TWI711455B - 多層視網膜細胞移植物 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種製備多層視網膜細胞移植物的方法。該方法包含以層連結蛋白塗覆一基質以獲得一層連結蛋白修飾的基質，並在該層連結蛋白修飾的基質上培養源自幹細胞或誘導的多能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的視網膜細胞，其中該生長的視網膜細胞包括多層視網膜細胞，並提供促進視網膜修復的性質和功效。
Description
本發明一般涉及一種用於修復視網膜缺損或疾病之多層視網膜細胞移植物。
老年性黃斑部病變(Age-related macular degeneration，AMD)是一種全球性的失明主因，特別是在發展中國家。具有末期老年性黃斑部病變(AMD)的患者永久喪失其中心視力，主要是由於視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)和黃斑中的光感受器的纖維血管性瘢痕或萎縮。目前的治療著重於透過重複注射抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來控制濕性老年性黃斑部病變(AMD)中脈絡膜新生血管的生長和滲漏。(Martin等人，用於新生血管的老年性黃斑部病變之Ranibizumab單株抗體與bevacizumab單株抗體。新英格蘭醫學期刊，2011年；第364期：第1897-908頁。)由於纖維組織的持續性以及視網膜色素上皮細胞(RPE)與光感受器的喪失，視覺結果通常受到限制。為了防止濕性老年性黃斑部病變(AMD)中的新血管的形成和進一步的破壞，許多新的治療被提出，包括抑制血小板衍生的生長因子、中和鞘胺醇-1-磷酸、抗整聯蛋白寡肽、放射線療法、外科移植物和基因治療。(Pecen & Kaiser。新生血管的老年性黃斑部病變的現階段第1/2期研究。當代眼科觀點期刊，2015年；第26期：第188-93頁。)此外，目標為補體因子D的人源化單株抗體，lampalizumab，也被設計用於治療乾性老年性黃斑部病變(AMD)中的地圖樣萎縮(Do DV等，在具有地圖樣萎縮的患者中抗因子D單株抗體片段FCFD4514S的階段ia劑量遞增研究。Retina期刊(費城，賓州)。2014年；第34期：第313-20頁。)然而，顯少有治療將其作用著重於視網膜色素上皮細胞(RPE)和神經感覺視網膜上，其功能障礙和病變可能會減弱血液-視網膜屏障，並最初導致老年性黃斑部病變(AMD)。為此，幹細胞治療提供了另一種視網膜病變的理想根治機會。
有鑑於以治療藥物治療晚期老年性黃斑部病變(AMD)的缺點，視網膜色素上皮細胞(RPE)、光感受器或其他視網膜細胞的移植是修復老年性黃斑部病變(AMD)患者的受損視網膜的替代方案。然而，要獲得足夠數量的合適的供體視網膜色素上皮細胞(RPE)以及光感受器，以用於在拯救老年性黃斑部病變(AMD)的視覺功能障礙中的體外移植，仍然是這種治療的障礙。因此，基於多能幹細胞的治療，如胚胎幹細胞(embryonic stem cells，ESC)和誘導多能細胞(induced pluripotent cells，iPSC)，是針對再生醫學中的有限的供體視網膜色素上皮細胞(RPE)的可能的解決方法。(Carr等人，用於治療老年性黃斑部病變的人類胚胎幹細胞之發展，神經科學趨勢期刊，2013年；第36期：第385-95頁。)據報告，與懸浮的視網膜色素上皮細胞(RPE)相比，視網膜色素上皮細胞(RPE)的極化單層顯示出更好的存活率及生長情況。(Diniz等人，視網膜下植入來自人胚胎幹細胞的視網膜色素上皮細胞：當作為單層植入時改善存活率。調查眼科及視覺科學期刊。2013年；第54期：第5087-96頁。)將多能幹細胞分化的視網膜色素上皮細胞(RPE)作為單層層片移植，具有更大的機率可成功修復視網膜，特別是針對有需要修復相當大面積的視網膜的乾性老年性黃斑部病變(AMD)患者的地圖樣萎縮。(Reardon & Cyranoski，日本幹細胞試驗引人羨慕。自然期刊，2014年；第513期：第287-8頁。)然而，可移植材料的生物安全性和功效，以及植入的視網膜色素上皮細胞(RPE)在視網膜下的空間的視覺功能改善尚未得到證實。
因此，開發用於修復視網膜缺損，特別是老年性黃斑部病變(AMD)的新支架細胞移植物是需要的。
據此，本發明提供了一種製備多層視網膜細胞移植物的方法以及由其所製備之產品，其特徵在於在一層連結蛋白修飾的基質上培養視網膜細胞。所獲得之多層視網膜細胞移植物含有多層各種視網膜細胞，包括至少視網膜色素上皮細胞(RPE)與光感受器，其可以在該連結蛋白修飾的基質上充分生長，其係作為一可促進該視網膜色素上皮(RPE)細胞的體外生長、吞噬作用，以及色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)分泌的仿次視網膜布魯赫氏基質。因此，本發明之多層視網膜細胞移植物具有更大的潛力可成功修復視網膜。
在一個方面，本發明提供了一種製備多層視網膜細胞移植物的方法。該方法包含將層連結蛋白塗覆於一基質以獲得一層連結蛋白修飾的基質，並在該層連結蛋白修飾的基質上培養源自幹細胞或誘導的多能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的視網膜細胞，其中該生長的視網膜細胞包括多層視網膜細胞，並提供促進視網膜修復的性質和功效。
根據本發明，該視網膜細胞可以在該連結蛋白修飾的基質上充分生長，且該生長的視網膜細胞含有多層各種視網膜細胞，包括至少視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)與光感受器。在實施例中證實了該層連結蛋白修飾的基質，作為仿次視網膜布魯赫氏基質，可以促進該視網膜色素上皮(RPE)細胞的體外生長、吞噬作用，以及色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)的分泌。
