ES2950789T3 - Polipéptidos de apelina - Google Patents

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Alexander J Pickrell
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Lewis D Pennington
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Abstract

La invención proporciona polipéptidos de apelina modificados que tienen mayor estabilidad, vida media circulante y/o potencia en relación con el polipéptido de apelina-13 nativo. También se describen composiciones que comprenden los polipéptidos de apelina modificados y métodos para usar los polipéptidos para tratar trastornos cardíacos, tales como insuficiencia cardíaca. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de apelina
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/010.322, presentada el 10 de junio de 2014.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La solicitud se refiere a agonistas del receptor de APJ que tienen elevada estabilidad, semivida en circulación y/o potencia con respecto a la apelina nativa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La apelina es el ligando endógeno del receptor de APJ (APLNR, 1 similar al receptor de angiotensina). El receptor APJ es un miembro de la familia del receptor acoplado a proteína G (GPCR) similar a rodopsina. El sistema apelina/APJ se ha observado en muchos tejidos, tales como el corazón, el riñón, el páncreas, el pulmón y el sistema nervioso central, lo que indica diversas funciones del sistema en la fisiología y la patología de los mamíferos.
Los péptidos de apelina se procesan a partir de una forma pre-pro de 77 residuos en fragmentos bioactivos más pequeños, principalmente una forma de 36 residuos (apelina 42-77- también denominada apelina-36) y un polipéptido de 13 residuos más pequeño (apelina 65-77- también denominada apelina-13) (Hosoya et al., J. Biol. Chem.
275:21061 -21067, 2000). Se determinó previamente que los péptidos de apelina eran ligandos endógenos del receptor de APJ huérfano, un miembro de la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G de siete dominios transmembranarios (Tatemoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 251:471-476, 1998). Se ha informado que una de las isoformas más activas más cortas identificadas, la apelina-13 piroglutamada ([PE65]Apelina-13 (65-77)), es la forma más potente y abundante de la apelina en el tejido cardíaco (Maguire et al., Hypertension, 54:598-604, 2009). Modelos in vitro y preclínicos han indicado que el sistema apelina/APJ tiene una función en la homeostasis cardiovascular, así como el metabolismo (Barnes et al., Heart, 96:1011-1016, 2010). Los niveles circulantes de apelina son transitorios y apelina-13 tiene una breve semivida plasmática de < 5 minutos, lo que conduce a efectos cardiovasculares de corta duración.
In vitro, la apelina exógena aumenta la contractilidad en concentraciones subnanomolares en tiras auriculares y corazones completos de rata, y aumenta el acortamiento de sarcómeros en hasta el 140 % en cardiomiocitos aislados (Barnes et al., Heart, 96:1011-1016, 2010). La apelina también tiene un potente efecto inotrópico en un ensayo de corazón aislado ex vivo. In vivo, la infusión aguda de apelina restaura la fracción de eyección, aumenta el gasto cardíaco y reduce la presión telediastólica ventricular izquierda en ratas con insuficiencia cardíaca crónica (Berry et al., Circulation, 110:187-193, 2004). La apelina exógena potencia potentemente la contractilidad miocárdica sin inducir hipertrofia ventricular izquierda concomitante con reducción en la precarga y poscarga ventricular (Barnes et al., Heart, 96:1011-1016, 2010).
Se ha informado de estudios de relación estructura-actividad (SAR) muy limitados para péptidos de apelina. Los limitados estudios de SAR se han centrado en el potenciamiento de la afinidad y/o potencia in vitro. No hay informes de SAR centrados en aumentar la estabilidad proteolítica y prolongar la semivida circulante, al tiempo que se mejora o mantiene la potencia de los agonistas de APJ.
Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de análogos novedosos de apelina que retengan la potencia de polipéptidos nativos de apelina, pero tengan elevada estabilidad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona novedosos polipéptidos de apelina modificados que tienen actividad de agonista de APJ para su uso en terapia. En algunas realizaciones, los péptidos modificados tienen elevada estabilidad con respecto a la apelina no mutante. Los péptidos modificados de la invención se pueden usar para tratar insuficiencia cardíaca u otros trastornos que responden a la activación del receptor de APJ.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos modificados de apelina tienen características farmacéuticas ventajosas, tales como elevada estabilidad, semivida y/o potencia. En algunas realizaciones, los polipéptidos modificados de apelina comprenden al menos un D-aminoácido, un p-aminoácido, un N-metilaminoácido, un a-metilaminoácido, un aminoácido no canónico o la forma D o p del aminoácido no canónico. En una realización, el polipéptido de apelina modificado comprende dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, u ocho o más residuos de aminoácidos no canónicos. En ciertas realizaciones, los residuos de aminoácidos no canónicos sustituyen a los residuos de aminoácidos canónicos dentro de la secuencia de polipéptidos de apelina. Los polipéptidos de apelina modificados se pueden ciclar para potenciar más la estabilidad.
La invención se refiere a un polipéptido de apelina que comprende la secuencia de aminoácidos: X i X2 X3X4 X5 X6 X7 Xa X9X10GX11X 12 X13 X14 (SEQ ID NO: 717), en donde: X1 es R, E, [hArg], o
El documento de patente US 2014/0155315 A1 se refiere a composiciones que comprenden secuencias de péptidos y polipéptidos modificadas diseñadas para tratar una enfermedad cardiovascular en sujetos a los que se administran y que presentan resistencia a la degradación.
Margathe et al. (Journal of Medical Chemistry, 2014(57), 2908-2919) describen que el agonista del receptor de apelina no peptídico E339-3D6 es una mezcla de especies polimetiladas. Además, se describe un enfoque en fase sólida que permite el acceso al principal componente del agonista del receptor de apelina no peptídico E339-3D6.
El documento de patente WO 2012/125408 A1 se refiere a composiciones y métodos de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la apelina. Específicamente, la solicitud se refiere a una forma pegilada de apelina para proporcionar vida en circulación prolongada y efectos inotrópicos, tratándose así la enfermedad o los trastornos asociados a la apelina.
El documento de patente WO 2013/106437 A1 se refiere a compuestos que son moduladores alostéricos de la apelina del receptor acoplado a la proteína G (APJ) y describe el uso de estos compuestos de receptor de APJ y composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de receptor de APJ en el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas a la modulación del receptor de APJ.
Murza et al. (ChemMedChem, 2012(7), 318-325) sintetizaron análogos de apelina-13 modificados en posiciones seleccionadas con aminoácidos no naturales, con una énfasis particular en la porción carboxiterminal. Entonces se probaron los análogos en ensayos de unión y funcionales que evaluaban la disminución mediada por Gi/o en los niveles de cAMP y que evaluaban el reclutamiento de p-arrestina 2 al receptor de APJ.
Zhang et al. (Bioorganic and Medical Chemistry 22 (2014), 2992-2997) examinaron el efecto de las truncaciones de péptidos carboxiterminales y la amplia relación estructura-actividad (SAR) para una serie de análogos basados en apelina-13 en un intento por desarrollar análogos más potentes y estables.
Brame et al. (Pulmonary Hypertension, 65(4), 834-840) usaron simulaciones de dinámica molecular de interacciones apelina/receptor para diseñar análogos cíclicos. ausente; X2 es [r], R, E, [hArg] o ausente; X3 es Q, [q] o [BLeu]; X4 es [hArg], [NMeArg], R, E o [r]; X5 es P o [aMePro]; Xa es R, E, [r], [hArg] o [NMeArg]; X7 es L, [aMeLeu], [BLeu], [NMeLeu] o [Cha]; X8 es S, [BhSer] o [NhSerG]; X9 es H o Y; X10 es K o [NLysG]; X11 es P, [Oic], [aMePro] o [Pip]; X 12 es [Nle], [rNle] o [pl-Phe]; X 13 es P, [BhPro], [aMePro] o [Aib]; y X14 es F, [D-BhPhe], [4-Cl-F], [D-4ClF] o [D-Bip] para su uso en terapia. En algunas realizaciones, X7 es [NMeLeu], X 12 es [pl-Phe] y X 14 es [D-Bip]. En ciertas realizaciones, X 1 es [hArg], X2 es [hArg], X3 es Q, X4 es [hArg] y X5 es P. En otras realizaciones, X13 es [BhPro], [aMePro] o [Aib] y X14 es [D-BhPhe] o [4-Cl-F]. En ciertas realizaciones, X6 es [NMeArg] o [hArg] y X7 es [aMeLeu] o [BLeu]. El polipéptido de apelina modificado puede estar acetilado en su extremo amino. El polipéptido de apelina tiene preferentemente muy poca o ninguna actividad de antagonista contra el receptor de APJ (es decir, el polipéptido de apelina es un agonista del receptor de APJ completo).
En algunas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados para el uso al que se refiere esta memoria se pueden conjugar, opcionalmente a través de un enlazador, con otro resto, tal como un ácido graso u otro lípido, un polímero (p. ej., polímero de polietilenglicol), proteína (p. ej., un anticuerpo o dominio Fc), u otra secuencia de péptidos (p. ej., un dominio de direccionamiento) que sirve de un resto que prolonga la semivida. Estos conjugados de resto que prolonga la semivida-apelina pueden tener una o más propiedades mejoradas, tales como estabilidad, semivida in vivo o potencia, con respecto a los péptidos nativos de apelina. El resto se puede conjugar con el polipéptido de apelina mediante el extremo N o C, o cualquier otro sitio del polipéptido. En ciertas realizaciones, el resto que prolonga la semivida está conjugado con el extremo N del polipéptido de apelina modificado.
En algunas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados o conjugados de los mismos para el uso al que se refiere esta memoria tienen elevada estabilidad in vitro o in vivo con respecto a la apelina-13 nativa (SEQ ID NO: 4) o pir-apelina-13 (SEQ ID NO: 6). En diversas realizaciones, el polipéptido de apelina modificado con elevada estabilidad tiene una elevada semivida in vitro. En otras realizaciones, el polipéptido de apelina modificado con elevada estabilidad tiene una elevada semivida in vivo. La elevada semivida in vivo puede ser un resultado de reducida proteólisis o elevada estabilidad metabólica y/o inclusión de un resto que prolonga la semivida u otras modificaciones de los polipéptidos de apelina.
En particular, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 G X11 X12 X13 X14 (SEQ ID NO: 717), en donde X 1 es R, E, [hArg] o ausente; X2 es [r], R, E, [hArg] o ausente; X3 es Q, [q] o [BLeu]; X4 es [hArg], [NMeArg], R, E o [r]; X5 es P o [aMePro]; X6 es R, E, [r], [hArg] o [NMeArg]; X7 es L, [aMeLeu], [BLeu], [NMeLeu] o [Cha]; X8 es S, [BhSer], o [NhSerG]; X9 es H o Y; X10 es K o [NLysG]; X11 es P, [Oic], [aMePro] o [Pip]; X 12 es [Nle], [rNle] o [pl-Phe]; X13 es P, [BhPro], [aMePro] o [Aib]; y X14 es F, [D-BhPhe], [4-CI-F], [D-4CIF] o [D-Bip] para su uso en terapia.
En una realización, el polipéptido para el uso al que se refiere esta memoria está acetilado en su extremo amino o en donde el polipéptido está conjugado con un grupo acilo C 1 a C25 graso saturado o insaturado, o con un polímero de polietilenglicol (PEG), o con una inmunoglobulina o un dominio Fc de inmunoglobulina, opcionalmente a través de un enlazador de conjugación.
En algunas realizaciones, el grupo acilo graso es tridecanαlo, butanαlo, hexanoílo, hexadecanoílo, butanodinαlo, octanodinoílo o decanodinoílo, octanoílo, decanαlo, dodecanoílo, tetradecanαlo, pentadecanαlo, hexadecanoílo, heptadecanoílo, octadecanoílo u octadecandinoílo; opcionalmente en donde el enlazador de conjugación comprende Aeea, Aeea-Aeea, YGlu-Aeea, YGlu-Aeea-Aeea o yGIu. En otras realizaciones, el polímero de PEG es un polímero de PEG de 5 kDa, 10 kDa o 20 kDa, opcionalmente en donde el enlazador de conjugación comprende ácido 3-mercaptopropanoico. En aún otras realizaciones, el enlazador de conjugación es un enlazador peptidílico o un enlazador no peptidílico, opcionalmente en donde el enlazador no peptidílico comprende un polímero de PEG.
En algunas realizaciones, X7 es [NMeLeu], X 12 es [pl-Phe] y X 14 es [D-Bip]; o X 1 es [hArg], X2 es [hArg], X3 es Q, X4 es [hArg] y X5 es P; o X6 y X7 son [NMeArg] y [aMeLeu], [hArg] y [BLeu], o [hArg] y [aMeLeu; o X13 es [BhiPro], [aMePro] o [Aib] y X14 es [D-BhPhe] o [4-CI-F]; o el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8-11, 16, 17, 31, 32, 45, 53, 60, 68, 69-71, 92, 112, 114, 119, 120, 221, 228, 237, 263, 286, 287, 362, 373, 376, 379, 382, 388, 412, 416, 460, 468, 482, 483, 485, 491, 498, 499, 500, 502, 505, 514, 519, 526, 531, 534, 544, 552, 554, 560 y 571.
En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el polipéptido para el uso al que se refiere esta memoria tiene elevada estabilidad con respecto a la apelina-13 no mutante (SEQ ID NO: 4) o la apelina-13 no mutante piroglutamada (SEQ ID NO: 6).
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico). BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Estructuras de aminoácidos no canónicos ejemplares.
Figura 2. Ejemplos de grupos de PEG y grupos de enlazador que se pueden fijar a polipéptidos de apelina de la invención.
Figura 3. Estrategias para estabilizar los agonistas de péptido contra el metabolismo usando modificaciones del esqueleto.
Las Figuras 4A-4D muestran efectos inotrópicos del polipéptido de apelina de SEQ ID NO: 16 (N=8) en comparación con vehículo (N=6) en corazones de rata perfundidos aislados. La FIG.4A muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la presión sistólica ventricular izquierda. La FIG. 4B muestra el porcentaje cambio con respecto al vehículo en la presión ventricular izquierda desarrollada. La FIG. 4C muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la tasa máxima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo. La FIG. 4D muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la tasa mínima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo. 2 de 8 ratas no respondieron, pero los datos incluyen a las 8 ratas. Análisis de ANOVA unifactorial: ****<0,0001.
Las Figuras 5A-5D muestran efectos inotrópicos de polipéptido de apelina de SEQ ID NO: 53 (N=8) en comparación con vehículo (N=7) en corazones de rata perfundidos aislados. La FIG.5A muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la presión ventricular izquierda desarrollada. La FIG. 5B muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la tasa máxima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo. La FIG. 5C muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la presión sistólica ventricular izquierda. La FIG. 5D muestra el porcentaje de cambio con respecto al vehículo en la tasa mínima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo.
Las Figuras 6A-6D muestran los efectos farmacodinámicos de pir-apelina-13 (SEQ ID NO: 6) en ratas con insuficiencia cardíaca. La FIG. 6A muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la fracción de eyección (FE) a tres dosis diferentes de pir-apelina. La FIG. 6B muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la tasa máxima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo (dP/dtmáx.) a tres dosis diferentes de pir-apelina. La FIG. 6C muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la presión arterial media (PAM) a tres dosis diferentes de pir-apelina. La FIG.6D muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la frecuencia cardíaca (FC) a tres dosis diferentes de pir-apelina.
Las Figuras 7A-7D muestran los efectos farmacodinámicos del polipéptido de apelina de SEQ ID NO: 109 en ratas con insuficiencia cardíaca. La FIG. 7A muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la fracción de eyección (FE) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina. La FIG.7B muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la tasa máxima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo (dP/dtmáx.) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina. La FIG.7C muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la frecuencia cardíaca (FC) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina. La FIG. 7D muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en presión arterial media (PAM) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina.
Las Figuras 8A-8D muestran los efectos farmacodinámicos del polipéptido de apelina de SEQ ID NO: 16 en ratas con insuficiencia cardíaca. La FIG. 8A muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la fracción de eyección (FE) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina. La FIG.8B muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la tasa máxima de cambio de presión en el ventrículo izquierdo (dP/dtmáx.) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina. La FIG.8C muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la presión arterial media (PAM) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina. La FIG. 8D muestra el porcentaje de cambio desde el nivel basal en la frecuencia cardíaca (FC) en dos dosis diferentes del polipéptido de apelina.
La Figura 9 muestra la farmacocinética in vivo de cuatro péptidos de apelina PEGilados de 20 kDa diferentes (SEQ ID NO: 103, 105, 107 y 108) en rata. Se muestra un gráfico de concentración de péptido en plasma de rata frente al tiempo. Se simularon los datos para una dosis de 5 mg/kg para SEQ ID NO: 103 (diamantes) basándose en el escalado predictivo para resaltar la elevada exposición resultante de la mayor estabilidad metabólica de este polipéptido.
Las Figuras 10A-10B muestran la farmacocinética in vivo para diversos péptidos de apelina lipidados en rata.
La FIG. 10A muestra las concentraciones plasmáticas con el tiempo para diferentes lípidos conjugados con la misma secuencia de péptidos. La FIG. 10B muestra las concentraciones plasmáticas con el tiempo para diferentes lípidos conjugados con diferentes secuencias de péptidos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El sumario anterior no pretende definir cada uno de los aspectos o realizaciones de la invención, y se pueden describir aspectos adicionales en otras secciones. El documento completo está destinado a referirse como una divulgación unificada, y debe entenderse que se pueden contemplar todas las combinaciones de características descritas en esta memoria, incluso si la combinación de características no se encuentra junta en la misma oración, párrafo o sección de este documento.
Además de lo anterior, como un aspecto adicional, todas las realizaciones de alcance más estrecho en cualquier forma que las variaciones definidas por los párrafos específicos de esta memoria pueden incluirse en esta divulgación. Por ejemplo, determinados aspectos se describen como un género, y debe entenderse que cada uno de los miembros de un género puede ser, individualmente, una realización. Además, debe entenderse que aspectos descritos como un género o la selección de un miembro de un género abarcan combinaciones de dos o más miembros del género. También debe entenderse que si bien se presentan diversas realizaciones en la memoria descriptiva utilizando el lenguaje "que comprende", bajo diversas circunstancias, una realización relacionada también puede describirse utilizando un lenguaje "que consiste en" o "que consiste esencialmente en".
Se entenderá que las descripciones en esta memoria son ejemplares y explicativas solamente y no son restrictivas de la invención como se reivindica. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido," no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, el uso del término "porción" puede incluir parte de un resto o el resto completo.
A menos que se defina lo contrario en esta memoria, las expresiones y los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Por lo tanto, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes al plural, a menos que el contexto claramente indica de otro modo. Por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye poblaciones de una pluralidad de células.
También debe entenderse que al describir un intervalo de valores, la característica que se describe podría ser un valor individual que se encuentre dentro del intervalo. Por ejemplo, "un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6" podría ser, pero no se limita a, pH 4, 4,2, 4,6, 5,1,5,5, etc. y cualquier valor entre dichos valores. Adicionalmente, "un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6" no debe interpretarse en el sentido de que el pH en cuestión varía 2 unidades de pH de pH 4 a pH 6, sino que se puede elegir un valor dentro de un intervalo de dos pH para el pH de la solución.
En algunas realizaciones, cuando se usa el término "aproximadamente", significa el número citado más o menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 % o más que el número citado. La variación real prevista se puede determinar a partir del contexto.
Los encabezados de sección usados en esta memoria son para fines organizativos solo y no se deben interpretar como limitantes de la materia descrita.
La presente invención proporciona polipéptidos de apelina modificados que actúan de agonistas del receptor de APJ para su uso en terapia. Como se usa en esta memoria, un "agonista del receptor de APJ" se refiere a una molécula que es capaz de activar el receptor de APJ, que puede entonces afectar o estimular procesos bioquímicos, celulares o fisiológicos. El agonista del receptor de APJ puede unirse al receptor de APJ. El término también puede referirse a un polipéptido que tiene actividad biológica al menos comparable a la de un péptido de apelina que existe de forma natural; sin embargo, también puede referirse a un polipéptido que tiene actividad biológica inferior a un péptido de apelina que existe de forma natural. El término incluye además moléculas que potencian los efectos de los péptidos de apelina que existen de forma natural. El agonista del receptor de APJ puede ser un ligando de APJ, que se refiere a una molécula que se une al receptor de APJ o forma un complejo con el receptor de APJ. El ligando puede ser, pero no es necesariamente, una molécula desencadenante de señales.
En algunas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria son más estables en comparación con los polipéptidos de apelina nativos. Por ejemplo, en una realización, los polipéptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria tienen elevada estabilidad (p. ej., estabilidad proteolítica ) con respecto a la apelina-13 (SEQ ID NO: 4) o la apelina-13 piroglutamada (SEQ ID NO: 6). En estas y otras realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados tienen actividad de agonista de receptor de APJ comparable o potenciada en comparación con los polipéptidos de apelina nativos. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria tienen una actividad agonista en el corazón aumentando, por ejemplo, diversos aspectos de contractilidad cardíaca, tales como dp/dt, fracción de eyección o frecuencia cardíaca. El término "péptidos de apelina nativos" o "péptidos de apelina endógenos" incluye preproteína de apelina de longitud completa que tiene la secuencia MNLRLCVQAL LLLWLSLTAV CGGSLMPLPD GNGLEDGNVR HLVQPRGSRN GPGPWQGGRR KFRRQR-PRLS HKGPMPF (SEQ ID NO: 2); apelina (42-77), también denominada apelina-36, que tiene la secuencia LVQPRGSRNG PGPWQGGRRK FRRQRPRLSH KGPMPF (SEQ ID NO: 3); apelina (65-77), también denominada apelina-13 no mutante, que tiene la secuencia QRPRLSHKGPMPF (SEQ ID n O: 4); apelina (61-77), también conocida como apelina-17, que tiene la secuencia KFRRQRPRLS HKGPMPF (SEQ ID NO:5), y otros fragmentos de apelina de longitud completa. Los fragmentos de apelina se definen frecuentemente como un intervalo de secuencias de aminoácidos particular dentro de la preproteína de apelina de longitud completa (SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, para la apelina-17, el K aminoterminal está en la posición 61 y el F carboxiterminal está en la posición 77 con respecto a la proteína apelina de longitud completa (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, se puede definir que los péptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria tienen sustituciones de aminoácidos particulares en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 61 a 77 en la secuencia de apelina de longitud completa (SEQ ID NO: 2). A modo de ejemplo, la notación Oic74 se refiere a un residuo de Oic en el polipéptido modificado en una posición correspondiente al aminoácido 74 en SEQ ID NO: 2.
