ES2957479A1 - Metodo de obtencion de datos utiles para la prediccion del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis - Google Patents
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Abstract
Método de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis. La presente invención se relaciona con un método in vitro de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, encuadrándose dentro del campo de la medicina personalizada. En concreto, dicho método se basa en el análisis de una serie de polimorfismos genéticos del sujeto, así como otros datos de carácter ambiental del mismo, que conjuntamente son útiles y permiten predecir el riesgo de que un sujeto desarrolle fibrosis.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis
La presente invención se relaciona con un métodoin vitrode obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, encuadrándose dentro del campo de la Medicina Personalizada. En concreto, dicho método, se basa en el análisis de una serie de polimorfismos genéticos, así como otros datos de carácter ambiental del sujeto, que conjuntamente son útiles y permiten la predicción del riesgo de que un sujeto desarrolle fibrosis.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La fibrosis en términos generales hace referencia a un crecimiento y acumulación anómala de componentes de la matriz extracelular, que provoca un endurecimiento o fibrosación de tejido repercutiendo en una pérdida de función parcial o total del tejido u órgano afectado. La enfermedad fibrótica comprende una amplia gama de patologías clínicas que se estima sean responsables del 45% de todas las muertes del mundo desarrollado.
Las patologías fibróticas pueden afectar a un gran número de órganos y tejidos diferentes, sin embargo, se cree que las vías de generación de las mismas son comunes en cualquier órgano. Por otro lado, la patología fibrótica puede darse tras una intervención quirúrgica Esta condición, denominada como la fibrosis postquirúrgica, se caracteriza por una proliferación excesiva de tejido fibrótico y cicatricial generada tras una intervención quirúrgica en un paciente, formándose más tejido fibroso del necesario, lo que habitualmente tiene un impacto negativo en su calidad de vida.
La fibrosis aparece muy frecuentemente a nivel articular, lo que conlleva al desarrollo de la artrofibrosis, con el consecuente endurecimiento o agarrotamiento patológico de una articulación debido a una exagerada respuesta fibrótica. Por ejemplo, la aparición de fibrosis es una complicación a tener en cuenta en las intervenciones quirúrgicas de las articulaciones por su incidencia: oscilando entre el 1 y el 15% de pacientes afectados en las artroplastias de rodilla, y entre el 4 y el 38% en la reconstrucción de ligamento cruzado anterior.
Teniendo en cuenta que solo en EEUU al año se estiman puedan surgir unos 85.000 nuevos casos de artrofibrosis solo de rodilla, y que de ellas un 25% necesitan cirugía adicional para intentar reestablecer un movimiento adecuado de rodilla, se puede estimar las implicaciones no solo a nivel de empeoramiento en la calidad de vida derivadas por la menor movilidad, sino también la repercusión social y económica que supone este tipo de patología.
Se han descrito diversos métodos que tienen relación con el diagnóstico o pronóstico de la fibrosis o condiciones similares:
En la solicitud de patente EP2428583A1 se describe un método para determinar el progreso del proceso de cicatrización de un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado entre los genes TFAP2A, EGFR, ILIA, IL1B, IL6, IL10, IL18, CD44, TNFRSF1A, HSPD1, MYC, CTGF, MMP7, MMP2, MMP9, MMP25, TGFA, TGFB2, EREG, FN1, HBEGF, NF1, SRC, EGF4, CDKN2A, PLAU, SPP1, ITGB2, BAX, MET y PPAR, o de una variante funcionalmente equivalente de dichos genes, en una muestra de dicho sujeto.
En ES2422874B1, se describe un métodoin vitropara el pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave que se caracteriza por la detección de una serie de polimorfismos genéticos y la determinación de variables clínicas.
En CA2805267A1, se describe un método que comprende la medición del nivel de cadherina-11 en una muestra obtenida de un sujeto, y su comparación con valores control, donde un nivel de cadherina-11 en la muestra obtenida del sujeto mayor que el valor control indica fibrosis o riesgo de desarrollar fibrosis.
Sin embargo, los métodos descritos no permiten predecir de forma fiable el riesgo de un sujeto de padecer fibrosis, lo cual dificulta y limita la toma de decisiones o medidas preventivas que puedan evitar esta condición. Así, a la luz del estado de la técnica, es necesario disponer de métodos que tengan utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir un proceso de fibrosis y que permitan determinar con fiabilidad el riesgo de sufrir complicaciones de este tipo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención divulga un método de obtención de datos útilesin vitro parapredecir el riesgo de un sujeto de sufrir un proceso de fibrosis.
Para el desarrollo del mismo, los inventores se basan en la utilización de variables ambientales (grado de obesidad, utilización o no de plasma rico en plaquetas, y adicionalmente datos relativos a las variables área susceptible de sufrir fibrosis y/o sexo del sujeto) junto con variables genéticas que comprenden el análisis de uno o varios polimorfismos genéticos de los genes MMP3, NEDD4, SMAD4, así como sus combinaciones con polimorfismos de los genes IL6R, CTGF, IL-6, BMP4, La aplicación de un algoritmo que tiene en cuenta las variables anteriores permite obtener un valor del riesgo de un sujeto de generar fibrosis.
En la bibliografía científica, existen estudios de asociación que determinan por separado la implicación de factores genéticos y ambientales con eventos fibróticos a nivel pulmonar, hepática, articular, u otros. Sin embargo, el algoritmo de la invención tiene en cuenta variables genéticas y ambientales de forma conjunta, que permiten calcular un valor de riesgo específico de cada sujeto.
Los inventores han observado que la aplicación de esta aproximación en pacientes, tiene una sensibilidad y especificidad elevadas, teniendo el método de la invención buena capacidad predictiva, tal y como muestran los análisis de curvas ROC, por sus siglas en inglésReceiver Operating Characteristic,(Figura 1; Tablas 7, 8 y 9).
