine
Current assignee: Astellas Institute for Regenerative Medicine
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2024-05-30
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: JP7245752B2; EP2970903B1; IL294897A; EP2970903A4; AU2014233403A1; US20190290701A1; IL266775B; IL241177A0; US20190321414A1; JP2020031635A; US20160030490A1; CA3177943A1; CN105378070A; WO2014145108A1; IL241177B; IL276173B2; HK1218931A1; KR20230058556A; US20140294778A1; IL276173B

Abstract

Se proporcionan métodos para la producción de células fotorreceptoras y células progenitoras de fotorreceptoras a partir de células madre pluripotentes. Además se proporcionan composiciones de células fotorreceptoras y células fotorreceptoras, así como métodos para el uso terapéutico de las mismas. Los métodos ejemplares pueden producir cultivos sustancialmente puros de células fotorreceptoras y/o células fotorreceptoras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Fotorreceptores y progenitores de fotorreceptores producidos a partir de células madre pluripotentes

Antecedentes

Las enfermedades de la retina a menudo provocan ceguera debido a la pérdida de células neuronales posmitóticas. Entre las enfermedades de la retina se encuentran las distrofias de conos o bastones, la degeneración de la retina, la retinitis pigmentosa, la retinopatía diabética, la degeneración macular, la amaurosis congénita de Leber y la enfermedad de Stargardt. En la mayoría de las degeneraciones de la retina, la pérdida de células se produce principalmente en la capa nuclear externa, que incluye fotorreceptores de conos y bastones. Con la pérdida de poblaciones de células neuronales posmitóticas, se necesita una fuente exógena de nuevas células como reemplazo de las células fotorreceptoras.

Una posible fuente de reemplazo de células fotorreceptoras incluye las células madre. Los primeros estudios incorporaron el uso de células de ratón, células madre de ratón o poblaciones heterogéneas de células progenitoras de la retina como posible fuente de células para la sustitución de los fotorreceptores perdidos. Estos primeros estudios describieron el trasplante de células precursoras de fotorreceptores de la retina de ratón del día 1 posnatal (Maclaren et al. Nature 444(9): 203-207, 2006), generaciónin vitrode células precursoras de la retina a partir de células madre embrionarias de ratón (Ikeda et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 102(32): 11331-11336, 2005), generación de células progenitoras de la retina a partir de retinas de ratón del día 1 posnatal (Klassen et al. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 45(11): 4167-4175, 2004), implantación de células madre mesenquimales de médula ósea en un modelo de degeneración de retina en ratas RCS (Inoue et al. Exp. Eye Res. 85(2): 234-241, 2007), producción de células progenitoras de la retina, incluidas células ganglionares, células amacrinas, fotorreceptores en los que el 0.01 % del total de células expresaban S-opsina o Rodopsina, células bipolares y células horizontales, de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (Lamba et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 103(34): 12769-12774, 2006) y la inducción de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de fibroblastos humanos para producir células progenitoras de la retina (Lamba et al. PLoS ONE 5(1): e8763. doi:10.1371/journal.pone.0008763). Ninguno de estos enfoques produjo una población homogénea de células progenitoras de los fotorreceptores o células fotorreceptoras para implantación. Ninguno de estos enfoques produjo una población homogénea de células progenitoras de los fotorreceptores o células fotorreceptoras que mostraran función de cono o bastónin vivo(por ejemplo, detectable al conferir mejoras en la agudeza visual). Los suministros de tejido derivado de donantes a partir del cual se pueden aislar fotorreceptores y progenitores de fotorreceptores (tales como cadáveres, tejido fetal y animales vivos) son limitados. Las células madre se pueden propagar y expandirin vitroindefinidamente, proporcionando una fuente potencialmente inagotable de células no derivadas de donantes para terapia humana. La diferenciación de células madre en una población homogénea de progenitores fotorreceptores o fotorreceptores puede proporcionar un suministro abundante de células no derivadas de donantes para la implantación y el tratamiento de enfermedades de la retina.

Mellough et al. (2012; Stem Cells; 30(4); 673-686) describen un método que implica el cultivo de células madre en condiciones de baja adherencia para formar cuerpos embrioides antes de transferirlas a condiciones de cultivo de unión. Las células permanecen en las condiciones de cultivo de unión durante el resto del proceso de diferenciación. Meyer et al. (2009; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 106(39): 16698-16703) describen un proceso en el que las células madre embrionarias humanas se diferencian como agregados flotantes y se les incita a adherirse a placas de cultivo recubiertas de laminina para permitir la formación de rosetas neuronales. Luego, las rosetas del campo ocular se levantan mecánicamente y se hacen crecer como neuroesferas. Los autores describen además un método para cultivar células progenitoras del campo ocular en condiciones no adherentes, como neuroesferas, para producir células fotorreceptoras.

Breve resumen

La invención se refiere a una preparación sustancialmente pura de células progenitoras de los fotorreceptores, que comprende: una pluralidad de células progenitoras de los fotorreceptores y un medio adecuado para mantener la viabilidad de las células progenitoras de los fotorreceptores.

De acuerdo con las reivindicaciones, la invención proporciona una preparación de células que comprende:

(a) una pluralidad de células en las que más del 90 por ciento de las células en la preparación son células progenitoras de los fotorreceptores que son inmunocitoquímicamente PAX6+ y CHX10-, y un transcrito de ARNm positivo para MASH1, de acuerdo con se detecta mediante qPCR, y

(b) un medio adecuado para mantener la viabilidad de las células progenitoras de los fotorreceptores.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una preparación de células progenitoras de los fotorreceptores, que comprende: una pluralidad de células progenitoras de los fotorreceptores sustancialmente libres de células madre pluripotentes, células ganglionares de la retina, fotorreceptores maduros y/o células amacrinas, es decir, incluyen menos del 10 % o cualquiera de esas células, e incluso más preferiblemente menos de menos de 5 %, 2 %, 1 %, 0.1 % o incluso menos de 0.01 % de células madre pluripotentes del campo ocular, células ganglionares de la retina, fotorreceptores maduros y/o células amacrinas; y un medio adecuado para mantener la viabilidad de las células progenitoras de los fotorreceptores.

En determinadas realizaciones, la invención proporciona una preparación farmacéutica de células progenitoras de los fotorreceptores que es adecuada para su uso en un paciente mamífero, que comprende: una pluralidad de células progenitoras de los fotorreceptores; y un vehículo farmacéuticamente aceptable para mantener la viabilidad de las células progenitoras de los fotorreceptores para su trasplante en un paciente mamífero.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una preparación celular criogénica que comprende al menos 109 células progenitoras de los fotorreceptores, y un sistema criopreservador compatible con las células progenitoras de los fotorreceptores y capaz de mantener la viabilidad de tales células después de la descongelación.

De acuerdo con las reivindicaciones, al menos el 90 % de las células en la preparación son inmunocitoquímicamente PAX6+ y CHX10-, y la transcripción de ARNm positiva para MASH1 de acuerdo con se detecta mediante qPCR, e incluso más preferiblemente al menos el 95 % o el 98 % de las células en la preparación son inmunocitoquímicamente PAX6+ y CHX10-, y la transcripción de ARNm es positiva para MASH1 de acuerdo con lo detectado por qPCR.

En determinadas realizaciones, la mayoría de las células progenitoras de los fotorreceptores son transcritos de ARNm positivos para Nr2e3, Trp2, RORp y NRO de acuerdo con se detecta mediante qPCR.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores expresan al menos 2, 3, 4, 5 o incluso 10 veces más, con respecto a las células progenitoras neuronales de la retina, de una o más proteínas seleccionadas de uPA, tenascina-C, CXCL16, CX3CL1 y quitinasa 3 tipo 1, detectado mediante inmunoensayo de proteínas secretadas o niveles de transcripción de ARNm mediante qPCR.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen capacidad replicativa para experimentar al menos 10, 20, 30, 50 o incluso 100 duplicaciones de población en cultivo celular, con menos del 25 por ciento de las células experimentando muerte celular, senescencia o diferenciación en células fenotípicamente no fotorreceptoras por la 10a, 20ava, 30ava, 50ava o incluso 100ava duplicación.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen niveles de proteína transferrina y/o ARNm de transferrina que son al menos un 10, 25, 50 o incluso un 75 por ciento menos que los de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores son genotípicamente idénticas a HLA y preferiblemente son genómicamente idénticas.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen una longitud media del fragmento de restricción terminal (TRF) que es mayor que 7 kb, 7.5 kb, 8 kb, 8.5 kb, 9 kb, 9.5 kb, 10 kb, 10.5 kb, 11 kb, 11.5 kb o incluso 12 kb.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen un contenido y/o actividad enzimática disminuidos estadísticamente significativos, en relación con fotorreceptores derivados de fetos, de proteínas implicadas en uno o más de (i) regulación del ciclo celular y envejecimiento celular, (ii) energía celular y/o metabolismo de lípidos, (iii) apoptosis.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen un mayor contenido y/o actividad enzimática estadísticamente significativa de proteínas implicadas en la estructura del citoesqueleto y la dinámica celular relacionada con los mismos, en relación con los fotorreceptores derivados del feto.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores son adecuadas para la administración a un paciente humano.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores son adecuadas para la administración a un paciente veterinario no humano.

En realizaciones preferidas de las preparaciones anteriores, las células progenitoras de los fotorreceptores se derivan de células madre pluripotentes de mamíferos, especialmente células madre pluripotentes humanas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores se diferencian de una fuente común de células madre pluripotentes.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores mantienen la plasticidad para diferenciarse tanto en bastones como en conos.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores se pueden trasplantar al espacio subretiniano de ratones ELOVL4-TG2, migrarán a la capa nucleada externa y mejorarán las respuestas del ERG escotópico y fotópico en los ratones ELOVL4-TG2.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen actividad fagocítica, tal como la capacidad de fagocitar segmentos externos de fotorreceptores aislados, BioParticles pHrodo™ Red de E. coli o ambas.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores secretan uno o más factores neuroprotectores.

En determinadas realizaciones, el medio adecuado para mantener la viabilidad de las células progenitoras de los fotorreceptores se selecciona del grupo que consiste en un medio de cultivo, un criopreservante y un medio de inyección biocompatible adecuado para inyección en un paciente humano.

En determinadas realizaciones, la preparación de células progenitoras de los fotorreceptores está libre de pirógenos y micógenos.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una preparación farmacéutica de fotorreceptores que es adecuada para su uso en un paciente mamífero, que comprende células fotorreceptoras derivadas de células madre pluripotentes, en donde más del 90 %, 95 % o incluso el 98 % de las células son inmunocitoquímicamente PAX6+, CHX10- y son Rodopsina+ y/u opsina+; y un vehículo farmacéuticamente aceptable para mantener la viabilidad de las células fotorreceptoras para su trasplante en un paciente mamífero.

También se describe en el presente documento una preparación farmacéutica que comprende: células epiteliales pigmentarias de la retina y células progenitoras de los fotorreceptores, células fotorreceptoras o ambas; y un vehículo farmacéuticamente aceptable para mantener la viabilidad de las células fotorreceptoras para su trasplante en un paciente mamífero. La preparación de células se puede proporcionar como suspensiones de células (ya sea mezcladas entre sí o en forma de un kit con dosis separadas de células que se administran de forma conjunta), o como un injerto de células multicapa (opcionalmente dispuesto sobre una matriz biocompatible o soporte sólido). En el caso del injerto de células multicapa, las células del RPE se pueden proporcionar como una monocapa, preferiblemente una monocapa polarizada.

Aún otro aspecto de la invención proporciona preparaciones de células progenitoras de los fotorreceptores o preparaciones de células fotorreceptoras, como se define en las reivindicaciones, para uso en métodos para tratar enfermedades y trastornos causados por la pérdida de fotorreceptores en un paciente. El método puede comprender administrar dichas preparaciones farmacéuticas como se describe en el presente documento, tales como preparaciones de células progenitoras de los fotorreceptores o células fotorreceptoras, o ambas. Las preparaciones pueden inyectarse localmente, como por ejemplo en el espacio subretiniano del ojo del paciente, en el vítreo de los pacientes, o administrarse sistémicamente o en otras cavidades corporales donde las células pueden persistir.

Las enfermedades o trastornos causados por la pérdida de fotorreceptores incluyen la degeneración macular, tal como la degeneración macular relacionada con la edad, ya sea en una etapa temprana o tardía, y la retinitis pigmentosa.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para producir células progenitoras de los fotorreceptores, que comprende las etapas de

(a) cultivar células progenitoras del campo ocular, preferiblemente como grupos de células y preferiblemente en condiciones de baja adherencia o no adherentes, en un medio de diferenciación neuronal durante un período de tiempo suficiente para que los grupos de células formen esferas celulares individuales;

(b) cultivar las esferas celulares en un medio de diferenciación neuronal en condiciones adherentes, preferiblemente en una matriz (tal como una estructura de biomaterial) hasta que la mayoría de las células en el cultivo sean células progenitoras neuronales de la retina caracterizadas como PAX6+, CHX10+ y SOX2-;

(c) a partir de entonces, alternar las condiciones de cultivo una o más veces entre condiciones de baja adherencia o no adherencia durante un período de tiempo suficiente para que las células progenitoras neuronales de la retina formen esferas celulares individuales, y después cultivar la célula progenitora neuronal de la retina que contiene esferas celulares en condiciones adherentes, cuyas condiciones de cultivo alternantes se continúan hasta que la mayoría de las células son células progenitoras de los fotorreceptores.

En realizaciones preferidas, las células progenitoras del campo ocular se caracterizan, tal como inmunocitoquímicamente, como PAX6+ y RX1+ y OCT4- y NANOG-, e incluso más preferiblemente también se caracterizan como Six3+, Six6+, Lhx2+, Tbx3+, SOX2+ y Nestina+, tales como pueden determinarse mediante inmunotinción y/o citometría de flujo u otro ensayo estándar utilizado para caracterizar la expresión del marcador en las células.

En realizaciones preferidas, las células progenitoras de los fotorreceptores se caracterizan, tal como inmunocitoquímicamente, como PAX6+ y CHX10- (tal como se puede determinar mediante inmunotinción y/o citometría de flujo u otro ensayo estándar usado que caracterice la expresión de marcadores en las células), e incluso más preferiblemente también se caracteriza como transcrito de ARNm positivo para Mashl, Nr2e3, Trp2, RORp y NRO de acuerdo con lo detectado por qPCR.

En realizaciones preferidas, las células progenitoras de los fotorreceptores se caracterizan por ser capaces de diferenciarse en células fotorreceptoras tras el tratamiento con ácido retinoico.

En realizaciones preferidas, las células progenitoras de los fotorreceptores mantienen la plasticidad para diferenciarse tanto en bastones como en conos.

En realizaciones preferidas, las células progenitoras de los fotorreceptores, cuando se trasplantan al espacio subretiniano de ratones ELOVL4-TG2, migran a la capa nucleada externa y mejoran las respuestas del ERG escotópico y fotópico en los ratones ELOVL4-TG2 con respecto a ratones ELOVL4-TG2 de control (sin células inyectadas).

En ciertas realizaciones, las condiciones adherentes incluyen un sistema de cultivo que tiene una superficie a la que las células pueden adherirse que incluye un material adherente, que puede, simplemente para ilustrar, comprender uno o más de un poliéster, un polipropileno, un polialquileno, un polifluorocloroetileno, un cloruro de polivinilo, una resina de fluoruro de polivinilo, un poliestireno, una polisulfona, un poliuretano, un tereftalato de polietileno, una celulosa, una fibra de vidrio, una partícula cerámica, una estructura de biomaterial, un ácido poli L láctico, un dextrano, una fibra de metal inerte, sílice, vidrio de natrón, vidrio de borosilicato, quitosano o una esponja vegetal. En algunas realizaciones, el material adherente está cargado electrostáticamente. En determinadas realizaciones, la estructura de biomaterial es una matriz extracelular, tal como colágeno (tal como colágeno tipo IV o tipo I), matriz derivada de 804G, fibronectina, vitronectina, condronectina, laminina o Matrigel™. En otras realizaciones, el biomaterial es gelatina, alginato, poliglicólido, fibrina o péptidos autoensamblables.

En determinadas realizaciones, las células progenitoras del campo ocular y, como consecuencia, las células progenitoras neuronales de la retina y las células progenitoras de los fotorreceptores, se derivan de células madre pluripotentes, tales como células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas.

En realizaciones preferidas, la preparación resultante de células progenitoras de los fotorreceptores se proporciona sustancialmente libre de células madre pluripotentes, es decir, incluye menos del 10 % de células madre pluripotentes, e incluso más preferiblemente menos del 5 %, 2 %, 1 %, 0.1 % o incluso menos del 0.01 % de células madre pluripotentes.

En realizaciones preferidas, la preparación resultante de células progenitoras de los fotorreceptores se proporciona sustancialmente libre de células progenitoras del campo ocular y células progenitoras neuronales de la retina, es decir, incluye menos del 10 % o cualquiera de esas células, e incluso más preferiblemente menos del 5 %, 2 %, 1 %, 0.1 % o incluso menos del 0.01 % de células progenitoras del campo ocular y células progenitoras neuronales de la retina.

En realizaciones preferidas, el componente celular de la preparación resultante de células progenitoras de los fotorreceptores es al menos un 50 % puro con respecto a otros tipos de células (es decir, células que no son células progenitoras de los fotorreceptores), y preferiblemente al menos un 75 %, al menos un 85 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o aproximadamente 100 % puro.

En determinadas realizaciones, el método incluye la etapa adicional de criopreservar las células progenitoras de los fotorreceptores. Las células se congelan preferiblemente en un criopreservante que sea compatible con descongelar en última instancia las células congeladas y, después de lavar opcionalmente las células para eliminar el criopreservante, los fotorreceptores retienen al menos un 25 % de viabilidad celular (tal como en base a la eficiencia del cultivo), y más preferiblemente al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso al menos un 90 % de viabilidad celular.

Varias de las células progenitoras, así como las células fotorreceptoras pueden criopreservarse. En algunas realizaciones, las células progenitoras de los fotorreceptores se criopreservan como esferas.

En determinadas realizaciones, los medios de diferenciación neuronal (o medio como a veces se denomina en este documento) pueden comprender D-glucosa, penicilina, estreptomicina, GlutaMAX™, Suplemento de N2, Suplemento de B27, solución de aminoácidos no esenciales de MEM y opcionalmente incluyendo Nogina.

Los medios de diferenciación neuronal pueden incluir agentes que activan la vía de Notch, tales como ligandos o anticuerpos de Notch.

En determinadas realizaciones, los medios de diferenciación neuronal pueden ser un medio esencialmente libre de suero, tal como un medio condicionado MEDII. En determinadas realizaciones, los medios de diferenciación neuronal comprenden DMEM/F12, FGF-2 y un medio condicionado MEDII. En determinadas realizaciones, el medio de diferenciación neuronal está entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 50 % > de medio condicionado MEDII. En determinadas realizaciones, el medio condicionado MEDII es un medio condicionado Hep G2. El medio MEDII puede comprender una proteína de matriz extracelular de gran peso molecular. El medio MEDII puede comprender un componente de bajo peso molecular que comprende prolina.