También se describe en esta memoria un polipéptido de apelina modificado que comprende la secuencia de la siguiente fórmula:
Nx1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15x16x17 (SEQ ID NO: 1), en donde:
N es una extensión, enlazador de conjugación o cualquier resto (p. ej., un grupo acetilo, Y-glu o un lípido) que puede mejorar la estabilidad con respecto a apelina-13 no mutante (SEQ ID NO: 4);
x1 está ausente, es un residuo de aminoácido básico o polar, o comprende una porción de un enlazador de conjugación;
x2 está ausente, es un residuo de aminoácido no funcional o hidrófobo, o comprende una porción de un enlazador de conjugación;
x3 está ausente, es un residuo de aminoácido básico o polar, o comprende una porción de un enlazador de conjugación;
x4 está ausente, es un residuo de aminoácido básico o polar, o comprende una porción de un enlazador de conjugación;
x5 está ausente o es un residuo no funcional, hidrófobo o polar (p. ej., pE, Q, Cit, L, V, G, H o P), o comprende una porción de un enlazador de conjugación;
x6 está ausente o es un residuo polar o básico (p. ej., K o Cit, R, NMeArg o hArg);
x7 es un residuo hidrófobo o no funcional (p. ej., P, Oic o G);
x8 es un residuo básico o polar (p. ej., Q, Cit, R, NMeArg o hArg);
x9 es un residuo no funcional o hidrófobo (p. ej., V, I, o L preferido, NMeLeu o Cha);
x10 es un residuo no funcional, polar o hidrófobo, o comprende una porción de un enlazador de conjugación (p. ej., S, F y 4F-Phe);
x11 es un residuo no funcional, polar, básico o hidrófobo, o comprende una porción de un enlazador de conjugación;
x12 es un residuo no funcional, hidrófobo, polar o de carácter básico;
x13 es un residuo no funcional o aromático (p. ej. G);
x14 es un residuo no funcional o hidrófobo (p. ej., P y Oic);
x15 es un residuo no funcional, polar o hidrófobo (p. ej., residuos alifáticos, aromáticos, hidrófobos); x16 es un residuo no funcional o hidrófobo (p. ej., F, 4I-Phe, 4Cl-Phe, Bip, P, Oic); y
x17 está ausente o es un residuo hidrófobo (p. ej., residuos aromáticos).
Los residuos de aminoácidos en la fórmula anterior pueden ser D- o L- aminoácidos, a- o p-aminoácidos, aminoácidos no canónicos o formas D o L o a o p de los aminoácidos no canónicos.
El término "aminoácido" o "residuo" debe entenderse que significa un compuesto que contiene un grupo amino (NH2), un grupo ácido carboxílico (COOH) y cualquiera de diversos grupos laterales, que tienen la fórmula básica NH2CHRCOOH, y que se enlazan mediante enlaces peptídicos para formar proteínas. Los aminoácidos pueden ser, por ejemplo, de carácter ácido, básico, aromáticos, polares o derivatizados. Aminoácidos no estándares pueden denominarse aminoácidos "no canónicos". Los aminoácidos se encuentran naturalmente en la forma a y L, sin embargo, también se pueden preparar aminoácidos de la forma p y D. (Araghi, R.R. et al., Aminoacids 41:733-742, 2011). En los aminoácidos a, el grupo ácido carboxílico y el grupo amino están unidos en el mismo centro de carbono. En los aminoácidos p, el grupo amino está unido en el carbono p que se encuentra en la mayoría de los aminoácidos, excepto la glicina. En general, los aminoácidos p se observan raramente en la naturaleza con respecto a la forma a dominante.
Con frecuencia se emplea un sistema de abreviaturas de una letra para designar las identidades de los veinte residuos de aminoácidos "canónicos" generalmente incorporados en péptidos y proteínas que se producen de forma natural (Tabla 1). Abreviaturas de una letra de este tipo son completamente intercambiables en significado con abreviaturas de tres letras o nombres de aminoácidos no abreviados. Dentro del sistema de abreviaturas de una letra usado en esta memoria, una letra mayúscula indica un aminoácido L, y una letra minúscula indica un aminoácidos D. Por ejemplo, la abreviatura "R" designa L-arginina y la abreviatura "r" o "[r]" designa D-arginina.
Tabla 1. Abreviaturas de una letra para los aminoácidos canónicos
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Una sustitución de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos se puede designar en esta memoria con una abreviatura de una letra para el residuo de aminoácido en una posición particular, seguida de la posición numérica del aminoácido con respecto a una secuencia nativa de interés, que luego es seguida por el símbolo de una letra para el residuo de aminoácido sustituido en. Por ejemplo, "T30D" simboliza una sustitución de un residuo de treonina con un residuo de aspartato en la posición de aminoácido 30, con respecto a la secuencia nativa de interés.
Los residuos de aminoácidos se clasifican comúnmente de acuerdo con diferentes características químicas y/o físicas. La expresión "residuo de aminoácido de carácter ácido" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Residuos de carácter ácido ejemplares incluyen residuos de ácido aspártico y ácido glutámico. El término "residuo de aminoácido de alquilo" se refiere a residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales de alquilo C1-6 que pueden ser lineales, ramificadas o cíclicas, que incluyen la amina de aminoácido como en prolina, en donde el alquilo C1-6 está sustituido por 0, 1, 2 o 3 sustituyentes seleccionados de haloalquilo C1-4, halógeno, ciano, nitro, -C(=O)Rb, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRa, -C(=NRa)NRaRa, -NRaC(=NRa)NRaRa, -ORa, -OC(=O)Rb, -OC(=O)NRaRa, -O-alquil C2-6-NRaRa, --O-alquil C2-6-ORa, -SRa, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, -S(=O)2NRaRa, -NRaRa, -N(Ra)C(=O)Rb, -N(Ra)C(=O)ORb, -N(Ra)C(=O)NRaRa, -N(Ra)C(=NRa)NRaRa, -N(Ra)S(=O)2Rb, -N(Ra)S(=O)2NRaRa, -NRa-alquil C2-6-NRaRa y -NRa-alquil C2-6-ORa; en donde Ra es independientemente, en cada caso, H o Rb; y Rb es independientemente, en cada caso, alquilo C1-6 sustituido con 0, 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, alquilo C1-4, haloalquilo C1-3, -Oalquilo C1-4, -NH2, -NH-alquilo C1-4 y -N(alquil C1-4)alquilo C1-4; o cualquier forma protonada de los mismos, que incluye alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, cisteína, metionina, hidroxiprolina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, ácido 2-aminobutírico, pero cuyos residuos no contienen un grupo arilo o aromático.
La expresión "residuo de aminoácido aromático" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Residuos aromáticos ejemplares incluyen residuos de triptófano, tirosina, 3-(1 -naftil)alanina, histidina o fenilalanina. La expresión "residuo de aminoácido de carácter básico" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos de carácter básico. Residuos de aminoácidos de carácter básico ejemplares incluyen residuos de histidina, lisina, homolisina, ornitina, arginina, N-metil-arginina, w-aminoarginina, w-metil-arginina, 1 -metil-histidina, 3-metil-histidina y homoarginina (hR). El término "residuo de aminoácido hidrófilo" o "residuo de aminoácido polar" se refiere a residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Los residuos hidrófilos o polares ejemplares incluyen residuos de cisteína, serina, treonina, histidina, lisina, asparagina, aspartato, glutamato, glutamina y citrulina (Cit). El término "residuo de aminoácido hidrófobo" o "residuo de aminoácido lipófilo" se refiere a residuos de aminoácidos en la forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos sin carga, alifáticos o aromáticos. Las cadenas laterales lipófilas ejemplares incluyen fenilalanina, isoleucina, leucina, norleucina, metionina, valina, triptófano y tirosina. La alanina (A) es anfífila - es capaz de actuar como un residuo hidrófilo o lipófilo (es decir, hidrófobo). La alanina, por lo tanto, está incluida dentro de la definición tanto de residuo "lipófilo" (es decir, "hidrófobo") como de residuo "hidrófilo". La expresión residuo de aminoácido "no funcional" o "neutro" se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos de carácter ácido, básico o aromáticos. Los residuos de aminoácidos neutros ejemplares incluyen metionina, glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina y norleucina.
El término aminoácidos "no canónicos" o "no naturales" se refiere a residuos de aminoácidos en la forma D o L que no están entre los 20 aminoácidos canónicos incorporados, en general, en las proteínas que existen de forma natural. Se pueden encontrar ejemplos de aminoácidos no canónicos en la Figura 1 y la Tabla 2. Pueden incorporarse residuos de aminoácidos no canónicos en un péptido empleando técnicas conocidas de manipulación de proteínas que utilizan células de expresión recombinante. Véase, p. ej., Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinión in Biotechnology, 14(6):603-609, 2003. Los ejemplos adicionales de aminoácidos no canónicos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, p-aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivatizadas. Los ejemplos adicionales pueden incluir (en la forma L o la forma D) p-alanina, ácido paminopropiónico, ácido piperidínico, ácido aminocaproico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, Na-etilglicina, Na-etilaspargina, hidroxilisina, allo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, wmetilarginina, Na-metilglicina, Na-metilisoleucina, Na-metilvalina, Y-carboxiglutamato, s-N,N,N-trimetil-lisina, s-N-acetillisina, O-fosfoserina, Na-acetilserina, Na-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, y otros aminoácidos similares, y los enumerados en la Tabla 2 que sigue, y formas derivatizadas de cualquiera de estos como se describen en esta memoria. La Tabla 2 y la Figura 1 contienen algunos residuos de aminoácidos canónicos ejemplares que se pueden incorporar en los polipéptidos de apelina modificados de la invención, así como las abreviaturas asociadas que se usan normalmente en esta memoria. Sin embargo, el experto habitual entenderá que diferentes abreviaturas y nomenclaturas se pueden aplicar a la misma sustancia y aparecer indistintamente en esta memoria. Algunas secuencias de aminoácidos, como se cita en esta memoria, pueden incluir "{H}", "{H2}" o "{Hidrógeno}" en el extremo N, todos los cuales representan un grupo amino aminoterminal, y/o pueden incluir "-{Ácido libre}" o {COOH} en el extremo C, ambos de los cuales representan un grupo carboxi carboxiterminal. Algunas secuencias incluyen un "Ac", "Acetilo" o "Acetil-NH" en el extremo N, que indica acetilación en el extremo N (p. ej., acetato o acetamida). Como se usa en esta memoria, el término "bromoacetilo" se refiere a bromoacetato o bromoacetamida.
En el caso de que una abreviatura enumerada en la Tabla 2 difiera de otra abreviatura para la misma sustancia descrita en otra parte de esta memoria, se entiende que ambas abreviaturas son aplicables. Los aminoácidos enumerados en la Tabla 2 pueden estar en forma L o en forma D, a menos que se indique lo contrario.
Tabla 2. Ejemplos de aminoácidos no canónicos para su uso en secuencias de péptidos
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Los polipéptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria pueden ser desde aproximadamente 10 aminoácidos hasta aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, desde aproximadamente 13 aminoácidos hasta aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, o desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados son de aproximadamente 12 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados son de aproximadamente 13 aminoácidos de longitud. En una realización particular, el polipéptido de apelina modificado es de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. En otra realización particular, el polipéptido de apelina modificado es de aproximadamente 17 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el polipéptido de apelina modificado es de aproximadamente 36 aminoácidos de longitud.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria tienen al menos un aminoácido no canónico. En otras realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados tienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, o al menos nueve aminoácidos no canónicos. Los polipéptidos de apelina modificados pueden tener al menos el 25 % de los aminoácidos totales en el péptido como aminoácidos no canónicos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos el 30 % de los aminoácidos en el polipéptido son aminoácidos no canónicos. En una realización, los polipéptidos de apelina modificados de la invención tienen al menos el 50 % de los aminoácidos en el polipéptido como aminoácidos no canónicos. En otra realización, al menos el 60 % de los aminoácidos en el polipéptido de apelina modificado son aminoácidos no canónicos. En otra realización adicional, al menos el 70 % de los aminoácidos en el polipéptido de apelina modificado son aminoácidos no canónicos. Los aminoácidos no canónicos pueden ser cualquiera de los desvelados en esta memoria, que incluyen los enumerados en la Tabla 2.
En algunas realizaciones, los polipéptidos de apelina modificados de la invención para su uso en terapia comprenden la secuencia de aminoácidos:
X1 X2 X3X4 X5 Xa X7 Xa X9X 10GX11X 12 X13 X14 (SEQ ID NO: 717), en donde:
X1 es R, E, [hArg] o ausente;
X2 es [r], R, E, [hArg] o ausente;
X3 es Q, [q] o [BLeu];
X4 es [hArg], [NMeArg], R, E o [r];
X5 es P o [aMePro];
Xa es R, E, [r], [hArg] o [NMeArg];
X7 es L, [aMeLeu], [BLeu], [NMeLeu] o [Cha];
Xa es S, [BhSer] o [NhSerG];
X9 es H o Y;
X10 es K o [NLysG];
X i i es P, [Oic], [aMePro] o [Pip];
X12 es [Nle], [rNle] o [pl-Phe];
X13 es P, [BhPro], [aMePro] o [Aib]; y
X14 es F, [D-BhPhe], [4-Cl-F], [D-4CIF] o [D-Bip].
En algunas de dichas realizaciones, X7 es [NMeLeu], X12 es [pl-Phe] y X14 es [D-Bip]. En realizaciones relacionadas, X1 es [hArg], X2 es [hArg], X3 es Q, X4 es [hArg] y X5 es P. En ciertas realizaciones, X6 y X7 son, respectivamente, [NMeArg] y [aMeLeu], [hArg] y [BLeu], o [hArg] y [aMeLeu]. En otras realizaciones particulares, X 13 es [BhPro], [aMePro] o [Aib] y X14 es [D-BhPhe] o [4-Cl-F]. Los polipéptidos de apelina modificados de la invención pueden comprender una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 8-11, 16, 17, 31,32, 45, 53, 60, 68, 69-71,92, 112, 114, 119, 120, 221,228, 237, 263, 286, 287, 362, 373, 376, 379, 382, 388, 412, 416, 460, 468, 482, 483, 485, 491,498, 499, 500, 502, 505, 514, 519, 526, 531, 534, 544, 552, 554, 560 y 571. En esta memoria también se desvela un polipéptido de apelina modificado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19, 20, 22-24, 29, 30, 33, 34, 37, 46, 47, 50-52, 55, 56, 97-105, 107, 109, 111, 115, 117, 118, 127, 150, 154, 156, 157, 176-181, 183-185, 211 -232, 236, 241,242, 261 -267, 270, 274, 275, 278-281,284, 349, 540 y 698.
Los polipéptidos de apelina modificados de la invención para el uso al que se refiere esta memoria pueden estar acetilados en el extremo N. Los polipéptidos de apelina modificados descritos en esta memoria pueden comprender la secuencia de aminoácidos:
Ac-X1 X2 X3 X4X5 XsXy XeXg X10X 11X12 X13 X14 X15 X16 X17 (SEQ ID NO: 718), en donde: X1 es O o [BhLys]; X2 es F, [BhPhe] o [Bphe]; X3 es [hArg], [NmeArg] o [BhArg]; X4 es [hArg], [NmeArg] o [BhArg]; X5 es Q, [BhGln], [BhAsn] o [BhLeu]; X6 es [hArg], [NmeArg] o [BhArg]; X7 es P, [Sar], [Aib], [BhPro] o [Pip]; Xs es [hArg], [NmeArg] o [BhArg]; X9 es [Cha] o [BhLeu]; X 10 es S, [BhSer], [Sar] o [bAla]; X11 es H, [NmeVal] o [bAla]; X12 es K, [NmeLys], [BhLys], [BLys] o [bAla]; X13 es G, [Sar], [Aib] o [bAla]; X14 es [Oic], [Aib], [Sar], [bAla], [BhPro] o [Pip]; X15 es [Nle] o [bAla]; X16 es P, [Sar], [Aib], [BhPro], [bAla], [Pip], [D-1Nal] o [D-2Nal]; y X17 es [4-Cl-F], [Bh-Phe] o [Bphe]. El polipéptido de apelina modificado descrito en esta memoria puede comprender una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los péptidos enumerados en la Tabla 3 que sigue.
Tabla 3. Polipéptidos de apelina modificados ejemplares
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Los polipéptidos de apelina modificados acetilados descritos en esta memoria pueden comprender la secuencia de aminoácidos: [z] X i X2 X3X4 X5 X6 X7SHX8G[Oic] X9 X10 X 11 (SEQ ID NO: 719), en donde: z es acetilo o está ausente; X i es acetilo, [r] o [hArg]; X2 es [r], R o [hArg]; X3 es Q o [q]; X4 es [hArg], R o [r]; X5 es P o [Oic]; X6 es [r], [hArg] o [NMeArg]; X7 es [NMeLeu] o [Cha]; X8 es K o [NLysG]; X9 es [pl-Phe] o [Nle]; X10 es P o [D-1 Nal] o [Pip]; y X 11 es un D-aminoácido, un p-aminoácido, un aminoácido no canónico o la forma D o p del aminoácido no canónico. Por ejemplo, X11 es [D-Bip], [4-CL-F], [D-4CLF], [TIC], [f] o está ausente. Los polipéptidos de apelina modificados ejemplares, que incluyen polipéptidos de apelina modificados acetilados, se enumeran en la Tabla 4 que sigue. En ciertas realizaciones descritas o reivindicadas en esta memoria, el polipéptido de apelina modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los péptidos enumerados en la Tabla 4 que sigue.
Tabla 4. Polipéptidos de apelina modificados ejemplares adicionales
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En algunas realizaciones descritas en esta memoria, los polipéptidos de apelina modificados comprenden la secuencia de aminoácidos: [z] X 1 X2[hArg][hArg]X3X4X5X6X7XeX9 X10G[Oic][Nle]Xn [4-Cl-F] (SEQ ID NO:720), en donde: z es acetilo, X1 es O o O; X2 es F; X3 es Q o [BLeu]; X4 es [hArg] o [rhArg]; X5 es P o [aMePro]; X6 es [hArg] o [rhArg]; X7 es [aMeLeu], [rCha], [BLeu] o [Cha]; X8 es [NhSerG], [aMeS], [rSer], [DrSer] o S; X9 es H o [rHis]; X10 es K, [NLysG], [rLys] o [aMeOm]; y X11 es P o [aMePro]. Por consiguiente, el polipéptido de apelina modificado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 29-44.
La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos de apelina modificados descritos en esta memoria. Las variantes de los polipéptidos de apelina desvelados se pueden generar haciendo adiciones o inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, sustituciones de aminoácidos y/o derivados químicos de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de polipéptidos de apelina. Las sustituciones de aminoácidos deseadas (tanto conservativas como no conservativas) pueden ser determinadas por los expertos en la técnica según la orientación proporcionada en esta memoria para aumentar la estabilidad, mientras se mantiene o mejora la potencia de los polipéptidos de apelina. En determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden abarcar residuos de aminoácidos que se producen de forma no natural que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos.
Las modificaciones conservativas pueden producir péptidos que tienen características funcionales, físicas y químicas similares a las del péptido a partir del cual se hacen dichas modificaciones. Por el contrario, se pueden lograr modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los péptidos seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal molecular en la región de la sustitución, por ejemplo, como una conformación a-helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de forma que exista poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis por barrido de alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl., 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998, que trata la mutagénesis por barrido de alanina).
Residuos que se producen de forma natural se pueden dividir en clases según las propiedades comunes de la cadena lateral:
hidrófobos: norleucina (Nor o Nle), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
ácidos: Asp, Glu;
básicos: His, Lys, Arg;
residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.
Al realizar cambios de este tipo, de acuerdo con determinadas realizaciones, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada uno de los aminoácidos se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobia y carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se entiende en la técnica la importancia del índice de aminoácidos hidropático en conferir función biológica interactiva a una proteína (véase, por ejemplo, Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-131, 1982). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse con otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropático similar y aún conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios basados en el índice hidropático, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos, cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2. En determinadas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ± 1, y en determinadas realizaciones se incluyen los que están dentro de ± 0,5.
La sustitución de aminoácidos similares se puede realizar de manera eficaz sobre la base de la hidrofilia. En ciertas realizaciones, la mayor hidrofilia promedio local de una proteína, como se rige por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Los siguientes valores de hidrofilia se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 1); glutamato (+3,0 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (­ 0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al realizar cambios basados en valores de hidrofilia similares, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos, cuyos valores de hidrofilia están dentro de ± 2, en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ± 1, y en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ± 0,5.
Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo), tal como isoleucina, valina, leucina norleucina, alanina o metionina, por otro residuo no polar, la sustitución de un residuo de aminoácido polar (hidrófilo) por otro residuo polar, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo de aminoácido básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro residuo básico, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, por otro residuo ácido. La expresión "sustitución conservadora de aminoácidos" también incluye el uso de un residuo derivatizado químicamente en lugar de un residuo no derivatizado, siempre que dicho polipéptido muestre la bioactividad requerida. Otras sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo que se pueden usar en generar variantes de los polipéptidos de apelina modificados desvelados en esta memoria se exponen en al Tabla 5 que sigue.
Tabla 5. Algunas sustituciones de aminoácidos útiles
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También se pueden generar variantes de los polipéptidos de apelina modificados descritos en esta memoria derivatizando aminoácidos dentro de la secuencia de polipéptidos. Se debe entender que los términos "derivatizar" y "derivado" o "derivatizado" significan procesos y compuestos resultantes, respectivamente, en los que una porción de la molécula parental se ha modificado químicamente. Ejemplos pueden incluir: (1) un compuesto que tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación entre residuos dentro del compuesto; (2) un compuesto reticulado o que tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo cisteinilo y, por lo tanto, forma dímeros reticulados; (3) uno o más enlaces peptidilo se reemplazan por un enlace no peptidilo; (4) un extremo N se modifica con agentes capaces de reaccionar con el grupo amino; (5) el extremo C se puede reemplazar por una amida o un éster; y (6) compuestos en los que los restos de aminoácidos individuales se modifican mediante el tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados.
En diversas realizaciones, se puede derivatizar el polipéptido de apelina y/o porción de vehículo/soporte de los compuestos descritos en esta memoria. Dichos derivados pueden mejorar la solubilidad, absorción, estabilidad, semivida biológica y similares de los compuestos. Los restos del derivado pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto no deseable de los compuestos, tales como la inducción de la desgranulación de mastocitos. En la Figura 3 se exponen diversas estrategias de derivatización, que se han usado en la preparación de los polipéptidos de apelina modificados de la invención y son particularmente útiles para aumentar la estabilidad de péptidos de apelina.
"Derivado químico" o "químicamente derivatizado" también se refiere a un péptido objeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. Moléculas derivatizadas de este tipo incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que se han derivatizado grupos amino libres para formar hidrocloruros de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. También se incluyen como derivados químicos los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que existen de forma natural de los veinte aminoácidos canónicos, tanto en forma L como D. Por ejemplo, se puede sustituir prolina por 4-hidroxiprolina; se puede sustituir lisina por 5-hidroxilisina; se puede sustituir histidina por3-metilhistidina; se puede sustituir serina por homoserina; y se puede sustituir lisina por ornitina.
