ES2939112T3 - Composiciones y métodos de uso de interleucina-10 en combinación con inhibidores de vías de puntos de control inmunitario - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona un método para el tratamiento de enfermedades neoplásicas en un sujeto mamífero, comprendiendo el método la administración de un agente IL-10 en combinación con la administración de al menos un modulador de al menos una vía de punto de control inmunitario. La presente descripción proporciona además un método para el tratamiento de la enfermedad neoplásica en el que el neoplasma tiene una carga de mutación tumoral baja o intermedia, un nivel bajo o intermedio de expresión de la molécula del punto de control inmunitario o una enfermedad neoplásica metastásica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de uso de interleucina-10 en combinación con inhibidores de vías de puntos de control inmunitario

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a agentes de IL-10 para su uso, en combinación con un inhibidor de vías de puntos de control inmunitario que es un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario, en el tratamiento o prevención del cáncer de pulmón no microcítico.

La citocina interleucina-10 (IL-10) es una citocina pleiotrópica que regula múltiples respuestas inmunitarias a través de acciones sobre los linfocitos T, linfocitos B, macrófagos y células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés). IL-10 puede suprimir respuestas inmunitarias al inhibir la expresión de IL-1a, IL-1p, IL-6, IL-8, TNF-a, GM-CSF y G-CSF en monocitos activados y macrófagos activados, y también suprime la producción de IFN-y por parte de las células NK. Aunque la IL-10 se expresa predominantemente en macrófagos, también se ha detectado expresión en linfocitos T activados, linfocitos B, mastocitos y monocitos. Además de suprimir las respuestas inmunitarias, IL-10 presenta propiedades inmunoestimuladoras, incluyendo la estimulación de la proliferación de timocitos tratados con IL-2 e IL-4, potenciando la viabilidad de los linfocitos B y estimulando la expresión de MHC de clase II.

Como resultado de su actividad pleiotrópica, IL-10 se ha relacionado con una amplia gama de enfermedades, trastornos y afecciones, incluyendo afecciones inflamatorias, trastornos relacionados con el sistema inmunitario, trastornos fibróticos, trastornos metabólicos y cáncer. Evaluaciones clínicas y preclínicas con IL-10 para diversas enfermedades, trastornos y afecciones de este tipo han consolidado su potencial terapéutico en el tratamiento de múltiples aplicaciones. Por otra parte, las variantes de IL-10, tal como IL-10 pegilada, han demostrado eficacia en múltiples aplicaciones terapéuticas, incluido el tratamiento del cáncer (véase por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 8.865.652 y 9.364.517).

La amplia cantidad de alteraciones genéticas y epigenéticas que son características de todas las células tumorales proporciona un conjunto diverso de antígenos que el sistema inmunitario puede utilizar para distinguir las células tumorales de sus homólogas normales. En el caso de la respuesta mediada por linfocitos T, la magnitud (por ejemplo, los niveles de producción o proliferación de citocinas) y la calidad (por ejemplo, el tipo de respuesta inmunitaria generada, tal como el patrón de producción de citocinas) de la respuesta inmunitaria iniciada a través del reconocimiento de antígenos por el receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés), está regulada por un equilibrio entre señales coestimulantes e inhibidoras. Si bien los ligandos y receptores coestimulantes e inhibidores que regulan la activación de los linfocitos T con frecuencia no se sobreexpresan en los cánceres con respecto a los tejidos normales, los ligandos y receptores inhibidores que regulan las funciones efectoras de los linfocitos T en los tejidos se sobreexpresan comúnmente en las células tumorales o en las células no transformadas asociadas con el microentorno tumoral.

La inmunidad mediada por linfocitos T incluye múltiples etapas secuenciales, cada una de las cuales está regulada contrarrestando señales estimulantes e inhibidoras para optimizar la respuesta. En condiciones normales, el equilibrio de estimulación e inhibición desempeña un papel importante en la prevención de la autoinmunidad (es decir, el mantenimiento de la autotolerancia) y en garantizar una respuesta adecuada que minimice el daño tisular cuando el sistema inmunitario responde a una infección por patógenos. Si bien casi todas las señales estimuladoras e inhibidoras de la respuesta inmunitaria modulan en última instancia vías de señalización intracelular, muchas se inician a través de receptores de membrana, cuyos ligandos están unidos a membrana o son solubles.

Las vías de puntos de control inmunitario se refieren a un conjunto de vías integradas en el sistema inmunitario que son cruciales para mantener la autotolerancia y modular la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas en los tejidos periféricos para minimizar el daño tisular colateral. En determinados casos, los tumores asumen el control de ciertas vías de puntos de control inmunitario como un mecanismo principal de resistencia inmunitaria, particularmente contra los linfocitos T que son específicos para antígenos tumorales. Véase, por ejemplo, Stagg y Allard, (2013) Ther. Adv. Med. Oncol. 5(3): 169-81. Debido a que la señalización a través de muchas de las vías de puntos de control inmunitario se inicia mediante interacciones ligando-receptor, las vías de puntos de control inmunitario pueden estar moduladas por diversos agentes, tales como anticuerpos, formas recombinantes de ligandos o receptores y compuestos de molécula pequeña. A diferencia de la mayoría de los anticuerpos actualmente aprobados para terapia contra el cáncer que están dirigidos contra antígenos específicos de tumores, los moduladores de los puntos de control inmunitario no se dirigen directamente a las células tumorales, sino que se dirigen a receptores de linfocitos o sus ligandos para modular la actividad antitumoral endógena. Véase Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64.

Quizás el ejemplo mejor estudiado de una vía de punto de control inmunitario y su relación con el cáncer es la vía de PD1. La vía de puntos de control inmunitario activada por la interacción de PD1 (proteína de muerte celular programada 1; también conocida como CD279) con su homólogo PDL1 (ligando de PD1; también conocido como B7-H1) regula negativamente los linfocitos T. PD1 limita las funciones efectoras de los linfocitos T en los tejidos. Los tumores pueden escapar a la vigilancia inmunitaria del hospedador al expresar PD-L1, que regula negativamente las respuestas inmunitarias al interactuar con PD1 en los linfocitos T. Iwai Y, et al. (2002) PNAS(USA) 99:12293-7. Al aumentar la expresión de PDL1, las células tumorales pueden bloquear las respuestas inmunitarias antitumorales en el microambiente tumoral e inducir el agotamiento de los linfocitos T. Los datos de muestras clínicas sugieren que la expresión elevada de ligandos de PD1 en tumores se correlaciona con un mal pronóstico. Thompson RH, et al. (2004) PNAS(USA) 101:17174-9; y Thompson RH, et al. (2007) PNAS(USA) 19:813-24. La administración de agentes que interfieren en la unión de PD1/PDL1 da como resultado la inhibición de la vía de puntos de control inmunitario de PD1, revirtiendo el agotamiento de los linfocitos T, restaurando la producción de citocinas y aumentando la expansión de los linfocitos T dependientes de antígenos. Los agentes que interfieren con la unión de PD1 a PDL1 y/o PDL2 han demostrado utilidad y/o promesa en varias enfermedades, trastornos y afecciones, entre los que se incluyen trasplante, infección, tumor y enfermedad autoinmunitaria (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30).

Sin embargo, la eficacia clínica real de dichos moduladores de vías de puntos de control inmunitario mostró una eficacia teórica disminuida en algunos tumores, particularmente en aquellos tumores que tienen una carga tumoral de mutaciones baja y en aquellos tumores donde la expresión génica relacionada con PDL1 y/o IPN^y es baja. La presente invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplásicas (de manera específica NSCLC) empleando los efectos combinados de agentes de IL-10 y moduladores de vías de puntos de control inmunitario (de manera específica un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario).

Concretamente, la presente invención es como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.

La figura 1 proporciona una ilustración gráfica de los resultados obtenidos en un ensayo clínico en seres humanos diseñado para evaluar la respuesta de sujetos que padecen cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) a la administración de una combinación de un agente de IL-10 (AM0010) con los anticuerpos anti-PD1 nivolumab y pembrolizumab con respecto a la expresión de PDL1 tumoral y la carga mutacional del tumor. Esta figura ilustra que la administración de un AM0010 en terapia de combinación con anticuerpos anti-PD1 es eficaz para producir un resultado clínico favorable en pacientes con carga tumoral de mutaciones baja o intermedia y niveles de expresión de PDL1 bajos o intermedios.

La figura 2 proporciona una ilustración gráfica de los resultados obtenidos en ensayos clínicos en seres humanos que evalúan la respuesta en sujetos que padecen cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) a la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) con los anticuerpos anti-PD1 nivolumab y pembrolizumab con respecto al perfil de expresión del gen de interferón gamma que comprende los genes STAT1, HLA-DRA, CXCL9, IDO, IFN-y y CXCL10 y la carga mutacional del tumor. Esta figura ilustra que la administración de un AM0010 en terapia de combinación con anticuerpos anti-PD1 es eficaz para producir un resultado clínico favorable en pacientes con perfil de expresión de IPN^y bajo y niveles de expresión de PDL1 bajos.

La figura 3 proporciona una ilustración gráfica de los resultados obtenidos en un ensayo clínico en seres humanos diseñado para evaluar el cambio en la carga tumoral (porcentaje) en sujetos que padecen cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) a la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) y los anticuerpos anti-PD1 nivolumab y pembrolizumab en función de la duración del tratamiento con la terapia de combinación como se describe con más detalle a continuación.

La figura 4 proporciona una ilustración gráfica de los resultados obtenidos en un ensayo clínico en seres humanos diseñado para evaluar el cambio en la carga tumoral (porcentaje) en sujetos que padecen carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés) a la administración de una combinación de un agente de IL-10 (AM0010 ) y los anticuerpos anti-PD1 nivolumab y pembrolizumab en función de la duración del tratamiento con la terapia de combinación como se describe con más detalle a continuación.

En la figura 5, los grupos A y B proporcionan exámenes histológicos de tejidos hepáticos obtenidos de un sujeto de ensayo clínico en seres humanos que padecía cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) antes del tratamiento (grupo A) y después de 7 meses de tratamiento con una combinación de un agente de IL-10 ( AM0010) y terapia anti-PD1 con pembrolizumab según el protocolo de tratamiento que se describe con más detalle a continuación (grupo B). Las flechas en la figura 5, grupo A, ilustran la presencia de lesiones metastásicas en el hígado. El grupo B ilustra que dichas lesiones se han reducido o eliminado significativamente en respuesta a la administración de la combinación de un agente de IL-10 y un modulador de una vía de puntos de control inmunitario.

La figura 6 proporciona una representación gráfica del cambio en el número de lesiones hepáticas mensurables determinadas por exámenes histológicos de tejidos hepáticos obtenidos de sujetos de ensayos clínicos en seres humanos que padecen cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) en función de las semanas de tratamiento con una combinación de AM0010 y pembrolizumab según el protocolo de tratamiento que se describe con más detalle en el presente documento a continuación. Este gráfico ilustra que la combinación de AM0010 y pembrolizumab da como resultado una reducción significativa de las lesiones hepáticas mensurables en pacientes con NSCLC, lo que demuestra la eficacia real de la administración de la combinación de un agente de IL-10 y un modulador de una vía de punto de control inmunitario en el tratamiento de enfermedades neoplásicas metastásicas.

Antes de describir la presente divulgación con más detalle, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a las realizaciones particulares establecidas en el presente documento, y también debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende ser limitante.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en el intervalo indicado, está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños, y también están comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención intervalos que excluyen alguno de los límites incluidos o ambos. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un" o "una", "uno/una", y "el/la", incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asimismo, cabe señalar que las reivindicaciones pueden redactarse de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación pretende servir de fundamento previo para el uso de dicha terminología exclusiva tal como "únicamente", "solamente" y similar, en relación con la exposición de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".

A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio ponderal, la temperatura está en grados Celsius (°C) y la presión es igual o cercana a la atmosférica. Se utilizan abreviaturas convencionales, que incluyen las siguientes: pb = par (o pares) de bases; kb = kilobase (o kilobases); pl = picolitro(s); s o sec = segundo (o segundos); min = minuto (minutos); h u hr = hora (u horas); aa = aminoácido (o aminoácidos); kb = kilobase (o kilobases); nt = nucleótido (o nucleótidos); pg = picogramo; ng = nanogramo; |jg = microgramo; mg = miligramo; g = gramo; kg = kilogramo; dl o dl = decilitro; j l o j l = microlitro; ml o ml = mililitro; l o l = litro; jM = micromolar; mM = milimolar; M = molar; kDa = kilodalton; i.m. = (por vía) intramuscular; i.p. = (por vía) intraperitoneal; s.c. o s.q. = (por vía) subcutánea; QD = diario; BID = dos veces al día; QW = semanal; QM = mensual; HPLC = cromatografía de líquidos de alto rendimiento; PC = peso corporal; U = unidad; ns = no estadísticamente significativo; PBS = solución salina tamponada con fosfato; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; NHS = N-hidroxisuccinimida; HSA = albúmina sérica humana; MSA = albúmina sérica de ratón; DMEM = modificación de Dulbecco del medio de Eagle; GC = copia del genoma; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético.

Los métodos convencionales de biología molecular se describen en la bibliografía científica (véanse, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; y Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, N.Y., que describe la clonación en células bacterianas y la mutagénesis de ADN (vol. 1), la clonación en células de mamífero y levadura (vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3) y bioinformática (vol. 4)).

La bibliografía científica describe métodos para la purificación de proteínas, incluida la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización, así como el análisis químico, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión y glucosilación de proteínas (véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NY).

A menos que se indique otra cosa, los siguientes términos pretenden tener el significado que se establece a continuación. Otros términos se definen en otras partes de la memoria descriptiva.

Como se usa en el presente documento, el término "actividad" se refiere a una propiedad de una molécula que cuando entra en contacto con otra molécula da como resultado una respuesta mensurable. Los ejemplos de "actividades" de una molécula incluyen pero sin limitación: (a) la capacidad de una molécula para unirse a un ligando o receptor; (b) la capacidad de una molécula para inducir o inhibir la actividad catalítica de una enzima; (c) la capacidad de una molécula para estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración celular; a la actividad antigénica; (d) la capacidad de una molécula para modular las actividades de otras moléculas. La "actividad" se puede cuantificar y normalmente se expresa como el grado del efecto con respecto a la cantidad de la molécula, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunitaria]/[mg de proteína]. El término "bioactividad" se usa para describir la actividad de un agente en un sistema biológico.

Como se usa en el presente documento, los términos "administración" y "administrar" se usan indistintamente para referirse al acto de poner en contacto un sujeto, incluyendo poner en contacto una célula, tejido, órgano o fluido biológico in vitro, in vivo o ex-vivo del sujeto, con un agente. Cuando el agente es un agente de IL-10, los términos "administración", "administrar", y "tratar" se refiere al contacto de un sujeto o una célula, tejido, órgano o fluido biológico del sujeto in vitro, in vivo o ex-vivo con una composición que comprende un agente de IL-10. La administración de un agente se puede lograr a través de cualquiera de una variedad de métodos reconocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, administración tópica, intravenosa, incluida la infusión intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracraneal, intratumoral, subcutánea, transdérmica, transmucosa, intralinfática, intragástrica, intraprostática, intravascular, incluyendo intravenosa, intraterial, intravesical (a la vejiga), iontoforesis, respiratoria, intraocular, intraabdominal, intralesional intraovárica, intracerebral, inyección intracerebroventricular (ICVI, por sus siglas en inglés), y similares. El término "administración" incluye el contacto de un agente con la célula, así como el contacto de un agente con un líquido, en que el líquido está en contacto con la célula.

Como se usa en el presente documento, la expresión "acontecimiento adverso" se refiere a cualquier experiencia indeseable asociada con el uso de un compuesto en un paciente. Los acontecimientos adversos no tienen por qué estar causados por el compuesto. Los acontecimientos adversos pueden ser leves, moderados o graves. La clasificación de los acontecimientos adversos, tal como se utiliza en el presente documento, se realiza según los criterios de terminología común para acontecimientos adversos v4.03 (CTCAE) del 14 de junio de 2010 publicados por el United States Department of Health and Human services, National Institutes of Health National Cancer Institute.

Como se usa en el presente documento, el término "agonista" se refiere a una molécula que interactúa con una diana para provocar o promover un aumento en la activación de la diana. Los activadores o agonistas son moléculas que aumentan, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o incrementan, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor, vía biológica (incluida una vía de punto de control inmunitario) o célula.

Como se usa en el presente documento, el término "antagonista" o "inhibidor" se refiere a una molécula que se opone a la una o más acciones de un agonista. Un antagonista impide, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista, y un antagonista también puede impedir, inhibir o reducir la actividad constitutiva de una diana, por ejemplo, un receptor diana, incluso cuando no hay un agonista identificado. Los inhibidores son moléculas que disminuyen, bloquean, evitan, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o reducen, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor, vía biológica incluida una vía de punto de control inmunitario o célula.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere colectivamente a: (a) inmunoglobulinas glicosiladas y no glicosiladas (incluidas, entre otras, las clases de inmunoglobulinas de mamíferos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que se unen de manera específica a la molécula diana y (b) derivados de inmunoglobulina que incluyen, entre otros, IgG (1-4) deltaCH2, F(ab')², Fab, ScFv, V^h, V^l, tetracuerpos, triacuerpos, diacuerpos, dsFv, F(ab')3, scFv-Fc y (scFv)² que compiten con la inmunoglobulina de la que proceden por unirse a la molécula diana. El término anticuerpo no se limita a las inmunoglobulinas procedentes de una especie de mamífero en particular e incluye anticuerpos murinos, humanos, equinos, de camello y humanos. El término "anticuerpo" abarca los anticuerpos naturales que se pueden aislar de fuentes naturales y también anticuerpos modificados genéticamente, incluyendo anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, injertados con CDR, anticuerpos revestidos o desinmunizados (por ejemplo, para eliminar epítopos de linfocitos T). El término "anticuerpo" no debe interpretarse como limitado a ningún medio de síntesis en particular e incluye anticuerpos naturales que se pueden aislar de fuentes naturales, así como moléculas de anticuerpos modificadas genéticamente que se obtienen por medios "recombinantes", incluidos los anticuerpos aislados de animales transgénicos que son transgénicos. para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de ellos, anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada con una construcción de ácido nucleico que da como resultado la expresión de un anticuerpo, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria que incluye bibliotecas de presentación en fagos. En una realización, un "anticuerpo" es una inmunoglobulina de mamífero que es un "anticuerpo de longitud completa" que comprende dominios variables y constantes que proporcionan funciones efectoras y de unión. En la mayoría de los casos, un anticuerpo completo comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena ligera, una región variable y una región constante. En una realización, el anticuerpo es un "anticuerpo de longitud completa" que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena ligera una región variable y una región constante que proporciona funciones efectoras y de unión. En una realización preferida, las regiones constante y variable son "humanas" (es decir, que poseen secuencias de aminoácidos características de las inmunoglobulinas humanas).

Como se usa en el presente documento, la expresión "célula tumoral circulante (CTC)" se refiere a las células tumorales que se desprenden de la masa tumoral a la circulación periférica.

Como se usa en el presente documento, el término "comparable" se usa para describir el grado de diferencia en dos mediciones de un parámetro evaluable. Por ejemplo, cuando una primera medición de un parámetro evaluable (por ejemplo, la actividad de IL-10 determinada por un ensayo de IL-10) y una segunda medición del parámetro evaluable no se desvían más allá de un intervalo aceptable (es decir,, un intervalo que el experto en la materia reconocería como que no produce una diferencia estadísticamente significativa en el efecto entre los dos resultados en esas circunstancias) las dos mediciones se considerarían "comparables". En determinados casos, las mediciones pueden considerarse "comparables" si una medición se desvía de otra en menos del 35 %, en menos del 30 %, en menos del 25 %, en menos del 20 %, en menos del 15 %, en menos del 10 %, en menos del 7 %, en menos del 5 %, en menos del 4 %, en menos del 3 %, en menos del 2 % o en menos del 1 %. En realizaciones particulares, una medición es comparable con un patrón de referencia si se desvía en menos del 15 %, en menos del 10 % o en menos del 5 % del patrón de referencia.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "respuesta completa (CR, por sus siglas en inglés)" "respuesta parcial (PR, por sus siglas en inglés)", "enfermedad estable (SD, por sus siglas en inglés)" y "enfermedad progresiva (PD, por sus siglas en inglés)" con respecto a las lesiones diana y las expresiones "respuesta completa (RC)" "respuesta incompleta/enfermedad estable (SD)" y enfermedad progresiva (PD) con respecto a lesiones no diana, se entienden tal y como se definen en los criterios RECIST.

La expresión "procedente de" como se usa en el presente documento en el contexto de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de polinucleótidos (porejemplo, una secuencia de aminoácidos "procedente de" un polipéptido de IL-10), indica que el polipéptido o ácido nucleico tiene una secuencia que se basa en la de un polipéptido o ácido nucleico de referencia (por ejemplo, un polipéptido de IL-10 natural o un ácido nucleico que codifica IL-10), y no pretende limitar la fuente o el método en el que se produce la proteína o el ácido nucleico. A modo de ejemplo, la expresión "procedente de" incluye homólogos y muteínas de secuencias de ADN o de aminoácidos de referencia.

Como se usa en el presente documento, la expresión "mutación oncoiniciadora" se refiere a una mutación en una célula neoplásica que contribuye al crecimiento y supervivencia de la neoplasia y, por lo tanto, confiere una ventaja selectiva.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "respuesta completa inmunomediada (irCR, por sus siglas en inglés)", "respuesta parcial inmunomediada (irPR, por sus siglas en inglés)" "enfermedad progresiva inmunomediada (irPD, por sus siglas en inglés)" y "enfermedad estable inmunomediada (irSD, por sus siglas en inglés)" son tal como se define según los criterios de respuesta inmunomediada (irRC).

Como se usa en el presente documento, las expresiones "ADN", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido" y similares, se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos lineales y circulares, ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc), polinucleótidos recombinantes, vectores, sondas, cebadores y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión "criterios de respuesta inmunomediada (irRC)" se refiere a un sistema para evaluar la respuesta a las inmunoterapias como se describe en Wolchok, et al. (2009) Guidelines for the Evaluation of Immune Therapy Activity in Solid Tumors: Immune-Related Response Criteria, Clinical Cancer Research 15(23): 7412-7420.

Como se usa en el presente documento, la expresión "en combinación con" se refiere a la administración de un primer agente y un segundo agente a un sujeto. Para los fines de la presente invención, se considera que un agente (por ejemplo, un agente de IL-10) se administra en combinación con un segundo agente (por ejemplo, un modulador de una vía de punto de control inmunitario) si el efecto biológico resultante de la administración del primer agente persiste en el sujeto en el momento de administración del segundo agente de manera que los efectos terapéuticos del primer agente y del segundo agente se solapen. Por ejemplo, los inhibidores de puntos de control inmunitario de PD1 (por ejemplo, nivolumab o pembrolizumab) normalmente se administran por infusión intravenosa cada dos semanas o cada tres semanas, mientras que los agentes que se combinan con dicha molécula, tal como se contempla en la presente descripción, tal como hIL-10 o hIL-10 PEGilada, se administran comúnmente a diario por vía subcutánea. Sin embargo, la administración del primer agente proporciona un efecto terapéutico durante un tiempo prolongado y la administración del segundo agente proporciona su efecto terapéutico mientras que el efecto terapéutico del primer agente continúa, de modo que se considera que el segundo agente se administra en combinación con el primero agente, incluso aunque el primer agente se haya administrado en un momento significativamente distante (por ejemplo, días o semanas) del momento de la administración del segundo agente. En una realización, se considera que un agente (por ejemplo, un agente de IL-10) se administra en combinación con un segundo agente (por ejemplo, un modulador de una vía de puntos de control inmunitario) si el primer y el segundo agente se van a administrar simultáneamente (con una diferencia de 30 minutos entre uno y otro), al mismo tiempo o secuencialmente. En el contexto de la presente invención, cuando la duración de la acción de las moléculas es significativa, se considera que un primer agente se ha administrado "simultáneamente" con un segundo agente si el primero y el segundo agentes se van a administrar con un plazo de aproximadamente 24 horas entre sí, preferentemente con un plazo de aproximadamente 12 horas entre sí, preferentemente con un plazo de aproximadamente 6 horas entre sí, preferentemente con un plazo de aproximadamente 2 horas entre sí, o preferentemente con un plazo de aproximadamente 30 minutos entre sí. También se entenderá que la expresión "en combinación con" se aplica a la situación en la que un primer agente (por ejemplo, el agente PEG-IL-10) y un segundo agente (por ejemplo, un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario) se formulan juntos en una sola formulación farmacéuticamente aceptable ( por ejemplo, una solución isotónica tamponada para administración IV) y la formulación conjunta se administra a un sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresión "en una cantidad suficiente para efectuar un cambio" se utiliza con respecto a la cantidad de uno o más agentes terapéuticos a administrar a un sujeto que necesita tratamiento de manera que exista una diferencia detectable entre el nivel de un indicador medido antes (por ejemplo, un nivel de referencia) y después de la administración de uno o más agentes terapéuticos en particular. Los indicadores incluyen cualquier parámetro objetivo (incluidos, entre otros, los criterios de respuesta de irCR, irRC, criterios de respuesta RECIST de CR, PR, o SD ) o parámetros subjetivos (por ejemplo, sensación de bienestar de un sujeto).

Como se usa en el presente documento, la expresión "que necesita prevención" se refiere a la determinación de un ciclo de tratamiento con respecto a un sujeto que, a juicio de un médico, en función de la información disponible aceptada en el campo para la determinación de la probabilidad de padecer una afección patológica, que un sujeto requiere o se beneficiará de atención preventiva.

Como se usa en el presente documento, la expresión "en necesidad de tratamiento" se refiere a una determinación hecha por un médico con respecto a un sujeto en función de la información disponible aceptada en el campo para la identificación de una enfermedad, trastorno o afección que incluye pero sin limitación rayos X, exploraciones por TC, pruebas de diagnóstico de laboratorio convencionales (por ejemplo, hemograma, etc.), datos genómicos, datos de expresión de proteínas, inmunohistoquímica, que el sujeto requiere o se beneficiará del tratamiento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "heterogeneidad intratumoral (ITH, por sus siglas en inglés)" se refiere a la variación genética y fenotípica dentro de un tumor, o entre lesiones tumorales individuales en el mismo paciente.

T al como se utiliza en el presente documento, el término "enriquecida" significa que una muestra se manipula de forma no natural (por ejemplo, por un científico) para que una molécula de interés (por ejemplo, un polipéptido) esté presente en: (a) una mayor concentración (por ejemplo, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 64 veces mayor o más) que la concentración de la molécula de interés en la muestra de partida, tal como una muestra biológica (por ejemplo, una muestra en la que el polipéptido se encuentra de forma natural o en la que está presente después de la administración), o (b) una concentración mayor que el entorno en el que se produjo la molécula de interés (por ejemplo, una célula bacteriana recombinante).