En determinadas realizaciones, el medio de diferenciación neuronal es esencialmente un entorno de diferenciación celular libre de suero que comprende menos del 5 % de suero.

En determinadas realizaciones, los medios de diferenciación neuronal están esencialmente libres de LIF.

Los medios de diferenciación neuronal también pueden comprender diversos suplementos tales como el suplemento B27 (Invitrogen) y el suplemento N2 (también de Invitrogen). El suplemento B27 contiene, entre otros componentes, SOD, catalasa y otros antioxidantes (GSH) y ácidos grasos únicos, como ácido linoleico, ácido linolénico, ácidos lipoicos. El suplemento de N2 se puede sustituir por, por ejemplo, el siguiente cóctel: transferrina (10 g/L), insulina (500 mg/L), progesterona (0.63 mg/L), putrescina (1611 mg/L) y selenito (0.52 mg/L).

En ciertas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, las células progenitoras de los fotorreceptores se diferencian de una fuente de células madre pluripotentes, tal como una célula madre pluripotente que expresa OCT4, fosfatasa alcalina, SOX2, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y TRA-1-80 (tales como, entre otros, una línea de células madre embrionarias (ES) o una línea de células madre de pluripotencia inducida (iPS)), e incluso más preferiblemente de una fuente de células madre pluripotentes común.

En ciertas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, las células progenitoras de los fotorreceptores tienen una longitud media del fragmento de restricción terminal (TRF) que es mayor que 7 kb, 7.5 kb, 8 kb, 8.5 kb, 9 kb, 9.5 kb, 10 kb, 10.5 kb, 11 kb, 11.5 kb o incluso 12 kb.

En ciertas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, una preparación es adecuada para la administración a un paciente humano, y más preferiblemente libre de pirógenos y/o libre de productos animales no humanos.

En ciertas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, una preparación es adecuada para la administración a un mamífero veterinario no humano, tal como, entre otros, un perro, gato o caballo.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para producir células progenitoras del campo ocular, que comprende (a) cultivar células madre pluripotentes en un medio de cultivo de inducción de retina. Dichas células madre pluripotentes pueden ser humanas.

Dicho medio de cultivo de inducción de retina puede comprender insulina. Dicha insulina puede ser humana. Dicha insulina puede estar presente en una concentración de aproximadamente 5-50 pg/mL de insulina humana o aproximadamente 25 pg/mL. Dicho medio de cultivo de inducción de retina puede comprender DMEM/F12, DMEM/glucosa alta o DMEM/inactivación.

Dicho medio de cultivo de inducción de retina puede comprender D-glucosa. El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender aproximadamente 450 mg/mL de D-glucosa o entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 mg/mL de D-glucosa.

El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender uno o más antibióticos. Dichos antibióticos pueden incluir uno o ambos de penicilina y estreptomicina, opcionalmente en concentraciones de aproximadamente 0-100 unidades/mL de penicilina y opcionalmente aproximadamente 0-100 pg/mL de estreptomicina, y además opcionalmente en concentraciones de aproximadamente 100 unidades/mL de penicilina y opcionalmente aproximadamente 100 pg/mL de estreptomicina.

El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender un suplemento de N2. Dicho suplemento de N2 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0.1 a 5 % o aproximadamente 1 %.

El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender un suplemento de B27. Dicho suplemento de B27 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0.05-2.0 % o aproximadamente 0.2 %.

El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender aminoácidos no esenciales o aminoácidos no esenciales de MEM o glutamina o GlutaMAX™. Dichos aminoácidos no esenciales o aminoácidos no esenciales de MEM pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 0.1 mM.

El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender un inhibidor de señalización de BMP. Dicho inhibidor de señalización de BMP puede seleccionarse del grupo que consiste en: Nogina tal como polipéptido de Nogina, dorsomorfina, LDN-193189 y cualquier combinación de los mismos.

El medio de cultivo de inducción de retina puede comprender Nogina, tal como polipéptido Nogina. Dicha Nogina puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente 5-100 ng/mL o aproximadamente 10-100 ng/mL o aproximadamente 50 ng/mL.

En algunas realizaciones, el medio puede comprender Nogina, DKK1 e IGF-1. En algunas realizaciones, el medio puede comprender 5 ng/mL de Nogina, 5 ng/mL de DKK1 y 5 ng/mL de IGF-1.

Dichas células madre pluripotentes pueden comprender células ES humanas, células iPS humanas o células STAP humanas. Dichas células madre pluripotentes pueden cultivarse en condiciones sin alimentador y/o sin xeno y/o sobre un sustrato que comprende opcionalmente Matrigel™ (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) y opcionalmente en medio mTESR1, antes de cultivarse en dicho medio de cultivo de inducción de retina que comprende insulina.

Dicho medio de cultivo de inducción de retina puede sustituirse diariamente por medio de cultivo de inducción de retina nuevo. Dicho cultivo en la etapa (a) puede continuar durante aproximadamente 1-10 días o aproximadamente 2-7 días o aproximadamente 5-6 días.

El método puede comprender además (b) cultivar las células en un medio de diferenciación neuronal. Dicho medio de diferenciación neuronal puede comprender medio neurobasal.

Dicho medio de diferenciación neuronal puede comprender D-glucosa. El medio de diferenciación neuronal puede comprender aproximadamente 450 mg/mL de D-glucosa o entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 mg/mL de D-glucosa.

El medio de diferenciación neuronal puede comprender uno o más antibióticos. Dichos antibióticos pueden incluir uno o ambos de penicilina y estreptomicina, opcionalmente en concentraciones de aproximadamente 0-100 unidades/mL de penicilina y opcionalmente aproximadamente 0-100 pg/mL de estreptomicina, y además opcionalmente en concentraciones de aproximadamente 100 unidades/mL de penicilina y opcionalmente aproximadamente 100 pg/mL de estreptomicina.

El medio de diferenciación neuronal puede comprender un suplemento de N2. Dicho suplemento de N2 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0.1 a 5 % o aproximadamente 2 %.

El medio de diferenciación neuronal puede comprender un suplemento de B27. Dicho suplemento de B27 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0.05-5.0 %, aproximadamente 0.05-2.0 % o aproximadamente 2 %.

El medio de diferenciación neuronal puede comprender aminoácidos no esenciales o aminoácidos no esenciales de MEM o glutamina o GlutaMAX™. Dichos aminoácidos no esenciales o aminoácidos no esenciales de MEM pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 0.1 mM.

El medio de cultivo de diferenciación neuronal puede comprender un inhibidor de señalización de BMP Dicho inhibidor de señalización de BMP puede seleccionarse del grupo que consiste en: Nogina tal como polipéptido Nogina, dorsomorfina, LDN-193189 y cualquier combinación de los mismos.

El medio de cultivo de diferenciación neuronal puede comprender Nogina, tal como polipéptido Nogina. Dicha Nogina puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente 10-100 ng/mL o aproximadamente 50 ng/mL.

Dichas células pueden cultivarse en dicho medio de diferenciación neuronal durante aproximadamente 10 a 60 días o aproximadamente 15 a 35 días o aproximadamente 24 días.

Dichas células progenitoras del campo ocular pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo.

Dichas células progenitoras del campo ocular expresan uno o ambos marcadores PAX6 y RX1. Por lo tanto, las células progenitoras del campo ocular pueden ser PAX6(+) y/o RX1(+). Dichas células progenitoras del campo ocular pueden ser una o más de SlX3(+), SIX6(+), LHX2(+), TBX3(+) y/o Nestina(+). Dichas células progenitoras del campo ocular pueden ser una o más de SOX2(+) y OCT4(-) y Nanog(-). Dichas células progenitoras del campo ocular pueden ser humanas.

El método puede comprender además diferenciar dichas células progenitoras del campo ocular en células progenitoras neuronales de la retina.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células progenitoras del campo ocular producidas usando un método como se describe en el presente documento, por ejemplo, como se describe en los párrafos anteriores. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células progenitoras del campo ocular, que son opcionalmente humanas.

Dichas células progenitoras del campo ocular pueden ser humanas. Dichas células progenitoras del campo ocular pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo. Dichas células progenitoras del campo ocular expresan uno o ambos marcadores PAX6 y RX1. Por lo tanto, las células progenitoras del campo ocular pueden ser PAX6(+) y/o RX1(+). Dichas células progenitoras del campo ocular pueden ser una o más de SIX3(+), SIX6(+), LHX2(+), TBX3(+) y/o Nestina(+). Dichas células progenitoras del campo ocular pueden ser una o más de SOX2(+) y OCT4(-) y Nanog(-). Dichas células progenitoras del campo ocular pueden criopreservarse.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un individuo que lo necesita, que comprende administrar una composición que comprende células progenitoras del campo ocular (por ejemplo, una composición como se describe en el presente documento o una composición producida usando un método como se describe en el presente documento) a dicho individuo. Dicha composición se puede administrar al ojo, al espacio subretiniano o por vía intravenosa. Dichos individuos pueden tener degeneración macular, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, y dicha degeneración macular puede estar en una etapa temprana o tardía. Estos individuos pueden tener retinitis pigmentosa, displasia de retina, degeneración de retina, retinopatía diabética, distrofia de retina congénita, amaurosis congénita de Leber, desprendimiento de retina, glaucoma o neuropatía óptica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para producir células progenitoras neuronales de la retina o células progenitoras de los fotorreceptores, que comprende (a) cultivar células progenitoras del campo ocular en un medio de diferenciación neuronal. Dicho medio de diferenciación neuronal puede comprender medio neurobasal.

El medio de cultivo de diferenciación neuronal opcionalmente no comprende un inhibidor de señalización de BMP añadido exógenamente. El medio de diferenciación neuronal opcionalmente no contiene Nogina añadida exógenamente, tal como el polipéptido Nogina.

La etapa (a) puede comprender (i) cultivar células progenitoras del campo ocular hasta que las células formen esferas, y (ii) sembrar las esferas en condiciones adherentes.

La etapa (i) puede comprender cultivar las células en placas de baja adherencia. La etapa (i) puede comprender cultivar las células en una gota colgante. El cultivo de la etapa (i) puede formarse rompiendo mecánica o enzimáticamente células cultivadas en una única suspensión celular. La etapa (i) puede continuar durante 1-10, 3-8 o aproximadamente 5 días.

La etapa (ii) puede comprender sembrar las esferas sobre Matrigel™. La etapa (ii) puede comprender sembrar las esferas sobre laminina o colágeno. La etapa (ii) puede continuar hasta que dicho cultivo sea confluente.

Las etapas (i) y (ii) pueden repetirse de forma alterna.

Dichas células pueden cultivarse en dicho medio de diferenciación neuronal durante aproximadamente 10-60 días o aproximadamente 15-35 días o aproximadamente 25 días.

Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden diferenciarse de dichas células progenitoras del campo ocular y pueden estar presentes en números crecientes en dicho cultivo. Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo.

Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden expresar uno o ambos marcadores PAX6 y RX1. Por lo tanto, las células progenitoras neuronales pueden ser PAX6(+) y/o CHX10(+). Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden ser SOX2(-). Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden ser Tuj1(+) o Tuj1(-).

Dichas células pueden cultivarse en dicho medio de diferenciación neuronal durante aproximadamente 10-330 días o aproximadamente 15-300 días o aproximadamente 10-100 días o aproximadamente 15-100 días o aproximadamente 100 días.

Dichas células progenitoras de los fotorreceptores se diferencian de dichas células progenitoras neuronales de la retina y pueden estar presentes en números crecientes en dicho cultivo. Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo.

Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden ser PAX6(+) y/o CHX10(-). Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden expresar uno o más de los marcadores Nr2e3, Trp2, Mash1, RORp y/o NRO, y por lo tanto pueden ser Nr2e3(+) y/o Trp2(+) y/o Mash1(+) y/o RORp(+) y/o NRO(+).

Dichas células pueden cultivarse en dicho medio de diferenciación neuronal durante al menos aproximadamente 130 días, al menos aproximadamente 160 días, al menos aproximadamente 190 días o más, por lo que dichas células progenitoras de los fotorreceptores exhiben una capacidad disminuida o nula para diferenciarse en conos mientras conservan la capacidad para formar bastones.

El método puede comprender además diferenciar dichas células progenitoras de los fotorreceptores en fotorreceptores.

Dichas células progenitoras del campo ocular pueden diferenciarse de una célula madre pluripotente, tal como una célula ES o una célula iPS o una célula STAP, cuya célula madre pluripotente, tal como una célula ES o una célula iPS o una célula STAP, puede ser opcionalmente humana.

En otro aspecto, dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden ser humanas.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células progenitoras neuronales de la retina producidas de acuerdo con cualquier método descrito en el presente documento, por ejemplo, los métodos descritos en los párrafos anteriores. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células progenitoras neuronales de la retina, que son opcionalmente humanas.

Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo.

Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden expresar uno o ambos marcadores PAX6 y CHX10 y, por lo tanto, pueden ser PAX6(+) y/o CHX10(+). Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden ser SOX2(-). Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden ser Tuj1(+) o Tuj1 (-).

Dichas células progenitoras neuronales de la retina pueden criopreservarse.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un individuo que lo necesita, que comprende administrar una composición que comprende células progenitoras neuronales de la retina, por ejemplo, una composición descrita en el presente documento o una composición producida de acuerdo con un método descrito en el presente documento, a dicho individuo. Dicha composición se puede administrar al ojo, al espacio subretiniano o por vía intravenosa. Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden ser humanas. Dichos individuos pueden tener degeneración macular, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, y dicha degeneración macular puede estar en una etapa temprana o tardía. Dichos individuos pueden tener retinitis pigmentosa, displasia de retina, degeneración de retina, retinopatía diabética, distrofia de retina congénita, amaurosis congénita de Leber, desprendimiento de retina, glaucoma o neuropatía óptica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células progenitoras de los fotorreceptores producidas de acuerdo con un método descrito en el presente documento, por ejemplo, un método de acuerdo con los párrafos anteriores. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células progenitoras de los fotorreceptores, que son opcionalmente humanas.

Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo.

Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden ser PAX6(+) y/o CHX10(-). Dichas células progenitoras de los fotorreceptores expresan uno o más de los marcadores Nr2e3, Trp2, Mash1, RORp y/o NRO, y por lo tanto pueden ser Nr2e3(+) y/o Trp2(+) y/o Mash1(+) y/o RORp(+) y/o NRO(+).

Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden criopreservarse.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un individuo que lo necesita, que comprende administrar una composición que comprende células progenitoras de los fotorreceptores, por ejemplo, una composición como se describe en el presente documento, por ejemplo, en los párrafos anteriores, o una composición producida de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en los párrafos anteriores, a dicho individuo. Dicha composición se puede administrar al ojo, al espacio subretiniano o por vía intravenosa. Dichos individuos pueden tener degeneración macular, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, y dicha degeneración macular puede estar en una etapa temprana o tardía. Estos individuos pueden tener retinitis pigmentosa, displasia de retina, degeneración de retina, retinopatía diabética, distrofia de retina congénita, amaurosis congénita de Leber, desprendimiento de retina, glaucoma o neuropatía óptica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para producir células fotorreceptoras, que comprende (a) cultivar células progenitoras de los fotorreceptores en un medio de diferenciación de fotorreceptores. Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender medio neurobasal.

Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender D-glucosa. El medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender aproximadamente 450 mg/mL de D-glucosa o entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 mg/mL de D-glucosa.

El medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender uno o más antibióticos. Dichos antibióticos pueden incluir uno o más o todos de penicilina y estreptomicina, opcionalmente en concentraciones de aproximadamente 0 100 unidades/mL de penicilina y opcionalmente aproximadamente 0-100 pg/mL de estreptomicina, y además opcionalmente en concentraciones de aproximadamente 100 unidades/mL de penicilina y opcionalmente aproximadamente 100 pg/mL de estreptomicina.

El medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender un suplemento de N2. Dicho suplemento de N2 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0.1 a 5 % o aproximadamente 2 %.

El medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender un suplemento de B27 (por ejemplo, de fórmula número 080085-SA). Dicho suplemento de B27 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0.05 5.0 %, aproximadamente 0.05-2.0 % o aproximadamente 2 %.

El medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender aminoácidos no esenciales o aminoácidos no esenciales de MEM o glutamina o GlutaMAX™. GlutaMAX™ es L-alanil-L-glutamina, que es una forma estabilizada de L-glutamina. Dichos aminoácidos no esenciales o aminoácidos no esenciales de MEM pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 0.1 mM.

Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender forskolina. Dicha forskolina puede estar presente en el medio de diferenciación de fotorreceptores en una concentración entre aproximadamente 1-100 pM o aproximadamente 5 pM.

Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender BDNF. Dicho BDNF puede estar presente en el medio de diferenciación de fotorreceptores en una concentración entre aproximadamente 1-100 ng/mL o aproximadamente 10 ng/mL.

Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender CNTF. Dicho CNTF puede estar presente en el medio de diferenciación de fotorreceptores en una concentración entre aproximadamente 1-100 ng/mL o aproximadamente 10 ng/mL.

Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender LIF. Dicho LIF puede estar presente en el medio de diferenciación de fotorreceptores en una concentración entre aproximadamente 5-50 ng/mL o aproximadamente 10 ng/mL.

Dicho medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender DATP Dicho DATP puede estar presente en el medio de diferenciación de fotorreceptores en una concentración entre aproximadamente 1-100 pM o aproximadamente 10 pM.

Dichas células progenitoras de los fotorreceptores pueden diferenciarse de las células progenitoras neuronales de la retina, que opcionalmente son humanas. Dichas células fotorreceptoras pueden ser humanas.

En alguna realización, las células progenitoras de los fotorreceptores se tratan previamente con ácido retinoico y taurina en medio ND, antes del cultivo en el medio de diferenciación de fotorreceptores. El ácido retinoico se puede usar en una concentración de aproximadamente 100-1000 ng/mL y la taurina se puede usar en una concentración de aproximadamente 20-500 pM. Esta etapa de cultivo puede ocurrir durante aproximadamente 1 a 2 semanas, en algunas realizaciones. En algunos casos, el medio se puede cambiar (por ejemplo, cambio medio) cada 2 días. Luego se puede cambiar el medio a medio ND que carece de ácido retinoico y taurina, y las células se pueden cultivar durante aproximadamente 1 a 2 semanas más, o hasta que se vuelvan confluentes.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células fotorreceptoras producidas de acuerdo con un método como se describe en el presente documento, por ejemplo, en los párrafos anteriores, que son opcionalmente humanas.

Dichas células fotorreceptoras pueden ser PAX6(-). Dichas células fotorreceptoras pueden comprender al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicho cultivo. Dichas células fotorreceptoras pueden criopreservarse.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un individuo que lo necesita, que comprende administrar una composición que comprende células fotorreceptoras, por ejemplo, una composición como se describe en el presente documento tal como en los párrafos anteriores o una composición producida mediante un método como se describe en el presente documento, por ejemplo, en los párrafos anteriores, a dicho individuo. Dicha composición se puede administrar al ojo, al espacio subretiniano o por vía intravenosa. Dichos individuos pueden tener degeneración macular, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, y dicha degeneración macular puede estar en una etapa temprana o tardía. Estos individuos pueden tener retinitis pigmentosa, displasia de retina, degeneración de retina, retinopatía diabética, distrofia de retina congénita, amaurosis congénita de Leber, desprendimiento de retina, glaucoma o neuropatía óptica.