於另一方面，本發明提供透過該方法所獲得之多層視網膜細胞移植物，其係具有視網膜修復的潛力。
於另一方面，本發明提供了一種用於在一有需要之個體的眼睛內修復視網膜缺損的方法，包含在視網膜缺損上移植透過該方法所獲得的多層視網膜細胞移植物。
所發現為以層連結蛋白修飾的基質提供了用於培養源自幹細胞或其上之誘導的多能幹細胞(iPSCs)的視網膜細胞的良好性質。以層連結蛋白修飾的基質作為仿次視網膜布魯赫氏基質，視網膜細胞生長於其上，且生長的視網膜細胞包括多層視網膜細胞，並提供促進視網膜修復的良好性質和功效。
在本發明中，該基質為任何生物相容的聚合化合物層片，包括但不限於聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷(GPTES)、胺基丙基三乙氧基矽烷(APTES)、二甲苯或丙酮。用於本發明之基質的一個實例為聚二甲基矽氧烷(PDMS)。
根據本發明，該基質可透過任何習知及/或本領域中通常使用的方法來以層連結蛋白修飾。在本發明的一個實施例中，該基質係透過化學及氧電漿處理而以層連結蛋白進行表面修飾。
在本發明中出人意料地發現，以層連結蛋白修飾的基質(例如PDMS)為在該基質上生長的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層提供視網膜下的環境。
在本發明的一個實施例中，以電漿-PmL處理的PDMS (「PDMS-PmL」)提供以下意想不到的性質或功效： (1)增強分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的附著、增殖、極化和成熟； (2)增加極化緊密連接、PEDF分泌、黑素體色素沉積，以及分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的吞噬能力； (3)與分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)和光感受器前體形成多層結構的能力； (4)良好的生物相容性； (5)維持營養性PEDF的分泌。
總之，該層連結蛋白修飾的基質，例如PDMS-PmL，能夠維持極化的視網膜色素上皮細胞(RPE)單層的生理學形態和功能，並且表現在體內挽救黃斑部病變的潛力。
現在將參考以下實施例更具體地描述本發明，該實施例是為了說明而不是限制的目的而提供的。
實施例
實施例1 PDMS-PmL層片的製備和評估
吞噬作用分析
使用pHrodoTM大腸桿菌螢光生物顆粒(Invitrogen公司)透過基於流式細胞術的方法評估吞噬作用，當內化於細胞內吞噬體的降低的pH環境時，該大腸桿菌生物顆粒發出螢光。生物顆粒在中性pH環境下不會發出螢光，因此與非特異性黏附有關的背景螢光是可忽略的。根據製造商的說明書，在活細胞成像溶液(Invitrogen公司)中以5 μg/μL的濃度製備生物顆粒。在含有CO2
非依賴性培養基(Invitrogen)的12孔培養盤中，將集合的視網膜色素上皮細胞(RPE)與70μL生物顆粒加上每孔630μL HBSS，於37°C下培養17-18小時。陰性對照組的培養盤則在4°C下培養。在顯微鏡下檢查細胞，以TrpLE收穫細胞並以流式細胞術在流式細胞儀上計數20,000個細胞以進行分析。將門控細胞群體的直方圖上的螢光強度向右移動以指示由吞噬作用進行的陽性攝取。
PDMS表面修飾
PDMS表面修飾的方法與如下的三個步驟一致： 1) 經由電漿處理的PDMS氧化作用(PDMS-OH)。將樣品暴露於氧電漿(PC150，JunSun Tech Co., Ltd)以產生親水表面。它們在10-2
Torr的壓力下，以氧電漿在50W和氧氣流速為17 sccm的條件下處理5分鐘。 2) PDMS基質(PDMS-NH2
)的胺化。在電漿處理後，將PDMS膜浸入在無水乙醇中的1%體積的APTES (Ca.440140，Sigma-Aldrich公司，密蘇里州)之矽烷溶液中。然後，在溶液中加入5%體積的去離子水以水解矽烷，並使其在75°C下反應15分鐘。在矽烷反應後，將PDMS樣品以75%體積的含水乙醇洗滌一次，並以去離子水洗滌三次以除去殘留的矽烷化合物。胺化的PDMS膜表示為PDMS-NH2
。 3) 將層連結蛋白表面嫁接到PDMS-NH2
膜上。以交聯劑EDC/NHS (Sigma-Aldrich公司，密蘇里州)進行將層連結蛋白綴合於PDMS-NH2
膜上。將EDC/NHS (1:1莫耳比)加到在PBS緩衝液中的10 μg/ml層連結蛋白以獲得10 mM的終濃度，並使其在37°C下與PDMS-NH2
膜反應1小時。然後以去離子水洗滌PDMS膜以除去殘留的試劑，並在細胞接種前以PBS沖潤。
接觸角的量測
在環境溫度下透過錄影-影像固定滴張力計(100SB型，Sindatek Instruments Co., Ltd)測量PDMS表面上的水接觸角。將1.5 μl的去離子水滴滴在基質表面上並拍照。然後以錐形截面分析擬合水滴的形狀和基線，以計算三相(固-液-氣)接觸點。針對每個PDMS基質，在表面的五個不同區域上進行測量，並平均該數值。
透過比色分析法測定表面上的胺含量
使用比色法-酸性橙II測定法定量在矽烷化的PDMS表面(PDMS-NH2
)上暴露的胺的含量。簡言之，將胺化的PDMS樣品(在12孔培養盤中為3.9 cm2
)在酸性條件(Milli-Q水，以6N HCl調整至pH 3)下，在室溫下浸漬於1 mL酸性橙色染料溶液(500 μM)中整夜。然後使用酸性溶液(pH3)將樣品洗滌3次以除去未結合的染料。之後，將著色的樣品浸入1mL鹼性溶液(以6N NaOH調整至pH 12的Milli-Q水)整夜，以使基質上結合的染料脫離。以測量492nm處的光密度來定量結合染料的量，其代表表面可使用的胺含量。在Milli-Q水中製備不同濃度的酸性橙II溶液(10-50μM)，並調整至pH12以建立標準曲線。未修飾的PDMS基質作為陰性對照組。
