JP6968894B2 - メチル化dnaの多重検出方法 - Google Patents
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Description
(1)メチル化特異PCR (methylation specific PCR)
前記メチル化特異PCRによりメチル化を検出するためにゲノムDNAにバイサルファイトを処理すると、5’−CpG’−3部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンで残っており、非メチル化された場合にはウラシルに変わることになる。従って、バイサルファイト処理後変換された塩基配列を対象に、5’−CpG−3’塩基配列が存在する部位に該当するPCRプライマーを作製した。プライマーを利用してPCRを行うと、メチル化された場合にはメチル化された塩基配列に該当するプライマーを使ったものからPCR産物が作られることになり、メチル化の有無は、アガロースゲル電気泳動方法で定性的に確認することができる。ここで、前記メチル化 検出プローブは、TaqManプローブ、分子ビーコンプローブ(molecular beacon probe)、または自己レポーティング(self−reporting)機能またはエネルギー転移標識機能を有するプローブであってもよいが、これに制限されるものではない。
リアルタイムメチル化特異PCRは、メチル化特異PCR方法をリアルタイム測定方法に変換したもので、ゲノムDNAにバイサルファイトを処理した後、メチル化されたケースに該当するPCRプライマーをデザインし、これらプライマーを利用してリアルタイムPCRを行うことである。この時、増幅された塩基配列と相補的なTanManプローブを利用して検出する方法とmSybergreenを利用して検出する方法の二方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異PCRは、メチル化されたDNAだけを選択的に定量分析することができる。この時、in vitro methylated DNAサンプルを利用して標準曲線を作成して、標準化のために塩基配列内に5'−CpG−3'配列がない遺伝子を陰性対照群として共に増幅してメチル化程度を定量分析した。
メチル化DNA特異的結合蛋白質を利用したPCRまたはDNAチップアッセ方法は、メチル化DNAにだけ特異的に結合する蛋白質をDNAと混ぜると、メチル化DNAにだけ特異的に蛋白質が結合するため、メチル化DNAだけを選択的に分離することができる。
メチル化CpGを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを修飾させる製剤と接触させる段階及びCpG−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使って試料のCpG−含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化及び非メチル化核酸を区別してメチル化核酸を検出することを特徴とする。前記増幅段階は、選択的であり、好ましいが必須ではない。前記方法は、修飾された(例えば、化学的に修飾された)メチル化及び非メチル化DNAを区別するPCR反応に依存するものである。
メチル化CpGを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを修飾させる製剤と接触させる段階及びメチル化に非依存的な(methylation independent)オリゴヌクレオチドプライマーを使って試料のCpG−含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化及び非メチル化核酸を区別して核酸を増幅することを特徴とする。
前記増幅された産物は、シーケンスプライマーを用いてサンガー法によるシーケンシングするか、あるいは、メチル化核酸の検出のためのバイサルファイト( bisulfite)シーケンスと関連された次世代シーケンシング方法によるシーケンシングされてもよい。
ヒト大腸癌細胞株であるHCT116、SW480、およびHT−29細胞株を韓国細胞株バンク(ソウル、韓国)から購入し、10%のウシ胎児血清(JBI, Seoul, South Korea)、ペニシリン、およびストレプトマイシンが含まれたRPMI1640培地(JBI, Seoul, South Korea)と、37℃、5%の二酸化炭素培養器で培養した。
SDC2遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、SDC2遺伝子の全CpG島を代弁することができる18セットのメチル化特異的検出プライマーおよびプローブを設計し(表3)、LTE−qMSPを行った。そのために、健常者25名および大腸癌患者25名の大便からゲノムDNAを分離(QIAamp DNA Stool Mini kit, Qiagen)し、前記ゲノムDNAを、EZ DNA methylation−Gold kit(Zymo Research, USA)を用いてバイサルファイトで処理した後、滅菌蒸留水10μlで溶出してLTE−qMSP(Linear Target Enrichment-Methylation-specific real time PCR)に使用した。バイサルファイトで処理されたゲノムDNAを鋳型とし、表3で設計したメチル化ターゲット特異的配列(R)を用いて一方向に線形増幅(LTE)を行った(図3)。LTE反応は、Rotor−Gene Q PCR装備(Qiagen)を用いて、総20μlのPCR反応溶液(鋳型DNA、10μl;5X AptaTaq DNA Master(Roche Diagnostics)、4μl;COL2A1ターゲット特異的配列、1μl(1 pmole);SDC2ターゲット特異的配列、1μl(1 pmole);D.W.4μl)を準備し、PCR条件を、95℃、5分処理後、95℃で15秒、60℃で1分として、総35回行った。
実施例1に記載の方法により、セット6に対するLTE−qMSP方法とqMSP方法の検出敏感度を比較した。その結果、従来の方法は、200pgのDNAでは100%の検出率を示したが、20pgでは37.5%および10pgでは0%の検出率を示したのに対し、本発明の方法は、200pg−20pgまでは何れも100%の検出率を示し、10pgでも33.3%の検出率を示すことを確認した(図4aおよび表4)。
実施例1に記載の方法により、セット17に対するLTE−qMSP方法とqMSP方法の検出敏感度を比較した。その結果、qMSP方法は、200pgのDNAでは100%の検出率を示したが、20pgでは45.0%および10pgでは0%の検出率を示したのに対し、本発明の方法は、200pg−100pgまでは何れも100%の検出率を示し、20pgで91.7%、そして10pgでも29.2%の検出率を示すことを確認した(図4bおよび表5)。
表3中の各サンプルのメチル化程度はCt値で測定し、ROC curve分析(MedCalcプログラム、ベルギー)により、各プライマーおよびプローブセットの敏感度および特異度を計算した(表6)。
Claims (27)
- 次のステップを含む DNAのメチル化状態を検出する方法:
(a)バイサルファイトで、ターゲットDNAが含まれているサンプルを処理するステップと、
(b)バイサルファイトで処理されたターゲットDNA配列に相補的に結合するように設計されたターゲット特異的配列、およびターゲットDNAに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを含むリバースプライマーであって、前記ユニバーサルプライマーは、ターゲット特異的配列の5’末端に結合するリバースプライマーを作製するステップと、
(c)前記(b)ステップで作製されたリバースプライマーをプライマーとして用い、前記(a)ステップでバイサルファイトで処理されたターゲットDNAを鋳型として用いて、単一方向PCRにより一方向に(asymmetric)線形増幅するステップと、
(d)前記(c)ステップで線形増幅されたDNAに相補的に結合できるフォワードプライマーおよび前記線形増幅されたターゲットDNAに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを用いてターゲットDNAを増幅するステップと、