Como se usa en el presente documento, los términos "prevenir", "que previene", "prevención" y similares se refieren a un tratamiento de acción (tal como administrar IL-10 o una composición farmacéutica que comprende IL-10) iniciado de manera (por ejemplo, antes de la aparición de una enfermedad, trastorno, afección o síntoma de la misma) que se evite, suprima, inhiba o reduzca, ya sea de manera temporal o permanente, el riesgo de un sujeto de padecer una enfermedad, trastorno, afección o similar (según lo determinado mediante, por ejemplo, la ausencia de síntomas clínicos) o se retrase su aparición, generalmente en el contexto de un sujeto predispuesto a tener una enfermedad, trastorno o afección particular.

Como se usa en el presente documento, el término "metástasis" describe la propagación de células cancerosas desde el tumor primario a los tejidos circundantes y a órganos distantes.

Como se usa en el presente documento, los términos "modular", "modulación" y similares se refieren a la capacidad de un agente para efectuar una respuesta, ya sea positiva o negativa o directa o indirectamente, en un sistema, incluyendo un sistema biológico o vía bioquímica. El término modulador incluye tanto agonistas como antagonistas.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés)" se refiere a cualquiera de diversos métodos de secuenciación de ADN de alto rendimiento que utilizan el proceso de procesamiento paralelo masivo en lugar de la secuenciación de cadenas de ADN individuales.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad neoplásica" se refiere a trastornos o afecciones en un sujeto que surgen de la hiperproliferación celular o de la replicación celular no regulada (o desregulada). La expresión enfermedad neoplásica se refiere a trastornos que surgen de la presencia de neoplasias en el sujeto. Las neoplasias se pueden clasificar en: (1) benigna (2) premaligna (o "precancerosa"); y (3) maligna (o "cancerosa"). Los ejemplos de neoplasias benignas susceptibles de tratamiento utilizando las composiciones y métodos descritos incluyen, entre otros, adenomas, fibromas, hemangiomas y lipomas. Los ejemplos de neoplasias premalignas susceptibles de tratamiento usando las composiciones y los métodos descritos incluyen, entre otros, hiperplasia, atipia, metaplasia y displasia. Los ejemplos de neoplasias malignas susceptibles de tratamiento usando las composiciones y métodos descritos incluyen, entre otros, carcinomas (cánceres que surgen de tejidos epiteliales como la piel o los tejidos que recubren los órganos internos), leucemias, linfomas y sarcomas normalmente procedentes de la grasa ósea, músculo, vasos sanguíneos o tejidos conectivos). La expresión "enfermedad neoplásica" incluye cánceres tales como cánceres de mama; sarcomas (incluidos, entre otros, osteosarcomas y angiosarcomas) y fibrosarcomas), leucemias, linfomas, cánceres genitourinarios (incluidos, entre otros, cánceres de ovario, uretral, de vejiga y próstata); cánceres gastrointestinales (incluidos, entre otros, cánceres de colon, esófago y estómago); cánceres de pulmón; mielomas; cánceres de páncreas; cánceres de hígado; cánceres de riñón; cánceres endocrinos; cánceres de piel; y tumores cerebrales o del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) y periférico, malignos o benignos, incluyendo gliomas y neuroblastomas, astrocitomas, trastornos mielodisplásicos; carcinoma cervical in situ; poliposis intestinales; leucoplasias orales; histiocitosis, cicatrices hiperproliferativas incluyendo cicatrices queloides, hemangiomas; estenosis arterial hiperproliferativa, psoriasis, artritis inflamatoria; hiperqueratosis y erupciones papuloescamosas, incluida la artritis. También se incluyen neoplasias inducidas por virus, como verrugas y enfermedades inducidas por EBV (es decir,, mononucleosis infecciosa), formación de cicatrices, enfermedad vascular hiperproliferativa, incluida la hiperplasia de las células del músculo liso de la íntima, restenosis y oclusión vascular y similares. La expresión "enfermedades neoplásicas" incluye neoplasias mieloides y neoplasias linfoides. Cada categoría contiene diferentes tipos de cáncer hematopoyético con características morfológicas, patobiológicas, terapéuticas y/o pronósticas definidas. La clasificación correcta, junto con la identificación de factores adicionales que pueden influir en el pronóstico o la respuesta a quimioterapia, es esencial para permitir un tratamiento óptimo. Las neoplasias mieloides incluyen, pero sin limitación, neoplasias mieloproliferativas, trastornos mieloides y linfoides con eosinofilia, neoplasias mieloproliferativas/mielodisplásicas, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide aguda y neoplasias precursoras relacionadas, y leucemia aguda de linaje ambiguo. Las neoplasias linfoides incluyen, pero sin limitación, neoplasias linfoides precursoras, neoplasias de linfocitos B maduros, neoplasias de linfocitos T maduros, linfoma de Hodgkin y trastornos linfoproliferativos asociados a inmunodeficiencias. Otros cánceres del sistema hematopoyético incluyen, pero sin limitación, neoplasias de células histiocíticas y dendríticas. La expresión "enfermedad neoplásica" incluye enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con neoplasias que se refieren a afecciones que están asociadas, directa o indirectamente, con enfermedades neoplásicas, e incluye, por ejemplo, angiogénesis y afecciones precancerosas tales como displasia.

Como se usa en el presente documento, la expresión "adicción al oncogén" se refiere al fenómeno por el cual la supervivencia de las células cancerosas depende de la actividad continua de un oncogén mutado.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "mutación o mutaciones pasajeras" se refiere a una o más mutaciones que surgen durante la aparición de una neoplasia como resultado del aumento de las tasas de mutación, pero no contribuyen al crecimiento de la neoplasia.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a una molécula que es una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, incluidas aquellas moléculas que se han modificado química o bioquímicamente. Un polipéptido puede incorporar aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, o aminoácidos derivatizados, y polipéptidos que tienen cadenas principales polipeptídicas modificadas, tal como mediante la incorporación de enlaces que no son amida. El término polipéptido incluye proteínas de fusión, que incluyen, pero sin limitación, proteínas de fusión compuestas de dominios procedentes de fuentes divergentes, formas precursoras de proteínas maduras que tienen secuencias líder de péptido señal; polipéptidos que tienen restos de metionina aminoterminales o N-formil metionina que son el resultado de la expresión recombinante directa; proteínas de fusión de proteínas inmunitariamente activas (por ejemplo, fragmentos antigénicos de toxina diftérica o tetánica); y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión "actividad proliferativa" se refiere a una actividad celular que promueve, que es necesaria para, o que está específicamente asociada con, por ejemplo, la división celular normal, así como con cáncer, tumores, displasia, transformación celular, metástasis y angiogénesis.

Como se usa en el presente documento, el término "reducir o inhibir" se usa en referencia a la capacidad de un agente, solo o en combinación, para proporcionar una disminución del 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en un parámetro observable con respecto al estado preexistente antes de la exposición al agente.

Como se usa en el presente documento, el término "respuesta", se refiere al cambio en el parámetro evaluable que incluye uno objetivo (por ejemplo, parámetro bioquímico o fisiológico) o subjetivo (por ejemplo, sensación de bienestar) de una célula, tejido, órgano, organismo o sujeto en respuesta a la administración de un agente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST, por sus siglas en inglés)" se refiere a un conjunto de reglas como se describe en Therasse, et al., (2000) New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors (RECIST Guidelines) J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216 actualizado en Eisenhauer, et al., (2009) New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1) European Journal of Cancer 45(2):228-247.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuenciación de ARN (RNA-Seq)" se refiere al uso de NGS para determinar la secuencia del transcriptoma, o el conjunto completo de transcritos de ARN en una muestra.

La expresión "se une de manera específica" se usa en el presente documento para referirse al grado de selectividad o afinidad con el que una molécula se une a otra. En el contexto de pares de unión (por ejemplo, un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno, anticuerpo/ligando, pares de unión anticuerpo/receptor) se dice que una primera molécula de un par de unión se une de manera específica a una segunda molécula de un par de unión cuando la primera molécula del par de unión no se une en una cantidad significativa a otros componentes presentes en la muestra. Se dice que una primera molécula de un par de unión se une de manera específica a una segunda molécula de un par de unión cuando la afinidad de la primera molécula por la segunda molécula es al menos dos veces mayor, al menos diez veces mayor, al menos 20 veces mayor, o al menos 100 veces mayor que la afinidad de la primera molécula por otros componentes presentes en la muestra. En una realización particular, cuando la primera molécula del par de unión es un anticuerpo, el anticuerpo se une de manera específica a la segunda molécula del par de unión (por ejemplo, una proteína, antígeno, ligando o receptor) si la afinidad del anticuerpo por la segunda molécula del par de unión es superior a aproximadamente 109 litros/mol, alternativamente superior a aproximadamente 1010 litros/mol, superior a aproximadamente 1011 litros/mol, superior a aproximadamente 1012 litros/mol determinada mediante, por ejemplo, análisis de Scatchard (Munsen, et al. 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239). La unión específica se puede evaluar mediante técnicas conocidas en la técnica, incluidas, entre otras, ELISA de competición, ensayos BIACORE® y/o ensayos KINEXA®

Como se usa en el presente documento, la expresión "moléculas pequeñas" se refiere a compuestos químicos que tienen un peso molecular que es inferior a aproximadamente 10 kDa, inferior an aproximadamente 2kDa o inferior a aproximadamente 1kDa. Las moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radioactivo y moléculas sintéticas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "mutación somática" se refiere a una alteración genética adquirida por una célula que puede transmitirse a la descendencia de la célula mutada pero que no estaba presente en el ADN de la línea germinal (espermatozoide u óvulo).

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente puro/a" indica que un componente (por ejemplo, un polipéptido) constituye más del 50 % del contenido total de la composición y normalmente más del 60 % del contenido total. Más habitualmente, "sustancialmente puro/a" se refiere a composiciones en las que al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o más de la composición total es el componente de interés. En algunos casos, el componente de interés comprenderá más de aproximadamente el 90 %, o más de aproximadamente el 95 %, o más de aproximadamente el 99 % del contenido total de la composición.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero humano o no humano. Ejemplos de especies de mamíferos no humanos incluyen cánidos (perro), équidos (caballo), félidos (gato), suínos (cerdo), bóvidos (vaca). El término "paciente" se usa indistintamente con el término "sujeto" en el presente documento cuando el sujeto es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que, cuando se administra a un sujeto que padece una enfermedad, trastorno o afección, proporciona un efecto positivo objetivo o un efecto positivo subjetivo (por ejemplo, la sensación de bienestar de un sujeto) sobre cualquier síntoma, aspecto o característica de la enfermedad, trastorno o afección. Los factores que contribuyen a la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente incluyen, entre otros, indicios fácilmente identificables tales como la edad, peso, sexo, estado de salud general, puntuación ECOG, parámetros fisiológicos observables (por ejemplo, temperatura corporal, presión arterial, etc.), afecciones adicionales (por ejemplo, diabetes, síndrome metabólico), análisis del sujeto (por ejemplo, rayos X, ultrasonidos, exploración por TC, análisis de fluidos corporales), biomarcadores (tal como citocinas inflamatorias, IFN-y, granzimas, y similares). Los factores adicionales que contribuyen a la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente incluyen, entre otros, las características de la enfermedad específica a tratar, incluido el tipo de enfermedad, estado de progresión de la enfermedad, la carga tumoral así como la modalidad terapéutica y si las composiciones se van a administrar en combinación con otra administración conjunta de otro agente que puede dar lugar a incompatibilidades o reacciones cruzadas. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ajustarse durante el transcurso del tratamiento de un sujeto en relación con la pauta posológica y/o la evaluación de la afección del sujeto y las variaciones en los factores anteriores. En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de un agente que cuando se usa solo o en combinación con otro agente no da como resultado acontecimientos adversos graves irreversibles en el transcurso de la administración a un sujeto mamífero.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren al acto de administrar una composición que comprende un agente a un sujeto en donde dicho sujeto padece una enfermedad, trastorno o afección, o un síntoma de los mismos, para eliminar, reducir, suprimir, mitigar o mejorar temporal, transitoria o permanentemente una causa o al menos un síntoma de dicha enfermedad, trastorno o afección, pero no indica necesariamente una eliminación total de todos los síntomas de trastorno que afectan a un sujeto. El término "tratar" incluye la suspensión o la desaceleración de la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, o la inhibición de la progresión de la misma a un estado nocivo o de otro modo no deseado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "carga tumoral de mutaciones (TMB, por sus siglas en inglés)" como se usa en el presente documento se refiere al número de mutaciones somáticas presentes en una muestra tumoral expresado como el número de mutaciones por megabase determinado por secuenciación de ácidos nucleicos en donde se secuencian al menos 0,2 megabases del ácido en la muestra tumoral, como alternativa, en donde se secuencian al menos 0,5 megabases del ácido nucleico en la muestra tumoral, como alternativa en donde se secuencia al menos 1 megabase del ácido nucleico en la muestra tumoral, o como alternativa en donde se secuencian al menos 5 megabases o como alternativa en donde se secuencian al menos diez megabases del ácido nucleico en la muestra tumoral. Como se describe en Chalmers, et al. (2017) Genome Medicine 9:34, la precisión en la evaluación de la carga tumoral de mutaciones baja (TMB, por sus siglas en inglés baja) se mejora utilizando el ensayo FoundationOne (Foundation Medicine, Cambridge m A como se describe en Frampton, et al. (2013) Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nature Biotechnology 31: 1023-31; He, et al. (2016) Integrated genomic DNA/RNA profiling of hematologic malignancies in the clinical setting. Blood 127:3004-14) con mayor cantidad de ácido nucleico secuenciado, pero la desviación porcentual es menor en las muestras que tienen TMB, de modo que la TMB alta (definida en este estudio como >20 mutaciones por megabase) se puede identificar de manera eficaz mediante la secuenciación dirigida de solamente varios cientos de genes, mientras que la TMB intermedia se mejora mediante la secuenciación de al menos 0.5 Mb secuenciadas, considerando que la evaluación fiable de la TMB baja se mejora mediante la secuenciación de 5 megabases, como alternativa, 10 megabases o más de ácido nucleico en la muestra tumoral. La secuenciación para evaluar la TMB se puede lograr mediante cualquiera de una variedad de métodos aceptados en la técnica, incluida la secuenciación parcial del genoma, WES o WGS usando NGS. La carga tumoral de mutaciones puede expresarse como el número total de mutaciones en el genoma si se secuenció esencialmente el genoma completo en la muestra tumoral. La carga tumoral de mutaciones también puede expresarse como el número de mutaciones por megabase de ácido nucleico secuenciado en la muestra tumoral. Se entiende que la tasa de carga tumoral de mutaciones varía entre las enfermedades neoplásicas, por lo que la carga de mutaciones tumorales debe evaluarse en el contexto de un tipo de enfermedad determinado. Por ejemplo, determinados tipos de cáncer presentan una amplia gama de tasas de mutación desde menos de 1 mutación por megabase hasta cientos por megabase. En general, la expresión "carga tumoral de mutaciones baja" significa una carga tumoral de mutaciones inferior o igual a 15 mutaciones por megabase secuenciada, inferior o igual a 10 mutaciones por megabase secuenciada, como alternativa inferior o igual a 7 mutaciones por megabase secuenciada, como alternativa inferior o igual a 5 mutaciones por megabase secuenciada, como alternativa inferior o igual a 2 mutaciones por megabase secuenciada, o como alternativa inferior o igual a 1 mutación por megabase secuenciada. La expresión "carga tumoral de mutaciones intermedia" significa una carga tumoral de mutaciones mayor que el umbral superior del nivel de carga tumoral de mutaciones aplicado a la expresión carga de mutación baja en el contexto particular. La expresión carga tumoral de mutaciones intermedia significa una carga tumoral de mutaciones superior a aproximadamente 15 mutaciones por megabase secuenciada pero inferior a aproximadamente 100 mutaciones por megabase secuenciada. La expresión mutación tumoral alta es una carga tumoral de mutaciones superior a una carga tumoral de mutaciones intermedia superior o igual a 100 mutaciones por megabase secuenciada.

Como se usa en el presente documento, "expresión baja de PD-L1" se refiere a un nivel de expresión de PD-L1 en la superficie celular inferior al 1 %; "expresión intermedia de PD-L1" se refiere a un nivel de expresión de PD-L1 en la superficie celular del 1 % al 49 %; y "alta expresión de PD-L1" se refiere a un nivel de expresión de PD-L1 en la superficie celular igual o superior al 50 %, donde la expresión de PD-L1 se evalúa según las metodologías disponibles en la técnica, tal como en Rizzi et al. (2015) Science 348: 124-128.

Como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a derivados de polipéptidos naturales y derivados no naturales que comprenden secuencias de aminoácidos diferentes del polipéptido original del que procede la variante. Las variantes naturales incluyen homólogos (polipéptidos y ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, de una especie a otra) y variantes alélicas (polipéptidos y ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, de un individuo a otro dentro de una especie). Las variantes no naturales de un polipéptido que comprenden una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos donde el cambio en la secuencia de aminoácidos se introduce artificialmente se denominan en el presente documento "muteínas". Se describen muteínas de IL-10 ilustrativas en Eaton, et al. publicación de solicitud de atente de Estados Unidos N.° S2015/0038678A1 publicada el 2 de febrero de 2015; Hansen, et al. publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° US203/0186386A1 publicada el 2 de octubre de 2003 y Van Vlasselaer, et al., publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US20160068583 A1 publicada el 10 de marzo de 2016.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuenciación del exoma completo (WES, por sus siglas en inglés)" se refiere a un método para determinar la secuencia de ADN de todos los exones dentro de los genes que codifican proteínas en un genoma.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuenciación del genoma completo (WGS, por su siglas en inglés)" se refiere a la secuenciación para determinar la secuencia de ADN completa del genoma de un organismo de una sola vez, normalmente el genoma de cáncer somático en estudios de oncología.

Se apreciará que a lo largo de la presente divulgación se hace referencia a los aminoácidos naturales según los códigos de una sola letra o de tres letras. Para comodidad del lector, los códigos de aminoácidos de una y tres letras se proporcionan en la tabla 1 a continuación:

continuación

Como se usa en el presente documento en el contexto de la estructura de un polipéptido, las expresiones "extremo N" (o "extremo amino") y "extremo C" (o "extremo carboxilo") se refieren a los finales extremos amino y carboxilo del polipéptido, respectivamente, mientras que los términos "aminoterminal" y "carboxiterminal" se refieren a posiciones relativas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido hacia el extremo N y el extremo C, respectivamente, y puede incluir los restos en el extremo N y extremo C, respectivamente. "Inmediatamente aminoterminal" o "inmediatamente carboxiterminal" se refiere a una posición de un primer resto de aminoácido con respecto a un segundo resto de aminoácido donde el primer y segundo restos de aminoácidos están unidos covalentemente para proporcionar una secuencia de aminoácidos contigua.

La presente invención proporciona un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad neoplásica (en concreto, NSCLC) en un sujeto mamífero mediante la administración del agente de IL-10 en combinación con un modulador de vías de puntos de control inmunitario (en concreto, un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario). Como se usa en el presente documento, la expresión general "modulador de vías de puntos de control inmunitario" se refiere a una molécula que inhibe o estimula la actividad de una vía de puntos de control inmunitario en un sistema biológico que incluye un mamífero inmunocompetente. Un modulador de vías de puntos de control inmunitario puede ejercer su efecto al unirse a una proteína de puntos de control inmunitario (tal como las proteínas de puntos de control inmunitario expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos (APC) tal como una célula cancerosa y/o un linfocito T efector inmunitario) o puede ejercer su efecto sobre las reacciones previas y/o posteriores en la vía de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, un modulador de vías de puntos de control inmunitario puede modular la actividad de SHP2, una tirosina fosfatasa que participa en la señalización de PD-1 y CTLA-4. La expresión "moduladores de vías de puntos de control inmunitario" abarca tanto uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario capaces de reducir al menos parcialmente la función de un punto de control inmunitario inhibidor (denominado en el presente documento "inhibidor de vías de puntos de control inmunitario" o "antagonista de vías de puntos de control inmunitario") como uno más moduladores de vías de puntos de control inmunitario capaces de aumentar al menos parcialmente la función de un punto de control inmunitario estimulador (denominado en el presente documento "efector de vías de puntos de control inmunitario" o "agonista de vías de puntos de control inmunitario"). En la presente invención, el modulador de vías de puntos de control inmunitario es un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario.

Las realizaciones particulares de la presente divulgación contemplan la administración del agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) en combinación con el modulador de vías de puntos de control inmunitario más uno o más agentes antineoplásicos adicionales (por ejemplo., agentes quimioterapéuticos) o modalidades de tratamiento antineoplásico (por ejemplo, radiación). Se describen a continuación, en el presente documento, realizaciones en donde se deben administrar uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales (por ejemplo., agentes quimioterapéuticos) junto con las combinaciones de un agente de IL-10 y uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario.

La expresión general "vía de puntos de control inmunitario" se refiere a la respuesta biológica desencadenada por la unión de una primera molécula (por ejemplo, una proteína tal como PD1) que se expresa en una célula presentadora de antígenos (APC) a una segunda molécula (por ejemplo, una proteína tal como PDL1) que se expresa en una célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T) que modula la respuesta inmunitaria, ya sea a través de la estimulación (por ejemplo, aumento de la actividad de los linfocitos T) o inhibición (por ejemplo, disminución de la actividad de los linfocitos T) de la respuesta inmunitaria. Las moléculas que participan en la formación del par de unión que modulan la respuesta inmunitaria se denominan comúnmente "puntos de control inmunitario". Las respuestas biológicas moduladas por dichas vías de puntos de control inmunitario están mediadas por vías de señalización intracelular que dan lugar a vías efectoras inmunitarias posteriores, tal como la activación celular, la producción de citocinas, la migración celular, la secreción de factores citotóxicos y la producción de anticuerpos. Las vías de puntos de control inmunitario suelen desencadenarse por la unión de una primera molécula expresada en la superficie celular a una segunda molécula de la superficie celular asociada con la vía de puntos de control inmunitario (por ejemplo, la unión de PD1 a PDL1, CTLA4 a CD28, etc.). La activación de las vías de puntos de control inmunitario puede dar lugar a la estimulación o inhibición de la respuesta inmunitaria.

Una vía de puntos de control inmunitario cuya activación da como resultado la estimulación de la respuesta inmunitaria se denomina en el presente documento "vía de puntos de control inmunitario positiva". La expresión vía de puntos de control inmunitario positiva incluye, pero sin limitación, vías biológicas moduladas por la unión de ICOSL a ICOS (CD278), B7-H6 a NKp30, CD155 a CD96, OX40L a OX40, CD70 a CD27, CD40 a CD40L y GITRL a GITR. Las moléculas que agonizan los puntos de control inmunitario positivos (tales como ligandos naturales o sintéticos para un componente del par de unión que estimula la respuesta inmunitaria) son útiles para aumentar la respuesta inmunitaria. Los ejemplos de tales agonistas de puntos de control inmunitario positivos incluyen, entre otros, anticuerpos agonistas que se unen a receptores activadores de linfocitos T tales como ICOS (como JTX-2011, Jounce Therapeutics), OX40 (como MEDI6383, Medimmune o), CD27 (como varlilumab, Celldex Therapeutics), CD40 (como dacetuzmumab CP-870,893, Roche, Chi Lob 7/4), HVEM, CD28, CD137, 4-1BB, CD226 y GITR (como MEDI1873, Medimmune; INCAGN1876, Agenus).

Un punto de control inmunitario cuya activación da como resultado la inhibición o disminución de la respuesta inmunitaria se denomina en el presente documento "vía de puntos de control inmunitario negativa". La inhibición de la respuesta inmunitaria resultante de la activación de un punto de control inmunitario negativo disminuye la capacidad del sistema inmunitario del hospedador para reconocer un antígeno extraño, tal como un oncoantígeno. La expresión vía de puntos de control inmunitario negativa incluye, pero sin limitación, vías biológicas moduladas por la unión de PD1 a PDL1, PD1 a PDL2 y CTLA4 a CDCD80/86. Los ejemplos de dichos antagonistas de puntos de control inmunitario negativos incluyen, entre otros, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos antagonistas) que se unen a los receptores inhibidores de linfocitos T, incluidos, entre otros, PD1 (también denominada CD279), TIM3 (proteína 3 de membrana de linfocitos T; también conocida como HAVcr2), BTLA (atenuador de linfocitos B y T; también conocido como CD272), el receptor VISTA (B7-H5), LAG3 (gen 3 de activación de linfocitos); también conocido como CD233) y CTLA4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos; también conocido como CD152).

La respuesta inmunitaria mediada por vías de puntos de control inmunitario no se limita a la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. Por ejemplo, los receptores KIR de las células NK modulan la respuesta inmunitaria a las células tumorales mediada por células NK. Las células tumorales expresan una molécula llamada HLA-C, que inhibe los receptores KIR de las células NK provocando una disminución de la respuesta inmunitaria antitumoral. La administración de un agente que antagoniza la unión de HLA-C al receptor KIR, tal como un mAb anti-KIR3 (por ejemplo, lirilumab, BMS), inhibe la capacidad de HLA-C para unirse al receptor inhibidor de células NK (KIR, por sus siglas en inglés), restaurando así la capacidad de las células NK para detectar y atacar células cancerosas. De este modo, la respuesta inmunitaria mediada por la unión de HLA-C al receptor KIR es un ejemplo de una vía de puntos de control inmunitario negativa cuya inhibición da como resultado la activación de una respuesta inmunitaria no mediada por linfocitos T.

Como se ha analizado anteriormente, "inhibidor de vías de puntos de control inmunitario negativas" se refiere a un modulador de vías de puntos de control inmunitario que interfiere con la activación de una vía de puntos de control inmunitario negativa dando como resultado el aumento o la potenciación de la respuesta inmunitaria. Los inhibidores de vías de puntos de control inmunitario negativas ilustrativos incluyen, entre otros, inhibidores de la vía de la muerte programada 1 (PD1), inhibidores de la vía del ligando de muerte programada 1 (PDL1), inhibidores de la vía de TIM3 e inhibidores de la vía del antígeno 4 contra linfocitos T citotóxicos (CTLA4).

En una realización, el modulador de vías de puntos de control inmunitario es un antagonista de una vía de puntos de control inmunitario negativa que inhibe la unión de PD1 a PDL1 y/o PDL2 ("inhibidor de la vía de PD1"). Los inhibidores de la vía de PD1 dan como resultado la estimulación de una variedad de respuestas inmunitarias favorables, como la reversión del agotamiento de los linfocitos T, la restauración de la producción de citocinas y la expansión de linfocitos T dependientes de antígeno. Los inhibidores de la vía de PD1 se han reconocido como una variedad eficaz de cánceres que recibieron la aprobación de la FDA de los EE. UU. para el tratamiento de una variedad de cánceres, incluido melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, linfoma de Hodgkin, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga y cáncer urotelial.