La presente invención provee así una aproximación innovadora en el área de la Medicina Personalizada con múltiples ventajas asociadas: permite obtener datos de utilidad para conocer el riesgo de un paciente a padecer fibrosis con una sensibilidad y especificidad elevada; permite tomar decisiones o medidas preventivas que puedan evitar dicha condición, lo cual en el caso de que el paciente vaya a ser sometido a cirugía, a su vez puede facilitar una correcta recuperación y/o futuras intervenciones para eliminar la fibrosis generada. Además, también puede tener utilidad a la hora de orientar la aplicación de determinados tratamientos preventivos en función del riesgo identificado en el paciente, como, por ejemplo, ajustar la dieta o aplicar fisioterapia preoperatoria, farmacología oral o técnicas quirúrgicas alternativas, que eviten la generación de fibrosis. Asimismo, permite conocer el riesgo de un paciente a padecer fibrosis postquirúrgica previo a pasar por quirófano.
Método de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un métodoin vitrode obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de sufrir fibrosis de un sujeto, de aquí en adelante "el método de la invención”, que comprende las siguientes etapas:
(a) analizar en una muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos;
(b) recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental, seleccionada de la lista que consiste en: uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad;
(c) asignar un valor p a los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) según la Tabla 3, y asignar un valor p a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) según la Tabla 3; y
(d) calcular un valor P de riesgo a sufrir fibrosis, mediante la aplicación del algoritmo:
en donde,
Po = 3,256
P1x es la suma de todos los valores p asignados en la etapa (c).
El término“in vitro”se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto.
El término “fibrosis” se refiere a un proceso propio del tejido conectivo vascularizado, en el que participan el plasma y las células circulantes y residentes del tejido conectivo, destacando mediadores de la inflamación, granulocitos, macrófagos, plaquetas y células endoteliales, además de los fibroblastos y miofibroblastos entre otros. A nivel celular la fibrosis está caracterizada por la proliferación de los fibroblastos, células abundantes en el tejido conectivo que segregan compuestos como colágeno y proteoglicanos. Del mismo modo, los miofibroblastos, también desempeñan un papel muy importante durante la inflamación, reparación y cicatrización. Tal y como se usa aquí, se refiere a un aumento patológico del tejido conectivo en algún órgano o tejido.
El término “cicatrización”, tal y como se usa aquí, se refiere a un proceso natural que tiene el cuerpo de un sujeto que ha sufrido una herida para regenerar los tejidos comprometidos en la misma. En dicho proceso se llevan a cabo una serie de complejos fenómenos bioquímicos que tienen lugar para reparar el daño causado por la herida. El proceso de cicatrización de la presente invención se refiere, pero no se limita a, cualquier tipo de cicatrización de una herida causada en el cuerpo humano, incluyendo heridas de procesos postquirúrgicos.
En determinadas ocasiones dicho proceso de cicatrización se descontrola dando lugar a procesos fibróticos como la formación de queloides. El término “queloides” , tal y como se usa en el presente documento, se refiere a cicatrices patológicas producidas por una respuesta de cicatrización de la herida aberrante y demasiado exuberante. Los queloides son cicatrices elevadas que se extienden más allá de los márgenes de una herida original e invaden la piel normal que rodea el lugar de la herida. Los queloides pueden seguir creciendo con el tiempo y no remitir espontáneamente. Se puede considerar que una lesión queloide está formada por varias partes diferentes que pueden presentar una actividad biológica muy distinta entre sí. Por lo general, la parte central de una lesión queloide madura (la porción intra-lesional) es en gran parte acelular, mientras que la parte periférica de la lesión (la porción peri-lesional) es relativamente más celular y es el sitio de mayor actividad angiogénica.
En la presente invención, la frase “predecir el riesgo de sufrir fibrosis en un sujeto”, se refiere a determinar o predecir la probabilidad de un sujeto a padecer dicha condición. En la presente invención, la obtención de datos útiles para esta predicción comprende la aplicación de un algoritmo que tiene en cuenta variables ambientales y genéticas, en particular, polimorfismos genéticos.
En la presente invención el algoritmo del método de la invención se considera predictivo cuando la AUCROC (AUC-4reaUnderCurveo área bajo la curva;ROC-Receiver Operating Characteristico característica operativa del receptor) es mayor de 0,5. El AUCROC se define como la probabilidad de clasificar correctamente un par de individuos caso y control, seleccionados al azar de la población, mediante los resultados o valores obtenidos al aplicarles el algoritmo.
El AUCROC por convenio está comprendido entre 0,5 y 1: cuanto más cercano a 1 es el valor AUCROC de una variable, más preciso y predictivo se considera. La sensibilidad de la prueba diagnóstica es la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo tiene la enfermedad o condición, en la presente invención, fibrosis. La especificidad de una prueba indica la probabilidad de obtener un resultado negativo cuando el individuo no tiene la enfermedad o condición, en la presente invención, no desarrolla o sufre fibrosis.
El término "sujeto” en la presente invención, se refiere a cualquier individuo susceptible de sufrir fibrosis, o a cualquier individuo del que se tenga interés en conocer el riesgo a sufrir dicha condición. Los términos "paciente” o "sujeto” se usan en la presente invención de forma indistinta.
En la presente invención, la fibrosis puede afectar a cualquier órgano o tejido del sujeto. Preferiblemente, la fibrosis afecta a una articulación. Más preferiblemente, la fibrosis afecta a una articulación, en donde la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
El método de la invención, además, permite predecir el riesgo de un sujeto a padecer fibrosis postquirúrgica previo a ser sometido a cirugía.