在RCS大鼠的視網膜下空間中植入分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL膜
所有的實驗動物在台北榮民總醫院的動物中心中飼養，而且所有的外科手術係根據國家實驗動物中心的機構動物福利指南進行。將分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL移植物移植到20~24週齡的皇家學院外科醫生(Royal College Surgeon，RCS)大鼠的眼睛中，以用於短期和長期的觀察。在受治療的眼睛中局部施用0.5%托品醯胺滴眼劑後，以腹膜內注射方式施用0.05 ml/100 g Rompun (Bayer公司，台灣)和0.1 ml/100 g Zoletil (Virbac公司，台灣)以麻醉這些大鼠。在手術開始時完成上結膜環切術，並使用6-0絲縫合對該大鼠的眼球進行暫時的固定。然後使用26號針切割治療區域的鞏膜和脈絡膜。以注射一些黏性流體而解剖視網膜下空間後，經由這些鞏膜-脈絡膜傷口將移植物精確地***視網膜下空間。在手術的最後階段，以10-0縫合線閉合結膜創傷，並對嫁接的眼睛施用並覆蓋0.3%建它黴素眼藥膏。追蹤並記錄所有研究用的大鼠的可視化彩色眼底、OCT影像和ERG功能測定。
統計分析
結果以平均值±標準差(SD)表示。使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，然後透過學生氏t檢驗分析各組之間的差異。P值＜0.05被認為是具有統計學上的顯著性。
結果
1. 多能幹細胞衍生的視網膜色素上皮細胞(RPE)單層的產生
多能細胞衍生的視網膜色素上皮細胞(RPE)已經用於幾種動物模型中的視網膜疾病的修復，並且用於修復晚期老年性黃斑部病變(AMD)患者中的退化視網膜色素上皮細胞(RPE)的臨床前試驗中測試。我們先前以電穿孔運輸Oct4、Sox2、Klf4、Lin28、Myc和sh-p53從T細胞建立人類誘導的多能幹細胞(iPSCs)細胞株(圖1A，上方，補充資料)。然後將人類誘導的多能幹細胞(iPSCs)分化為視網膜色素上皮細胞(RPE)(圖1A，中間，補充資料)，用於進一步的體外和體內研究。這些多能細胞分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)呈現具有重色素沉澱的六邊形堆積形態(圖1A，中間和底部)，並且表現視網膜色素上皮細胞(RPE)特異性蛋白質標誌物，例如RPE65、bestrophin、MITF和PAX6，以及一種緊密連接特異性蛋白，閉合小帶(zodula occludens)-1 (ZO-1)(圖1B)。為了檢查分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的吞噬功能，我們以pH敏感性的pHrodoTM大腸桿菌螢光生物顆粒與分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)一起培養，以顯現吞噬體的併吞現象。如圖1C所示，分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)表現出高量的紅色螢光，其係在細胞經歷吞噬作用並且併吞吞噬體中的顆粒時被誘導。與對照組相比，紅色螢光的定量顯示在分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)中顯著增強的吞噬活性(圖1C，右)。整體而言，這些分析證實分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)具有典型的視網膜色素上皮細胞(RPE)形態、標記物表現、吞噬作用功能和細胞接觸的緊密連接。此外，人類視網膜色素上皮細胞(RPE)的生理形態是極化的單層襯裡，在光感受器層下面，以提供必需的營養物質且併吞噬光感受器外節片段的末端。對於視網膜色素上皮細胞(RPE)細胞維持其生理組織以改善其生存和發揮其功能而言是至關重要的。然後，我們設計了一個基於PDMS的仿生膜，目的在於支持該極化的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層以在活體中植入個體的視網膜下的空間(圖1D)。
2. 以O2
電漿處理修飾和層連結蛋白塗覆的PDMS。
PDMS是具有高生物相容性的普遍的生物安全材料，已廣泛用於微流體裝置構造，特別是用於生物應用。然而，其低細胞黏附性和高疏水性造成其主要缺點並導致實質的樣品損失。為了克服PDMS的缺點，我們對PDMS基材進行表面修飾以增強其黏附性並降低其疏水性。圖2A所示為用於官能化PDMS基質的表面修飾方案。我們首先用O2
電漿預處理PDMS表面以引入OH基團，如先前研究中所述。由於表面上存在矽烷醇(Si-OH)基團，因此在O2
電漿處理後PDMS表面變為親水性。透過掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察到O2
電漿處理30秒之前和之後的PDMS膜的形態(圖2B)。與均勻的未處理的PDMS相比，電漿處理的PDMS表現出顆粒狀表面。PDMS表面上的氧含量將隨著電漿功率的增加和暴露時間的延長而增加；然而，這也可以在表面上造成蝕刻並且增加PDMS基質上的表面粗糙度，其影響隨後在表面上的細胞附著。為了評價PDMS修飾的最佳條件，以連續滴定功率和不同曝光時間的O2
電漿處理PDMS膜(圖2C)。無論暴光時間多長，以50W和30W的O2