La expresión inhibidores de la vía de PD1 incluye anticuerpos monoclonales que interfieren con la unión de PD1 a PDL1 y/o PDL2. Los inhibidores de la vía del anticuerpo de PD1 son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de inhibidores de la vía PD1 disponibles comercialmente en las que anticuerpos monoclonales interfieren con la unión de PD1 a PDL1 y/o PDL2 incluyen nivolumab (Opdivo®, b Ms -936558, MDX1106, comercialmente disponible de BristolMyers Squibb, Princeton NJ), pembrolizumab (Keytruda® MK-3475, lambrolizumab, disponible comercialmente de Merck and Company, Kenilworth NJ) y atezolizumab (Tecentriq®, Genentech/Roche, South San Francisco CA). Se encuentran en desarrollo clínico anticuerpos inhibidores de la vía de PD1 adicionales, incluidos, entre otros, durvalumab (MEDI4736, Medimmune/AstraZeneca), pidilizumab (CT-011, CureTech), PDR001 (Novartis), BMS-936559 (MDX1105, BristolMyers Squibb) y avelumab (MSB0010718C, Merck Serono/Pfizer) y SHR-1210 (Incyte).

Inhibidores de la vía de anticuerpos de PD1 adicionales se describen en la patente de Estados Unidos N.° 8.217.149 (Genentech, Inc) emitida el 10 de julio de 2012; la patente de Estados Unidos N.° 8.168.757 (Merck Sharp and Dohme Corp. ej.) emitida el 1 de mayo de 2012, la patente de Estados Unidos N.° 8.008.449 (Medarex) emitida el 30 de agosto de 2011, la patente de los Estados Unidos n.° 7.943.743 (Medarex, Inc) emitida el 17 de mayo de 2011.

En una realización de la invención, el modulador de la vía de puntos de control inmunitario de PD1 es un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR proporcionadas en la tabla 2 a continuación:

Las expresiones "región determinante de la complementariedad" y su abreviatura "CDR" son aquellas secuencias proporcionadas normalmente en moléculas de inmunoglobulina que determinan las propiedades de unión usadas en el presente documento para referirse a los dominios hipervariables de dominios variables de inmunoglobulinas. La identificación sistemática de restos incluidos en las CDR se ha desarrollado por Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). La numeración de las posiciones de CDR en el presente documento se proporciona según las convenciones de numeración de Kabat.

En una realización de la invención, el inhibidor de la vía de puntos de control inmunitario de PD1 es un anticuerpo que comprende las secuencias de dominio variable (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8) proporcionadas en la tabla 3 a continuación:

En una realización de la invención, el anticuerpo antagonista de PD1 es AM0001: un anticuerpo monoclonal con una cadena ligera lambda 2 y una IgG4 con una sustitución de serina por prolina en la posición 228 (S228P) para proporcionar una cadena pesada "estabilizada en bisagra", caracterizada por unas c Dr de VL y VH que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NO: 1-6 como se establece en la tabla 2 anterior en el presente documento, una región variable de cadena ligera caracterizada por la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada caracterizada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. El anticuerpo AM0001 se caracteriza por tener una afinidad de unión (Kd) para PD-1 humana y de macaco cangrejero de aproximadamente 10 pM o menos a 25 °C. La afinidad de unión de AM0001, medida mediante interferometría de biocapas (BLI, por sus siglas en inglés), se muestra en la tabla 4 a continuación.

Las secuencias de aminoácidos de longitud completa de la cadena pesada y la cadena ligera de AM0001 se proporcionan a continuación.

AM0001 Secuencia de proteína de cadena pesada madura (marco de IgG4 S228P humana):

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCPASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLGWVS

DISGGGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCAKS

GTVVTDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK

D YFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKT Y

T CNVDHKP SNTK VDKRVESK Y GPPCPPCP APEFLGGP S VFLFPPKPKDTLM

ISRTPEVTC VVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRV

V S VLT VLHQD WLN GKEYKCK V SNKGLP S SIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP

SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID

NO: 11)

AM0001 Secuencia de proteína de cadena ligera madura (marco de Lambda-2 humana):

S YVLTQPP S V S VAPGQT ARVTCGGNSIGS Y S VHW YQQKPGQ APVL V VYD

D SDRP S GIPERF S GSNS GNT A ALTISRVE AGDE AD Y Y C Q VWDT S S YW VF G

GGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW

K AD S SP VK AGVETTTP SKQ SNNK Y AAS S YLSLTPEQWKSHRS YSCQ VTHE

GSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 12)

El anticuerpo inhibidor de la vía de PD-1 puede producirse mediante medios recombinantes. La presente invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. En una realización, la presente divulgación proporciona secuencias de ácidos nucleicos cuando el anticuerpo antagonista de PD1 es AM0001, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera de AM0001 (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12) se establecen a continuación como SEQ ID NO: 13 y SEQ iD NO: 14, respectivamente.

AM0001 Secuencia de ADN de cadena pesada madura (Marco de IgG4 S228P humana):

GAGGTCCAGCTCCTGGAATCCGGGGGCGGTCTGGTCCAGCCGGGCGG

CTCGCTCCGCCTGTCCTGCCCGGCGAGCGGCTTCACCTTCTCCTCCTAC

GCCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTCGGCTGGGT

CAGCGACATCTCCGGCGGCGGCGGCACCACGTACTACGCGGACTCGG

TGAAGGGCCGGTTCACGATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGT

ACCTGCAGATGAACTCACTGCGGGGCGAGGACACGGCGGTGTATTACT

GCGCCAAGTCCGGAACGGTTGTGACTGATTTCGACTACTGGGGCCAGG

GCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCCAGCGTGT

TCCCCCTGGCGCCGTGCTCGCGGAGCACCAGCGAGTCCACCGCCGCGC

TCGGTTGCCTCGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCGGTCACAGTGTCAT

GGAACTCCGGCGCGCTGACGAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCCGTGC

TC C A GTC C A GC GGC C TGT A C A GC C TC A GT A GC GTC GTGA C GGTGC C C T

CGTCGTCGCTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAG

CCGTCCAACACCAAGGTCGATAAGCGAGTGGAGAGCAAGTACGGCCC

CCCGTGCCCCCCCTGCCCGGCCCCGGAGTTCCTGGGTGGCCCCTCCGT

GTTCCTCTTCCCCCCGAAGCCCAAAGACACCCTCATGATCAGCCGGAC

GCCGGAGGTCACGTGCGTCGTCGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCGG

AGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCATAACGCCA

AGACCAAGCCTCGCGAGGAACAGTTCAACTCCACTTACCGCGTCGTGT

CCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAATACA

AGTGCAAGGTCTCGAACAAGGGCCTGCCGTCGTCCATCGAGAAGACC

ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCGCGGGAGCCCCAGGTCTACACCCT

CCCCCCCTCCCAGGAAGAGATGACGAAGAACCAGGTGAGCCTGACGT

GCCTCGTGAAGGGGTTCTACCCCTCCGACATCGCAGTCGAGTGGGAGA

GCAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAAGACGACCCCCCCGGTGCTG

GACAGCGACGGGTCCTTCTTCCTCTACTCGCGTCTCACAGTCGACAAG

TCGCGCTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGTGATGCACGAG

GCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCGCTGTCCCTGTCCCTGGGC

AA G (SEQ ID NO: 13)

AM0001 Secuencia de proteína de cadena ligera madura (marco de Lambda-2 humana):

A G C T A C G T G C T G A C C C A G C C G C C C T C G G T G T C G G T C G C C C C G G G C C A G

A C G G C A C G T G T G A C C T G C G G C G G T A A C A G C A T C G G C T C C T A C T C G G T C

C A C T G G T A T C A G C A G A A G C C G G G G C A G G C C C C G G T C C T G G T G G T C T A C

G A C G A C A G C G A C C G C C C G T C C G G C A T C C C C G A A C G C T T C A G C G G C T C A

A A C A G C G G G A A C A C C G C G G C C C T G A C G A T C T C G C G C G T C G A G G C G G G

G G A C G A A G C C G A T T A C T A C T G C C A G G T C T G G G A C A C C T C G A G T T A C T G

G G T G T T C G G C G G G G G C A C G A A G C T G A C C G T C C T C G G C C A G C C G A A G G

C C G C C C C C T C A G T A A C C C T G T T C C C C C C G T C C T C G G A G G A G T T G C A G G

C G A A C A A G G C G A C G C T G G T G T G C T T G A T C T C G G A C T T C T A C C C C G G A G

C G G T G A C G G T C G C C T G G A A G G C C G A C T C C T C C C C G G T C A A G G C G G G C

G T G G A G A C G A C C A C C C C C T C C A A G C A G A G C A A C A A C A A G T A C G C C G C

C T C G A G C T A C C T C T C G C T G A C A C C C G A G C A G T G G A A G T C C C A C C G G T C

C T A C T C G T G C C A G G T A A C C C A C G A G G G C T C C A C C G T C G A G A A G A C C G T

G G C C C C C A C C G A G T G C A G C (S E Q ID N O : 14)

En general, la expresión inhibidores de la vía de PD1 no se limita a anticuerpos antagonistas. Los inhibidores biológicos de la vía de PD1 que no son anticuerpos también están en desarrollo clínico, incluidos AMP-224, una proteína de fusión PD-L2 IgG2a y AMP-514, una proteína de fusión PDL2, están en desarrollo clínico por Amplimmune y Glaxo SmithKline. Los compuestos aptámeros también se describen en la bibliografía como útiles como inhibidores de la vía de PD1 (Wang, et al. Selection of PD1/PD-L1 X-Aptamers, Biochimie, in press; disponible en línea el 11 de septiembre de 2017, en la dirección de Internet: https://doi.org/10.10167j.biochi.2017.09.006.

La expresión general inhibidores de la vía de PD1 incluye inhibidores de la vía de peptidil PD1 como los descritos en Sasikumar, et al., patente de los Estados Unidos N.° 9,422,339 emitida el 23 de agosto de 2016, y Sasilkumar, et al., patente de Estados Unidos n.° 8.907.053 emitida el 9 de diciembre de 2014. Según se informa, CA-170 (AUPM-170, Aurigene/Curis) es una molécula pequeña biodisponible por vía oral que se dirige a los puntos de control inmunitario de PDL1 y VISTA. Pottayil Sasikumar, et al. Oral immune checkpoint antagonists targeting PD-L1/VISTA or PD-L1/Tim3 for cancer therapy. [abstract]. En: Proceedings of the 107th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 16-20 de abril de 2016; Nueva Orleans, LA. Filadelfia (PA): AACR; Cancer Res 2016;76(14 Suppl): Resumen N.°4861. Según se informa, CA-327 (AUPM-327, Aurigene/Curis) es una molécula pequeña disponible por vía oral que inhibe los puntos de control inmunitario, del ligando de muerte programada 1 (Pd L1) y proteína 3 que contiene el dominio de mucina e inmunoglobulina de linfocitos T (TIM3, por sus siglas en inglés).

La expresión general inhibidores de la vía de PD1 incluye inhibidores de la vía de PD1 de molécula pequeña. En la técnica se describen ejemplos de inhibidores de la vía de PD1 de molécula pequeña, incluidos Sasikumar, et al. 1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators (PCT/IB2016/051266 presentado el 7 de marzo de 2016, publicado como el documento WO2016142833A1 el 15 de septiembre de 2016) y Sasikumar, et al. 3-substituted-1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators (número de serie de solicitud del PCT, PCT/IB2016/051343 presentada el 9 de marzo de 2016 y publicada como el documento WO2016142886A2), BMS-1166 y BMS-1001 (Skalniak, et al (2017) Oncotarget 8(42): 72167-72181) que tiene las estructuras:

Chupak LS and Zheng X. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. 2015, documento WO 2015/034820 A1, documento EP3041822 B1 otorgado el 9 de agosto de 2017; documento WO2015034820 A1; y Chupak, et al. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. 2015, documento WO 2015/160641 A2. El documento W^o 2015/160641 A2, Chupak, et al. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. Sharpe, et al. Modulators of immunoinhibitory receptor PD-1, and methods of use thereof, documento WO 2011082400 A2 (publicado el 7 de julio de 2011); patente de los Estados Unidos N.° 7.488.802 (Wyeth) emitida el 10 de febrero de 2009.

Otro modulador de vías de puntos de control inmunitario es un antagonista de una vía de puntos de control inmunitario negativa que inhibe la unión de CTLA4 a CD28 ("inhibidor de la vía de CTLA4"). El receptor de puntos de control inmunitario CTLA4 pertenece a la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas, en la que también se incluyen PD1; BTLA; atenuador de linfocitos; TIM3 e inmunoglobulina de dominio V supresora de la activación de linfocitos T. CD80 (también conocido como B7.1) y CD86 (también conocido como B7.2) se han identificado como ligandos del receptor CTLA4. CTLA4, el primer receptor de puntos de control inmunitario en seleccionarse clínicamente, se expresa exclusivamente en linfocitos T, donde regula principalmente la amplitud de las primeras etapas de activación de los linfocitos T. Se ha demostrado que contrarresta la actividad del receptor coestimulador de linfocitos T CD28.

Tras el reconocimiento del antígeno, la señalización de CD28 amplifica de forma potente la señalización del receptor de linfocitos T para activar los linfocitos T. Véase, por ejemplo, Riley et al., (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:11790-95. CTLA4 se induce transcripcionalmente después de la activación de los linfocitos T. Aunque CTLA4 se expresa por linfocitos T efectores CD8+ activados, se cree que su función fisiológica principal se manifiesta a través de distintos efectos en los dos subconjuntos principales de linfocitos T CD4+: i) modulación negativa de la actividad de los linfocitos T auxiliares, y ii) potenciación de la actividad inmunosupresora de los linfocitos T reguladores. Concretamente, el bloqueo de CTLA4 da como resultado una potenciación de la respuesta inmunitaria dependiente de los linfocitos T auxiliares, mientras que la interacción de CTLA4 con los linfocitos T reguladores aumenta su función supresora. Véase, por ejemplo, Fontenot et al., (2003) Nat. Immunol. Proc. 4:330-36. Los ejemplos de inhibidores de la vía de CTLA4 son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.682.736 (Abgenix) emitida el 27 de enero de 2004; la patente de los Estados Unidos N.° 6,984,720 (Medarex, Inc.) emitida el 29 de mayo de 2007; la patente de los Estados Unidos N.° 7,605,238 (Medarex, Inc.) emitida el 20 de octubre de 2009).

Actualmente, los enfoques de tratamiento con anticuerpos inhibidores de la vía de CTLA4 no están exentos de deficiencias. A modo de ejemplo, se ha informado que el tratamiento de melanomas metastásicos con un anticuerpo antagonista anti-CTLA4 humanizado causa ciertas toxicidades autoinmunitarias (por ejemplo, inflamación intestinal y dermatitis), incitando a la determinación de una ventana terapéutica tolerada (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30). La mayor eficacia terapéutica de la combinación de un inhibidor de la vía de CTLA4 (por ejemplo, un anticuerpo como ipilimumab) con el agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) ofrece la posibilidad de reducir las dosis manteniendo la eficacia terapéutica.

Otro modulador de vías de puntos de control inmunitario es un antagonista de una vía de puntos de control inmunitario negativa que inhibe la unión de BTLA a HVEM ("inhibidor de la vía de BTLA"). BTLA es una molécula coinhibidora estructural y funcionalmente relacionada con CTLA-4 y PD-1. Aunque BTLA se expresa en linfocitos T CD8+ humanos específicos de virus, se disminuye progresivamente después de su diferenciación de un fenotipo indiferenciado a efector (Paulos et al., (enero de 2010) J. Clin. Invest. 120(1):76-80). El mediador de entrada del virus del herpes (HVEM; también conocido como TNFRSF14), que se expresa en ciertos tipos de células tumorales (por ejemplo, melanoma) y células endoteliales asociadas a tumores, se ha identificado como el ligando de BTLA. Debido a que las interacciones entre BTLA y HVEM son complejas, las estrategias de inhibición terapéutica son menos sencillas para BTLA que para otros receptores y ligandos inhibidores de vías de puntos de control inmunitario. Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64. Se han evaluado varios enfoques dirigidos a la vía de BTLA/HVEM utilizando anticuerpos anti-BTLA y HVEM-Ig antagonista, y dichos enfoques han sugerido una utilidad prometedora en una serie de enfermedades, trastornos y afecciones, entre los que se incluyen trasplante, infección, tumor y enfermedad autoinmunitaria (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30).

Otro modulador de vías de puntos de control inmunitario es un antagonista de una vía de puntos de control inmunitario negativa que inhibe la capacidad de TIM3 para unirse a ligandos activadores de TIM3 ("inhibidor de la vía de TIM3"). TIM3 inhibe las respuestas de los linfocitos T auxiliares 1 (TH1), y se ha demostrado que los anticuerpos anti-TIM3 potencian la inmunidad antitumoral. Galectina 9, una molécula implicada en la modulación de la vía de TIM3, aumenta en varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama. Se ha informado que TIM3 se coexpresa con PD1 en linfocitos T CD8+ específicos de tumor. Cuando se estimula por el antígeno NY-ESO-1 de cáncer de testículos, la inhibición dual de ambas moléculas potencia significativamente la proliferación y producción de citocinas in vitro de linfocitos T humanos. Por otra parte, en modelos animales, se informó que el bloqueo coordinado de PD1 y TIM3 potencia las respuestas inmunitarias antitumorales en circunstancias en las que solo se observaron efectos moderados del bloqueo de cada molécula individual. Véase, por ejemplo, Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64; Zhu et al., (2005) Nature Immunol. 6:1245-52; Ngiow et al., (2011) Cancer Res. 71:3540-51). Los ejemplos de inhibidores de la vía de TIM3 se conocen en la técnica y se describen ejemplos no limitantes representativos en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° PCT/US2016/021005 publicada el 15 de septiembre de 2016; Lifke, et al. Publicación de Patente de los Estados Unidos N.° US 20160257749 A1 publicada el 8 de septiembre de 2016 (F. Hoffman-LaRoche), Karunsky, Patente de los Estados Unidos N.° 9.631.026 emitida el 27 de abril de 2017; Karunsky, Sabatos-Peyton, et al. Patente de los Estados Unidos N.° 8.841.418 emitida el 23 de septiembre de 2014; Patentes de Estados Unidos N.° 9.605.070; y Takayanagi, et al. Patente de los Estados Unidos N.° 8552156 emitida el 8 de octubre de 2013.

Se ha demostrado que LAG3 desempeña un papel en la potenciación de la función de los linfocitos T reguladores (Treg) e independientemente en la inhibición de las funciones de los linfocitos T CD8+ efectores. En algunos cánceres epiteliales aumentan las moléculas MHC de clase II, el ligando para LAG3, (con frecuencia en respuesta a IFN^y) y también se expresan en macrófagos infiltrantes de tumores y células dendríticas. Aunque el papel de la interacción LAG3-MHC de clase II no se ha aclarado definitivamente, la interacción puede ser un componente clave en el papel de LAG3 en la potenciación de la función de los linfocitos Treg.

LAG3 es uno de varios receptores de puntos de control inmunitario que aumentan de forma coordinada tanto en linfocitos Treg como en linfocitos T anérgicos. El bloqueo simultáneo de LAG3 y PD1 puede provocar una reversión potenciada del estado anérgico en comparación con el bloqueo de un solo receptor. De hecho, se ha demostrado que el bloqueo de LAG3 y PD1 revierte sinérgicamente la anergia entre los linfocitos T CD8+ específicos de tumores y los linfocitos T CD8+ específicos de virus en el contexto de una infección crónica. Se está evaluando IMP321 (ImmuFact) en melanoma, cáncer de mama y carcinoma de células renales. Véase en general Woo et al., (2012) Cancer Res 72:917-27; Goldberg et al., (2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344:269-78; Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64; Grosso et al, (2007) J. Clin. Invest. 117:3383-392.

A2aR inhibe las respuestas de los linfocitos T al estimular los linfocitos T CD4+ para que se conviertan en linfocitos Treg. A2aR es particularmente importante en la inmunidad tumoral porque la tasa de muerte celular en los tumores debido a la renovación celular es alta y las células moribundas liberan adenosina, que es el ligando para A2aR. Además, la eliminación de A2aR se ha asociado con respuestas inflamatorias potenciadas y a veces patológicas a una infección. La inhibición de A2aR puede efectuarse mediante anticuerpos que bloquean la unión de adenosina o mediante análogos de adenosina. Dichos agentes pueden ser útiles en trastornos como el cáncer y la enfermedad de Parkinson. Véase, en general, Zarek et al., (2008) Blood 111:251-59; Waickman et al., (25 de noviembre de 2011) Cancer Immunol. Immunother. (doi: 10. 1007/s00262-011-1155-7)].

La IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) es una enzima reguladora inmunitaria que normalmente se expresa en células tumorales y en células inmunitarias activadas. La IDO disminuye la respuesta inmunitaria mediada a través de la oxidación del triptófano. Esto da como resultado la inhibición de la activación de los linfocitos T y la inducción de la apoptosis de los linfocitos T, creando un entorno en el que los linfocitos T citotóxicos específicos de tumor se vuelven funcionalmente inactivos o ya no pueden atacar las células cancerosas de un sujeto. Indoximod (NewLink Genetics) es un inhibidor de IDO que se está evaluando en el cáncer de mama metastásico.

Se describen la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (por ejemplo, Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); están disponibles técnicas convencionales para caracterizar interacciones ligando/receptor (véase, por ejemplo, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York); están disponibles métodos de citometría de flujo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), (véase, por ejemplo, Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ); y están disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico, (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.; Sigma-Aldrich (2003) Catalog, St. Louis, Mo .).

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención permite el tratamiento de enfermedades neoplásicas en un sujeto mamífero mediante la administración de un agente de IL-10 como se define en las reivindicaciones en combinación con uno o más agentes que modulan al menos una vía de puntos de control inmunitario, incluidos moduladores de vías de puntos de control inmunitario que modulan dos, tres o más vías de puntos de control inmunitario, como se define en las reivindicaciones.

En una realización, múltiples vías de puntos de control inmunitario pueden modularse mediante la administración de moléculas multifuncionales que son capaces de actuar como moduladores de múltiples vías de puntos de control inmunitario (observándose que, en la presente invención, un modulador de vías de puntos de control inmunitario es un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario que se administra en el método). Los ejemplos de dichos moduladores de múltiples vías de puntos de control inmunitarios incluyen, entre otros, anticuerpos biespecíficos o poliespecíficos. Se conocen en la técnica ejemplos de anticuerpos poliespecíficos capaces de actuar como moduladores de múltiples vías de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2013/0156774 describe agentes biespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos) y métodos para su uso, para dirigirse a células que coexpresan PD1 y TIM3. Por otra parte, se ha demostrado que el bloqueo dual de BTLA y PD1 potencia la inmunidad antitumoral (Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64). La presente divulgación contempla el uso de agentes de IL-10 en combinación con moduladores de vías de puntos de control inmunitario que se dirigen a múltiples vías de puntos de control inmunitario, incluidos, entre otros, anticuerpos biespecíficos que se unen tanto a PD1 como a LAG3. De este modo, la inmunidad antitumoral se puede potenciar en múltiples niveles, y se pueden generar estrategias combinatorias en vista de varias consideraciones mecánicas.

Otras realizaciones contemplan la administración de un agente de IL-10 en combinación con moduladores de múltiples vías de puntos de control, y otras realizaciones adicionales más contemplan la administración de un agente de IL-10 en combinación con tres o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario. Dichas combinaciones de agentes de IL-10 con moduladores de múltiples vías de puntos de control inmunitario pueden ser ventajosas porque las vías de puntos de control inmunitario pueden tener distintos mecanismos de acción, que brinda la oportunidad de atacar la enfermedad, trastorno o afecciones subyacentes desde múltiples ángulos terapéuticos distintos. Las combinaciones representativas (algunas de las cuales se encuentran en ensayos clínicos como se identifica a continuación) de moduladores de vías de puntos de control inmunitario que se pueden combinar con la administración de un agente de IL-10 incluyen, entre otras:

(a) inhibidores de la vía PD1/PDL1 (incluidos, entre otros, nivolumab, pembrolizumab, PDR001; MEDI4736, atezolizumab y durvalumab) con anticuerpos antagonistas de LAG3 (por ejemplo. BMS-986016, identificador de ensayo clínico NCT01968109), anticuerpos antagonistas de CTLA4 (por ejemplo, ipilumumab), anticuerpos antagonistas de B7-H3 (por ejemplo, enoblituzumab, por ejemplo, identificador de ensayo clínico NCT01968109), anticuerpos antagonistas de KIR (por ejemplo, lirilumab, por ejemplo, identificador de ensayo clínico NCT01714739);

(b) inhibidores de la vía de PD1/PDL1 (incluidos, entre otros, nivolumab, pembrolizumab, PDR001; MEDI4736, atezolizumab y durvalumab) con anticuerpos agonistas de puntos de control inmunitario positivos, tal como anticuerpos agonistas contra 4-1BB (relumab, identificador de ensayo clínico NCT02253992), anticuerpos agonistas contra ICOS (por ejemplo, JTX-2011, por ejemplo, identificador de ensayo clínico NCT02904226), anticuerpos agonistas de c D27 (por ejemplo, varlilumab, por ejemplo, identificador de ensayo clínico NCT02335918), anticuerpos agonistas de GIT^r (por ejemplo, GWN323, por ejemplo, identificador de ensayo clínico NCT02740270), y anticuerpos agonistas de OX40 (por ejemplo, MEDI6383, (por ejemplo, identificador de ensayo clínico NCT02221960).

Otras terapias de combinación representativas con inhibidores de la vía de PD1/PDL1 que pueden complementarse con la adición de un agente de IL-10 incluyen la combinación de inhibidores de la vía PD1/PDL1 con inhibidores de BRAF/MEK, inhibidores de cinasas tal como sunitinib (NCT02484404), inhibidores de PARP tal como olaparib (NCT02484404), inhibidores de EGFR tal como osimertinib (Ahn, et al. (2016) J Thorac Oncol. 11: S115), inhibidores de IDO tal como epacadostat y virus oncolíticos tal como talimogene laherparepvec (T-VEC).

Agentes de IL-10:

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente de IL-10" se refiere a una molécula dimérica que tiene actividad de IL-10 que comprende dos polipéptidos de IL-10 que se unen al receptor de IL-10 y modulan la misma vía de señalización que IL-10 y son capaces de provocar una respuesta biológica característica de IL-10. La expresión agente de IL-10 incluye análogos de IL-10 y variantes de IL-10 y agentes de IL-10 modificados.