Así, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el sujeto va a ser sometido a cirugía. En otra realización más preferida, la cirugía a la que va a ser sometido el sujeto se realiza en una articulación. Ejemplos de articulaciones, incluyen, sin limitar a, rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo. Así, en otra realización aún más preferida, la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la fibrosis es fibrosis postquirúrgica.
El término "fibrosis postquirúrgica” se refiere al proceso de fibrosis como respuesta a una cirugía (o intervención quirúrgica, términos empleados indistintamente en el presente documento) que comprende un proceso de cicatrización secundaria. Tal y como se usa aquí, se usa para referirse a una condición que comprende una cicatrización excesiva secundaria producida tras una intervención quirúrgica, formándose más tejido fibroso del necesario provocando efectos indeseados que pueden complicar la recuperación del paciente. Ejemplos de efectos indeseados relacionados con dicha fibrosis postquirúrgica incluyen, sin limitar a, la compresión de un nervio por la cicatriz excesiva, que causa dolores al paciente, afectando a su recuperación y a su calidad de vida de quien la padece o la restricción en el rango de movimiento de una articulación tras su intervención quirúrgica.
La fibrosis postquirúrgica, mayormente aparece a nivel articular, lo que conlleva al desarrollo de la artrofibrosis, con el consecuente endurecimiento o agarrotamiento patológico de una articulación debido a una exagerada respuesta fibrótica. Esta puede surgir en grandes articulaciones como hombros, codos, cadera y rodillas, y generalmente causan la perdida de función e inmovilidad de dichas articulaciones. Así, en una realización preferida del método de la invención, la fibrosis postquirúrgica se produce en una articulación. Preferiblemente, la articulación es seleccionada de la lista que consiste en hombro, codo, cadera y rodilla.
Etapa(a) del método de la invención: análisis de los polimorfismos genéticos
Una primera etapa del método de la invención [etapa (a)] comprende analizar en una muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3, rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos;
El término "polimorfismo genético” se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tiene al menos una frecuencia del 1% en los individuos de una población. Los polimorfismos genéticos pueden ser variaciones de uno o varios nucleótidos. Los polimorfismos de un solo nucleótido,“single nucleotide polymorphism”o SNP, generalmente dan lugar a dos alelos.
Los términos “polinudeótido”, “secuencia nudeotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico” y “oligonucleótido” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención, el término “analizar” referido a “polimorfismo/s” genético/s” , se refiere a detectar dicho polimorfismo/s, determinando su genotipo o genotipos.
El polimorfismo genético rs679620 del gen MMP3, se refiere a un SNP situado en la posición 102842889 del cromosoma 11 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 11 dehomosapiens:NC_000011.10). Los genotipos pueden ser homocigoto para adenina (A:A), heterocigoto adenina:guanina (A:G) u homocigoto para guanina (G:G).
El polimorfismo genético rs8032158 del gen NEDD4, se refiere a un SNP situado en la posición 55902679 del cromosoma 15 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 15 dehomo sapiens:NC_000015.10). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:timina (C:T) u homocigoto para timina (T:T).
El polimorfismo genético rs12456284 del gen SMAD4, se refiere a un SNP situado en la posición 51083598 del cromosoma 18 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 18 dehomo sapiens:NC_000018.10). Los genotipos pueden ser homocigoto para adenina (A:A), heterocigoto adenina:guanina (A:G) u homocigoto para guanina (G:G).
En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas del método de la invención, la etapa (a) comprende analizar, al menos, dos polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
En una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar el polimorfismo genético rs12456284 del gen SMAD4 y el polimorfismo genético rs679620 del gen MMP3.
En otra realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar el polimorfismo genético rs8032158 del gen NEDD4 y el polimorfismo genético rs12456284 del gen SMAD4.
En otra realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar el polimorfismo genético rs8032158 del gen NEDD4 y el polimorfismo genético rs679620 del gen MMP3.
En otra realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
En otra realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, rs679620 del gen MMP3, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos. Aún más preferiblemente, los polimorfismos genéticos son rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3
Además del análisis de al menos uno, al menos dos, al menos tres, o tres de los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, o cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, la etapa (a) del método de la invención puede comprender analizar, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en, rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y/o cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
El polimorfismo genético rs2228145 del gen IL6R, se refiere a un SNP situado en la posición 154454494 del cromosoma 1 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 1 dehomo sapiens: NC_000001.11). Los genotipos pueden ser homocigoto para adenina (A:A), heterocigoto adenina:citosina (A:C) u homocigoto para citosina (C:C).
El polimorfismo genético rs9493150 del gen CTGF, se refiere a un SNP situado en la posición 131952851 del cromosoma 6 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 6 dehomo sapiens:NC_000006.12). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:guanina (C:G) u homocigoto para guanina (G:G).
El polimorfismo genético rs1800796 del gen IL-6, se refiere a un SNP situado en la posición 22726627 del cromosoma 7 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 7 dehomo sapiens:NC_000007.14). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:guanina (C:G) u homocigoto para guanina (G:G).
El polimorfismo genético rs17563 del gen BMP4, se refiere a un SNP situado en la posición 53950804 del cromosoma 14 dehomo sapiens(número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 14 dehomo sapiens:NC_000014.9). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:timina (C:T) u homocigoto para timina (T:T).
Así, en una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) además comprende analizar, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) además comprende analizar, al menos, dos, al menos tres, al menos cuatro, polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, incluyendo cualquier combinación de los mismos.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar, al menos, 7 polimorfismos genéticos seleccionados de lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, incluyendo cualquier combinación de los mismos..