電漿處理時PDMS表面皆被顯著地蝕刻(圖2C)。當電漿功率降低至10W時，PDMS表面顯現出保持其完整性(圖2C)。通過低功率電漿處理的連續測試，我們發現10W/5分鐘處理的PDMS顯示保持了比其他PDMS具有處理矽烷化和層連結蛋白塗覆更好的數量(未顯示數據)。因此，選擇10W/5分鐘電漿修飾條件作為本研究的標準處理方法。使用掠射角反射率(80°) FTIR，未修飾、電漿處理、表面胺化和塗覆層連結蛋白的/電漿處理的PDMS (PDMS-PmL)的表面特性顯示於圖2D中，且證實PDMS-PmL表面存在層連結蛋白。為了評價修飾的PDMS的親水性，我們測量了具有不同修飾作用的PDMS表面上的水接觸角，並且證明與未修飾的PDMS對照組相比，PDMS-PmL顯示出增加的親水性(圖2E)。此外，我們檢驗了層連結蛋白塗覆對PDMS的細胞黏附的影響。結果顯示，分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)和ARPE-19 RPE細胞株在PDMS-PmL上形成六角形單層，但在PDMS-Pm(僅有無層連結蛋白塗層的氧氣電漿)上則較不均質，而兩種細胞都難以附著在未修飾的PDMS上(圖2F)。然後我們檢驗了在PDMS、PDMS-Pm和PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)和ARPE-19的細胞毒性和附著性。如圖2G所示，與未修飾的PDMS和PDMS-Pm相比，當在PDMS-PmL上生長時，兩種細胞皆具有更好的存活率及最高的附著百分比。總之，這些分析顯示，用電漿處理和層連結蛋白塗覆的修飾增加了PDMS的親水性，可以使分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)生長和附著的更好。
3. PDMS-PmL上分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層的超微結構
我們接著評估該修飾是否影響PDMS的電導和擴散能力。如圖3A的左圖所示，PDMS-PmL仍呈現多孔的特性。透過使用改進的電化學光譜分析(補充資料)，該多孔PDMS-PmL的電導和擴散能力優於玻璃酸和PE膜，但有效孔徑可能小於0.22 μm濾膜(Merk Millipore corp公司，Darmstadt，德國)和3.5K截止的透析膜(Cellu.Sep，Membrane Filtration Products, Inc.,Seguin，德州，美國)(圖3A，右)。這些結果顯示，多孔PDMS-PmL的孔徑大於蔗糖分子(~9 Å)，其可以穿透玻璃膜[32]但小於30個胺基酸胜肽(~2nm)。因此，我們的多孔PDMS-PmL的有效孔徑大約為0.9~2nm。此外，彈性模量檢查的結果也顯示該修飾作用不影響PDMS的彈性(圖3B)。總之，這些數據表明小分子，包括必需營養素如葡萄糖、蔗糖、胺基酸和小分子胜肽，可以直接通過PDMS-PmL，以提供用於維持分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)存活的植入環境。
為了進一步檢查PDMS-PmL是否有利於分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的極化，我們將分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)接種在PDMS-PmL上，如圖3C所示。使用掃描式電子顯微鏡(SEM)，可以觀察到分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)表面的超微結構形態，以及塗覆在PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層。PDMS-PmL的表面看起來平滑、緊實，具有顯著的完整性，避免細胞通過膜進行遷移(圖3D)。在掃描式電子顯微鏡(SEM)影像中，在PDMS-PmL上觀察到平坦和極化的視網膜色素上皮細胞(RPE)單層的形成(圖3D，左上)。這些分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)也顯示在該層連結蛋白嫁接的PDMS-PmL上保持均勻的六邊形形狀(圖3D，左下)和豐富的頂端微絨毛(圖3D，右上)。使用穿透式電子顯微鏡(TEM)，我們顯示出這些分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)表現黑素體染色體沉澱，這是一種成熟視網膜色素上皮細胞(RPE)的典型特徵(圖3D，右下)。此外，pHrodoTM大腸桿菌吞噬作用測定(圖3E，上方)和ZO-1的免疫螢光染色(圖3E，中間)證明了分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層內活性吞噬功能和細胞-細胞接觸的緊密連接(圖3E，底部)。總之，我們的發現指出，修飾的PDMS-PmL膜的表面為視網膜色素上皮細胞(RPE)生長以及在單層結構中緊密的極化、視網膜色素上皮細胞(RPE)層的生理形態提供了一個基質膜樣的環境。
4. PDMS-PmL增強了分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的分化和功能成熟。
層連結蛋白是視網膜細胞外基質的重要組成分之一，也是用於幹細胞分化的微環境生態位。為了進一步探討PDMS-PmL是否促進視網膜色素上皮細胞(RPE)的分化和成熟，在進行視網膜色素上皮細胞(RPE)分化程序之前，將人類誘導的多能幹細胞(iPSCs)接種在PDMS和PDMS-PmL上。在顯微鏡下觀察分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)顯示，在25天的分化期間，與PDMS上的細胞相比，PDMS-PmL上的細胞呈現出更好的附著性和六邊形結構(圖4A)。此外，自分化程序的第20天起，PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)表現出更多的黑素體色素沉澱(圖4A)。重要的是，緊密連接特異性ZO-1蛋白的免疫螢光染色證明，自誘導分化後第15天起，與在PDMS-對照組相比，接種在PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的細胞-細胞接觸處的ZO-1具有更好的組織(圖4B)。