Derivatizaciones útiles incluyen, en algunas realizaciones, aquellas en las que el extremo amino del péptido está bloqueado químicamente de manera que se prevenga que tenga lugar la conjugación con un vehículo o soporte en un grupo amino libre aminoterminal. También puede haber otros efectos beneficiosos de dicha modificación, por ejemplo, una reducción en la susceptibilidad del análogo de péptidos de apelina a la proteólisis enzimática. El extremo N puede acilarse o modificarse para dar una amina sustituida, o derivatizarse con otro grupo funcional, tal como un resto aromático (p. ej., un ácido indol, bencilo (Bzl o Bn), dibencilo (DiBzl o Bn2) o benciloxicarbonilo (Cbz o Z)), N,N-dimetilglicina o creatina. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un resto de acilo, tal como, pero no se limita a, un formilo, acetilo (Ac), propanoílo, butanilo, heptanilo, hexanoílo, octanoílo o nonanαlo, puede estar ligado covalentemente al extremo aminoterminal del péptido, que puede prevenir las reacciones secundarias no deseadas durante la conjugación del vehículo o soporte al péptido. Otros grupos de derivados aminoterminales ejemplares incluyen -NRR1 (distinto de -NH2), -NRC(O)R1 , -NRC(O)OR1 , -NRS(O)2R1 , -NHC(O)NHR1 , succinimida o benciloxicarbonil-NH-(Cbz-NH-), en donde R y R1 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en donde el anillo de fenilo se puede sustituir con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, cloro y bromo.
En algunas realizaciones, uno o más enlaces peptidil [-C(O)NR-] (enlaces) entre residuos de aminoácidos se pueden reemplazar por un enlace no peptidilo. Los enlaces no peptidílicos ejemplares son -CH2-carbamato [-CH2-OC(O)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(O)2NR-], urea [-NHC(O)NH-], -CH2-amina secundaria y péptido alquilado [-C(O)NR6-en donde R6 es alquilo inferior].
En algunas realizaciones, pueden derivatizarse uno o más residuos de aminoácidos individuales. Se sabe que diversos agentes derivatizantes reaccionan específicamente con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, tal como se describe en detalle más adelante a modo de ejemplo.
Los residuos de lisinilo y los residuos amino terminales se pueden hacer reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4 pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.
Los residuos de arginilo se pueden modificar por reacción con uno cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.
Se ha estudiado extensamente la modificación específica de residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente.
Los grupos carboxilo de la cadena lateral (aspartilo o glutamilo) se pueden modificar selectivamente por reacción con carbodiimidas R'-N=C=N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.
Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se pueden desamidar a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.
Los residuos de cisteinilo se pueden reemplazar por residuos de aminoácidos u otros restos para eliminar los enlaces disulfuro o, a la inversa, para estabilizar la reticulación. Véase, p. ej., Bhatnagar et al., J. Med. Chem., 39:3814-3819, 1996.
La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales con una matriz de soporte insoluble en agua, si se desea, o con otros vehículos macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres disuccinimidílicos, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, se emplean matrices reactivas insolubles en agua, tales como hidratos de carbono activados por bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos, p. ej., como se describe en las patentes de EE. UU. N.° 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440, para la inmovilización de proteínas.
Otras posibles modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina en las cadenas laterales. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86, 1983.
Los ejemplos anteriores de derivatizaciones no pretenden ser un tratamiento exhaustivo, sino meramente ilustrativos.
La expresión de proteínas mediadas por ADN y/o ARN recombinante y las técnicas de manipulación de proteínas, o cualquier otro método de preparación de péptidos, son aplicables a la preparación de los polipéptidos de apelina desvelados en esta memoria. El término "recombinante" debe entenderse que significa que el material (p. ej., un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido alterado artificial o sintéticamente (es decir, de forma no natural) por intervención humana. La alteración se puede realizar en el material dentro o fuera de su entorno o estado natural. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se prepara recombinando los ácidos nucleicos, por ejemplo, durante la clonación, barajado de ADN u otros procedimientos biológicos moleculares bien conocidos. Se encuentran ejemplos de procedimientos de biología molecular de este tipo en Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982. Una "molécula de ADN recombinante" se compone de segmentos de ADN unidos entre sí mediante técnicas de biología molecular .de este tipo La expresión "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante", tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una molécula de proteína que se expresa utilizando una molécula de ADN recombinante. Una "célula huésped recombinante" es una célula que contiene y/o expresa un ácido nucleico recombinante.
Los péptidos de la invención se pueden preparar en células hospedadoras transformadas según métodos conocidos para los expertos en la técnica. Brevemente, se prepara una molécula de ADN recombinante, o construcción, que codifica el péptido. Los métodos para preparar moléculas de ADN de este tipo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, secuencias que codifican los péptidos se pueden escindir del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Cualquiera de un gran número de células huésped disponibles y bien conocidas puede utilizarse en la práctica de diversas realizaciones. La selección de un huésped particular depende de un cierto número de factores reconocidos por la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, velocidad de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bioseguridad y costes. Debe lograrse un equilibrio de estos factores, entendiendo que no todos los huéspedes pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas pautas generales, células huésped microbianas útiles en cultivo incluyen bacterias (tales como Escherichia coli sp.), levadura (tales como Saccharomyces sp.) y otras células fúngicas, células de insectos, células vegetales, células de mamíferos (incluidas las humanas), p. ej., células CHO y células HEK293. También se pueden realizar modificaciones a nivel del ADN. La secuencia de ADN que codifica el péptido puede cambiarse por codones más compatibles con la célula huésped elegida. Para E. coli, se conocen en la técnica codones optimizados. Los codones pueden sustituirse para eliminar los sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula huésped seleccionada. A continuación, el huésped transformado se cultiva y se purifica. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales para que se expresen los compuestos deseados. Condiciones de fermentación de este tipo son bien conocidas en la técnica. Además, el ADN codifica opcionalmente, además, en 5’ la región codificante de una proteína de fusión, una secuencia de péptido señal (p. ej., un péptido señal secretor) enlazada operativamente al análogo peptídico expresado. Para ejemplos adicionales de métodos recombinantes apropiados y construcciones de ADN ejemplares útiles para la expresión recombinante de las composiciones por células de mamífero, que incluyen proteínas de fusión Fc diméricas ("pepticuerpos") o heterotrímeros de inmunoglobulina quimérica (cadena ligera cadena pesada)-Fc ("hemicuerpos"), véase, p. ej., Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, publicación de patente de EE. UU. N.° 2007/0071764 y Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, documento de patente WO 2008/088422.
Los polipéptidos de apelina modificados de la invención también se pueden preparar por métodos de síntesis. La síntesis en fase sólida se puede utilizar como una técnica para producir péptidos individuales, ya que es el método más rentable para producir péptidos pequeños. Por ejemplo, las técnicas de síntesis en fase sólida bien conocidas incluyen el uso de grupos protectores, enlazadores y soportes de fase sólida, así como condiciones de reacción de protección y desprotección específicas, condiciones de escisión del enlazador, uso de depuradores y otros aspectos de la síntesis de péptidos en fase sólida. Técnicas adecuadas son bien conocidas en la técnica. Véanse, p. ej., Merrifield, Chem. Polypeptides, Katsoyannis y Panayotis eds., pp. 335-361, 1973; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963; Davis et al., Biochem. Intl. 10:394-414, 1985; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 1969; patente de EE. UU. N.° 3.941.763; Finn et al., The Proteins, 3a ed., 2:105-253, 1976; y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., 2: 257-527, 1976; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3a ed., T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; catálogo NovaBiochem, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes y H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," W. C. Chan y P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000; G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 77-183, 1990. Para más ejemplos de métodos sintéticos y de purificación conocidos en la técnica, que son aplicables a la preparación de polipéptidos y conjugados, véase, p. ej., Sullivan et al., publicación de patente de EE. UU. N.° 2007/0071764 y Sullivan et al., documento de patente w O 2008/088422
Los polipéptidos de apelina modificados de la invención pueden estar covalentemente fusionados, ligados, unidos o conjugados con uno o más restos o vehículos que prolongan la semivida. Un "resto que prolonga la semivida", que se usa indistintamente en esta memoria con "vehículo", se refiere a una molécula que previene o mitiga la degradación in vivo por proteólisis u otra modificación química que reduce la actividad, aumenta la semivida in vitro o in vivo u otras propiedades farmacocinéticas, tales como, pero no se limitan a, disminuir la tasa de depuración renal o hepática, aumentar la tasa de absorción, reducir la toxicidad, reducir la inmunogenicidad, mejorar la solubilidad, aumentar la actividad biológica y/o selectividad diana del péptido de apelina con respecto a una diana de interés, y/o aumenta la fabricabilidad, en comparación con una forma no conjugada del péptido de apelina. El resto que prolonga la semivida puede ser uno que sea farmacéuticamente aceptable.
Una composición que incluye un péptido o polipéptido de apelina ligado, fijado o unido covalentemente, ya sea directa o indirectamente mediante un resto enlazador, con otro péptido, vehículo, o un resto que prolonga la semivida, es un "conjugado" o molécula "conjugada", si se conjuga por medios químicos (p. ej., postraduccionalmente o postsintéticamente) o por fusión recombinante. La conjugación de los polipéptidos de apelina con el resto que prolonga la semivida, o restos, puede ser por el extremo N y/o extremo C del péptido de apelina, o pueden estar intercalado en cuanto a la secuencia de aminoácidos primarios de los péptidos. En ciertas realizaciones, el resto que prolonga la semivida está conjugado con el extremo N del polipéptido de apelina modificado.
El resto que prolonga la semivida o vehículo se puede seleccionar de forma que el conjugado de péptido resultante logre un tamaño hidrodinámico suficiente para prevenir la depuración por filtración renal in vivo. Por ejemplo, se puede seleccionar un resto que prolongue la semivida que sea una macromolécula polimérica, que sea sustancialmente de cadena lineal, de cadena ramificada (br) o dendrítica. Alternativamente, se puede seleccionar un resto que prolonga la semivida de forma que, in vivo, el conjugado de péptido resultante se una a una proteína sérica para formar un complejo, de forma que el complejo así formado evite una importante depuración renal. El resto que prolonga la semivida o vehículo puede ser, por ejemplo, un polímero (p. ej., polietilenglicol (PEG)); un lípido; un grupo de colesterol (tal como un esteroide); un hidrato de carbono u oligosacárido (p. ej., dextrano); cualquier proteína natural o sintética (p. ej., un anticuerpo o dominio Fc), o cualquier polipéptido o péptido que se una a un receptor de rescate.
Los restos que prolongan la semivida ejemplares que se pueden usar, según la presente invención, incluyen una inmunoglobulina, un dominio Fc de inmunoglobulina, o una porción del mismo, o un polímero o copolímero biológicamente adecuado, por ejemplo, un compuesto de polialquilenglicol, tal como un polietilenglicol (PEG) o un polipropilenglicol. Otros compuestos de polialquilenglicol apropiados incluyen, pero no se limitan a polímeros cargados o neutros de los siguientes tipos: dextrano, polilisina, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en hidratos de carbono, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina. En algunas realizaciones, una inmunoglobulina (incluyendo cadenas ligeras y pesadas) o una porción de la misma, se puede usar como un resto que prolonga la semivida, preferentemente una inmunoglobulina de origen humano, y que incluye cualquiera de las inmunoglobulinas, tales como, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Otros ejemplos del resto que prolonga la semivida o vehículo, según la invención, incluyen un copolímero de etilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1,3-dioxolano, un poli-1,3,6-trioxano, un copolímero de etileno-anhídrido maleico, un poliaminoácido (p. ej., polilisina o poliornitina), una nvinilpirrolidona de dextrano, una poli n-vinil pirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un poli(alcohol vinílico), una cadena glucosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga, o un ácido polisiálico (p. ej., tecnología PolyXen™; Gregoriadis et al., Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids, Intl. J. Pharmaceutics, 300:125-130, 2005.
En otras realizaciones, el resto que prolonga la semivida es una entidad química aniónicamente cargada, ligada covalentemente al extremo N del péptido de apelina. Las entidades químicas aniónicamente cargadas incluyen, pero no se limitan a, fosfotirosina, fosfoserina, p-fosfono(difluoro-metil)-fenilalanina (Pfp), p-fosfono-metil-fenilalanina (Pmp), p-fosfatidil-fenilalanina (Ppa) o p-fosfono-metilceto-fenilalanina (Pkp), que pueden estar ligados covalentemente al extremo amino del péptido de apelina, opcionalmente indirectamente, por un enlazador AEEA u otro enlazador como se describe en esta memoria. Véase el documento de patente WO 2006/042151 A2; Beeton et al., "Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases", Molec. Pharmacol. 67(4):1369-1381,2005; Pennington et al., "Engineering a stable and selective peptide blocker of the Kv1.3 channel in T lymphocytes", Molecular Pharmacology Fast Forward, publicado el 2 de enero de 2009 as doi:10.1124/mol.108.052704.
Otras realizaciones del resto que prolonga la semivida, según la invención, incluyen ligandos de péptido o ligandos de molécula (orgánica) pequeña que tienen afinidad de unión por una proteína sérica de semivida larga en condiciones fisiológicas de temperatura, pH y fuerza iónica. Los ejemplos incluyen un péptido de unión a albúmina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a transtiretina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a globulina de unión a tiroxina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a anticuerpo o ligando de molécula pequeña, u otro péptido o molécula pequeña que tiene una afinidad por una proteína sérica de semivida larga, tal como albúmina de suero. Véase, p. ej., Kratz, "Albumin as a drug carrier: Design of prodrugs, drug conjugates and nanoparticles", J. Controlled Release, 132:171-183, 2008; Dennis et al., "Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins", J. Biol. Chem. 277(38):35035-35043, 2002; Knudsen et al., "Potent derivative of glucagon-like Peptide-1 with pharmacokinetic properties suitable for once daily administration", J. Med. Chem.
43:1664-1669, 2000; Kurtzhals et al., "Albumin binding of insulins acylated with fatty acids: characterization of the ligand-protein interaction and correlation between binding affinity and timing of the insulin effect in vivo", Biochem. J.
312:725-731, 1995; Kenyon et al., "13C NMR Studies of the binding of medium-chain fatty acids to human serum albumin", J. Lipid Res. 35:458-467, 1994; Blaney et al., "Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands", patente de EE. UU. N.° 5.714.142; Sato et al., "Serum albumin binding moieties", publicación de patente de EE. UU. N.° 2003/0069395 A1; y patente de EE. UU. N.° 6.342.225. Ligandos de molécula pequeña ejemplares que se pueden unir a albúmina de suero humano incluyen, pero no se limitan a, pIFBu (ácido (S)-2-(4-(4-yodofenil)butanamido)pentanodioico) y DOTA (ácido 2,2',2",2™-(1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetrail)tetraacético). Dichos ligandos se pueden fijar a los polipéptidos de apelina modificados de la invención, tal como en el polipéptido de SEQ ID NO: 118 ({pIFBu}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QRP[NMeArg]LSHKGP[Nle]P[4-Cl-F] {Co Oh }), para aumentar la semivida en suero.
Una "proteína sérica de semivida prolongada" es una de los cientos de proteínas diferentes disueltas en el plasma sanguíneo de los mamíferos, incluyendo las denominadas "proteínas de soporte" (tales como albúmina, transferrina y haptoglobina), fibrinógeno y otros factores de coagulación sanguínea, componentes del complemento, inmunoglobulinas, inhibidores de enzimas, precursores de sustancias, tales como angiotensina y bradiquinina y muchos otros tipos de proteínas. La invención engloba el uso de cualquier especie individual de resto que prolongue la semivida farmacéuticamente aceptable, tal como, pero no se limita a, las descritas en esta memoria, o el uso de una combinación de dos o más restos que prolongan la semivida diferentes, tales como PEG y dominio Fc de inmunoglobulina o una porción del mismo (véase, p. ej., Feige et al., "Modified peptides as therapeutic agents", patente de EE. UU. N.° 6.660.843), tal como un dominio CH2 de Fc, albúmina (p. ej., albúmina de suero humano (HSA); véase, p. ej., Ehrlich et al., "Preparation and characterization of albumin conjugates of a truncated Peptide YYY analogue for half-life extension", Bioconjugate Chem., 24(12):2015-2024, 2013; patente de EE. UU. N.° 6.926.898; publicación de patente de EE. UU. N.° 2005/0054051; patente de EE. UU. N.° 6.887.470), una transtiretina (TTR; véase, p. ej., las publicaciones de patente de EE. UU. N.° 2003/0195154 A1 y 2003/0191056 A1), o una globulina que se une a tiroxina (TBG), o una combinación tal como inmunoglobulina (cadena ligera+cadena pesada) y dominio Fc (la combinación heterotrimérica denominada "hemicuerpo"), por ejemplo, como se describe en el documento de patente WO 2008/088422.
La prolongación de la semivida del polipéptido de apelina modificado también se puede denominar "estabilidad" elevada. Estabilidad elevada también se puede entender que significa depuración reducida del polipéptido de apelina o elevada exposición global del polipéptido de apelina o un polipéptido de apelina con una modificación o combinación de modificaciones que reduce la tasa de degradación metabólica con respecto al polipéptido de apelina sin modificar. La elevada estabilidad puede prolongar la semivida del polipéptido de apelina en matrices biológicas, tales como plasma y homogeneizados de tejido in vitro y prolongar los tiempos de residencia en plasma in vivo. Tiempos de residencia en plasma in vivo se debe entender que significa la vida útil en circulación de la entidad de fármaco de péptido intacto administrada en un animal. Se debe entender que los tiempos de residencia de plasma in vitro significan la vida útil de la entidad de fármaco de péptido intacto después de la adición, en medio biológico.
Las modificaciones del polipéptido de apelina también pueden conducir a un aumento de la "potencia" de la molécula, p. ej., mejora de las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas de la molécula. La elevada potencia también se puede entender que significa un polipéptido de apelina con una modificación o combinación de modificaciones que reduce la tasa de degradación metabólica con respecto al polipéptido de apelina sin modificar. La elevada estabilidad puede prolongar la semivida del polipéptido de apelina en matrices biológicas, tales como plasma y homogeneizados de tejido in vitro y prolongar los tiempos de residencia en plasma in vivo. La elevada potencia se puede entender además que significa afinidad y/o eficacia elevadas del polipéptido de apelina modificado para el receptor de APJ. En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de apelina modificados descritos en esta memoria está conjugado o unido con un resto que prolonga la semivida o vehículo a través del extremo N, extremo C, esqueleto o cadena lateral del polipéptido por modificación química en diversas configuraciones. Por lo tanto, en una realización, los conjugados de vehículo-péptido se pueden describir por la siguiente fórmula I:
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en donde:
V1 es un vehículo (p. ej., un PEG, lípido, u otro resto que prolonga la semivida);
A1, A2, A3 y A4 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)e-P1, -(L1)e-P1-(L2)f -P2, -(L1)e-P1-(L2)fP2-(L3)g-P3, -(L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3-(L4)h-P4 y multímeros superiores de los mismos;
P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias de polipéptidos de apelina y pueden ser cualquiera de los péptidos de apelina descritos en la presente solicitud sin el lípido y/o Aeea y/o Y-glutamato y/u otro resto que comprende una porción del enlazador de conjugación, p. ej., los péptidos de apelina con secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 121-647;
L1, L2, L3 y L4 son, cada uno de ellos independientemente, enlazadores; y
a, b, c, d, e, f, g y h son, cada uno independientemente, 0 o 1, con la condición de que al menos uno de a, b y c sea 1.
En otra realización, el conjugado de vehículo-péptido se describe por la siguiente fórmula II:
V1-A1
y multímeros del mismo, en donde V1 es un PEG, lípido u otro resto que prolonga la semivida, y está fijado, con o sin un enlazador, en el extremo N de A1;
En otra realización, el conjugado de vehículo-péptido se describe por la siguiente fórmula III:
A2
V1
y multímeros del mismo, en donde V1 es un PEG, lípido u otro resto que prolonga la semivida, y está fijado, con o sin un enlazador, en el esqueleto o cadena lateral de A2;
En otra realización, el conjugado de vehículo-péptido se describe por la siguiente fórmula IV:
A3-V1
y multímeros del mismo, en donde V1 es un PEG, lípido u otro resto que prolonga la semivida, y está fijado, con o sin un enlazador, en el extremo C de A3;
En otra realización, el conjugado de vehículo-péptido se describe por la siguiente fórmula V:
A2-V1-A1
y multímeros del mismo, en donde V1 es un PEG, lípido u otro resto que prolonga la semivida, y está fijado, con o sin un enlazador, en cualquier localización de A1 y A2;
En otra realización, el conjugado de vehículo-péptido se describe por la siguiente fórmula VI;
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y multímeros del mismo, en donde V1 es un PEG, lípido u otro resto que prolonga la semivida, y está fijado, con o sin un enlazador, en cualquier localización de A1, A2, A3 o A4;
En otra realización, el conjugado de vehículo-péptido se describe por la siguiente fórmula VII:
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y multímeros del mismo, en donde V1 y V2 son un PEG, lípido u otro resto que prolonga la semivida, y están fijados, con o sin un enlazador, en cualquier localización de A1.
En ciertas realizaciones, se puede insertar Y-glutamato en un polipéptido de apelina modificado de la invención. El yglutamato se puede insertar entre un resto de lípido (p. ej., un ácido graso) y el polipéptido de apelina modificado. Además del Y-glutamato, cualquier otro resto puede estar presente como constituyente del enlazador de conjugación como se describe en más detalle en esta memoria. Un constituyente del enlazador de conjugación puede ser un resto polar, no polar, hidrófobo, alifático o aromático que cumple una función especial, funcional y/o estructural.
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En ciertas realizaciones, el resto que prolonga la semivida o vehículo es un lípido. Por lo tanto, cualquiera de los polipéptidos de apelina modificados desvelados en esta memoria se puede conjugar, opcionalmente mediante un enlazador de conjugación, con un resto de lípido, tal como un ácido graso. En algunas realizaciones, el ácido graso es un ácido graso C1 a C25 saturado o insaturado. Los ácidos grasos ejemplares que se pueden usar como restos que prolongan la semivida y se conjugan con los polipéptidos de apelina modificados de la invención, opcionalmente mediante un enlazador de conjugación, se enumeran en la Tabla 6 que sigue.
Tabla 6. Restos de ácidos grasos ejemplares
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En algunas realizaciones, el ácido graso o grupo acilo graso conjugado con un polipéptido de apelina modificado de la invención se selecciona de butanαlo, hexanoílo, octanαlo, decanoílo, dodecanoílo, tridecanαlo, tetradecanoílo, pentadecanoílo, hexadecanαlo, heptadecanαlo, octadecanαlo, octadecanodinαlo, octanodinoílo, decanodinoílo, dodecanodinαlo, hexanodinαlo, butanodinαlo, tetradecanodinαlo o hexadecanodinαlo. En otras realizaciones, el ácido graso o grupo acilo graso conjugado con un polipéptido de apelina modificado de la invención se selecciona de octadecanodinαlo, heptadecanαlo, tridecanαlo, butanαlo, hexanoílo, hexadecanαlo, butanodinoílo, octanodinoílo o decanodinoílo. En ciertas realizaciones, el ácido graso o grupo acilo graso conjugado con un polipéptido de apelina modificado de la invención se selecciona de tridecanαlo, butanαlo, hexanoílo, hexadecanαlo, butanodinαlo, octanodinoílo o decanodinαlo. En ciertas otras realizaciones, el ácido graso o grupo acilo graso conjugado con un polipéptido de apelina modificado de la invención se selecciona de octanαlo, decanαlo, dodecanoílo, tridecanoílo, tetradecanoílo, pentadecanoílo, hexadecanαlo, heptadecanαlo, octadecanoílo u octadecanodinoílo.