En otra realización más preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
En el presente documento se emplea la frase “polimorfismos de la invención” para referirnos a al menos un polimorfismo genético seleccionado de entre los polimorfismos rs679620 del gen MMP3, rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, y/o a cualquier combinación de uno o más de los polimorfismos genéticos anteriores con al menos un polimorfismo genético seleccionado de entre rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, y rs17563 del gen BMP4, incluyendo cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con ellos
En la presente invención, los polimorfismos genéticos son SNPs, por lo que los términos polimorfismos de la invención y SNPs de la invención pueden usarse indistintamente a lo largo del documento.
Los polimorfismos genéticos que pueden ser analizados como parte del método de la presente invención, y que tienen utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto a sufrir fibrosis, se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Polimorfismos genéticos que pueden ser incluidos como variables genotípicas dentro del modelo de predicción.
Por otro lado, cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con ellos, puede ser analizado en la presente invención.
El término “desequilibrio de ligamiento”, se refiere a la propiedad de algunos genes o marcadores de ADN de no segregar de forma independiente, es decir, poseen una frecuencia de recombinación menor del 50%. Esto suele deberse a que los doslociimplicados se encuentran en el mismo cromosoma, lo que imposibilita su transferencia a la progenie de manera aleatoria con la separación de los cromosomas en anafase. En la presente invención, se refiere a aquellos polimorfismos genéticos que debido a su cercanía física en un cromosoma, se presentan juntos de manera más frecuente de lo que se esperaría por azar. Un polimorfismo genético que se encuentren en desequilibrio de ligamiento con otro presenta la misma capacidad o da una información equivalente, en la presente invención, relativa a la predicción de riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, ya que por la propia definición, ambos se heredan en conjunto.
Una medida del desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores genéticos se define como "r2” . Dos polimorfismos genéticos que no han sido separados por recombinación (desequilibrio de ligamiento total), muestran un r2=1. En la presente invención, los polimorfismos que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y/o rs12456284 del gen SMAD4, preferiblemente presentan una medida de desequilibrio de ligamiento r2 > 0,8, más preferiblemente una medida de desequilibrio de ligamiento r2 > 0,9.
El análisis de los polimorfismos de la invención, se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin. Por ejemplo, se puede realizar mediante kits de genotipado, secuenciación o mediante amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y posterior análisis con enzimas de restricción o mediante PCR a tiempo real. Los kits de genotipado pueden contener oligonucleótidos marcados con fluoróforos y puede requerir la hibridación de estos con una muestra biológica aislada de un sujeto.
Así, en el método de la invención, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a), se lleva a cabo por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, se lleva a cabo mediante amplificación, más preferiblemente amplificación PCR, y/o secuenciación
En otra realización preferida del método de la invención, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a), se lleva a cabo usando un kit de genotipado.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a) comprende el empleo de sondas y/o cebadores que detectan y/o amplifican dichos polimorfismos.
En una realización más preferida, los cebadores y/o sondas comprenden, o consisten en, las secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y/o cualquier combinación de ellos.
SEQ ID NO: 1
CCATATTCTCCTCTTCCTCCTCTATCTTCA
SEQ ID NO: 2
CTCCAGCAACCAGGAATGTG
Las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2, corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs2228145 del gen IL6R.
SEQ ID NO: 3
GGGCAGTGGTACTGAAGAAGAAT
SEQ ID NO: 4
GGGCAGTGGTACTGAAGAAGAAG
Las secuencias SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO: 4 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs2228145 del gen IL6R.
SEQ ID NO: 5
ACTTATTCTGTTAGAAATATCTAGAAAACTACTACGACCT
SEQ ID NO: 6
ACAACAGGACCACTGTCCTT
Las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs679620 del gen MMP3.
SEQ ID NO: 7
TCTCCTAACAAACTGTTTCACATCTTTTTT
SEQ ID NO: 8
TCTCCTAACAAACTGTTTCACATCTTTTTC
Las secuencias SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs679620 del gen MMP3.
SEQ ID NO: 9
AAATGATAAATCTATAATGCATTGTTTCTAAAGCCGAT
SEQ ID NO: 10
TGTTGATGCTTCAGAGCATGG
Las secuencias SEQ ID NO: 9 y 10 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs9493150 del gen CTGF.
SEQ ID NO: 11
CATGGGTTCAAGATAAGCATATCTGTTTC
SEQ ID NO: 12
CATGGGTTCAAGATAAGCATATCTGTTTG
Las secuencias SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs9493150 del gen CTGF.
SEQ ID NO: 13
CTGTGTTCTGGCTCTCCCTGT
SEQ ID NO: 14
GCCTTGAAGTAACTGCACGAAATT
Las secuencias SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs1800796 del gen IL-6.
SEQ ID NO: 15
AGGCAGTTCTACAACAGCCC
SEQ ID NO: 16
AGGCAGTTCTACAACAGCCG
Las secuencias SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs1800796 del gen IL-6.
SEQ ID NO: 17
CCACCTGCTCCCGGAAGA
SEQ ID NO: 18
CGTTTCCTCTTTAACCTCAGCA
Las secuencias SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs17563 del gen BMP4.
SEQ ID NO: 19
GCATCCCTGAGAACGAGGC
SEQ ID NO: 20
GCATCCCTGAGAACGAGGT
Las secuencias SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs17563 del gen BMP4.
SEQ ID NO: 21
TGAATTTCATCCTTAAGTTCTTTTTATTTAATAAATGTTA
SEQ ID NO: 22
GTGTATGTTTGAAATTTTCCCTAACGAA
Las secuencias SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4.
SEQ ID NO: 23
TTTAAAATATTTGGGAAAAAACTAGCTTATAATAAC
SEQ ID NO: 24
TTTAAAATATTTGGGAAAAAACTAGCTTATAATAAT
Las secuencias SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4.
SEQ ID NO: 25
GGCCCAACCCAGAGCCATTA
SEQ ID NO: 26
CACACCGTTTATTTAAATGCTTTCTCA
Las secuencias SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4.