La expresión polipéptido de IL-10 debe interpretarse de manera amplia e incluye, por ejemplo, polipéptidos relacionados con IL-10 humanos y no humanos, incluyendo homólogos, variantes (incluyendo muteínas) y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos de IL-10 que tengan, por ejemplo, una secuencia líder (por ejemplo, el péptido señal) y versiones modificadas de los anteriores. En realizaciones particulares adicionales, IL-10, el uno o más polipéptidos de IL-10 y el uno o más agentes de IL-10 son agonistas. La expresión "análogo de IL-10", como se usa en el presente documento, se refiere a agentes de IL-10 que funcionan a través de los agentes de IL-10 que incluyen análogos de IL-10 y variantes de IL-10 que funcionan a través del mismo mecanismo de acción que IL-10 (es decir,, que se unen de manera específica a y modulan la actividad del receptor de IL-10 y los agentes que modulan la misma vía de señalización que IL-10 de manera análoga) y son capaces de provocar una respuesta biológica comparable a (o mayor que) la de IL-10.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye polipéptidos de IL-10 que comprenden sustituciones conservativas de aminoácidos. La expresión "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a las sustituciones que conservan la actividad de la proteína mediante la sustitución de uno o más aminoácidos en la proteína con un aminoácido con una cadena lateral que tiene una acidez, basicidad, carga, polaridad o tamaño similar al de la cadena lateral. Las sustituciones conservativas de aminoácidos generalmente implican la sustitución de restos de aminoácidos dentro de los siguientes grupos: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; y 6) D, E. La pauta para sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden basarse en alineaciones de secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas variantes o proteínas de diferentes especies. De este modo, además de cualquier polipéptido de IL-10 natural, la presente divulgación contempla que tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, generalmente no más de 20, 10 o 5 sustituciones de aminoácidos, donde la sustitución suele ser una sustitución conservativa de aminoácidos.

En algunos casos, el polipéptido de IL-10 incluye uno o más enlaces distintos de los enlaces peptídicos, por ejemplo, se unen al menos dos aminoácidos adyacentes a través de un enlace que no sea un enlace amida para reducir o eliminar la proteólisis u otros medios de degradación no deseados, y/o para aumentar la estabilidad en suero, y/o para restringir o aumentar la flexibilidad conformacional, se pueden sustituir uno o más enlaces amida dentro de la cadena principal de IL-10. Pueden reemplazarse uno o más enlaces amida (-CO-NH-) en un polipéptido de IL-10 con un enlace que es un isóstero de un enlace amida, tales como -CH2NH-, -CH2S-, -C^h 2^c H2-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH²- o -CH²SO-. También se pueden reemplazar uno o más enlaces amida en IL-10 por, por ejemplo, un enlace pseudopeptídico isóstero reducido. Véase Couder et al. (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41:181-184. Dichos reemplazos y cómo efectuarlos son conocidos por los expertos en la materia.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye polipéptidos de IL-10 que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos que incluyen pero sin limitación: a) sustitución de aminoácidos hidrófobos sustituidos con alquilo, incluyendo alanina, leucina, isoleucina, valina, norleucina, ácido (S)-2-aminobutírico, (S)-ciclohexilalanina u otros aaminoácidos simples sustituidos por una cadena lateral alifática de C¹-C¹⁰ carbonos, incluyendo sustituciones con alquilo, alquenilo o alquinilo ramificados, cíclicos y de cadena lineal;

b) sustitución de aminoácidos hidrófobos aromáticos sustituidos, incluyendo fenilalanina, triptófano, tirosina, sulfotirosina, bifenilalananina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, 2-benzotienilalanina, 3-benzotienilalanina, histidina, incluyendo formas sustituidas con amino, alquilamino, dialquilamino, aza, halógenos (fluoro, cloro, bromo o yodo) o alcoxi (de C¹-C⁴) de los aminoácidos aromáticos mencionados anteriormente, cuyos ejemplos ilustrativos son: 2, 3 o 4- aminofenilalanina, 2, 3 o 4-clorofenilalanina, 2, 3 o 4-metilfenilalanina, 2, 3 o 4-metoxifenilalanina, 5-amino, 5-cloro, 5- metil o 5-metoxitriptófano, 2', 3', o 4'-amino-, 2', 3', o 4'-cloro-, 2, 3 o 4-bifenilalanina, 2', 3', o 4'-metil-, 2, 3 o 4-bifenilalanina y 2 o 3-piridilalanina; c) sustitución de aminoácidos que contienen cadenas laterales básicas, incluyendo arginina, lisina, histidina, ornitina, ácido 2,3-diaminopropiónico, homoarginina, incluyendo derivados sustituidos con alquilo, alquenilo o arilo (de C¹-C¹⁰ ramificados, lineales o cíclicos) de los aminoácidos anteriores, si el sustituyente se encuentra en los heteroátomos (como el nitrógeno a, o el nitrógeno o nitrógenos distales, o en el carbono a, en la posición pro-R por ejemplo. Los compuestos que sirven como ejemplos ilustrativos incluyen: N-épsilon-isopropil-lisina, 3-(4-tetrahidropiridil)-glicina, 3-(4-tetrahidropiridil)-alanina, N,N-gamma, gamma'-dietil-homoarginina. También se incluyen compuestos tales como a-metil-arginina, ácido a-metil-2,3-diaminopropiónico, a-metil-histidina, a-metilornitina donde el grupo alquilo ocupa la posición pro-R del carbono a. También se incluyen las amidas formadas a partir de derivados de alquilo, aromáticos, heteroaromáticos (donde el grupo heteroaromático tiene uno o más nitrógenos, oxígenos o átomos de azufre solos o en combinación), ácidos carboxílicos o cualquiera de los muchos activados conocidos tales como cloruros de ácido, ésteres activos, azolidas activas y derivados relacionados, y lisina, ornitina o ácido 2,3-diaminopropiónico; d) sustitución de aminoácidos ácidos, incluyendo ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, tirosina, sulfonamidas de alquilo, arilo, arilalquilo y heteroarilo del ácido 2,4-diaminopriopionico, ornitina o lisina y aminoácidos de alquilo sustituidos con tetrazol; e) sustitución de restos de amida de la cadena lateral, incluida la asparagina, glutamina y derivados sustituidos con alquilo o aromáticos de asparagina o glutamina; y f) sustitución de aminoácidos que contienen hidroxilo, incluyendo serina, treonina, homoserina, ácido 2,3-diaminopropiónico y derivados sustituidos con alquilo o aromáticos de serina o treonina.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye polipéptidos de IL-10 que comprenden uno o más L-aminoácidos naturales no codificados genéticamente, L-aminoácidos sintéticos, o D-enantiómeros de un aminoácido. Por ejemplo, IL-10 puede comprender solamente D-aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido de IL-10 puede comprender uno o más de los siguientes restos: hidroxiprolina, p-alanina, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, ácido paminobenzoico, ácido m-aminometilbenzoico, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido a-aminoisobutírico, N-metilglicina (sarcosina), ornitina, citrulina, t-butiladenina, t-butilglicina, N-metilisoleucina, fenilglicina, ciclohexilalanina, norleucina, naftilalanina, piridilalanina, 3-benzotienil alanina, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, p-2-tienilalanina, sulfóxido de metionina, homoarginina, N-acetil lisina, ácido 2,4-diaminobutírico, rho-aminofenilalanina, N-metilvalina, homocisteína, homoserina, ácido £-amino hexanoico, ácido w-aminohexanoico, ácido w-aminoheptanoico, ácido w-aminooctanoico, ácido w-aminodecanoico, ácido w-aminotetradecanoico, ciclohexilalanina, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,pdiaminopropiónico, ácido 8-amino valérico y ácido 2,3-diaminobutírico.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye polipéptidos de IL-10 que comprenden uno o más restos de cisteína o análogos de cisteína adicionales para facilitar el enlace del polipéptido de IL-10 con otro polipéptido a través de un enlace disulfuro o para proporcionar la ciclación del polipéptido de IL-10. Los métodos para introducir una cisteína o un análogo de cisteína son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 8.067.532.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye polipéptidos ciclados. Se puede generar un enlace ciclante con cualquier combinación de aminoácidos (o con un aminoácido y -(CH2)n-CO- o -(CH2)n-C6H4-CO-) con grupos funcionales que permiten la introducción de un puente. Algunos ejemplos son los disulfuros, miméticos de disulfuro como el puente -(CH2)n- carba, puentes tioacetales, tioéter (cistationina o lantionina) y puentes que contienen ésteres y éteres. En estos ejemplos, n puede ser cualquier número entero, pero con frecuencia es menos de diez.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye modificaciones adicionales que incluyen, por ejemplo, una sustitución N-alquilo (o arilo) (^[CONR]), o entrecruzamiento de la cadena principal para construir lactamas y otras estructuras cíclicas. Otros derivados incluyen derivados de hidroximetilo carboxiterminal, derivados o-modificados (por ejemplo, hidroximetilbenciléter carboxiterminal), derivados modificados en el extremo N que incluyen amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas.

La expresión "polipéptido de IL10" incluye un análogo retroinverso (véase, por ejemplo, Sela y Zisman (1997) FASEB J. 11:449). Los análogos retroinversos de péptidos son isómeros de polipéptidos lineales en los que la dirección de la secuencia de aminoácidos está invertida (retro) y la quiralidad, D- o L-, de uno o más aminoácidos en el mismo está invertida (inverso), por ejemplo, utilizando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos. [Véase, por ejemplo, Jameson et al. (1994) Nature 368:744; y Brady et al. (1994) Nature 368:692].

La expresión "polipéptido de IL10" incluye modificaciones para incluir un "dominio de transducción de proteínas" (PTD, por sus siglas en inglés). La expresión "dominio de transducción de proteínas" se refiere a un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato o molécula orgánica o inorgánica que facilita atravesar una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulos o membrana de vesículas. Un PTD unido a otra molécula facilita que la molécula atraviese una membrana, por ejemplo, pasar del espacio extracelular al espacio intracelular, o del citosol al interior de un orgánulo. En algunas realizaciones, un PTD está unido covalentemente al extremo amino de un polipéptido de IL-10, mientras que, en otras realizaciones, un PTD está unido covalentemente al extremo carboxilo de un polipéptido de IL-10. Los dominios de transducción de proteínas ilustrativos incluyen, pero sin limitación, un dominio de transducción de proteína undecapeptídico mínimo (correspondiente a los restos 47-57 de TAT de VIH-1 que comprende YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 15); una secuencia de poliarginina que comprende varias argininas suficientes para dirigir la entrada en una célula (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio VP22 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); un dominio de transducción de proteínas de Drosophila Antennapedia (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); un péptido de calcitonina humana truncado (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polilisina (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO: 16); transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 17); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 18); y RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 19). Los PTD ilustrativos incluyen, pero sin limitación, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 15), RKKRRQRRR (SEQ ID NO:20); un homopolímero de arginina de 3 restos de arginina a 50 restos de arginina; las secuencias de aminoácidos del dominio PTD ilustrativas incluyen, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 15); RKKRRQRR (SEQ ID NO: 21); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 22); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 23); y GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 24).

El grupo carboxilo COR³ del aminoácido en el extremo carboxiterminal de un polipéptido de IL-10 puede estar presente en forma libre (R3 = OH) o en forma de una sal alcalina o alcalinotérrea fisiológicamente tolerada, tal como, por ejemplo, una sal de sodio, potasio o calcio. El grupo carboxilo también se puede esterificar con alcoholes primarios, secundarios o terciarios tales como, por ejemplo, metanol, alcoholes alquílicos C1-C6 ramificados o no ramificados, por ejemplo, alcohol etílico o terc-butanol. El grupo carboxilo también se puede amidar con aminas primarias o secundarias tales como amoníaco, alquilaminas C1-C6 ramificadas o no ramificadas o dialquilaminas C1-C6, por ejemplo, metilamina o dimetilamina.

El grupo amino del aminoácido NR1R2 en el extremo aminoterminal de un polipéptido de IL-10 puede estar presente en forma libre (R1 = H y R2 = H) o en forma de una sal fisiológicamente tolerada tal como, por ejemplo, un cloruro o acetato. El grupo amino también se puede acetilar con ácidos de manera que R1 = H y R2 = acetilo, trifluoroacetilo o adamantilo. El grupo amino puede estar presente en forma protegida por grupos protectores de amino utilizados convencionalmente en la química de péptidos, tales como los proporcionados anteriormente (por ejemplo, Fmoc, benciloxi-carbonilo (Z), Boc y Alloc). El grupo amino puede estar N-alquilado en el que R¹ y/o R² = C¹-C⁶ alquilo o C²-C8 alquenilo o C⁷-C⁹ aralquilo. Los restos alquilo pueden ser de cadena lineal, ramificados o cíclicos (por ejemplo, etilo, isopropilo y ciclohexilo, respectivamente).

La expresión "polipéptido de IL10" incluye fragmentos activos de polipéptidos de IL-10. La expresión "fragmento activo de polipéptido de IL-10" se refiere a polipéptidos de IL-10 que son fragmentos (por ejemplo, subsecuencias) de especies de IL-10 naturales que contienen restos de aminoácidos contiguos procedentes de especies de IL-10 naturales que son capaces de dimerizarse con otro polipéptido de IL-10, de manera que el dímero posea actividad de IL-10. La longitud de los restos de aminoácidos contiguos de una subsecuencia peptídica o polipeptídica varía dependiendo de la secuencia específica de aminoácidos naturales de la que procede la subsecuencia. En general, los péptidos y polipéptidos pueden ser de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 140 aminoácidos, de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 150 aminoácidos a aproximadamente 155 aminoácidos, de aproximadamente 155 aminoácidos hasta el péptido o polipéptido de longitud completa.

Adicionalmente, los polipéptidos de IL-10 pueden tener una identidad de secuencia definida en comparación con una secuencia de referencia en una longitud definida de aminoácidos contiguos (por ejemplo, una "ventana de comparación"). Los métodos de alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Madison, Wis.) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)). Están disponibles paquetes de programas informáticos y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líder, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glicosilación y alineamientos de secuencias, (véase, por ejemplo, GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); y DeCypher™ (TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV).

Como ejemplo, un polipéptido de IL-10 adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de una serie contigua de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 140 aminoácidos, de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 150 aminoácidos a aproximadamente 155 aminoácidos, de aproximadamente 155 aminoácidos hasta el péptido o polipéptido de longitud completa.

Tal como se analiza adicionalmente a continuación, los polipéptidos de IL-10 pueden aislarse de una fuente natural (por ejemplo, un entorno distinto del entorno natural) y también pueden prepararse de forma recombinante (por ejemplo, en una célula hospedadora modificada genéticamente, tal como una bacteria, levadura, Pichia, células de insecto, y similares), donde la célula hospedadora genéticamente modificada se modifica con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Los polipéptidos de IL-10 también se pueden producir sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis química sin células).

La presente divulgación contempla agentes de IL-10 compuestos por polipéptidos de IL-10 obtenidos de una variedad de fuentes de mamíferos y no mamíferos que incluyen ortólogos y formas modificadas de los mismos. Además de los polipéptidos humanos y las moléculas de ácido nucleico que los codifican, la presente divulgación contempla los polipéptidos de IL-10 y las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes de otras especies que incluyen murinas, rata (registro NP_036986.2; GI 148747382); vaca (registro NP_776513.1; GI 41386772); oveja (registro NP_001009327.1; GI 57164347); perro (registro ABY86619.1; GI 166244598); y conejo (registro AAC23839.1; GI 3242896).

Ejemplos de agentes de IL-10 procedentes de fuentes que o son mamíferos incluyen IL-10 viral procedente de la familia herpesviridae subfamilia betaherpesvirinae, género citomegalovirus, incluido el citomegalovirus humano, números de registro de Genbank AAR31656 y ACR49217), citomegalovirus del mono verde, (número de registro de Genbank AEV80459), citomegalovirus de rhesus, (número de registro de Genbank AAF59907), citomegalovirus de babuino, (número de registro de Genbank AAF63436), citomegalovirus del mono búho, (número de registro de Genbank AEV80800), y citomegalovirus del mono ardilla, (número de registro de GenBank AEV80955); familia Gammaherpesvirinae género linfocriptovirus, virus de Epstein-Barr, (número de registro de Genbank CAD53385), herpesvirus de bonobo, (número de registro de GenBank XP_003804206.1), linfocriptovirus de rhesus, (número de registro de Genbank AAK95412), linfocriptovirus de babuino, (número de registro de GenBank AAF23949); género macavirus que incluye el herpesvirus 2 ovino (número de registro de Genbank AAX58040); género percavirus que incluye el herpesvirus 2 de équidos (número de registro de Genbank AAC13857); familia alloherpesviridea género ciprinivirus que incluye herpesvirus 3 de ciprínidos (n.° de registro de Genbank ABG429610), herpesvirus 1 de anguílidos(n.° de registro de Genbank AFK25321); familia poxviridae, subfamilia chodopoxvirinae género parapoxvirus que incluye el virus orf (n.° de registro de Genbank AAR98352), virus de la estomatitis papular bovina (n.° de registro de Genbank AAR98483), virus de pseudoviruela bovina (n.° de registro de Genbank ADC53770); género capripoxvirus, incluido el virus de la dermatosis nodular contagiosa (n.° de registro de Genbank AAK84966), el virus de la viruela ovina (n.° de registro de Genbank NP_659579), el virus de la viruela caprina (n.° de registro de Genbank YP_00129319) y el virus de la viruela de las aves, incluido el virus de la viruela del canario (n.° de registro de Genbank NP_955041).

La expresión "actividad de IL-10" se refiere a agentes de IL-10 que normalmente ejercen sus efectos uniéndose al receptor de IL-10. El receptor de IL-10, un receptor de citocinas de tipo II, consiste en subunidades alfa y beta, que también se conocen como R1 y R2, respectivamente. La activación del receptor requiere la unión tanto a alfa como a beta. Un monómero de IL-10 de la IL-10 dimérica se une a alfa y el otro monómero de IL-10 de la IL-10 se une a beta. La actividad de IL-10 puede evaluarse mediante ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de IL-10 de un agente de IL-10 se puede determinar utilizando el ensayo de inhibición de TNF-a, ensayo de proliferación de MC9, ensayo de secreción de IPN^y por linfocitos T CD8 o en modelos de tumores y análisis de tumores como se proporciona a continuación. Sin embargo, el experto en la materia entiende que los siguientes ensayos son representativos y no excluyentes de, ensayos para determinar la actividad de IL-10. El experto en la materia comprenderá que cualquier ensayo o metodología reconocidos en la técnica para medir la actividad de IL-10 puede usarse solo o en combinación para evaluar la actividad de los agentes de IL-10 descritos en el presente documento.

La actividad de IL-10 de un agente de IL-10 puede evaluarse sustancialmente según el siguiente ensayo de inhibición de TNFa. Brevemente, la estimulación con PMA de células U937 (línea celular humana de linfoblastos de pulmón disponible de Sigma-Aldrich (n.° 85011440); St. Louis, MO) provoca que las células secreten TNFa, y el tratamiento posterior de estas células secretoras de TNFa con un agente de prueba que tenga actividad de IL-10 dará como resultado una disminución en la secreción de TNFa de manera dependiente de la dosis. Se puede realizar un ensayo de inhibición de TNFa ilustrativo utilizando el siguiente protocolo. Después de cultivar células U937 en RMPI que contenía 10 % de FBS/FCS y antibióticos, sembrar en placa 1 x 105, 90 % de células U937 viables en placas de fondo plano de 96 pocillos (se puede utilizar cualquier placa de cultivo tisular tratada con plasma (por ejemplo, Nunc; Thermo Scientific, ^e E. UU.) por triplicado por condición. Sembrar en placa células para proporcionar las siguientes condiciones (todas al menos por triplicado; para 'medios solos', el número de pocillos se duplica porque la mitad se utilizará para determinar la viabilidad después de la incubación con PMA 10 nM): 5 ng/ml de LPS solo; 5 ng/ml de LPS 0,1 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 1 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 10 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 100 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 1000 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml LPS 0,1 ng/ml de PEG-rhIL-10; 5 ng/ml LPS 1 ng/ml de PEG-rhIL-10; 5 ng/ml LPS 10 ng/ml de PEG-rhIL-10; 5 ng/ml LPS 100 ng/ml de PEG-rhIL-10; y 5 ng/ml de LPS 1000 ng/ml de PEG-rhIL-10. Exponer cada pocillo a PMA 10 nM en 200 pl durante 24 horas, cultivar a 37 °C en una estufa de incubación con CO² al 5 %, después de lo cual ~90 % de las células deben ser adherentes. Los tres pocillos adicionales se resuspenden y las células se cuentan para evaluar la viabilidad (>90 % debe ser viable). Lavar suavemente pero a fondo 3 veces con medios que no contienen PMA nuevos, asegurándose de que las células todavía estén en los pocillos. Agregar 100 pl por pocillo de medio que contenga las concentraciones apropiadas (2X ya que el volumen se diluirá al 100 %) del agente de IL-10, incubar a 37 °C en una estufa de incubación con CO² al 5 % durante 30 minutos. Añadir 100 pl por pocillo de LPS madre de 10 ng/ml para lograr una concentración final de 5 ng/ml de LPS en cada pocillo e incubar a 37 °C en una estufa de incubación con CO² al 5 % durante 18-24 horas. Retirar el sobrenadante y realizar ELISA para TNFa según las instrucciones del fabricante. Ejecutar cada sobrenadante acondicionado por duplicado en ELISA.

La actividad de IL-10 de un agente de IL-10 puede evaluarse sustancialmente según el siguiente ensayo de proliferación de células MC/9. Brevemente, la administración de compuestos que tienen actividad de IL-10 a células MC/9 provoca una mayor proliferación celular de manera dependiente de la dosis. MC/9 es una línea celular murina con características de mastocitos disponible de Cell Signaling Technology; Danvers, MA. Thompson-Snipes, L. et al. ((1991) J. Exp. Med. 173:507-10) describen un protocolo de ensayo convencional en el que las células MC/9 se complementan con IL3 IL10 e IL3 IL4 IL10. Los expertos en la materia podrán modificar el protocolo de ensayo convencional descrito en Thompson-Snipes, L. et al, de modo que las células solo se complementen con IL-10.

La actividad de IL-10 de un agente de IL-10 puede evaluarse sustancialmente según el siguiente ensayo de secreción de IPNy por linfocitos T CD8. Brevemente, los linfocitos T CD8 primarios humanos activados secretan IPNy cuando se tratan con compuestos que tienen actividad de IL-10 y después con un anticuerpo anti-CD3. El siguiente protocolo proporciona un ensayo de secreción de IPNy por linfocitos T CD8 ilustrativo. Las células mononucleares primarias de sangre periférica humana (PBMC, por sus siglas en inglés) se pueden aislar según cualquier protocolo convencional (véase, por ejemplo, Fuss et al. (2009) Current Protocols in Immunology, Unidad 7.1, John Wiley, Inc., NY). Se pueden cultivar 2,5 ml de PBMC (a una densidad celular de 10 millones de células/ml) por pocilio con RPMI completo, que contiene RPMI (Life Technologies; Carlsbad, CA), HEPES 10 mM (Life Technologies; Carlsbad, CA), suero fetal de ternera al 10 % (Hyclone Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA) y cóctel de penicilina/estreptomicina (Life Technologies; Carlsbad, CA), en cualquier placa de 6 pocillos tratada con cultivo tisular convencional (BD; Franklin Lakes, NJ). A continuación, se añade el agente de IL-10 a los pocillos a una concentración final de 100 ng/ml; también se puede añadir una concentración final de 10 pg/ml de anticuerpos que bloquean la función de los receptores inhibidores/de puntos de control en combinación con el agente de IL-10. Las células se pueden incubar en una estufa de incubación humidificada a 37 °C con CO² al 5 % durante 6-7 días. Después de la incubación, los linfocitos T CD8 se aíslan usando la tecnología de separación de células MACS de Miltenyi Biotec en conformidad sustancial con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec; Auburn, CA). Los linfocitos T CD8 aislados pueden cultivarse a continuación con RPMI completo que contiene 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD3 (Affymetrix eBioscience; San Diego, CA) en cualquier placa de cultivo tisular convencional durante 4 horas. Después de la incubación de 4 horas, los medios se recogen y analizan para determinar IPNy utilizando un kit ELISA comercial (por ejemplo, Affymetrix eBioscience; San Diego, CA) en conformidad sustancial con las instrucciones del fabricante.

Pueden usarse modelos tumorales para evaluar la actividad de un agente de IL-10 en diversos tumores. Los modelos tumorales y los análisis tumorales descritos a continuación son representativos de los que se pueden utilizar. Las células tumorales de ratón singénicas se inyectan por vía subcutánea o intradérmica a 104, 105 o 106 células por inoculación tumoral. Se pueden utilizar modelos de Ep2 de carcinoma mamario, CT26 de carcinoma de colon, PDV6 de carcinoma escamoso de piel y 4T1 de carcinoma de mama (véase, por ejemplo, Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465). Se pueden usar ratones Balb/C inmunocompetentes o Balb/C deficientes en linfocitos B. Los agentes de IL-10 basados en especies murinas de IL-10 pueden administrarse a ratones inmunocompetentes, los agentes de IL-10 basados en IL-10 humana u otras especies no murinas se administran normalmente en ratones con deficiencia de linfocitos B. El crecimiento tumoral se monitoriza normalmente dos veces por semana usando calibradores electrónicos. El volumen tumoral se puede calcular usando la fórmula (ancho2 x longitud/2) donde la longitud es la dimensión más larga. Se permite que los tumores alcancen un tamaño de 90-250 mm3 antes de la administración del agente de IL-10 a analizar. El agente de IL-10 o control de tampón se administra en un lugar distante del implante del tumor. El crecimiento tumoral después de la administración del agente de IL-10 a analizar se monitoriza normalmente dos veces por semana usando calibradores electrónicos como se indica anteriormente y los efectos sobre el volumen tumoral en respuesta a la administración del agente de IL-10 a analizar se evalúan a lo largo del tiempo. Los tejidos tumorales y los órganos linfáticos se recogen en varios puntos finales para medir la expresión de ARNm para una serie de marcadores inflamatorios y para realizar inmunohistoquímica para varios marcadores de células inflamatorias. Los tejidos se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C.