En una realización descrita en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
X1 X2 X3 X4 (SEQ ID NO: 721) en donde:
X1 es un grupo acilo graso,
X2 es yGIu o está ausente,
X3 es un grupo PEG o está ausente, y
X4 es un polipéptido de apelina.
Los residuos de aminoácidos en el péptido de apelina de la fórmula anterior pueden ser L- o D-aminoácidos, a- o paminoácidos, aminoácidos no canónicos o las formas L o D o a o p de los aminoácidos no canónicos. El polipéptido de apelina en la fórmula anterior puede ser cualquiera de los polipéptidos de apelina modificados descritos en esta memoria. En una realización, el grupo PEG es uno o más grupos AEEA (ácido [2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acético). En realizaciones relacionadas, X2 es yGIu (también denominado en esta memoria AC4Abu) y X3 es AEEA o AEEA-AEEA. Como se describe en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3P[Cha]SHKG[Oic][Nle]X4 X5 (SEQ ID NO. 722), en donde: X1 es [hArg] o está ausente, X2 es Q o [q], X3 es [hArg] o [r], X4 es P o [Pip] y X5 es [4-Cl-F] o [D-4CIF]. En estas y otras realizaciones descritas o reivindicadas en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 237, 239 o 242.
En otra divulgación más, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{HDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]Xi X2X3PX4X5SHKG[Oic][Nle]X6X7 (SEQ ID No. 723) en donde: X 1 es [hArg] o está ausente, X2 es Q o [q], X3 es r o [hArg], X4 es r o [NMeArg], X5 es [NMeLeu] o [Cha], X6 es [Pip] o P y X7 es [4-CL-F], [f], [D-4ClF] o [Tic]. En estas y otras realizaciones descritas o reivindicadas en esta memoria, el conjugado de lípidopéptido puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 234-243.
Como se describe en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{TDA} [AC4Abu] [Aeea][Aeea]X1X2X3X4 X5X6 X7X8KG[Oic]X9X10 X11 (SEQ ID NO: 724), en donde: X1 es [hArg], [r] o está ausente, X2 es Q, [q], [BLeu] o [NMeGln], X3 es [hArg] o [r], X4 es P, [Pip], [Oic] o [Sar], X5 es [NMeArg],[r] o [hArg], X6 es [Cha], [NMeLeu], [BLeu] o [NMeCha], X7 es S, [BhSer], [bAla], [NhSerG] o [aMeS], X8 es H, A, Y, [Tle], [Deg], L o V, X9 es [Nle] o [pl-Phe], X 10 es P, un D-aminoácido, un p-aminoácido, un aminoácido no canónico o la forma D o p del aminoácido no canónico y X11 es [4-Cl-F], [D-4CIF], [D-Bip] o está ausente. En ciertas divulgaciones, X10 es [D-Tic], [4-Cl-F], [D-4ClF], [Aic], [Oic], [D-4F], [D-Ogl], [f], [1 -Nal], [2-Nal], [D-Bip], [Tic], [Aib] o [Deg]. En estas y otras divulgaciones, el conjugado de lípido-péptido puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 121 -210 y 245-256.
Como se describe en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X2X3 (SEQ ID No: 725), en donde: X1 es [hArg] o está ausente, X2 es P, un D-aminoácido o un aminoácido no canónico, y X3 es un D-aminoácido, un aminoácido no canónico o -COOH. En estas y otras divulgaciones, el conjugado de lípido-péptido puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 121 -152.
Como se describe en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]q[hArg]P[NMeArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]X1COOH (SEQ ID No. 726), en donde X 1 es un D-aminoácido, un p-aminoácido, un aminoácido no canónico o la forma D o p del aminoácido no canónico. En algunas divulgaciones, X 1 es [D-Tic], [4-CL-F], [D-4ClF], [Aic], [Oic], [D-4lF], [D-IgL], [f], [1 -Nal], [2-Nal], [D-Bip] o [Tic]. En ciertas divulgaciones, el conjugado de lípido-péptido puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 166, 171 y 245-256.
Como se describe en esta memoria, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]QX1PX2X3SHKG[Oic]X4X5Xs (SEQ ID No: 727), en donde: X1 es R, r o [hArg], X2 es r, [hArg] o [NMeArg], X3 es [NMeLeu] o [Cha], X4 es [pl-Phe] o [Nle], X5 es P o [D-1 Nal] y X6 es [D-Bip], [4-CL-F], [D-4ClF] o está ausente. En estas y otras divulgaciones, el conjugado de lípido-péptido puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 165 y 211 -233.
En otra divulgación más, el conjugado de lípido-péptido de apelina se puede describir por la siguiente fórmula:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea]X1X2X3PX4X5X6X7KG[Oic]X8X9X10 (SEQ ID No: 728), en donde: X1 es [hArg] o [r], X2 es Q o [q], X3 es r o [hArg], X4 es r o [NMeArg], X5 es [NMeLeu], [BLeu] o [Cha], X6 es S o [bAla], X7 es H, A o [Tle], X8 es [Nle] o [pl-Phe], X9 es P, un D-aminoácido, un p-aminoácido, un aminoácido no canónico o la forma D o p del aminoácido no canónico, y X10 es [Oic], [4-Cl-F], [D-4ClF], [D-1 Nal], [D-Bip] o está ausente. En algunas divulgaciones, X9 es [D-Tic], [4-Cl-F] [D-4ClF], [Aic], [Oic], [D-igl], [f], [D-1Nal], [D-2Nal], [1 -Nal], [2-Nal] o [D-Bip] y X10 está ausente. En ciertas divulgaciones, el conjugado de lípido-péptido puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 153-155, 166, 171, 173-175, 180, 199, 201,208 y 245-256.
Los conjugados de lípido-péptido de apelina ejemplares de la invención se proporcionan en la Tabla 7 que sigue. La presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende la secuencia de uno cualquiera de los conjugados de lípido-péptido enumerados en la Tabla 7.
Tabla 7. Conjugados de lípido-péptido de apelina ejemplares
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Cualquiera de los grupos acilo grasos en los conjugados de péptido específicos enumerados en la Tabla 7 se puede sustituir con otro grupo acilo graso, tal como los enumerados en la Tabla 6. A modo de ejemplo, un grupo acilo graso de TDA en cualquiera de los péptidos específicos enumerados anteriormente se pueden sustituir con un HDA, ODDA, u otro grupo acilo graso. En algunas realizaciones, un grupo acilo graso con una cadena de carbono más larga se puede sustituir con un grupo acilo graso con una cadena de carbono más corta en los conjugados de péptido enumerados anteriormente. Por ejemplo, un grupo acilo graso de palmitαlo, TDA, HDA u ODDA se puede sustituir por un grupo butanoílo o hexanoílo. En otras realizaciones, el grupo acilo graso en los conjugados de péptido específicos enumerados en la Tabla 7 se puede sustituir con otro resto que prolongue la semivida (p. ej., Pe G o una inmunoglobulina Fc) como se describe en esta memoria. En realizaciones alternativas, cualquiera de las porciones del péptido de apelina de los conjugados se puede usar como agonistas de APJ en una forma no conjugada.
En ciertas realizaciones, el resto que prolonga la semivida o vehículo es un polímero. Por lo tanto, cualquiera de los polipéptidos de apelina modificados desvelados en esta memoria se puede conjugar, opcionalmente mediante un enlazador de conjugación, con un polímero, particularmente un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, el resto de polímero que prolonga la semivida es un polímero de polietilenglicol (PEG), covalentemente unido, opcionalmente mediante un enlazador de conjugación, en el extremo N, extremo C o con una o más cadenas laterales intercaladas del polipéptido de apelina. En algunas realizaciones, el péptido conjugado puede incluir uno o más restos de PEG conjugados con un resto que prolonga la semivida distinto de PEG o con el polipéptido de apelina, o con cualquier combinación de cualquiera de estos. Por ejemplo, una inmunoglobulina o dominio Fc de inmunoglobulina o porción del mismo se puede mono-PEGilar, di-PEGilar, o multi-PEGilar de otro modo, por el proceso de conjugación covalente, y el polipéptido de apelina se puede conjugar con la inmunoglobulina o dominio Fc de inmunoglobulina por el uno o más restos de PEG.
La conjugación covalente de proteínas y péptidos con PEG puede prolongar significativamente las semividas en circulación in vivo. Se cree que la PEGilación logra este efecto predominantemente retardando la depuración renal, puesto que el resto de PEG añade considerable un radio hidrodinámico a la molécula (véase Zalipsky et al., "Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides, in poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications", J.M. Harris, Ed., Plenum Press: New York, 347-370, 1992). Beneficios adicionales conferidos a menudo por la PEGilación de proteínas y péptidos incluyen una solubilidad, resistencia a la degradación proteolítica incrementadas y una inmunogenicidad reducida del polipéptido terapéutico. Los méritos de la PEGilación de proteínas se demuestran por la comercialización de varias proteínas PEGiladas que incluyen PEG-adenosina desaminasa (Adagen™/Enzon Corp.), PEG-L-asparaginasa (Oncaspar™/Enzon Corp.), PEG-Interferón a-2b (PEG-Intron™/Schering/Enzon), PEG-Interferón a-2a (PEGASYS™/Roche) y PEG-G-CSF (Neulasta™/Amgen), así como muchos otros en ensayos clínicos.
Por "péptido PEGilado", "polipéptido PEGilado" o "proteína PEGilada" se indica un péptido que tiene un resto de polietilenglicol (PEG) unido covalentemente a un residuo de aminoácido del propio péptido o a un enlazador peptidílico o no peptidílico que se une covalentemente a un residuo del péptido, ya sea directa o indirectamente mediante otro resto enlazador. Un ejemplo no limitante es la conjugación N-terminal del péptido con 3-(1-(1-bromo-2-oxo-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-undecaoxa-3-azaoctatriacontan-38-il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)propanoílo (designado en esta memoria por la abreviatura "{bromoacetamida-PEG11-triazol} -").
Por "polietilenglicol" o "PEG" se entiende un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatización con restos de acoplamiento o activación (p. ej., con aldehído, hidroxisuccinimidilo, hidrazida, tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, disulfuro de ortopiridilo, vinilsulfona, yodoacetamida o un resto maleimida). De acuerdo con diversas realizaciones, PEG útil incluye PEG de cadena lineal, sustancialmente lineal, PEG ramificado (brPEG) o PEG dendrítico. Véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. N.° 5.171.264; 5.932.462; 6.602.498.
Brevemente, los grupos PEG generalmente se pueden fijar a la porción peptídica de la composición mediante acilación o alquilación (o aminación reductora) a través de un grupo reactivo en el resto de PEG (p. ej., un grupo aldehído, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el compuesto (p. ej., un grupo aldehído, amino o éster). Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste en combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, un péptido y un resto de PEG, portando cada uno una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva con el otro. Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis en fase sólida convencional. Los péptidos se pueden «preactivar» con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con el resto de PEG. El ligamiento del péptido con PEG tiene lugar habitualmente en fase acuosa y puede controlarse fácilmente mediante HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente mediante HPLC preparativa y caracterizarse mediante HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masas con desorción láser.
El PEG es un polímero soluble en agua bien conocido que está comercialmente disponible o se puede preparar por polimerización por abertura de anillo de etilenglicol según métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, 3:138-161). En la solicitud, el término "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, en forma mono-, bi- o poli-funcional, sin tener en cuenta el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar por la fórmula:
X-O(CH2CH2O)n-R,
en que n es 3 a 2300 y X es H o una modificación terminal, p. ej., un metilo o alquilo C1-4, y R es el resto reactivo utilizado para la fijación covalente.
En algunas realizaciones, se puede utilizar un PEG que termine en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("metoxi PEG"). Se observa que el otro extremo del PEG, que se muestra en la fórmula anterior que termina en R, se fija covalentemente a un resto de activación por un enlace de oxígeno del éter, un enlace amina o enlace amida. Cuando se usa en una estructura química, el término "PEG" incluye la fórmula anterior sin el hidrógeno del grupo hidroxilo mostrado, quedando el oxígeno disponible para reaccionar con un átomo de carbono libre de un enlazador para formar un enlace éter. Más específicamente, con el fin de conjugar PEG con un péptido, el péptido debe reaccionar con PEG en una forma "activada". El PEG activado se puede representar mediante la fórmula: (PEG)-(A)
donde PEG (definido arriba) se fija covalentemente a un átomo de carbono del resto de activación (A) para formar un éter enlace, un enlace amina o enlace amida, y (A) contiene un grupo reactivo que puede reaccionar con un grupo amino, azido, alquino, imino, maleimido, N-succinimidilo, carboxilo, aminooxi, seleno o tiol en un residuo de aminoácido de un péptido o un resto enlazador unido covalentemente al péptido de apelina.
Ejemplos de diversos restos de PEG se muestran a continuación y en la Figura 2.
Aminoalquil PEG
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Hidrazida PEG
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Azido PEG
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Maleimida PEG
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p-Nitrofenil carbonato PEG
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NHS carbonato PEG
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Disulfuro de orto-piridilo PEG
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Aeaa (ácido [2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acético) es otro PEG que se puede usar para aumentar la estabilidad de los péptidos de apelina o puede desempeñar una función espacial, funcional y/o estructural en un enlazador de conjugación del polipéptido de apelina. La estructura de Aeea se muestra a continuación.
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Técnicas para la preparación de PEG activado y su conjugación con péptidos biológicamente activos son bien conocidas en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. N.° 5.643.575, 5.919.455, 5.932.462 y 5.990.237, 5.985.265 y 5.824.784; Thompson et al., "PEGylation of polypeptides", documento de patente EP 0575545 B1; Petit, "Site specific protein modification", las patentes de EE. UU. N.° 6.451.986 y 6.548.644; S. Herman et al., "Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins", J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187, 1995; Y. Lu et al., "PEGylated peptides III: Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecular weight: synthesis of multiply PEGylated peptides", Reactive Polymers, 22:221-229, 1994; A.M. Felix et al., "PEGylated Peptides IV: Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs", Int. J. Peptide Protein Res., 46:253-264, 1995; A.M. Felix, "Site-specific poly(ethylene glycol)ylation of peptides", ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol)), 218-238, 1997; Y. Ikeda et al., "Polyethylene glycol derivatives, their modified peptides, methods for producing them and use of the modified peptides", documento de patente EP 0473084 B1; G.E. Means et al., "Selected techniques for the modification of protein side chains, in: Chemical modification of proteins", Holden Day, Inc., pp. 219, 1971).
El PEG activado, tales como PEG-aldehídos o hidratos de PEG-aldehído, puede sintetizarse químicamente por medios conocidos u obtenerse de fuentes comerciales, p. ej. Shearwater Polymers, (Huntsville, Al) o Enzon, Inc. (Piscataway, NJ).
Un ejemplo de un PEG activado útil puede ser un compuesto de PEG-aldehído (p. ej., un metoxi-PEG-aldehído), tal como PEG-propionaldehído, que está disponible comercialmente de Shearwater Polymers (Huntsville, Al). El PEG-propionaldehído está representado por la fórmula PEG-CH2CH2CHO. Véanse, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 5.252.714. También se incluyen dentro del significado de «compuesto de PEG-aldehído» los hidratos de PEG-aldehído, p. ej., PEG acetaldehído hidrato y PEG bis aldehído hidrato, este último que produce una estructura activada bifuncionalmente. Véase, p. ej., Bentley et al., "Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines", patente de EE. UU. N.° 5.990.237. Se puede usar un compuesto de PEG-aldehído multirramificado activado, por ejemplo, derivados de PEG que comprenden múltiples brazos para dar construcciones divalentes, trivalentes, tetravalentes, octavalentes. Usando un derivado de PEG de 4 brazos, se pueden fijar cuatro polipéptidos de apelina a cada molécula de PEG. Por ejemplo, el polipéptido de apelina se puede conjugar con un polietilenglicol (PEG) en 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con amino del PEG.
Al estar conjugado, el polietilenglicol (PEG), tal como se describe en esta memoria, se une covalentemente mediante la alquilación de un tiol presente en el péptido o se une covalentemente mediante una reacción de cicloadición entre restos azido y alquino presentes en el PEG y el péptido. Alternativamente, el PEG se puede unir covalentemente por aminación reductora directamente a al menos un resto de amina libre expuesto a disolvente de un residuo de aminoácido del propio polipéptido de apelina. En algunas realizaciones, el polipéptido de apelina se puede conjugar con un PEG con una o más aminas primarias o secundarias en el péptido, o con dos grupos PEG en un único sitio de la amina primaria en el péptido (p. ej., esto puede ocurrir cuando la reacción de aminación reductora implica la presencia de exceso de compuesto de PEG-aldehído). Se ha observado que cuando la PEGilación por aminación reductora está en una amina primaria en el péptido, no es raro tener cantidades (intervalo de 1 a 100%) de producto de reacción que tienen dos o más PEG presentes por molécula y, si se desea, el producto de PEGilación es uno con solo un PEG por molécula, entonces esta "sobre-PEGilación" puede ser indeseable. Cuando se desea un producto PEGilado con un solo PEG por molécula de producto de PEGilación, se puede emplear una realización que implique la PEGilación utilizando aminas secundarias del péptido farmacológicamente activo, porque solo se transferirá un grupo PEG por molécula en la reacción de aminación reductora.
Los residuos de aminoácidos que pueden proporcionar un residuo de amina primaria incluyen residuos de lisina, homolisina, ornitina, ácido a, p-diaminopropiónico (Dap), ácido a, p-diaminopropionoico (Dpr) y ácido a,Y-diaminobutírico (Dab), ácido aminobutírico (Abu) y ácido a-amino-isobutírico (Aib). El extremo N del polipéptido también proporciona un grupo a-amino útil para la PEGilación. Los residuos de aminoácidos que pueden proporcionar un resto de amina secundaria incluyen s-N-alquil lisina, a-N-alquil lisina, 5-N-alquil ornitina, a-N-alquil ornitina o una prolina N-terminal, en que el alquilo es C1 a C6.
Otro PEG activado útil para generar los análogos PEGilados es un compuesto de PEG-maleimida, tal como, pero no limitado a una metoxi PEG-maleimida, tal como maleimido monometoxi PEG, que son particularmente útiles para generar péptidos conjugados con PEG. (p. ej., Shen, "N-maleimidyl polymer derivatives", patente de EE. UU. N.° 6.602.498; C. Delgado et al., "The uses and properties of PEG-linked proteins", Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 9:249-304, 1992; S. Zalipsky et al., "Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides, in: Poly(ethylene glycol) chemistry", Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, Ed., Plenum Press: New York, 347-370, 1992; S. Herman et al., "Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins", J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187, 1995; P.J. Shadle et al., "Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1", patente de EE. UU. N.° 4.847.325; G. Shaw et al., "Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof, patentes de EE. UU. N.° 5.166.322 y EP 0469074 B1; G. Shaw et al., "Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof, documento de patente EP 0668353 A1; G. Shaw et al., "Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof, documento de patente EP 0668354 A1; N.V. Katre et al., "Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof, patente de EE. UU. N.° 5.206.344; R.J. Goodson y N.V. Katre, "Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site", Biotechnol., 8:343-346, 1990).
Una vinil sulfona de poli(etilenglicol) es otro PEG activado útil para generar los polipéptidos de apelina conjugados con PEG por conjugación en residuos de aminoácidos tiolados, p. ej., en residuos de C. Véase, p. ej., M. M orpurgo et al., "P reparation and characterization o f poly(e thylene glycol) vinyl su lfone", Bioconj. Chem., 7:363-368, 1996; véase tam bién Harris, "Functiona liza tion o f polyethylene glycol fo r fo rm a tion o f active sulfonete rm ina ted PEG derivatives fo r b inding to pro teins and b io log ica lly com patib le m ateria ls", patentes de EE. UU. N.s 5.446.090; 5.739.208; 5.900.461; 6.610.281 y 6.894.025; y Harris, "W ate r soluble active sulfones o f po ly(e thylene glycol)", docum ento de patente WO 95/13312 A1. Otra forma activada de PEG que es útil de acuerdo con diversas realizaciones es un compuesto de éster de PEG-N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, éster de metoxi PEG-N-hidroxisuccinimidilo (NHS). También son útiles las formas de PEG activadas heterobifuncionalmente. Véase, p. ej., Thompson e t al., "PEGylation reagents and b io log ica lly active compounds fo rm ed th e rew ith ", patente de EE. UU. N.s 6.552.170.
En algunas realizaciones de producción de un conjugado de PEG-péptido de apelina, el polipéptido de apelina se hace reaccionar por técnicas químicas conocidas con un compuesto de PEG activado, tal como, pero no se limita a, un compuesto de PEG activado con tiol, un compuesto de PEG activado con diol, un compuesto de PEG-hidrazida, un compuesto de PEG-oxiamina o un compuesto de PEG-bromoacetilo (véase, p. ej., S. Hermán, "Poly(ethylene glycol) w ith Reactive Endgroups: I. M od ifica tion o f Proteins", J. Bioactive and Com patib le Polymers, 10:145-187, 1995; S. Zalipsky, "Chem istry o f Polyethylene Glycol Conjugates w ith Biologically Active M olecules", Advanced Drug Delivery Reviews, 16:157-182, 1995; R. Greenwald e t al., "Poly(ethylene glycol) conjugated drugs and prodrugs: a comprehensive review ", Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 17:101-161, 2000).
En otra realización, el PEG activado para generar un polipéptido de apelina conjugado con PEG puede ser un PEG multivalente que tiene más de un residuo activado. Restos de PEG multivalentes pueden incluir, pero no se limitan a los que se muestran a continuación en la Tabla 8:
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En otras realizaciones más, el polipéptido de apelina se puede hacer reaccionar por técnicas químicas conocidas con un compuesto de PEG multirramificado activado (derivados de PEG que comprenden múltiples brazos para dar construcciones divalentes, trivalentes, tetravalentes, octavalentes), tales como, pero no se limitan a, tetrapolietilenglicol éter de pentaeritritol. La funcionalización y derivados activados, tales como, pero no se limitan a, N-succinimidiloxicarbonil)propilo, p-nitrofeniloxicarbonilo, (--CO2-p-C6H4NO2), 3-(N-maleimido)propanamido, 2-sulfaniletilo y 3-aminopropilo. Usando un derivado de PEG de 4 brazos, se pueden fijar cuatro polipéptidos de apelina a cada molécula de PEG. Por ejemplo, el polipéptido de apelina se puede conjugar con un polietilenglicol (PEG) en:
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con amino del PEG;
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con tiol del PEG;
1,2, 3 o 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG;
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG;
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con azido del PEG;
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con alquino o alquino del PEG; o
1.2, 3 o 4 sitios funcionalizados con haluro o haluro-acetilamida del PEG.
El tamaño práctico más pequeño de PEG es de aproximadamente 500 Dalton (Da), por debajo del cual PEG se vuelve tóxico. Por encima de aproximadamente 500 Da, se puede utilizar cualquier masa molecular para un PEG según se desee en la práctica, p. ej., de aproximadamente 500 Dalton (Da) a 100.000 Da (n es 10 a 2300). El número de monómeros de PEG (n) se aproxima a partir de la masa molecular media utilizando un PM = 44 Da para cada uno de los monómeros. En algunas realizaciones, la masa molecular promedio combinada o total del PEG usado en un polipéptido de apelina conjugado con PEG puede ser desde aproximadamente 500 Da hasta 10.000 Da (n total es desde 10 hasta 230), o desde aproximadamente 10.000 hasta 40.000 Da (n total es desde 230 hasta 910), o desde aproximadamente 40.000 hasta 100.000 Da (n total es desde 910 hasta 2300).