SEQ ID NO: 27
CCAGAGCCAGTGTTCTTGTTCA
SEQ ID NO: 28
CAGAGCCAGTGTTCTTGTTCG
Las secuencias SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4.
En una realización más preferida, el análisis de los polimorfismos llevado a cabo en la etapa (a) comprende empleo de sondas que detectan los polimorfismos de la invención. Preferiblemente, las sondas que detectan dichos polimorfismos se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y cualquier combinación de ellos.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a) comprende el empleo de sondas de hibridación marcadas con fluoróforos.
El término “secuenciación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la determinación de los nucleótidos de un ácido nucleico molde y de su orden.
El término “amplificación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al aumento del número de copias de un ácido nucleico molde, donde ésta puede ser realizada utilizando sondas fluorescentes. En una realización preferida, la amplificación tiene lugar mediante PCR a tiempo real.
El término “ácido nucleico molde” o “molde”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser amplificada o secuenciada.
El aumento del número de copias de un ácido nucleico molde se realiza por síntesis de ADN complementario mediante unas condiciones que lo permitan. Las condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario se refiere a las condiciones en las que puede tener lugar la incorporación de los nucleótidos a un ADN naciente mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde.
Las condiciones en las cuáles se realiza la secuenciación o la amplificación generalmente incluyen (a) poner en contacto un ácido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, (por ejemplo, Mg2+), y nucleótidos, generalmente, dNTPs y, al menos, un ddNTP, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar la secuencia de nucleótidos.
El término "cebador” , como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando hibrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa. Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
El término "cebador específico” , tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un cebador cuya secuencia es complementaria a una secuencia específica de nucleótidos en el ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar.
El término "cebador arbitrario” se refiere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar. Con frecuencia se emplea una población de distintos cebadores arbitrarios. El término "cebadores arbitrarios” se refiere a un conjunto de cebadores cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar.
El término "hibridación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al apareamiento de dos moléculas de ADN de cadena simple complementarias para dar una molécula de doble cadena. Preferiblemente, la complementariedad es del 100%. Esto es, en la región de complementariedad cada nucleótido de una de las dos moléculas de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en la otra molécula de ácido nucleico. Sin embargo, aquéllos con una experiencia normal en el campo reconocerán que dos moléculas de ácido nucleico que posean una región con complementariedad menor al 100% también pueden hibridar.
El término “nucleótido” , tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una molécula orgánica formada por la unión covalente de una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. El término nucleótido incluye desoxirribonucleósidos trifosfato como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. El término nucleótido incluye también dideoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTPs), como por ejemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP o derivados de los mismos.
De acuerdo con la presente invención un “nucleótido” o un “cebador” puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas.
El término “muestra biológica” en la presente invención se refiere a cualquier muestra que permita obtener ADN del individuo del que se ha obtenido dicha muestra, e incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin.
Así, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra biológica procede de cualquier tejido susceptible de una extracción de ADN. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, un tejido o una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, mucosa oral, lavado broncoalveolar, linfa o fluido ascítico. En una realización más preferida, la muestra biológica es seleccionada de la lista que consiste en tejido, mucosa oral, sangre, plasma, suero y linfa. Asimismo, la muestra biológica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.
Etapa(b) del método de la invención: Recoger datos del sujeto
Como se ha explicado previamente, el algoritmo empleado en el método de la invención que tiene utilidad y permite predecir el riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, se basa en la utilización de variables genómicas junto con variables ambientales de cada sujeto. Para ello, por tanto, es necesario recoger datos relativos a dichas variables ambientales del sujeto.
Así, una segunda etapa del método de la invención [etapa (b)] comprende recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en: uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad.
En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de dos variables ambientales, en donde las variables ambientales son uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad.
Además de recoger datos del sujeto de, al menos una, variable ambiental seleccionada entre uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, y grado de obesidad, o datos de ambas, la etapa (b) del método de la invención puede comprender adicionalmente recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto, que son variables ambientales que también pueden tener utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis.
Así, en una realización preferida del método de la invención, la etapa (b) además comprende recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
En una realización más preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad, área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
La frase "recoger datos del sujeto”, se refiere a la recolección y/o registro de los datos relativos a variables ambientales. Como entiende un experto en la materia, dicha recogida de datos puede realizarse mediante cualquier metodología o protocolo seguido por los profesionales sanitarios.
En la Tabla 2 se muestran los datos del sujeto que pueden ser recogidos en la etapa (b) del método de la invención.
Tabla 2. Datos del sujeto que pueden ser recogidos en la etapa (b) del método, y sus respectivas variables ambientales. En la columna izquierda se muestran las variables ambientales, mientras que en la columna derecha se muestra cada uno de los posibles datos a recoger del sujeto para cada variable.
Así, en la presente invención, el dato recogido de la variable ambiental grado de obesidad es IMC ≤30, IMC >30, porcentaje de masa grasa > 25% (hombres), o porcentaje de masa grasa > 33% (mujeres).
El dato recogido de la variable ambiental uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto es uso o no uso.
El dato recogido de la variable ambiental sexo del sujeto es hombre o mujer.
El dato recogido de la variable ambiental área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis es rodilla, tobillo, cadera, hombro, codo, u otra/s.
Así, en una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto, en donde los datos comprenden:
- área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis, en donde área del cuerpo es seleccionado de la lista que consiste en cadera, hombro, rodilla, tobillo u otra, incluyendo el término "otra” , cualquier otra parte, tejido u órgano del cuerpo del sujeto;
- sexo masculino o femenino del sujeto;
- uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto; y/o
-grado de obesidad, en donde preferiblemente, el grado de obesidad comprende un índice de masa corporal del sujeto mayor a 30 o menor o igual a 30; y/o un porcentaje de masa grasa mayor al 25% o menor o igual a 25% en hombres, o un porcentaje de masa grasa mayor al 33% o menor o igual a 33% en mujeres.