La divulgación describe una preparación sustancialmente pura de células progenitoras de los fotorreceptores (PRPC) o células fotorreceptoras (PR) de origen humano, preferiblemente células progenitoras de los fotorreceptores o células fotorreceptoras no derivadas de donantes, que se originan a partir de células no cultivadas en una plataforma alimentadora de fibroblastos de ratón. Por ejemplo, la preparación puede tener una pureza del 85 %-95 %. También se describe en el presente documento un método para preparar la preparación sustancialmente pura de PRPC o PR de origen humano que omite la necesidad de células derivadas de una plataforma alimentadora de fibroblastos de ratón. Reemplazar un sistema alimentador con los métodos de la presente invención produce una mayor homogeneidad de las células fotorreceptoras, por ejemplo, del 75 %-100 % o del 85 %-95 %. La diferenciación de las células madre libres de alimentador también puede ocurrir en ausencia de la introducción de factores inductores exógenos, lo que supone una mejora sustancial con respecto a la técnica anterior. Sin embargo, la adición opcional de Nogina puede acelerar la diferenciación de las células madre, aunque no es necesario que se produzca la diferenciación. Las células progenitoras de los fotorreceptores resultantes se caracterizan inmunocitoquímicamente únicamente como positivas para PAX6 (PAX6(+)) y negativas para CHX10 (CHX10(-)).

Breve descripción de los dibujos

La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo(s) en color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

FIG. 1: Análisis por PCR en tiempo real de transcripciones de factores de transcripción del campo ocular en células diferenciadas en diferentes condiciones.

FIG. 2: Morfología de las células en diferenciación. (A) El día 1 después de la diferenciación celular, las células en el margen de la colonia tenían forma de columna (flecha). (B) El día 10 después de la diferenciación, las células del borde se volvieron grandes y planas (punta de flecha) y las células centrales eran pequeñas y compactas (flecha). (C) Estructuras en forma de roseta se formaron el día 21.

FIG. 3: Las células cultivadas 21 días después del inicio de la diferenciación expresaron factores de transcripción del campo ocular. (A) Coexpresión de PAX6 (verde) y RX1 (rojo), como se desprende de la versión en color de la Figura. (B) El 93 % de las células coexpresaron PAX6 y RX1 como se muestra mediante análisis de citometría de flujo de doble color. (C) Las células expresaban Nestina (rojo). (D) Las células expresaron SOX2 (rojo). Tanto en (C) como en (D), DAPI (azul) marca los núcleos celulares. (E) Análisis por RT-PCR de transcripciones de factores de transcripción del campo ocular: RX1, PAX6, LHX2, SIX3, SIX6, TBX3 y SOX2.

FIG. 4: Las células cultivadas 30 días después del inicio de la diferenciación expresaron marcadores de progenitores neuronales de la retina. (A) Morfología de las células. Después de sembrar en Matrigel™, las neuronas migraron fuera de los agregados celulares (flecha). Se observan algunas células de tipo epitelial (punta de flecha) alrededor de los agregados celulares. (B) Panel superior, imagen de contraste de fase de neuronas migratorias; panel inferior, las neuronas migratorias expresaron Tuj1 (rojo). (C) Las células coexpresaron PAX6 (rojo) y CHX10 (verde), como se desprende de la versión en color de la Figura.

FIG. 5: Células cultivadas 3 meses después del inicio de la diferenciación. (A) Morfología de las células. (B) Las células expresan PAX6, pero no CHX10, como se desprende de la versión en color de la Figura que muestra tinción roja de algunas de las células, pero no tinción verde. (C) La expresión de Recoverina se limitó al citoplasma del cuerpo celular, como se desprende de la versión en color de la Figura. d) Análisis RT-PCT en tiempo real de transcripciones de Rodopsina, Opsina y Recoverina en progenitores neuronales de la retina (RNP) y células progenitoras de los fotorreceptores (indicadas como PhRP).

FIG. 6: Las células diferenciadas expresan marcadores de células fotorreceptoras. Células expresadas (A) Rodopsina (rojo), (B) Rodopsina (rojo) y Recoverina (verde), (C) Opsina (verde) y (D) subunidad alfa de la fosfodiesterasa 6A (PDE6a) (rojo). DAPI (azul) marca los núcleos celulares. La expresión de estos marcadores es evidente en la versión en color de la Figura.

FIG. 7: Diagrama esquemático de estudios con animales en ratones transgénicos ELOVL4.

FIG. 8: Función de respuesta de intensidad del ERG escotópico registrada un mes después de la inyección de células subretinianas. Curvas de intensidad de estímulo para ondas a escotópicas (panel superior) y ondas b (panel inferior) de ratones ELOVL4-TG2 a los que se les administró PBS (línea negra) o células progenitoras de los fotorreceptores (indicadas como PhRP, línea gris). *, p<0.001 (frente a PBS).

FIG. 9: Función de respuesta de intensidad del ERG escotópico registrada un mes después de la inyección de células sistémicas. Curvas de intensidad de estímulo para ondas a escotópicas (panel superior) y ondas b (panel inferior) de ratones ELOVL4-TG2 a los que se les administró PBS, células progenitoras de los fotorreceptores (indicadas como PhRP) o células progenitoras de los fotorreceptores tratadas con ácido retinoico (PhRP-RA). El blanco representa ratones no tratados. #, p<0.01 (frente a PBS).

FIGS. 10A-B. La inyección sistémica de células progenitoras de los fotorreceptores restaura la función de los bastones entre uno y dos meses después del trasplante de células. Amplitud de las ondas a (A) y ondas b (B) escotópicas del ERG uno y dos meses después de la inyección de células de ratones ELOVL4-TG2 a los que se les administró PBS (PBS) o células progenitoras de los fotorreceptores tratadas con ácido retinoico (PhRP-RA).

FIG. 10C: Función de respuesta de intensidad del ERG escotópico registrada dos meses después de la inyección de células sistémicas. Curvas de intensidad de estímulo para ondas a escotópicas (panel superior) y ondas b (panel inferior) de ratones ELOVL4-TG2 a los que se les administró PBS o células progenitoras de los fotorreceptores tratadas con ácido retinoico (PhRP-RA). El blanco representa ratones no tratados. La línea de base es el nivel registrado a las 4 semanas. *, p<0.001 (frente a PBS).

FIG. 11: Amplitud del ERG fotópico de las ondas a (panel superior) y las ondas b (panel inferior) uno y dos meses después de la inyección de células de ratones ELOVL4-TG2 a los que se les administró PBS o progenitores de fotorreceptores tratados con ácido retinoico (PhRP-RA). *, p<0.001 (frente a PBS 2 meses).

FIG. 12: Grosor completo de la retina central medido por OCT uno y dos meses después de la inyección de células de ratones ELOVL4-TG2 no tratados (blanco) y ratones a los que se les administró PBS, células progenitoras de los fotorreceptores (PhRP) o células progenitoras de los fotorreceptores tratadas con ácido retinoico (PhRP-RA).

FIG. 13: (A) Imágenes representativas de la tinción de retina con HE dos meses después de la inyección de células de ratones ELOVL4-TG2 a los que se les administró PBS (panel izquierdo) y células progenitoras de los fotorreceptores tratadas con ácido retinoico (panel derecho). ONL, capa nuclear exterior. iNl , capa nuclear interna. (B), Cuantificación del grosor de ONL de la retina dos meses después de la inyección de células de ratones ELOVL4-TG2 no tratados (blanco) y ratones a los que se les administró PBS o progenitores de fotorreceptores tratados con ácido retinoico (PhRP-RA).

FIG 14: Diagrama esquemático de estudios con animales en ratas RCS.

FIG. 15: Preservación de células fotorreceptoras del huésped después del trasplante de células progenitoras de los fotorreceptores derivadas de células ES humanas. Secciones de retina en P90 teñidas con DAPI: (A) La capa nuclear externa (ONL) se reduce a 0-1 capa en ratas de control. (B) Células ONL rescatadas en rata RCS después de una inyección intravenosa de células, que tiene entre 2-4 células de profundidad. (C) Células ONL rescatadas en rata RCS que reciben una inyección de células intravítreas, que tiene entre 3-5 células de profundidad. INL, capa nuclear interna; GL, capa de células ganglionares.

FIG. 16: Preservación del segmento externo (OS) de la célula fotorreceptora del bastón huésped después del trasplante de células progenitoras de los fotorreceptores derivadas de células ES humanas. Secciones de retina en P90 teñidas para Rodopsina (verde). (A) Pérdida completa de OS de bastones en ratas de control (flecha). (B) Expresión de Rodopsina en el OS de las células fotorreceptoras del bastón huésped en la retina de rata RCS después de la inyección intravenosa de células progenitoras de los fotorreceptores (flecha). (C) Expresión de Rodopsina en el 05 de las células fotorreceptoras del bastón huésped en la retina de rata RCS después del trasplante intravítreo de células progenitoras de los fotorreceptores (flecha). La expresión de Rodopsina es evidente en la versión en color de la Figura.

FIG. 17: Preservación del segmento externo (OS) de la célula fotorreceptora del cono huésped después del trasplante de células progenitoras de los fotorreceptores derivadas de células ES humanas. Secciones de retina en P90 teñidas para Opsina (verde). (A) Pérdida completa del cono OS en ratas de control (flecha). (B) Expresión de opsina en el OS de las células fotorreceptoras del cono huésped en la retina de rata RCS después de la inyección intravenosa de células progenitoras de los fotorreceptores (flecha). (C) Expresión de opsina en el OS de las células fotorreceptoras del cono huésped en la retina de rata RCS después del trasplante intravítreo de progenitores de fotorreceptores (flecha). La expresión de Opsina es evidente en la versión en color de la Figura.

FIG. 18: Células progenitoras de fotorreceptores derivadas de células ES humanas trasplantadas en el vítreo de ratas RCS diferenciadas en células fotorreceptoras de bastón maduras. Secciones de retina en P90 teñidas para rodopsina (verde en A), Recoverina (verde en B). Las células humanas se marcaron con anticuerpo anti-HuNU (rojo). DAPI marcó todos los núcleos. La expresión de Rodopsina y recoverina y la tinción con DAPI son evidentes en la versión en color de la Figura.

FIG. 19: Ilustra el método general usado para el desarrollo de fotorreceptores en los Ejemplos 1-2 e ilustra además los medios usados en cada etapa del proceso.

FIG. 20: Ilustra el momento del desarrollo de las células fotorreceptoras y de las células progenitoras de los fotorreceptores en los Ejemplos 1-2.

FIG. 21: Muestra los componentes de los medios de cultivo y los suplementos de medios utilizados en los Ejemplos.

FIG. 22: Ilustra el patrón de expresión génica de ESC, células progenitoras del campo ocular, células progenitoras neuronales de la retina, células progenitoras de los fotorreceptores y células fotorreceptoras durante la diferenciaciónin vitrode células madre pluripotentes humanas.

FIG. 23: Proporciona histogramas de citometría de flujo que muestran grados relativos de fagocitosis de biopartículas fluorescentes BioParticles pHrodo™ Red deE. coli(Invitrogen) mediante progenitores de fotorreceptores hES-RPE y hES a 37 °C y 4 °C, en comparación con el control (sin biopartículas). El histograma de las células progenitoras de los fotorreceptores ilustra que, al igual que las células del RPE, la intensidad de la señal de fluorescencia aumenta al cambiar las células de una temperatura relativamente no permisiva de 4 °C a una temperatura fisiológicamente relevante de 37 °C, lo que indica que las células progenitoras de los fotorreceptores son capaces de fagocitar las biopartículas. Las biopartículas son un sustituto de los segmentos externos desprendidos y de las drusas en el ojo.

Descripción detallada

La invención proporciona métodos para generar células fotorreceptoras (PRC) y células progenitoras de los fotorreceptores (PRPC). Estos métodos implican la diferenciaciónin vitrode progenitores anteriores, incluidas células madre pluripotentes, progenitores del campo ocular (EF) y células progenitoras neuronales de la retina. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden utilizar como material de partida cualquiera de las poblaciones progenitoras anteriores (incluidas las células madre).

La invención contempla además generar células fotorreceptoras (PRC) y células progenitoras de los fotorreceptores (PRPC)in vitroa partir de células progenitoras del campo ocular primario (EF) y células progenitoras neuronales de la retina (es decir, células primarias que se refieren a células obtenidas de un sujeto en lugar de diferenciaciónin vitrode un progenitor más inmaduro).

El desarrollo de los fotorreceptores se produce a través de varias etapas de desarrollo, cada una de las cuales puede definirse fenotípicamente (por ejemplo, mediante el perfil de expresión del marcador) y/o funcionalmente. Este desarrollo se ilustra esquemáticamente en la FIG. 22. Las células madre pluripotentesin vitrose diferencian en progenitores del EF, que a su vez se diferencian en células progenitoras neuronales de la retina, que a su vez se diferencian en células progenitoras de los fotorreceptores, que a su vez se diferencian en células fotorreceptoras.

Las células progenitoras, como se usan en el presente documento, se refieren a células que permanecen mitóticas y pueden producir más células progenitoras, de la misma o de capacidad diferenciativa más limitada, o pueden diferenciarse hasta un linaje celular de destino final. Los términos progenitor y precursor se usan indistintamente. Las células en cada una de estas etapas se discutirán con mayor detalle en el presente documento.

Las células progenitoras de los fotorreceptores (también denominadas progenitoras de fotorreceptores) y las células fotorreceptoras proporcionadas en el presente documento se pueden usar en una variedad de métodosin vivoein vitro.Por ejemplo, las células progenitoras de los fotorreceptores se pueden usarin vivopara tratar afecciones de la retina, incluidas, entre otras, degeneración macular y retinitis pigmentosa. Las células progenitoras de los fotorreceptores y las células fotorreceptoras se pueden usarin vitroen ensayos de detección para identificar posibles candidatos a tratamientos terapéuticos o profilácticos.

La invención proporciona además células progenitoras de los fotorreceptores y células fotorreceptoras obtenidas mediante los métodos descritos en el presente documento. Células progenitoras fotorreceptoras y células fotorreceptoras obtenidas mediante diferenciaciónin vitrode células madre pluripotentes o su progenie diferenciada, tales como células progenitoras del campo ocular. Las propias células progenitoras del campo ocular pueden obtenerse a partir de diferenciaciónin vitrode células madre pluripotentes, o pueden ser progenitoras primarias del campo ocular obtenidas de un sujeto.

La invención proporciona poblaciones de células progenitoras de los fotorreceptores y poblaciones de células fotorreceptoras que no se han obtenido o no son obtenibles a partir de fuentes primarias. Estas poblaciones pueden ser homogéneas o casi homogéneas en su contenido celular. Por ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicha población pueden ser células progenitoras de los fotorreceptores. Como otro ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o aproximadamente el 100 % de las células en dicha población pueden ser células fotorreceptoras. Estas células en estas poblaciones pueden ser de un solo haplotipo. Por ejemplo, pueden tener compatibilidad con HLA. Estas células en estas poblaciones pueden ser genéticamente idénticas.

La divulgación proporciona preparaciones sustancialmente puras (u homogéneas) de diversas poblaciones celulares basadas en la capacidad de los métodos divulgados para diferenciar directamente células progenitoras tales como, entre otras, células madre pluripotentes. Como se usa en el presente documento, la diferenciación dirigida pretende que la población de células progenitoras se diferencie en o hacia un linaje deseado, debido en parte a los factores u otros estímulos proporcionados a dichas células progenitoras, evitando así la diferenciación en otros linajes no deseados y, por lo tanto, potencialmente contaminantes. Los métodos proporcionados en el presente documento impulsan la diferenciación de, por ejemplo, células madre pluripotentes en progenitores del campo ocular sin generar cuerpos embrioides (EB). Los EB, como se describe a continuación, son grupos de células tridimensionales que pueden formarse durante la diferenciación de células madre pluripotentes que incluyen, entre otras, células madre embrionarias (ES), y que normalmente contienen células, incluidos progenitores, de linajes mesodérmico, ectodérmico y endodérmico. La naturaleza tridimensional de los EB puede crear un entorno diferente, que incluye diferentes interacciones célula-célula y diferente señalización célula-célula, que ocurre en los métodos no basados en EB descritos en este documento. Además, es posible que no todas las células dentro de los EB reciban una dosis similar de un agente agregado exógenamente, tal como un factor de diferenciación presente en el medio circundante, y esto puede resultar en diversos eventos y decisiones de diferenciación durante el desarrollo del EB.

Por el contrario, los métodos de cultivo de la invención que cultivan células progenitoras no requieren y preferiblemente evitan la formación de EB. En cambio, estos métodos cultivan células en condiciones que les proporcionan un contacto igual con el medio circundante, incluidos los factores de dicho medio. Las células pueden crecer como una monocapa o casi una monocapa unida a una superficie de cultivo, por ejemplo.

La capacidad de todas o la mayoría de las células progenitoras de estar en contacto con su medio circundante y, por tanto, con los factores de dicho medio en un grado aproximadamente igual, da como resultado que esas células progenitoras se diferencien en tiempos similares y en grados similares. Esta línea de tiempo de diferenciación similar para una población de células progenitoras indica que dichas células están sincronizadas. Las células también pueden estar sincronizadas con el ciclo celular en algunos casos. Tal sincronicidad da como resultado poblaciones de células que son homogéneas o casi homogéneas en su composición celular. Como ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden producir poblaciones celulares en las que al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % de las células son una célula particular de interés. La célula de interés puede definirse fenotípicamente, por ejemplo, mediante expresión de marcadores intracelulares o extracelulares. La célula de interés puede ser una célula progenitora del campo ocular, una célula progenitora de la retina neuronal, una célula progenitora de fotorreceptor o una célula fotorreceptora.

Como se usa en el presente documento, una mayoría de células significa al menos el 50 %, y dependiendo de la realización puede incluir al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % de células.

El grado de pureza que se puede lograr usando los métodos de la invención es particularmente importante cuando dichas poblaciones celulares se van a usarin vivocon fines terapéuticos o profilácticos. La capacidad de obtener poblaciones de alta pureza celular evita realizar otra manipulación, tal como una etapa de enriquecimiento o selección, que puede resultar en una pérdida celular innecesaria. Esto es particularmente importante cuando la población celular puede ser pequeña o el número de células puede ser limitado.

Definiciones: Como se define en el presente documento, las formas singulares se proporcionan con fines ilustrativos, pero también pueden aplicarse a versiones en plural de la frase. Las siguientes definiciones pretenden complementar las definiciones convencionales de los términos tal como los entenderían las personas con conocimientos habituales.