En diversas otras realizaciones, la masa molecular combinada de la molécula de PEG no debería exceder de aproximadamente 100.000 Da. En algunas realizaciones, la masa molecular promedio combinada o total del PEG usado en un polipéptido de apelina conjugado con PEG puede ser desde aproximadamente 3.000 Da hasta 60.000 Da (n total es desde 70 hasta 1.400), desde aproximadamente 10.000 Da hasta 40.000 Da (n total es desde aproximadamente 230 hasta aproximadamente 910). En otras realizaciones, la masa combinada de PEG es de aproximadamente 20.000 Da a 30.000 Da (n total es de aproximadamente 450 a aproximadamente 680). En una realización, la masa molecular promedio combinada o total del PEG usado en un polipéptido de apelina conjugado con PEG es aproximadamente 5.000 Da (5 kDa). En otra realización, la masa molecular promedio del PEG usado en un polipéptido de apelina conjugado con PEG es aproximadamente 10.000 Da (10 kDa). En otra realización adicional, la masa molecular promedio del PEG usado en un polipéptido de apelina conjugado con PEG es aproximadamente 20.000 Da (20 kDa).
En algunas realizaciones, el polímero de PEG está conjugado con el polipéptido de apelina mediante un enlazador de conjugación como se describe en detalle más adelante. En una realización, el enlazador de conjugación comprende ácido 3-mercaptopropanoico (abreviado MerPr en esta memoria). En otra realización, el enlazador de conjugación comprende ácido 3-(1H-1,2,3-triazol-4-il)propanoico (abreviado 3TP en esta memoria). 3TP resulta del ácido pent-4-inoico cuando se emplea una reacción de click de azida de PEG para la conjugación. Los conjugados de PEG-péptido de apelina ejemplares de la invención se muestran en la Tabla 9 que sigue. Las abreviaturas de PEG usadas en la Tabla 9 y en cualquier parte en esta memoria se definen como sigue: NPeg11 = ácido 1-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-dodecaoxanonatriacontan-39-oico; [Pra](NPeg9) = ácido (S)-2-amino-3-(1-(32-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-decaoxadotriacontil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)propanoico; 10K-mPEGacetamidaReg, 10K-mPEGReg o 10K-mPEGacetamida = Metoxipolietilenglicol amina-N-acetamida (10 kDa); y 20K-mPEGacetamidaReg, 20K-mPEGReg, 20K-mPEGacetamida = Metoxipolietilenglicol amina-N-acetamida (20 kDa). Obsérvese que MerPr y 3TP, que son ambos enlazadores como se ha definido anteriormente, están situados entre el polímero de PEG y el extremo amino del polipéptido de apelina aún cuando la abreviatura del enlazador se enumere primero en las secuencias que siguen. En ciertas realizaciones descritas o reivindicadas en esta memoria, el polipéptido de apelina modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los péptidos enumerados en la Tabla 9 que sigue.
Tabla 9. Conjugados de PEG-péptido de apelina ejemplares
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En ciertas realizaciones de la invención, el resto que prolonga la semivida o vehículo es una inmunoglobulina o dominio Fc de inmunoglobulina, particularmente una inmunoglobulina humana o dominio Fc de inmunoglobulina humana (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). Por lo tanto, cualquiera de los polipéptidos de apelina modificados desvelados en esta memoria se puede conjugar, opcionalmente mediante un enlazador de conjugación, con una inmunoglobulina o dominio Fc de inmunoglobulina. En realizaciones en las que el enlazador de conjugación está presente, el enlazador de conjugación puede ser un enlazador peptidílico o no peptidílico. En ciertas realizaciones, el enlazador no peptidílico comprende un polímero de PEG. El término "inmunoglobulina" abarca anticuerpos completos que comprenden dos cadenas pesadas (HC) dimerizadas, cada una enlazada covalentemente a una cadena ligera (LC); una única cadena pesada de inmunoglobulina no dimerizada y cadena ligera enlazada covalentemente (HC LC); o un heterotrímero de inmunoglobulina quimérico (cadena ligera cadena pesada)-Fc (un denominado "hemicuerpo"). Una "región Fc", o usado indistintamente en esta memoria, "dominio Fc" o "dominio Fc de inmunoglobulina", contiene dos fragmentos de la cadena pesada, que pueden comprender los dominios CH1, CH2 y CH3 de un HC de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende los dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulina, pero no el dominio CH1. Los dos fragmentos de cadena pesada de un dominio Fc se mantienen juntos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios CH3.
La fusión recombinante o conjugación química de los polipéptidos de apelina de la invención con una inmunoglobulina recombinante o dominio Fc de inmunoglobulina de cualquiera de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 puede ser útil para prologar la semivida farmacocinética. Véase, p. ej., el documento de patente WO 2010/108153A2. Cualquiera de las inmunoglobulinas portadoras o dominios Fc de las mismas desvelados en los documentos de patente WO 2010/108153 A2 o w O/2012/040518, o conversiones de isotipo de cualquiera de ellas que comprenden dominios constantes de diferente isotipo, u otras inmunoglobulinas portadoras conocidas en la técnica, se pueden usar como restos que prolongan la semivida dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, también se puede emplear monómeros de Fc de inmunoglobulina de variante aglucosiladas (p. ej., IgG1 de variante N297G; documento de patente WO 2012/075037 A1) y/o sustituidas con cisteína ("CysMab") para estabilidad potenciada o función efectora modificada. Véase, p. ej., el documento de patente WO2007/022070 A2.
Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada (HC) de IgG2 humana que se puede usar para producir una inmunoglobulina o resto que prolonga la semivida de dominio Fc tiene la secuencia de aminoácidos:
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Se conocen en la técnica secuencias de la región constante de otros isotipos de IgG para un isotipo de inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, si se desea. En general, la IgG2 humana se puede usar para dianas donde no se desean funciones efectoras, e IgG1 humana en situaciones donde se desean dichas funciones efectoras (p. ej., citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC)). La IgG3 tiene una semivida relativamente corta y la IgG4 humana forma "semimoléculas" de anticuerpo. Existen cuatro alotipos conocidos de IgG1 humana. El alotipo preferido se denomina "hIgG1z", también conocido como el alotipo "KEEM". Los alotipos de IgG1 humana "hIgG1za" (KDEL), "hIgG1f" (REEM) y "hIgG lfa" también son útiles; parece que todos tienen función efectora de ADCC.
El dominio constante de la cadena pesada (HC) de hIgG1 z humana tiene la secuencia de aminoácidos:
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El dominio constante de la cadena pesada (HC) de hIgG1 za humana tiene la secuencia de aminoácidos:
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El dominio constante de la cadena pesada (HC) de hIgG1f humana tiene la secuencia de aminoácidos:
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El dominio constante de la cadena pesada (HC) de hIgGIfa humana tiene la secuencia de aminoácidos:
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En algunas realizaciones de la invención, el resto que prolonga la semivida es un dominio Fc de inmunoglobulina (p. ej., un dominio Fc de inmunoglobulina humana, que incluye Fc de alotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) o una porción del mismo (p. ej., dominio CH2 del dominio Fc). El dominio Fc puede comprender la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 716 y 729-733. En una realización, el dominio Fc con el que está conjugado un polipéptido de apelina de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 716.
Fusiones o conjugados de Fc dimérico monovalente o dimérico bivalente-péptido de apelina son realizaciones útiles de los conjugados de péptido de la invención. Una fusión o conjugado de Fc "dimérico monovalente"-péptido de apelina, o indistintamente, "dímero monovalente" o indistintamente, "heterodímero monovalente", es una fusión o conjugado de Fc-análogo de péptido de apelina que incluye un péptido de apelina conjugado con solo uno de los dominios Fc dimerizados. Una fusión de Fc "dimérico bivalente"-análogo de péptido de apelina, o indistintamente, "dímero bivalente" u "homodímero bivalente", es una de fusión o conjugado de Fc-péptido de apelina que tiene ambos dominios Fc dimerizados, cada uno de ellos conjugado por separado con un análogo de péptido de apelina.
Los dominios Fc de inmunoglobulina incluyen variantes de Fc, que son restos que prolongan la semivida adecuados dentro del alcance de la presente invención. Un Fc nativo puede ser ampliamente modificado para formar un variante de Fc según la presente invención, siempre que se mantenga la unión al receptor de rescate; véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 97/34631, WO 96/32478 y WO 04/110472. En dichas variantes de Fc, se pueden retirar uno o más sitios de un Fc nativo que proporciona características estructurales o actividad funcional no requerida por las moléculas de fusión o conjugado de la presente invención. Se pueden retirar estos sitios, p. ej., sustituyendo o delecionando residuos, insertando residuos en el sitio, o truncando porciones que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos también pueden ser aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos. Pueden ser convenientes variantes de Fc por diversos motivos, varios de los cuales se describen a continuación. Las variantes de Fc ejemplares incluyen moléculas y secuencias en las que:
1. Se retiran sitios implicados en la formación de enlaces disulfuro. Dicha retirada puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedadora usadas para producir las moléculas de la invención. Para este fin, el segmento que contiene cisteína en el extremo N puede estar truncado o se pueden delecionar o sustituir residuos de cisteína con otros aminoácidos (p. ej., alanilo, serilo). Incluso cuando se retiran residuos de cisteína, los dominios Fc monocatenarios pueden todavía formar un dominio Fc dimérico que se mantiene junto no covalentemente.
2. Un Fc nativo se modifica para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, se puede retirar la secuencia de dipéptidos de PA cerca del extremo N de un Fc nativo típico, que puede ser reconocida por una enzima digestiva en E. coli, tal como prolina iminopeptidasa. También se puede añadir un residuo de metionina aminoterminal, especialmente cuando la molécula se expresa recombinantemente en una célula bacteriana, tal como E. coli.
3. Una porción del extremo N de un Fc nativo se retira para prevenir la heterogeneidad aminoterminal cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este fin, se puede delecionar cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácidos en el extremo N, particularmente aquellos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5.
4. Se retiran uno o más sitios de glucosilación. Los residuos que normalmente están glucosilados (p. ej., asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Dichos residuos pueden ser delecionados o sustituidos con residuos no glucosilados (p. ej., alanina).
5. Se retiran los sitios implicados en la interacción con el complemento, tal como el sitio de unión a C1q. Por ejemplo, se puede delecionar o sustituir la secuencia de tripéptidos de EKK de IgG1 humana. El reclutamiento del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de la presente invención y así se puede evitar con dicha variante de Fc.
6. Se retiran los sitios que afectan la unión a receptores de Fc distintos de un receptor de rescate. Un Fc nativo puede tener sitios para la interacción con ciertos glóbulos blancos que no son requeridos por las moléculas de fusión o conjugado de la presente invención y, por lo tanto, se pueden retirar.
7. Se retira el sitio de ADCC para reducir o eliminar la función efectora de ADCC, o alternativamente, modificar para función efectora de ADCC potenciada por no fucosilación o desfucosilación. Se conocen en la técnica los sitios de ADCC; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29(5): 633-9, 1992, con respecto a sitios de ADCC en IgG1. Estos sitios, además, no son requeridos por las moléculas de fusión o conjugado de la presente invención y, por lo tanto, se pueden retirar, o potenciar para la función efectora de ADCC, como puede desearse. Véase, Iida et al., Two mechanisms of the enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) efficacy of non-fucosylated therapeutic antibodies in human blood, BMC Cancer 9:58, 2009, doi:10.1186/1471 -2407-9-58.
8. Cuando el Fc nativo deriva de un anticuerpo no humano, el Fc nativo se puede humanizar. Normalmente, para humanizar un Fc nativo, se sustituirán residuos seleccionados en el Fc nativo no humano con residuos que normalmente se encuentran en Fc nativo humano. Se conocen bien la técnica las técnicas para la humanización de anticuerpos.
9. Un enlazador peptidílico o no peptidílico de longitud adecuada y carga neutra, tal como los descritos en más detalle a continuación, se puede fusionar covalentemente entre el extremo N del polipéptido de apelina de la invención y el extremo C, extremo N, o un residuo interno de un dominio Fc. En algunas realizaciones, el dominio Fc se puede manipular para incluir un residuo interno (tal como un residuo de cisteína) con el que el polipéptido de apelina se puede conjugar (véase el Ejemplo 11). Otros dominios Fc manipulados que se pueden usar en los conjugados de Fc-péptido de apelina se describen en el documento de patente WO2007/022070 A2. Para los fines de la invención, un dominio Fc de variante también puede ser parte de una cadena pesada monomérica de la inmunoglobulina, un anticuerpo, o un hemicuerpo heterotrimérico (LC+HC+Fc).
Se apreciará que se pueden preparar ''multímeros'' de conjugados de péptidos, puesto que el resto que prolonga la semivida empleado para la conjugación del polipéptido de apelina (con o sin un resto enlazador intermedio) puede ser multivalente (p. ej., bivalente, trivalente, tetravalente o un orden de valencia superior) con respecto al número de residuos de aminoácidos con los que se puede conjugar el resto que prolonga la semivida. En algunas realizaciones, el péptido puede ser multivalente (p. ej., bivalente, trivalente, tetravalente o un orden de valencia superior), y, por lo tanto, algunos "multímeros" pueden tener más de un resto que prolonga la semivida. En consecuencia, es posible producir una diversidad de estructuras peptídicas de restos que prolongan la semivida conjugados. A modo de ejemplo, un resto univalente que prolonga la semivida y un péptido univalente pueden producir un conjugado 1:1; un péptido bivalente y un resto que prolonga la semivida univalente pueden formar conjugados en los que los conjugados de péptidos portan dos restos del resto que prolonga la semivida, mientras que un resto bivalente que prolonga la semivida y un péptido univalente pueden producir especies en las que dos entidades peptídicas están enlazadas a un resto único que prolonga la semivida; el uso de un resto que prolonga la semivida de valencia superior puede conducir a la formación de agrupaciones de entidades peptídicas unidas a un único resto que prolonga la semivida, mientras que péptidos de valencia superior pueden incrustarse con una pluralidad de restos que prolongan la semivida. A modo de ejemplo adicional, si el sitio de conjugación de un resto que prolonga la semivida multivalente con el polipéptido de apelina es una cisteína u otro aminotiol, se pueden emplear los métodos desvelados por D’Amico et al., "Method of conjugating aminothiol containing molecules to vehicles", publicado como la publicación de patente de EE. UU. N.° 2006/0199812.
Los restos de péptidos pueden tener más de un grupo reactivo que reaccionará con el resto que prolonga la semivida activado y siempre debe considerarse la posibilidad de formar estructuras complejas; cuando se desee formar estructuras simples tales como aductos 1:1 del resto que prolonga la semivida y péptido, o utilizar el resto bivalente que prolonga la semivida para formar aductos de péptido:resto que prolonga la semivida:péptido, será beneficioso utilizar relaciones predeterminadas de resto activado que prolonga la semivida y material peptídico, concentraciones predeterminadas de los mismos y llevar a cabo la reacción bajo condiciones predeterminadas (tales como duración, temperatura, pH, etc.) para formar una proporción del producto descrito y luego separar el producto descrito de los otros productos de reacción. Las condiciones de reacción, proporciones y concentraciones de los reactivos se pueden obtener por experimentos de ensayo y error relativamente simples que están dentro de la capacidad de un experto en la técnica con aumento de escala apropiado, según sea necesario. La purificación y separación de los productos se consigue de forma similar mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.
Además, sales fisiológicamente aceptables del resto que prolonga la semivida fusionado o conjugado con el polipéptido de apelina también están englobadas por diversas realizaciones descritas en esta memoria.
Los restos que prolongan la semivida anteriormente descritos y otros restos que prolongan la semivida descritos en esta memoria son útiles, ya sea individualmente o en combinación, y como se describe adicionalmente en la técnica, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. N.° 2007/0071764 y el documento de patente WO 2008/088422. Diversas realizaciones engloban el uso de cualquier especie individual de resto que prolonga la semivida farmacéuticamente aceptable, tal como, pero no se limita a, las descritas en esta memoria, en conjugación con los polipéptidos de apelina, o el uso de una combinación de dos o más restos que prolongan la semivida similares o diferentes.
Los polipéptidos de apelina modificados de la invención se pueden conjugar o unir, en algunas realizaciones, con un resto que prolonga la semivida mediante un enlazador de conjugación. El enlazador, p. ej., puede consistir en un tioéter, amina, imina, amida, triazol, disulfuro o un enlace carbono-carbono. Por lo tanto, en diversas realizaciones, p. ej., un tioéter puede conectar el vehículo o resto que prolonga la semivida con el polipéptido de apelina. En ciertas realizaciones, el enlazador de conjugación, cuando está presente, comprende Aeea, Aeea-Aeea, yGlu-Aeea, yGlu-Aeea-Aeea, o yGIu. Véase, p. ej., el Ejemplo 2 en esta memoria.
El enlazador de conjugación o resto enlazador puede ser un grupo orgánico peptidílico o no peptidílico biológicamente aceptable que se une covalentemente a un residuo de aminoácido de un polipéptido de apelina u otra cadena de polipéptidos (p. ej., una cadena pesada de la inmunoglobulina o cadena ligera o dominio Fc de inmunoglobulina) contenida en una composición, cuyo resto enlazador une o conjuga covalentemente el polipéptido de apelina u otra cadena de polipéptidos con otro péptido o cadena de polipéptidos en la composición, o con un resto que prolonga la semivida. En algunas realizaciones, un resto que prolonga la semivida, como se describe en esta memoria, se conjuga, es decir, se une directamente covalentemente, con un residuo de aminoácido del propio polipéptido de apelina, u opcionalmente, con un resto enlazador peptidílico o no peptidílico (que incluye, pero no se limita a, enlazadores aromáticos o de arilo) que se une covalentemente con un residuo de aminoácido del polipéptido de apelina.
En algunas realizaciones, la presencia de un resto enlazador puede ser útil en optimizar la actividad farmacológica de los conjugados de péptido. El enlazador puede estar formado por aminoácidos enlazados entre sí por enlaces peptídicos. El resto enlazador, si está presente, puede ser independientemente el mismo o diferente de cualquier otro enlazador, o enlazadores, que puedan estar presentes en la composición. Como se ha establecido anteriormente, el resto enlazador, si está presente (ya sea dentro de la secuencia de aminoácidos primaria del péptido de apelina, o como un enlazador para la unión de un resto que prolonga la semivida con el péptido de apelina), puede ser de naturaleza "peptidilo" (es decir, constituido por aminoácidos unidos juntos por enlaces peptídicos) y ajustados en longitud, preferentemente, de desde 1 hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, de desde 1 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, o desde 1 hasta aproximadamente 10 residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos en el enlazador son de entre los veinte aminoácidos canónicos, p. ej., cisteína, glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y/o serina. En diversas realizaciones, un enlazador peptidílico puede estar formado por una mayoría de aminoácidos que no tienen impedimentos estéricos, tales como glicina, serina y alanina enlazadas por un enlace peptídico. También puede ser deseable que, si está presente, se seleccione un enlazador peptidílico que evite el rápido recambio proteolítico en circulación in vivo. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, como bien entienden los expertos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de enlazador útil que constituye un sitio de sialilación es X 1X2NX4X5G (SEQ ID NO: 734), en donde X 1, X2, X4 y X5 son, cada uno independientemente, cualquier residuo de aminoácido. También puede ser deseable que, si está presente, un enlazador peptidílico pueda consistir en cualquier aminoácido no canónico o una combinación de aminoácidos no canónicos y canónicos seleccionados para evitar o reducir el rápido recambio proteolítico in vitro y/o in vivo.
En otras realizaciones, los 1 a 40 aminoácidos del resto de enlazador peptidílico se pueden seleccionar de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Un enlazador puede estar formado por la mayoría de aminoácidos que no tienen impedimentos estéricos, tales como glicina y alanina. Por lo tanto, los enlazadores pueden incluir poliglicinas, poliserinas y polialaninas, o combinaciones de cualquiera de éstas. Algunos enlazadores peptidílicos ejemplares son poli(Gly)1-8, particularmente (Gly)3 (SEQ ID NO: 735), (Gly)4 (SEQ ID NO: 736), (Gly)5 (SEQ ID NO: 737) y (Gly)/ (SEQ ID NO: 738), así como, enlazadores poli-glicina-serina, tales como "L15" (Gg Gg s Gg Gg SGGGGS; SEQ ID n O: 739), enlazadores poli-glicina-alanina y polialanina. Otros ejemplos específicos de enlazadores peptidílicos útiles incluyen (Gly)5Lys (SEQ ID NO: 740) y (Gly)sLysArg (SEQ ID NO: 741). Otros ejemplos de enlazadores peptidílicos útiles son:
(Gly)aLys(Gly)4 (SEQ ID NO: 742);
(Gly)aAsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 743);
(Gly)aCys(Gly)4 (SEQ ID NO: 744); y
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 745).
Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 742) significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:742). También son útiles otras combinaciones de Gly y Lys o Gly y Ala.
Otros enlazadores son los identificados en esta memoria como "L5" (GGGGS; o "G4S"; SEQ ID NO: 746), "L10" (GGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 747); "L20" (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 748); "L25" (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 749) y cualquier enlazador utilizado en los ejemplos de trabajo que figuran más adelante.
En algunas realizaciones que comprenden un resto enlazador peptídico, se colocan restos de carácter ácido, por ejemplo, residuos de glutamato o aspartato en la secuencia de aminoácidos del resto enlazador. Ejemplos incluyen las siguientes secuencias de enlazador peptídico:
GGEGGG (SEQ ID NO: 750);
GGEEEGGG (SEQ ID NO: 751);
GEEEG (SEQ ID NO: 752);
GEEE (SEQ ID NO: 753);
GGDGGG (SEQ ID NO: 754);
GGDDDGG (SEQ ID NO: 755);
GDDDG (SEQ ID NO: 756);
GDDD (SEQ ID NO: 757);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO: 758);
WEWEW (SEQ ID NO: 759);
FEFEF (SEQ ID NO: 760);
EEEWWW (SEQ ID NO: 761);
EEEFFF (SEQ ID NO: 762);
WWEEEWW (SEQ ID NO: 763); o
FFEEEFF (SEQ ID NO: 764).
Los enlazadores mostrados aquí son ejemplares; los enlazadores peptidílicos pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. Un enlazador peptidílico puede contener, p. ej., una cisteína, otro tiol o nucleófilo para la conjugación con un resto que prolonga la semivida. En otra realización, el enlazador puede contener un residuo de cisteína u homocisteína, u otro resto de 2-amino-etanotiol o 3-amino-propanotiol para la conjugación con maleimida, yodoacetamida o tioéster, resto funcionalizado que prolonga la semivida.