En el presente documento, se entiende por "área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis” , a la localización, tejido, órgano o parte del cuerpo del sujeto que puede ser susceptible de sufrir fibrosis. Así, en la presente invención, uno de los posibles datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método de la invención es si el área del cuerpo, localización o tejido susceptible a sufrir fibrosis es cadera, hombro, rodilla, tobillo u otra, incluyendo el término "otra” cualquier otra parte, tejido u órgano del cuerpo del sujeto. Tal y como se usa aquí, la frase "otra parte del cuerpo” , se refiere a cualquier órgano, tejido, o área del cuerpo del sujeto distinto de cadera, hombro, rodilla, tobillo.
En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis es el tejido u órgano del sujeto donde se realiza la cirugía.
Otro de los datos posibles recogidos del sujeto en esta etapa (b) del método de la invención es si el sexo del sujeto es masculino o femenino.
En la presente invención, otro de los posibles datos recogidos del sujeto en la etapa (b) es el uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto. Tal y como se usa aquí, el "plasma rico en plaquetas” (o PRP), es de tipo 13-00-11/24-00-11 como se describe en Kon E.,etal.,Expert Opin Biol Ther., 20 (12):1447-1460 (2020).
En la etapa (b) del método de la invención, otro de los posibles datos recogidos del sujeto tiene que ver con el grado de obesidad del sujeto, entendiendo éste como un índice de masa corporal mayor a 30 (IMC ≤30), o menor o igual a 30 (IMC ≤30) o un porcentaje de masa grasa superior al 25% en hombres o menor o igual a 25%, y mayor al 33% en mujeres o menor o igual a 33%. El "índice de masa corporal” (o IMC) de un sujeto, en la presente invención un sujeto, se define como el cociente del peso en kilogramos del sujeto y el cuadrado de su altura en metros. El "porcentaje de grasa corporal” se puede calcular a través de impedancia bioeléctrica o por pliegues cutáneos mediante plicómetría.
Etapa(c) del método de la invención: asignar un valor B a los polimorfismos y datos del sujeto
Como ya se ha mencionado, el método de la invención tiene en cuenta variables genéticas y variables ambientales de cada sujeto. Previamente a la aplicación del algoritmo de la invención, se asigna un valor, en la presente invención valor p, a los polimorfismos analizados en la etapa (a), y a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método de la invención.
Así, una tercera etapa del método de la invención, la etapa (c), comprende asignar un valor p a los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) según la Tabla 3, y asignar un valor p a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) según la Tabla 3.
Tabla 3. Valores de p específicos para cada posibilidad de las variables analizadas. En el caso de los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) del método, un valor p es asignado para cada polimorfismo (según el genotipo del sujeto para ese polimorfismo). En el caso de los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método, un valor p es asignado para cada dato recogido.
Así, en el caso de los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) del método, para cada polimorfismo, según el genotipo del sujeto, se asigna un valor p. En el caso de los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método, un valor p es asignado para cada dato recogido.
El sumatorio de los valores p asignados en esta etapa (c) del método de la invención, constituye el valor Pix que forma parte del algoritmo aplicado en la siguiente etapa del método de la invención.
Etapa(d) del método de la invención: Cálculo del valor P mediante la aplicación de un algoritmo
La siguiente etapa del método de la invención, la etapa (d), comprende calcular un valor P de riesgo a sufrir fibrosis, mediante la aplicación del algoritmo:
en donde,
Po = 3,256
Pix es la suma de todos los valores P asignados en la etapa (c),
Este algoritmo, de aquí en adelante el algoritmo de la invención, relaciona el riesgo de un sujeto a sufrir fibrosis, según los polimorfismos genéticos previamente analizados y datos de las variables ambientales previamente recogidos del sujeto, a través de Pix.
Pix, es la suma de todos los valores P asignados en la etapa (c) a cada una de las variables: a cada polimorfismo analizado en la etapa (a) del método de la invención, en función del genotipo, se asigna un valor P según la Tabla 3; a cada dato recogido del sujeto en la etapa (b) del método de la invención, se asigna también un valor P según la Tabla 3. La suma de todos los valores P, constituye el valor Pix comprendido en el algoritmo de la invención.
La aplicación del algoritmo de la invención permite calcular el valor P de riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis. En la presente invención, el "valor P de riesgo de sufrir fibrosis” (también denominado, "valor de riesgo específico a generar fibrosis” , o "valor P” a secas, términos usados indistintamente en la presente invención), se refiere al riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis. El valor calculado está en tanto por uno, y puede ser también interpretado en términos de porcentaje, multiplicando el valor calculado por 100. Así, el método de la invención permite predecir el riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis.
Kit de la invención y sus usos
La puesta en práctica del método de la invención se fundamenta además de en la recolección de datos ambientales relativos al sujeto, en el análisis de polimorfismos genéticos, los polimorfismos de la invención. Los medios empleados para el análisis de dichos polimorfismos genéticos pueden estar formando parte de un kit.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante el "kit de la invención” , que comprende los medios para analizarin vitroen una muestra biológica aislada de un sujeto, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
Adicionalmente, el kit de la invención puede además comprender los medios para analizarin vitroal menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos. Así, en una realización preferida, el kit de la invención además comprende los medios para analizarin vitroen la muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
Más preferiblemente, el kit de la invención comprende los medios para analizarin vitroen una muestra biológica aislada del sujeto, los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra biológica procede de cualquier tejido susceptible de una extracción de ADN. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, un tejido o una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, mucosa oral, lavado broncoalveolar, linfa o fluido ascítico. En una realización más preferida, la muestra biológica es seleccionada de la lista que consiste en tejido, mucosa oral, sangre, plasma, suero y linfa
En la presente invención se entiende por "medios para analizarin vitrolos polimorfismos genéticos”, todos aquellos reactivos necesarios para analizarin vitrolos polimorfismos de la invención (cebadores, sondas, tampones, enzimas, coenzimas, sustratos). Por otro lado, los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización (tubos de plásticos, placas, reactivos, etc.). Los kits pueden contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos.