En una realización, en donde el polipéptido de IL-10 es un polipéptido de IL-10 humano. Como se usa en el presente documento, la expresión "IL-10 humana" o "hIL10" se refiere a un agente de IL10 compuesto por dos polipéptidos de iIL-10 humana. En una realización, un polipéptido de IL-10 humana es un polipéptido de 160 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos (desde el extremo amino a carboxilo):

SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE

SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT

LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI

EAYMTMKIRN (SEQ ID NO 25)

En una realización, un polipéptido de IL-10 humana es un polipéptido de 161 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos (desde el extremo amino a carboxilo):

MSPGQGTQSE NSCTHFPGNL PNMLRDLRDA FSRVKTFFQM KDQLDNLLLK

ESLLEDFKGY LGCQALSEMI QFYLEEVMPQ AENQDPDIKA HVNSLGENLK

TLRLRLRRCH RFLPCENKSK AVEQVKNAFN KLQEKGIYKA MSEFDIFINY

IEAYMTMKIR N (SEQ ID NO 26)

En una realización, un polipéptido de IL-10 humana es un polipéptido de 161 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos (desde el extremo amino a carboxilo):

N-formil-MSPGQGTQSE NSCTHFPGNL PNMLRDLRDA FSRVKTFFQM KDQLDNLLLK ESLLEDFKGY LGCQALSEMI QFYLEEVMPQ AENQDPDIKA HVNSLGENLK TLRLRLRRCH RFLPCENKSK AVEQVKNAFN KLQEKGIYKA MSEFDIFINY IEA YMTMKIR N (SEQ ID NO: 27)

Cabe señalar que cualquier referencia a "humano/a" en relación con los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación no pretende ser limitante con respecto a la forma en que se obtiene el polipéptido o ácido nucleico o la fuente, sino que se refiere únicamente a la secuencia, ya que puede corresponder a una secuencia de un polipéptido o molécula de ácido nucleico humano natural.

Los polipéptidos de IL-10 pueden aislarse de una fuente natural (po rejemplo, un entorno distinto del entorno natural) y también pueden prepararse de forma recombinante (por ejemplo, en una célula hospedadora modificada genéticamente, tal como una bacteria, levadura, Pichia, células de insecto, y similares), donde la célula hospedadora genéticamente modificada se modifica con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Los polipéptidos de IL-10 también se pueden producir sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis química sin células).

Cuando se sintetiza químicamente un polipéptido de IL-10, la síntesis puede realizarse en fase líquida o en fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés) permite la incorporación de aminoácidos no naturales y/o la modificación de la cadena principal de péptidos/proteínas. Diversas formas de SPPS, tales como 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y t-butiloxicarbonilo (Boc), están disponibles para sintetizar polipéptidos de la presente divulgación. Los detalles de las síntesis químicas se conocen en la técnica (por ejemplo, Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; y Camarero J.A. et al., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8).

La síntesis de péptidos en fase sólida se puede realizar como se describe en el presente documento a continuación. Las funciones alfa (Na) y cualquier cadena lateral reactiva están protegidas con grupos lábiles a ácidos o lábiles a bases. Los grupos protectores son estables en las condiciones de unión de los enlaces amida, pero se pueden escindir fácilmente sin alterar la cadena peptídica que se ha formado. Los grupos protectores adecuados para la función aamino incluyen, pero sin limitación, los siguientes: Boc, benciloxicarbonilo (Z), O-clorbenciloxicarbonilo, bifenilisopropiloxicarbonilo, terc-amiloxicarbonilo (Amoc), a, a-dimetil-3,5-dimetoxi-benciloxicarbonilo, o-nitrosulfenilo, 2-ciano-t-butoxi-carbonilo, Fmoc, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde) y similares.

Los grupos protectores de cadena lateral adecuados incluyen, pero sin limitación: acetilo, alilo (All), aliloxicarbonilo (Alloc), bencilo (Bzl), benciloxicarbonilo (Z), t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloximetilo (Bom), o-bromobenciloxicarbonilo, t-butilo (tBu), t-butildimetilsililo, 2-clorobencilo, 2-clorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo, ciclohexilo, ciclopentilo, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde), isopropilo, 4-metoxi-2,3-6-trimetilbencilsulfonilo (Mtr), 2,3,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), pivalilo, tetrahidropiran-2-ilo, tosilo (Tos), 2,4,6-trimetoxibencilo, trimetilsililo y tritilo (Trt).

En la síntesis en fase sólida, el aminoácido carboxiterminal se acopla a un material de soporte adecuado. Los materiales de soporte adecuados son aquellos que son inertes frente a los reactivos y las condiciones de reacción para las reacciones de condensación y escisión por etapas del proceso de síntesis y que no se disuelven en los medios de reacción que se van a utilizar. Los ejemplos de materiales de soporte comercialmente disponibles incluyen copolímeros de estireno/divinilbenceno que se han modificado con grupos reactivos y/o polietilenglicol; copolímeros de estireno/divinilbenceno clorometilados; copolímeros de estireno/divinilbenceno hidroximetilados o aminometilados; y similares. Cuando se desea la preparación del ácido peptídico, se puede utilizar poliestireno (1 %)-divinilbenceno o TentaGel® derivatizado con 4-benciloxibencil-alcohol (anclaje Wang) o cloruro de 2-clorotritilo. En el caso del péptido con amida, se puede utilizar poliestireno (1 %) divinilbenceno o TentaGel® derivatizado con el grupo ácido 5-(4'-aminometil)-3',5'-dimetoxifenoxi)valérico (anclaje PAL) o p-(2,4-dimetoxifenil-aminometil)-fenoxi S (anclaje de amida Rink).

El enlace con el soporte polimérico puede lograrse haciendo reaccionar el aminoácido carboxiterminal protegido con Fmoc con el material de soporte mediante la adición de un reactivo de activación en etanol, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano, tetrahidrofurano, N-metilpirrolidona o disolventes similares a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas (por ejemplo, entre 40 °C y 60 °C) y con tiempos de reacción de, por ejemplo, de 2 a 72 horas.

El acoplamiento del aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido Fmoc) al anclaje PAL, Wang o Rink puede realizarse, por ejemplo, con la ayuda de reactivos de acoplamiento tales como N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DlC) u otras carbodiimidas, tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTu ) u otras sales de uronio, O-acil-ureas, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-tris-pirrolidinofosfonio (PyBOP) u otras sales de fosfonio, N-hidroxisuccinimidas, otras N-hidroxiimidas u oximas en presencia o ausencia de 1-hidroxibenzotriazol o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, por ejemplo, con la ayuda de TBTU con adición de HOBt, con o sin la adición de una base tal como, por ejemplo, diisopropiletilamina (DIEA), trietilamina o N-metilmorfolina, por ejemplo, diisopropiletilamina con tiempos de reacción de 2 a 72 horas (por ejemplo, 3 horas en un exceso de 1,5 a 3 veces del aminoácido y los reactivos de acoplamiento, por ejemplo, en un exceso de 2 veces y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, 25 °C en un disolvente como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o diclorometano, por ejemplo, dimetilformamida).

En lugar de los reactivos de acoplamiento, también es posible utilizar los ésteres activos (por ejemplo, pentafluorofenilo, p-nitrofenilo o similares), el anhídrido simétrico del Na-Fmoc-aminoácido, su cloruro de ácido o fluoruro de ácido, en las condiciones descritas anteriormente.

El aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido con Fmoc) puede acoplarse a la resina de 2-clorotritilo en diclorometano con la adición de DIEA y con tiempos de reacción de 10 a 120 minutos, por ejemplo, de 20 minutos, pero no se limita al uso de este disolvente y esta base.

El acoplamiento sucesivo de los aminoácidos protegidos puede realizarse según métodos convencionales en síntesis de péptidos, normalmente en un sintetizador de péptidos automatizado. Después de la escisión del grupo protector Na-Fmoc del aminoácido acoplado en la fase sólida por tratamiento con, por ejemplo, piperidina (10 % a 5o %) en dimetilformamida durante 5 a 20 minutos, por ejemplo, 2 x 2 minutos con piperidina al 50 % en DMF y 1 x 15 minutos con piperidina al 20 % en DMF, el siguiente aminoácido protegido en un exceso de 3 a 10 veces, por ejemplo, en un exceso de 10 veces, se acopla al aminoácido anterior en un disolvente inerte, no acuoso, polar tal como diclorometano, DMF o mezclas de los dos y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, a 25 °C. Los reactivos mencionados anteriormente para acoplar el primer aminoácido Na-Fmoc al anclaje PAL, Wang o Rink son adecuados como reactivos de acoplamiento. También se pueden usar como alternativa ésteres activos del aminoácido protegido, o cloruros o fluoruros o anhídridos simétricos de los mismos.

Al final de la síntesis en fase sólida, el péptido se escinde del material de soporte al mismo tiempo que se escinden los grupos protectores de la cadena lateral. La escisión se puede llevar a cabo con ácido trifluoroacético o con otro medio fuertemente ácido con la adición de 5 %-20 % V/V de depuradores tales como dimetilsulfuro, etilmetilsulfuro, tioanisol, tiocresol, m-cresol, etanoditiol anisólico, fenol o agua, por ejemplo, 15 % v/v de dimetilsulfuro/etanoditiol/mcresol 1:1:1, dentro de 0,5 a 3 horas, por ejemplo, 2 horas. Los péptidos con cadenas laterales totalmente protegidas se obtienen escindiendo el anclaje de 2-clorotritilo con ácido acético glacial/trifluoroetanol/diclorometano 2:2:6. El péptido protegido se puede purificar por cromatografía en gel de sílice. Si el péptido se une a la fase sólida a través del anclaje Wang y si se pretende obtener un péptido con una alquilamidación carboxiterminal, la escisión puede realizarse por aminolisis con una alquilamina o fluoroalquilamina. La aminolisis se realiza a temperaturas entre aproximadamente -10 °C y 50 °C (por ejemplo, aproximadamente 25 °C), y a tiempos de reacción entre aproximadamente 12 y 24 horas (por ejemplo, aproximadamente 18 horas). Además, el péptido se puede escindir del soporte por reesterificación, por ejemplo, con metanol.

La solución ácida que se obtiene se puede mezclar con una cantidad de 3 a 20 veces mayor de éter o n-hexano fríos, por ejemplo, un exceso de 10 veces de éter dietílico, para precipitar el péptido y, por lo tanto, separar los depuradores y los grupos protectores escindidos que quedan en el éter. Se realizar una purificación adicional volviendo a precipitar el péptido varias veces en ácido acético glacial. El precipitado obtenido se puede recoger en agua o terc-butanol o mezclas de los dos disolventes, por ejemplo, una mezcla 1:1 de terc-butanol/agua, y liofilizar.

El péptido obtenido se puede purificar por varios métodos cromatográficos, incluyendo el intercambio iónico sobre una resina débilmente básica en forma de acetato; cromatografía de adsorción hidrófoba en copolímeros de poliestireno/divinilbenceno no derivatizados (por ejemplo, Amberlite® XAD); cromatografía de adsorción sobre gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, sobre carboximetilcelulosa; cromatografía de distribución, por ejemplo, en Sephadex® G-25; cromatografía de distribución en contracorriente; o cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés), por ejemplo, HPLC de fase inversa en fases de octilo u octadecilsililsílice (ODS, por sus siglas en inglés).

Los métodos que describen la preparación de IL-10 humana y de ratón se pueden encontrar en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.231.012, que enseña métodos para la producción de proteínas que tienen actividad de IL-10, incluyendo técnicas recombinantes y otras técnicas sintéticas. IL-10 puede ser de origen viral, y la clonación y expresión de una IL-10 viral del virus Epstein Barr (proteína BCRF1) se describe en Moore et al., (1990) Science 248:1230. La IL-10 se puede obtener de varias maneras utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tal como las descritas en el presente documento. La IL-10 humana recombinante también está disponible comercialmente, por ejemplo, de PeproTech, Inc., Rocky Hill, N.J.

La presente divulgación contempla las moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes de IL-10, incluidas sus isoformas naturales y no naturales, variantes alélicas y variantes de corte y empalme. La presente divulgación abarca también secuencias de ácidos nucleicos que varían en una o más bases con respecto a una secuencia de ADN natural pero que aún se traducen en una secuencia de aminoácidos que corresponde a un polipéptido de IL-10 debido a la degeneración del código genético.

Cuando se produce un polipéptido usando técnicas recombinantes, el polipéptido se puede producir como una proteína intracelular o como una proteína secretada, usando cualquier construcción adecuada y cualquier célula hospedadora adecuada, que puede ser una célula procariota o eucariota, como una célula hospedadora bacteriana (por ejemplo, E. coli) o una de levadura, respectivamente. Otros ejemplos de células eucariotas que se pueden usar como células hospedadoras incluyen células de insectos, células de mamífero y/o células vegetales. Cuando se utilizan células hospedadoras de mamífero, pueden incluir células humanas (por ejemplo, células HeLa, 293, H9 y Jurkat); células de ratón (por ejemplo, células NIH3T3, L y C127); células de primates (por ejemplo, Cos 1, Cos 7 y CV1); y células de hámster (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO).

Se puede emplear una variedad de sistemas hospedador-vector adecuados para la expresión de un polipéptido según los procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press, Nueva York; y Ausubel et al. 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley and Sons. Los métodos para la introducción de material genético en las células hospedadoras incluyen, por ejemplo, transformación, electroporación, conjugación, métodos con fosfato de calcio y similares. El método de transferencia puede seleccionarse para proporcionar expresión estable del ácido nucleico que codifica el polipéptido introducido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido se puede proporcionar como un elemento episómico heredable (por ejemplo, un plásmido) o se puede integrar genómicamente. Están disponibles comercialmente una variedad de vectores apropiados para su uso en la producción de un polipéptido de interés.

Los vectores pueden proporcionar el mantenimiento extracromosómico en una célula hospedadora o pueden proporcionar la integración en el genoma de la célula hospedadora. El vector de expresión proporciona secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción y puede proporcionar una expresión inducible o constitutiva cuando la región codificante está unida operativamente al control de la transcripción de la región de inicio de la transcripción y a una región de terminación de la transcripción y la traducción. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluir, pero sin limitación, secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden ser un promotor constitutivo potente (p. ej., T7).

Generalmente, las construcciones de expresión tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia promotora para posibilitar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de interés. Un marcador seleccionable operativo en el hospedador de expresión puede estar presente para facilitar la selección de células que contienen el vector. Por otra parte, la construcción de expresión puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener uno o dos sistemas de replicación, lo que permite que se mantenga en organismos, por ejemplo, en células de mamífero o de insecto para expresión y en un hospedador procariota para clonación y amplificación. Además, la construcción de expresión puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes de selección se conocen bien en la técnica y variarán según la célula hospedadora que se vaya a utilizar.

El aislamiento y la purificación de una proteína se pueden lograr según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína puede aislarse de un lisado de células modificadas genéticamente para expresar la proteína de forma constitutiva y/o por inducción, o de una mezcla de reacción sintética mediante purificación por inmunoafinidad, que generalmente implica poner en contacto la muestra con un anticuerpo antiproteínico, lavar para eliminar el material unido de manera inespecífica y eluir la proteína unida de manera específica. La proteína aislada puede purificarse adicionalmente mediante diálisis y otros métodos empleados normalmente en la purificación de proteínas. En una realización, la proteína se puede aislar usando métodos de cromatografía de quelatos metálicos. Las proteínas pueden contener modificaciones para facilitar el aislamiento.

Los polipéptidos se pueden preparar en forma sustancialmente pura o aislada (por ejemplo, exentos de otros polipéptidos). Los polipéptidos pueden estar presentes en una composición que está enriquecida en el polipéptido con respecto a otros componentes que pueden estar presentes (por ejemplo, otros polipéptidos u otros componentes de la célula hospedadora). Por ejemplo, el polipéptido purificado se puede proporcionar de tal manera que el polipéptido esté presente en una composición que esté sustancialmente exenta de otras proteínas expresadas, por ejemplo, menos de aproximadamente un 90 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 1 %.

Se puede generar un polipéptido de IL-10 usando técnicas recombinantes para manipular diferentes ácidos nucleicos relacionados con IL-10 conocidos en la técnica para proporcionar construcciones capaces de codificar el polipéptido de IL-10. Se apreciará que, cuando se proporciona una secuencia de aminoácidos particular, el experto en la materia reconocerá una variedad de moléculas de ácido nucleico diferentes que codifican dicha secuencia de aminoácidos en vista de sus antecedentes y experiencia en, por ejemplo, biología molecular.

La expresión "agentes de IL-10 modificados" son agentes de IL-10 que se han modificado mediante una o más modificaciones tales como pegilación, glicosilación (ligada a N y O); polisialilación; moléculas de fusión de albúmina que comprenden albúmina sérica (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica de macaco cangrejero, o albúmina de suero bovino (BSA)); unión de albúmina mediante, por ejemplo, una cadena de ácidos grasos conjugados (acilación); y proteínas de fusión Fc. Los agentes de IL-10 modificados se pueden preparar para potenciar una o más propiedades, por ejemplo, inmunogenicidad moduladora; métodos para aumentar la solubilidad en agua, la biodisponibilidad, la semivida en suero y/o la semivida terapéutica; y/o modular la actividad biológica. Determinadas modificaciones también pueden ser útiles para, por ejemplo, aumentar anticuerpos para su uso en ensayos de detección (por ejemplo, etiquetas de epítopos) y para facilitar la purificación de proteínas.

En una realización, el agente de IL-10 modificado es un agente de PEG-IL10. La expresión "agente de PEG-IL-10" se refiere a un agente de IL-10 modificado que comprende al menos una molécula de polietilenglicol (PEG) fijada covalentemente (conjugada) a al menos un resto de aminoácido de un polipéptido de IL-10. Las expresiones "agente de IL-10 monopegilada" y "agente de mono-PEG-IL-10" se refieren a un agente de IL-10 con una molécula de polietilenglicol fijada covalentemente a un solo resto de aminoácido en un polipéptido de IL-10 del dímero de IL-10, generalmente a través de un enlazador. Como se usa en el presente documento, las expresiones "IL-10 dipegilada" y "di-PEG-IL-10" indican que al menos una molécula de polietilenglicol está fijada a un solo resto en el polipéptido de IL-10 del dímero de IL-10, generalmente a través de un enlazador.

La pegilación de los agentes de IL-10 da como resultado la mejora de determinadas propiedades, incluidos los parámetros farmacocinéticos (por ejemplo, la semivida en suero), la potenciación de la actividad, la mejora de la estabilidad física y térmica, la protección contra la susceptibilidad a la degradación enzimática, el aumento de la solubilidad, una semivida en circulación in vivo más extensa y la disminución del aclaramiento, la reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad y la reducción de la toxicidad. Además de los efectos beneficiosos de la pegilación sobre los parámetros farmacocinéticos, la pegilación en sí misma puede potenciar la actividad. Por ejemplo, se ha demostrado que la PEG-IL-10 es más eficaz contra determinados tipos de cáncer que la IL-10 sin pegilar (véase, por ejemplo, el documento EP. 206636A2).

En determinadas realizaciones, el agente de PEG-IL-10 utilizado en la presente divulgación es un agente de mono-PEG-IL-10 en el que de una a nueve moléculas de PEG se fijan covalentemente a través de un enlazador al grupo aamino del resto de aminoácido en el extremo N de un polipéptido de IL-10 del dímero de IL-10. La monopegilación de un polipéptido de IL-10 generalmente da como resultado una mezcla no homogénea de polipéptidos de IL-10 sin pegilar, monopegilados y dipegilados debido al reordenamiento de subunidades. Realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden la administración de una mezcla de agentes de IL-10 mono y dipegilada producidos por los métodos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, el agente de IL-10 se proporciona como una mezcla de especies de IL-10 monopegiladas y dipegiladas, teniendo la mezcla aproximadamente un 50 % de mono-PEG-IL-10 y aproximadamente un 50 % de di-PEG-IL-10, teniendo como alternativa aproximadamente un 40 % de mono-PEG-IL-10 y aproximadamente un 60 % de di-PEG-IL-10, teniendo como alternativa aproximadamente un 60 % de mono-PEG-IL-10 y aproximadamente un 40 % de di-PEG-IL-10, teniendo como alternativa aproximadamente un 55 % de una mono-PEG-IL-10 y aproximadamente un 45 % de una di-PEG-IL-10, o teniendo como alternativa aproximadamente un 45 % de una mono-PEG-IL10 y aproximadamente un 55 % de una di-PEG -IL-10.

La actividad biológica de los agentes de PEG-IL-10 puede analizarse mediante la evaluación de los niveles de citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-a o IFN-y) en el suero de sujetos expuestos a un antígeno bacteriano (lipopolisacárido (LPS)) y tratados con PEG-IL-10, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.052.686.

Aunque el método o sitio de unión de PEG a IL-10 no es crítico, en determinadas realizaciones, la pegilación no altera, o solo altera mínimamente, la actividad del agente de IL-10. En determinadas realizaciones, el aumento de la semivida es mayor que cualquier disminución de la actividad biológica.

Los PEG adecuados para la conjugación con una secuencia polipeptídica de IL-10 son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R(O-CH²-CH²)nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector como un grupo alquilo o alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos. El PEG conjugado con la secuencia polipeptídica puede ser lineal o ramificado.

La presente divulgación contempla derivados de PEG ramificados, "PEG en estrella" y PEG de grupos múltiples.

El peso molecular del PEG utilizado en la presente divulgación no está restringido a ningún intervalo en particular. El componente PEG del agente de PEG-IL-10 puede tener una masa molecular superior a aproximadamente 5 kDa, superior a aproximadamente 10 kDa, superior a aproximadamente 15 kDa, superior a aproximadamente 20 kDa, superior a aproximadamente 30 kDa, superior a aproximadamente 40 kDa o superior a aproximadamente 50kDa. En algunas realizaciones, la masa molecular es de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 15 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 15 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 25 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 30 kDa.

La presente divulgación también contempla composiciones de conjugados en donde los PEG tienen diferentes valores de n y, por lo tanto, los diversos PEG diferentes están presentes en relaciones específicas. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden una mezcla de conjugados donde n=1, 2, 3 y 4. En algunas composiciones, el porcentaje de conjugados donde n=1 es un 18-25 %, el porcentaje de conjugados donde n=2 es un 50-66 %, el porcentaje de conjugados donde n=3 es un 12-16 %, y el porcentaje de conjugados donde n=4 es hasta un 5 %. Dichas composiciones se pueden producir mediante condiciones de reacción y métodos de purificación conocidos en la técnica. La cromatografía se puede usar para resolver fracciones de conjugados, y luego se identifica cuál contiene el conjugado que tiene, por ejemplo, el número deseado de PEG fijados, de purificados exentos de secuencias de proteínas sin modificar y de conjugados que tienen otros números de PEG fijados.

Los PEG adecuados para la conjugación con una secuencia polipeptídica son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R(O-CH²-CH²)nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector como un grupo alquilo o alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos.

Dos monometoxi PEG activados (mPEG) de primera generación ampliamente utilizados son succinimidil carbonato de PEG (SC-PEG; véase, por ejemplo, Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114; y Miron y Wilcheck (1993) Bio-conjug. Chem. 4:568-569) y benzotriazol carbonato de PEG (BTC-PEG; véase, por ejemplo, Dolence, et al. patente de los Estados Unidos n.° 5.650.234), que reaccionan preferentemente con restos de lisina para formar un enlace carbamato, pero también se sabe que reaccionan con restos de histidina y tirosina. Se ha demostrado que el enlace a los restos de histidina en ciertas moléculas (por ejemplo, IFNa) es un enlace imidazolcarbamato hidrolíticamente inestable (véase, por ejemplo, Lee y McNemar, patente de Estados Unidos N.° 5.985.263). La tecnología de pegilación de segunda generación se ha diseñado para evitar estos enlaces inestables, así como la falta de selectividad en la reactividad de los restos. El uso de un enlazador PEG-aldehído se dirige a un solo sitio en el extremo N de un polipéptido mediante aminación reductora.

El PEG conjugado con la secuencia polipeptídica puede ser lineal o ramificado. La presente divulgación contempla derivados de PEG ramificados, "PEG en estrella" y PEG de grupos múltiples. Los ^p E^g de realizaciones específicas útiles en la práctica de la presente invención incluyen un PEG-aldehído lineal de 10 kDa (por ejemplo, Sunbright® ME-100AL, NOF America Corporation, One North Broadway, White Plains, NY 10601 EE:u U.), éster de PEG-NHS lineal de 10 kDa (por ejemplo, Sunbright® ME-100CS, Sunbright® ME-100AS, Sunbright® ME-100GS, Sunbright® ME-100HS, NOF), un PEG-aldehído lineal de 20 kDa (por ejemplo, Sunbright® ME-200AL, NOF, un éster de PEG-NHS lineal de 20 kDa (por ejemplo, Sunbright® ME-200CS, Sunbright® ME-200AS, Sunbright® ME-200GS, Sunbright® ME-200HS, NOF), un PEG-aldehído ramificado de dos grupos de 20 kDa, el PEG-aldehído de 20 kDa que comprende dos moléculas de PEG lineal de 10 kDa (por ejemplo, Sunbright® GL2-200AL3, NOF), un éster de PEG-NHS ramificado de dos grupos de 20 kDa, el éster de PEG-NHS de 20 kDa que comprende dos moléculas de PEG lineal de 10 kDa (por ejemplo, Sunbright® GL2-200TS, Sunbright® GL200GS2, NOF), un PEG-aldehído ramificado de 2 grupos de 40 kDa, el PEG-aldehído de 40 kDa que comprende dos moléculas de PEG lineal de 20 kDa (p. ej. Sunbright® GL2-400AL3, un éster de PEG-NHS ramificado de dos grupos de 40 kDa, el éster de PEG-NHS de 40 kDa que comprende dos moléculas de PEG lineal de 20 kDa (p. ej. Sunbright® GL2-400AL3, Sunbright® GL2-400GS2, NOF), un PEG-aldehído lineal de 30 kDa (por ejemplo, Sunbright® ME-300AL) y un éster de PEG-NHS lineal de 30 kDa.

La pegilación se produce con mayor frecuencia en el grupo a-amino en el extremo N del polipéptido, en el grupo épsilon amino en la cadena lateral de los restos de lisina y en el grupo imidazol en la cadena lateral de los restos de histidina. Debido a que la mayoría de los polipéptidos recombinantes poseen un solo grupo alfa y varios grupos amino épsilon e imidazol, se pueden generar numerosos isómeros posicionales dependiendo de la química del enlazador. Las estrategias de pegilación generales conocidas en la técnica se pueden aplicar en el presente documento.

El PEG puede estar unido a un polipéptido de IL-10 de la presente divulgación a través de un grupo reactivo terminal (un "espaciador") que media un enlace entre los grupos amino o carboxilo libres de una o más de las secuencias polipeptídicas y el polietilenglicol. El PEG que tiene el espaciador que se puede unir al grupo amino libre incluye N-hidroxisuccinilimida polietilenglicol, que se puede preparar activando el éster de ácido succínico de polietilenglicol con N-hidroxisuccinilimida. Otro polietilenglicol activado que puede unirse a un grupo amino libre es el 2,4-bis(O-metoxipolietilenglicol)-6-cloro-s-triazina, que se puede preparar haciendo reaccionar polietilenglicol monometil éter con cloruro cianúrico. El polietilenglicol activado que se une al grupo carboxilo libre incluye polioxietilendiamina.