Otro enlazador peptidílico útil es un enlazador grande y flexible que comprende una secuencia Gly/Ser/Thr aleatoria, por ejemplo: GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 765) o HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT (SEQ ID NO: 766), que se estima que tiene aproximadamente el tamaño de una molécula de PEG de 1 kDa. Alternativamente, un enlazador peptidílico útil puede estar compuesto por secuencias de aminoácidos conocidas en la técnica por formar estructuras helicoidales rígidas (p. ej., Enlazador rígido: - AEAAAKEAAAKEAAAKAGG (SEQ ID NO: 767). Adicionalmente, un enlazador peptidílico también puede comprender un segmento no peptidilo, tal como una molécula alifática de 6 carbonos de fórmula -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-. Los enlazadores peptidílicos se pueden alterar para formar derivados tal como se describe en esta memoria.
Un resto de enlazador no peptidílico también es útil para conjugar el resto que prolonga la semivida con el péptido de apelina. Por ejemplo, se pueden utilizar enlazadores de alquilo, tales como -NH-(CH2)s-C(O)-, en donde s = 2-20. Estos enlazadores de alquilo se pueden sustituir adicionalmente por cualquier grupo de impedimento no estérico, tal como alquilo inferior (p. ej., C1-C6), acilo inferior, halógeno (p. ej., Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc. Los enlazadores no peptidílicos ejemplares son enlazadores de PEG (p. ej., mostrado a continuación):
Figure imgf000096_0001
en donde n es tal que el enlazador tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 Dalton (Da). En ciertas realizaciones, el enlazador no peptidílico es bromoacetil-NPeg11 como se ilustra en el Ejemplo 11 para un conjugado de Fc-péptido de apelina.
El enlazador también podría ser un aminoácido no natural, tal como ácido aminohexanoico, o un grupo orgánico, tal como un ácido dicarboxílico, tal como ácido succínico (ácido butanodioico).
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En una realización, el enlazador no peptidilo es arilo. Los enlazadores se pueden alterar para formar derivados de la misma manera que se describe en esta memoria. Además, los restos de PEG pueden fijarse a la amina N-terminal o aminas de cadena lateral seleccionadas por alquilación reductora utilizando aldehídos de PEG o acilación utilizando hidroxisuccinimido o ésteres de carbonato de PEG, o por conjugación con tiol.
"Arilo" es fenilo o fenilo condensado vecinalmente con un puente de carbono de 3, 4 o 5 miembros saturado, parcialmente saturado o insaturado, estando el fenilo o el puente sustituido con 0, 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-8, haloalquilo C1-4 o halo. "Heteroarilo" es un anillo bicíclico, insaturado, de 5, 6 o 7 miembros, monocíclico o parcialmente saturado o insaturado de 6, 7, 8, 9, 10 u 11 miembros, en donde al menos un anillo está insaturado, el anillo monocíclico y los anillos bicíclicos que contienen 1, 2, 3 o 4 átomos seleccionados de N, O y S, en donde el anillo está sustituido con 0, 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-8, haloalquilo C1-4 y halo. Las porciones que no son péptidos, tales como enlazadores no peptidílicos o restos no peptídicos que prolongan la semivida pueden sintetizarse mediante reacciones de química orgánica convencionales.
Lo anterior es simplemente ilustrativo y no un tratamiento exhaustivo de los tipos de enlazadores que se pueden emplear opcionalmente según las diversas realizaciones de los conjugados de péptido de apelina que prolongan la semivida de la invención.
Como una estrategia adicional para aumentar la estabilidad de los polipéptidos de apelina, se pueden preparar polipéptidos en los que un enlace covalente une cualesquiera dos átomos presentes en el polipéptido para formar una estructura cíclica. Xn y Xn+3 o Xn y Xn+4 son independientemente un aminoácido natural o no natural seleccionado de K, D, Orn, Dab o E en estereoquímica D o L, donde las cadenas laterales de los aminoácidos en estas posiciones están unidas juntas covalentemente formando un enlace amida (-NHC(O)- o -C(O)-NH-). El enlace amida se puede formar directamente por la cadena lateral amino y grupos funcionales carboxilo o con un enlazador diamino, biscarboxilo o amino-carboxilo que forma los enlaces amida. Alternativamente, el enlace amida se puede sustituir con cualquiera de un monosulfuro (-S-), un disulfuro (-S-S-) o un enlace de la fórmula -S-CH2-C(=Z)-CH2-S-; en donde Z es O, N-O- CH2C(O)- para realizar la ciclación. En algunas realizaciones, los polipéptidos de apelina cíclicos se conjugan con un resto que prolonga la semivida para potenciar adicionalmente la estabilidad de los péptidos y/o modular el perfil farmacocinético de los péptidos.
En una divulgación, un polipéptido de apelina modificado se puede describir por la siguiente fórmula:
N1[AC4Abu]N2X, en donde: N1 es un grupo acilo graso o Acetil-NH, N2 es [Aeea][Aeea] o [Aeea], y X es un polipéptido de apelina de 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos de longitud que comprende E1xxK1 (ciclado por un enlace amida entre E y K), en donde xx es 2-3 aminoácidos seleccionados de D- o L-aminoácidos, a- o p-aminoácidos, aminoácidos homologados, aminoácidos N-metilados, a-metilaminoácidos, aminoácidos que llevan la cadena lateral en N en lugar del carbono a u otro aminoácido canónico o no canónico.
En otra divulgación, un polipéptido de apelina modificado de la invención se puede describir por la siguiente fórmula:
[Z]X1 X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X 12 X13PX14 (SEQ ID NO: 768) que tiene solo un enlace amida entre la cadena lateral de carboxilato de E y la cadena lateral de amino de K y en donde: Z es acetilo, acilo, [Atz(PEG10)], un derivado de PEG, {TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea], u otro resto que prolonga la semivida o está ausente; X 1 es r, [hArg], [NmeArg], R, ausente o E y si X 1 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X4 o X5; X2 es r, [hArg], [NmeArg], R, ausente, o E y si X2 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X5 o X6 ; X3 es Q, q o E y si X3 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X6 o X7; X4 es r, [hArg], [NmeArg], R, K o E y si X4 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X7 o Xg, o si X4 es K su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X1 ; X5 es P, K o E y si X5 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición Xg o X9, o si X5 es K su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X1 o X2 ; X6 es r, [hArg], [NmeArg], R, K o E y si X6 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X9 o X10, o si X6 es K su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X2 o X3; X7 es [Cha], [NmeLeu], K o E y si X7 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X10 o X11, o si K es X7 su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X3 o X4; Xg es S, K o E y si X8 es E su cadena lateral de carboxilato forma un enlace amida con la cadena lateral de un K en la posición X10 o X11, o si X8 es K su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X4 o X5; X9 es H, o K y si X9 es E su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X5 o X6 ; X10 es K y su cadena lateral de amina puede formar, pero no forma necesariamente, un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X6 o X7 ; X11 es G, o K y si X11 es K su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X7 o Xg; X12 es [Oic] o K y si X12 es K su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X8 o X9; X13 es [p-I-Phe], [Nle], o K y si X13 es E su cadena lateral de amina forma un enlace amida con la cadena lateral de E en la posición X9, y X14 es [D-Bip], [D-4C1F] o [4-Cl-F].
Los polipéptidos de apelina cíclicos ejemplares conjugados con un resto de lípido se muestran en la Tabla 10. E1xxK1 o E1xxxK1 (subrayado) indica la posición de ciclación por las cadenas laterales de los residuos E y K.
Tabla 10. Polipéptidos de apelina cíclicos ejemplares
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En algunas divulgaciones, un polipéptido de apelina modificado se puede describir por la siguiente fórmula: Z i Z2 X i X2 X3 X4X5 X6X7 X8X9 X 10X11X12 X 13 X14 X i 5 X16 X 17 (SEQ ID NO: 769), en donde Z i es un grupo acilo; Z2 comprende un enlazador de conjugación o está ausente; X1 es O, K, [D-Orn], [k], [BLys], [D-BLys], [BhLys], o [D-BhLys] o está ausente; X2 es F, [BhPhe], [BPhe] o está ausente; X3 es R, [hArg], [r], [NMeArg], [NMehArg], [rhArg], [rArg], [BhArg] o está ausente; X4 es R, [hArg], [r], [NMeArg], [NMehArg], [rhArg], [rArg], [BhArg] o está ausente; X5 es Q, L, N, [q], [l], [PE], [BhGln], [BhAsn], [aMeLeu], [aMeGln], [Bleu] o [BhLeu]; X6 es R, [hArg], [r], [NMeArg], [NMehArg], [rhArg], [rArg] o [BhArg]; X7 es P, [Sar], [Aib], [BhPro], [aMePro], [Oic], [rPro] o [Pip]; X8 es R, [hArg], [r], [NMeArg], [NMehArg], [rhArg], [rArg] o [BhArg]; X9 es L, [Cha], [NMeCha], [rCha], [rLeu], [NMeLeu], [aMeLeu], [BLeu], o [BhLeu]; X10 es S, [aMeSer], [BhSer], [rSer], [Sar] o [bAla]; X 11 es H, A, V, L, Y, [Deg], [Tle], [NMeVal] o [bAla]; X12 es K, [NMeLys], [BhLys], [BLys] o [bAla]; X 13 es G, [Sar], [Aib] o [bAla]; X14 es P, [Sar], [Aib], [BhPro], [aMePro], [Oic], [Idc], [rPro], o [Pip]; X 15 es M, L, V, I, [Met(O)], [Nle], [Nva] o [pI-Phe]; X 16 es P, [Sar], [Aib], [BhPro], [aMePro], [Oic], [Idc], [rPro], o [Pip]; y X17 es F, [Tic], [D-Tic], [Tiq], [D-Tiq], [4-Cl-F], [pI-Phe], [D-4FF], [D-4CIF], [D-4IF], [Idc], [Aic], [Oic], [D-Igl], [f], [D-1 Nal], [D-2Nal], [1 -Nal], [2-Nal] o [D-Bip] o está ausente. En una divulgación particular, X16 es F, [Tic], [D-Tic], [Tiq], [D-Tiq], [4-Cl-F], [pI-Phe], [D-4FF], [D-4C1F], [D-4IF], [Idc], [Aic], [Oic], [D-Igl], [f], [D-1Nal], [D-2Nal], [1 -Nal], [2-Nal] o [D-Bip] y X17 está ausente.
En ciertas divulgaciones, Z 1 es un grupo acilo graso C1 a C25 saturado o insaturado. Por ejemplo, Z1 puede ser cualquier grupo acilo graso de la Tabla 6, tal como un grupo acilo graso seleccionado de octanoílo (Oct) o decanoílo (Dec) o dodecanαlo (DDA), tridecanαlo (TDA), tetradecanoílo (miristαlo), pentadecanαlo (PDA), hexadecanoílo (palmitαlo), heptadecanoílo (HDA), octadecanαlo (estearαlo), octadecanodioílo (ODDA). En algunas divulgaciones, Z1 es acetilo. En otras divulgaciones, Z1 es un polímero de PEG de 5 kDa, 10 kDa o 20 kDa o cualquier otro polímero de PEG desvelado en esta memoria. En algunas divulgaciones, Z2 es un enlazador de conjugación que comprende Aeea, yglutamato, o combinaciones de los mismos. En otras divulgaciones, el enlazador de conjugación Z2 está ausente.
La presente invención proporciona uno o más de los polipéptidos de apelina modificados o conjugados de los mismos desvelados en esta memoria para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno, u otra afección médica, particularmente trastornos cardíacos. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, o al menos uno de los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno, es suficiente para afectar dicho tratamiento para la enfermedad, trastorno o síntoma. La "cantidad terapéuticamente eficaz" puede variar dependiendo del conjugado de polipéptido o péptido específico empleado, la enfermedad, el trastorno y/o los síntomas de la enfermedad o trastorno, la gravedad de la enfermedad, trastorno y/o síntomas de la enfermedad o el trastorno, la edad del sujeto que se va a tratar, y/o el peso del sujeto que se va a tratar. Una cantidad apropiada en cualquier caso dado puede ser fácilmente evidente para los expertos en la técnica.
Como se usa en esta memoria, "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere a detener o mejorar una enfermedad, trastorno, o al menos uno de los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno, reducir el riesgo de adquirir una enfermedad, trastorno, o al menos uno de los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno, reducir el desarrollo de una enfermedad, trastorno, o al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad o trastorno, o reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno o al menos uno de los síntomas clínicos de una enfermedad o trastorno. "Tratar" o "tratamiento" se refiere también a inhibir la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente, (p. ej., estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (p. ej., estabilización de un parámetro físico), o ambos, o inhibiendo al menos un parámetro físico que puede no ser perceptible para el sujeto. Además, "tratar" o "tratamiento" se refiere a retrasar la aparición de la enfermedad o trastorno o al menos los síntomas de la misma en un sujeto que se puede exponer a o predisponer a una enfermedad o trastorno aún cuando ese sujeto no ha notado o mostrado todavía los síntomas de la enfermedad o trastorno.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación de polipéptidos de apelina modificados
Se han preparado polipéptidos que pueden actuar de agonistas de APJ. Los polipéptidos se cribaron para potencia y estabilidad metabólica como se describe en detalle en los siguientes ejemplos. Las secuencias se optimizaron mediante técnicas conocidas en la técnica en las que uno o más aminoácidos se pueden cambiar mientras se mantiene o mejora la afinidad, actividad funcional o estabilidad del péptido. Nishizawa et al., Peptide Science 37:151-157, 2001; Murza et al., Chem MeD Chem., 7:318-325, 2012.
Se usaron diversos aminoácidos no canónicos en la preparación de los polipéptidos de apelina modificados. Algunos de estos aminoácidos están disponibles comercialmente. Lo siguiente describe métodos de preparación de ciertos aminoácidos no canónicos que se pueden usar en la síntesis de polipéptidos de apelina modificados.
ESQUEMA 1
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Preparación del compuesto 1
Se añadieron 4-metilmorfolina (1,25 ml, 11,4 mmoles) y cloroformiato de etilo (1,09 ml, 11,4 mmoles) a una disolución con agitación de ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-(1,3-bis(tercbutoxicarbonil)guanidino)hexanoico (6,95 g, 11,4 mmoles) en THF (50 ml) a -10 °C en un matraz de 3 bocas equipado con un termómetro. La mezcla se agitó a -10 °C durante 10 min. Se añadió borohidruro de sodio (1,29 g, 34,1 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó hasta 0 °C. Entonces se añadió lentamente metanol (50 ml) a 0 °C durante 30 min mediante un embudo de adición. La mezcla de reacción se diluyó entonces con acetato de etilo y se lavó con 5 % de ácido cítrico acuoso. La fase acuosa se separó y se extrajo una vez más con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con 5 % de ácido cítrico acuoso, bicarbonato sódico acuoso saturado, cloruro sódico acuoso saturado, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío dando un aceite. El aceite se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente del 50 al 100 % de EtOAc/heptano) dando 1 (4,68 g, 69 % de rendimiento) como un sólido blanco. LC/MS (ESI-) m/z = 597,3 (M+H)+.
Preparación del compuesto 2
Se añadió peryodinano de Dess-Martin (5,19 g, 12,2 mmoles) a una disolución helada de 1 (5,62 g, 9,42 mmoles) en DCM (50 ml) bajo argón. Se retiró el baño de hielo y la mezcla se agitó durante 3 h. La mezcla se vertió en una mezcla de dietil éter (100 ml) y bicarbonato sódico acuoso saturado (100 ml), y luego se agitó vigorosamente durante 30 min. La suspensión resultante se filtró y la torta de filtración se lavó con dietil éter. El filtrado bifásico se separó y la fase acuosa se extrajo con dietil éter (2x). Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío dando 2 , que se usó sin más purificación.
Preparación del compuesto 3
Se añadieron 1 -(-)-prolina (2,71 g, 23,6 mmoles) y triacetoxiborohidruro de sodio (2,99 g, 14,1 mmoles) a una disolución a 0 °C de 2 en DCM (50 ml) y la mezcla se agitó durante la noche con calentamiento hasta ta. Se añadió bicarbonato sódico acuoso saturado y la mezcla se agitó hasta que la mezcla bifásica se volvió clara. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con 9:1 de DCM/MeOH (2x). Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío dando un aceite. El aceite se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente de DCM al 9 % de MeOH/1 % de AcOH en DCM) dando ácido (S)-1-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-(1,3-bis(terc-butoxicarbonil)guanidino)hexil)pirrolidina-2-carboxílico (3 , 2,14 g, 33 % de rendimiento a partir de 1) como un sólido blanco. LC/MS (ESI-) m/z = 694,4 (M+H)+.
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Preparación del compuesto 5
Se añadieron N,N'-diciclohexilcarbodiimida (2,04 g, 9,90 mmoles) y fmoc-lys(boc)-OH (4,22 g, 9,00 mmoles) a una mezcla con agitación de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (0,97 g, 9,90 mmoles) y trietilamina (1,38 ml, 9,90 mmoles) en DCM (40 ml). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 2,5 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta -20 °C y se filtró. El sólido recogido se lavó con DCM frío y luego se desechó. El filtrado se lavó con bicarbonato sódico acuoso saturado, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. El producto en bruto resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice, eluyendo con 10 % al 75 % de EtOAc en heptano, dando tercbutil (6-(metoxi(metil)amino)-6-oxohexano-1,5-diil)dicarbamato de (S)-(9H-fluoren-9-il)metilo (5 , 4,31 g, 91% rendimiento) como un aceite. LC/MS (ESI-) m/z = 534,2 (M+Na)+.
Preparación del compuesto 6
Se añadió gota a gota hidruro de litio y aluminio (disolución 1,0 M en THF, 3,29 ml, 3,29 mmoles) a una disolución de terc-butil (6-(metoxi(metil)amino)-6-oxohexano-1,5-diil)dicarbamato de (S)-(9H-fluoren-9-il)metilo (5 , 886 mg, 1,73 mmoles) en THF (9 ml) a 0 °C. Esta mezcla se agitó durante 45 min antes de ser enfriada rápidamente a 0 °C por la cuidadosa adición de disolución acuosa 1 M de bisulfato de potasio. Se separó la mezcla bifásica resultante y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (1x). Los extractos combinados se lavaron con agua (1x), se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío dando 2-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexil)amino)acetato de (S)-alilo (6) como un aceite. Este material se llevó a la siguiente etapa sin más purificación.
Preparación del compuesto 7
Se disolvió 2-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexil)amino)acetato de (S)-alilo (compuesto 6) en DCM (4 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadió gota a gota una disolución de 2-aminoacetato de alilo (0,20 g, 1,73 mmoles) en DCM (1 ml), seguido de triacetoxiborohidruro de sodio (0,44 g, 2,08 mmoles). Esta mezcla se agitó a 0 °C durante 1 h, luego se extinguió con bicarbonato sódico acuoso saturado. La mezcla bifásica resultante se separó y la fase acuosa se extrajo con DCM (1 x). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío dando un aceite que se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente del 50 al 100 % de EtOAc/heptano) dando 2-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexil)amino)acetato de (S)-alilo (7, 0,51 g, 54 % de rendimiento durante dos etapas) como un aceite. LC/MS (ESI-) m/z = 552,2 (M+H)+.
Preparación del compuesto 8
Se añadieron base de Hunig (0,19 ml, 1,11 mmoles) y dicarbonato de di-terc-butilo (0,22 g, 1,02 mmoles) a una disolución de 2-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexil)amino)acetato de (S)-alilo (7, 0,51 g, 0,92 mmoles) en DCM (4 ml) bajo argón. La mezcla se agitó durante 4 h, momento en el que se añadió agua y el producto se extrajo en DCM (3x). Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío dando un aceite. El aceite se purificó por cromatografía en gel de sílice (gradiente del 0 al 100 % de EtOAc/heptano) dando 2-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-((tercbutoxicarbonil)amino)hexil)(terc-butoxicarbonil)amino)acetato de (S)-alilo (7, 0,52 g, 86 % de rendimiento) como un aceite. LC/MS (ESI-) m/z = 674,2 (M+Na)+.
Preparación del compuesto 9
Se añadieron tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (91 mg, 0,078 mmoles) y fenilsilano (0,19 ml, 1,57 mmoles) a una disolución desgasificada de 2-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexil)(terc b u tox icarb o n il)am in o )acetato d e (S )-a lilo (8 , 0 ,52 g, 0 ,78 m m oles) en D C M (5 ml). L a m e z c la se b u rbu jeó con argón d urante 3 min y luego s e agitó a T A d urante 2 h, m om ento en el que se a ñ a d ió a g u a y el producto s e extrajo en D C M (2 x). L o s extractos co m b in a d o s s e se c a ro n so b re sulfato de m a g n e sio an hidro, s e filtraron y s e co n cen traron a v a c ío d an d o un a ce ite . E l a ce ite s e purificó por cro m ato g rafía en gel d e s ílic e (gradiente del 0 al 10 % de M e O H /D C M ) d an d o el producto com o un só lid o m arrón. E ste só lid o s e d iso lv ió e n to n ce s en D C M ( 10 ml) y luego s e retiró u n a im p u re z a co lo re a d a a g itan d o con gel de s ílic e S ilia B o n d D M T ( 300 % en peso) d urante 1 h a 30 ° C . E l gel de s ílic e s e se p a ró por filtración u sa n d o C e lite y el filtrado s e co ncen tró a v a c ío d an d o á c id o (S ) -2 -((2 -((((9 H -flu o re n -9 -il)m e to x i)ca rb o n il)a m in o )-6 -((terc-b u to xicarb o n il)am in o )h e x il)(te rc-b u to x ica rb o n il)a m in o )a cé tico (9 , 0 ,36 g, 76 % de rendim iento) com o un só lido b lan co . L C /M S ( E S I -) m/z = 634 ,2 (M Na)+.
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Preparación del compuesto 1b
U n a s u s p e n sió n d e (1a) co m e rcia lm e n te d isp o n ib le (6 ,0 g, 9 ,82 m m oles), p a ra fo rm a ld e h íd o (2 ,95 g, 29 ,5 m m oles), á c id o 4 -m e tilb e n ce n o su lfó n ico , m o nohidratad o (0 ,093 g, 0 ,491 m m oles) en tolueno ( 150 ml) se calen tó h a sta 75 ° C d urante 30 m in. L a d iso lu ció n s e enfrió h a sta 20 ° C , luego s e extrajo con 5 % de N a H C O 3 (2 x 25 ml). L a o rg á n ic a s e se c ó so b re M g S O 4, s e filtró, luego s e co ncen tró so b re s ílic e s e c a ( 10 g) a presió n re d u cid a . Lo s prod uctos s e pu rificaron e n to n ce s por cro m ato g rafía en gel de s ílic e ( 220 g) e lu ye n d o los productos con un g rad ien te del 0 al 40 % de acetato de etilo /heptano p rop orcio n an d o 5 -o x o -4 -( 3 -o x o -3 -(trit ila m in o )p ro p il)o xa zo lid in a-3 -carb o x ila to de (S ) -(9 H -flu o re n -9 -il)m etilo (1b, 5 ,95 g, 97 % rendim iento) com o un só lido b lan co . m /z (A P C I, ion p os.) 645 ,2 (M N a).