Como sabe un experto en la materia, los polimorfismos genéticos pueden analizarse mediante técnicas y métodos conocidos en el estado de la técnica, incluyendo técnicas y métodos diferentes a los aquí presentados. Estos métodos y técnicas se han explicado en el aspecto inventivo anterior, y tanto ellas como sus realizaciones preferidas, son aplicables al kit de la invención.
En una realización preferida del kit de la invención, los medios para analizarin vitrolos polimorfismos de la invención comprenden los reactivos necesarios para llevar a cabo la técnica de amplificación, preferiblemente PCR, y/o secuenciación.
En otra realización preferida del kit de la invención, los medios para analizarin vitrolos polimorfismos de la invención comprenden cebadores y/o sondas que detectan de forma específica dichos polimorfismos genéticos.
En una realización más preferida del kit de la invención, los cebadores y/o sondas comprenden, o consisten en, las secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y/o cualquier combinación de ellos.
Más preferiblemente, los medios comprenden sondas que detectan de forma específica los polimorfismos de la invención. Aún más preferiblemente, las sondas que detectan dichos polimorfismos se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y cualquier combinación de ellos.
Preferiblemente, los kits comprenden además las instrucciones para llevar a cabo el análisis de los polimorfismos de la invención y/o el método de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
El kit de la invención, que comprende los medios para analizarin vitrolos polimorfismos de la invención, tiene utilidad en el método de la invención. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención en el método de la invención.
Los términos empleados para definir el kit y uso del kit de la invención han sido explicados para el método de la invención, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas son aplicables también para el kit de la invención y su uso en el método de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variables los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto, en la cual cada punto de la gráfica muestra un posible punto de corte para el modelo en el cual informa sobre su sensibilidad concreta en ese punto (eje Y) con respecto a su 1- especificidad (eje X). Diagonalmente en el gráfico (desde 0,0 hasta 1,1) se representa la línea diagonal de referencia o línea de no discriminación. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 2. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 3. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 4. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 5. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 6. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 7. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 8. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 9. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 10. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3. y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 11. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 12. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 13. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 14. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 15. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la invención, incluyendo un ejemplo de la aplicación del método de la invención en la predicción del riesgo de un sujeto a sufrir fibrosis.
1. Metodología
Se seleccionaron un total de 240 pacientes que habían sido operados por el equipo de traumatología de la Unidad de Cirugía Artroscópica del doctor Mikel Sanchez. A todos ellos se les tomo una muestra de frotis bucal mediante los hisopos 4N6FLOQSwab-Life Technologies. El ADN de las muestras fue extraído mediante QIAmp DNA Mini kit (Qiagen), y cuantificado fluorimétricamente utilizando Qubit (Life Technologies). Las muestras de ADN resultantes fueron analizadas mediante un análisis de genotipado de SNPs (polimorfismos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4) utilizando la metodología Biomark HD system (Fluidigm). Los pacientes fueron categorizados teniendo en cuenta los siguientes factores ambientales:
- Tejido operado: cadera, hombro, rodilla, tobillo u otros
- sexo masculino o femenino del paciente;
- uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del paciente. Tal y como se usa aquí, el "plasma rico en plaquetas” (o PRP), es de tipo 13-00-11/24-00-11 como se describe en Kon E., et al., Expert Opin Biol Ther., 20 (12):1447-1460 (2020).
-grado de obesidad: considerándolo como un índice de masa corporal del paciente mayor a 30, o menor o igual a 30. Peso y talla se midieron estando el sujeto en ropa interior con una báscula- con una precisión de 100 gramos (peso) y 1 mm (talla). El cálculo del índice de masa corporal se realizó a través de la fórmula IMC (Kg/m2)= Peso (Kg)/(Talla (m))2.
A partir de los datos relativos a los factores ambientales, y los polimorfismos genéticos ambientales, los inventores aplicaron el siguiente algoritmo para la obtención del riesgo específico a generar fibrosis (denominado como P o valor P):
en donde,
P0= 3,256
p1x es la suma de todos los valores p asignados según la Tabla 3, previamente mostrada en el presente documento.
Así, tomando como ejemplo el caso de un paciente varón que presentaba lesión en su ligamento cruzado de la rodilla derecha, siendo un área susceptible a sufrir fibrosis posquirúrgica, para el cual se recogieron los siguientes datos:
Peso = 83kg
Altura: 1.70 m
IMC= 83 / (1.70)2= 28.71
Sexo: hombre
Área susceptible a sufrir fibrosis: Rodilla.
Utilización de (PRGF®-Endoret®): Si
Además, se realizó un perfil genético para los rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, obteniendo el siguiente perfil genético:
rs2228145 = A:C
rs679620 = A:A
rs9493150 = C:G
rs1800796 = G:G
rs17563 = C:T
rs8032158 = C:C
rs12456284 = A:A
Una vez obtenidos los datos, se obtuvo el valor de p para cada uno, y se sumaron todas las p para obtener el valor Pix. Dicho valor, así como la asignación de cada valor p (según la Tabla 3 previamente mostrada en el presente documento) viene representado en la Tabla 4.