在膜上視網膜色素上皮細胞(RPE)分化過程下的誘導的多能幹細胞(iPSCs)的西方墨點分析證明了Otx2視網膜譜系標誌物和Mitf視網膜色素上皮細胞(RPE)特異性蛋白逐漸增加表現(圖4C)。值得注意的是，視網膜色素上皮細胞(RPE)分化程序，在標準程序下通常需要30至40天，在PDMS-PmL上僅需25天就產生成熟視網膜色素上皮細胞(RPE)(圖4A-B)。這些數據顯示，PDMS-PmL可以提供有效的視網膜色素上皮細胞(RPE)分化的利基。此外，我們透過分析PEDF分泌量和吞噬作用能力來進一步評估PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的功能成熟度。與分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-對照組相比，在分化後第15天和第25天，ELISA分析證明分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL的培養基中PEDF的分泌增加(圖4D)。胞外PEDF的免疫螢光染色也支持PDMS-PmL增強分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的PEDF分泌(圖4E)。與增加的PEDF分泌一致，比生長在PDMS-對照組上相較，分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)在PDMS-PmL上呈現出更好的吞噬活性(圖4F)。總之，我們的分子、形態和功能分析證實，以電漿處理和層連結蛋白塗覆進行修飾的PDMS可促進視網膜色素上皮細胞(RPE)的分化和功能成熟，至少是在幹細胞的視網膜譜系的分化。
5.PDMS-PmL能攜帶多層視網膜細胞
視網膜是由若干不同的細胞層，包括視網膜色素上皮細胞(RPE)、感光細胞、雙極視網膜神經細胞和視網膜神經節細胞，所組成的組織複雜組合。與視網膜色素上皮細胞(RPE)移植物聯合使用的感光細胞的產生，可能是用於恢復嚴重視網膜病變中的視覺功能障礙的一種解決方案。為了模擬視網膜的物理結構並檢查PDMS-PmL在嚴重視網膜病變如晚期老年性黃斑部病變(AMD)中的不同應用，我們檢查了PDMS-PmL膜攜帶多層視網膜細胞的能力(圖5A)。根據我們以前的實驗方法，我們使用了分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層作為視網膜細胞-對-細胞環境，以促進幹細胞分化為神經祖細胞[35]。然後我們透過在hRPE塗覆的PDMS-PmL膜上接種誘導的多能幹細胞(iPSCs)衍生的神經祖細胞，開發了光感受器/分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL多層裝置(圖5A)。該雙層裝置的免疫螢光染色顯示出在PDMS-PmL膜上共培養的VSX陽性光感受器祖細胞和RPE65陽性視網膜色素上皮細胞(RPE)細胞(圖5B)，表示在我們的系統中成功的塗覆了誘導的多能幹細胞(iPSCs)/神經祖細胞衍生的光感受器前體和分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)。
視網膜功能在很大程度上依賴於每個組織層的順序和組織。我們進一步調查誘導的多能幹細胞(iPSCs)/神經祖細胞衍生的光感受器前體/分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)雙層在PDMS-PmL膜上的超微結構。掃描式電子顯微鏡(SEM)資料顯示在PDMS-PmL膜上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層(圖5C，a-b)；在分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層的頂部鋪設具有典型尖峰形態的分化的神經祖細胞(圖5C，c-d)。此外，電子顯微鏡顯示在該雙層裝置上的誘導的多能幹細胞(iPSCs)/神經祖細胞衍生的光感受器前體細胞的典型光感受器形態(圖5D，左上和右上)。還觀察到在該雙層裝置上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)中的黑素體沉澱(圖5D，右下)。值得注意的是，可以在TEM下觀察到細胞-細胞接觸之間的緊密連接，表示在PDMS-PmL膜上的雙層組織的完整性(圖5D，左下)。此外，螢光顯微鏡清楚地顯示了在PDMS-PmL仿生膜上的RFP標記的hRPE和GFP標記的光感受器前體細胞的雙層結構(圖5E、圖5F)。這些數據表示PDMS-PmL攜帶多層視網膜細胞及其在晚期視網膜病變疾病中的潛在應用的能力。
6. 驗證在豬隻的視網膜下PDMS-PmL移植物的長期生物安全性和生物穩定性
為了進一步驗證PDMS-PmL移植物在體內的長期生物安全性和生物穩定性，我們分別在4個和6個豬隻眼睛中的黃斑部區域周圍的視網膜下空間中植入PDMS和PDMS-PmL。在PDMS和PDMS-PmL的視網膜下移植後，每3個月以光同調斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)、裂隙燈檢查、彩色眼底照相術、全場及多焦視網膜電圖(electroretinograms，ERG)檢查每個個體的視網膜解剖結構、功能和眼部狀況。在為期2年的追蹤期間，移植物的位置和視網膜結構的保存以OCT和彩色眼底照相監測。在所有PDMS和PDMS-PmL移植的眼睛中，移植物是原位的，並且穩定沒有移動。在PDMS眼睛中，橫切面OCT成像鑑定光感受器/視網膜色素上皮細胞(RPE)層被破壞且隨後損失(表1)。然而，在PDMS-PmL眼睛中，OCT成像顯示在移植2年後，視網膜解剖結構良好整合並且膜被成功放置在豬隻的視網膜下空間中，並且維持穩定(圖6A；表1)。它揭示完整的光感受器/視網膜色素上皮細胞(RPE)層與完整的視網膜附著於該移植物上方及周圍，且沒有水腫或萎縮。移植物兩側的視網膜和視網膜色素上皮細胞(RPE)看起來不受影響。在移植後滿2年時，以彩色眼底照相分析顯示，圍繞在PDMS-PmL視網膜下植入區域的視網膜脈管系統保持沒有纖維化或萎縮的跡象(圖6B)。此外，我們執行兩年的追蹤調查，每3個月進行檢視查驗。我們的調查結果顯示，在眼前房和玻璃體內沒有檢測到發炎的跡象(見表1)。還觀察到通過裂隙燈檢查的角膜/晶狀體的結果是正常的；而且以彩色眼底攝影檢查，結果顯示所有豬隻，不論是PDMS或PDMS-PmL組，的玻璃體介質都是清楚的。 表1 型態變化的示意總覽 