Preparación del compuesto 1c
A una disolución con agitación de (1b) (5,95 g, 9,56 mmoles) y trietilsilano (5,56 g, 47,8 mmoles) en CHCl3 (30 ml) a 20 °C se añadió ácido trifluoroacético (30 ml). La disolución se agitó durante 18 h a 40 °C. Los disolventes se retiraron entonces a presión reducida y el residuo se separó por cromatografía azeotrópica con AcOH glacial (3 x 100 ml) proporcionando (S)-(9H-fluoren-9-il)metil 5-oxo-4-(3-oxo-3-(tritilamino)propil)oxazolidina-3-carboxilato (1c) como un sólido blanco que se usó en la siguiente etapa sin más purificación, m/z (APCl, ion pos.) 383,1 (M+1).
Preparación del compuesto 1d
A una suspensión con agitación de (1c) (3,6 g, 9,41 mmoles), trifenilmetanol (4,90 g, 18,83 mmoles), anhídrido acético (1,922 g, 18,83 mmoles) en AcOH glacial (40 ml) se añadió ácido sulfúrico puro (0,025 ml, 0,471 mmoles) a 20 °C. La mezcla amarillenta se calentó hasta 45 °C para crear una disolución y se agitó durante 18 h. La reacción se repartió entonces entre agua con hielo (200 ml) y EtOAc (200 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se concentró a presión reducida, luego se purificó por cromatografía en gel de sílice (220 g) eluyendo los productos con un gradiente del 10 al 30 % de 3:1 de acetato de etilo/etanol (disolvente B) y heptano (disolvente A) proporcionando ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)(metil)amino)-5-oxo-5-(tritilamino)pentanoico (1d, 3,85 g, 6,16 mmoles, 65,5 % rendimiento) como espuma blanca. m/z (APCI, pos. ion) 647,2 (M+Na).
También se llevó a cabo directamente la N-metilación del esqueleto del péptido según Scanlon et al. Int. J. Pept. Res. Ther. 2008, 14, 381-386 o Biron et al. J. Peptide Sci. 2006, 12, 213-219. Brevemente, el péptido soportado sobre resina se trató con cloruro de o-nitrobencenosulfonilo y 2,4,6-colidina, seguido por p-nitrotriflato de metilo y MTBD o con trifenilfosfina, DIAD y metanol. El producto intermedio o-nitrobencenosulfonamida se escindió mediante tratamiento con mercaptoetanol y DBU.
Sigue una descripción más detallada de la preparación de los polipéptidos de apelina modificados usando síntesis de péptidos en fase sólida.
Método experimental para la síntesis de péptidos
Se prepararon péptidos en un sintetizador de péptidos automático de alta resolución Intavis MultiPep RSi usando metodologías de síntesis de péptidos en fase sólida Na-Fmoc (SPPS) con protección ortogonal apropiada y estrategias de enlazadores de resina. Los péptidos se sintetizaron en una escala de 0,1 mmoles usando resinas de Fmocaminoácido precargadas. Los aminoácidos restantes se añadieron a la cadena de péptido en crecimiento por adición escalonada usando métodos convencionales en fase sólida en recipientes de reacción fritados de 10 ml. El grupo Na-Fmoc se retiró del aminoácido unido a la resina mediante la adición de disolución al 20 % de piperidina en dimetilformamida (DMF, 1 x 5 min, 1 x 15 min). Las reacciones de acoplamiento avanzaron por preactivación (5 min) de un exceso quíntuple del aminoácido Na-Fmoc, exceso quíntuple de diisopropilcarbodiimida (DIC) y exceso quíntuple de 1 -hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) en DMF de calidad para síntesis de péptidos, seguido de la adición a las resinas de péptido. Las concentraciones de reserva fueron aminoácido 0,5 M, DIC 1 M y HOAt 0,4 M. La mezcla de resina se mezcló durante 60 min por ciclo, se drenó y, si se usó un ciclo de acoplamiento doble, el ciclo de acoplamiento se repitió antes de la retirada de Fmoc. Tras la formación completa del péptido protegido, el grupo protector final Na-Fmoc se retiró como se ha descrito anteriormente. Se realizaron acilaciones aminoterminales como se describe para el acoplamiento de aminoácidos. Las acetilaciones aminoterminales se realizaron con 3 ml de 10 % de anhídrido acético y 0,5 ml de DIEA 1,25 M en DMF durante 1 h. Los péptidos con lipidación en los residuos de esqueleto se prepararon eliminando primero Mtt del residuo de Lys(Mtt) con una disolución al 2 % de TFA/5 % de Tis en DCM (5 x 10 min), neutralización de la épsilon-amina con 10 % de DIEA en DCM (2 x 5 min), seguido de acilaciones como se ha descrito anteriormente para los ciclos de acoplamiento de aminoácidos. Se lavaron las resinas de péptido con DMF (4x), DCM (6x) y se secaron minuciosamente a vacío antes de la escisión.
Método experimental para la desprotección y escisión del soporte sólido
Los péptidos se escindieron de la resina agitando cada resina de péptido en 5 ml de una disolución de ácido trifluoroacético (TFA, 87,5 %), triisopropilsilano (Tis, 5 %), agua (2,5 %), anisol (1 %) y tioanisol (1 %) durante 2 h a temperatura ambiente. Las disolución en TFA de péptido en bruto se transfirieron a tubos cónicos alquitranados de 50 ml por filtración usando un dispositivo de escisión Biotage Syro, las resinas se lavaron con 5 ml de la disolución de TFA y los filtrados se combinaron. Los filtrados combinados se concentraron en los tubos cónicos de polipropileno de 50 ml por centrifugación a vacío durante 2 h (Genevac HT-12), y los péptidos en bruto se recuperaron mediante precipitación con etil éter anhidro frío, dando un precipitado de color blanco a ámbar. Los tubos cónicos de 50 ml se centrifugaron a 3000 rpm durante 4 min, se decantó el éter, se lavaron los precipitantes con 50 ml adicionales de éter frío, se centrifugaron, se decantaron y luego se secaron a vacío antes del análisis analítico por CL-EM.
Método para el análisis analítico de péptidos en bruto
Se disolvieron péptidos en bruto en 50 % de ACN en H2O (0,1 % de TFA) y las disoluciones se filtraron con filtros de jeringa de 0,45 um. Se prepararon muestras de análisis en bruto para el análisis por CL-EM haciendo diluciones al 10 en 50 % de ACN en H2O (0,1 % de TFA). Los péptidos se analizaron por CL-EM analítica por elución de una columna Phenomenex Kinetex C18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm). Los péptidos acetilados se caracterizaron usando un gradiente lineal de 5-50 % de ACN en H2O (0,1 % de TFA) durante 3 min a un caudal de 1000 μl/min. Los péptidos PEGilados y lipidados se caracterizaron usando un gradiente lineal de 20-65 % de ACN en H2O (0,1 % de TFA) durante 3 min a un caudal de 1000 μl/min.
Método general para la purificación
Los péptidos se purificaron por cromatografía de líquidos de alta presión en fase inversa (RP-HPLC) preparativa por elución de una columna YMC Triart C18 (5 um, 30 x 250 mm). Los métodos típicos consistieron en un mantenimiento de 4 min en condiciones de equilibrio, seguido por un gradiente lineal de 0,333 % de aumento de acetonitrilo en H2O (0,1 % de TFA) durante 56 min a 40 ml/min. Se recogieron las fracciones de alta pureza correspondientes a los productos correctos, se combinaron, se concentraron a vacío y se liofilizaron proporcionando un sólido amorfo.
Método general para la caracterización
Se analizaron los productos purificados para pureza y verificación de MW en un sistema de CL-EM Agilent 1290 por elución de una columna Phenomenex Max-RP (2,5 μm, 2,0 x 50 mm). Los péptidos acetilados se caracterizaron usando un gradiente lineal de 5-50 % de ACN en H2O (0,1 % de TFA) durante 10 min a un caudal de 700 μl/min. Los péptidos PEGilados y lipidados se caracterizaron usando un gradiente lineal de 20-65 % de ACN en H2O (0,1 % de TFA) durante 10 min a un caudal de 700 μl/min. Los péptidos se cuantificaron por detección quimioluminiscente de nitrógeno (CLND). Los péptidos con > 95 % de pureza a 214 nM y con masa teórica observados se registraron en la base de datos y se sometieron a caracterización in vitro e in vivo adicional como se describe en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2. Preparación de polipéptidos de apelina lipidados
La lipidación de los polipéptidos de apelina modificados es una estrategia para prolongar la semivida de los polipéptidos modificados in vivo. Sigue una descripción genérica de la estrategia:
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A representa un grupo acilo graso, donde R = ácido carboxílico, amina, hidroxilo, éster, alqueno, alquino o metilo. B representa yGlu (ácido a-carboxi-4-aminobutírico; AC4Abu) para acidez y solubilidad. C es un grupo de PEG corto, tal como [ácido 2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acético (Aeea) para flexibilidad y solubilidad. X = punto de unión covalente al polipéptido de apelina. Como constituyentes independientes o unidos, B y C comprenden el enlazador de conjugación. El enlazador de conjugación no es crítico para lograr la prolongación de la semivida y no contribuyen a la actividad de agonista de APJ intrínseca del polipéptido de apelina, pero desempeña un papel espacial, funcional y/o estructural entre el resto de acilo graso que prolonga la semivida y el polipéptido de apelina. A este respecto, el enlazador de conjugación puede estar ausente o se puede sustituir con cualquier otro resto que realice la unión covalente del grupo de prolongación de la semivida de acilo graso.
Los ácidos grasos se unen covalentemente al extremo N, o los aminoácidos correspondientes en las posiciones 70 o 71 en la preproteína de apelina (SEQ ID NO: 2), u otros sitios en el péptido. El grupo acilo graso se puede unir directamente al polipéptido o con un espaciador tal como: AEEA (grupo de PEG pequeño), AEEA-AEEA, yGIu-AEEA, YGlu-AEEA-AEEA, yGIu, u otro aminoácido. La cadena de alquilo del ácido graso está compuesta normalmente por 2 a 24 unidades de metileno.
Se conjugaron diversos polipéptidos de apelina modificados con varios grupos acilo grasos diferentes según esta estrategia y los polipéptidos lipidados resultantes se probaron para la actividad de agonista del receptor de APJ como se describe en los Ejemplos 3 y 10. Se debe observar que los polipéptidos de apelina en las secuencias que siguen y descritas en esta memoria, sin conjugación (p. ej., sin conjugación con un grupo acilo graso) también pueden servir de agonistas de APJ.
Ejemplo 3. Actividad de agonista de APJ de polipéptidos de apelina modificados
Se usaron más de 800 péptidos modificados en ensayos de relación estructura-actividad para optimizar la potencia y estabilidad metabólica con respecto al ligando endógeno del receptor de APJ, pir apelina-13 (SEQ ID NO: 6). Los compuestos se cribaron hasta 10 μM junto con pir apelina-13, que se usó como control positivo. Los compuestos que mostraron actividad funcional en todos los ensayos de SAR se consideraron positivos y se volvieron a rastrear. El proceso iterativo continuó y los péptidos se modificaron adicionalmente para su optimización.
Se emplearon dos ensayos diferentes, que se describen a continuación, para evaluar la actividad de agonista de APJ de los polipéptidos de apelina modificados. El ensayo de cAMP implica medir cambios en cAMP intracelular como resultado de la activación del receptor de APJ. La activación del receptor de APJ por el ligando endógeno pir-apelina da como resultado una disminución en el cAMP intracelular. El segundo ensayo, que es el ensayo de GTPyS, mide el acoplamiento de proteína G al receptor de APJ cuando se une a un agonista. Por lo tanto, el grado de disminución en los niveles de cAMP y la eficacia de la proteína G unida al complejo de receptor de agonista se usa para evaluar el grado de actividad de agonista de los polipéptidos de apelina modificados.
Ensayo de cAMP
Se incubaron estirpes celulares CHO estables que expresan el receptor de APJ humano o de rata con tampón de estimulación que contenía tampón Hanks, forskolina e IBMX 0,5 mM en ausencia o presencia de diversas concentraciones de péptidos a 37 °C durante 45 min. El nivel de cAMP se determinó usando un kit de AMP cíclico (kit de cAMP de Cisbio) según las instrucciones del fabricante.
Ensayo de [35S] GTPyS
Para ensayar GTPyS unido al receptor, se prepararon membranas a partir de estirpes celulares estables que expresaban el receptor de APJ humano o de rata y se usó el receptor unido a GTP no hidrolizable (GTPyS) para determinar la eficacia/potencia de los péptidos modificados. Se determinaron inicialmente las condiciones experimentales óptimas para las concentraciones de GDP, MgCl2 y NaCl en el tampón de ensayo. Las membranas se incubaron con péptidos modificados en el tampón de ensayo. La reacción se inició mediante la adición de [35S] GTPyS en ausencia o presencia de péptidos y se incubó a temperatura ambiente durante 90 min. Se determinó la unión no específica en presencia de GTPyS frío en exceso y fue siempre inferior al 0,2 % de unión total. [35S] GTPyS unido se separó de radiomarcador libre por filtración. La radiactividad unida al filtro se determinó mediante recuento de centelleo líquido.
Los resultados del ensayo de GTPyS para diversos polipéptidos de apelina modificados se muestran en la Tabla 11 que sigue. Se proporcionan valores de CE50 para cada polipéptido modificado para la activación de los receptores de APJ humanos y de rata
Tabla 11. Actividad agonista de APJ de polipéptidos de apelina modificados
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Ejemplo 4. Los polipéptidos de apelina mejoran la función cardíaca
Para evaluar la función cardíaca hemodinámica de los péptidos, se usó un sistema de corazón aislado de Langendorff. El corazón aislado de rata proporciona un amplio espectro de mediciones que puede incluir índices bioquímicos, metabólicos, morfológicos y fisiológicos. Aunque el sistema carece de influencias neurohormonales, regulación neural y altos flujos coronarios, las ventajas del sistema incluyen la capacidad de estudiar efectos cardíacos directos sin circulación sistémica y un montón de interacciones periféricas. Este método puede dar excelentes relaciones dosisrespuesta y proporciona una visión crítica en las propiedades farmacológicas y fisiológicas de las moléculas de interés.
Se anestesió a los animales mediante administración de 50-100 mg/kg de dosis de pentobarbital sódico por vía intraperitoneal. El corazón se extirpó y se acunó suavemente entre los dedos para evitar lesiones, seguido de un ligero levantamiento antes de realizar una incisión en la aorta, la vena cava y los vasos pulmonares. Inmediatamente después de la escisión del corazón con aorta, el corazón se montó sobre la cánula en el aparato de Langendorff a través de la aorta. El corazón se perfundió con tampón de Krebs-Henseleit oxigenado modificado a pH 7,5 y se equilibró con 95 % de O2/5 % de CO2 a 37 °C. La perfusión se realizó a un flujo constante de 10 ml/min y regulando la velocidad a 300 lμm. La presión se midió mediante un catéter de detección de la presión con globo insertado en la cavidad ventricular izquierda. Los efectos intrínsecos de inotropía (fuerza de contracción muscular) y lusitropía (relajación cardíaca) del corazón se evaluaron mediante dp/dtmáx y dp/dtmín.
Se probaron los siguientes polipéptidos para los efectos sobre la función cardíaca en el sistema de corazón aislado de Langendorff.
Acetil-[hArg][r]Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH} (SEQ ID NO: 16)
Acetil-Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip] {COOH} (SEQ ID NO: 53)
Las Figuras 4A-D y 5A-D ilustran una mejora dependiente de la dosis de tanto la función sistólica como diastólica en corazones de rata perfundidos aislados con péptidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 53, respectivamente.
Ejemplo 5. Los polipéptidos de apelina mejoran la función cardíaca en ratas con insuficiencia cardíaca
Para evaluar los efectos cardiovasculares de los polipéptidos de apelina modificados, los polipéptidos se administraron a ratas con insuficiencia cardíaca inducida por infarto de miocardio (IM). La función cardíaca se evaluó por el sistema de bucle PV de Millar.
Se usaron ratas Lewis macho de 2-3 meses de edad para los estudios. El infarto de miocardio fue inducido por ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Se realizó una ecocardiografía una semana después del MI para el reclutamiento de los animales. Si la fracción de eyección (FE) era superior al 40% y no se identificaba infarto alguno en las imágenes de ecocardiografía, estos animales se excluyeron del estudio. Se insertó un catéter de bucle PV de Millar en la arteria carótida común derecha y luego se hizo avanzar al ventrículo izquierdo (VI) para la evaluación hemodinámica cardiovascular. El catéter de presión arterial se insertó en una arteria femoral para controlar la presión sanguínea periférica. Los experimentos se realizaron de seis a siete semanas tras la inducción del IM. Los siguientes polipéptidos de apelina se administraron por vía intravenosa por la vena yugular en diversas dosis.
Pir-Apelina: {Hidrógeno} [PE]RPRLSHKGPMPF {COOH} (SEQ ID NO: 6)
{Acetil-NH}[NPeg11]QRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{COOH} (SEQ ID NO: 109)
Acetil-[hArg][r]Q[hArg]P[r][NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH} (SEQ ID NO: 16)
Los péptidos se infundieron continuamente durante 30 min a cada dosis. Al final del experimento, el tamaño del infarto se verificó por morfología macroscópica. Las Figuras 6-8 muestran los resultados de estos experimentos. El tamaño del infarto (38-39 % de VI) fue muy similar entre grupos. Los resultados demuestran los efectos dependientes de la dosis de pir-apelina-13 (s Eq ID n O. 6; Figura 6A-D) y análogos modificados (SEQ ID NO. 109 y 16; Figuras 7A-D y 8A-D, respectivamente) sobre la función hemodinámica en ratas con IM tras la infusión continua. Se informan los cambios de contractilidad (dp/dt máx.), fracción de eyección (EF), presión arterial media (PAM) y frecuencia cardíaca (FC) con respecto al nivel basal al final del periodo de infusión de 30 min para cada polipéptido.
Ejemplo 6. Perfil farmacocinético de polipéptidos de apelina modificados
Se realizó la evaluación del perfil farmacocinético in vivo de varios polipéptidos de apelina pegilados y lipidados en rata (Figuras 9 y 10A-B). Los polipéptidos de apelina se administraron a ratas Sprague-Dawley mediante administración subcutánea (SC) y se evaluó posteriormente el perfil farmacocinético para cada polipéptido. Se administró a las ratas una disolución de tampón PBS que contenía el péptido de apelina por la vena yugular a una dosis final de 0,5 mg/kg o 5 mg/kg. Se transfirieron las muestras de sangre recogidas durante un periodo de 24 h a tubos de extracción que contenían EDTA potásico y se almacenaron sobre hielo hasta que se procesaron. El plasma se obtuvo de la sangre mediante centrifugación. Después de transferir a un recipiente de 96 pocillos, las muestras de plasma se almacenaron en un congelador mantenido a aproximadamente -80 °C. Se logró el análisis cuantitativo del polipéptido de apelina en muestras de plasma de rata usando el modo de monitoreo de múltiples reacciones (MRM) en un sistema de CL-EM/EM.
Se investigó la farmacocinética in vivo de una serie de péptidos PEGilados de 20 kDa en ratas Sprague-Dawley. La secuencia del polipéptido de apelina varió entre los péptidos probados, mientras que el polímero de PEG (PEG de 20 kDa) fue constante. La concentración plasmática/exposición se puede modular por estabilidad metabólica intrínseca del péptido. Como se muestra en la Figura 9, se lograron elevadas concentraciones plasmáticas con el péptido SEQ ID NO: 103 a 1/10 de la dosis de otros péptidos de apelina PEGilados de 20 kDa.
Las secuencias de los polipéptidos de apelina PEGilados usados en el estudio farmacocinético se enumeran a continuación:
{Acetil} [Atz(20-mPEG)]KFRRQRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F] ICOOHI (SEQ ID NO: 105)
{Acetil-NH}[Pra](20K-mPEG Reg)OF[hArg][hArg]QRP[hArg] [NMeLeu]SHKG [Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH} (SEQ ID NO: 107)
{Acetil-NH}[Pra](20K-mPEG Reg)OF[hArg][hArg]QRP[hArg] [NMeLeu]SHKG [Oic][pI-Phe]P[pI-Phe]{COOH} (SEQ ID NO: 108)
{H2}[3TP](20K-mPEG Reg)[hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH} (SEQ ID NO: 103)
Se investigó la farmacocinética in vivo de una serie de péptidos lipidados en ratas Sprague-Dawley. En el primer conjunto de experimentos, los grupos acilo grasos (tridecanoílo, pentadeconilo, heptadeconilo y octadecanodioílo) se variaron entre los péptidos probados, mientras que la secuencia de péptidos siguió igual. Como se muestra en la Figura 10A, la concentración plasmática/exposición se puede modular con longitud y composición del grupo acilo graso. La estructura para cada uno de los péptidos que se usaron en este primer conjunto de experimentos se representa a continuación:
{TDA}[AC4Abu][Aeea][Aeea][hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic][pI-Phe]P[D-Bip]{COOH} (SEQ ID NO: 261)
{PDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu] SHKG [Oic] [pI-Phe]P [D-Bip] {COOH} (SEQ ID NO: 262)
{HDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu] SHKG [Oic] [pI-Phe]P [D-Bip] {COOH} (SEQ ID NO: 263)
{ODDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu]SHKG[Oic] [pI-Phe]P[D-Bip] {COOH} (SEQ ID NO: 264)
En el segundo conjunto de experimentos, la secuencia del péptido de apelina se varió en SEQ ID NO. de polipéptido: 237, 213, 212 y 261, mientras que los grupos acilo grasos se diferenciaron entre las SEQ ID NO. de polipéptido: 237 y 263 y SEQ ID NO. de polipéptido: 212, 213 y 261. Como se muestra en la Figura 10B, la concentración/exposición plasmática se puede modular por estabilidad metabólica intrínseca del péptido, así como el grupo acilo graso. La estructura para cada uno de los péptidos que se usaron en este segundo conjunto de experimentos se representa a continuación:
{HDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [q] [hArg]P[NMeArg] [Cha] SHKG[Oic] [Nle]P[D-4ClF]{COOH}(SEQ ID NO: 237)
{HDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [hArg]rQ[hArg]Pr[NMeLeu] SHKG [Oic] [pI-Phe]P [D-Bip] {COOH}(SEQ ID NO: 263)
{TDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea]RQRP[hArg] [NMeLeu]SHKG[Oic] [pI-Phe]P[D-Bip] {COOH}(SEQ ID NO: 212) {TDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [hArg]rQ [hArg]Pr[NMeLeu] SHKG[Oic] [pI-Phe]P[D-Bip] {COOH}(SEQ ID NO: 261)
{TDA} [AC4Abu] [Aeea] [Aeea] [r]QRP[hArg][NMeLeu]SHKG[Oic] [pI-Phe]P[D-Bip] {COOH} (SEQ ID NO: 213) Ejemplo 7. Efecto de polipéptidos de apelina modificados sobre la desgranulación de mastocitos
Se midió la desgranulación de mastocitos para varios polipéptidos de apelina modificados del siguiente modo para determinar el posible efecto inmunogénico de los péptidos. Se usaron el péptido de desgranulación de mastocitos (MCDP) y el compuesto 48/80 como controles positivos. MCDP se obtuvo de Alomone Labs (Israel). El compuesto 48/80 se obtuvo de Sigma (Saint Louis, MI). El kit de ELISA de histamina se obtuvo de NEOGEN (Lexington, KY). Se obtuvo tampón de Tyrode de Sigma (N.° T2397).