La conjugación de una o más de las secuencias polipeptídicas de IL-10 de la presente divulgación con PEG que tiene un espaciador puede realizarse mediante varios métodos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación se puede realizar en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura desde 4 °C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando una relación molar de reactivo a proteína de 4:1 a 30:1. Las condiciones de reacción se pueden seleccionar para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado deseado de sustitución. En general, una temperatura baja, un pH bajo (por ejemplo, pH = 5) y un tiempo de reacción corto tienden a disminuir la cantidad de PEG fijados, mientras que la temperatura alta, un pH de neutro a alto (por ejemplo, pH > 7) y un tiempo de reacción más largo tienden a aumentar el número de PEG fijados. Se pueden usar diversos medios conocidos en la técnica para finalizar la reacción. En algunas realizaciones, la reacción se finaliza acidificando la mezcla de reacción y congelando a, por ejemplo, -20 °C. La pegilación de varias moléculas se analiza en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.252.714; 5.643.575; 5.919.455; 5.932.462; y 5.985.263. PEG-IL-10 se describe en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.052.686. Las condiciones de reacción específicas contempladas para su uso en el presente documento se exponen en la sección experimental.

La pegilación se produce con mayor frecuencia en el grupo alfa amino en el extremo N del polipéptido, en el grupo épsilon amino en la cadena lateral de los restos de lisina y en el grupo imidazol en la cadena lateral de los restos de histidina. Debido a que la mayoría de los polipéptidos recombinantes poseen un solo grupo alfa y varios grupos amino épsilon e imidazol, se pueden generar numerosos isómeros posicionales dependiendo de la química del enlazador. Las estrategias de pegilación generales conocidas en la técnica se pueden aplicar en el presente documento.

La conjugación de una o más de las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación con PEG que tiene un espaciador puede realizarse mediante varios métodos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación se puede realizar en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura desde 4 °C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando una relación molar de reactivo a proteína de 4:1 a 30:1. Las condiciones de reacción se pueden seleccionar para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado deseado de sustitución. En general, una temperatura baja, un pH bajo (por ejemplo, pH = 5) y un tiempo de reacción corto tienden a disminuir la cantidad de PEG fijados, mientras que la temperatura alta, un pH de neutro a alto (por ejemplo, pH > 7) y un tiempo de reacción más largo tienden a aumentar el número de PEG fijados. Se pueden usar diversos medios conocidos en la técnica para finalizar la reacción. En algunas realizaciones, la reacción se finaliza acidificando la mezcla de reacción y congelando a, por ejemplo, -20 °C. La pegilación de varias moléculas se analiza en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.252.714; 5.643.575; 5.919.455; 5.932.462; y 5.985.263. PEG-IL-10 se describe en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.052.686.

Aunque la presente divulgación contempla la síntesis de IL-10 pegilada por cualquier medio conocido por el experto en la materia, lo siguiente proporciona varios esquemas sintéticos alternativos para producir mono-PEG-IL-10 y la mezcla de mono-/di-PEG-IL-10 pretende ser solamente ilustrativa. Si bien tanto la mono-PEG-IL-10 como una mezcla de mono-/di-PEG-IL-10 tienen muchas propiedades comparables, una mezcla de mono- y di-PEG-IL-10 pegilados selectivamente mejora el rendimiento del producto pegilado final (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 7.052.686 y la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2011/0250163). Además de aprovechar sus propias habilidades en la producción y el uso de PEG (y otras tecnologías de administración de fármacos) adecuados en la práctica de la presente divulgación, el experto también está familiarizado con muchos proveedores comerciales de tecnologías relacionadas con PEG (y otras tecnologías de suministro de fármacos). A modo de ejemplo, NOF America Corp (Irvine, CA) suministra PEG lineales monofuncionales, PEG bifuncionales, PEG multibrazo, PEG ramificados, PEG heterofuncionales, PEG bifurcados y PEG que se pueden liberar; y Parchem (New Rochelle, NY) es un distribuidor mundial de productos de PEG y otras materias primas especiales.

Esquema de síntesis de PEG-IL-10 ilustrativo n.° 1. La IL-10 se dializa frente a fosfato sódico 10 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM. La IL-10 dializada se diluye 3,2 veces hasta una concentración de aproximadamente 0,5 a 12 mg/ml usando el tampón de diálisis. Antes de la adición del enlazador, SC-PEG-12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, Ill.), se añade un volumen de tetraborato de sodio 100 mM a pH 9,1 a 9 volúmenes de IL-10 diluida para elevar el pH de la solución de IL-10 a 8,6. El enlazador SC-PEG-12K se disuelve en el tampón de diálisis y se añade el volumen adecuado de la solución del enlazador (1,8 a 3,6 moles de enlazador por mol de IL-10) a la solución de IL-10 diluida para iniciar la reacción de pegilación. La reacción se realiza a 5 °C para controlar la velocidad de la reacción y la solución de reacción se agita suavemente. Cuando el rendimiento de mono-PEG-IL-10, según lo determinado por HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC), es cercano al 40 %, la reacción se detiene añadiendo solución de glicina 1 M hasta una concentración final de 30 mM. El pH de la solución de reacción se ajusta lentamente a 7,0 usando una solución de HCl, y la reacción se filtra con un filtro de 0,2 micras y se almacena a -80 °C.

Esquema de síntesis de PEG-IL-10 ilustrativo n.° 2. El mono-PEG-IL-10 se prepara utilizando metoxi-PEG-aldehído (PALD-PEG) como enlazador (Inhale Therapeutic Systems Inc., Huntsville, AL; también disponible de NOF America Corp (Irvine, CA)). PALD-PEG puede tener pesos moleculares de 5 KDa, 12 KDa o 20 KDa. IL-10 se dializa y se diluye como se describe anteriormente, con la excepción de que el pH del medio de reacción está entre 6,3 y 7,5. El enlazador PALD-PEG activado se añade al tampón de reacción en una relación molar de 1:1. Se añade cianoborohidruro acuoso a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 0,5 a 0,75 mM. La reacción se realiza a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 15-20 horas con agitación suave. La reacción se desactiva con glicina 1M. Los rendimientos se analizan mediante SE-HPLC. El mono-PEG-IL-10 se separa de IL-10 sin reaccionar, del enlazador de PEG y de di-PEG-IL-10 por cromatografía de filtración en gel y se caracteriza por RP-HPLC y bioensayo (por ejemplo, estimulación de células o líneas celulares sensibles a IL-10).

Esquema de síntesis de PEG-IL-10 ilustrativo n.° 3. IL-10 (por ejemplo, roedor o primate) se dializa frente a fosfato sódico 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, el pH varía entre 5-7,4. Se hace reaccionar una relación molar de 1:1-1:7 de PEG-propilaldehído 5 K con IL-10 a una concentración de 1-12 mg/ml en presencia de cianoborohidruro de sodio 0,75­ 30 mM. Como alternativa, la reacción se puede activar con picolina borano de manera similar. La reacción se incuba a 5-30 °C durante 3-24 horas. El pH de la reacción de pegilación se ajusta a 6,3, se hacen reaccionar 7,5 mg/ml de hIL-10 con PEG para hacer que la relación de IL-10 a enlazador de PEG sea 1:3,5. La concentración final de cianoborohidruro es de -25 mM y la reacción se realiza a 15 °C durante 12-15 horas. El mono y di-PEG IL-10 son los productos más grandes de la reacción, siendo la concentración de cada uno de -45-50°% al final. La reacción se puede desactivar usando un aminoácido tal como glicina o lisina o, como alternativa, tampones Tris. Se pueden emplear múltiples métodos de purificación, como la filtración en gel, cromatografías de intercambio aniónico y catiónico, y HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC) para aislar las moléculas de IL-10 pegiladas deseadas.

En una realización de la invención, el agente de IL-10 modificado es una IL-10 glicosilada. Para los fines de la presente divulgación, "glicosilación" se refiere en términos generales al proceso enzimático que une glicanos a las proteínas, lípidos u otras moléculas orgánicas. El uso del término "glicosilación" junto con la presente divulgación generalmente significa añadir o eliminar uno o más restos de carbohidratos (ya sea eliminando el sitio de glicosilación subyacente o eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que pueden o no estar presentes en la secuencia natural. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de carbohidratos presentes. La glicosilación puede afectar drásticamente las propiedades físicas (por ejemplo, la solubilidad) de los polipéptidos tales como la IL-10 y también puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización subcelular de las proteínas. Los polipéptidos glicosilados también pueden presentar una mayor estabilidad o pueden mejorar una o más propiedades farmacocinéticas, tal como la semivida. Además, las mejoras de solubilidad pueden, por ejemplo, permitir la generación de formulaciones más adecuadas para la administración farmacéutica que las formulaciones que comprenden el polipéptido no glicosilado.

La adición de sitios de glicosilación puede lograrse alterando la secuencia de aminoácidos del polipéptido de IL-10. La alteración del polipéptido de IL-10 se puede realizar, por ejemplo, mediante adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina (para sitios de glicosilación ligados a O) o restos de asparagina (para sitios de glicosilación ligados a N). Las estructuras de los oligosacáridos ligados a N y ligados a O y los restos de azúcar que se encuentran en cada tipo pueden ser diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (en lo sucesivo denominado en el presente documento, ácido siálico). El ácido siálico suele ser el resto terminal de los oligosacáridos ligados a N y ligados a O y, debido a su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glicoproteína. Una realización particular de la presente divulgación comprende la generación y uso de variantes de N-glicosilación. Se proporcionan ejemplos de polipéptidos de IL-10 que comprenden secuencias de aminoácidos modificadas para incorporar el sitio de glicosilación en, por ejemplo, Van Vlasselaer, et al., publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US20160068583 A1 publicada el 10 de marzo de 2016. Las secuencias de polipéptidos de IL-10 de la presente divulgación pueden alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel de ácido nucleico, particularmente mediante la mutación del ácido nucleico que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados para facilitar la introducción de sitios de glicosilación.

En una realización de la invención, el agente de IL-10 modificado es IL-10 polisialada. El término "polisialilación" se refiere a la conjugación de polipéptidos a ácido polisiálico ("PSA") enlazado a -(2^8) biodegradable natural para mejorar la estabilidad y la farmacocinética in vivo de los polipéptidos. El PSA es un polímero biodegradable, natural no tóxico que es altamente hidrófilo, confiriéndole un alto peso molecular aparente en la sangre que aumenta su semivida en suero. Además, la polisialilación de una gama de agentes terapéuticos peptídicos y proteínicos ha dado lugar a una proteólisis notablemente reducida, conservación de actividad in vivo actividad y reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad (véase, por ejemplo, G. Gregoriadis et al., Int. J. Pharmaceutics 300(1-2):125-30). Hay disponibles varias técnicas para la polisialilación específica de sitio (véase, por ejemplo, T. Lindhout et al., PNAS 108(18)7397-7402 (2011)).

En una realización de la invención, el agente de IL-10 modificado se conjuga con albúmina, denominado en el presente documento como "fusión de albúmina IL-10". El término "albúmina", como se usa en el contexto de fusiones de albúmina IL-10, incluye albúminas tales como albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica de macaco cangrejero, o albúmina de suero bovino (BSA). Según la presente divulgación, la albúmina se puede conjugar con un polipéptido de IL-10 (por ejemplo, un polipéptido descrito en el presente documento) en el extremo carboxilo, el extremo amino, tanto el extremo carboxilo como amino, e internamente (véase, por ejemplo, los documentos USP 5.876.969 y USP 7.056.701). En los conjugados de polipéptido HSA - IL-10 contemplados por la presente divulgación, se pueden usar varias formas de albúmina, tales como presecuencias de secreción de albúmina y variantes de las mismas, fragmentos y variantes de los mismos, y variantes de HSA. Dichas formas generalmente poseen una o más actividades de albúmina deseadas. En realizaciones adicionales, la presente divulgación comprende proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de IL-10 fusionado directa o indirectamente con albúmina, un fragmento de albúmina y una variante de albúmina, etc., en donde la proteína de fusión tiene una mayor estabilidad en plasma que la molécula de fármaco sin fusionar y/o la proteína de fusión conserva la actividad terapéutica de la molécula de fármaco sin fusionar. En algunas realizaciones, la fusión indirecta se efectúa mediante un enlazador, tal como un enlazador peptídico o una versión modificada del mismo.

Como alternativa, la fusión de albúmina con IL-10 comprende polipéptidos de IL-10 que son proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica de dominio de unión a albúmina (ABD, por su sigls en inglés) y un polipéptido de IL-10. Como se ha hecho alusión anteriormente, las proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica de dominio de unión a albúmina (ABD) y un polipéptido de IL-10 pueden, por ejemplo, lograrse mediante manipulación genética, tal que el ácido nucleico que codifica HSA, o un fragmento del mismo, se une al ácido nucleico que codifica una o más secuencias polipeptídicas de IL-10.

Los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación con un agente de IL-10 incluyen, por ejemplo, tiroglobulina; toxoide tetánico; toxoide diftérico; poliaminoácidos tales como poli(D-lisina:ácido D-glutámico); polipéptidos VP6 de rotavirus; hemaglutinina del virus de la gripe, nucleoproteína del virus de la gripe; hemocianina de lapa californiana (KLH); y proteína central y antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; o cualquier combinación de los anteriores.

La presente divulgación contempla la conjugación de uno o más componentes o moléculas adicionales en el extremo amino y/o carboxiterminal de una secuencia polipeptídica, tal como otro polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga al polipéptido en cuestión), o una molécula transportadora. De este modo, se puede proporcionar una secuencia polipeptídica ilustrativa como un conjugado con otro componente o molécula.

También se puede conjugar un polipéptido de IL-10 con macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa o perlas de celulosa; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico o polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de virus inactivadas; toxinas bacterianas inactivadas tal como el toxoide de la difteria, tétanos, cólera, o moléculas de leucotoxina; bacterias inactivadas; y células dendríticas. Dichas formas conjugadas, si se desea, puede usarse para producir anticuerpos contra un polipéptido de la presente divulgación.

Los componentes y moléculas candidatos adicionales para la conjugación incluyen aquellos adecuados para el aislamiento o la purificación. Los ejemplos particulares no limitantes incluyen moléculas de unión, tal como biotina (par de unión específica biotina-avidina), un anticuerpo, un receptor, un ligando, una lectina, o moléculas que comprenden un soporte sólido, que incluyen, por ejemplo, perlas de plástico o poliestireno, placas o perlas, perlas magnéticas, tiras reactivas y membranas.

En determinadas realizaciones, el extremo amino o carboxilo de una secuencia polipeptídica de IL-10 de la presente divulgación se puede fusionar con una región Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, Fc humana) para formar un conjugado de fusión (o molécula de fusión). Se ha demostrado que los conjugados de fusión con Fc aumentan la semivida sistémica de los productos biofarmacéuticos y, por lo tanto, el producto biofarmacéutico puede precisar una administración menos frecuente. Fc se une al receptor de Fc neonatal (FcRn) en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y, al unirse, la molécula de fusión con Fc se protege de la degradación y se vuelve a liberar a la circulación, manteniendo la molécula en circulación durante más tiempo. Se cree que esta unión a Fc es el mecanismo por el cual la IgG endógena conserva su larga semivida plasmática. La tecnología de fusión con Fc más reciente une una sola copia de un producto biofarmacéutico a la región Fc de un anticuerpo para optimizar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del producto biofarmacéutico en comparación con los conjugados de fusión con Fc tradicionales.

La presente divulgación contempla el uso de otras modificaciones, conocidas actualmente o creadas en el futuro, de agentes de IL-10 para mejorar una o más propiedades. Los ejemplos incluyen hesilación, describiéndose varios aspectos de la misma en, por ejemplo, las solicitudes de patente de Estados Unidos N.° 2007/0134197 y 2006/0258607, y moléculas de fusión de polipéptido de IL-10 que comprenden SUMO como etiqueta de fusión (LifeSensors, Inc.; Malvern, PA).

La presente divulgación también contempla agentes de IL-10 en los que el polipéptido de IL-10 es una proteína de fusión de un polipéptido de IL-10 y miméticos de PEG. Se han creado miméticos de polipéptido PEG que conservan los atributos de PEG (por ejemplo, semivida sérica potenciada) al mismo tiempo que confieren varias propiedades ventajosas adicionales. A modo de ejemplo, se pueden producir de manera recombinante cadenas polipeptídicas simples (que comprenden, por ejemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser y Thr) capaces de formar una conformación ampliada similar a PEG ya fusionadas con el fármaco peptídico o proteínico de interés (por ejemplo, la tecnología XTEn de Amunix; Mountain View, CA). Los agentes de IL-10 que comprenden proteínas de fusión de dichas secuencias polipeptídicas pueden generarse por medios recombinantes mediante la expresión de una secuencia de un ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión, obviando la necesidad de una etapa de conjugación adicional durante el proceso de fabricación. Por otra parte, las técnicas establecidas de biología molecular permiten el control de la composición de la cadena lateral de las cadenas polipeptídicas, permitiendo la optimización de la inmunogenicidad y las propiedades de fabricación.

Los enlazadores y su uso se han descrito anteriormente. Cualquiera de los componentes y moléculas anteriores utilizados para modificar las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación puede conjugarse opcionalmente con un agente de IL-10 o un polipéptido de IL-10 a través de un enlazador. Los enlazadores adecuados incluyen "enlazadores flexibles" que generalmente tienen una longitud suficiente para permitir algún movimiento entre las secuencias polipeptídicas modificadas y los componentes y moléculas unidos. Las moléculas enlazadoras tienen generalmente aproximadamente 6-50 átomos de longitud. Las moléculas enlazadoras también pueden ser, por ejemplo, aril acetileno, oligómeros de etilenglicol que contienen 2-10 unidades monoméricas, diaminas, diácidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos. Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener cualquier longitud adecuada, tal como 1 aminoácido (por ejemplo, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 o más de 50 aminoácidos.

Los ejemplos de enlazadores flexibles incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, GSGGSn (SEQ ID NO: 9) y GGGSn (Se Q ID NO: 10), siendo n un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un anclaje neutro entre los componentes.

Otros ejemplos de enlazadores flexibles incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GmSo)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 28), (GmSoGm)n, (GmSoGmSoGm)n (SEQ ID NO: 29), (GSGGSm)n (SEQ ID NO: 30), (GSGSmG)n (SEQ ID NO: 31) y (GGGSm)n (SEQ ID NO: 32), u combinaciones de los mismos, donde m, n, y o se seleccionan cada uno independientemente de un número entero de al menos 1 a 20, por ejemplo, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) y otros enlazadores flexibles. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un anclaje neutro entre los componentes. Los ejemplos de enlazadores flexibles incluyen, pero sin limitación, GGSG (SEQ ID NO: 33), GGSGG (SEQ ID NO: 34), GSGSG (SEQ ID NO: 35), GSGGG (SEQ ID NO: 36), GGGSG (SEQ ID NO: 37) y GSSSG (SEQ ID NO: 38).

Los enlazadores flexibles adicionales incluyen polímeros de glicina (G)n o polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 9), (GGGS)n (SEQ ID NO: 10) y (GGGGS)n (SEQ ID NO: 39), donde n=1 a 50, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50. Los enlazadores flexibles ilustrativos incluyen, pero sin limitación, GGGS (SEQ ID NO: 40), GGGGS (SEQ ID NO: 41), GGSG (SEQ ID NO: 33), GGSGG (SEQ ID NO: 34), GSGSG (SEQ ID NO: 35), GSGGG (SEQ ID NO: 36), GGGSG (SEQ ID NO: 37) y GSSSG (SEQ ID NO: 38). Un multímero (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o 30-50) de estas secuencias enlazadoras pueden unirse para proporcionar enlazadores flexibles que pueden usarse para conjugar una secuencia de aminoácidos heteróloga con los polipéptidos divulgados en el presente documento. Como se describe en el presente documento, la secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser una secuencia señal y/o una pareja de fusión, tal como, albúmina, secuencia Fc, y similares.

Tratamiento de enfermedades neoplásicas:

Las composiciones y el método de la presente divulgación son particularmente adecuados para el tratamiento de afecciones neoplásicas para las que los inhibidores de la vía de PD1 han demostrado un efecto clínico en seres humanos, ya sea a través de la aprobación de la FDA para el tratamiento de la enfermedad o la demostración de eficacia clínica en ensayos clínicos que incluyen, entre otros, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer endometrial uterino, cáncer de cuello del útero, sarcoma uterino, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de colon deficiente en reparación de errores de emparejamiento de ADN, cáncer de endometrio deficiente en reparación de errores de emparejamiento de ADN, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, cáncer de tiroides, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, micosis fungoide, linfoma periférico de linfocitos T. En la presente invención, la enfermedad neoplásica es cáncer de pulmón no microcítico.

Las respuestas terapéuticas a los inhibidores de vías de puntos de control inmunitario generalmente se manifiestan mucho más tarde que las respuestas a las quimioterapias tradicionales, tal como los inhibidores de tirosina cinasas. En algún caso, pueden pasar seis meses o más después del inicio del tratamiento con inhibidores de vías de puntos de control inmunitario antes de que se observen indicios objetivos de una respuesta terapéutica. Además, en algunos casos relacionados con la terapia con anticuerpos anti-CTLA4, las lesiones metastásicas en realidad aumentan de tamaño en las exploraciones mediante tomografía computarizada (CT, por sus siglas en inglés) u obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) antes de la regresión posterior [véase, por ejemplo, Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64]. Por lo tanto, la determinación de si el tratamiento con uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario en combinación con un agente de IL-10 de la presente divulgación (por ejemplo, PEG-IL-10) debe realizarse durante un periodo de tiempo hasta la progresión que con frecuencia es más largo que con las quimioterapias convencionales. La respuesta deseada puede ser cualquier resultado que se considere favorable según las circunstancias. En algunas realizaciones, la respuesta deseada es la prevención de la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, mientras que en otras realizaciones la respuesta deseada es una regresión o estabilización de una o más características de la enfermedad, trastorno o afecciones (por ejemplo, reducción en el tamaño tumoral). En otras realizaciones más, la respuesta deseada es la reducción o eliminación de uno o más efectos adversos asociados con uno o más agentes de la combinación.

La determinación de la eficacia clínica en el tratamiento del cáncer generalmente se asocia con el logro de uno o más parámetros reconocidos en la técnica, tales como la reducción de las lesiones, particularmente la reducción de la lesión metastásica, reducción de las metástasis, reducción en el volumen tumoral, mejora en la puntuación ECOG, y similares. La determinación de la respuesta al tratamiento se puede evaluar mediante la medición de biomarcadores que pueden proporcionar información reproducible útil en cualquier aspecto de la IL-10 o del modulador de vías de puntos de control inmunitario, incluyendo la existencia y el alcance de la respuesta de un sujeto a dicha terapia y la existencia y el alcance de los efectos adversos causados por dicha terapia. A modo de ejemplo, pero sin limitación, los biomarcadores asociados con PD1/PDL1 incluyen la potenciación de IFNy y el aumento de granzima A, granzima B y perforina; los biomarcadores asociados con bTlA incluyen un aumento en el número y la función de los linfocitos T CD8+; los biomarcadores asociados con CTLA4 incluyen potenciación de IFNy, aumento de granzima A, granzima B y perforina, y un aumento en la expresión de ICOS en los linfocitos T CD8+; los biomarcadores asociados con TIM3 incluyen el aumento de granzima A, granzima B y perforina; y los biomarcadores asociados con LAG3 incluyen la potenciación de linfocitos Treg que expresan IL-10. Se sabe que la expresión de las moléculas efectoras IP-10 (proteína 10 inducible) y MIG (monocina inducida por IFNy) aumenta en determinados tumores que expresan IL-10 mediante LPS o IFNy; estas moléculas efectoras también pueden aprovecharse como posibles biomarcadores séricos que pueden potenciarse mediante las terapias de combinación descritas en el presente documento. La respuesta al tratamiento se puede caracterizar mediante medidas convencionales de eficacia clínica que se pueden emplear, tal como la respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD) y con respecto a las lesiones diana, se pueden considerar la respuesta completa (CR)", respuesta incompleta/enfermedad estable (SD) según lo definido por RECIST, así como respuesta completa inmunomediada (irCR), respuesta parcial inmunomediada (irPR) y enfermedad estable inmunomediada (irSD) tal como se definen en los criterios de respuesta inmunomediada (irRC) para demostrar la eficacia en el tratamiento de la enfermedad neoplásica.

Ahora se describe un método o modelo para determinar la cantidad óptima de uno o más agentes en una combinación. Una cantidad óptima puede ser, por ejemplo, una cantidad que logra un efecto óptimo en un sujeto o población de sujetos, o una cantidad que logra un efecto terapéutico mientras minimiza o elimina los efectos adversos asociados con uno o más de los agentes. Por ejemplo, se sabe que la combinación de IL-10 e inhibidores de vías de puntos de control inmunitario es, o se ha determinado que es, eficaz en el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o afección descritos en el presente documento (por ejemplo, una afección cancerosa) en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) o una población de sujetos, y se titula una cantidad de un agente mientras que la cantidad de los otros agentes se mantiene constante. Al manipular las cantidades del uno o más agentes de esta manera, un médico puede determinar la relación de agentes más efectiva para, por ejemplo, el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en particular, o la eliminación de los efectos adversos o la reducción de los efectos adversos de tal manera que sean aceptables en esas circunstancias.

Quizás la inmunoterapia más estudiada y con mayor experiencia clínica se haya obtenido con los anticuerpos monoclonales anti-PD1 pembrolizumab (Keytruda®) y nivolumab. Estos productos han demostrado una eficacia real significativa y actualmente gozan de múltiples aprobaciones para una amplia variedad de cánceres. La experiencia clínica con estos agentes ha demostrado una serie de parámetros que señalan a una mayor probabilidad de éxito. La terapia con anti-PD1 ha demostrado niveles más altos de eficacia real en aquellos tumores donde hay altos niveles de expresión de PDL1 Garon et al. (2015) New England Journal of Medicine 372:2018-2028), donde el tumor tiene una carga tumoral mutacional (Rizvi et al., Science (2015) Science 348:124-128; Carbone et al. (2017) New England Journal of Medicine 376:2415-2426), donde hay altos niveles de linfocitos T CD8+ en el tumor (Tumeh et al., (2014) Nature 515:568-571), una firma de activación inmunitaria asociada con IFNy (Prat et al. (2017) Cancer Research 77(13):OF1-OF11), Cancer Res. 2017; Ayers et al (2107) J. Clinical Investigation 127:2930-2940), y carencia de enfermedad metastásica, particularmente metástasis hepática (Tumeh et al. (2017) Cáncer Imm. Research 5:417-424); Pillai et al. (2017)) J. Clin. Oncology 34:15 suppl. e20665-e20665. Estos factores limitan la eficacia real de la terapia con PD1 a una gama comparativamente pequeña de tumores. Una amplia variedad de tumores tiene una carga baja de neoantígenos con linfocitos T CD8+ específicos de neoantígenos raros, y los tumores con una carga alta de neoantígenos finalmente han escapado a los ICI. En otras situaciones, hay un desierto inmunitario en el microambiente tumoral donde los linfocitos T se han agotado y apoptosado, dando lugar la falta de expresión de linfocitos T a niveles bajos de expresión de granzima e IFN^y en el tumor. La monoterapia con IL-10 aborda muchos de estos parámetros. Se ha observado que la IL-10 aumenta la actividad de los linfocitos T CD8+ intratumorales, aumenta los niveles de granzimas, FasL e IFN^y. Mumm et al., (2011) Cancer Cell 20(6):781-796; Emmerich, et al., (2012) Cancer Research 72(14):3570-81; Oft, (2014) Cancer Immunology Research. 72(14):3570-81). Debido a la utilidad establecida de IL-10 para abordar estos obstáculos, los presentes inventores evaluaron un agente de IL-10 en combinación con una terapia con Mab anti-PD1.