"Preparación sustancialmente pura de células progenitoras de los fotorreceptores (PRPC)". Como se usa en el presente documento, esta frase se refiere a una preparación de células (por ejemplo, una composición que comprende células) en la que las células son al menos un 75 % puras o preferiblemente al menos un 85 % puras, al menos un 95 % puras o son aproximadamente 85 % a 95 % puras. Por ejemplo, el nivel de pureza puede cuantificarse determinando la proporción de células en la preparación que expresan uno o más marcadores, tales como aquellos marcadores de PRPC (incluidos aquellos marcadores identificados en esta solicitud u otros conocidos en la técnica), con respecto al número total de células en la preparación, por ejemplo, detectando células que expresan o no dicho uno o más marcadores. Opcionalmente, también se puede detectar la expresión de marcadores indicativos de células no PRPC, facilitando así la detección y/o cuantificación de dichas células. Los ejemplos de métodos que pueden utilizarse incluyen, sin limitación, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica, hibridaciónin situy otros métodos adecuados conocidos en la técnica. Opcionalmente, la determinación de la pureza se puede realizar sin tener en cuenta las células no viables presentes en la preparación.

"Preparación sustancialmente pura de células fotorreceptoras (PR) de origen humano". Como se usa en el presente documento, esta frase se refiere a una preparación de células (por ejemplo, una composición que comprende células) en la que las células son al menos un 75 % puras o preferiblemente al menos un 85 % puras, al menos un 95 % puras o son aproximadamente 85 % a 95 % puras. Por ejemplo, el nivel de pureza puede cuantificarse determinando la proporción de células en la preparación que expresan uno o más marcadores, tales como aquellos marcadores de PR (incluidos los marcadores identificados en esta solicitud u otros conocidos en la técnica), con respecto al número total de células en la preparación, por ejemplo, detectando células que expresan o no dicho uno o más marcadores. Opcionalmente, también se puede detectar la expresión de marcadores indicativos de células no PR, facilitando así la detección y/o cuantificación de dichas células. Los ejemplos de métodos que pueden utilizarse incluyen, sin limitación, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica, hibridaciónin situy otros métodos adecuados conocidos en la técnica. Opcionalmente, la determinación de la pureza se puede realizar sin tener en cuenta las células no viables presentes en la preparación.

"Cuerpos embrioides" se refiere a agregados o cúmulos de células pluripotentes (por ejemplo, iPSC o ESC) que pueden formarse cultivando células pluripotentes en condiciones no unidas, por ejemplo, sobre un sustrato poco adherente o en una "gota colgante". En estos cultivos, las células pluripotentes pueden formar agregados o cúmulos de células denominados cuerpos embrioides. Véase Itskovitz-Eldor et al., Mol Med. Febrero de 2000; 6(2): 88-95. Normalmente, los cuerpos embrioides se forman inicialmente como agregados o cúmulos sólidos de células pluripotentes y, con el tiempo, algunos de los cuerpos embrioides llegan a incluir cavidades llenas de líquido; las últimas se denominan en la literatura EB "simples" y las segundas como cuerpos embrioides "quísticos".

El término "célula madre embrionaria" (célula ES o ESC) se usa en el presente documento tal como se usa en la técnica. Las células madre embrionarias utilizadas en realizaciones de la presente invención se generan mediante métodos que no implican la destrucción de embriones humanos. Este término incluye células derivadas de la masa celular interna de blastocistos o mórulas humanas, incluidas aquellas que se han pasado en serie como líneas celulares. Las células ES pueden derivarse de la fertilización de un óvulo con esperma, así como del uso de ADN, transferencia nuclear de células no humanas, partenogénesis o mediante la generación de células ES con homocigosidad en la región de HLA. Las células ES también son células derivadas de un cigoto, blastómeros o embriones de mamíferos en etapa de blastocisto producidos por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, la transferencia nuclear de células no humanas, la partenogénesis, la androgénesis o la reprogramación de la cromatina y la posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula. Las células madre embrionarias, independientemente de su origen o del método particular utilizado para producirlas, pueden identificarse basándose en (i) la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales, (ii) la expresión de al menos OCT 4 y fosfatasa alcalina, y (iii) capacidad de producir teratomas cuando se trasplantan a animales inmunodeficientes. Los ejemplos de líneas celulares incluyen NED1, NED2, NED3, NED4, NED5 y NED7. Véase también el Registro de Células Madre Embrionarias Humanas de los NIH. Las células ES humanas utilizadas de acuerdo con ejemplos de realizaciones de la presente invención pueden derivarse y mantenerse de acuerdo con los estándares de GMP

El término "células ES" no infiere, y no debe inferirse que significa, que las células se generaron mediante la destrucción de un embrión. Por el contrario, hay varios métodos disponibles que pueden usarse para generar células ES sin destruir un embrión, tal como un embrión humano. Como ejemplo, las células ES pueden generarse a partir de blastómeros únicos derivados de un embrión, de manera similar a la extracción de blastómeros para el diagnóstico genético previo a la implantación (PGD). Ejemplos de tales líneas celulares incluyen NED1, NED2, NED3, NED4, NED5 y NED7. Véase también Chung et al. 2008, Cell Stem Cell, 2: 113. Todas estas líneas se generaron sin destrucción de embriones.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "células madre pluripotentes" incluye, entre otras, células madre derivadas de tejidos, células madre embrionarias, células madre derivadas de embriones, células madre pluripotentes inducidas y células de adquisición de pluripotencia activadas por estímulos (STAP), independientemente del método mediante el cual se obtengan las células madre pluripotentes. El término también incluye células madre pluripotentes que tienen las características funcionales y fenotípicas de las células mencionadas anteriormente, independientemente del método utilizado para generar dichas células. Las células madre pluripotentes se definen funcionalmente como células madre que son: (a) capaces de inducir teratomas cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes (SCID); (b) capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales (por ejemplo, pueden diferenciarse en tipos de células ectodérmicas, mesodérmicas y endodérmicas); y (c) expresan uno o más marcadores de células madre embrionarias (por ejemplo, expresan OCT4, fosfatasa alcalina, antígeno de superficie SSEA-3, antígeno de superficie SSEA-4, Nanog, T<r>A-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1, etc.). En determinadas realizaciones, las células madre pluripotentes expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, fosfatasa alcalina, SSEA-3, SSEA-4, TrA-1-60 y TRA-1-81. Se pueden generar ejemplos de células madre pluripotentes usando, por ejemplo, métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de células madre pluripotentes incluyen células madre embrionarias derivadas del ICM de embriones en etapa de blastocisto, así como células madre embrionarias derivadas de uno o más blastómeros de un embrión en etapa de escisión o etapa de mórula (opcionalmente sin destruir el resto del embrión). Estas células madre embrionarias pueden generarse a partir de material embrionario producido mediante fertilización o por medios asexuales, incluida la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) de células no humanas, la partenogénesis y la androgénesis. Otros ejemplos de células madre pluripotentes incluyen células madre pluripotentes inducidas (iPSC) generadas mediante la reprogramación de una célula somática mediante la expresión de una combinación de factores (denominados en el presente documento factores de reprogramación). Las iPSC se pueden generar utilizando células somáticas fetales, posnatales, recién nacidas, juveniles o adultas.

En determinadas realizaciones, los factores que se pueden usar para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de OCT 4 (a veces denominada OCT 3/4), SOX2, c-Myc y KLF4. En otras realizaciones, los factores que se pueden usar para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de OCT 4, SOX2, Nanog y Lin28. En determinadas realizaciones, al menos dos factores de reprogramación se expresan en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, al menos tres factores de reprogramación se expresan en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, al menos cuatro factores de reprogramación se expresan en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, se identifican y usan factores de reprogramación adicionales solos o en combinación con uno o más factores de reprogramación conocidos para reprogramar una célula somática en una célula madre pluripotente. Las células madre pluripotentes inducidas se definen funcionalmente e incluyen células que se reprograman utilizando cualquiera de una variedad de métodos (vectores integrativos, vectores no integrativos, medios químicos, etc.). Las células madre pluripotentes pueden modificarse genéticamente o modificarse de otro modo para aumentar la longevidad, la potencia, la localización, para prevenir o reducir las respuestas aloinmunes o para administrar un factor deseado en células que se diferencian de dichas células pluripotentes (por ejemplo, fotorreceptores, células progenitoras de los fotorreceptores, bastones, conos, etc. y otros tipos de células descritos en el presente documento, por ejemplo, en los ejemplos).

Las "células madre pluripotentes inducidas" (células iPS o iPSC) pueden producirse mediante la transducción proteica de factores de reprogramación en una célula somática. En determinadas realizaciones, al menos dos proteínas de reprogramación se transducen en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, se transducen al menos tres proteínas de reprogramación en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, se transducen al menos cuatro proteínas de reprogramación en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática.

Las células madre pluripotentes pueden ser de cualquier especie. Se han obtenido con éxito células madre embrionarias, por ejemplo, en ratones, múltiples especies de primates no humanos y seres humanos, y se han generado células madre embrionarias a partir de numerosas especies adicionales. Por lo tanto, un experto en la técnica puede generar células madre embrionarias y células madre derivadas de embriones de cualquier especie, incluidos, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores (ratones, ratas), ungulados (vacas, ovejas, etc.), perros (domésticos y salvajes), gatos (domésticos y salvajes como leones, tigres, guepardos), conejos, hámsteres, jerbos, ardillas, cobayas, cabras, elefantes, pandas (incluido el panda gigante), cerdos, mapaches, caballos, cebras, mamíferos marinos (delfines, ballenas, etc.) y similares. En determinadas realizaciones, la especie es una especie en peligro de extinción. En determinadas realizaciones, la especie es una especie actualmente extinta.

De manera similar, las células iPS pueden ser de cualquier especie. Estas células iPS se han generado con éxito utilizando células humanas y de ratón. Además, se han generado con éxito células iPS utilizando tejido embrionario, fetal, de recién nacido y de adulto. En consecuencia, se pueden generar fácilmente células iPS utilizando una célula donante de cualquier especie. Por lo tanto, se pueden generar células iPS de cualquier especie, incluidos, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores (ratones, ratas), ungulados (vacas, ovejas, etc.), perros (perros domésticos y salvajes), gatos (gatos domésticos y salvajes tales como leones, tigres, guepardos), conejos, hámsteres, cabras, elefantes, pandas (incluido el panda gigante), cerdos, mapaches, caballos, cebras, mamíferos marinos (delfines, ballenas, etc.) y similares. En determinadas realizaciones, la especie es una especie en peligro de extinción. En determinadas realizaciones, la especie es una especie actualmente extinta.

Las células madre pluripotentes inducidas pueden generarse utilizando, como punto de partida, prácticamente cualquier célula somática de cualquier etapa de desarrollo. Por ejemplo, la célula puede ser de un donante de embrión, feto, recién nacido, juvenil o adulto. Los ejemplos de células somáticas que pueden usarse incluyen fibroblastos, tales como fibroblastos dérmicos obtenidos mediante una muestra de piel o biopsia, sinoviocitos de tejido sinovial, células de prepucio, células de mejilla o fibroblastos de pulmón. Aunque la piel y las mejillas proporcionan una fuente de células apropiadas fácilmente disponible y alcanzable, se puede utilizar prácticamente cualquier célula. En determinadas realizaciones, la célula somática no es un fibroblasto.

La célula madre pluripotente inducida puede producirse expresando o induciendo la expresión de uno o más factores de reprogramación en una célula somática. La célula somática puede ser un fibroblasto, tal como un fibroblasto dérmico, un fibroblasto sinovial o un fibroblasto de pulmón, o una célula somática no fibroblástica. La célula somática puede reprogramarse provocando la expresión (tal como a través de transducción viral, vectores integrantes o no integrantes, etc.) y/o contacto con (por ejemplo, usando dominios de transducción de proteínas, electroporación, microinyección, anfífilos catiónicos, fusión con bicapas que contienen lípidos, permeabilización de detergentes, etc.) al menos 1, 2, 3, 4, 5 factores de reprogramación. Los factores de reprogramación se pueden seleccionar entre OCT 3/4, SOX2, NANOG, LIN28, C-MYC y KLF4. La expresión de los factores de reprogramación puede inducirse poniendo en contacto las células somáticas con al menos un agente, tal como agentes de molécula orgánica pequeña, que inducen la expresión de los factores de reprogramación.

Otros ejemplos de células madre pluripotentes incluyen células madre pluripotentes inducidas generadas reprogramando una célula somática expresando o induciendo la expresión de una combinación de factores ("factores de reprogramación"). Las células iPS se pueden obtener de un banco de células. La fabricación de células iPS puede ser una etapa inicial en la producción de células diferenciadas. Las células iPS pueden generarse específicamente utilizando material de un paciente particular o de un donante compatible con el objetivo de generar PHRPS o células fotorreceptoras compatibles con el tejido. Las iPSC pueden producirse a partir de células que no son sustancialmente inmunogénicas en un receptor previsto, por ejemplo, producidas a partir de células autólogas o de células histocompatibles con un receptor previsto.

La célula somática también se puede reprogramar usando un enfoque combinatorio en el que se expresa el factor de reprogramación (por ejemplo, usando un vector viral, plásmido y similares) y se induce la expresión del factor de reprogramación (por ejemplo, usando una pequeña molécula orgánica). Por ejemplo, los factores de reprogramación pueden expresarse en la célula somática mediante infección usando un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral. Además, los factores de reprogramación pueden expresarse en la célula somática usando un vector no integrativo, tal como un plásmido episomal. Véase, por ejemplo, Yu et al., Science. 8 de mayo de 2009; 324(5928): 797-801. Cuando los factores de reprogramación se expresan usando vectores no integrativos, los factores pueden expresarse en las células usando electroporación, transfección o transformación de las células somáticas con los vectores. Por ejemplo, en células de ratón, la expresión de cuatro factores (OCT3/4, SOX2, C-MYC y KLF4) utilizando vectores virales integrativos es suficiente para reprogramar una célula somática. En células humanas, la expresión de cuatro factores (OCT3/4, SOX2, NANOg y LIN28) utilizando vectores virales integrativos es suficiente para reprogramar una célula somática.

Una vez que los factores de reprogramación se expresan en las células, las células pueden cultivarse. Con el tiempo, aparecen células con características de ES en la placa de cultivo. Las células pueden elegirse y subcultivarse basándose, por ejemplo, en la morfología de ES, o basándose en la expresión de un marcador seleccionable o detectable. Las células pueden cultivarse para producir un cultivo de células que se asemejan a las células ES - éstas son supuestas células iPS.

Para confirmar la pluripotencia de las células iPS, las células pueden probarse en uno o más ensayos de pluripotencia. Por ejemplo, las células pueden analizarse para determinar la expresión de marcadores de células ES; se puede evaluar la capacidad de las células para producir teratomas cuando se trasplantan a ratones SCID; se puede evaluar la capacidad de las células para diferenciarse para producir tipos de células de las tres capas germinales. Una vez que se obtiene una iPSC pluripotente, se puede usar para producir tipos de células divulgadas en el presente documento, por ejemplo, células progenitoras de los fotorreceptores, células fotorreceptoras, bastones, conos, etc. y otros tipos de células descritos en el presente documento, por ejemplo, en los ejemplos.

Las células de adquisición de pluripotencia activadas por estímulos (STAP) son células madre pluripotentes producidas mediante la reprogramación de células somáticas con estímulos subletales, como la exposición a un pH bajo. La reprogramación no requiere transferencia nuclear ni manipulación genética de las células somáticas. Se puede hacer referencia a Obokata et al., Nature, 505: 676-680, 2014.

"Célula madre" se utiliza en el presente documento para referirse a una célula pluripotente que puede proliferar y/o diferenciarse en una célula madura y que es opcionalmente de origen humano.

"Célula madre adulta" se refiere a una célula multipotente aislada de tejido adulto y puede incluir células madre de médula ósea, células madre de sangre del cordón umbilical y células madre adiposas y es de origen humano.

"Retina" se refiere a las células neuronales del ojo, que están divididas en tres capas nucleares compuestas por fotorreceptores, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células gliales de Müller y células ganglionares.

"Célula precursora" se refiere a una célula capaz de diferenciarse hasta un linaje celular de destino final. En realizaciones de la invención, una "célula progenitora del campo ocular" se diferencia de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas y expresa los marcadores PAX6 y RX1. En realizaciones de la invención, una "célula progenitora neuronal de la retina" se refiere a una célula diferenciada de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas, que expresa los marcadores celulares PAX6 y CHX10. En realizaciones de la invención, "progenitor de fotorreceptor" se refiere a células diferenciadas de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas y que expresan el marcador PAX6 mientras no expresan el marcador CHX10 (es decir, CHX10(-)). Estas células expresan transitoriamente CHX10 en la etapa de progenitor neuronal de la retina, pero la expresión de CHX10 se desactiva cuando las células se diferencian en la etapa de progenitor de fotorreceptor. Además, "fotorreceptor" puede referirse a células posmitóticas diferenciadas de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas y que expresan el marcador celular Rodopsina o cualquiera de las tres opsinas de cono, y opcionalmente expresan la fosfodiesterasa de GMPc de bastón o cono. Los fotorreceptores también pueden expresar el marcador recoverina, que se encuentra en los fotorreceptores. Los fotorreceptores pueden ser fotorreceptores de bastones y/o conos.

"Signos" de enfermedad, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier anomalía indicativa de enfermedad, detectable mediante el examen del paciente; una indicación objetiva de enfermedad, en contraste con un síntoma, que es una indicación subjetiva de enfermedad.

"Síntomas" de enfermedad, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier fenómeno mórbido o desviación de lo normal en estructura, función o sensación, experimentado por el paciente e indicativo de enfermedad.

"Terapia", "terapéutico", "que trata", "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere ampliamente al tratamiento de una enfermedad, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos y/o aliviar la enfermedad, provocando la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. La terapia abarca profilaxis, prevención, tratamiento, cura, remedio, reducción, alivio y/o alivio de una enfermedad, signos y/o síntomas de una enfermedad. La terapia abarca un alivio de los signos y/o síntomas en pacientes con signos y/o síntomas de enfermedad en curso. La terapia también abarca "profilaxis" y "prevención". La profilaxis incluye prevenir la enfermedad que ocurre después del tratamiento de una enfermedad en un paciente o reducir la incidencia o gravedad de la enfermedad en un paciente. El término "reducido", para fines terapéuticos, se refiere en términos generales a la reducción clínica significativa de los signos y/o síntomas. La terapia incluye el tratamiento de recaídas o signos y/o síntomas recurrentes. La terapia abarca, entre otras cosas, impedir la aparición de signos y/o síntomas en cualquier momento, así como reducir los signos y/o síntomas existentes y eliminar los signos y/o síntomas existentes. La terapia incluye el tratamiento de enfermedades crónicas ("mantenimiento") y enfermedades agudas. Por ejemplo, el tratamiento incluye tratar o prevenir las recaídas o la recurrencia de signos y/o síntomas.

Las afecciones que se van a tratar de acuerdo con la invención y, por lo tanto, que utilizan una o más de las preparaciones proporcionadas en el presente documento incluyen, entre otras, la degeneración macular, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, y dicha degeneración macular puede estar en una etapa temprana o tardía. Otras afecciones por tratar incluyen, entre otras, retinitis pigmentosa, displasia de retina, degeneración de retina, retinopatía diabética, distrofia retiniana congénita, amaurosis congénita de Leber, desprendimiento de retina, glaucoma, neuropatía óptica y traumatismos que afecten al ojo.