Mastocitos peritoneales de rata
Se recogió líquido peritoneal de rata en tampón Tyrode de ratas Sprague Dawley o Lewis hembra de 8 semanas de edad (Gillespie et al., Histamine release from rat peritoneal mast cells: inhibition by colchicine and potentiation, 1968; 154-1). El porcentaje de mastocitos peritoneales (5-8 %) se determinó por citometría de flujo e inmunohistoquímica (IHC).
Mastocitos humanos
Se obtuvieron mastocitos humanos maduros de células precursoras de sangre periférica CD34+ después de un proceso de diferenciación/maduración de 8-12 semanas in vitro. Se obtuvieron células de sangre periférica CD34+ de AllCells (N.° MPB016F, ID de donante N.°: PCA1452A) y se cultivaron en los siguientes medios durante 8-12 semanas: medio sin suero SFEM11 Stem Spun (N.° 09655 de StemCell Technologies), 1x penicilina (100U/ml) y estreptomicina (100 ug/ml) (N.° 15140-122, Life Technologies), 1x gentamicina/anfotericina B (Gibco N.° 50-0640), 100 ng/ml de SCF (n .° 300-07, PeproTech), IL-3 durante la primera semana solo (5 ng/ml, N.° 203-IL-050, R&D Systems), IL-9 durante la semana 1-3 (15 ng/ml, N.° 209-IL-050, R&D Systems), IL-6 durante la semana 5-en adelante (50 ng/ml, N.° 206-IL-050, R&D Systems) e IL-4 durante la semana 8-en adelante (10 ng/ml, N.° 204-IL-050, R&D Systems). Se confirmó la maduración de mastocitos por expresión de los marcadores de mastocitos c-kit y FceRI por citometría de flujo (>75 % positivos) y liberación de histamina.
Medición de la desgranulación de mastocitos
Se lavaron mastocitos (humanos o de rata) en tampón Tyrode y se sembraron en placas de 96 pocillos (aprox. 2000 mastocitos/pocillo). Se preparó una dilución de 10 puntos de los compuestos de prueba en tampón Tyrode y se incubó (0,005 a 30 μM) con mastocitos a 37 °C durante 30 min. Cuando se probaron las moléculas lipidadas, tensioactivos tales como 0,1 % de Tween 80 de Croda (Edison, NJ) se pueden incluir en el tampón Tyrode para mantener la solubilidad de moléculas lipidadas en el ensayo. Se compara un control de tensioactivo de mastocitos con un control de tampón Tyrode de mastocitos para garantizar que los tensioactivos no están induciendo la liberación de histamina en ausencia de la molécula lipidada. La liberación de histamina se inactivó poniendo las placas sobre hielo durante 5 min. Las células se centrifugaron a 350 x g a 4 °C durante 5 min y el sobrenadante se recogió. La histamina liberada se cuantificó por ELISA (Neogen Corporation) según las instrucciones de los kits. Brevemente, se midió la absorbancia a 650 nm en un lector de microplacas, siguiendo una reacción de ELISA competitivo directo con muestras de prueba comparadas con una curva patrón. El contenido de histamina total de las células (0,1 % de Triton X-100) y la liberación espontánea también se midieron para determinar el porcentaje de liberación de histamina. El porcentaje de liberación de histamina se calculó por la siguiente fórmula:
% de liberación de histamina = (ng/ml de liberación de histamina por el artículo de prueba - ng/ml de liberación de histamina espontánea en tampón Tyrode) / (ng/ml de contenido de histamina total de células
lisadas en 0,1 % de Tritón X-100 - ng/ml de liberación de histamina espontánea en tampón Tyrode) x 100.
La Tabla 12 que sigue resume los resultados del ensayo de desgranulación de mastocitos de rata para varios polipéptidos de apelina modificados.
Tabla 12. Actividad de péptidos de apelina en inducir la liberación de histamina de mastocitos de rata
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Los polipéptidos de apelina sintéticamente modificados tienen un intervalo de potencias en inducir la liberación de histamina in vitro. Se Q ID NO: 50-52 son tan potentes como el control positivo, MCDP, mientras que SEQ ID NO: 237 y 6 (pir-apelina-13) son inactivas a las mayores concentraciones probadas. Se puede observar de la tabla que el polipéptido de SEQ ID No. 237 no induce la liberación de histamina en el ensayo.
Ejemplo 8. Polipéptidos de apelina modificados con capacidades de desgranulación de mastocitos reducidas
Como se muestra en el Ejemplo 7, algunos polipéptidos de apelina modificados inducen la liberación de histamina de mastocitos de rata, lo que indica que estos polipéptidos pueden tener un posible efecto inmunogénico. Para entender más completamente la relación entre la estructura de los polipéptidos modificados y la inducción de desgranulación, y para generar polipéptidos adicionales con capacidad de desgranulación reducida, se realizó un estudio adicional de la relación estructura-actividad (SAR). Los polipéptidos de apelina modificados en la Tabla 13 que sigue se probaron para la inducción de liberación de histamina de mastocitos de rata y humanos usando los métodos descritos en el Ejemplo 7. Los compuestos que indujeron menos del 30 % del contenido de histamina detectado total en las células se consideró que era negativo en el ensayo.
Tabla 13. Actividad de desgranulación de mastocitos de polipéptidos de apelina modificados
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Se propone que la desgranulación de mastocitos ocurre en parte por un mecanismo no inmunológico (Watt, A. P. Immunopharmacology, 2002, 9, 421-434) relacionado con las propiedades físicas de los desgranuladores de péptidos. Para los polipéptidos de apelina modificados, la desgranulación de mastocito se podría reducir disminuyendo la lipofilia de un compuesto y la carga formal. Por ejemplo, los residuos ácidos se podrían sustituir en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 63, 64, 66 y 68 en la preproteína de apelina (SEQ ID NO: 2) como en los polipéptidos modificados expuestos en SEQ ID NO: 75-77, 477 y 526. Se prefirieron residuos alifáticos (p. ej., Nle) en el aminoácido correspondiente a la posición 75 en SEQ ID NO: 2 y residuos aromáticos pequeños (p. ej., 4-Cl-F) en el aminoácido correspondiente a la posición 77 en SEQ ID NO: 2. La PEGilación o conjugación de proteína Fc (véase el Ejemplo 11) en el extremo N del polipéptido de apelina redujo la desgranulación de mastocitos en comparación con el propio polipéptido de apelina. Por ejemplo, el polipéptido de apelina de SEQ ID NO: 92 fue positivo en inducir la liberación de histamina de mastocitos de rata. Véase la Tabla 13. Sin embargo, si este mismo péptido se pegiló (polipéptido de SEQ ID NO: 120) o conjugó con un dominio Fc de inmunoglobulina (inmunoglobulina 4 en el Ejemplo 11), el péptido ya no indujo la liberación de histamina de mastocitos de rata. La acetilación aminoterminal fue bastante bien tolerada. En general, los péptidos lipidados tuvieron elevada lipofilia y, por lo tanto, tendieron a ser desgranuladores de mastocitos más potentes. Reduciendo aún más la carga formal (~<1), se podría evitar la desgranulación para péptidos lipidados también. Lípidos lipófilos menos lipófilos más cortos tuvieron menos actividad de desgranulación de mastocitos como se ilustra para el polipéptido de apelina de SEQ ID NO: 491.
Ejemplo 9. Polipéptidos de apelina modificados con estabilidad mejorada
Se realizó la evaluación de la estabilidad in vitro de plasma, hígado y riñón de varios péptidos de apelina modificados.
Los péptidos de apelina se enriquecieron en plasma, homogeneizado de hígado y homogeneizado de riñón de rata, que se obtuvieron de fuentes comerciales, hasta una concentración final de 5 μM. Entonces se incubaron las muestras a 37 °C durante un periodo de 4 h. Se muestrearon hasta 8 momentos de tiempo para facilitar la estimación de la semivida in vitro en las tres matrices diferentes. En un experimento típico, una alícuota de 100 μl de muestra se sacó del vial de incubación, seguido por la adición de 300 μl de MeOH que contenía patrón interno. La muestra extinguida se centrifugó a 5500 g durante 15 min después de 15 min de agitación en vórtice a temperatura ambiente. A continuación, se analizó el sobrenadante mediante LC-MS de alta resolución. Se usaron datos precisos de masas de barridos completos de masas para la estimación del nivel de péptido original con respecto a la evolución temporal de 4 h, y los d ato s s e u sa ro n p o steriorm en te p a ra la e stim a ció n d e la se m iv id a in vitro en p la sm a , h íg a d o y riñón. Los re su lta d o s d e la e sta b ilid a d in vitro d e p la sm a , rata y riñón s e m u estran a co n tin u ació n en la T a b la 14.
Tabla 14. Estabilidad de polipéptidos de apelina modificados en plasma, hígado y riñón de rata
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Basándose en los resultados de estos estudios de estabilidad, se identificaron sitios de metabolismo dentro de los polipéptidos de apelina modificados y estos sitios se sustituyeron con aminoácidos metabólicamente más estables. Se introdujeron aminoácidos no naturales mediante síntesis química para bloquear el metabolismo o reducir el reconocimiento por peptidasas. Un N-metilaminoácido en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 66 (NMeArg66), 68 (NMeArg68) y 69 (NMeLeu69) en SEQ ID NO: 2, un N-alquilaminoácido en la posición correspondiente al aminoácido 70 (NhSerG70) en SEQ ID NO: 2 y un alfa-metilaminoácido en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 67 (aMePro67), 69 (aMeLeu69), 74 (aMePro74) y 76 (aMePro76) en SEQ ID N: 2 puede impedir estéricamente el acceso de peptidasas a enlaces en los péptidos de apelina. Los D-aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 64, 65, 66 y 68 en SEQ ID NO: 2 (r64, q65, r66, r68) y betaaminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 65, 69, 70, 76 y 77 en SEQ ID NO: 2 (BLeu65, BLeu69, BhSer70, BhPro76, D-BhPhe77) pueden evitar el reconocimiento de peptidasas que escinden péptidos endógenos que contienen L-aminoácidos. Los aminoácidos del enlace amida reducidos por y(CH2NH), por ejemplo en una posición correspondiente al aminoácido 75 en SEQ ID NO: 2 (rNle75), sustituyen un enlace amida con un enlace amina más estable. Los péptidos cíclicos no son reconocidos por exopeptidasas e impiden estéricamente el acceso por otras peptidasas. El metabolismo oxidativo en la metionina 75 en la secuencia nativa (posiciones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 2) se evitó por sustitución con norleucina75. La combinación de NMeLeu, pI-Phe y D-Bip en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 69, 75 y 77, respectivamente, en SEQ ID NO: 2 dio péptidos particularmente estables. La conjugación con lípido o PEG mejoró la estabilidad in vitro de los péptidos y redujo la depuración in vivo.
Se realizó un análisis farmacocinético in vivo en rata para cuatro péptidos de apelina lipidados (SEQ ID NO: 286, 376, 379 y 382) según los métodos descritos en el Ejemplo 6. La Tabla 15 que sigue resume los resultados del estudio farmacocinético.
Tabla 15. Análisis FC en rata para polipéptidos de apelina modificados
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Ejemplo 10. Polipéptidos de apelina modificados con potencia mejorada
En algunos casos, la modificación de los polipéptidos de apelina para aumentar estabilidad condujo a una disminución en la potencia de los péptidos para activar el receptor de APJ. Para mejorar la potencia de agonista de APJ de los péptidos estabilizados, se realizó un estudio de SAR adicional. Los polipéptidos de apelina modificados en la Tabla 16 que sigue se probaron para la actividad de agonista de APJ usando el ensayo de GTPyS como se describe en el Ejemplo 3. Los valores de CE50 se proporcionan para cada polipéptido modificado para la activación de los receptores de APJ humanos y de rata.
Los resultados muestran que la potencia y eficacia de los péptidos se podría obtener conservando las características de las cadenas laterales de la secuencia nativa de apelina-13 (SEQ ID NO: 4), mientras que el esqueleto de péptido s e m odificó p a ra la e stab ilid ad . E n el extrem o N del polipéptido m o dificado , la s e c u e n c ia : hArg hArg Q hArg P ( S E Q ID N O : 715 ) en la s p o s ic io n e s co rre sp o n d ie n te s a los a m in o á c id o s 63 a 67 de S E Q ID N O : 2 prop orcionó b u e n a p o tencia. E n la s p o s ic io n e s co rre sp o n d ie n te s a los a m in o á c id o s 68 y 69 d e S E Q ID N O : 2 , los s ig u ie n te s p a re s de su stitu c io n e s d ieron potentes a g o n ista s: (i) N M eA rg y a M e L e u , (ii) hArg y B L e u , (iii) hArg y a M e L e u y (iv) N M ehA rg y L. L a s p o s ic io n e s dentro de los polip ép tid os m o d ifica d o s co rre sp o n d ie n te s a los a m in o á c id o s 70 a 73 de S E Q ID N O : 2 fueron m e n o s su sc e p tib le s a la s su stitu c io n e s, s in e m b a rg o B h S e r70 , N h S e rG 70 , Y 71 y N L y s G 72 fueron to le ra d a s. E n la p o sic ió n de a m in o á cid o en el polipéptido m o dificado co rre sp o n d ie n te al a m in o á cid o 74 de S E Q ID N O : 2 , s e prefirieron O ic y a M e P ro p a ra lograr potentes p ép tid os, y P ip en e sta p o sic ió n tam b ién tendió a m ejo rar la p otencia. E n la p o sició n de a m in o á cid o en el polipéptido m o dificado co rre sp o n d ie n te al a m in o á cid o 75 de SeQ ID N O : 2 , N le o rN le d ieron potentes c o m p u e sto s. Lo s re s id u o s del extrem o C (p o sic io n e s c o rre sp o n d ie n te s a los a m in o á c id o s 76 y 77 de S E Q ID N O : 2) fueron crítico s p a ra tanto la a ctiv id a d co m o la e stab ilid ad . B h P ro , a M e P ro o A ib en la po sició n co rre sp o n d ie n te al a m in o á cid o 76 y D -B h P h e o 4 -C l -F en la p o sic ió n co rre sp o n d ie n te al a m in o á cid o 77 dio un buen eq u ilib rio d e p o ten cia y e sta b ilid a d . L a co n ju g a c ió n d e líp id o s a m in o te rm in a le s tuvo poco efecto so b re la p o ten cia o e fic a c ia . P E G y los co n ju g a d o s de F c (v é a se el E je m p lo 11 ) no fueron so lu b le s en D M S O y s e rea liza ro n e n s a y o s in vitro d e re se rv a s a c u o s a s . E n a u s e n c ia de D M S O , la s le ctu ra s de p o ten cia y e f ic a c ia s e red ujeron, en g e n e ra l, en el e n s a y o de G T P y S . S in e m b a rg o , con resp ecto a [ M e rP r](10 K -m P E G a c e ta m id a R e g ) -a p e lin a 13 re a liza d o en la s m ism a s co n d ic io n e s ( C E 50 de h A P J 0 ,21 μM; C E 50 de rA P J 0 ,39 μM), P E G y los co n ju g a d o s d e F c de los polip ép tid os m o d ifica d o s fueron potentes a g o n ista s de A P J co m p leto s.
Tabla 16. Actividad de agonista de APJ de polipéptidos de apelina modificados
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Ejemplo 11. Conjugados de Fc de inmunoglobulina-péptido de apelina
Se usaron cuatro polipéptidos de apelina modificados de la invención (SEQ ID NO: 8-11) para la conjugación selectiva de sitio con una región Fc manipulada de una IgG humana. Los péptidos se conjugaron con la región Fc mediante un enlazador de bromoacetil-NPeg11 unido en el extremo amino de los péptidos. Haciendo reaccionar la porción de bromoacetamida del enlazador con un residuo de cisteína libre en la proteína Fc, se formó un enlace tioéter covalente como se ilustra a continuación.
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Las secuencias de los cuatro péptidos se muestran en la Tabla 17. La secuencia de proteínas de Fc de IgG humana se muestra a continuación.
Secuencia de Fc de IgG humana (SEQ ID NO: 716)
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La C subrayada indica el sitio de una cisteína manipulada y el punto de fijación covalente del polipéptido de apelina modificado. En el homodímero, C7-C7 y C10-C10 son disulfuros intermoleculares, mientras que C42-C102 y C148-C206 son disulfuros intramoleculares.
Tabla 17. Secuencias de aminoácidos de polipéptidos de apelina modificados para la conjugación de Fc selectiva de sitio
Figure imgf000179_0004
La proteína Fc forma un homodímero tras el plegamiento y así contiene dos sitios reactivos de cisteína manipulada por proteína plegada. Cada conjugado de Fc-homodímero contendrá idealmente dos copias del polipéptido de apelina modificado. Cada uno de los conjugados se evaluó para eficacia en activar los receptores de APJ de rata y humanos como se mide por el ensayo de Gt PyS (véase el Ejemplo 3 para los métodos). Los conjugados también se probaron para la inducción de liberación de histamina de mastocitos de rata (véase el Ejemplo 7 para los métodos). Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 18 que sigue. Los datos para los péptidos sin conjugar tam b ién s e m uestran p ara co m p a ra c ió n . C o m o s e pu ed e a p re c ia r de los re su ltad o s en la tab la, la co n ju g a c ió n d e los pép tid os d e a p e lin a no afectó s ig n ificativam e n te la po ten cia del péptido en a ctiva r el receptor d e A P J . A d e m á s , n inguno d e los c o n ju g a d o s de Fc-p é p tid o indujo la lib eración d e h ista m in a de m asto cito s de rata. En un c a so , el co n ju g a d o de F c e lim in ó la activa ció n de lib eración d e h istam in a del péptido sin co n ju g a r (v é a se el co n ju g a d o d e Fc-p é p tid o N .° 4).
Tabla 18. Comparación de conjugados de Fc-péptido de apelina con péptidos de apelina sin conjugar
Figure imgf000180_0001
A lo largo de e sta m em o ria d e scrip tiv a s e ha h ech o refe re n cia a d iv e rs a s p u b lic a c io n e s, patentes y so lic itu d e s de patentes. L a refe re n cia a d ich o s d o cu m e n to s no s e d eb e interpretar co m o un reco no cim iento de qu e d ich o s d o cu m e n to s s e a n estad o de la té c n ic a p a ra la so licitud .

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1 .Un polipéptido q u e co m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s :
X i X 2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X 9 X 10 G X 11 X 12 X 13 X 14 ( S E Q ID N O : 717 ) , en d on de:
X I e s R, E , [hArg] o a u se n te ;
X 2 e s [r], R, E , [hArg] o a u se n te ;
X 3 e s Q , [q] o [B Leu ];
X 4 e s [hArg], [N M eArg], R, E o [r];
X 5 e s P o [aM ePro];
X6 e s R, E , [r], [hArg] o [NM eArg];
X 7 e s L, [aM eLeu], [BLeu], [N M eLeu] o [C h a];
X8 e s S , [B h S e r] o [N h S e rG ];
X9 e s H o Y ;
X 10 e s K o [N L y sG ];
X I I e s P, [Oic], [aM ePro] o [P ip ];
X 12 e s [Nle], [rNle] o [p l-Ph e];
X 13 e s P, [BhPro], [aM ePro] o [Aib]; y
X 14 e s F, [D -B h P h e ], [4 -C I-F ] , [D -4 C IF ] o [D -B ip]
p a ra su u so en terap ia.
2 . E l polipéptido d e la re iv in d icac ió n 1 p a ra el u so al qu e s e refiere e sta m em oria , en d on d e el polipéptido e s tá acetilad o en su extrem o am in o o en d on d e el polipéptido e stá co n ju g a d o co n un grupo a cilo g ra so C 1 a C 25 satu rad o o insatu rad o , o con un polím ero d e polietilenglico l ( P E G ) , o con u n a in m u n o g lo b u lin a o un d om inio F c d e in m uno glo b ulina, o p cio n alm e n te m ed ian te un e n la z a d o r d e co n ju g a c ió n .
3 . E l polipéptido d e la re iv in d icac ió n 2 p a ra el u so al q u e s e refiere e sta m em oria , en d on d e
(a) el grupo a cilo g ra so e s trid e ca n o ílo , b u tanoílo , h e x an o ílo , h e x a d e ca n o ílo , bu tan o d in oílo , o cta n o d in o ílo o d e ca n o d in o ílo , o ctan o ílo , d e ca n o ílo , d o d e ca n o ílo , te trad e can o ílo , p e n ta d e ca n o ílo , h e x a d e ca n o ílo , h e p ta d e ca n o ílo , o cta d e ca n o ílo u o cta d e ca n d in o ílo ; o p cio n alm e n te en d on d e el e n la z a d o r d e co n ju g a c ió n co m p re n d e A e e a , A e e a -A e e a , y G lu -A e e a , y G lu -A e e a -A e e a o y G lu ;
(b) el po lím ero d e P E G e s un p o lím ero d e P E G de 5 k D a , 10 k D a o 20 k D a , o p cio n alm e n te e n d o n d e el e n la z a d o r de co n ju g a c ió n co m p re n d e á cid o 3 -m e rca p to p ro p a n o ico ; o
(c) el e n la z a d o r d e co n ju g a c ió n e s un e n la z a d o r p ep tid ílico o un e n la z a d o r no p ep tid ílico , o p cio n alm e n te en d o n d e el e n la z a d o r no p ep tid ílico co m p re n d e un polím ero d e P E G .
4 . E l polipéptido d e la re iv in d icac ió n 1 p a ra el u so al q u e se refiere e sta m em oria , en d on d e X 7 e s [N M eLeu], X 12 e s [pl-Phe] y X 14 e s [D -B ip ], o en d o n d e X 1 e s [hArg], X 2 e s [hArg], X 3 e s Q , X 4 e s [hArg] y X 5 e s P, o en d o n d e X6 y X 7 son [NM eArg] y [aM eLeu], [hArg] y [BLeu], o [hArg] y [aM eLeu], o en d on d e X 13 e s [BhPro], [aM ePro] o [Aib] y X 14 e s [D -B h P h e ] o [4 -C I-F ] , o en d o n d e el polipéptido co m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á cid o s s e le c c io n a d a d e S E Q ID N O : 8 ­ 11, 16 , 17 , 31, 32 , 45, 53 , 60, 68, 69 -71, 92 , 112 , 114 , 119 , 120 , 221, 228 , 237 , 263 , 286 , 287 , 362 , 373 , 376 , 379 , 38 2 , 388 , 412 , 416 , 460, 468, 482 , 483, 485, 491,49 8 , 499, 500, 502 , 505 , 514 , 519 , 526 , 531, 534 , 544, 552 , 554 , 560 , y 571.
5 . E l polipéptido de u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 4 p a ra el u so al q u e s e refiere e sta m em oria , en don de el polipéptido tien e e le v a d a e sta b ilid a d con resp ecto a a p e lin a -13 no m utante ( S E Q ID N O : 4) o la a p e lin a -13 no m utante p iro g lu ta m ad a ( S E Q ID N O : 6).
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