(e)前記(d)ステップで増幅されたターゲットDNA配列に相補的にハイブリダイズできるプローブを用いてターゲットDNAのメチル化を検出するステップ。 - 前記バイサルファイト処理によって少なくとも一つのシトシン塩基がウラシルにまたはシトシンと異なる塩基に変換されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 単一反応器内のサンプルの複数のターゲットDNAのメチル化を検出することを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ユニバーサルプライマーは、配列番号7、および35〜41で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)のターゲット特異的配列は、ターゲットDNAのメチル化部位および/または非メチル化部位に相補的に結合することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)のターゲット特異的配列は、一つ以上のCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)のターゲット特異的配列は、SDC2と相補的に結合することが可能であり、配列番号2、5、9、14、17、21、および26で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(e)のメチル化検出は、PCR、メチル化特異PCR (methylation specific PCR)、 リアルタイムメチル化特異PCR(real time methylation specific PCR)、メチル化DNA特異的結合蛋白質を利用したPCR、メチル化DNA特異的結合抗体を利用したPCR、定量PCR、遺伝子チップ、シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス(Sequencing-by-synthesis)、および シーケンシングバイライゲーション(Sequencing-by-ligation)で構成された群から選択される方法により行われることを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(d)のフォワードプライマーは、一つ以上のCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(d)のフォワードプライマーは、SDC2と相補的に結合することが可能であり、配列番号1、4、8、10〜13、15、16、18〜20、22〜25、27、および28で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(e)のプローブは、一つ以上のCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(e)のプローブは、SDC2と相補的にハイブリダイズすることが可能であり、配列番号3、6、29、30、および31〜34で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(e)のプローブは、リポーター(reporter)または消光剤(quencher)をさらに含むことを特徴とする請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(d)のオリゴヌクレオチドおよびステップ(d)のユニバーサルプライマーは、自己レポーティング(self−reporting)機能を有するか、またはエネルギー転移標識されたことを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リポーターは、FAM(6-carboxyfluorescein)、Texas red、HEX(2'、4'、5'、7'、-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)、JOE、Cy3及びCy5で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記消光剤は、TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine)、BHQ1、BHQ2及びDabcylで構成
される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項13に記載の方法。 - バイサルファイトと、
メチル化されたDNAから区別される非メチル化DNAを変形させるバイサルファイトで処理されたターゲットDNA配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列およびターゲット特異的配列の5’末端に融合した、ターゲットDNAにハイブリダイズしないユニバーサルプライマーを含むリバースプライマーと、
線形増幅されたターゲットDNAに相補的に結合できるフォワードプライマーおよび線形増幅されたターゲットDNAに相補的でないユニバーサルプライマーと、
前記増幅されたターゲットDNA配列に相補的にハイブリダイズできるプローブと、を含む、メチル化DNA検出用組成物。 - 単一反応器内のサンプルの複数のターゲットDNAのメチル化を検出することを特徴とする請求項17に記載の組成物。
- 前記ユニバーサルプライマーは、配列番号7、および35〜41で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項17又は18に記載の組成物。
- 前記前記ターゲット特異的配列は、ターゲットDNAのメチル化部位および/またはターゲットDNAの非メチル化部位に相補的に結合することを特徴とする請求項17〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記前記ターゲット特異的配列は、一つ以上のCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項17〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ターゲット特異的配列は、SDC2と相補的に結合することが可能であり、配列番号2、5、9、14、17、21、および26で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項17〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、一つ以上のCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項17〜22のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、SDC2と相補的に結合することが可能であり、配列番号1、4、8、10〜13、15、16、18〜20、22〜25、27、および28で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項17〜23のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記プローブは、一つ以上のCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項17〜24のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記プローブは、SDC2と相補的にハイブリダイズすることが可能であり、配列番号3、6、29、30、および31〜34で構成された群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項17〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項17〜26のいずれか一項に記載の組成物を含む、メチル化DNAの検出用キット。
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