我們也沒有發現在PDMS-PmL植入後，這六個受試動物的眼睛中有其他眼部併發症，例如結膜、角膜、眼前房、晶狀體、高眼內壓、玻璃體、視網膜斷裂、視網膜剝離、高眼壓以及視網膜出血。
重要的是，在移植2年後，暗視ERG記錄的結果顯示，在移植PDMS-PmL的眼睛中，視網膜對光反應的功能與在手術前眼睛或對照組眼睛中記錄的光反應並無顯著差異(圖6C)。總之，這些結果證實了活體內PDMS-PmL的長期生物穩定性和生物安全性。
7. PDMS-PmL移植物和PDMS移植物之間的比較。
為了評價在活體內的PDMS移植物和PDMS-PmL移植物的長期生物安全性和生物穩定性，分別將PDMS和PDMS-PmL植入至4個和6個豬隻眼睛中的黃斑部區域周圍的視網膜下空間。在PDMS-PmL眼睛中，OCT成像顯示視網膜解剖結構良好完整，而且膜被成功地放置，並在移植後兩年在豬隻的視網膜下空間中穩定保持(參見圖7A)。移植物兩側的視網膜和視網膜色素上皮細胞(RPE)看起來不受影響。在移植後2年時，PDMS-PmL視網膜下植入區域周圍，以彩色眼底照相術分析，視網膜血管系統保持沒有纖維化或萎縮的跡象(參見圖7B)。在移植後兩年，暗視ERG記錄的結果顯示，PDMS-PmL移植的眼睛中視網膜對光反應的功能與手術前眼中記錄的沒有顯著差異(參見圖7C)。
PDMS-PmL移植後長達2年維持黃斑部功能，並為視網膜下膜支架提供良好的微環境。我們還隔離黃斑部區域以檢測移植PDMS和PDMS-PmL的眼睛中的PEDF含量。與移植PDMS後的PEDF含量降低相比，在2年時，在PDMS-PmL眼睛中觀察到維持營養PEDF含量，以保持PDMS-PmL眼中的視網膜微環境(圖7D-7F)。總之，這些數據表明PDMS-PmL能夠維持極化視網膜色素上皮細胞(RPE)單層的生理形態和功能，並且證明PDMS-PmL移植在體內用於挽救黃斑部病變的潛在應用。
8. PDMS移植物和PDMS-PmL移植物的長期功能
視網膜黃斑部位於視網膜的中心並且負責中心、高解析度的視覺。然而，如何測量在幹細胞移植或仿生視網膜植入後視網膜變性的患者的黃斑部功能，仍是一個沒有標準答案的問題。多焦點ERG (mtERG)可以提供客觀的方法來分析老年性黃斑部病變(AMD)患者以及大型動物眼中的局部電生理光響應，包括黃斑部區域。
將PDMS移植物和PDMS-PmL移植物移植到受移植的豬隻的視網膜下空間中。在每個時間點，右圖為3D地形圖，且右圖是用於mtERG的單獨記錄的軌跡陣列。使用mtERG作為平台來評估黃斑部的功能，在2年時，以PDMS移植的右眼顯示出部分抑制mtERG痕跡，表示有PDMS相關的視網膜損傷(圖8A)。然而，在2年的追蹤期間中，PDMS-PmL眼睛中的mfERG信號通常仍會持續(圖8B)。
鑑於上述內容，可以得出結論，PDMS-PmL能夠維持極化的視網膜色素上皮細胞(RPE)單層的生理學形態和功能，並且證明分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL在體內增加光響應的有效性。如圖9所示，分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL裝置在老年性黃斑部病變(AMD)患者中可能的應用是可以被開發的。
據信，本發明所屬領域之普通技術人員可以基於本文的描述而將本發明用於其最廣泛的範圍，而無需進一步說明。因此，所提供的描述及申請專利範圍應當被理解為示意性之目的，而不是以任何方式限制本發明之範圍。
無。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及本發明的以下詳細描述。為了說明本發明之目的，在附圖中示出了目前優選的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於該具體實施例。
在圖式中：
圖1所示為來自患者特異性的誘導的多能幹細胞(iPSCs)的單層視網膜色素上皮細胞(RPE)的產生。圖1(A)提供老年性黃斑部病變(AMD)患者特異性的誘導的多能幹細胞(iPSCs)、分化的視網膜色素上皮細胞(RPE)以及單層視網膜色素上皮細胞(RPE)的顯微鏡照片。比例尺 = 100 μm。圖1(B)提供在分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)中視網膜色素上皮細胞(RPE)特異性蛋白質標記物Rpe65、bestrophin、MITF和PAX，以及ZO-1緊密連接標記物的免疫染色的影像。比例尺 = 50 μm。圖1(C)顯示分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)通過與pH敏感的紅色螢光綴合的大腸桿菌顆粒共同培養18小時後，進行吞噬作用分析。在螢光顯微鏡下觀察螢光染料的變化(左)並以流式細胞儀定量(右)。比例尺 = 100 μm。(D)仿生視網膜下植入的設計程序的示意圖。
圖2所示為電漿修飾的PDMS層片的特徵：(A) PDMS的表面修飾程序的示意圖。使用醫療用等級的彈性體(Nusil Technology公司)產生PDMS膜，並以O2
電漿處理PDMS表面。在電漿修飾之後，使用矽烷溶液(APTES)將胺基(NH2