Marcadores celulares: Los ejemplos de marcadores celulares cuya expresión puede evaluarse incluyen los siguientes: PAX6, RX1, SIX3, SIX6, LHX2, TBX3, SOX2, CHX10, Nestina, TRbeta2, NR2E3, NRL, MASH1, RORbeta, Recoverina, Opsina, Rodopsina, fosfodiesterasa cGMP de bastones y conos, que pueden evaluarse en la proteína y/o ARNm (véase Fischer AJ, Reh TA, Dev Neurosci. 2001; 23(4-5): 268-76; Baumer et al., Development. Julio de 2003; 130(13): 2903-15, Swaroop et al., Nat Rev Neurosci. Agosto de 2010; 11 (8): 563-76, Agathocleous y Harris, Annu. Rev. Cell Dev. Biol 2009. 25: 45-69). Dichos identificadores de marcadores se usan generalmente como en la literatura y en la técnica, particularmente en los campos de la técnica en relación con los contextos en los que se citan esos identificadores de genes en el presente documento, que pueden incluir literatura relacionada con fotorreceptores, bastones, conos, diferenciación de fotorreceptores, progenitores de fotorreceptores, diferenciación neuronal, células madre neuronales, células madre pluripotentes y otros campos de acuerdo con lo indicado por el contexto. Además, los marcadores son generalmente humanos, por ejemplo, excepto cuando el contexto indique lo contrario. Los marcadores celulares se pueden identificar usando métodos inmunocitoquímicos convencionales o métodos de PCR convencionales, técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Medios de cultivo celular: En realizaciones de la invención, las células se almacenan, proliferan o diferencian en diversos medios de cultivo celular. El medio de inducción retiniana se utiliza para la producción de células madre en células progenitoras del campo ocular. El medio de inducción retiniana puede comprender D-glucosa, penicilina, estreptomicina, suplemento de N2 (por ejemplo, 0.1-5 %), suplemento de B27 (por ejemplo, 0.005 a 0.2 %), solución de aminoácidos no esenciales de MEM y, opcionalmente, incluir insulina y/o Nogina, y puede estar en un medio DMEM/F12 (Invitrogen) o similar. Por ejemplo, el medio de inducción de retina puede incluir al menos insulina. Además, la concentración de insulina puede variarse o aumentarse, lo que puede promover la supervivencia celular y/o el rendimiento de células diferenciadas. Por ejemplo, la concentración de insulina puede variarse a lo largo de un intervalo y monitorizarse la supervivencia y/o diferenciación para identificar una concentración de insulina que mejore uno o ambos de estos atributos. Se cree que la adición de Nogina no es necesaria, pero se observó que aumenta la expresión de los factores de transcripción del campo ocular.

Los componentes de DMEM/F12, medio Neurobasal, suplemento de suero N2 y suplemento de suero B27 se proporcionan en la FIG. 21. Debe entenderse que la invención contempla el uso de estos medios y suplementos particulares o medios o suplementos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en estos componentes.

Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizar factores humanos tales como Nogina humana, insulina humana y similares.

La Nogina es un inhibidor de BMP secretado que, según se informa, se une a BMP2, BMP4 y BMP7 con alta afinidad para bloquear la actividad de la familia TGFp. SB431542 es una molécula pequeña que, según se informa, inhibe TGFp/Activina/Nodal al bloquear la fosforilación de los receptores ACTRIB, TGFpR1 y ACTRIC. Se cree que SB431542 desestabiliza la red de pluripotencia mediada por Activina y Nanog, así como suprime el destino de las células endodérmicas, del trofoblasto y del mesodermo inducido por BMP al bloquear las señales endógenas de Activina y BMP. Se espera que los agentes que tengan una o más de las actividades antes mencionadas puedan reemplazar o aumentar las funciones de uno o ambos de Nogina y SB431542, por ejemplo, tal como se usan en el contexto de los métodos divulgados. Por ejemplo, los solicitantes prevén que la proteína Nogina y/o la molécula pequeña SB4312542 podrían ser reemplazadas o aumentadas por uno o más inhibidores que afecten a todas o cada una de las siguientes tres áreas objetivo: 1) prevenir la unión del ligando al receptor; 2) bloquear la activación del receptor (p. ej., dorsomorfina) y 3) inhibir las proteínas intracelulares/factores de transcripción SMAD. Los ejemplos de factores potencialmente adecuados incluyen los inhibidores de BMP secretados naturales Chordin (que bloquea BMP4) y Folistatina (que bloquea Activina), así como análogos o miméticos de los mismos. Ejemplos de factores adicionales que pueden imitar el efecto de Nogina incluyen el uso de receptores negativos dominantes o anticuerpos bloqueantes que secuestrarían BMP2, BMP4 y/o BMP7. Además, con respecto al bloqueo de la fosforilación del receptor, se ha informado que la dorsomorfina (o el Compuesto C) tiene efectos similares en las células madre. La inhibición de las proteínas SMAD también se puede efectuar usando inhibidores solubles como SIS3 (6,7-Dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, inhibidor específico de Smad3, SIS3), sobreexpresión de uno o más de los SMAD inhibidores (p. ej., SMAD6, SMAD7, SMAD10) o ARNi para uno de los receptores SMAD (SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, SMAD8/9). Otra combinación de factores que se espera que sea adecuada para generar progenitores neuronales comprende un cóctel de factor inhibidor de la leucemia (LIF), inhibidor de GSK3 (CHIR 99021), compuesto E (inhibidor de y secretasa XXI) y el inhibidor de TGFp SB431542 que previamente se ha demostrado que es eficaz para generar células madre de la cresta neuronal (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA. 17 de mayo de 2011; 108(20): 8299-304). Ejemplos de factores adicionales pueden incluir derivados de SB431542, por ejemplo, moléculas que incluyen uno o más sustituyentes agregados o diferentes, grupos funcionales análogos, etc. y que tienen un efecto inhibidor similar sobre una o más proteínas SMAD. Se pueden identificar factores o combinaciones de factores adecuados, por ejemplo, poniendo en contacto células pluripotentes con dicho(s) factor(es) y monitorizando la adopción de fenotipos de células progenitoras del campo ocular, tales como la expresión génica característica (incluyendo la expresión de los marcadores descritos en el presente documento, la expresión de un gen indicador acoplado a un promotor de células progenitoras del campo ocular, o similares) o la capacidad de formar un tipo de célula divulgada en el presente documento tal como células progenitoras neuronales de la retina, progenitores de fotorreceptores, progenitores de bastones, conos y/o bastones.

Preferiblemente, las células se tratan o se cultivan en un medio de inducción retiniana antes del cultivo con un medio de diferenciación neuronal. Se utiliza un medio de diferenciación neuronal para la producción de células progenitoras del campo ocular en células progenitoras neuronales de la retina. El medio de diferenciación neuronal puede comprender D-glucosa, penicilina, estreptomicina, GlutaMAX™, Suplemento de N2, Suplemento de B27, solución de aminoácidos no esenciales de MEM y opcionalmente incluyendo Nogina. El medio de diferenciación neuronal también se puede utilizar para la producción de células progenitoras neuronales de la retina en células progenitoras de los fotorreceptores, pero sin la inclusión de Nogina. El uso de un medio de diferenciación neuronal, opcionalmente suplementado con ácido retinoico y taurina, seguido de la utilización de un medio de diferenciación de fotorreceptores (Invitrogen) que opcionalmente puede comprender D-glucosa, penicilina, estreptomicina, GlutaMAX™, suplemento de N2, suplemento de B27 (p. ej., número de fórmula 080085-SA) con la adición de forskolina, BDNF, CNTF, LIF y DATP se utilizan para la producción de células progenitoras de los fotorreceptores en células fotorreceptoras. Por ejemplo, el medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender hormona tiroidea, por ejemplo, en una cantidad que está presente en el medio anterior, o en una cantidad diferente o mayor. Por ejemplo, dicho medio puede comprender hormona tiroidea añadida exógenamente. En ejemplos de realizaciones, el medio de diferenciación de fotorreceptores puede comprender uno, dos o los tres BDNF, C<n>TF y DATP, por ejemplo, BDNF, CNTF, DATP, BDNF y CNTF, CNTF y DATP, BDNF y DATP, o los tres de BDNF, CNTF y DATP, cuyo medio puede comprender opcionalmente medio neurobasal y/o puede comprender opcionalmente hormona tiroidea.

Los constituyentes del medio de diferenciación neuronal son los siguientes: N2: 1 % (1 mL de N2 por 100 mL), B27: 2 % (2 mL de B27 por 100 mL) y Nogina: 50 ng/mL.

Nogina no es necesaria después de que todas las células se hayan convertido en progenitoras del campo ocular.

Células madre embrionarias (ESC) o células madre adultas o células madre pluripotentes inducidas (IPS): las ESC, o células madre adultas o células iPS utilizadas en este documento pueden propagarse en un sistema sin alimentador, como en Matrigel™ (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) u otra matriz. Además, o alternativamente, dichas células pluripotentes se pueden cultivar en una matriz que se puede seleccionar del grupo que consiste en laminina, fibronectina, vitronectina, proteoglicano, entactina, colágeno, colágeno I, colágeno IV, colágeno VIII, sulfato de heparán, Matrigel™ (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), CellStart, un extracto de membrana basal humana y cualquier combinación de los mismos. Dicha matriz puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en Matrigel™ (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)). Las células madre no forman cuerpos embrioides en cultivo, lo que supone una mejora con respecto a la técnica anterior. Las células se diferencian en células progenitoras del campo ocular en ausencia de factores exógenos. En una realización, las ESC se diferencian en células progenitoras del campo ocular en presencia de Nogina.

Células progenitoras del campo ocular (EFPC): Las EFPC se diferencian de las ESC, las células madre adultas o las células pluripotentes inducidas (iPC) en células que son PAX6(+) y RX1(+). Las EFPC también pueden ser SIX3(+), SIX6(+), LHX2(+), TBX3(+) Nestina(+) y/o SOX2(+) y OCT4(-) y NANOG(-). La diferenciación en EFPC se produce en un medio de inducción retiniana que puede comprender DMEM/F12, D-glucosa, penicilina, estreptomicina, suplemento de N2, suplemento de B27, aminoácidos no esenciales de MEM e insulina. El día 5, cuando las células alcanzan la confluencia, se cambian a un medio de diferenciación neuronal. Preferiblemente, la etapa de producir EFPC se realiza antes de cultivar células pluripotentes en el medio de diferenciación neuronal descrito a continuación, ya que se ha observado que dichas condiciones de cultivo pueden afectar negativamente a la viabilidad de las células pluripotentes.

Células progenitoras neuronales de la retina (RNPC): las RNPC se diferencian de las EFPC en ausencia de factores exógenos. Las RNPC son PAX6(+) y CHX10(+). Las células en este estado pueden ser Tuj1+ o Tuj1-. Opcionalmente, el método puede incluir enriquecer o purificar células Tuj1+ o Tuj1- en esta etapa, y/o purificar o eliminar células fuertemente Tuj1+ y/o purificar o eliminar células fuertemente Tuj1- (por ejemplo, células que carecen incluso de un nivel bajo de expresión detectable de los mismos) y continuar con las etapas posteriores del método con una u otra de estas poblaciones. En una realización, se añade Nogina para acelerar la diferenciación de EFPC a RNPC. La diferenciación en RNPC se produce en un medio de diferenciación neuronal que puede comprender medio neurobasal (Invitrogen), D-glucosa, penicilina, estreptomicina, GlutaMAX™, suplemento de N2, suplemento de B27 y solución de aminoácidos no esenciales de MEM. Se puede añadir Nogina a una concentración final de 5-100 pg/mL.

Células progenitoras de fotorreceptores (PhRPC): las PhRPC pueden diferenciarse de las RNPC en ausencia de Nogina y en un medio de diferenciación neuronal). Las PRPC son PAX6(+) y CHX10(-). Al menos el 90 % o el 95 % de las PRPC son inmunocitoquímicamente PAX6(+) y CHX10(-). Las PRPC también pueden ser Nr2e3(+), Trp2(+), Mash1(+), RORp(+)y/o NRO(+). La presencia de CHX10 sugeriría un linaje celular bipolar, pero en el presente método, las PRPC se han diferenciado a un linaje de fotorreceptores y, por lo tanto, no poseen CHX10 en esta etapa. Las células pueden cultivarse como esferas o neuroesferas (por ejemplo, en placas de unión bajas u opcionalmente en cultivos en forma de gotas colgantes, en un entorno de baja gravedad u otras condiciones de cultivo adecuadas).

Fotorreceptores (PR): Los PR pueden diferenciarse de los PhRPC en un proceso de diferenciación de dos etapas: 1) agregar medio de diferenciación neuronal con ácido retinoico y taurina durante 2 semanas y 2) agregar el medio de diferenciación de fotorreceptores. - ver el Ejemplo 2.

Los PR pueden ser Rodopsina (+), recoverina (+), PE6a (+) u opsina (+). La opsina puede ser cualquiera de las opsinas de cono. Los PR pueden ser bipotenciales para conos o bastones. Los ejemplos de fotorreceptores producidos mediante este método pueden ser PAX6-, que pueden contrastar con algunas supuestas células fotorreceptoras descritas anteriormente. Como se describe a continuación en ejemplos de realizaciones, hay un proceso de diferenciación de 2 etapas 1) agregar medio ND y ácido retinoico y taurina durante 2 semanas y 2) uso del medio de diferenciación de fotorreceptores, cuyos métodos se ejemplifican con mayor detalle en los ejemplos de trabajo a continuación.

En ejemplos de realizaciones, el método puede producir 40-60 millones de EFPC, 60-90 millones de RNPC o 0.5-1 mil millones de PhRPC por 1 millón de células pluripotentes iniciales.

En un ejemplo de realización, las células se pueden trasplantar a una rata que lo necesite, por ejemplo, una rata RCS u otro modelo animal de enfermedad (por ejemplo, para ceguera nocturna o daltonismo), y se puede detectar el efecto resultante sobre la función visual mediante la prueba de respuesta optomotora, ERG, registro del umbral de luminancia y/o el ensayo de flujo sanguíneo del centro visual.

Aplicaciones y usos

Ensayos de detección

La presente divulgación proporciona métodos para seleccionar diversos agentes que modulan la diferenciación de una célula progenitora de la retina. También podría usarse para descubrir agentes terapéuticos que apoyen y/o rescaten fotorreceptores maduros que se generan en cultivo a partir de células progenitoras de la retina. Para los fines de esta invención, se pretende que un "agente" incluya, entre otros, un compuesto biológico o químico tal como una molécula orgánica o inorgánica simple o compleja, un péptido, una proteína (por ejemplo, anticuerpo), un polinucleótido (por ejemplo, antisentido) o una ribozima. Se puede sintetizar una amplia gama de compuestos, por ejemplo, polímeros, tales como polipéptidos y polinucleótidos, y compuestos orgánicos sintéticos basados en diversas estructuras centrales, y estos también se incluyen en el término "agente". Además, diversas fuentes naturales pueden proporcionar compuestos para la detección, tales como extractos de plantas o animales y similares. Debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que el agente se usa solo o en combinación con otro agente, que tiene la misma o diferente actividad biológica que los agentes identificados mediante la detección de la invención.

Para practicar el método de detecciónin vitro,se puede obtener una población aislada de células como se describe en el presente documento. Cuando el agente es una composición distinta de ADN o ARN, tal como una molécula pequeña como se describió anteriormente, el agente puede agregarse directamente a las células o agregarse al medio de cultivo para su adición. Como resulta evidente para los expertos en la técnica, se debe añadir una cantidad "efectiva" que pueda determinarse empíricamente. Cuando el agente es un polinucleótido, se puede añadir directamente mediante el uso de una pistola genética o electroporación. Alternativamente, se puede insertar en la célula usando un vehículo de administración de genes u otro método como se describió anteriormente. Se pueden analizar controles positivos y negativos para confirmar la supuesta actividad del fármaco u otro agente.

Estructuras neurosensoriales de la retina

Las células progenitoras de los fotorreceptores, y opcionalmente las células fotorreceptoras diferenciadas de las mismas, pueden usarse para generar estructuras neurosensoriales de la retina. Por ejemplo, la invención contempla la generación de estructuras celulares multicapa compuestas de células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) y células fotorreceptoras (o células progenitoras de los fotorreceptores). Estas estructuras se pueden utilizar para la detección de fármacos, como modelos de enfermedades o como preparación farmacéutica. En el último caso, la preparación farmacéutica puede ser un injerto de fotorreceptores de r Pe , que puede disponerse sobre un soporte o matriz sólida biocompatible (preferiblemente una matriz o soporte bioreabsorbible) que puede implantarse como un "parche".

Para ilustrar mejor, el soporte biocompatible para las células puede ser un soporte de película de poliéster biodegradable para células progenitoras de la retina. El poliéster biodegradable puede ser cualquier poliéster biodegradable adecuado para su uso como sustrato o estructura para soportar la proliferación y diferenciación de células progenitoras de la retina. El poliéster debería ser capaz de formar una película delgada, preferiblemente una película microtexturizada, y debería ser biodegradable si se utiliza para trasplante de tejidos o células. Los poliésteres biodegradables adecuados para su uso en la invención incluyen ácido poliláctico (PLA), polilactidas, polihidroxialcanoatos, tanto homopolímeros como copolímeros, tales como polihidroxibutirato (PHB), cohidroxivalerato de polihidroxibutirato (PHBV), cohidroxihexanoato de polihidroxibutirato (PHBHx), cohidroxioctonoato de polihidroxibutirato, (PHBO) y cohidroxioctadecanoato de polihidroxibutirato (PHBOd), policaprolactona (PCL), poliesteramida (PEA), copoliésteres alifáticos, tales como succinato de polibutileno (PBS) y succinato/adipato de polibutileno (PBSA), copoliésteres aromáticos. Se pueden utilizar poliésteres tanto de alto como de bajo peso molecular, poliésteres sustituidos y no sustituidos, en bloque, ramificados o aleatorios, y mezclas y combinaciones de poliésteres. Preferiblemente el poliéster biodegradable es policaprolactona (PCL).

En determinadas realizaciones, el soporte biocompatible es un polímero de poli(p-xilileno), tal como parileno N, parileno D, parileno-C, parileno AF-4, parileno SF, parileno HT, parileno VT-4 y parileno CF, y la mayoría de preferiblemente parileno-C.

Normalmente, el soporte polimérico puede formarse en una película delgada usando técnicas conocidas. El espesor de la película es ventajosamente de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 50 micrómetros, y preferiblemente aproximadamente 5 micrómetros de espesor. La superficie de la película puede ser lisa o la superficie de la película puede estar parcial o completamente microtexturizada. Las texturas adecuadas de la superficie incluyen, por ejemplo, microranuras o micropostes. La película se puede cortar y moldear para darle una forma adecuada para la implantación.

Las RPE y/o las células fotorreceptoras o las células progenitoras de los fotorreceptores se pueden sembrar directamente - juntas o secuencialmente (por ejemplo, células fotorreceptoras o células progenitoras de los fotorreceptores después de que se forme una capa de RPE) - sobre la película para formar una estructura biocompatible. Alternativamente, la película polimérica se puede recubrir con un material de recubrimiento adecuado tal como poli-D-lisina, poli-L-lisina, fibronectina, laminina, colágeno I, colágeno IV, vitronectina y Matrigel™. Las células se pueden sembrar en placas con cualquier densidad deseada, pero se prefiere una única capa de células RPE (una monocapa de RPE).