AM0010, una forma PEGilada de hIL-10 que comprende una mezcla de IL-10 mono y di-PEGilada se ha evaluado en múltiples ensayos clínicos y se ha demostrado que se tolera bien como agente único (144 pacientes con excelente cumplimiento hasta 2,5 años después del inicio de tratamiento). El término AM0010 se refiere a una interleucina 10 humana recombinante (rHuIL-10) que comprende una mezcla de polipéptidos de IL-10 monopegilados y dipegilados y que emplea polietilenglicol (PEG) de 5 kDa fijado a través de un enlazador al extremo amino del polipéptido de IL-10. AM0010 es una proteína homodimérica no glicosilada compuesta por dos monómeros polipeptídicos de rHuIL-10 asociados de manera no covalente, donde cada monómero está compuesto por 161 aminoácidos, incluyendo una metionina aminoterminal que no está presente en el polipéptido de IL-10 humano natural que surge de la producción recombinante directa, comprendiendo cada monómero dos enlaces disulfuro intramoleculares, el primero entre las cisteínas en las posiciones 13 y 109 y el segundo entre las cisteínas en las posiciones 63 y 115 del polipéptido de rHuIL-10 de 161 aminoácidos (correspondiente a las cisteínas en las posiciones 12 y 108 y las posiciones 62 y 114 del polipéptido de hIL-10 natural). Los TrAE observados de la monoterapia con AM0010 incluyen que fueron manejables y reversibles y no ha habido TrAE duraderos relacionados con la autoinmunidad, tales como colitis, neumonitis, hepatitis o trastornos endocrinos. En estos estudios, la monoterapia con AM0010 a una dosis subcutánea diaria de 20 microgramos/kg induce respuestas objetivas en carcinoma de células renales (RCC, ORR del 25 %), melanoma uveal y CR en linfoma cutáneo de linfocitos T con respuestas duraderas de hasta 2,5 años y enfermedad estable prolongada en CRC y PDAC.

Sin AM0010, los linfocitos T CD8+ reconocen la célula tumoral, se agotan y experimentan apoptosis. Con AM0010, los linfocitos T CD8+ que reconocen el tumor se activan y proliferan. AM0010 inhibe la apoptosis de los linfocitos T CD8+ e induce granzimas y FasL, lo que induce la muerte de las células tumorales y AM0010 prepara una memoria inmunitaria sostenida. La dosis principal de monoterapia con AM10 es de 2 mg o (20 microgramos/kg) administrados por vía subcutánea diariamente.

Para evaluar, y solo como referencia, la combinación de un agente de IL-10 con un modulador de puntos de control inmunitario, se realizó un ensayo clínico con 57 sujetos humanos que padecían carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés) para comparar la monoterapia con AM0010 con combinaciones de dos dosis diferentes de AM0010, cada una en combinación con los anticuerpos antagonistas de la vía de puntos de control inmunitario anti-PD1 pembrolizumab y nivolumab. La población de pacientes y el diseño del estudio se resumen en la tabla 3 a continuación.

TABLA . DI EÑ DE EN AY LINI EN R

Se administró pembrolizumab (Keytruda®, Merck and Co, Rahway NJ) a una dosis de 160 mg (2 mg/kg) por vía intravenosa cada tres semanas. Se administró nivolumab (Opdivo®, Bristol, Myers Squibb, Princeton NJ) según la dosis revisada aprobada en la etiqueta de 240 mg (3 mg/kg) administrada por vía intravenosa cada dos semanas. Se administró AM0010 diariamente por vía subcutánea a una dosis de 20 microgramos/kg en el grupo de monoterapia, y diariamente por vía subcutánea a 10 microgramos/kg y 20 microgramos/kg en cada uno de los grupos de terapia de combinación con anti-PD1. Los resultados de este estudio se resumen en la tabla 4 y en la tabla 5 a continuación y en la figura 4 de los dibujos adjuntos.

TABLA 4. RE LTAD DEL EN AY LÍNI EN R

TABLA . RE LTAD DEL EN AY LINI EN R

Como puede observarse a partir de los datos anteriormente presentados, el 56 % de los pacientes evaluables en el grupo de monoterapia con AM0010 mostró una respuesta clínica duradera (DCR, por sus siglas en inglés) con una tasa de respuesta objetiva (ORR, por su siglas en inglés) de aproximadamente el 25 %. Sin embargo, los datos anteriores muestran que la combinación de AM0010 con los inhibidores de puntos de control de PD1 produce resultados significativamente mejores en comparación con la monoterapia con AM0010 o la monoterapia con anti-PD1 (según los resultados indicados en la bibliografía). La combinación de AM0010 con pembrolizumab (Keytruda®) mostró una DCR en el 100 % de los pacientes que recibieron AM0010 en combinación con pembrolizumab en dosis de 10 y 20 microgramos/kg y una ORR general del 50 %. De forma análoga, en pacientes que recibieron nivolumab en combinación con AM0010 a la dosis de 10 microgramos/kg mostraron una DCR del 100 % y el 70 % de los pacientes que recibieron la dosis de 20 microgramos/kg de AM0010 mostraron una DCR del 81 % con una ORR combinada del 42 %. Los informes de la bibliografía sobre las tasas de respuesta en RCC después de la administración de nivolumab en RCC demuestran una DCR de aproximadamente 57-65 % con una ORR de aproximadamente 20-22 % (Motzer, et al., Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial, (2015) Journal of Clinical Oncology 33(13):1430-1437) and an ORR of 25 % (Mazza, et al. (2017) Nivolumab in renal cell carcinoma: latest evidence and clinical potential, Therapeutic Advances in Medical Oncology Vol. 9(3) 171-18). Estos datos demuestran que la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) en combinación con un inhibidor de vías de puntos de control inmunitario (por ejemplo, nivolumab y pembrolizumab) da como resultado una mejora significativa en el resultado terapéutico en el tratamiento de carcinoma de células renales en sujetos humanos.

Un segundo enfoque del presente estudio fue evaluar los acontecimientos adversos asociados con la terapia de combinación. Los resultados de los acontecimientos adversos derivados de este estudio se muestran en la tabla 6 a continuación.

TABLA . A NTE IMIENT ADVER DEL EN AY EN R

Los datos anteriores demuestran que la combinación de AM10 y anti-PD-1 es bien tolerada en pacientes con carcinoma de células renales en cada dosis de AM0010 en combinación con pembrolizumab (2 mg/kg, cada 3 semanas) o nivolumab (3 mg/kg, cada 2 semanas), aunque todos los acontecimientos adversos de grado 3 y grado 4 fueron transitorios y se resolvieron, a la luz de los datos de eficacia anteriores, una dosis de 10 mcg/kg de AM10 en combinación con un inhibidor de la vía de PD1 parece preferible en función de estos datos clínicos limitados.

Paralelamente al estudio en RCC anterior, se realizó otro estudio clínico en sujetos que padecían cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) para evaluar la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) en combinación con los inhibidores de la vía de puntos de control inmunitario de PD1 (por ejemplo, nivolumab y pembrolizumab) en sujetos humanos (es decir, como ejemplo de la presente invención). En este estudio se evaluaron los niveles de expresión de PDL1 de muestras tumorales. El diseño del estudio fue similar al anterior estudio en RCC con la población de pacientes sin tratamiento previo con anti-PD1 antes del inicio del estudio. El diseño del estudio y los datos de la población de pacientes se resumen en la tabla 7 a continuación. La "expresión baja de PD-L1" se refiere a un nivel de expresión de PD-L1 en la superficie celular inferior al 1 %; "expresión intermedia de PD-L1" se refiere a un nivel de expresión de PD-L1 en la superficie celular del 1 % al 49 %; y "alta expresión de PD-L1" se refiere a un nivel de expresión de PD-L1 en la superficie celular igual o superior al 50 %, donde la expresión de PD-L1 se evalúa según las metodologías disponibles en la técnica, como en Rizzi et al. (2015) Science 348:124-128.

TABLA 7. DI EÑ DE EN AY LÍNI EN N L

Se administró pembrolizumab (Keytruda®) a una dosis de 160 mg (2 mg/kg) por vía intravenosa cada tres semanas. Se administró nivolumab (Opdivo®) según la dosis revisada aprobada en la etiqueta de 240 mg (3 mg/kg) administrada por vía intravenosa cada dos semanas. Se preparó AM0010 en una cantidad sustancial como la anterior y se administró por vía subcutánea diariamente a una dosis de 20 microgramos/kg en el grupo de monoterapia, y por vía subcutánea diariamente a 10 microgramos/kg y 20 microgramos/kg en cada uno de los grupos de terapia de combinación con anti-PD1. Los resultados de este estudio se resumen en la tabla 8 a continuación y en la figura 3 de los dibujos adjuntos.

continuación

Como puede observarse a partir de los datos anteriormente presentados, El 57 % de los pacientes evaluables (7/9) en el grupo de monoterapia con AM0010 presentaron una respuesta clínica duradera (DCR). Sin embargo, los datos muestran que la combinación de AM0010 con inhibidores de puntos de control de PD1 proporciona resultados terapéuticos significativamente potenciados en comparación con la monoterapia con AM0010 o la monoterapia con anti-PD1 (según los resultados indicados en la bibliografía). La combinación de AM0010 con pembrolizumab (Keytruda®) mostró una DCR en el 100 % de los pacientes que recibieron AM0010 en combinación con pembrolizumab tanto en dosis de 10 como de 20 microgramos/kg (datos para ambas dosis de AM0010 combinadas) y una ORR general del 40 % (datos para ambas dosis de AM0010 combinadas). De forma análoga, en pacientes que recibieron nivolumab en combinación con AM0010 en dosis de 10 y 20 microgramos/kg mostraron una DCR del 82 % (datos para ambas dosis de AM0010 combinadas) con una ORR del 42 % (datos para ambas dosis de AM0010 combinadas). Los informes de la bibliografía sobre las tasas de respuesta en NSCLC tras la administración de pembrolizumab sugieren una DCR del 41 % para la monoterapia con anti-PD1 y una ORR de aproximadamente el 20­ 22 % (Garon, et al. (2015) NEJM 372:2018-28). Estos datos demuestran que la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) en combinación con un inhibidor de vías de puntos de control inmunitario (por ejemplo, nivolumab y pembrolizumab) da como resultado una mejora significativa en el resultado terapéutico en el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico en sujetos humanos.

Cabe destacar la respuesta observada en este estudio en función del estado de PDL1. Como se ha indicado anteriormente, el estado de PDL1 bajo generalmente se asocia con un mal pronóstico en respuesta a los inhibidores de la vía anti-PD1, como pembrolizumab y nivolumab. Los datos relacionados con la ORR como factor de expresión de PDL1 se resumen en la siguiente tabla.

TABLA . RE LTAD DEL EN AY EN N L N RE PE T A LA EXPRE I N DE PDL1

Como muestran los datos anteriores, al combinar AM0010 con los anticuerpos anti-PD1 pembrolizumab y nivolumab (datos añadidos anteriormente) se demuestra un aumento significativo en la ORR en todos los niveles de expresión de PDL1. Sin embargo, quizás lo más notable es que la tasa de respuesta en NSCLC a niveles bajos (<1 %) de expresión de PDL1 donde la combinación mostró una ORR del 33 % (un aumento del 362 % en la ORR frente a datos históricos de monoterapia con pembrolizumab) y a niveles intermedios de expresión de PDL1 (1 %-49 % ) de PDL1 muestran una ORR del 67 % (una mejora del 429 % en la ORR frente a los datos históricos de la monoterapia con pembrolizumab). Estos datos demuestran que la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) en combinación con un inhibidor de vías de puntos de control inmunitario (por ejemplo, nivolumab y pembrolizumab) da como resultado una mejora significativa en el resultado terapéutico en el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico en sujetos humanos, incluso en niveles de expresión bajos o intermedios de PDL1 en tumores.

Efecto en tumores con baja carga tumoral de mutaciones:

Otro parámetro que se evaluó en el curso del estudio en NSCLC descrito anteriormente fue la carga tumoral de mutaciones. Como indican Carbone, et al., 23 de 111 (21 %) de pacientes con NSCLC con carga tumoral de mutaciones baja o intermedia tuvieron una tasa de respuesta reducida a nivolumab solo (n=23 de 111, 21 %). Por el contrario, cinco de ocho pacientes (60 %) con TMB baja o intermedia presentaron una PR a la combinación de AM0010 con anti-PD1 como se resume en la tabla 10 a continuación y en la figura 1 de los dibujos adjuntos.

Estos datos demuestran que la combinación de un agente de IL-10 (AM0010) en combinación con un inhibidor de vías de puntos de control inmunitario (por ejemplo, nivolumab y pembrolizumab) da como resultado una mejora significativa en el resultado terapéutico en el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico en sujetos humanos que tiene baja TMB, incluso en presencia de niveles de expresión de p DL1 bajos o intermedios, dos factores reconocidos como atenuantes de la terapia de PD1.

Efecto de AM0010 en combinación con pembrolizumab en enfermedades metastásicas

La metástasis es la principal causa de morbilidad y mortalidad por cáncer y representa aproximadamente el 90 % de las muertes por cáncer. Chaffer y Weinberg (2011). A perspective on cancer cell metastasis, Science. 331:1559-64. Los pacientes con metástasis en el hígado tienen una tasa de respuesta general más baja a la inhibición de puntos de control inmunitario. Tumeh et al. (2017); Pillai et al (2017) supra. En el estudio de NSCLC anterior, se realizó una evaluación de las metástasis hepáticas y los resultados se presentan en las figuras 5 y 6 de los dibujos adjuntos. Tal y como se ilustra, la combinación de AM0010 con pembrolizumab dio como resultado una reducción significativa de las lesiones metastásicas hepáticas mensurables durante el transcurso del tratamiento.

Efecto de AM0010 en combinación con terapia con Mab anti-PD1 en función del perfil de expresión génica asociada a IFNv

Como se indica en la bibliografía, los pacientes con un perfil bajo de expresión génica asociada a IFNy (por ejemplo, expresión de STAT1, HLA-DRA, CXCL9, IDO, IFNy y CXCL10) tienen una tasa de respuesta reducida a pembrolizumab (Prat et al. (2017) supra; Ayers et al. (2017) supra. Como parte del estudio en NSCLC anterior, se evaluó la respuesta terapéutica a la combinación de AM0010 en combinación con la terapia con mAb anti-PD1 en función del perfil de expresión génica asociada con IFNg. Los resultados se presentan en la figura 2 de los dibujos adjuntos. Tal y como se ilustra, dos pacientes (de cinco) con un perfil bajo de expresión génica asociada a IFNy tuvieron una respuesta parcial en respuesta a la combinación de AM0010 con terapia con mAb anti-PD-1 con 2 sujetos adicionales que presentaron enfermedad estable durante más de 6 meses.

Los datos clínicos anteriores generados en sujetos humanos que padecen una enfermedad neoplásica demuestran que la administración de un agente de IL-10 en combinación con la administración de al menos un modulador de al menos una vía de puntos de control inmunitario, en donde el modulador es un agonista de vías de puntos de control inmunitario positivas o un antagonista de vías de puntos de control inmunitario negativas, es eficaz en el tratamiento de enfermedades neoplásicas en sujetos mamíferos.

Los datos clínicos anteriores generados en sujetos humanos que padecen una enfermedad neoplásica demuestran que la administración de un agente de IL-10 en combinación con la administración de al menos un modulador de al menos una vía de puntos de control inmunitario, en donde el modulador es un agonista de vías de puntos de control inmunitario positivas o un antagonista de vías de puntos de control inmunitario negativas, es eficaz en el tratamiento de enfermedades neoplásicas en sujetos mamíferos en donde el neoplasma tiene una carga tumoral de mutaciones baja o intermedia.

Los datos clínicos anteriores generados en sujetos humanos que padecen una enfermedad neoplásica demuestran que la administración de un agente de IL-10 en combinación con la administración de al menos un modulador de al menos una vía de puntos de control inmunitario, en donde el modulador es un agonista de vías de puntos de control inmunitario positivas o un antagonista de vías de puntos de control inmunitario negativas, es eficaz en el tratamiento de enfermedades neoplásicas en sujetos mamíferos en los que el neoplasma tiene un nivel bajo o intermedio de expresión de la molécula de puntos de control inmunitario.

Los datos clínicos anteriores generados en sujetos humanos que padecen una enfermedad neoplásica demuestran que la administración de un agente de IL-10 en combinación con la administración de al menos un modulador de al menos una vía de puntos de control inmunitario, en donde el modulador es un agonista de vías de puntos de control inmunitario positivas o un antagonista de vías de puntos de control inmunitario negativas, es eficaz en el tratamiento de enfermedades neoplásicas metastásicas en sujetos mamíferos.

Los datos clínicos anteriores generados en sujetos humanos que padecen una enfermedad neoplásica demuestran que la administración de un agente de IL-10 en combinación con la administración de al menos un modulador de al menos una vía de puntos de control inmunitario, en donde el modulador es un agonista de vías de puntos de control inmunitario positivas o un antagonista de vías de puntos de control inmunitario negativas, es eficaz en el tratamiento de enfermedades neoplásicas en un sujeto con un perfil de expresión génica asociada a IFN^y bajo o intermedio, comprendiendo el perfil de expresión génica asociada a IFNy uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en STAT1, HLA-DRA, CXCL9, IDO, IFNy y CXCL10.

La presente divulgación permite además métodos para tratar enfermedades neoplásicas con un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario (incluido al menos un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario) y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional. Tales combinaciones adicionales se denominan "combinaciones complementarias", "terapia de combinación complementaria" y los agentes que se añaden a las combinaciones de IL-10 y uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario pueden denominarse "agentes complementarios".

Los ejemplos de dichos "agentes complementarios" incluyen agentes quimioterapéuticos. La expresión "agentes quimioterapéuticas" incluye, entre otros, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluida altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamima; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbacina; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; platino y complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT11; inhibidores de la topoisomerasa; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. La expresión "agentes quimioterapéuticos" también incluye agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores tales como los antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, onapristona, y toremifeno; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, el agente complementario puede ser uno o más agentes químicos o biológicos identificados en la técnica como útiles en el tratamiento de enfermedades neoplásicas, que incluyen, pero sin limitación, citocinas o antagonistas de citocinas tales como IL-12, INFa,, o antirreceptor de factor de crecimiento epidérmico, radioterapia, anticuerpos contra antígenos tumorales, un complejo de un anticuerpo monoclonal y una toxina, un adyuvante de linfocitos T, trasplante de médula ósea o células presentadoras de antígenos (por ejemplo, terapia con células dendríticas), vacunas antitumorales, virus competentes para la replicación y linfocitos T-CAR.

En dicha terapia de combinación complementaria, los diversos uno o más agentes activos complementarios frecuentemente tienen diferentes mecanismos de acción que IL-10 y/o el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario. Dicha terapia de combinación complementaria puede ser especialmente ventajosa al permitir una reducción de la dosis de uno o más de los agentes, reduciendo o eliminando de este modo los acontecimientos adversos asociados con uno o más de los agentes. Asimismo, dicha terapia de combinación complementaria puede tener un efecto terapéutico o profiláctico aditivo o sinérgico sobre la enfermedad, trastorno o afección subyacente. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el uno o más agentes complementarios son uno o más agentes de diagnóstico.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, cada uno de los agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios pueden estar en forma farmacéutica separada. A modo de ejemplo, la PEG-IL-10 puede estar en una formulación adecuada para administración s.c., los inhibidores de vías de puntos de control inmunitario pueden estar en una formulación adecuada para la administración i.v., y el agente complementario puede estar en una formulación adecuada para la administración oral; en este contexto, cada uno de los agentes puede alojarse por separado o dos o más de los agentes pueden alojarse juntos (por ejemplo, como componentes distintos de un kit). En otras realizaciones de la presente divulgación, dos o más del agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios están en la misma forma farmacéutica. Por ejemplo, la PEG-IL-10, el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios pueden formularse para administración i.v.; en este contexto, uno o más de los agentes se pueden formular conjuntamente (por ejemplo, tal como los agentes terapéuticos activos en una jeringa). La presente divulgación abarca sales, ácidos o derivados de farmacéuticamente aceptables cualquiera de los anteriores.

En determinadas realizaciones, el agente de IL-10, el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) deben administrarse o aplicarse en combinación con los otros agentes, incluyendo secuencialmente, por ejemplo, cuando se administra primero el agente de IL-10, en segundo lugar, se administra un inhibidor de vías de puntos de control inmunitario y, en último lugar, se administra un agente complementario. En otras realizaciones, el agente de IL-10, el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios deben administrarse simultáneamente, por ejemplo, cuando dos de los agentes se van a administrar simultáneamente y el tercero se administra antes o después. Independientemente de si el agente de IL-10, el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios deben administrarse secuencial, simultáneamente, o como alguna variación de las mismas, se considera que se administran como terapia de combinación complementaria para los fines de la presente divulgación.

La presente divulgación contempla el uso de un régimen de dosificación para la terapia de combinación complementaria que puede ser aceptable, apropiado u óptimo en las circunstancias y no da como resultado la inducción de un acontecimiento adverso irreversible de grado 4 o de grado 4. Los regímenes que se describen a continuación son ilustrativos, no excluyentes. En una realización, el tratamiento con el agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios deben mantenerse durante un período de tiempo. En otra realización, el tratamiento con el agente de IL-10, el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario y el uno o más agentes complementarios deben reducirse o continuarse durante un período de tiempo (por ejemplo, cuando el sujeto está estable). En otra realización, el tratamiento con el uno o más agentes complementarios se debe reducir o interrumpir (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), mientras que el tratamiento con el agente de IL-10 y el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario debe mantenerse en un régimen de dosificación constante. En una realización adicional, el tratamiento con el uno o más agentes complementarios se debe reducir o interrumpir (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), el tratamiento con el agente de IL-10 se reduce (por ejemplo, una dosis más baja, dosificación menos frecuente o régimen de tratamiento más corto), y el tratamiento con los inhibidores de vías de puntos de control inmunitario debe mantenerse en un régimen de dosificación constante. En una realización adicional, el tratamiento con el uno o más agentes complementarios se debe reducir o interrumpir (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), el tratamiento con el agente de IL-10 se reduce (por ejemplo, una dosis más baja, dosificación menos frecuente o un régimen de tratamiento más corto), y el tratamiento con el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario debe mantenerse en un régimen de dosificación constante.

Administración:

En algunas realizaciones, el agente IL10 debe administrarse por inyección parenteral, incluyendo inyección subcutánea en determinadas realizaciones. El uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario también pueden administrarse por cualquier vía eficaz en vista de la naturaleza del modulador y de la vía de puntos de control inmunitario a modular. En algunas realizaciones, el agente de IL-10 y los moduladores de vías de puntos de control inmunitario pueden administrarse por la misma vía (por ejemplo, i.v.), mientras que en otras realizaciones se pueden administrar por diferentes vías (por ejemplo, el agente de IL-10 se puede administrar por vía subcutánea y el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario se pueden administrar por vía intravenosa.

En determinados aspectos de la presente divulgación, dicho tratamiento o prevención se efectúa utilizando parámetros de dosificación particulares que sirven para minimizar cualquier acontecimiento adverso asociado con la administración de las terapias individuales por sí mismas. La IL-10 específica y el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario (junto con, por ejemplo, el objetivo terapéutico) influyen en la administración, las pautas posológicas, los parámetros de dosificación, etc. cuando se usan en combinación.

Los agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y los moduladores de vías de puntos de control inmunitario de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto en una cantidad que depende de, por ejemplo, el objetivo de la administración (por ejemplo, el grado de resolución deseado); la edad, peso, sexo, salud y estado físico del sujeto al que se va a administrar la formulación; la vía de administración; y la naturaleza de la enfermedad, trastorno, afección o síntoma de los mismos. El régimen de dosificación también puede tener en cuenta la existencia, naturaleza y alcance de cualquier acontecimiento adverso asociado con el uno o más agentes que se van a administrar. Las cantidades de dosificación y los regímenes de dosificación eficaces pueden determinarse fácilmente a partir de, por ejemplo, ensayos de seguridad y aumento de la dosis, estudios in vivo (por ejemplo, modelos animales) y otros métodos conocidos por el experto en la materia.

Los niveles en plasma sanguíneo de agentes de IL-10 en los métodos descritos en el presente documento se pueden caracterizar de varias maneras, que incluyen: (1) una concentración mínima media en suero del agente de IL-10 por encima de algún nivel especificado o en un intervalo de niveles; (2) una concentración mínima media en suero del agente de IL-10 por encima de algún nivel especificado durante algún tiempo; (3) un nivel de concentración en suero del agente de IL-10 en estado estacionario por encima o por debajo de algún nivel especificado o en un intervalo de niveles; o (4) una Cmáx del perfil de concentración por encima o por debajo de algún nivel especificado o en algún intervalo de niveles. Como se expone en el presente documento, se ha encontrado que las concentraciones mínimas medias en suero del agente de IL-10 son de particular importancia para la eficacia en determinadas indicaciones.