Tabla 4. Valores p para las variables recogidas para el paciente problema.
p
Una vez obtenido el valor Pix = -5,561 y teniendo en cuenta que Po= 3,256, se reemplazan las variables con dichos valores en la fórmula:
obteniendo como resultado una P=0,090, es decir un riesgo del 9,00% de sufrir fibrosis.
2. Resultados
Siguiendo una metodología como la explicada anteriormente en pacientes, se aplicó en el algoritmo de la invención, es decir:
teniendo en cuenta diferentes variables genéticas y ambientales, realizándose para cada caso un análisis ROC.
2.1. Análisis ROC teniendo en cuenta los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
Se realizó un análisis ROC (Fig. 1), estableciendo el riego de 50,90% de sufrir fibrosis como punto de corte para clasificar al sujeto o paciente en cuestión como de alto o bajo riesgo de desarrollar fibrosis. Así, si el valor P calculado para el sujeto es mayor a 0,509, el sujeto es clasificado como de alto riesgo de sufrir fibrosis, mientras que si el valor P es menor a 0,509, el sujeto es clasificado como de bajo riesgo de sufrir fibrosis. Tomando el caso ejemplo del paciente varón para el que se obtuvo una P=0,090, dicho valor es netamente inferior al punto de corte seleccionado 0,509, por tanto, dicho paciente tiene bajo riesgo de desarrollar fibrosis.
El modelo mostró unos valores de Sensibilidad del: 74.8% y de especificidad del 73.6%. A continuación, se muestra una tabla de clasificación de los pacientes "Observado” frente a lo "Pronosticado” por el modelo (siendo ,00 no fibrosis y 1,00 si fibrosis) (Tabla 5).
Tabla 5. Tabla de clasificación de los pacientesa
En la Tabla 6, se ofrece el valor del área bajo la curva para el modelo, con una AUC (area under the curve)de 0,818 y su intervalo de confianza 95% (IC 95%) fue 0,766 0,871.
Tabla 6. Área bajo la curva
V i bl d lt d d b P b bilid d ti d
Las variables de resultado de prueba: Probabilidad pronosticada tienen, como
mínimo, un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Las estadísticas podrían estar sesgadas.
a. Bajo el supuesto no paramétrico
b. Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
2.2. Análisis ROC teniendo en cuenta 2, 3 y 4 variables.
Además del análisis ROC teniendo en cuenta todas las variables genéticas y ambientales del apartado anterior, se llevaron a cabo análisis ROC teniendo en cuenta un menor número de variables, demostrando que también tienen utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, tal y como muestran los resultados obtenidos y resumidos en la Tabla 7, Tabla 8 y Tabla 9.
Tabla 7. Resumen de los resultados arrojados por el análisis ROC (2 variables) en función de las variables genéticas y ambientales tenidas en cuenta a la hora de aplicar el algoritmo.
La Fig. 2 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 3 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 4 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 5 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 6 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 7 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el grado de obesidad.
Tabla 8. Resumen de los resultados arrojados por el análisis ROC (3 variables) en función de las variables genéticas y ambientales tenidas en cuenta a la hora de aplicar el algoritmo.
La Fig. 8 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 9 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 10 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3. y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 11 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 12 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 13 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad.
Tabla 9. Resumen de los resultados arrojados por el análisis ROC (4 variables) en función de las variables genéticas y ambientales tenidas en cuenta a la hora de aplicar el algoritmo.
La Fig. 14 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 15 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad.
Claims (24)
- REIVINDICACIONES 1. Un métodoin vitrode obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de sufrir fibrosis de un sujeto, que comprende las siguientes etapas: (a) analizar en una muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos; (b) recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental, seleccionada de la lista que consiste en: uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad; (c) asignar un valor p a los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) según la Tabla 3, y asignar un valor p a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) según la Tabla 3; y (d) calcular un valor P de riesgo a sufrir fibrosis, mediante la aplicación del algoritmo:en donde, Po = 3,256 Pix es la suma de todos los valores p asignados en la etapa (c).
- 2. El método según la reivindicación 1, en donde la etapa (a) comprende analizar, al menos, dos polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
- 3. El método según la reivindicación 2, en donde la etapa (a) comprende analizar, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3, rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
- 4. El método según la reivindicación 3, en donde la etapa (a) comprende analizar tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, rs679620 del gen MMP3, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
- 5. El método según la reivindicación 4, en donde los polimorfismos genéticos son rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3.
- 6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa (a) además comprende analizar, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
- 7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa (a) comprende analizar los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
- 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de dos variables ambientales, en donde las variables ambientales son uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad.
- 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa (b) además comprende recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
- 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad, área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
- 11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la fibrosis afecta a una articulación.
- 12. El método según la reivindicación 11, en donde la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
- 13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la fibrosis es fibrosis postquirúrgica.
- 14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el sujeto va a ser sometido a una cirugía.
- 15. El método según la reivindicación 14, en donde la cirugía se realiza en una articulación.
- 16. El método según la reivindicación 15, en donde la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
- 17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la muestra biológica procede de cualquier tejido susceptible de una extracción de ADN.
- 18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el análisis de los polimorfismos que se lleva a cabo en la etapa (a) comprende el empleo de sondas que detectan dichos polimorfismos.
- 19. El método según la reivindicación 18, en donde las sondas se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y cualquier combinación de ellos.
- 20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el análisis de los polimorfismos se lleva a cabo en la etapa (a) mediante PCR y/o secuenciación.
- 21. Kit que comprende los medios para analizarin vitroen una muestra biológica aislada de un sujeto, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
- 22. Kit según la reivindicación 21, que además comprende los medios para analizarin vitroen la muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
- 23. Kit según la reivindicación 22, que comprende los medios para analizarin vitroen una muestra biológica aislada del sujeto, los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
- 24. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
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