Usos terapéuticos

Esta invención también proporciona preparaciones de células progenitoras de los fotorreceptores o preparaciones de células fotorreceptoras, como se define en las reivindicaciones, para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno causado por la pérdida de fotorreceptores en un paciente. En el presente documento se describen métodos para reemplazar o reparar células fotorreceptoras en un paciente que necesita este tratamiento, que comprenden administrar una preparación farmacéutica que incluye las células progenitoras de los fotorreceptores de la presente invención, o fotorreceptores derivados de las mismas o una combinación de las mismas, a un paciente. Como se describe en el presente documento, la preparación farmacéutica puede ser una suspensión de células o células que se forman en tejido trasplantablein vitro.En muchos casos, las células se administrarán en el espacio subretiniano de una retina enferma o degenerada. Sin embargo, como las células progenitoras de los fotorreceptores de la presente invención también tienen un efecto neuroprotector, las células pueden administrarse localmente pero fuera de la retina (tal como en el vítreo) o mediante administración de depósito o sistémica a otras partes del cuerpo.

Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar en una amplia gama de enfermedades y trastornos que resultan en el deterioro del sistema visual, incluyendo enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina. Tales enfermedades y trastornos pueden ser causados por el envejecimiento, de modo que parece haber una ausencia de una lesión o enfermedad que sea identificable como una fuente sustancial del deterioro. Los expertos en la técnica comprenderán los métodos establecidos para diagnosticar tales estados patológicos y/o inspeccionar signos conocidos de tales lesiones. Además, la literatura está repleta de información sobre la disminución o el deterioro relacionado con la edad en aspectos del sistema visual de los animales. El término "enfermedad relacionada con la degeneración de la retina" pretende referirse a cualquier enfermedad resultante de una degeneración o anomalías de la retina innata o posnatal. Ejemplos de enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina incluyen displasia de retina, degeneración de la retina, degeneración macular envejecida, retinopatía diabética, retinitis pigmentosa, distrofia retiniana congénita, amaurosis congénita de Leber, desprendimiento de retina, glaucoma, neuropatía óptica y traumatismo.

Adicional o alternativamente, el deterioro de los componentes del sistema visual, tales como la retina neurosensorial, puede ser causado por una lesión, por ejemplo, un traumatismo en el propio sistema visual (por ejemplo, un ojo), en la cabeza o el cerebro, o en el cuerpo en general. Se sabe que algunas de estas lesiones están relacionadas con la edad, es decir, su probabilidad o frecuencia aumenta con la edad. Ejemplos de tales lesiones incluyen desgarros de retina, agujeros maculares, membrana epirretiniana y desprendimientos de retina, cada uno de los cuales puede ocurrir en un animal de cualquier edad, pero que es más probable que ocurra, u ocurre con mayor frecuencia, en animales envejecidos, incluidos los que por lo demás están sanos.

El deterioro del sistema visual o de componentes del mismo también puede ser causado por una enfermedad. Entre las enfermedades se incluyen varias enfermedades relacionadas con la edad que afectan el sistema visual. Estas enfermedades ocurren con mayor probabilidad y/o frecuencia en animales más viejos que en los jóvenes. Ejemplos de enfermedades que pueden afectar el sistema visual, incluyendo por ejemplo las capas neurosensoriales de la retina, y causar su deterioro son diversas formas de retinitis, neuritis óptica, degeneración macular, retinopatía diabética proliferativa o no proliferativa, edema macular diabético, atrofia progresiva de la retina, degeneración progresiva de la retina, degeneración retiniana adquirida súbita, retinopatía mediada por el sistema inmunológico, displasia retiniana, coriorretinitis, isquemia retiniana, hemorragia retiniana (prerretiniana, intrarretiniana y/o subretiniana), retinopatía hipertensiva, inflamación retiniana, edema retiniano, retinoblastoma o retinitis pigmentosa.

Algunas de las enfermedades anteriores tienden a ser específicas de ciertos animales tales como animales de compañía, por ejemplo, perros y/o gatos. Algunas de las enfermedades se enumeran de forma genérica, es decir, puede haber muchos tipos de retinitis o hemorragia retiniana; por lo tanto, algunas enfermedades no son causadas por un agente etiológico específico, sino que son más descriptivas del tipo de enfermedad o del resultado. Muchas de las enfermedades que pueden causar disminución o deterioro de uno o más componentes del sistema visual pueden tener efectos tanto primarios como secundarios o más remotos en el sistema visual de un animal.

Ventajosamente, las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar para compensar la falta o disminución de la función de las células fotorreceptoras. Los ejemplos de disfunción retiniana que pueden tratarse mediante poblaciones de células madre retinianas y métodos de la invención incluyen, entre otros: degeneración de fotorreceptores (como ocurre, por ejemplo, en retinitis pigmentosa, distrofias de conos, distrofias de conos y/o bastones y conos y degeneración macular); desprendimiento de retina y traumatismo de retina; lesiones fóticas causadas por láser o luz solar; un agujero macular; un edema macular; ceguera nocturna y daltonismo; retinopatía isquémica causada por diabetes u oclusión vascular; retinopatía por prematuridad/nacimiento prematuro; afecciones infecciosas, tales como, por ejemplo, retinitis por CMV y toxoplasmosis; condiciones inflamatorias, tales como las uveítis; tumores, tales como retinoblastoma y melanoma ocular; y para el reemplazo de las neuronas internas de la retina, que se ven afectadas en neuropatías oculares, incluido el glaucoma, la neuropatía óptica traumática y la neuropatía y retinopatía óptica por radiación.

En un aspecto, las células pueden tratar o aliviar los síntomas de la retinitis pigmentosa en un paciente que necesita el tratamiento. En otro aspecto, las células pueden tratar o aliviar los síntomas de la degeneración macular, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (húmeda o seca), la enfermedad de Stargardt, la degeneración macular miópica o similares, en un paciente que necesita este tratamiento. Para todos estos tratamientos, las células pueden ser autólogas o alogénicas del paciente. En un aspecto adicional, las células de la invención se pueden administrar en combinación con otros tratamientos.

La retinitis pigmentosa (RP) se refiere a un grupo heterogéneo de trastornos oculares hereditarios caracterizados por una pérdida progresiva de la visión debido a una degeneración gradual de los fotorreceptores. Se estima que 100,000 personas en los Estados Unidos tienen RP. La clasificación de este grupo de trastornos bajo una rúbrica se basa en las características clínicas observadas con mayor frecuencia en estos pacientes. Las características distintivas de la RP son ceguera nocturna y reducción de la visión periférica, estrechamiento de los vasos retinianos y migración del pigmento desde el epitelio pigmentario alterado de la retina hacia la retina, formando grupos de varios tamaños, a menudo junto a los vasos sanguíneos retinianos.

Normalmente, los pacientes notan primero dificultad para ver por la noche debido a la pérdida de fotorreceptores de bastones; los fotorreceptores cónicos restantes se convierten en el pilar de la función visual. Sin embargo, con el paso de los años y décadas, los conos también se degeneran, provocando una pérdida progresiva de la visión. En la mayoría de los pacientes con RP, los defectos del campo visual comienzan en la periferia media, entre 30° y 50° desde la fijación. Las regiones defectuosas se agrandan gradualmente, dejando islas de visión en la periferia y un campo central restringido (llamado visión de túnel). Cuando el campo visual se contrae a 20° o menos y/o la visión central es 20/200 o peor, el paciente queda legalmente ciego.

Los patrones de herencia indican que la RP se puede transmitir en modos ligado al cromosoma X (XLRP), autosómico dominante (ADRP) o recesivo (ARRP). Entre los tres tipos genéticos de RP, el ADRP es el más leve. Estos pacientes suelen conservar una buena visión central hasta los 60 años y más. Por el contrario, los pacientes con la forma XLRP de la enfermedad suelen estar legalmente ciegos entre los 30 y los 40 años de edad. Sin embargo, la gravedad y la edad de aparición de los síntomas varían mucho entre pacientes con el mismo tipo genético de RP Esta variación es evidente incluso dentro de la misma familia cuando presumiblemente todos los miembros afectados tienen la misma mutación genética. Actualmente se han descrito muchas mutaciones que inducen RP De los genes identificados hasta ahora, muchos codifican proteínas específicas de fotorreceptores, varias de las cuales están asociadas con la fototransducción en los bastones, tales como la Rodopsina, las subunidades de la fosfodiesterasa de cGMP y el canal de Ca2+ activado por cGMP Se han encontrado múltiples mutaciones en cada uno de los genes clonados. Por ejemplo, en el caso del gen de la Rodopsina, se han identificado 90 mutaciones diferentes entre los pacientes con ADRP

Independientemente de la mutación específica, la pérdida de visión más crítica para los pacientes con RP se debe a la degeneración gradual de los conos. En muchos casos, la proteína a la que afecta la mutación que causa RP ni siquiera se expresa en los conos; el mejor ejemplo es la rodopsina, el pigmento visual específico de los bastones. Por lo tanto, la pérdida de conos puede ser una consecuencia indirecta de una mutación específica de los bastones. La capacidad de reemplazar los fotorreceptores dañados proporciona una aproximación al tratamiento de esta enfermedad.

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) provoca una pérdida progresiva de la visión central y es la causa más común de pérdida de visión en personas mayores de 55 años. La patología subyacente es la degeneración de los fotorreceptores. Varios estudios han implicado factores hereditarios, enfermedades cardiovasculares, factores ambientales como el tabaquismo y la exposición a la luz, y causas nutricionales como factores que contribuyen al riesgo de desarrollar AMD. La degeneración del RPE se acompaña de una pérdida variable tanto de los fotorreceptores suprayacentes como de la perfusión coroidea subyacente. La pérdida de agudeza visual o pérdida del campo visual ocurre cuando el RPE se atrofia y resulta en una pérdida secundaria de las células fotorreceptoras suprayacentes que suministra. La capacidad de reemplazar el RPE y las células fotorreceptoras proporciona un medio para tratar la a Md establecida.

La degeneración macular se divide ampliamente en dos tipos. En la forma neovascular exudativa, o AMD "húmeda", que representa el 10 % de todos los casos, se produce un crecimiento anormal de vasos sanguíneos debajo de la mácula. Se forma una red subretiniana de neovascularización coroidea a menudo asociada con hemorragia intrarretiniana, líquido subretiniano, desprendimiento del epitelio pigmentario e hiperpigmentación. Con el tiempo, este complejo se contrae y deja una cicatriz elevada distintiva en el polo posterior. Estos vasos sanguíneos filtran líquido y sangre hacia la retina y, por lo tanto, dañan los fotorreceptores. La AMD húmeda tiende a progresar rápidamente y puede causar daños graves; puede producirse una rápida pérdida de la visión central en tan solo unos pocos meses.

El 90 % restante de los casos de AMD son degeneración macular atrófica (forma seca), en la que hay alteración pigmentaria en la región macular, pero no hay cicatriz macular elevada ni hemorragia ni exudación en la región de la mácula. En estos pacientes hay una desaparición gradual del epitelio pigmentario de la retina (RPE), lo que resulta en áreas circunscritas de atrofia. Dado que la pérdida de fotorreceptores sigue a la desaparición del RPE, las áreas de la retina afectadas tienen poca o ninguna función visual. La pérdida de visión por AMD seca se produce de forma más gradual a lo largo de muchos años. Estos pacientes suelen conservar algo de visión central, aunque la pérdida puede ser lo suficientemente grave como para comprometer la realización de tareas que requieren ver detalles.

Cuando la edad adecuada y los hallazgos clínicos van acompañados de pérdida de agudeza visual, campo visual u otras funciones visuales, la afección a menudo se clasifica como AMD. En ocasiones, la etapa previa al inicio de la pérdida visual se ha catalogado como AMD si el paciente presenta drusas características y antecedentes familiares relevantes.

En ocasiones, la degeneración macular se produce a una edad mucho más temprana. Muchos de estos casos son causados por mutaciones genéticas. Existen muchas formas de degeneración macular hereditaria, cada una con sus propias manifestaciones clínicas y causa genética. La forma más común de degeneración macular juvenil se conoce como enfermedad de Stargardt que se hereda como una forma autosómica recesiva. Los pacientes suelen ser diagnosticados antes de los 20 años. Aunque la progresión de la pérdida de visión es variable, la mayoría de estos pacientes son legalmente ciegos a los 50 años. Se han identificado mutaciones que causan la enfermedad de Stargardt en el gen ABCR, que codifica una proteína que transporta retinoides a través de la membrana del fotorreceptor.

Las células progenitoras de los fotorreceptores de la presente invención encuentran uso en el tratamiento de enfermedades degenerativas y pueden administrarse como células progenitoras; como su progenie diferenciada (bastones y conos), por ejemplo, después del compromiso con un linaje de fotorreceptores de interés. Las células se administran de una manera que les permita injertarse o migrar al sitio retiniano previsto, tal como en la capa nucleada externa, y reconstituir o regenerar el área funcionalmente deficiente.

También se pueden utilizar células progenitoras o fotorreceptores modificadas genéticamente para dirigir productos genéticos a sitios de degeneración. Estos productos génicos pueden incluir factores que promueven la supervivencia para rescatar neuronas nativas degeneradas, factores que pueden actuar de manera autocrina para promover la supervivencia y la diferenciación de células injertadas en neuronas específicas de un sitio o para administrar neurotransmisor(es) para permitir la recuperación funcional. La terapia génicaex vivo,por ejemplo, la modificación recombinante de las células progenitoras o los fotorreceptores en cultivo, podría usarse eficazmente como estrategia neuroprotectora para prevenir la pérdida de células de la retina en RP, AMD y glaucoma y en enfermedades que causan desprendimiento de retina, mediante la administración de factores de crecimiento y neurotrofinas como FGF2, NGF, factor neurotrófico ciliar (CNTF) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factores que han demostrado ralentizar significativamente el proceso de muerte celular en modelos de degeneración de la retina. La terapia que utiliza células fotorreceptoras progenitoras y/o fotorreceptoras modificadas para sintetizar un factor de crecimiento o una combinación de factores de crecimiento no sólo puede garantizar la administración sostenida de neuroprotectores, sino que también puede reconstruir la retina dañada.

En los métodos de la invención, las células que se van a trasplantar se transfieren a un receptor en cualquier excipiente fisiológicamente aceptable que comprenda un excipiente isotónico preparado en condiciones suficientemente estériles para la administración humana. Para conocer los principios generales de la formulación medicinal, se remite al lector a Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn y W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996. La elección del excipiente celular y de cualquier elemento acompañante de la composición se adaptará de acuerdo con la vía y el dispositivo utilizado para la administración. Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similar. Las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, pudiendo utilizarse una vez descongeladas. Si se congelan, las células generalmente se almacenarán en un medio con 10 % de DMSO, 50 % de FCS, 40 % de RPMI 1640.

Las preparaciones farmacéuticas de la invención se envasan opcionalmente en un recipiente adecuado con instrucciones escritas para el fin deseado. Tales formulaciones pueden comprender un cóctel de diferenciación retiniana y/o factores tróficos, en una forma adecuada para combinarse con células fotorreceptoras o progenitoras de fotorreceptores. Dicha composición puede comprender además tampones y/o excipientes adecuados para su transferencia a un animal. Tales composiciones pueden comprender además las células que se van a injertar.

Preparaciones Farmacéuticas

Las PRPC o células fotorreceptoras pueden formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las PRPC o células fotorreceptoras se pueden administrar solas o como componente de una formulación farmacéutica. Los compuestos en cuestión pueden formularse para administración de cualquier forma conveniente para su uso en medicina. Las preparaciones farmacéuticas adecuadas para la administración pueden comprender las PRPC o células fotorreceptoras, en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina equilibrada (BSS)), dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden ser reconstituidos en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de preparaciones farmacéuticas comprenden las PRPC o células fotorreceptoras en combinación con ALCON® BSS PLUS® (una solución salina equilibrada que contiene, en cada mL, cloruro de sodio 7.14 mg, cloruro de potasio 0.38 mg, cloruro de calcio dihidratado 0.154 mg, cloruro de magnesio hexahidratado 0.2 mg, fosfato de sodio dibásico 0.42 mg, bicarbonato de sodio 2.1 mg, dextrosa 0.92 mg, disulfuro de glutatión (glutatión oxidado) 0.184 mg, ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio (para ajustar el pH a aproximadamente 7.4) en agua).

Cuando se administran, las preparaciones farmacéuticas para uso en esta divulgación pueden estar en una forma fisiológicamente aceptable y libre de pirógenos.

La preparación que comprende PRPCS o células fotorreceptoras utilizadas en los métodos descritos en el presente documento se puede trasplantar en una suspensión, gel, coloide, suspensión espesa o mezcla. Además, es deseable que la preparación se encapsule o se inyecte en forma viscosa en el humor vítreo para su administración al sitio del daño retiniano o coroideo. Además, en el momento de la inyección, las células fotorreceptoras PRPCS criopreservadas se pueden resuspender con una solución salina equilibrada disponible comercialmente para lograr la osmolalidad y concentración deseadas para la administración mediante inyección subretiniana. La preparación se puede administrar en un área de la mácula pericentral que no se perdió por completo debido a la enfermedad, lo que puede promover la unión y/o la supervivencia de las células administradas.

Las células PRPCS y/o fotorreceptoras pueden congelarse (criopreservarse) como se describe en el presente documento. Tras la descongelación, la viabilidad de tales células puede ser al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % (por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % de las células recolectadas después de la descongelación son viables o al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % del número de células inicialmente congeladas se recolectan en un estado viable después de la descongelación).

Las PRPCS o células fotorreceptoras de la divulgación pueden administrarse en una formulación oftálmica farmacéuticamente aceptable mediante inyección intraocular. Cuando se administra la formulación mediante inyección intravítrea, por ejemplo, la solución se puede concentrar de modo que se puedan administrar volúmenes mínimos. Las concentraciones para inyecciones pueden ser cualquier cantidad que sea efectiva y no tóxica, dependiendo de los factores descritos en este documento. Las preparaciones farmacéuticas de PRPCS o células fotorreceptoras para el tratamiento de un paciente pueden formularse en dosis de al menos aproximadamente 104 células/mL. Las PRPCS o preparaciones de células fotorreceptoras para el tratamiento de un paciente se formulan en dosis de al menos aproximadamente 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o 1010 PRPCS o células fotorreceptoras/mL. Por ejemplo, las células PRPCS o fotorreceptoras pueden formularse en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las preparaciones farmacéuticas de PRPCS o células fotorreceptoras descritas en el presente documento pueden comprender al menos aproximadamente 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; o 9,000 p Rp CS o células fotorreceptoras. Las preparaciones farmacéuticas de PRPCS o células fotorreceptoras pueden comprender al menos aproximadamente 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 1076 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7x 1010, 8x 1010, o 9x 1010 PRPCS o células fotorreceptoras. Las preparaciones farmacéuticas de PRPCS o células fotorreceptoras pueden comprender al menos aproximadamente 1 x 102-1 x 103, 1 x 102-1 x 104, 1 x 104-1 x 105, o 1 x 103-1 x 106 PRPCS O PRPCS o células fotorreceptoras. Las preparaciones farmacéuticas de PRPCS o células fotorreceptoras pueden comprender al menos aproximadamente 10,000, 20,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000 o 200,000 PRPCS o células fotorreceptoras. Por ejemplo, la preparación farmacéutica de PRPCS o células fotorreceptoras puede comprender al menos aproximadamente 20,000-200,000 PRPCS o células fotorreceptoras en un volumen de al menos aproximadamente 50-200 pL. Además, la preparación farmacéutica de PRPCS o células fotorreceptoras puede comprender aproximadamente 50,000 PRPCS o células fotorreceptoras en un volumen de 150 pL, aproximadamente 200,000 PRPCS o células fotorreceptoras en un volumen de 150 pL, o al menos aproximadamente 180,000 PRPCS o células fotorreceptoras en un volumen de al menos aproximadamente 150 pL.