)引入到表面，以用於進一步的蛋白質附著。層連結蛋白通過EDC/NHS介導的共價鍵化學連接到胺化表面上。在該反應中，羧酸基團層連結蛋白能夠與PDMS表面上的胺基偶聯，並最終在PDMS基質上形成穩定的醯胺鍵。(B)帶有(10W和50W)或不帶有電漿處理30秒的PDMS基質的掃描式電子顯微鏡(SEM)影像。樣品在真空中乾燥，然後濺射塗覆金(JFC 1200，JOEL公司，東京，日本)。使用JSM-7600F (JOEL公司，東京，日本)掃描式電子顯微鏡(SEM)獲得影像，電子束能量為5kV。在10W電漿處理後，PDMS表面上出現小的顆粒狀結構。在50W電漿處理後，在表面上形成波狀結構。比例尺 = 100 nm。(C)帶有不同電漿暴露時間和功率的電漿處理的ODMS基質的掃描式電子顯微鏡(SEM)影像。比例尺 = 100 nm。(D)使用掠射角反射率(80°)FTIR測量以確認PDMS基質的化學組成。未修飾的PDMS基質的特徵峰包括：分別在2870和2970cm-1
處從≡Si-CH3
基團伸展的對稱和不對稱-CH3
；在1259cm-1
處從≡Si-CH3
基團的對稱-CH3
彎曲；在793cm-1
處從≡Si-CH3
基團的-CH3
搖動；在1076和1018cm-1
處的Si-O-Si峰。帶有電漿處理的PDMS基質在IR光譜中增加了從3100-3600 cm-1
的-OH伸展。在蛋白質附著反應完成後，出現在表面上的蛋白質以分別在1640、1550和1320 cm-1
之對應於醯胺I (H-CO-NH2
)、醯胺II (H-CO-NHR)，以及醯胺III (H-CO-NHRR')的峰值來表示其特徵。結果證實在電漿修飾的PDMS表面上的層連結蛋白塗層。(E)透過錄影-影像固定滴張力計(上圖)測量並在圖表(下圖)中量化，以在環境溫度下測量在a:未修飾的PDMS，b: O2
電漿處理過的PDMS (PDMS-Pm)，c: 胺化的PDMS-Pm，以及d: PDMS-PmL表面上的水接觸角度。表面粗糙度和非均勻性以動態接觸角測量來表示其特徵。結果顯示層連結蛋白塗覆的PDMS變得更為親水且增加表面粗糙度(由接觸角滯後的角度反射)，結果產生對細胞附著高度有利的表面。(F)誘導的多能幹細胞(iPSCs)分化的視網膜色素上皮細胞(RPE)和ARPE-19細胞株接種在PDMS、10W/5分鐘電漿處理的PDMS (PDMS-Pm)，以及10W/5分鐘電漿處理的具有層連結蛋白塗層的PDMS (PDMS-PmL)上。在顯微鏡下觀察細胞的形態。(G)在PDMS、PDMS-Pm和PDMS-PmL膜上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)和ARPE-19細胞株的定量細胞毒性(左)和附著作用(右)。
圖3所示為PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)單層的電子顯微鏡結構：(A)左圖：多孔PDMS的掃描式電子顯微鏡(SEM)影像。比例尺 = 100 μm。右圖：玻璃膜的導電電流(黑線)；多孔DPMS的電流響應(紅線)；塑料膜的電流響應(橙線)；0.22 μm濾膜的電流響應(綠線)；3K截止透析膜的電流響應(藍線)。在這項工作中的電位測量與Ag/AgCl參考電極直接相關。(B)多孔PDMS的彈性模量。(C)產生分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL仿生膜的示意圖。(D)在PDMS-PmL膜(左上，比例尺 = 10 μm)上的單層分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的掃描式電子顯微鏡(SEM)影像以及在PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的典型六邊形組織(左下，比例尺 = 10 μm)。當在PDMS-PmL膜(右上，比例尺 = 10 μm)上生長時，分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的頂端微絨毛的掃描式電子顯微鏡(SEM)影像。穿透式電子顯微鏡(TEM)影像顯示當生長在PDMS-PmL膜上時，該分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)具有細胞黑素體沉積(右下，比例尺= 500 nm)。(E)在PDMS-PmL膜上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)透過與pH敏感的紅色螢光綴合的大腸桿菌顆粒一起培養18小時後，進行吞噬作用分析。在螢光顯微鏡下觀察螢光染料的變化。比例尺 = 100 μm。
圖4所示為在PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的生長和功能的評價：(A)將患者特異性誘導的多能幹細胞(iPSCs)接種在PDMS-對照組和PDMS-PmL上，並進行視網膜色素上皮細胞(RPE)分化程序。在顯微鏡下觀察第15天、第20天和第25天的細胞形態。比例尺 = 100 μm。(B)將在PDMS-對照組和PDMS-PmL上的分化的視網膜色素上皮細胞(RPE)進行ZO-1的免疫染色。比例尺 = 50 μm。(C)在指定日期經歷視網膜色素上皮細胞(RPE)分化方案的細胞中的視網膜色素上皮細胞(RPE)特異性蛋白質Otx2和Mitf的蛋白質西方墨點分析。(D)分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-對照組和分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL進行ELISA分析以評估PEDF的分泌量。(E)在分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS和分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL仿生膜上的PEDF免疫螢光染色。比例尺 = 50 μm。(F)分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS和分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL通過與pH敏感的紅色螢光綴合的大腸桿菌顆粒一起培養18小時後，進行吞噬作用分析。在螢光顯微鏡下觀察螢光染料的變化。比例尺 = 25 μm。