En una realización, la presente divulgación contempla la administración del agente de IL-10 para lograr determinadas concentraciones mínimas en suero y/o para mantener determinadas concentraciones mínimas medias en suero. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la concentración mínima media en suero del agente de IL-10 se encuentra en el intervalo de 1,0 pg/ml a 100 pg/ml; de 0,1 ng/ml a 1,0 ng/ml; de 1,0 ng/ml a 10 ng/ml; de 0,5 ng/ml a 5.0 ng/ml; de 0,75 ng/ml a 1,25 ng/ml o de 0,9 ng/ml a 1,1 ng/ml. En realizaciones particulares de la presente divulgación, la concentración mínima media en suero del agente de IL-10 es de al menos 1,25 ng/ml, al menos 1,5 ng/ml, al menos 1,6 ng/ml, al menos 1,7 ng/ml, al menos 1,8 ng/ml, al menos 1,85 ng/ml, al menos 1,9 ng/ml, al menos 1,95 ng/ml, al menos 1,97 ng/ml y al menos 1,98 ng/ml, al menos 1,99 ng/ml, al menos 2,0 ng/ml o superior a 2 ng/ml. En realizaciones adicionales, el periodo de tiempo anteriormente mencionado es de al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 6 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses o superior a 12 meses. En realizaciones particulares de la presente divulgación, la concentración mínima media en suero del agente de IL-10 se mantiene durante al menos el 85 % del período de tiempo, al menos el 90 %, al menos el 96 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % del período de tiempo.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, los perfiles de concentración de niveles en plasma sanguíneo y/o suero que se pueden producir incluyen: una concentración mínima media en plasma y/o suero del agente de IL-10 superior a aproximadamente 1,0 pg/ml, superior a aproximadamente 10,0 pg/ml, superior a aproximadamente 20,0 pg/ml, superior a aproximadamente 30 pg/ml, superior a aproximadamente 40 pg/ml, superior a aproximadamente 50,0 pg/ml, superior a aproximadamente 60,0 pg/ml, superior a aproximadamente 70,0 pg/ml, superior a aproximadamente 80.0 pg/ml, superior a aproximadamente 90 pg/ml, superior a aproximadamente 0,1 ng/ml, superior a aproximadamente 0,2 ng/ml, superior a aproximadamente 0,3 ng/ml, superior a aproximadamente 0,4 ng/ml, superior a aproximadamente 0,5 ng/ml, superior a aproximadamente 0,6 ng/ml, superior a aproximadamente 0,7 ng/ml, superior a aproximadamente 0,8 ng/ml, superior a aproximadamente 0,9 ng/ml, superior a aproximadamente 1,0 ng/ml, superior a aproximadamente 1,5 ng/ml, superior a aproximadamente 2,0 ng/ml, superior a aproximadamente 2,5 ng/ml, superior a aproximadamente 3,0 ng/ml, superior a aproximadamente 3,5 ng/ml, superior a aproximadamente 4,0 ng/ml, superior a aproximadamente 4,5 ng/ml, superior a aproximadamente 5,0 ng/ml, superior a aproximadamente 5,5 ng/ml, superior a aproximadamente 6,0 ng/ml, superior a aproximadamente 6,5 ng/ml, superior a aproximadamente 7,0 ng/ml, superior a aproximadamente 7,5 ng/ml, superior a aproximadamente 8,0 ng/ml, superior a aproximadamente 8,5 ng/ml, superior a aproximadamente 9,0 ng/ml, superior a aproximadamente 9,5 ng/ml o superior a aproximadamente 10,0 ng/ml.

En realizaciones particulares de la presente divulgación, una concentración mínima media en suero del agente de IL-10 está en el intervalo de 1,0 pg/ml a 10 ng/ml. En algunas realizaciones, la concentración mínima media en suero del agente de IL-10 se encuentra en el intervalo de 1,0 pg/ml a 100 pg/ml. En otras realizaciones, la concentración mínima media en suero del agente de IL-10 se encuentra en el intervalo de 0,1 ng/ml a 1,0 ng/ml. En otras realizaciones más, la concentración mínima media en suero del agente de IL-10 se encuentra en el intervalo de 1,0 ng/ml a 10 ng/ml. Debe entenderse que la presente divulgación contempla intervalos que incorporan cualquier concentración comprendida por las establecidas en el presente documento incluso si dichos intervalos no se mencionan explícitamente. A modo de ejemplo, la concentración media en suero del agente de IL-10 en una realización puede estar en el intervalo de 0,5 ng/ml a 5 ng/ml. Como ejemplos adicionales, las realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden una concentración mínima media en suero del agente de IL-10 en un intervalo de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 10,5 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 10,0 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 9,0 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 10,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 9,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml, de aproximadamente 2,0 ng/ml a aproximadamente 10,0 ng/ml, de aproximadamente 2,0 ng/ml a aproximadamente 9,0 ng/ml, de aproximadamente 2,0 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, y de aproximadamente 2.0 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml.

La presente divulgación contempla la administración de cualquier dosis y régimen de dosificación que dé como resultado el mantenimiento de cualquiera de las concentraciones mínimas en suero del agente de IL-10 expuestas anteriormente. A modo de ejemplo, pero sin limitación, cuando el sujeto es un ser humano, puede administrarse hIL-10 no pegilada a una dosis superior a 0,5 pg/kg/día, superior a 1,0 pg/kg/día, superior a 2,5 pg/kg/día, superior a 5 pg/kg/día, superior a 7,5 pg/kg, superior a 10,0 pg/kg, superior a 12,5 pg/kg, superior a 15 pg/kg/día, superior a 17,5 pg/kg/día, superior a 20 pg/kg/día, superior a 22,5 pg/kg/día, superior a 25 pg/kg/día, superior a 30 pg/kg/día, o superior a 35 pg/kg/día. Además, a modo de ejemplo, pero sin limitación, cuando el sujeto es un ser humano, el agente de hIL-10 pegilada que comprende un PEG relativamente pequeño (por ejemplo, mono-di-PEG-hIL-10 de 5 kDa) puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,5 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 0,75 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 1 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 1,5 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 1,75 pg/kg/día, como alternativa de aproximadamente 2,0 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 3 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 4 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 5 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 8 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 10 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 12 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 15 pg/kg/día/s.c., como alternativa de aproximadamente 20 pg/kg/día/s.c.

Se prevé que un régimen de dosificación suficiente para mantener una concentración mínima en suero en estado estacionario deseada (por ejemplo, 1 ng/ml) puede dar como resultado una concentración mínima en suero inicial que es más alta que la concentración mínima en suero en estado estacionario deseada. Debido a las características farmacodinámicas y farmacocinéticas de la IL-10 en un sujeto mamífero, una concentración mínima inicial (lograda, por ejemplo, mediante la administración de una o más dosis de carga seguidas de una serie de dosis de mantenimiento) disminuye de forma gradual pero continua durante un período de tiempo, incluso cuando los parámetros de dosificación (cantidad y frecuencia) se mantienen constantes. Después de ese período de tiempo, la disminución gradual pero continua finaliza y se mantiene una concentración mínima en suero en estado estacionario. A modo de ejemplo, se requiere la administración parenteral (por ejemplo, s.c. e i.v.) de ~0,1 mg/kg/día de un agente de IL-10 (por ejemplo, mIL-10) a un ratón (por ejemplo, un ratón C57BL/6) para mantener una concentración mínima en suero en estado estacionario de 2,0 ng/ml. Sin embargo, la concentración mínima en suero en estado estacionario puede no alcanzarse hasta aproximadamente 30 días después del inicio de la dosificación de 0,1 mg/kg/día (y también después de una o más dosis de carga cualquiera). En su lugar, después de que se haya alcanzado una concentración mínima en suero inicial (por ejemplo, 2,5 ng/ml), esa concentración disminuye de forma gradual pero continua a lo largo del curso de tratamiento, después de lo cual se mantiene la concentración mínima en suero en estado estacionario deseada (2,0 ng/ml). Un experto en la materia podrá determinar la dosis necesaria para mantener la concentración mínima deseada en estado estacionario usando, por ejemplo, ADME y parámetros específicos del paciente.

En general, los parámetros de dosificación dictan que la cantidad de dosificación sea menor que una cantidad que podría ser irreversiblemente tóxica para el sujeto (es decir, la dosis máxima tolerada, "MTD", por sus siglas en inglés) y no menos de una cantidad necesaria para producir un efecto mensurable en el sujeto. Dichas cantidades se determinan mediante, por ejemplo, los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos asociados con la ADME, teniendo en cuenta la vía de administración y otros factores.

Una dosis eficaz (DE) es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o un efecto deseado en alguna fracción de los sujetos que lo toman. La "dosis media eficaz" o DE50 de un agente es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o un efecto deseado en el 50 % de la población a la cual se le administra. Aunque la DE50 se utiliza comúnmente como una medida de expectativa razonable del efecto de un agente, no es necesariamente la dosis que un médico podría considerar apropiada teniendo en cuenta todos los factores pertinentes. De este modo, en algunas situaciones, la cantidad eficaz puede ser mayor que la DE50 calculada, en otras situaciones, la cantidad eficaz puede ser menor que la DE50 calculada y, en otras situaciones más, la cantidad eficaz es la misma que la DE50 calculada. Además, una dosis eficaz del agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) de la presente divulgación puede ser una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un sujeto, produce un resultado deseado con respecto a un sujeto sano. Por ejemplo, para un sujeto que padece un trastorno en particular, una dosis eficaz puede ser una que mejora un parámetro, medida, marcador de diagnóstico y similares del trastorno en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, o más del 90 %, donde el 100 % se define como el parámetro, medida, marcador de diagnóstico, y similares, presentados por un sujeto normal. La dosis eficaz del agente de IL10 puede determinarse mediante ensayos de actividad de IL-10 conocidos en la técnica y descritos en otra parte del presente documento. A modo de ejemplo, en el contexto tumoral, la actividad adecuada de IL-10 incluye, por ejemplo, la infiltración de linfocitos T CD8+ en sitios tumorales, expresión de citocinas inflamatorias, tal como IFN-^y, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L, a partir de estas células infiltrantes y niveles elevados de TNF-a o IFN-^y en muestras biológicas.

En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando el agente IL10 es un agente de PEG-IL-10 que se va a administrar por infusión intravenosa continua para suministrar aproximadamente de 50 a 800 pg de proteína/kg de peso corporal/día (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 16 pg de proteína/kg de peso corporal/día de un agente de PEG-IL-10). La tasa de infusión se puede variar según la evaluación de, por ejemplo, acontecimientos adversos y recuentos de células sanguíneas. Otros parámetros de dosificación específicos para los agentes de IL-10 se describen en otra parte del presente documento.

En determinadas realizaciones, la dosificación del agente de IL-10 y el modulador de vías de puntos de control inmunitario se proporciona en una "forma farmacéutica unitaria". La expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un agente de IL-10 y un modulador de vías de puntos de control inmunitario de la presente divulgación, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes adicionales, suficiente para producir el efecto deseado. Se apreciará que los parámetros de una forma farmacéutica unitaria dependerán del agente particular y del efecto a conseguir.

En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla métodos en donde el agente de IL-10 y el modulador de vías de puntos de control inmunitario se administrarán a un sujeto al menos una vez al día, al menos una vez cada 48 horas, al menos una vez cada 72 horas, al menos una vez por semana, al menos una vez cada 2 semanas, al menos una vez al mes, al menos una vez cada 2 meses, o al menos una vez cada 3 meses o más. En determinadas realizaciones, el agente de IL-10 debe administrarse en combinación con pembrolizumab (Keytruda®, Merck and Co, Rahway NJ) administrado a una dosis de 160 mg (2 mg/kg) por vía intravenosa cada tres semanas. En determinadas realizaciones, el agente de IL-10 debe administrarse en combinación con nivolumab (Opdivo®, BristolMyers Squibb, Princeton NJ) administrado según la dosis revisada aprobada en la etiqueta de 240 mg (3 mg/kg) administrada por vía intravenosa cada dos semanas.

Aunque el análisis anterior sobre las concentraciones en suero, dosis y protocolos de tratamiento del agente de IL-10 que son necesarios para lograr concentraciones en suero particulares de IL-10, etc., se refiere a la monoterapia con un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), en determinadas realizaciones dichas dosis, protocolos de tratamiento, etc. también son relevantes para los regímenes terapéuticos que comprenden un agente de IL-10 en combinación con uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, un régimen de dosificación de PEG-IL-10 puede ser el mismo cuando se va a administrar solo o cuando se va a administrar en combinación con un antagonista de PD1 porque la PEG-IL-10 y el antagonista de PD1 tienen mecanismos de acción distintos que permiten que los agentes se combinen sin modificaciones de sus parámetros de dosificación. Sin embargo, dichas combinaciones pueden permitir modificaciones en el régimen de dosificación normal de PEG-IL-10 y/o de inhibidores de vías de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, se puede reducir la dosis terapéutica de uno o ambos agentes, se puede disminuir la frecuencia de dosificación de uno o ambos agentes, y/o se puede acortar la duración de la terapia de uno o ambos agentes, conservando el efecto terapéutico deseado.

El experto en la materia (por ejemplo, un farmacólogo) puede determinar el uno o más regímenes de dosificación óptimos cuando se va a administrar un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) en combinación con uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, el régimen de dosificación óptimo de PEG-IL-10 puede requerir una reducción en la cantidad de PEG-IL-10 administrada por dosis (por ejemplo, inferior a 1,0 pg/kg/día, inferior a 0,75 pg/kg/día, inferior a 0,5 pg/kg/día, inferior a 0,25 pg/kg/día o inferior a 0,125 pg/kg/día). En determinadas realizaciones ilustrativas de la presente divulgación, una concentración mínima media en suero del agente de IL-10 puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 9,5 ng/ml, de aproximadamente 0,25 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml, de aproximadamente 0,75 ng/ml a aproximadamente 6,0 ng/ml, o de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 5,0 ng/ml.

Cuando se va a administrar un agente de IL-10 en combinación con inhibidores de vías de un punto de control inmunitario, pueden modificarse uno o más de los parámetros de dosificación del agente de IL-10 aplicables a monoterapia mientras que los parámetros de dosificación del uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario aplicables a monoterapia pueden seguir siendo los mismos; pueden permanecer iguales uno o más de los parámetros de dosificación del agente de IL-10 aplicables a monoterapia mientras que pueden modificarse uno o más de los parámetros de dosificación del uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario aplicables a monoterapia; pueden modificarse uno o más de los parámetros de dosificación del agente de IL-10 y del uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario aplicables a monoterapia; o los parámetros de dosificación de cada uno del agente de IL-10 y del uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario aplicables a la monoterapia pueden seguir siendo los mismos.

Los agentes de IL-10 y los inhibidores de vías de puntos de control inmunitario de la presente divulgación pueden estar en forma de composiciones adecuadas para la administración a un sujeto. En general, dichas composiciones son "composiciones farmacéuticas" que comprenden IL-10 y/o uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario y uno o más diluyentes, transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables. En determinadas realizaciones, los agentes de IL-10 y los inhibidores de vías de puntos de control inmunitario están presentes cada uno en una cantidad terapéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse en los métodos de la presente divulgación; de este modo, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse ex vivo o in vivo a un sujeto para poner en práctica los métodos y usos terapéuticos y profilácticos descritos en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente aceptable de un agente de IL-10 en combinación con una cantidad terapéuticamente aceptable de uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario, junto con uno o más diluyentes, transportadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, una solución de inyección isotónica). La composición farmacéutica es generalmente una que es adecuada para la administración a seres humanos. Asimismo, en algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos un agente complementario adicional.

Una formulación farmacéutica puede comprender un agente de IL-10 y al menos un modulador de vías de puntos de control inmunitario o en formulación farmacéutica con múltiples moduladores de vías de puntos de control inmunitario que contengan opcionalmente un agente terapéutico complementario

Las composiciones farmacéuticas normalmente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de IL-10 y/o una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de vías de puntos de control inmunitario, opcionalmente un agente complementario, en presencia de agentes de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables. Los diluyentes, transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y bisulfato de sodio), conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico, metil parabenos, etilo o n-propilo, p-hidroxibenzoato), agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes dispersantes, disolventes, cargas, agentes de carga, detergentes, tampones, vehículos, diluyentes y/o adyuvantes. Por ejemplo, un vehículo adecuado puede ser solución salina fisiológica o solución salina tamponada con citrato, posiblemente complementada con otros materiales comunes en composiciones farmacéuticas para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con seroalbúmina son vehículos ilustrativos adicionales. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una diversidad de tampones que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas y las formas farmacéuticas contempladas en el presente documento. Los tampones típicos incluyen, pero sin limitación, ácidos débiles, bases débiles o mezclas de los mismos farmacéuticamente aceptables. Como ejemplo, los componentes tamponantes pueden ser materiales hidrosolubles tales como ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido glutámico y sales de los mismos. Los agentes tamponantes aceptables incluyen, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal de sodio de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) y ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS).

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión oleosa o acuosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse según la técnica conocida utilizando los agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión mencionados en el presente documento. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Los diluyentes, disolventes y medios de dispersión que pueden emplearse incluyen agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Además, convencionalmente se emplean aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Por otra parte, los ácidos grasos, tales como el ácido oleico, encuentran uso en la preparación de inyectables. Puede conseguirse la absorción prolongada de formulaciones inyectables particulares incluyendo un agente que retrase la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina).

Las composiciones farmacéuticas que contienen el uno o más agentes activos pueden estar en forma adecuada para su uso oral, por ejemplo, como comprimidos, cápsulas, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes, soluciones, microperlas o elixires. En realizaciones particulares, un agente activo o un agente coadministrado con un agente de IL-10 descrito en el presente documento está en una forma adecuada para uso oral. Las composiciones farmacéuticas destinadas al uso oral pueden prepararse según cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y tales composiciones pueden contener uno o más agentes tales como, por ejemplo, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, para proporcionar preparaciones sabrosas y farmacéuticamente elegantes. Los comprimidos, cápsulas y similares contienen el principio activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Las formulaciones de los agentes también pueden diseñarse para proporcionar una liberación prolongada de los agentes activos. Las formulaciones de liberación prolongada son conocidas en la técnica e incluyen partículas biodegradables o biocompatibles o una sustancia polimérica tal como poliésteres, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianhídridos, ácido poliglicólico, etilen-vinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina o copolímeros de lactida/glicolida, copolímeros de polilactida/glicolida o copolímeros de etilenvinilacetato, para controlar el suministro de una composición administrada. Por ejemplo, el agente oral puede quedar atrapado en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, mediante el uso de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en un sistema coloidal de suministro de fármacos. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, microperlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los métodos para la preparación de las formulaciones mencionadas anteriormente serán evidentes para los expertos en la materia. Las formulaciones de los agentes también pueden ser inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o por vía intramuscular, que también se pueden utilizar para liberar los agentes activos divulgados en el presente documento durante un período de tiempo definido.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de las mismas. Dichos excipientes pueden ser agentes de suspensión, por ejemplo, carmelosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes, por ejemplo, un fosfátido natural (por ejemplo, lecitina) o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos (por ejemplo, estearato de polioxietileno), o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga (por ejemplo, para heptadecaetilenoxicetanol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol (por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado). La suspensión acuosa puede contener también uno o más conservantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden ser suspensiones oleosas que pueden formularse suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes tales como los indicados anteriormente y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral de sabor agradable.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden ser polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua que proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. En el presente documento se ejemplifican agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto; fosfátidos naturales, por ejemplo, soja, lecitina, y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos; anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden incluir transportadores para proteger la composición contra la rápida degradación o eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, liposomas, hidrogeles, profármacos y sistemas de suministro microencapsulados. Por ejemplo, pueden emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo, solo o en combinación con una cera.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Los supositorios pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se funda en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao y polietilenglicoles.

Las composiciones de la presente divulgación también pueden estar en forma de cualquier otra composición farmacéutica adecuada (por ejemplo, pulverizaciones para su uso nasal o por inhalación) conocida actualmente o desarrollada en el futuro.

Presentaciones:

Una vez que se ha formulado una composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso, una forma liofilizada que precisa reconstitución antes del uso, una forma líquida que precisa dilución antes del uso u otra forma aceptable. En determinados casos, la composición farmacéutica se proporciona en un envase de un solo uso (por ejemplo, un vial, ampolla, jeringa o autoinyector de un solo uso (similar a, por ejemplo, un EpiPen®)), mientras que en otras realizaciones se proporciona un recipiente de múltiples usos (por ejemplo, un vial de múltiples usos). Se puede usar cualquier aparato de suministro de fármacos para suministrar IL-10, incluyendo sistemas de implantes (por ejemplo, bombas implantables) y catéteres, bombas y dispositivos de inyección lenta, siendo todos ellos bien conocidos por los expertos en la materia. También pueden utilizarse inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o por vía intramuscular, también se puede utilizar para liberar los polipéptidos divulgados en el presente documento durante un período de tiempo definido. Las inyecciones de absorción lenta son habitualmente a base de aceite o sólido y generalmente comprenden al menos uno de los componentes de formulación expuestos en el presente documento. Un experto en la materia está familiarizado con las posibles formulaciones y usos de las inyecciones de absorción lenta.

Determinados casos de la presente divulgación contemplan un recipiente estéril que contiene una de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente y, opcionalmente, uno o más componentes adicionales. A modo de ejemplo, pero sin limitación, el recipiente estéril puede ser una jeringa, en particular, una jeringa precargada lista para la administración. En otros casos más, el recipiente estéril es un componente de un kit; el kit también puede contener, por ejemplo, un segundo recipiente estéril que comprende al menos un agente profiláctico o terapéutico, cuyos ejemplos se exponen en otra parte en el presente documento.

La presente divulgación también contempla kits que comprenden formulaciones farmacéuticas de agentes de IL-10 y uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario. Los kits generalmente están en forma de una estructura física que aloja diversos componentes, como se describe a continuación, y pueden utilizarse, por ejemplo, en la puesta en práctica de los métodos descritos anteriormente. Un kit puede incluir una o más formulaciones farmacéuticas de agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) divulgadas en el presente documento proporcionadas en un recipiente estéril y una o más formulaciones farmacéuticas de moduladores de vías de puntos de control inmunitario, proporcionando las formulaciones farmacéuticas en uno o más recipientes estériles. Los agentes de IL-10 de las formulaciones farmacéuticas y el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario de las formulaciones farmacéuticas se pueden proporcionar en una forma que esté lista para su uso o en una forma que requiera, por ejemplo, reconstitución o dilución antes de la administración. Cuando los agentes de IL-10 y/o el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario se proporcionan en una forma que el usuario necesita reconstituir, el kit también puede incluir tampones, excipientes farmacéuticamente aceptables y similares, empaquetados con o por separado de los agentes de IL-10 o el uno o más moduladores de vías de puntos de control inmunitario. De forma análoga, cuando se contempla la terapia complementaria (por ejemplo, un agente de IL-10, uno o más inhibidores de vías de puntos de control inmunitario y un agente complementario, el kit puede contener varios agentes por separado o dos o más de ellos ya pueden estar combinados en el kit. Un kit de la presente divulgación puede diseñarse para que reúna las condiciones necesarias para mantener adecuadamente los componentes alojados en el mismo (por ejemplo, refrigeración o congelación).

Un kit puede contener una etiqueta o un prospecto que incluya información identificativa de los componentes del mismo e instrucciones para su uso (por ejemplo, los parámetros de dosificación, la farmacología clínica del uno o más principios activos, incluyendo el mecanismo de acción, la farmacocinética y la farmacodinámica, los efectos adversos, las contraindicaciones, etc.). Cada componente del kit puede estar contenido dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo envase. Las etiquetas o prospectos incluyen información del fabricante, tal como números de lote y fechas de caducidad. La etiqueta o el prospecto pueden, por ejemplo, estar integrados en la estructura física que aloja los componentes, contenidos por separado dentro de la estructura física o incluidos en un componente del kit (por ejemplo, una ampolla, jeringa o vial).

Las etiquetas o prospectos incluyen adicionalmente, o se incorporan en, un medio legible por ordenador, tal como un disco (por ejemplo, disco duro, tarjeta, disco de memoria), disco óptico tal como CD o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnética o un medio de almacenamiento eléctrico, tal como una RAM y ROM o híbridos de estos tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos, medios FLASH o tarjetas de memoria. En determinados casos, las instrucciones propiamente dichas no están presentes en el kit, sino que se proporcionan los medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de un sitio de Internet.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de IL-10 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad neoplásica en un sujeto mamífero, en donde la enfermedad neoplásica tiene una carga tumoral de mutaciones intermedia de más de aproximadamente 15 mutaciones por megabase secuenciada pero menos de aproximadamente 100 mutaciones por megabase secuenciada o en donde la enfermedad neoplásica tiene una carga de mutaciones baja inferior o igual a 15 mutaciones por megabase secuenciada, en donde la enfermedad neoplásica es cáncer de pulmón no microcítico, y en donde el tratamiento o la prevención comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de IL-10 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de vías de puntos de control inmunitario;

en donde:

- el modulador de vías de puntos de control inmunitario es un anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario; y

- el agente de IL-10 es una molécula dimérica que tiene actividad de IL-10 que comprende dos polipéptidos de IL-10 que se unen al receptor de IL-10 y modulan la misma vía de señalización que IL-10 y son capaces de provocar una respuesta biológica característica de IL-10.

2. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad neoplásica es un tumor primario.

3. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el agente de IL-10 comprende dos polipéptidos de IL-10 (i) que tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 25, (ii) que tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 26, o (iii) que tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 27.

4. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el agente de IL-10 está PEGilado.

5. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la expresión de PD-L1 en la superficie celular es intermedia o baja en la enfermedad neoplásica.

6. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 5, en donde el anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab, nivolumab y AM0001.

7. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab y nivolumab.

8. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el agente de IL-10 comprende al menos una modificación para formar un agente de IL-10 modificado, en donde la modificación no altera la secuencia de aminoácidos del agente de IL-10.

9. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 8, en donde el agente de IL-10 modificado es un agente de PEG-IL-10.

10. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 9, en donde el agente de PEG-IL-10 comprende: (i) al menos una molécula de PEG fijada covalentemente a al menos un resto de aminoácido de al menos una subunidad de IL-10; o (ii) una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada.

11. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 9 o 10, en donde el componente de PEG del agente de PEG-IL-10 tiene una masa molecular de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa.

12. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 9 o 10, en donde el componente de PEG del agente de PEG-IL-10 tiene una masa molecular de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa.

13. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde la modificación comprende un enlazador.

14. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el agente de IL-10 modificado es una molécula de fusión con Fc.

15. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el agente de IL-10 modificado comprende una albúmina sérica o un dominio de unión a albúmina (ABD).

16. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el agente de IL-10 modificado está glicosilado o hesilado.

17. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 1, en donde el agente de IL-10 es AM0010 y el anticuerpo antagonista de PD1 inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab y nivolumab.

18. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde la administración del modulador de vías de puntos de control inmunitario y del agente de IL-10 se realiza mediante inyección parenteral.

19. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 18, en donde la administración del agente de IL-10 se realiza mediante inyección subcutánea.

20. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el modulador de vías de puntos de control inmunitario y el agente de IL-10 se administran simultáneamente o se administran secuencialmente.

21. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el tratamiento o la prevención comprende además la administración de al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional.

22. El agente de IL-10 para su uso según la reivindicación 21, en donde el agente profiláctico o terapéutico es un agente quimioterapéutico.

23. El agente de IL-10 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en donde el sujeto es un ser humano.