En las preparaciones y composiciones farmacéuticas antes mencionadas, el número de PRPCS o células fotorreceptoras o la concentración de PRPCS o células fotorreceptoras se puede determinar contando las células viables y excluyendo las células no viables. Por ejemplo, las PRPCS o fotorreceptoras no viables se pueden detectar al no excluir un tinte vital (como el azul tripán) o al usar un ensayo funcional (como la capacidad de adherirse a un sustrato de cultivo, fagocitosis, etc.). Además, el número de PRPCS o células fotorreceptoras o la concentración de PRPCS o células fotorreceptoras se puede determinar contando células que expresan una o más PRPCS o marcadores de células fotorreceptoras y/o excluyendo células que expresan uno o más marcadores indicativos de un tipo de célula distinto de PRPCS o fotorreceptoras.

Las células PRPCS o fotorreceptoras pueden formularse para su administración en un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable, de manera que la preparación se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un período de tiempo suficiente para permitir que las células penetren en las regiones afectadas del ojo, como por ejemplo, la cámara anterior, la cámara posterior, el cuerpo vítreo, el humor acuoso, el humor vítreo, la córnea, el iris/ciliar, el cristalino, la coroides, la retina, la esclerótica, el espacio supracoroideo, la conjuntiva, el espacio subconjuntival, el espacio epiescleral, el espacio intracorneal, el espacio epicorneal, la pars plana, regiones avasculares inducidas quirúrgicamente o la mácula.

Las células PRPCS o fotorreceptoras pueden estar contenidas en una lámina de células. Por ejemplo, se puede preparar una lámina de células que comprende PRPCS o células fotorreceptoras cultivando PRPCS o células fotorreceptoras sobre un sustrato del que se puede liberar una lámina intacta de células, por ejemplo, un polímero termosensible tal como una superficie injertada con poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPA Am) termosensible, sobre la cual las células se adhieren y proliferan a la temperatura del cultivo, y luego, tras un cambio de temperatura, las características de la superficie se alteran provocando la liberación de la lámina de células cultivadas (p. ej., enfriando por debajo de la temperatura de solución crítica inferior (LCST) (véase da Silva et al., Trends Biotechnol. Diciembre de 2007; 25(12): 577-83; Hsiue et al., Trasplantation. 15 de febrero de 2006; 81(3): 473-6; Ide, T et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614, Sumide, T et al. (2005), FASEB J. 20, 392-394; Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385; y Nishida, K. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196). La lámina de células puede estar adherida a un sustrato adecuado para trasplante, tal como un sustrato que puede disolversein vivocuando la lámina se trasplanta a un organismo huésped, por ejemplo, preparado cultivando las células en un sustrato adecuado para trasplante, o liberando las células de otro sustrato (tal como un polímero termosensible) sobre un sustrato adecuado para el trasplante. Un ejemplo de sustrato potencialmente adecuado para trasplante puede comprender gelatina (véase, Hsiue et al., citado anteriormente). Los sustratos alternativos que pueden ser adecuados para el trasplante incluyen matrices a base de fibrina y otros. La lámina de células puede usarse en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad de degeneración de la retina. La lámina de PRPCS O células fotorreceptoras puede formularse para su introducción en el ojo de un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, la lámina de células puede introducirse en un ojo que lo necesite mediante membranectomía subfoveal con trasplante de la lámina de PRPCS o células fotorreceptoras, o puede usarse para la fabricación de un medicamento para trasplante después de una membranectomía subfoveal.

El volumen de preparación administrado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento puede depender de factores tales como el modo de administración, el número de P PRPCS o células fotorreceptoras, la edad y el peso del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad que se está tratando. Si se administra mediante inyección, el volumen de una preparación farmacéutica de PRPCS o células fotorreceptoras de la divulgación puede ser de al menos aproximadamente 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 o 5 mL. El volumen puede ser al menos aproximadamente 1-2 mL. Por ejemplo, si se administra mediante inyección, el volumen de una preparación farmacéutica de PRPCS o células fotorreceptoras de la divulgación puede ser al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 pL (microlitros). Por ejemplo, el volumen de una preparación de la divulgación puede ser de al menos aproximadamente 10-50, 20-50, 25-50 o 1-200 pL. El volumen de una preparación de la divulgación puede ser al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 pL, o más.

Por ejemplo, la preparación puede comprender al menos aproximadamente 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104 o 9 x 104 PRPCS o células fotorreceptoras por pL. La preparación puede comprender 2000 PRPCS o células fotorreceptoras por pL, por ejemplo, 100,000 PRPCS o células fotorreceptoras por 50 pL o 180,000 PRPCS o células fotorreceptoras por 90 pL.

El método para tratar la degeneración de la retina puede comprender además la administración de un inmunosupresor. Los inmunosupresores que pueden usarse incluyen, entre otros, anticuerpo policlonal de globulina antilinfocitos (ALG), anticuerpo policlonal de globulina anti-timocitos (ATG), azatioprina, BASILlXlMAB® (anticuerpo receptor anti-IL-2Ra), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMAB® (anticuerpo receptor anti-IL-2Ra), everolimus, ácido micofenólico, RITUXlMAB® (anticuerpo anti-CD20), sirolimus y tacrolimus. Los inmunosupresores se pueden dosificar al menos aproximadamente 1,2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. Cuando se usan inmunosupresores, pueden administrarse sistémica o localmente, y pueden administrarse antes, concomitantemente o después de la administración de las PRPCS o células fotorreceptoras. La terapia inmunosupresora puede continuar durante semanas, meses, años o indefinidamente después de la administración de PRPCS o células fotorreceptoras. Por ejemplo, al paciente se le pueden administrar 5 mg/kg de ciclosporina durante 6 semanas después de la administración de las PRPCS o células fotorreceptoras.

El método de tratamiento de la degeneración de la retina puede comprender la administración de una dosis única de PRPCS o células fotorreceptoras. Además, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden comprender un ciclo de terapia en el que PRPCS o células fotorreceptoras se administran múltiples veces durante un período determinado. Los ejemplos de cursos de tratamiento pueden comprender tratamientos semanales, quincenales, mensuales, trimestrales, semestrales o anuales. Alternativamente, el tratamiento puede realizarse en fases en las que inicialmente se administran múltiples dosis (p. ej., dosis diarias durante la primera semana) y posteriormente se necesitan menos dosis y con menos frecuencia.

Si se administra mediante inyección intraocular, las PRPCS o células fotorreceptoras pueden administrarse una o más veces periódicamente a lo largo de la vida de un paciente. Por ejemplo, las PRPCS o células fotorreceptoras pueden administrarse una vez al año, una vez cada 6-12 meses, una vez cada 3-6 meses, una vez cada 1-3 meses o una vez cada 1-4 semanas. Alternativamente, puede ser deseable una administración más frecuente para ciertas afecciones o trastornos. Si se administra mediante un implante o dispositivo, las PRPCS o células fotorreceptoras se pueden administrar una vez, o una o más veces periódicamente durante la vida del paciente, según sea necesario para el paciente particular y el trastorno o afección que se está tratando. De manera similar se contempla un régimen terapéutico que cambia con el tiempo. Por ejemplo, es posible que sea necesario un tratamiento más frecuente al principio (por ejemplo, tratamiento diario o semanal). Con el tiempo, a medida que la condición del paciente mejora, es posible que se necesite un tratamiento menos frecuente o incluso ningún tratamiento adicional.

Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además la etapa de controlar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo las respuestas del electrorretinograma, el umbral de agudeza optomotora o el umbral de luminancia en el sujeto. El método también puede comprender controlar la eficacia del tratamiento o la prevención mediante el control de la inmunogenicidad de las células o la migración de las células en el ojo.

Las PRPC o PR pueden usarse en la fabricación de un medicamento para tratar la degeneración de la retina. La divulgación también abarca el uso de la preparación que comprende PRPc o PR en el tratamiento de la ceguera. Por ejemplo, las preparaciones que comprenden PRPC o PR humanas se pueden usar para tratar la degeneración de la retina asociada con una serie de dolencias que alteran la visión y que resultan en daño de los fotorreceptores y ceguera, tales como retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular relacionada con la edad, p. ej., degeneración macular húmeda relacionada con la edad y degeneración macular seca relacionada con la edad), retinitis pigmentosa y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus), ceguera nocturna y daltonismo. La preparación puede comprender al menos aproximadamente 5,000-500,000 PRPC o PR (por ejemplo, 100,000 PRPC o PR) que pueden administrarse a la retina para tratar la degeneración de la retina asociada con una serie de dolencias que alteran la visión y que dan como resultado daño a los fotorreceptores y ceguera, tal como retinopatía diabética, degeneración macular (incluida la degeneración macular relacionada con la edad), retinitis pigmentosa y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus).

Las PRPC o PR proporcionadas en este documento pueden ser PRPC o PR. Sin embargo, téngase en cuenta que las células humanas pueden usarse en pacientes humanos, así como en modelos animales o pacientes animales. Por ejemplo, las células humanas pueden probarse en modelos de degeneración de retina de ratón, rata, gato, perro o primate no humano. Además, las células humanas pueden usarse terapéuticamente para tratar animales que lo necesiten, tal como en medicina veterinaria. Ejemplos de sujetos o pacientes veterinarios incluyen, entre otros, perros, gatos y otros animales de compañía, y animales económicamente valiosos tales como ganado y caballos.

Los siguientes son ejemplos para ilustrar la invención y no deben considerarse limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de células progenitoras de los fotorreceptores

En la medida en que las células madre embrionarias humanas (hESC) mencionadas puedan solamente ser obtenidas exclusivamente mediante la destrucción de un embrión humano o de una línea celular que se ha establecido mediante la destrucción de un embrión humano, las hESC no forman parte de la invención reivindicada y se mencionan únicamente con fines de referencia. Se cultivaron células madre embrionarias humanas en condiciones sin alimentador en medio mTESR1 (Stem Cell Technology) sobre una superficie de Matrigel™ (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), BD Biosciences). Tras una confluencia del 80-90 %, las células se pasaron o se congelaron. El pase de células madre se realizó mediante técnicas enzimáticas (dispasa) o no enzimáticas (tampón de disociación celular basado en EDTA, Invitrogen).

Se utilizaron métodos de diferenciación directa para la generación de células progenitoras del campo ocular, células progenitoras neuronales de la retina, células progenitoras de los fotorreceptores y células fotorreceptoras de la retina. No fue necesaria la formación de cuerpos embrioides.

El método general utilizado para el desarrollo de fotorreceptores en estos ejemplos se ilustra esquemáticamente en la FIG. 19, que ilustra con más detalle los medios utilizados en cada etapa del proceso.

Con base en los datos de tinción, se determinó que las células se convierten en EFPC entre el día 7 - día 30 (indicado por la tinción realizada el día 20 que confirmó esta identidad celular), se convierten en RNPC entre el día 21 - día 45 (indicado por la tinción realizada el día 30) y se convierten en PhRPC entre 1-4 meses (de acuerdo con la tinción realizada el día 90).

Además, se estimó que el momento en el que surgieron diferentes tipos de células usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 fue el siguiente:

Progenitores del campo ocular (EFPC): 7-30 días/65 % - 98 % de pureza

Progenitores neuronales retinianos (RNPC): 21-45 días/70 %-95 % de pureza

Progenitores de fotorreceptores (PhRP) capaces de convertirse tanto en fotorreceptores de bastones como en fotorreceptores de conos: 1-4 meses/85 %-95 % de pureza

Se cree que los progenitores de fotorreceptores (PhRP) han perdido o experimentado una reducción en su capacidad de convertirse en fotorreceptores de bastones (pero no en fotorreceptores de conos): 5-12 meses/85 %-95 % de pureza.

Día 0: La diferenciación celular de células madre pluripotentes humanas se indujo con una confluencia del 15-20 %. El medio de cultivo se cambio a medio de inducción retiniana (RI): DMEM/F12 suministrado con 450 mg/mL de D-glucosa, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, suplemento de N2 al 1 % (u opcionalmente 0,1 y 5 %) (Invitrogen), suplemento de B27 al 0.2 % (u opcionalmente 0.05-2.0 %), MEM 0.1 mM. Se añadió solución de aminoácidos no esenciales, 25 pg/mL (u opcionalmente 5-50 pg/mL) de insulina humana al medio RI. También se incluyó el inhibidor de Smad Nogina y aumentó la expresión de los factores de transcripción del campo ocular cuando se incluyó en una concentración de 10-100 ng/mLo preferiblemente 50 ng/mL. Como se muestra en la FIG. 1, inclusión de diferentes factores que incluyen 50 ng/mL de Nogina, 5 ng/mL de Dkk1, 5 ng/mL de IGF-1 o una combinación de 5 ng/mL de Nogina, 5 ng/mL de Dkk1 y 5 ng/mL de IGF-1. afectó el nivel de expresión de los factores de transcripción del campo ocular en células progenitoras diferenciadas del campo ocular el día 21. Entre esas condiciones, la inclusión de 50 ng/mL de Nogina indujo en gran medida la expresión de marcadores progenitores del campo ocular.

La composición del medio RI incluía lo siguiente:

N2: 1 % (1 mL de N2 por 100 mL de medio)

B27: 0.2 % (0.2 mL de B27 por 100 mL)

Insulina humana: 20 pg/mL (además de los 5 pg/mL de insulina suministrados por N2). La concentración final de insulina fue de 25 pg/mL.

Nogina: Concentración final de 50 ng/mL.

Día 1 - Día 4: Cada día se realizó un cambio completo de medio. Aunque se prefiere esta frecuencia, se cree que cambiar el medio con menos frecuencia, por ejemplo, cada 2-3 días, puede ser adecuado particularmente si se utiliza un volumen mayor de medio. Las colonias celulares continuaron creciendo en el medio R<i>con insulina y Nogina en las mismas concentraciones que en la etapa anterior. Después de 1 día de exposición al medio RI, las células ubicadas en el margen de la colonia se alargaron y tenían forma de columna, como se muestra en la FIG. 2A.

Dia 5: Los cultivos celulares alcanzaron una confluencia del 80-90 % el día 5. El medio se cambió a medio de diferenciación neuronal (ND): Medio Neurobasal (componentes enumerados en la FIG. 21, Invitrogen) suministrado con 450 mg/mL de D-glucosa, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 1 x GlutaMAX™ (una forma estabilizada de dipéptido de L-glutamina, L-alanil-L-glutamina), suplemento de N2 al 1 % (u opcionalmente de 0.1 a 5 %) (un suplemento químicamente definido sin suero basado en la formulación de N-1 de Bottenstein que comprende transferrina humana (Holo) 1 mM, cadena completa recombinante de insulina 0.0861 mM, progesterona 0.002, putrescina 10.01 mM y selenita 0.00301 mM, Invitrogen), suplemento de B27 al 2 % (u opcionalmente 0.05-2.0 %) (componentes enumerados en la FIG. 21), solución de aminoácidos no esenciales de MEM 0.1 mM. También se añadió Nogina al medio ND a una concentración final de 50 ng/mL (u opcionalmente 10-100 ng/mL).

Día 6 - Día 20: Las células se mantuvieron en el medio ND. Se cambió la mitad de la cantidad de medio cada 2 días. Las colonias de células continuaron creciendo en el medio ND. Las células de los bordes se vuelven planas y grandes, mientras que las células centrales se vuelven más pequeñas y forman grupos de células compactos (FIG. 2B). Alrededor del día 14, las células ubicadas en el centro de las colonias comenzaron a formar estructuras tipo roseta (FIG. 2C). El día 21, más del 90 % de las células coexpresaron PAX6 y RX1 (FIG. 3A-3B) de acuerdo con lo revelado por inmunotinción y citometría de flujo. Mediante inmunotinción, las células fueron positivas para Nestina y SOX2 (FIG.

3C-3D). Las células fueron negativas para un marcador de células ES (específicamente OCT4) y un marcador de progenitor neuronal de la retina (específicamente CHX10). Mediante RT-PCR, las células expresaron factores de transcripción del campo ocular: pAx 6, RX1, LHX2, SIX3, SIX6, TBX3 y SOX2 (FIG. 3E). Estos resultados indican que las células eran células progenitoras del campo ocular.

Las células se convierten en progenitoras del campo ocular después de cultivarlas con medios de diferenciación neuronal, aproximadamente entre el día 7 y 8 (aproximadamente 2 a 3 días de cultivo en medio ND). En estos puntos de tiempo surgen células detectables doblemente positivas para pax6/rx 1. Después de aproximadamente el día 14 (entre los días 14-30), se genera una alta pureza (>90 %) del progenitor del campo ocular.

Aproximadamente entre los días 7 y 30 se forman "células progenitoras del campo ocular" o "EFPC".

Día 21 - Día 24: El día 21, las células se separaron de la superficie de crecimiento y se fragmentaron mecánicamente en grupos en medio ND sin Nogina. Los grupos de células se transfirieron a placas de cultivo de fijación ultrabaja de 100 mm. Los grupos de células se redondearon y formaron esferas individuales (grupos sólidos) en el cultivo en suspensión. El día 23, se reemplazó la mitad del medio de cultivo.

El día 25, se recogieron las esferas y se eliminaron las células muertas y los residuos lavando las esferas con medio ND. Las esferas celulares se sembraron en un portaobjetos de cámara de vidrio recubierto con Matrigel™ (para inmunotinción) o placas de cultivo de tejidos en el medio ND. Las esferas se unieron en 12 horas. Continuaron creciendo y mostrando fenotipos neuronales, exhibiendo específicamente agregados celulares dentro de las esferas que extendían neuritas similares a axones con algunas células migrando desde los agregados (FIG. 4A). Había pocas células grandes de tipo epitelial que pudieran eliminarse durante el paso celular (véase "Mes 2 - Mes 3" a continuación). Los cultivos se mantuvieron cambiando la mitad del medio de cultivo cada dos días hasta que los cultivos celulares se volvieron confluentes. Se observó que se formaban bolas de esferas adheridas a la placa.