圖5所示為PDMS-PmL攜帶的多層誘導的多能幹細胞(iPSCs)衍生的視網膜組織的發育：(A)產生誘導的多能幹細胞(iPSCs)/神經祖細胞衍生的光感受器祖細胞和分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)雙層塗覆PDMS-PmL仿生膜的程序的示意圖。(B)在PDMS-PmL膜上共培養的神經祖細胞衍生的光感受器前體(VSX)和分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)(RPE65)雙層的免疫螢光染色。比例尺 = 50 μm。(C)塗覆在PDMS-PmL仿生膜上的神經祖細胞衍生的光感受器前體/分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)雙層的掃描式電子顯微鏡(SEM)分析。比例尺 = 100 μm。(D)塗覆在PDMS-PmL上的光感受器前體/分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)雙層的穿透式電子顯微鏡(TEM)影像。觀察到分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)的光感受器的典型形態(左上和右上)和緊密連接(左下；箭頭指向細胞-細胞連接處)和細胞黑素體沉積(右下；箭頭指示處)。(E)在螢光顯微鏡下觀察在PDMS-PmL膜上的以GFP標記的神經祖細胞衍生的光感受器前體和以RFP標記的分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)。比例尺 = 50 μm。(F)誘導的多能幹細胞(iPSCs)/神經祖細胞衍生的光感受器前體/分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/ PDMS-PmL裝置的示意圖。
圖6所示為在移植的豬隻的視網膜下空間中，用於監測PDMS-PmL的長期生物穩定性的OCT和眼部檢查。(A) OCT篩檢顯示，在視網膜手術移植1年後，在移植的豬隻的視網膜下空間的PDMS-PmL視網膜附著良好。對照組：未經手術的正常視網膜。(B)和(C)眼底攝影的連續觀察顯示，在移植後至少12個月的期間，PDMS-PmL移植物在相同的解剖位置沒有誘導任何併發症。(D)
植入後6週，PDMS-PmL移植眼中記錄的暗視ERG反應與對照組眼中記錄的沒有顯著差異。
圖7所示為PDMS移植物和PDMS-PmL移植物在體內的長期生物安全性和生物穩定性，其中 分別在4個和6個豬眼中的黃斑區域周圍的視網膜下空間中植入PDMS和PDMS-PmL。(A)在PDMS-PmL眼中，OCT影像顯示視網膜解剖良好整合，且膜被成功地放置並在移植後二年在豬的視網膜下空間中穩定維持。(B)移植物兩側的視網膜和視網膜色素上皮細胞(RPE)看起來不受影響。在PDMS-PmL視網膜下植入區域周圍，視網膜脈管系統在移植2年時以彩色眼底照相保存而沒有纖維化或萎縮的跡象。(C)在移植2年後，暗視ERG記錄的結果顯示，PDMS-PmL移植的眼睛中的視網膜光響應功能，與手術前眼睛或對照組眼睛中記錄的沒有顯著差異。整體而言，這些結果證實了PDMS-PmL在體內的長期生物穩定性和生物安全性。 (D)、(E)和(F)顯示PDMS移植物和PDMS-PmL移植物在治療組和對照組之間對PEDF分泌的比較。意外地觀察到PDMS移植物的PEDF分泌被抑制，但是PDMS-PmL移植物的PEDF分泌沒有被抑制。
圖8所示為在移植的豬隻的視網膜下空間中，用於監測PDMS和PDMS-PmL的長期功能的多灶性ERG記錄。在每個時間點，右圖為3D地形圖，右圖是用於mtERG的單獨記錄的軌跡陣列。(A)與手術前的基線右眼相比，在PDMS移植後2年右眼中的mfERG記錄為顯著地抑制。左眼也作為對照組。(B)與手術前基線右眼相比，在PDMS-PmL移植後2年右眼中的mfERG記錄顯示沒有顯著變化。左眼也作為對照組。
圖9提供了分化的視網膜色素上皮細胞(dRPE)/PDMS-PmL裝置在老年性黃斑部病變(AMD)患者中可能的應用之示意性流程圖。
無。
無。
Claims (2)
- 一種製備多層視網膜細胞移植物的方法，包含將層連結蛋白透過化學及氧電漿處理而以層連結蛋白進行表面修飾一聚二甲基矽氧烷(PDMS)之基質以獲得一仿次視網膜布魯赫氏基質，並在該基質上培養源自幹細胞或誘導的多能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)使其生長分化形成視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞與光感受器而得該多層視網膜細胞移植物；其中該基質可促進該視網膜色素上皮(RPE)細胞的體外生長、吞噬作用，維持該多層視網膜細胞移植物中該視網膜色素上皮(RPE)細胞的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)的分泌，以及提供該多層視網膜細胞移植物促進視網膜修復的性質和功效。
- 一種透過如請求項1之方法所獲得之多層視網膜細胞移植物。
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