El día 30, las células migratorias dieron positivo para Tuj1, que marca las neuronas maduras e inmaduras (FIG. 4B). Las células de los agregados fueron negativas para Tuj1. Más del 95 % de las células (incluidas las células de los agregados o las que migran fuera de los agregados) coexpresaron PAX6 y CHX10, lo que sugiere que se habían convertido en progenitores neuronales de la retina (FIG. 4C).

Mes 2 - Mes 3: Crecimiento y paso de células en el medio ND. Las células de la etapa anterior se pasaron cuando se volvieron confluentes. Se utilizó una técnica de pases sucesivos de dos etapas para producir cultivos neuronales de alta pureza mediante la eliminación de la mayoría de las células de fenotipo no neuronal. La primera etapa: cultivo de la esfera neuronal. Las células se disociaron enzimáticamente (por ejemplo, usando Accutase) o mecánicamente en una mezcla de células individuales y grupos de células. Las células se transfirieron a placas de fijación ultrabaja en medio ND. Todas las células con fenotipo neuronal forman esferas neuronales en el cultivo en suspensión. El día 3 se cambió la mitad del medio y las células se mantuvieron hasta el día 5. La segunda etapa: cultivo adherente. Se recogieron esferas neuronales el día 5 y se eliminaron las células muertas y los desechos lavando las esferas con medio ND. Las esferas se colocaron sobre placas de cultivo de tejidos recubiertas con Matrigel™ hasta confluencia. Se alternaron la primera y la segunda etapa y las células se mantuvieron así hasta el final del tercer mes.

Al final del tercer mes, las células mostraron un fenotipo neuronal. Específicamente, las células formaron neuritas en cultivo (FIG. 5A). Eran capaces de proliferar. Expresaron PAX6, pero fueron negativos para CHX10 de acuerdo con lo evaluado mediante inmunotinción (FIG. 5B). Mediante inmunotinción, las células dieron positivo para Recoverina, que se expresó en el citoplasma del cuerpo celular (FIG. 5C). Las células también expresaron ARNm de Rodopsina, Opsina y Recoverina (FIG. 5D). Los análisis de PCR en tiempo real revelaron que las expresiones de los factores de transcripción que controlan la diferenciación de los fotorreceptores de bastones y/o conos están altamente expresadas (Tabla 1). Estos resultados indican que las células eran progenitoras de fotorreceptores. Además, en este momento se basó en observaciones de que todas o esencialmente todas las células en el cultivo son progenitores de fotorreceptores.

Tabla 1. Análisis de RT-PCT cuantitativo de factores de transcripción que controlan la diferenciación y regeneración de fotorreceptores

Mes 4-Mes 9/o más: Expansión in vitro de progenitores de fotorreceptores. En algunos experimentos, las células se expandieron aún más utilizando la técnica de pases sucesivos de dos etapas descrita anteriormente ("Mes 2-Mes 3"). Sin embargo, se observó que con el tiempo las células pierden su capacidad de diferenciarse en fotorreceptores de conos (aunque conservan la capacidad de diferenciarse en fotorreceptores de bastones). Específicamente, después de que los progenitores de fotorreceptores se mantuvieron mediante la técnica de pases sucesivos de dos etapas durante 9 meses en cultivo y luego se indujeron a diferenciarse, solo produjeron células que expresaron marcadores de fotorreceptores de bastones y no células que expresaron marcadores de fotorreceptores de conos. Esta propiedad podría potencialmente tener un uso ventajoso, ya que las células progenitoras que producen preferentemente fotorreceptores de bastones pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades en las que es deseable la formación de bastones, o como reactivo para el estudio de factores implicados en la determinación del destino de los progenitores de los fotorreceptores.

Ejemplo 2: Diferenciación de células progenitoras de los fotorreceptores: tratamiento celular con ácido retinoico y taurina.

Los progenitores de fotorreceptores adheridos se trataron con ácido retinoico en las siguientes condiciones durante dos semanas: medio ND suministrado con 100 ng/mL (u opcionalmente 10-1000 ng/mL) de ácido retinoico y taurina 100 |jM (u opcionalmente 20-500 j M). La mitad del medio de cultivo se cambió cada 2 días.

Diferenciar células en medios de diferenciación de fotorreceptores: el medio se cambió a medio de diferenciación de fotorreceptores que comprendía medio neurobasal (Invitrogen) suministrado con 450 mg/mL de D-glucosa, 100 unidades/mL de penicilina, 100 jg/m L de estreptomicina, 1 x GlutaMAX™, suplemento de N2 al 1 % (Invitrogen), suplemento de b27 al 2 % (número de fórmula 080085-SA), con la adición de forskolina 5 jM (u opcionalmente 1-100<j>M), 10 ng/mL(u opcionalmente 1-100 ng/mL) de BDNF, 10 ng/mL(u opcionalmente 1-100 ng/mL) de CNTF, 10 ng/mL (u opcionalmente 5-50 ng/mL) de LIF y DATP 10 jM (u opcionalmente 1-100 j M). La mitad del medio se cambió cada 2 días. Específicamente las cantidades de cada factor fueron las siguientes: Forskolina (5 j M), BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL) y DATP (10 j M). Se determinó que LIF no es necesario y puede omitirse.

Dos semanas después de iniciar la diferenciación celular, se detectaron las expresiones de Rodopsina, Opsina (verde/rojo), Recoverina y la subunidad alfa de la fosfodiesterasa 6A (PDE6a) en el citoplasma del cuerpo celular y las neuritas (FIG. 6A-6D). Estos resultados de expresión génica indican que se trata de células fotorreceptoras.

Ejemplo 3: Crioconservación de progenitores neuronales retinianos derivados de ESC humanos.

Los progenitores neuronales de la retina de la invención, los progenitores de fotorreceptores de la invención y los progenitores de fotorreceptores de la invención tratados con ácido retinoico se pueden congelar en un tampón de crioconservación sin animales, tal como Cryostor CS10, u otro tampón de crioconservación tal como FBS al 90 % y DMSO al 10 %. Con respecto a los progenitores de los fotorreceptores, se observó que congelar las células como neuroesferas era beneficioso, lo que puede deberse a los beneficios del contacto célula-célula. Preferiblemente, las neuroesferas se congelaron a un tamaño que no fuera demasiado grande, tal como 50-250 células.

Ejemplo 4: Estudios en animales en un modelo animal de distrofia macular de Stargardt.

Los estudios en animales se llevaron a cabo en un modelo animal de distrofia macular Stargardt, ratones ELOVL4 transgénicos 2 (TG2) (FIG. 7).

Los progenitores de fotorreceptores (producidos como se describe en el Ejemplo 1) y por separado, los progenitores de fotorreceptores tratados con ácido retinoico y taurina (es decir, células fotorreceptoras inmaduras, producidas como se describe en el Ejemplo 2) se disociaron en células individuales usando Accutase. Las células se resuspendieron en tampón de PBS.

Los ratones TG2 de 28 días de edad recibieron una inyección de 1 jL de suspensión celular que contenía 5 x 105 células en el espacio subretiniano o 150 jL de suspensión celular que contenía 1 x 106 células en la vena de la cola. Todos los ratones se sometieron a pruebas ERG y OCT iniciales antes de la inyección celular.

Los ratones fueron alimentados con agua suministrada con ciclosporina A (modificada según la USP).

Un mes después de la inyección de células, los ratones que recibieron una inyección subretiniana de progenitores de fotorreceptores mostraron una mejora significativa de la función de los fotorreceptores de bastones revelada por un aumento significativo de la amplitud del ERG escotópico de las ondas a y b (FIG. 8). Los ratones que recibieron una inyección en la vena de la cola de progenitores de fotorreceptores y progenitores de fotorreceptores tratados con ácido retinoico y taurina mostraron una mejora significativa de la función de los fotorreceptores de bastones revelada por un aumento significativo de la amplitud del ERG escotópico de las ondas a y b (FIG. 9).

Dos meses después de la inyección de células, los ratones que recibieron una inyección en la vena de la cola de progenitores de fotorreceptores tratados con ácido retinoico mostraron una mejora adicional de la función de los fotorreceptores de bastones revelada por un aumento adicional de la amplitud de las ondas a y b de la curva sensible al ERG escotópico (FIG. 10A-10C). La función de los fotorreceptores de los conos mejoró significativamente, como lo revela un aumento significativo de la amplitud del ERG fotópico tanto de la onda a como de la onda b (FIG. 11).

Dos meses después de la inyección, los ratones que recibieron una inyección en la vena de la cola de células fotorreceptoras inmaduras tratadas con ácido retinoico y taurina mostraron un aumento significativo del espesor total de la retina revelado por OCT (FIG. 12).

Dos meses después del trasplante de células, hubo una preservación significativa de las neuronas fotorreceptoras en la ONL de la retina en ratones que recibieron ácido retinoico y progenitores fotorreceptores tratados con taurina (FIG.

13).

Ejemplo 5: Modelos animales de acromatopsia (daltonismo) y mejora de la visión nocturna.

Las células producidas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 o el Ejemplo 2 se prueban en modelos de acromatopsia (daltonismo) de ratón, oveja y/o perro. Se utilizaron los siguientes modelos:

Ratón: (1) el ratón cpfl5: un modelo de ratón natural de acromatopsia con una mutación CNGA3; (2) ratones con inactivación de CNGA3; (3) ratones GNAT2cpfl3: mutación relacionada con GNAT2; (4) PDE6C-cpfl1: mutación relacionada con pde6c.

Oveja: corderos de ovejas Awassi: mutación en CNGA3

Perro: Se han identificado dos caninos naturales para la mutación en CNGA3: la degeneración de conos caninos autosómica recesiva en el malamute de Alaska y el braco alemán de pelo corto.

Los progenitores de fotorreceptores (producidos como se describe en el Ejemplo 1) se disocian en células individuales usando Accutase. Las células se resuspenden en tampón de PBS. Los animales reciben inyecciones de 2 x 105 células o más en la cavidad vítrea o 5 x 106 células o más en una vena de la cola (p. ej., la vena de la cola). Los animales de control reciben una inyección con tampón de PBS. Después de uno o dos meses o en otros momentos, a los animales se les realizan pruebas de capacidad de respuesta optomotora para verificar la función visual con el fin de detectar posibles mejoras en la misma. Además, se realiza un análisis histológico para determinar si existe alguna preservación significativa de las neuronas fotorreceptoras o crecimiento de las neuronas fotorreceptoras y, además, para detectar si las células trasplantadas a la cavidad vítrea mostraron una buena supervivencia después de la inyección y si las células se diferenciaron en células fotorreceptoras de bastones o conos que expresan marcadores de los mismos.

Ejemplo 6: Estudios en animales en un modelo de rata con degeneración de fotorreceptores, rata del Royal College of Surgeons (RCS).

Los progenitores de fotorreceptores (producidos como se describe en el Ejemplo 1) se disociaron en células individuales usando Accutase. Las células se resuspendieron en tampón de PBS.

El día 30 posnatal, las ratas RCS recibieron inyecciones de 2 x 105 células en la cavidad vítrea o 5 x 106 células en la vena de la cola. Las ratas de control recibieron una inyección con tampón de PBS.

Las ratas RCS fueron alimentadas con agua suministrada con ciclosporina A (modificada según la USP).

Un mes y dos meses después de la inyección de células, se realizaron pruebas de respuesta optomotora a las ratas para comprobar la función visual. No hubo una mejora significativa en la función visual en las ratas tratadas (datos no mostrados).

El efecto resultante sobre la función visual puede detectarse mediante la prueba de respuesta optomotora, ERG, registro del umbral de luminancia y/o ensayo de flujo sanguíneo del centro visual.

Dos meses después de la inyección de células, la histología reveló una preservación significativa de las neuronas fotorreceptoras en la ONL de la retina en ratas RCS a las que se les administró tratamiento celular (FIG. 15).

La preservación del segmento externo del fotorreceptor de cono y bastón revelado mediante inmunotinción de Rodopsina (bastones) y opsina (conos) se observó en los grupos tratados con células (inyección tanto intravítrea como en la vena de la cola, FIG. 16 y FIG. 17).

Las células trasplantadas a la cavidad vítrea mostraron una buena supervivencia 2 meses después de la inyección, luego se diferenciaron aún más en células fotorreceptoras de bastones que expresan marcadores de fotorreceptores de bastones (FIG. 18).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparación de células, que comprende:

(a) una pluralidad de células en las que más del 90 por ciento de las células en la preparación son células progenitoras de los fotorreceptores que son inmunocitoquímicamente PAX6+, y CHX10-, y transcripción de ARNm positiva para MASH1, de acuerdo con lo detectado por qPCR, y

2. La preparación de la reivindicación 1, en la que las células progenitoras de los fotorreceptores están sustancialmente libres de células madre pluripotentes, células ganglionares de la retina, fotorreceptores maduros, células amacrinas, o una combinación de las mismas.

3. La preparación de la reivindicación 1, en la que la preparación es una preparación farmacéutica adecuada para su uso en un paciente mamífero y el medio es un vehículo farmacéuticamente aceptable para trasplante en un paciente mamífero.

4. La preparación de la reivindicación 1, en la que la preparación es una preparación celular criogénica que comprende al menos 109 células progenitoras de los fotorreceptores (PRPC), y en la que la preparación de células criogénicas comprende un sistema crioconservante compatible con la viabilidad de las células progenitoras de los fotorreceptores tras la descongelación.

5. La preparación de la reivindicación 1, en la que las células progenitoras de los fotorreceptores se derivan de células madre pluripotentes, preferiblemente en la que las células madre pluripotentes se seleccionan del grupo que consiste en células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas, y/o

en la que las células progenitoras de los fotorreceptores son células humanas, y/o en la que la mayoría de las células progenitoras de los fotorreceptores son transcritos de ARNm positivos para Nr2e3, Trp2, RORp y NRO, como se detecta mediante qPCR.

6. La preparación de la reivindicación 1, en la que las células progenitoras de los fotorreceptores expresan al menos 2 veces más, con respecto a las células progenitoras neuronales de la retina, uno o más marcadores seleccionados de uPA, tenascina-C, CXCL16, CX3CL1 y quitinasa 3 tipo 1, como la detectada mediante inmunoensayo de proteínas secretadas o niveles de transcripción de ARNm mediante qPCR.

7. La preparación de la reivindicación 1, en la que las células progenitoras de los fotorreceptores tienen capacidad replicativa para experimentar al menos 20 duplicaciones de población en cultivo celular, con menos del 25 por ciento de las células experimentando muerte celular, senescencia o diferenciación en células fenotípicamente no fotorreceptoras en la vigésima duplicación, y/o

en la que las células progenitoras de los fotorreceptores tienen niveles de proteína transferrina o de ARNm de transferrina que son al menos un 25 por ciento menores que los niveles de proteína o ARNm de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, respectivamente, y/o

en la que las células progenitoras de los fotorreceptores son HLA genotípicamente idénticas, y/o

en la que las células progenitoras de los fotorreceptores son genómicamente idénticas, y/o

en la que las células progenitoras de los fotorreceptores tienen una longitud media del fragmento de restricción terminal (TRF) que es superior a 8 kb.

8. Una preparación de células que comprende:

(a) células fotorreceptoras derivadas de células madre pluripotentes, en las que más del 90 por ciento de las células son inmunocitoquímicamente PAX6+, CHX10- y son rodopsina+ y/u opsina+; y

(b) un medio adecuado para mantener la viabilidad de las células fotorreceptoras derivadas de células madre, opcionalmente en el que el medio es un vehículo farmacéuticamente aceptable para mantener la viabilidad de las células fotorreceptoras para su trasplante en un paciente mamífero.

9. La preparación de células progenitoras de los fotorreceptores de la reivindicación 3 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno causado por la pérdida de fotorreceptores en un paciente.

10. La preparación de células fotorreceptoras de la reivindicación 8 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno causado por la pérdida de fotorreceptores en un paciente.

11. Un método para producir células progenitoras de los fotorreceptores, que comprende las etapas de cultivar células progenitoras del campo ocular en condiciones de cultivo que alternan entre condiciones de baja adherencia o no adherencia durante un período de tiempo suficiente para formar esferas celulares individuales, y luego condiciones adherentes, que alternan condiciones de cultivo que continúan hasta que la mayoría de las células son células progenitoras de los fotorreceptores, en el que las células progenitoras de los fotorreceptores de la mayoría se caracterizan como PAX6+, CHX10- y transcripción de ARNm positiva para MASH1, de acuerdo con lo detectado por qPCR.

12. El método de la reivindicación 11, que comprende las etapas de

(a) cultivar células progenitoras del campo ocular como grupos de células y en condiciones de baja adherencia o no adherencia, en un medio de diferenciación neuronal durante un periodo de tiempo suficiente para que los grupos de células formen esferas celulares individuales, en el que las células progenitoras del campo ocular se caracterizan como PAX6+, RX1+, OCT4-y NANOG-, y preferiblemente también se caracterizan como SIX3+, SIX6+, LHX2+, TBX3+, SOX2+ y Nestina+, de acuerdo con lo determinado mediante inmunotinción y/o citometría de flujo;

(b) cultivar las esferas celulares en un medio de diferenciación neuronal en condiciones adherentes sobre una estructura de biomaterial tal como gelatina, alginato, colágeno tipo 1, Matrigel™, poliglicólido, colágeno, fibrina, o péptidos autoensamblables, hasta que la mayoría de las células del cultivo sean células progenitoras neuronales de la retina caracterizadas como PAX6+, CHX10+ y SOX2-;

(c) a partir de entonces, alternar las condiciones de cultivo una o más veces entre condiciones de baja adherencia o no adherencia durante un período de tiempo suficiente para que las células progenitoras neuronales de la retina formen esferas celulares individuales, y después cultivar la célula progenitora neuronal de la retina que contiene esferas celulares en condiciones adherentes, cuyas condiciones de cultivo alternadas se continúan hasta que la mayoría de las células son células progenitoras de los fotorreceptores, en el que las células progenitoras de los fotorreceptores de la mayoría se caracterizan como PAX6+, CHX10-, y transcrito de ARNm positivo para MASH1, de acuerdo con lo detectado por qPCR, y en el que las células progenitoras de los fotorreceptores son capaces de diferenciarse en células fotorreceptoras tras el tratamiento con ácido retinoico.

13. Un método para preparar células progenitoras de los fotorreceptores derivadas de células madre pluripotentes que comprende:

(a) cultivar células madre pluripotentes en medio de cultivo de inducción de retina y producir una o más células progenitoras del campo ocular;

(b) cultivar dichas una o más células progenitoras del campo ocular en condiciones de baja adherencia o no adherencia en medio de diferenciación neuronal para formar esferas celulares;

(c) sembrar en placas las esferas celulares en condiciones adherentes para formar células adheridas;

(d) disociar las células adheridas y cultivar las células en condiciones de baja adherencia o no adherencia como se define en la etapa (b) para formar esferas celulares adicionales;

(e) sembrar en placa las esferas celulares adicionales en condiciones adherentes como se define en la etapa (c) para formar más células unidas,

obteniendo así una población de células progenitoras de los fotorreceptores.

14. El método de la reivindicación 13, que comprende además repetir las etapas (d) y (e) al menos una vez más.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en el que el medio de cultivo de inducción de retina comprende Nogina y el medio de diferenciación neuronal no comprende Nogina.